JP3483870B2

JP3483870B2 - 最終滅菌骨原性デバイスおよびその調製

Info

Publication number: JP3483870B2
Application number: JP2001331607A
Authority: JP
Inventors: エム．タッカーマジョリー; シー．ルーガーデイビッド; ティー．サンパスクバー
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2004-01-06
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: JP3430474B2; EP1334733A2; DE69626205T2; EP0837701B1; JP2002191686A; US6028242A; US6504079B2; US20020106394A1; US6013856A; ATE232401T1; DE69636824T2; US5674292A; US6461630B1; WO1996040297A1; AU6333596A; ATE350068T1; EP0837701A1; EP1334733A3; DE69636824D1; JPH11506360A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般に骨原性デバイ
スの分野に関し、そしてより特定すると、哺乳動物に移
植後、骨形成を誘導し得る最終滅菌骨原性デバイスに関
する。

【０００２】

【従来の技術】（発明の背景）治療用デバイス、より特
定すると骨原性デバイスは、典型的には意図されたレシ
ピエントに移植する前に滅菌される。滅菌は、デバイス
が潜在的な病原体、またはその他の生物感染性物質を意
図された患者に導入しないことを保証するために必要で
ある。不溶性のキャリア材料と組み合わされた骨原性タ
ンパク質を含む骨原性デバイスは、哺乳動物のあらかじ
め選択された位置（例えば骨折部位）に骨形成を誘導す
るのに有用である。それ故、キャリア材料と骨原性タン
パク質とは、典型的には別々に滅菌され、次いで滅菌移
植可能デバイスを製造するために組み合わされる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法は、得られたデバイスの滅菌性を保証し得ない。

【０００４】２個以上の部品（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を
含むデバイスを滅菌する最も望ましい方法は、当該分野
で「最終滅菌」と呼ばれるプロセスによる。このプロセ
スにより、デバイスは調合後、すなわちデバイス中にす
べての部品を相互に組み合わせた後に滅菌される。最終
滅菌に用いるために多様な物理的および化学的手法が開
発されており、例えばそれらは化学物質または熱に曝
露、またはイオン化または非イオン化放射線に曝露する
ことを含む。しかしながら、これらの方法は固有の問題
を有し得る。

【０００５】例えば、化学滅菌に有用な化学試薬、また
は反応副生成物は意図されたレシピエントに有害で有り
得る。従って、このような化学物質はデバイスの移植前
に除去しなければならない。エチレンオキシドとホルム
アルデヒドとが滅菌試薬として普通に使用される試薬で
ある。しかしながら、どちらもアルキル化剤であり、従
って生物活性分子を修飾し不活化し得る。さらにこれら
の化学物質は共に発癌性物質であり突然変異誘発物質で
ある（Ｄａｖｉｓら、（１９７３年）「Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第２版」、ＨａｒｐｅｒａｎｄＲｏｗ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。同様に、デバイスが生物活
性タンパク質を必要とする場合、タンパク質が変性し、
その結果、熱に曝露することで不活化され得るため、デ
バイスを高温に曝すことは望ましくない。イオン化およ
び非イオン化放射線に曝露することによる対象物の滅菌
は、潜在的に毒性のある化学物質を加える必然性がなく
なるが、放射線エネルギーおよび／または酸素フリーラ
ジカルを含むその副生物はタンパク質のコンフォーメー
ションを変化させる可能性があり、従ってタンパク質を
損傷または不活化し得る。さらに、ある種の医学的に重
要なポリマー、例えばポリウレタンまたはポリメチルメ
タクリレートをガンマ線に曝露することは、ポリマーに
当座または長期の物理的変化を与える結果となり得る。

【０００６】従って、哺乳動物のあらかじめ選ばれた位
置に移植した場合、その位置に骨を生成し得る最終滅菌
骨原性デバイスを提供することが、本発明の目的の一つ
である。他の目的は、デバイスの生物活性および／また
は生体適合性を損なわずに最終滅菌骨原性デバイスの一
般的プロセスを提供することである。また、本発明の他
の目的は、哺乳動物のあらかじめ選ばれた位置に、本発
明の最終滅菌デバイスを用いて骨形成を誘導する方法を
提供することである。

【０００７】本発明のこれらの目的および特徴は、以下
の説明、図面および請求の範囲で明らかになるであろ
う。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物に移
植するための最終滅菌骨原性デバイスであって；（ａ）不溶性の合成ポリマーキャリア材料と、このキャ
リア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、
軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離
された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む
骨原性デバイスを提供する工程；および（ｂ）工程
（ａ）の骨原性デバイスを、デバイスを滅菌するに十分
な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物に
おける軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有す
る最終滅菌骨原性デバイスを製造する工程により製造さ
れる、デバイス、を提供する。

【０００９】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリアがポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコール酸ま
たはその混合物を含む、上記のデバイスを提供する。

【００１０】本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物
に移植するための最終滅菌骨原性デバイスであって；（ａ）不溶性のポリマーキャリア材料と、このキャリア
材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨
性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離され
た生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原
性デバイスを提供する工程；および（ｂ）工程（ａ）の
デバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化
放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨
形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原
性デバイスを製造し、ここでこの最終滅菌骨原性デバイ
スは、滅菌前の骨原性デバイスの少なくとも約２０％の
生物活性を有する、工程により製造されるデバイス、を
提供する。

【００１１】本発明の好ましい実施形態では、上記キャ
リア材料と上記骨原性タンパク質とが重量比で約１：１
〜約２５０，０００：１の範囲で組み合わされる、上記
のデバイスを提供する。

【００１２】本発明の好ましい実施形態では、キャリア
と骨原性タンパク質との上記重量比が、約４０：１〜約
５０，０００：１の範囲である、上記のデバイス、を提
供する。

【００１３】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線がガンマ線である、上記のデバイスを提供す
る。

【００１４】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線が約０．５〜約４．０メガラドの範囲内の線
量で与えられる、上記のデバイスを提供する。

【００１５】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線が約２．０〜約３．５メガラドの範囲内の線
量で与えられる、上記のデバイス、を提供する。

【００１６】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線が電子線である、上記のデバイスを提供す
る。

【００１７】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線が約０．５〜約４．０メガラドの範囲内の線
量で与えられる、上記のデバイスを提供する。

【００１８】本発明の好ましい実施形態では、上記イオ
ン化放射線が約２．０〜約３．５メガラドの範囲内の線
量で与えられる、上記のデバイスを提供する。

【００１９】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が多孔性粒子を含む、上記のデバイスを
提供する。

【００２０】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が充填粒子を含む、上記のデバイスを提
供する。

【００２１】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が約７０〜約８５０μｍの範囲内の粒子
サイズを有する粒子を含む、上記のデバイスを提供す
る。

【００２２】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が約１２５〜約４５０μｍの範囲内の粒
子サイズを有する粒子を含む、上記のデバイスを提供す
る。

【００２３】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料がインビボ生分解性ポリマーを含む、上
記のデバイスを提供する。

【００２４】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が合成ポリマーを含む、上記のデバイス
を提供する。

【００２５】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料がポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコール
酸、またはその混合物を含む、上記のデバイスを提供す
る。

【００２６】本発明の好ましい実施形態では、上記不溶
性キャリア材料が天然ポリマー材料を含む、上記のデバ
イスを提供する。

【００２７】本発明の好ましい実施形態では、上記天然
ポリマー材料がヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシ
ウム、コラーゲンまたはその混合物を含む、上記のデバ
イスを提供する。

【００２８】本発明の好ましい実施形態では、上記天然
ポリマー材料が同種異系または異種骨である、上記のデ
バイスを提供する。

【００２９】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭ
Ｐ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ
−８、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１または
それらの機能的等価物である、上記のデバイスを提供す
る。

【００３０】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がホモダイマーである、上記のデバイスを
提供する。

【００３１】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１またはその機能的等価物であ
る、上記のデバイスを提供する。

【００３２】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がホモダイマーである、上記のデバイスを
提供する。

【００３３】本発明の好ましい実施形態では、上記最終
滅菌骨原性デバイスが哺乳動物の無血管位での関節軟骨
形成の誘導能を有する、上記のデバイスを提供する。

【００３４】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭ
Ｐ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ
−８、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１または
それらの機能等価物である、上記のデバイスを提供す
る。

【００３５】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１またはその機能的等価物であ
る、上記のデバイスを提供する。

【００３６】本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物
のあらかじめ選定した位置での軟骨性骨または関節軟骨
の形成の誘導に使用するための、上記の最終滅菌骨原性
デバイスを提供する。

【００３７】本発明の好ましい実施形態では、上記関節
軟骨形成が哺乳動物の無血管位で行われる、上記の使用
を提供する。

【００３８】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１またはその機能的等価物であ
る、上記の使用を提供する。

【００３９】本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物
のあらかじめ選定した位置に軟骨性骨または関節軟骨の
形成を誘導するための医薬の製造に使用するための、上
記の最終滅菌骨原性デバイスを提供する。

【００４０】本発明の好ましい実施形態では、上記関節
性軟骨形成が哺乳動物の無血管位で行われる、上記の使
用を提供する。

【００４１】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１またはその機能的等価物であ
る、上記の使用を提供する。

【００４２】本発明は、哺乳動物に移植するための最終
滅菌骨原性デバイスの製造法であって；（ａ）不溶性の合成ポリマーキャリア材料と、このキャ
リア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、
軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離
された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む
骨原性デバイスを提供する工程；および（ｂ）工程
（ａ）の骨原性デバイスを、デバイスを滅菌するに十分
な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物に
おける軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有す
る最終滅菌骨原性デバイスを製造する工程を含む、方
法、を提供する。

【００４３】本発明は、哺乳動物に移植するための最終
滅菌骨原性デバイスの製造法であって；（ａ）不溶性のポリマーキャリア材料と、このキャリア
材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨
性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離され
た生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原
性デバイスを提供する工程；および（ｂ）工程（ａ）の
デバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化
放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨
形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原
性デバイスを製造し、ここでこの最終滅菌骨原性デバイ
スは、滅菌前の骨原性デバイスの少なくとも約２０％の
生物活性を有する、工程を含む、方法、を提供する。

【００４４】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、Ｂ
ＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭ
Ｐ−８、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１また
はそれらの機能的等価物である、上記の方法を提供す
る。

【００４５】本発明の好ましい実施形態では、上記骨原
性タンパク質がＯＰ−１またはその機能的等価物であ
る、上記の方法を提供する。

【００４６】

【発明の実施の形態】（発明の要旨）不溶性キャリア材
料と組み合わせて生物活性タンパク質、例えば骨原性タ
ンパク質を含む最終滅菌治療用デバイス、特に骨原性デ
バイスは、イオン化放射線に曝露して滅菌した場合、哺
乳動物に移植すると骨および／または軟骨を誘導し得る
ということが見出された。生物活性タンパク質をイオン
化放射線に曝すと、タンパク質を化学修飾および不活化
する結果となる事が知られているため、この発見は予想
外である。

【００４７】その最も広い局面で、本発明は、哺乳動物
に移植した場合、骨および／または軟骨生成を誘導す
る、哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイス
を提供する。このデバイスは（ａ）不溶性キャリアと生
物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて、骨原性デバ
イスを形成する工程、および次いで（ｂ）骨原性タンパ
ク質の生物活性を維持しながらデバイスを滅菌する条件
下で、工程（ａ）の組み合わせをイオン化放射線に曝露
する工程により製造される。得られた滅菌デバイスは最
終滅菌されているが、哺乳動物に移植後なお、骨および
／または軟骨形成を誘導し得ることを特徴とする。

【００４８】本明細書で用いられる「滅菌」という用語
は、骨原性デバイスと関連した実質的にすべての生存生
物、特に微生物、ウイルスおよび他の病原体を除去する
ための物理的または化学的手段のいずれかを用いる行動
または方法のことである。本明細書で使用される滅菌さ
れたデバイスとは、ＦＤＡ（ＦｅｄｅｒａｌＤｒｕｇ
Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）規格で測定して１０
^-6の滅菌保証レベルを達成したデバイスを含むことが意
図される。本明細書で使用する「最終滅菌」という用語
は、本発明のデバイスの制作における最終工程におい
て、不溶性キャリア材料が骨原性タンパク質と組み合わ
された後に滅菌される工程を言う。本明細書で使用され
る「イオン化放射線」という用語は、物（例えば本明細
書で意図される治療用デバイス）を通過するときに直接
イオン化を生じるに十分なエネルギーを有する粒子また
はフォトンを言う。

【００４９】本明細書で使用される「骨原性デバイス」
という用語は、哺乳動物に移植した場合、骨形成を誘導
する能力を有するいずれものデバイスを言う。本明細書
に記載するデバイスはまた、滑膜性連結環境中の肋軟骨
下骨表面のような哺乳動物の無血管部位に移植した場
合、関節軟骨形成を誘導する能力を有する。本明細書で
使用する「骨」という用語は、主としてヒドロキシアパ
タイト・コラーゲン（主にＩ型コラーゲン）の形の沈着
カルシウムおよびリン酸塩と、骨芽細胞、骨細胞および
溶骨細胞、ならびに真正軟骨性骨の内部で形成する骨髄
組織のような骨細胞との複合体を含む石灰化（鉱物化）
結合組織を言う。

【００５０】本明細書で使用される「軟骨」という用語
は、コラーゲンのフィブリル（主としてＩＩ型コラーゲ
ンと共に他の少数のタイプ、例えばＩＸ型およびＸＩ
型）、種々のプロテオグリカン（例えばコンドロイチン
硫酸、ケラタン硫酸およびデルマタン硫酸プロテオグリ
カン）、他のタンパク質および水を含む細胞外網目構造
に埋め込まれた軟骨細胞を含むタイプの結合組織を言
う。「関節軟骨」とはヒアリンまたは関節軟骨を言い、
連結部の骨の連結表面を覆い、骨と骨が直接接触しない
で連結部を可動とし、それにより向き合う骨の表面が摩
耗したり損傷したりするのを防止する無血管性の非鉱物
化組織である。最も正常で健康な関節軟骨は「ヒアリ
ン」と呼ばれ、すなわち、すりガラスのような外観特性
を有する。生理的条件下では、軟骨組織は下地の鉱物化
した骨の表面、肋軟骨下骨の上にあり、高度に血管化し
た小骨を含む。これらの高度に血管化した小骨は、拡散
し得る養分を上にかぶさる軟骨に提供し得るが、間葉幹
細胞には提供し得ない。

【００５１】本明細書で使用される「骨原性タンパク
質」という用語は、哺乳動物中に移植した場合、軟骨性
骨形成の結果生じる細胞事象の発達カスケードを生成し
得る任意のタンパク質を意味する。軟骨性骨分化中に生
じる発達カスケードは、間葉細胞の化学走性、原始細胞
の軟骨細胞および骨芽細胞への増殖、軟骨の分化、血管
侵襲、骨形成、再構築、および最終的に骨髄分化からな
ると理解される。結果的に軟骨性骨生成となる上記事象
カスケードを誘導し得る真正骨原性因子が、現在同定、
単離され、クローン化されている。天然にはジスルフィ
ド結合した２量体タンパク質として生じるこれらのタン
パク質は、当該分野で「骨原性」タンパク質、「骨誘導
性」タンパク質および「骨形態形成」タンパク質と呼ば
れている。骨原性タンパク質は、例えば、公知の骨形態
形成タンパク質および／または本明細書に記載のおよび
／または当該分野におけるその等価物のいずれかであり
得、そして天然起源材料、組換え材料、およびその他の
方法で製造された組織形態形成を誘導し得る任意の材料
を含む。本明細書で定義される骨原性タンパク質はま
た、適当なインビボ無血管位置に関節軟骨形成を誘導す
ることができる。

【００５２】本明細書で使用される「キャリア材料」
は、浸潤する細胞の付着、増殖および分化のための間隙
を有する材料を意味すると理解される。それはインビボ
で生分解性であり、生体適合性である。すなわち、移植
拒絶となり得る抗体刺激性を全く持たない。好ましく
は、キャリアは不溶性材料を含み、さらに移植したと
き、所望の置換骨または軟骨組織を実質的に模倣する形
状および寸法を有するように処方される。キャリアはさ
らに、置換される組織に対し特異的であり、かつ／また
は同じ組織型に由来する残部を含む。

【００５３】好ましい実施態様において、骨原性タンパ
ク質とキャリア材料との重量比は、約１：１〜約１：２
５０，０００（例えば約１ｍｇタンパク質：１ｍｇキャ
リア〜約４ｎｇタンパク質〜１ｍｇキャリア）の範囲以
内であり、最も好ましくは約１：４０〜約１：５０，０
００（例えば約２５μｇタンパク質：１ｍｇキャリア〜
約２０ｎｇタンパク質〜１ｍｇキャリア）の範囲であ
る。

【００５４】一つの実施態様において、イオン化放射線
は電子線である。別の実施態様において、ガンマ線がイ
オン化放射線の好ましい線源である。任意の従来のガン
マ線または電子線生成装置を本発明の実施に使用し得る
と期待される。さらに、イオン化放射線の好ましい照射
量は、約０．５〜約４．０メガラドの範囲内、最も好ま
しくは約２．０〜約３．５メガラドの範囲で提供される
が、それは本明細書に記載した装置に対してＦＤＡが要
請する滅菌保証レベルである１０^-6を達成するに十分な
照射量である。しかしながら、特定のデバイスに対し１
０^-6の滅菌保証レベルを得るに必要な照射量は、その開
示が本明細書中に参考として援用される１９９２年出版
の「ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＡｄｖ
ａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」で決められ得る。

【００５５】別の実施態様において、不溶性キャリア材
料はさらに粒子化し得る多孔性材料を含む。微孔は好ま
しくは、遊走原始細胞がマトリックス中に入り込み、続
いて分化および増殖ができるに十分な寸法を有する。あ
るいは、不溶性キャリア材料を、粒子状材料をインビボ
での意図された用途、例えば骨の欠損を接続するに適し
た形状に細密充填して加工することもできる。多孔性粒
子または充填粒子は、好ましくは約７０〜約８５０ミク
ロン以内の範囲、最も好ましくは約１２５〜約４５０ミ
クロンの範囲の粒径を有する。別の実施態様において、
キャリア材料は関節軟骨デバイスの一部として処方され
る。デバイスは、失活（ｄｅｖｉｔａｌｉｚｅｄ）軟骨
組織、または他の不活性の非鉱物化マトリックス材料お
よび骨原性タンパク質から形成することができ、次いで
そのデバイスをシート状に肋軟骨下骨表面に置く。ある
いは、処方したデバイスを粉砕し、または機械的に研磨
して、骨の表面に適用するために本明細書の記載通りに
ペーストまたはゲル状に処方し得る粒子を製造し得る。

【００５６】不溶性キャリア材料は、非タンパク質ベー
スポリマー、例えばポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコー
ル酸および／またはその混合物を含む合成ポリマー、お
よび／または一つ以上の天然起源分子、例えばヒドロキ
シアパタイト、リン酸三カルシウム、コラーゲンおよび
その混合物を含み得る。コラーゲンが、現在好ましいキ
ャリア材料である。当業者は、天然および／または合成
材料を賢明に選ぶことにより、所望のインビボ物理的お
よび化学的性質を有するポリマー材料を創製し得る。例
えば、自己由来コラーゲンは合成ポリマー（コポリマー
を含む）と混合されて、増強されたインビボ生分解速度
を有するマトリックスを製造し、かつ／または本発明の
デバイスを移植中により容易に操作できるようにする好
ましい操作性を改善することができる。例えば、粒子状
コラーゲン含有デバイスは、粒子をペースト状またはゲ
ル状物質に結合させる役割のある一つ以上の部品と組み
合わせられ得る。本発明で十分に特徴づけされる結合材
料には、例えば、カルボキシメチルセルロース、グリセ
ロール、ポリエチレングリコールなどが含まれる。ある
いは、デバイスは、所望の物理的特性を提供する合成マ
トリックス中に分散した骨原性タンパク質を含み得る。

【００５７】本発明の方法およびデバイスで有用な骨原
性タンパク質は、天然起源であろうが合成で調製されよ
うが、哺乳動物に移植したとき、接近可能な原始細胞の
召集（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を誘導し、その増殖を
刺激し、軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導し、さ
らに中間の軟骨、血管新生、骨新生、再構築、および最
終的には骨髄分化を誘導し得る。タンパク質はまた、適
当な局所環境に置かれた場合、肋軟骨下骨表面上に新し
い関節軟骨組織形成の誘導能を有する。

【００５８】好ましい骨原性タンパク質には、例えば、
ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ
−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはその機能的等価物
のホモまたはヘテロダイマーが含まれる。これらのタン
パク質は、当該分野では、ＴＧＦ−βスーパー遺伝子フ
ァミリーの「Ｖｇ／ｄｐｐ」タンパク質サブファミリー
の一員であると言われる。

【００５９】別の局面で、本発明は哺乳動物中に骨形成
および／または関節軟骨形成を誘導する方法を提供す
る。その方法は、（ａ）哺乳動物の予め選択された位置
に本発明の最終滅菌デバイスを移植する工程、および
（ｂ）デバイスに予め選択された位置に適当な組織形成
を誘導させる工程を包含する。

【００６０】別の局面で、本発明は哺乳動物に移植する
に適した最終滅菌骨原性デバイスを製造する一般的な手
順を提供する。その方法は、（ａ）生物活性骨原性タン
パク質を提供する工程；（ｂ）骨原性タンパク質を不溶
性キャリア材料と組み合わせる工程；および（ｃ）組み
合わせを、タンパク質の生物活性を維持しながら組み合
わせを最終滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露
する工程を包含する。そのプロセスは迅速、温和であ
り、従来の照射デバイスを用いて行われる。本発明は滅
菌プロセスとその方法で製造される滅菌された製品を意
図するものである。

【００６１】（発明の詳細な説明）イオン化放射線に曝
露することにより最終滅菌され、キャリア材料と組み合
わされた骨原性タンパク質を含む骨原性デバイスは、滅
菌後生物活性を維持し、哺乳動物に移植した場合、軟骨
性骨形成および／または軟骨形成の誘導能を有すること
が発見された。イオン化放射線はタンパク質構造を改変
し、それにより生物活性を破壊し得るので、その発見は
予想外である。

【００６２】本明細書に記載される一般的手順は、デバ
イスに組み込まれた骨原性タンパク質の生物活性を維持
しながら、骨原性デバイスの滅菌性を確実にする。その
手順には、不溶性キャリア材料と生物活性骨原性タンパ
ク質とを組み合わせる工程、および次いでこの組み合わ
せをイオン化放射線に曝露して最終滅菌し、それにより
哺乳動物に移植後、骨形成を誘導する滅菌デバイスを製
造する工程が含まれる。この方法は、様々な骨原性タン
パク質、キャリアマトリックス、およびそれらの処方物
に使用され得る。その方法はまた、インビボで無血管部
位に関節軟骨形成の誘導能を有するデバイスの製作に使
用し得る。

【００６３】インビボで骨および関節軟骨形性活性を有
する最終滅菌骨原性デバイスの調製、適切な骨原性タン
パク質、キャリア材料の性質および特性、タンパク質改
変を最小にする処理、最終滅菌を可能にする条件、およ
び本明細書中で請求された主題の製造法および使用法を
含む本発明の性質および有用性に関するその他の局面
は、以下の記載でさらに理解される。

【００６４】（Ｉ骨原性タンパク質）本明細書で定義
されるように、本発明の組成物および方法に有用な骨原
性タンパク質には、マトリックスと共に哺乳動物に移植
した場合、軟骨性骨活性を有し、「ＴＧＦ−β様」タン
パク質の「スーパーファミリー」のサブクラスを含む２
量体タンパク質のファミリーが含まれる。成熟した天然
型の天然起源骨原性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
測定して典型的には約３０〜６０ｋＤａの見かけの分子
量を有するグリコシル化２量体である。還元すると、３
０ｋＤａタンパク質は約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａの
見かけ分子量を有する、２個のグリコシル化ペプチドサ
ブユニットを生じる。還元状態では、タンパク質は検知
し得る骨原性活性を持たない。また骨原性活性を有する
非グリコシル化タンパク質２量体は、約２７ｋＤａの見
かけの分子量を有する。還元すると、２７ｋＤａタンパ
ク質は約１４ｋＤａ〜１６ｋＤａの分子量を有する２個
の非グリコシル化ポリペプチドを生じる。有用な配列に
は、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ起源）、Ｖｇｌ（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ起源）、Ｖｇｒ−１（マウス起源）、ＯＰ
−１およびＯＰ−２タンパク質（米国特許第５，０１
１，６９１号参照）、ならびにＢＭＰ２、ＢＭＰ３、Ｂ
ＭＰ４（ＷＯ８８／００２０５号、米国特許第５，０１
３，６４９号およびＷＯ９１／１８０９８号参照）、Ｂ
ＭＰ５およびＢＭＰ６（ＷＯ９０／１１３６６号、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９０／０１６３０）、ＢＭＰ８およびＢＭＰ９
と呼ばれるタンパク質のＣ末端１０２アミノ酸配列を含
むものが含まれる。

【００６５】タンパク質のこのファミリーの構成員は、
Ｃ末端領域に、保存された６個または７個のシステイン
の骨格を共有する。例えば、本明細書で「ＯＰＳ」と呼
ばれる６システイン骨格残基を定義する米国特許第５，
２６６，６８３号（その開示は本明細書中で参考として
援用される）中の配列番号１の残基３３５−４３１、ま
たはその中の配列番号１の残基３３０−４３１（７シス
テイン骨格を定義する１０２アミノ酸を含む）を参照の
こと。

【００６６】このタンパク質ファミリーには、所定のタ
ンパク質のより長い型、および系統発生型が含まれる。
系統発生型とは、例えば、種および対立遺伝子変異体お
よび生合成突然変異体のことである。これらは、保存さ
れたＣ末端システイン骨格を変更し得るような付加およ
び欠損突然変異体および変異体を含む。この改変によっ
て、タンパク質が、マトリックスと一緒に哺乳動物に移
植した場合、哺乳動物において骨形成を誘導できるコン
フォーメーションを有する２量体種をなお形成できるこ
とが前提になる。さらに、本発明のデバイスに有用な骨
原性タンパク質は、異なったグリコシル化パターンおよ
び異なったＮ末端を有する型を含み得る。骨原性タンパ
ク質は、天然起源であるか、または生合成的に誘導され
得、原核または真核宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現で
製造され得る。そのタンパク質は単一種、例えばホモ２
量体として、または混合種、例えばヘテロ２量体として
組み合わされて、活性である。

【００６７】一つの実施態様において、本明細書で意図
される骨原性タンパク質はＯＰ−１またはＯＰ−１関連
配列を包含する。有用なＯＰ−１配列は、米国特許第
５，０１１，６９１号、第５，０１８，７５３号および
第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋら、（１９
９０）ＥＭＢＯＪ．９：２０８５−２０９３；およ
びＳａｍｐａｔｈら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６００４
−６００８に詳しく述べられ、その開示は本明細書で参
考として援用される。ＯＰ−１関連配列には、異種ホモ
ログ、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ由来の６０Ａ（Ｗ
ｈａｒｔｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２１４−９２
１８）およびＣ末端７システインドメインでＯＰ−１と
６０％より高い同一性、好ましくは少なくとも６５％の
同一性を共有するタンパク質が含まれる。ＯＰ−１関連
配列の例には、ＯＰ−２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびそ
の種ホモログＶｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓら、（１９８９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：４５５４−４５５８；Ｃｅｌｅｓｔｅら、（１
９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８７：９８４３−９８４７；およびＰＣ
Ｔ国際出願ＷＯ９３／００４３２号；Ｏｚｋａｙｎａｋ
ら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７：１３１９８−１３２０５）が含まれる。当業者に理
解されるように、キメラ構築物は、新規配列を作出する
ために、異なる形態形成タンパク質配列の様々な部分を
組み合わせて、標準的な生物分子学および突然変異誘発
技術を用いて作出され得、これらの型のタンパク質も本
明細書で意図される。

【００６８】さらに別の好ましい局面では、骨原性的に
活性な２量体の一方または双方のポリペプチド鎖は、Ｏ
Ｐ−１の活性領域をコードする核酸配列に相補的なＤＮ
ＡまたはＲＮＡ配列に対し、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列
によってコードされる。本明細書で使用されるストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件とは、３７℃で
終夜４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液、および０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダ
イゼーション、および５０℃での０．１×ＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳ中での洗浄と定義される。

【００６９】上記アミノ酸配列およびＤＮＡ配列の情
報、当該分野の技術レベル、および骨原性タンパク質に
ついての数多くの刊行物（米国特許第５，０１１，６９
１号および公開ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１４６９号（１９
８９年１０月１９日公開）を含む）の開示が与えられる
と、本発明のデバイスに有用な骨原性タンパク質の少な
くとも活性ドメイン、およびその様々なアナログ（種お
よび対立遺伝子変異体および遺伝子操作された突然変異
を含む変異体を含む）、ならびに融合タンパク質、成熟
タンパク質の切形型、欠失および付加突然変異体、およ
び本発明のデバイスおよび方法に使用し得る類似の構造
体をコードする様々なＤＮＡが構築され得る。その上、
ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、これらのタ
ンパク質のいずれかの断片に由来し得るか、またはＯＰ
Ｓとして上記に定義された属配列から新たに設計され得
る。これらのプローブは次に本発明の補綴デバイスに有
用なさらなる骨原性タンパク質を同定するために、異な
るゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーンする
のに使用され得る。

【００７０】ＤＮＡは、ゲノムおよびｃＤＮＡ単離、合
成オリゴヌクレオチドからの合成ＤＮＡの構築、および
カセット突然変異誘発技術を含む周知のＤＮＡ操作技術
を用いて当業者によって製造し得る。１５〜１００マー
のオリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成装置で合成され得、
トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中でポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製され得る。次に
ＤＮＡは、ゲルから電気溶出され得る。重複オリゴマー
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、より大
きいブロック中にライゲートし得、これをＰＡＧＥで精
製し得る。

【００７１】次に適当に同定されたクローン由来のＤＮ
Ａを単離し、（好ましくは発現ベクター中に）サブクロ
ーンし、そして配列決定し得る。目的とする配列を含む
プラスミドを、次いでタンパク質発現およびさらなる特
性付けのために適当な宿主細胞中にトランスフェクトし
得る。宿主は原核または真核細胞で有り得るが、それは
前者がタンパク質をグリコシル化できないことが、タン
パク質の形態形成活性を破壊しないためである。有用な
宿主細胞にはＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、昆虫、バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細
胞、ＣＨＯ細胞および様々な他の哺乳動物細胞が含まれ
る。ベクターはさらに、転写プロモーターおよび終結配
列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配
列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、タンパク質分泌の
ための好ましいシグナル配列などを含む、組換えタンパ
ク質の正しい発現を促進する様々な配列をコードし得
る。

【００７２】目的とする遺伝子をコードするＤＮＡ配列
はまた、潜在的に阻害する配列を除去し、または望まし
くない２次構造の形成を最小にするように操作され得
る。組換え骨原性タンパク質はまた、融合タンパク質と
して発現され得る。翻訳された後、タンパク質は細胞そ
のものから精製され得るか、または培地から回収され得
る。生物活性タンパク質形態はすべて、ジスルフィド結
合によって接合されるか、または他の方法で会合される
２量体種を含むが、それらは適当な真核細胞内または個
々のサブユニットの発現後インビトロで、１種以上の様
々な組換えポリペプチド鎖を折りたたみ、酸化して製造
される。Ｅ．ｃｏｌｉおよび様々な異なった哺乳動物
細胞中で組換えＤＮＡから発現される骨原性タンパク質
の詳細な記載は、米国特許第５，２６６，６８３号に開
示されている。

【００７３】あるいは、骨原性ポリペプチド鎖は、当業
者に周知の従来のペプチド合成技術を用いて化学的に合
成され得る。例えば、タンパク質は、固相ペプチド合成
装置上で、標準操作手順を用いて完全な状態（ｉｎｔａ
ｃｔ）でまたは部分的に合成し得る。次いで、出来上が
った鎖を脱保護し、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフ
ィー）で精製する。タンパク質が部分的に合成された場
合、その部分を標準の方法を用いてペプチド結合し完全
なタンパク質を形成し得る。一般的に、骨原性タンパク
質を製造する方法は従来法であり、本発明の一部を構成
しない。

【００７４】（ＩＩ．キャリアマトリックス材料）（Ａ．マトリックスの一般的な考察）当業者に明らか
なように、マトリックスが細胞を浸潤および増殖させる
ための足場として作用するのに十分な３次元構造を有
し、インビボで生体吸収性で生体適合性があるならば、
本明細書で開示されるマトリックスについて使用される
基材それ自体の正確な性質は、新しい骨または関節軟骨
組織形成を誘導するためのデバイスの究極の能力の決定
因子ではない。本発明では、基材は、その上で骨原性タ
ンパク質により媒介されるある種の細胞事象が生じ得る
足場の役割を果たす。骨原性タンパク質に対する特異的
応答は、究極的には移植部位での内因性ミクロ環境およ
び応答する細胞の発達能で指令される。また当業者に明
らかなように、本明細書で開示されるマトリックスに利
用される基材の正確な選択は、部分的には、修復すべき
欠陥の型、欠陥部位での血管新生の程度のような解剖学
的考察などに依存する。

【００７５】マトリックスの形状、粒子サイズ、表面電
荷の存在、および多孔度（細胞浸潤間隙）はすべて、マ
トリックスの性能が良好であるために重要である。マト
リックスを、形成すべき新しい骨または関節軟骨組織の
所望の形に成形することが好ましい。ラットでの研究
は、新しい骨は移植されたデバイスの寸法を本質的に有
して形成されることを示す。

【００７６】マトリックスは、例えばコラーゲンで緩く
接着した粒子状材料から構成される形状保持固体を包含
し得る。それはまた、成形した多孔性固体、または周囲
組織により所定位置に保持された単なる細密充填粒子の
凝集も包含し得る。マトリックスはさらに、浸潤する細
胞の付着および増殖を可能にするに十分な間隙を有す
る、不溶性の非粒子状固体も包含し得る。特に本明細書
の記載通りに調製される場合、破壊された（ｍａｓｔｉ
ｃａｔｅｄ）筋肉または失活した生物学的に不活性な組
織が使用され得る。その骨髄腔を浄化し、そこにキャリ
アおよび分散された骨原性タンパク質を充填した場合、
大きな同種異系骨インプラントもマトリックス用キャリ
アとして作用し得る。あるいは、骨インプラントがそれ
自体キャリアとして作用し得、そのような場合、骨原性
タンパク質は骨インプラントの表面上に直接被覆され得
る。

【００７７】骨原性デバイスを処方して哺乳動物中に新
規な骨組織を形成する場合、現在好ましいマトリックス
材料は、本明細書の記載通りに処理した、失活し鉱物除
去した異種骨組織である。処方したデバイスは、多様な
臨床環境に有用な移植可能材料となる。様々な整形外科
法、歯周療法術および再構築法における骨形成用マトリ
ックスとしての用途に加えて、マトリックスはまた、持
続放出キャリア、またはインプラントのコラーゲン性被
覆としても使用され得る。マトリックスは、手術に前も
って所望のように成形され得るか、または手術中に医者
または技術者により成形され得る。従って、材料は、局
所、皮下、腹腔内、または筋肉内インプラントのために
使用され得、非癒着性の骨折を繋ぎ合わせ、または骨欠
陥を埋めるように成形され得る。

【００７８】（Ｂ．天然起源マトリックス）適切な同
種異系または異種マトリックスは、本明細書で以下に説
明するように、当該分野で周知の方法を用いて作製され
得る。特定すると、その方法は、組織の細胞非構造性成
分を、組織を失活させるように抽出するように設計され
る。得られた材料は、細胞により浸潤され得る間隙を規
定し、かつ非構造性関連成分が涸渇されている細胞マト
リックスを含む。

【００７９】非鉱化組織を失活させる現在好ましい方法
は、組織を固定する当該分野で使用される方法論に従
う。組織を、組織に含有する水をエタノールと実質的に
置換し、組織の細胞構造を破壊するに十分な時間、非極
性溶剤（例えば、９５％エタノール）に曝す。典型的に
は、約４〜４０℃の範囲の温度で組織を２００プルーフ
エタノールに数日曝すが、この際、溶液を新しいエタノ
ールと、組織の液体含有量が７０〜９０％エタノールを
含むような時間まで、６〜１２時間おきに取り替えるよ
う注意する。典型的には３〜４日の処理が適当である。
加える液体の容積は、組織を浸すに十分な量より多くな
ければならない。処理した組織を次いで凍結乾燥する。
得られた乾燥マトリックスは非構造成分が実質的に涸渇
されているが、組織に由来する細胞内および細胞外の両
マトリックス成分を保持している。

【００８０】処理した同種異系または異種マトリックス
は、哺乳動物中に新しい骨または関節軟骨を形成するた
めのデバイスを作製するために特に有用であると想起さ
れる。骨原性デバイスは、同種異系移植修復を増強する
ために、同種異系骨から処方され得る。失活した同種異
系または異種キャリア材料はまた、骨原性タンパク質と
組み合わせて、大きな骨欠陥のための構造支持体を提供
する固形の再吸収可能なマトリックスを提供し得る。同
様に、同種異系関節軟骨デバイスは、失活させた軟骨組
織、またはその他の不活性な非鉱化マトリックス材料お
よび骨原性タンパク質から形成され得、そのデバイスは
シートとして肋軟骨下骨表面上に置かれ得る。あるい
は、処方されたデバイスは、粉砕または機械的に研磨さ
れて、骨表面に適用するために本明細書の記載通りにペ
ーストまたはゲルに処方され得る粒子を生じ得る。

【００８１】（Ｃ．骨由来マトリックス）以下は、鉱
化組織、特に同種異系または異種骨組織から適当なマト
リックスを作製する現在の好ましい方法を提供する。

【００８２】（Ｃ．１鉱物除去骨マトリックス）鉱物
除去骨マトリックス、好ましくはウシ骨マトリックス
は、既に公開されている方法により調製される（Ｓａｍ
ｐａｔｈら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：６５９１−６
５９５）。ウシ骨幹骨を地方の屠殺場から得、採取した
ばかりで用いる。骨は、筋肉と脂肪とを除去し、骨膜を
取り除き、加圧冷水で骨髄除去し、冷無水エタノールに
浸し、−２０℃で貯蔵する。次いで、それらを乾燥し、
粉砕により破断し、そして大型のミルで粉末化する。液
体窒素を用いて加熱を防ぐように注意する。粉末化した
骨を７０〜８５０μｍ、好ましくは１５０〜４２０μｍ
の粒子サイズに製粉し、３容量のクロロホルム：メタノ
ール（３：１）で約２時間の洗浄を２回行って脱脂す
る。次いで、粒子状骨を、１容量の無水アルコールで洗
浄し、１容量の無水エーテルで乾燥し、脱脂骨粉を生じ
る。脱脂骨粉を次いで、４℃で４０分間、１０容量の
０．５ＮＨＣｌを用いた連続した４回の処理により鉱
物除去する。最後に、大量の水を用いる洗浄により、鉱
物除去骨粉を中和する。

【００８３】（Ｃ．２グアニジン抽出）このように調
製した鉱物除去骨マトリックスを、４℃で１６時間、５
容量の４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７．０で抽出する。懸濁液を濾過する。不
溶物を集め、マトリックスの調製に使用した。得られる
材料は、天然にはほとんどコラーゲン性であり、骨形成
活性または軟骨形成活性を有していない。

【００８４】（Ｃ．３マトリックス処理）全ての骨マ
トリックスの主要成分は、Ｉ型コラーゲンである。コラ
ーゲンに加えて、上述のように抽出した鉱物除去骨は、
その容積当たり５％を占める非コラーゲン性タンパク質
を含んでいる。異種マトリックスでは、これらの非コラ
ーゲン性成分は、強い抗原となり得、そして免疫原およ
び／または阻害成分になり得る。これらの成分はまた、
骨分化の発達カスケードを干渉することにより、同種異
系インプラントにおける骨形成を阻害し得る。コラーゲ
ンフィブリル改変剤でのマトリックス粒子の処理は、マ
トリックスから望ましくない可能性のある成分を引き出
し、そしてマトリックス材料の表面構成を改変する。有
用な薬剤は、酸、有機溶媒、または加熱水性媒体を含
む。種々の処理を以下に記載する。鉱物除去されグアニ
ジン抽出された骨コラーゲン粒子においてこれらのフィ
ブリル改変剤が有する影響の詳細な物理的分析は、同時
係属中の米国特許出願第４８３，９１３号（１９９０年
２月２２日出願）に開示されている。

【００８５】フィブリル改変剤との接触後、処理された
マトリックスを洗浄し、いかなる抽出成分をも除去す
る。簡潔には、マトリックスをＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化
生理食塩水）１ｇ／２００ｍｌ中に懸濁し、４℃で２時
間撹拌する；または６Ｍ尿素、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０（ＵＴＢＳ）
中で、室温で（ＲＴ）３０分間（ｐＨを中和するのに十
分な時間）撹拌する。材料を遠心分離により採集し、上
述の条件を用いて再洗浄し、遠心分離により再採集す
る。得られた材料を水で洗浄し、次いで凍結乾燥する。

【００８６】（Ｃ．３．１．酸処理）（Ｃ．３．１ａ．トリフルオロ酢酸）トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）は、非酸化性の強酸で、これは、タンパク
質に対する公知の膨潤剤であって、コラーゲンフィブリ
ルを改変する。上述のようにして調製されたウシ骨残渣
を篩にかけ、適切なサイズの粒子を集める。これらの粒
子を種々の比率（１．０％〜１００％）のトリフルオロ
酢酸および水（ｖ／ｖ）で、０℃または室温で１〜２時
間、絶えず撹拌しながら抽出する。処理されたマトリッ
クスを濾過し、凍結乾燥し、または水／塩で洗浄し、次
いで凍結乾燥する。

【００８７】（Ｃ．３．１ｂ．フッ化水素）トリフル
オロ酢酸と同様に、フッ化水素（ＨＦ）は強酸であり、
かつ膨張剤であり、そしてこれはまた、粒子内表面構造
を改変し得る。フッ化水素はまた、公知の脱グリコシル
化剤である。このように、フッ化水素は、これらのマト
リックスの骨形成活性を、グアニジン抽出後もなおこれ
らのマトリックスに結合したいずれもの糖タンパク質の
抗原性炭水化物含有物を除去することにより増大するよ
うに機能し得る。

【００８８】上述のようにして調製したウシ骨残渣を篩
にかけ、そして適切なサイズの粒子を集める。試料をＰ
₂Ｏ₅上で真空乾燥させ、反応容器に移し、そして−７０
℃で試料上で蒸留することにより無水フッ化水素（１０
〜２０ｍｌ／ｇマトリックス）に曝す。この容器を０℃
にまで温めさせ、次いで反応混合物をこの温度で１２０
分間撹拌する。真空でのフッ化水素のエパポレーション
後、残渣を真空でＫＯＨペレット上で完全に乾燥し、い
かなる微量の酸をも除去する。脱グリコシル化の程度
は、非共有結合により結合している炭水化物を除去する
ために適切に試料を洗浄した後、フッ化水素で処理する
前および後に採取したマトリックス試料の炭水化物分析
から決定され得る。ＨＦ処理材料からのＳＤＳ抽出タン
パク質は、ＣｏｎＡブロッティングにより決定されるよ
うに、炭水化物反応に対して陰性である。次いで、脱グ
リコシル化骨マトリックスを、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化
生理食塩水）またはＵＴＢＳ中で２回洗浄し、次いで水
で洗浄し、次いで凍結乾燥する。しかし、他の酸処理も
また、ＨＦおよびＴＦＡに加えて想起される。

【００８９】（Ｃ．３．２溶媒処理）（Ｃ．３．２ａ．ジクロロメタン）ジクロロメタン
（ＤＣＭ）は、タンパク質をその一次構造に影響を与え
ることなく変性し得る有機溶媒である。この膨潤剤は、
自動ペプチド合成における一般試薬であり、成分を除去
する洗浄工程において一般に用いられる。上述のように
調製されたウシ骨残渣を篩にかけ、そして適切なサイズ
の粒子を１００％ＤＣＭ、または好ましくは９９．９％
ＤＣＭ／０．１％ＴＦＡ中でインキュベートする。マト
リックスを膨潤剤と、０℃または室温で１〜２時間イン
キュベートする。あるいは、マトリックスをインキュベ
ートせずに短時間の洗浄（各回２０分）で、少なくとも
３回上記薬剤で処理する。

【００９０】（Ｃ．３．２ｂ．アセトニトリル）アセ
トニトリル（ＡＣＮ）は、タンパク質をその一次構造に
影響を与えることなく変性し得る有機溶媒である。これ
は、高速液体クロマトグラフィーで用いられる一般試薬
であり、疎水性相互作用を妨害することによりシリカベ
ースカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる。
上述のように調製した適切なサイズのウシ骨残渣粒子を
１００％ＡＣＮ（１．０ｇ／３０ｍｌ）、または好まし
くは９９．９％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで、室温で１〜
２時間、絶えず撹拌しながら処理する。処理されたマト
リックスを、次いで、水、尿素緩衝液、または４ＭＮａ
Ｃｌで洗浄し、次いで凍結乾燥する。あるいは、ＡＣＮ
またはＡＣＮ／ＴＦＡ処理マトリックスを洗浄せずに凍
結乾燥し得る。

【００９１】（Ｃ．３．２ｃ．イソプロパノール）イ
ソプロパノールもまた、タンパク質をその一次構造に影
響を与えることなく変性し得る有機溶媒である。これ
は、シリカＨＰＬＣカラムからタンパク質を溶出するの
に用いられる一般試薬である。上述のように調製した適
切なサイズのウシ骨残渣粒子を１００％イソプロパノー
ル（１．０ｇ／３０ｍｌ）、または好ましくは０．１％
ＴＦＡの存在下で、室温で１〜２時間、絶えず撹拌し
ながら処理する。次いで、マトリックスを、凍結乾燥す
る前に水、尿素緩衝液、または４ＭＮａＣｌで洗浄す
る。

【００９２】（Ｃ．３．２ｄ．クロロホルム）クロロ
ホルムもまた、上述の試薬と同様に、ウシマトリックス
の表面領域を増大させるために、そのまままたは酸性化
した後のいずれかで用いられる。上述のような処理は、
移植前に材料に病原体がないことを確実にするために有
効である。

【００９３】（Ｃ．３．３熱処理）現在最も好ましい
薬剤は、水のような加熱された水性フィブリル改変媒体
であり、マトリックス粒子の表面積および多孔度を増大
させる。現在最も好ましい水性媒体は、ｐＨが約４．５
未満（例えば、約ｐＨ２．０〜ｐＨ４．０の範囲内；加
熱前にコラーゲンの「膨潤」を助長し得る）である酸性
水性媒体である。０．１％の酢酸（約３のｐＨを有す
る）が現在最も好ましい。０．１Ｍ酢酸もまた用いられ
得る。

【００９４】種々の量の脱脂鉱物除去グアニジン抽出骨
コラーゲンを、水ジャケットを有するガラスフラスコ内
で絶えず撹拌しながら水性媒体（１ｇマトリックス／３
０ｍｌ水性媒体）中で加熱し、所定の温度で所定の時間
の間、維持する。好ましい処理時間は約１時間である
が、約０．５〜２時間の間の曝露時間が許容できるよう
である。用いられる温度は、約３７℃〜６５℃の範囲内
の温度で一定に保つ。現在好ましい熱処理温度は、約４
５℃〜６５℃の範囲内である。

【００９５】熱処理後、マトリックスを濾過し、洗浄
し、凍結乾燥し、そしてインプラントのために用いる。
酸性水性媒体を用いる場合、マトリックスはまた、好ま
しくは、洗浄および凍結乾燥の前に中和する。現在好ま
しい中和緩衝液は、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０である。マトリックスを中和するため
に、マトリックスは、好ましくは、温度処理の後にまず
冷却させ、次いで酸性水性媒体（例えば、０．１％酢
酸）を除去し、中和緩衝液と取り替え、そしてマトリッ
クスを約３０分間撹拌する。次いで、中和緩衝液を除去
し、マトリックスを洗浄し、凍結乾燥し得る。

【００９６】マトリックスはまた、汚染重金属を除去す
るように処理され得る。これは、例えば、マトリックス
を金属イオンキレート化剤に曝すことによる。例えば、
０．１％酢酸での温度処理の後、マトリックスを、エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウムを含有する
中和緩衝液（例えば、２００ｍＭリン酸ナトリウム、５
ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で中和し得る。５ｍＭ
ＥＤＴＡは、約１００倍モル過剰のキレート化剤を、
これまでに試験した最も汚染されたマトリックスに存在
する残留重金属に提供する。中和後の続くマトリックス
洗浄は、ＥＤＴＡの大半を取り除くようである。マトリ
ックス粒子のＥＤＴＡ処理は、試験した全ての金属（Ｓ
ｂ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｂ、Ｈ
ｇ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ａｇ、Ｚｎ、Ｔｌ）の残留重金属含有
量を約１ｐｐｍ未満に減少させる。ＥＤＴＡ処理マトリ
ックスでのバイオアッセイは、金属イオンキレート化剤
での処理が骨誘導活性を阻害しないことを示す。

【００９７】コラーゲンマトリックス材料は、好ましく
は、水に不溶で、非接着性粒子を含む微粉の形態をとり
得る。これはまた、新規な骨成長または持続放出が望ま
しい場合、周囲組織により所定位置に保持される体積内
に単に詰め込むことにより用いられ得る。あるいは、こ
の粉末は、体によって容易に吸収される、例えばゼラチ
ンまたはポリ乳酸コーティングにおいてカプセル化され
得る。粉末は、例えば、可溶性種生体適合性コラーゲン
を用いて粒子を粒子間接着することにより、所定の体積
に成形されて、その形で保持され得る。材料はまた、シ
ート状、棒状、ビーズ状、または他の巨視的形状（ｍａ
ｃｒｏｓｃｏｐｉｃｓｈａｐｅ）でも製造され得る。

【００９８】（Ｄ．合成マトリックス）天然起源マト
リックスの代替として、または天然起源マトリックスと
組み合わせて使用する補助材として、適切なマトリック
スはまた、所望の置換組織の寸法に合うように形成また
は成形され得る３次元足場構造を作出する役割をする一
つ以上の材料を用いて、新規に処方され得る。好ましく
は、マトリックスは、誘導される組織と同じ組織型由来
の、および／またはその特性を有する、またはそれに特
異的な残基も包含する。ある場合は、肋軟骨下骨表面上
に関節軟骨を形成する場合と同じく、浸潤した細胞を付
着させるに十分な３次元足場構造を規定し、そして非鉱
化材料で構成されるマトリックスと組み合わせた骨原性
タンパク質が、十分で有り得る。コラーゲン；グリコー
ル酸、乳酸および酪酸のホモポリマーまたはコポリマー
（それらの誘導体を含む）；およびセラミックス（例え
ば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよび
他のリン酸カルシウムおよびそれらの組み合わせ）を
（制限なしに）含む材料の任意の一つまたは組み合わせ
が、有利に使用され得る。

【００９９】合成マトリックスの組織特異性成分は、上
記のように同種異系または異種組織を失活させて、次い
で残りの不溶性マトリックスを粉砕または機械的に破砕
することにより容易に得られ得る。この粒子状材料は、
次に本明細書中に記載のものを含む、一つ以上の構造材
料と組み合わせられ得る。あるいは、組織特異性成分
は、当該分野で十分に特徴づけされている標準抽出法を
用いて、処理マトリックスからさらに精製され得、そし
て標準分析法を用いて、各精製工程で抽出された材料は
その組織特異性能について試験され得る。典型的な組織
抽出プロトコルについては、例えばＳａｍｐａｔｈら、
（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７８：７５９９−７６０３および米国特許第
４，９６８，５９０号（その開示は本明細書で参考とし
て援用される）参照。

【０１００】例えば、置換関節軟骨が、例えば、組織の
裂け目または局部表皮欠陥を補修するために、または年
齢、疾病または外傷のために現在消耗された関節軟骨表
面の高さを増すために現存の接合部で所望される場合、
合成マトリックスが望ましいとされ得る。このような関
節軟骨層の「表面再生」は、一つの実施態様では、本明
細書の記載通りに同種異系または異種関節軟骨組織のシ
ートを処理し、得られたマトリックスを骨原性タンパク
質で被覆し、処方されたデバイスをそれが標準正像手術
技法（ｏｒｔｈｏｓｃｏｐｉｃｓｕｒｇｉｃａｌｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いて接合部に導入されるよう
に巻き上げ（ｒｏｌｌｉｎｇｕｐ）、その部位に提供
されれば、関節骨表面上の層としてそのデバイスを広げ
る（ｕｎｒｏｌｌｉｎｇ）ことにより、本発明の方法お
よび組成物を用いて行い得る。

【０１０１】別の実施態様では、デバイスは、ペースト
または接合部の関節骨表面上に、標準正像手術法を用い
て注入できる注入可能なゲル状物質として処方される。
この実施態様では、処方は、マトリックスおよび骨原性
タンパク質の両方、ならびに粒子をペースト状またはゲ
ル状物質中に結合させる役割をする一つ以上の組成物を
含む、粉砕されたまたは他に機械的に破砕されたデバイ
スを含み得る。当該分野で十分に特徴づけされた結合材
料には、例えば、カルボキシメチルセルロース、グリセ
ロール、ポリエチレングリコールなどが含まれる。ある
いは、デバイスは、所望の物理的特性を提供する合成マ
トリックス中に分散した骨原性タンパク質を含み得る。

【０１０２】例えば、軟骨または骨に対し組織特異性を
有する合成マトリックスは、ＷＯ９１／１８５５８号
（１９９１年１２月２１日公開）に記載されている。簡
単に言えば、マトリックスは、生体適合性生分解性コラ
ーゲンおよび組織特異性細胞付着因子としての適当な組
織特異性グリコサミノグリカンの多孔性架橋構造ポリマ
ーを含む。多数の供給源に由来するコラーゲンが使用さ
れ得、これらは、不溶性コラーゲン、酸可溶コラーゲ
ン、中性または塩基性水溶液に可溶なコラーゲン、なら
びに市販のそれらのコラーゲンを含む。

【０１０３】グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはム
コ多糖は、組織特異性分布を有する動物起源のヘキソサ
ミン含有多糖であり、従ってモルフォゲン刺激分化細胞
の組織特異性決定を援助するために用いられ得る。ＧＡ
Ｇとの反応はまた、他の価値のある特性を有する、すな
わち動物ホストからの免疫反応（異物反応）を誘発しな
いコラーゲンを提供する。

【０１０４】化学的には、ＧＡＧは、グリコシド結合を
し、ヘキソウロン酸またはヘキソース部分のいずれかと
多少とも規則的に繰り返すヘキソサミン残基でなる（例
えば、Ｄｏｄｇｓｏｎら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｔｓＤｉｓｏｒ
ｄｅｒｓ」；Ｄｉｃｋｅｎｓら編集、ｖｏｌ．１、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９６８）を参照）。有用
なＧＡＧには、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫
酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−
硫酸、デルマタン硫酸およびケラチン硫酸が含まれる。
他のＧＡＧもまた本明細書に記載のマトリックスの形成
のために使用され得、当業者は日常的に行われる以上の
実験を用いなくても他の適切なＧＡＧを知っているか、
または確認することが可能である。ムコ多糖のより詳細
な記述に関しては、Ａｓｐｉｎａｌｌ、「Ｐｏｌｙｓａ
ｃｃｈａｒｉｄｅｓ」、ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓ
ｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９７０）参照のこと。

【０１０５】コラーゲンは酸性水溶液中好ましくは希酢
酸溶液中でＧＡＧと反応し得る。コラーゲン水性分散液
中にＧＡＧを滴下することにより、ＧＡＧで被覆された
絡み合ったコラーゲンフィブリルの共沈殿が得られる。
次いで、この絡み合った繊維の塊を微細線維の均一な分
散液を形成するようにホモジェナイズし、次いで濾過、
乾燥し得る。

【０１０６】コラーゲン − ＧＡＧ生成物の不溶性
は、これらの材料を共有結合架橋することにより、所望
の程度に生じさせ得、このことはまた、これらの材料の
再吸収に対する抵抗性を生じる役目を果たす。一般に
は、コラーゲンを架橋するに適した任意の共有結合架橋
法がこれらの複合材料を架橋するにも適切であるが、熱
脱水法による架橋が好ましい。

【０１０７】乾燥時には、架橋粒子は、約５００μｍの
直径を有する本質的に球状である。走査型電子顕微鏡で
は、表面に約２０μｍ、内部に４０μｍの微孔が見られ
る。内部は繊維状およびシート状の双方でできており、
細胞付着表面を提供する。空孔は相互に繋がり、粒子の
内部まで細胞が接近できる。材料はほぼ９９．５％の空
孔体積を有するようであり、このことは、材料を、ミク
ロキャリアの１グラム当たりに生育し得る潜在的な細胞
量に関して非常に効率のよいものとしている。

【０１０８】他の有用な合成マトリックスは、グリコー
ル酸、乳酸および／または酪酸でなるポリマーのような
生体適合性のインビボ生分解性合成ポリマー（コポリマ
ーおよびその誘導体を含む）から処方されたマトリック
スである。これらのポリマーは、当該分野で十分に記載
され、市販されている。例えば、ポリ−Ｄ，Ｌラクチ
ド：グリコリドの５０：５０混合物がＢｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ（例えばＲＧ５０３、ＲＧ５
０６、ＲＧ５０２ＨおよびＲＧ５０３Ｈ）およびＢｉｒ
ｍｉｎｇｈａｍＰｏｌｙｍｅｒｓ（例えばＬａｃｔｅ
ｌ）から市販されている。さらに８０％ポリラクチド／
２％グリコシドまたはポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含む
ポリマーがＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．より購入
され得る。ポリマー組成物は一般に球状形態で得られ、
骨原性デバイスは好ましくは有機溶剤と組み合わせて
（例えばエタノール−トリフルオロ酢酸溶液（ＥｔＯＨ
／ＴＦＡ）中で）、水性条件下で製造される。さらに、
特定のポリマー組成物のモルフォロジーを、例えば多孔
性を増すように、当該分野で公知の多数の特定の溶剤処
理のいずれかを用いて変化させ得る。

【０１０９】（ＩＩＩ．骨原性デバイスの製造）上記
の天然起源タンパク質および組換えタンパク質、ならび
に他の構造体は、本明細書および／または米国特許第
５，２６６，６８３号（その開示は本明細書中で参考と
して援用される）記載の方法のいずれかを用いて、適切
なマトリックス調製物中に組み合わせて分散させ得る。

【０１１０】典型的には、骨原性タンパク質を適切な溶
剤中に溶解し、マトリックスと組み合わせる。成分を会
合させる。典型的には、組み合わせた材料を次に凍結乾
燥し、その結果、骨原性タンパク質がマトリックスの表
面の上に配置されるか、またはそこに吸着される。有用
な可溶化溶剤には、エタノール／トリフルオロ酢酸溶液
（例えば４７．５％ＥｔＯＨ／０．０１％ＴＦＡ）；ア
セトニトリル／ＴＦＡ溶液；エタノール；含水エタノー
ル；または水性緩衝液が含まれるが、それに限定されな
い。酸性緩衝液中の処方物は、ＯＰ−１のマトリックス
表面上への吸着を容易にし得る。本発明のデバイスにと
って、有用な処方プロトコルは、エタノール／ＴＦＡ溶
液中（例えば３０〜５０％ＥｔＯＨ／０．０１〜０．１
％ＴＦＡ）でのマトリックスおよび骨原性タンパク質の
２４時間のインキュベーション後、凍結乾燥することで
ある。この手順は、７０〜９０％のタンパク質をマトリ
ックス表面上に吸着または沈殿させるに十分である。

【０１１１】使用される骨原性タンパク質の量は、使用
するデバイスの大きさ、および骨原性タンパク質の比活
性に依存する。大きなインプラントにはより多量が使用
され得る。大きな骨欠陥についての臨床処方物は現在、
コラーゲンマトリックス１ｇあたり約２．５ｍｇの骨原
性タンパク質を含む。

【０１１２】（１．エタノールトリフルオロ酢酸凍結
乾燥）この手順では、骨原性タンパク質をエタノールト
リフルオロ酢酸溶液（４７．５％ＥｔＯＨ／０．０１
％ＴＨＦ）中に可溶化し、キャリア材料に加える。スラ
リー（ｆｌｕｒｒｙ）を混合し、次いで凍結乾燥する。
この方法が現在のところ好ましい。

【０１１３】（２．アセトニトリルトリフルオロ酢酸
凍結乾燥）これは、アセトニトリル−トリフルオロ酢酸
（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液を用いて骨原性タンパク質を可
溶化し、次いでキャリア材料に加える上記手順の変法で
ある。試料を多数回激しく攪拌し、次に凍結乾燥する。

【０１１４】（３．エタノール沈殿）マトリックスを
グアニジン−ＨＣｌに溶解した骨原性タンパク質に加え
る。試料を攪拌し、低温（例えば４℃）でインキュベー
トし、再攪拌する。冷無水エタノール（５容量）を混合
物に加え、次いで攪拌し、好ましくは２０℃で３０分間
インキュベートする。遠心分離後（マイクロフュージ、
高速）、上清をデカントする。再構成マトリックスを冷
濃縮含水エタノール（８５％ＥｔＯＨ）で２回洗浄し、
次いで凍結乾燥する。

【０１１５】（４．尿素凍結乾燥）尿素緩衝液中で調
製されるこれらの骨原性タンパク質では、タンパク質を
マトリックス材料と混合し、多数回攪拌し、次いで凍結
乾燥する。凍結乾燥材料は「そのまま」、インプラント
用に使用し得る。

【０１１６】（５．緩衝液凍結乾燥）生理学的緩衝液
中の骨原性タンパク質調製物も、マトリックスと攪拌
し、凍結乾燥して、骨原性活性処方物を生成し得る。

【０１１７】さらに、本明細書記載の手順は、持続放出
目的のため、他の活性治療薬、ホルモンおよび様々な生
物活性種をマトリックスに吸着させるために使用し得
る。例えば、骨原性タンパク質に加えて、種々の成長因
子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗生物質、または
その他の生物活性薬剤もまた、基材上に吸着され得る
か、または内部に含浸され得、移植されてマトリックス
が徐々に吸収されるとき、経時的に放出され得る。従っ
て、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−αお
よびＴＧＦ−βのような種々の既知の成長因子がインビ
ボで放出され得る。マトリックスはまた、化学療法剤、
インスリン、酵素、酵素阻害剤、または走化−化学誘引
因子を放出させるためにも使用され得る。

【０１１８】（ＩＶ．滅菌）処方に続いて、得られた
骨原性デバイスをイオン化放射線に曝露して、例えば電
子線またはガンマ線に曝露して滅菌する。デバイスに関
連した酸素原子から高エネルギー酸素イオンおよびラジ
カルが発生し得るので、照射前に残存空気をデバイスか
ら除去しなければならない。

【０１１９】任意の形態のパッケージングが、そのパッ
ケージングが滅菌法および貯蔵条件下での滅菌性の維持
に適合性があるならば、本発明の骨原性デバイスを保持
するために使用され得る。好ましくは、本発明のデバイ
スをパッケージするために止め栓付きバイアルが使用さ
れる。

【０１２０】滅菌は、デバイスをバイアルに密封した
後、常法で行われる。現在好ましいアプローチでは、密
封前に真空によってバイアルから空気を排気する。しか
しながら、さらなる予防策として、密封前に排気バイア
ルに不活性ガス（例えばヘリウム、ネオン、アルゴン、
または窒素）を満たし得る。あるいは、バイアルは、密
封前に不活性ガスで単にパージされ得る。

【０１２１】密封したデバイスを続いて、例えば電子線
またはガンマ線照射に曝露して最終滅菌する。デバイス
を製造中に、例えば製造プロセス中の集中ライン工程
（ｉｎｔｅｇｒａｌｉｎｌｉｎｅｓｔｅｐ）として
滅菌し得るか、またはあるいは、デバイスを製造後、照
射のために商用滅菌サービス（例えばＩｓｏｍｅｄｉｘ
（Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏ、ＭＡ）またはＲＴＩ−Ｐｒｏｃ
ｅｓｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋａｗａｙ、Ｎ
Ｊ））へ送付し得る。

【０１２２】本発明のデバイスは、典型的には、バイオ
メカニカルデバイスの滅菌についてＦｅｄｅｒａｌＤ
ｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより要請され
るように、約１０^-6の滅菌保証レベルを提供するに十分
な線量で照射される。特定のデバイスを滅菌するに必要
な実際の線量は、参考テキスト「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏ
ｎｆｏｒｔｈｅＡｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｏｆ
ＭｅｄｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＧ
ｕｉｄｌｉｎｅｓ」（１９９２年出版）を参照して容易
に決定され得る。その中には、デバイスの特定の生物負
荷のための所定の滅菌保証レベルを達成するために必要
な放射線線量を決定するためのガイドラインが提供され
る。本発明のデバイスを滅菌するための線量は、約０．
５〜約４．０メガラドの範囲内であり、最も好ましくは
約２．０〜約３．５メガラドの範囲内である。

【０１２３】

【実施例】本発明を実施するために現在意図される最良
の態様を構成する本発明の骨原性デバイスを製造し使用
する手段、ならびにこれらの組成物の性質および用途に
関する他の材料の局面（請求した主題の製造法および使
用法を含む）は、以下の記述からより理解される。本発
明は、このような実施例、またはこれらの実施例に示さ
れた特定の詳細に制限されないことが理解される。

【０１２４】（実施例１．ＯＰ−１およびウシコラー
ゲンキャリア材料を含む最終滅菌骨原性デバイスの生物
活性）鉱物除去しグアニジン抽出したウシマトリックス
を、本明細書記載のエタノール／ＴＦＡプロトコルを用
い、ＯＰ−１の量を増やしながら処方した。簡単に言え
ば、エタノール／ＴＦＡ中に可溶化したＯＰ−１をウシ
コラーゲンキャリア材料と共に３時間インキュベートし
た。混合物をＯＰ−１マトリックススラリーとして凍結
し、真空下で乾燥した。処方後、各デバイスをガラスバ
イアルに移し、デバイスのいくつかには水を加えた。次
に、デバイスを密封前に５分間ヘリウムでパージした。
バイアルをゴム膜で閉じ、密封した。試料を以下の条件
の一つで２．５メガラドのガンマ線に曝露した：ドライ
アイス上で乾燥、ドライアイス上で湿潤、または室温で
乾燥。

【０１２５】得られたデバイスをラット皮下アッセイで
骨生成能について評価した。インビボ骨誘導をＳａｍｐ
ａｔｈら（前述）の記載通りにアッセイした。簡単に言
えば、最終滅菌デバイスを、エーテル麻酔下でレシピエ
ントラットに皮下移植した。２８〜３２日齢の雄のＬｏ
ｎｇ−Ｅｖａｎｓラットを使用した。無菌条件下で、胸
郭上の皮膚に縦の切れ目（１ｃｍ）を入れ、鈍切開でポ
ケットを作製した。約２５ｍｇの試験デバイスをポケッ
ト中に深く移植し、切開部を金属製皮膚クリップで閉じ
た。移植の日を実験のゼロ日とした。インプラントを第
１２日に取り除いた。異方向性（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐ
ｉｃ）部位によって、正方向性（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉ
ｃ）部位を使用することによって起こり得る不確かさを
生じさせずに、骨誘導を調べることができる。

【０１２６】骨誘導活性を、アルカリホスファターゼア
ッセイおよび第１２日インプラントのカルシウム含有量
によって生化学的に測定した。アルカリホスファターゼ
活性は、インプラントをホモジェナイズした後、分光学
的に測定した。組織学に骨発達を示さないインプラント
は、これらのアッセイ条件下でアルカリホスファターゼ
活性をほとんどまたは全く有さない。このアッセイは、
インプラントをラットから除去した後、骨形成を迅速に
定量し、その概算値を得るために有用である。一方、カ
ルシウム含有量はインプラント中に形成された骨の量に
比例する。従って、ラットにおける第１２日のインプラ
ントのカルシウム含有量を測定して、骨形成を計算す
る。

【０１２７】移植が成功したことは、インプラントがタ
ンパク質誘導軟骨性骨発達の各段階を通じて制御された
進行を示すことで特徴づけられ、それは（１）第１日の
多形核白血球による一過性浸潤；（２）第２〜３日の間
葉細胞遊走および増殖；（３）第５〜６日の軟骨細胞出
現；（４）第７日の軟骨マトリックス形成；（５）第８
日の軟骨石灰化；（６）第９および１０日の血管侵襲、
骨芽細胞の出現、および新骨の形成；（７）第１２〜１
８日の破骨細胞の出現、骨再構築および移植マトリック
スの分解；および（８）第２１日の小骨中の造血骨髄分
化を含む。

【０１２８】組織切片を作製し、染色を行い、インプラ
ント中の骨生成度を測定した。インプラントをＢｏｕｉ
ｎｓ液中で固定化し、パラフィン包埋し、６〜８μｍの
切片に切断した。トルイジンブルーまたはヘモトキシリ
ン／エオシン染色は、軟骨性骨の最終的な発達を明瞭に
示す。インプラントが新たに誘導された骨を含むかどう
かを決定するには、第１２日インプラントで通常十分で
ある。アッセイ結果を以下の表１〜４にまとめる。

【０１２９】表１ＯＰ−１なし／２５ｍｇコラーゲン
で処方されたデバイス

【０１３０】

【表１】表２ＯＰ−１５００ｎｇ／２５ｍｇコラーゲンで処
方されたデバイス

【０１３１】

【表２】表３ＯＰ−１１０００ｎｇ／２５ｍｇコラーゲンで
処方されたデバイス

【０１３２】

【表３】表４ＯＰ−１２５００ｎｇ／２５ｍｇコラーゲンで
処方されたデバイス

【０１３３】

【表４】表１〜４に示したデータは、ＯＰ−１含有デバイスが生
物活性を保持していることから明らかなように、骨原性
デバイスがガンマ線照射で滅菌され得ることを示してい
る。いくつかのグループでは骨原性能の低下が見られ
た。一般に、ドライアイス上で湿潤状態で照射した試料
が最高の活性を保持していた。

【０１３４】（実施例２．骨原性デバイスから空気を
除去するための別法）実施例１は、ある特定の環境下で
はガンマ線照射が照射デバイスの生物活性を減少させる
ことを示している。これらの結果は、照射前のデバイス
からの空気除去が不完全であったことに起因し得る。生
物活性減少を最小限にする試みとして、照射前にデバイ
スから空気を除去するための別なアプローチを用いた。

【０１３５】第一の方法では、バイアルを含むデバイス
を凍結乾燥器を用いて１００ミクロンＨｇ未満に排気
し、密封前にバイアルをこれらの条件下に５分間おい
た。第２の方法では、バイアルを含むデバイスを凍結乾
燥器中で１００ミクロンＨｇ未満に排気し、これらの条
件下に試料を５分間おき、次いで密封前にバイアルに２
分間ヘリウムをフラッシュした。得られた試料を２．５
メガラドのガンマ線で照射し、続いて実施例１の記載通
りにラット皮下アッセイを用いて生物活性を分析した。
結果を表５にまとめる。

【０１３６】キャリアマトリックス材料に対する損傷
を、マトリックスをＰＢＳで抽出することにより評価
し、得られた溶液の吸光度を測定し可溶化タンパク質の
量を決定した。選出された抽出液をアミノ酸組成につい
て解析したが、これは可溶化タンパク質がコラーゲン由
来であり、出発キャリアマトリックス材料の１〜２％を
表すことを示唆した。表５．照射前にデバイスから空気を除去するための異
なるアプローチの影響

【０１３７】

【表５】 ¹対照を除くすべてのデバイスを、２．５メガラドのガ
ンマ線照射で滅菌した。

【０１３８】結果は、ヘリウムパージ後ドライアイス上
で照射した試料が最も高いレベルの生物活性を保持して
いたことを示す。しかしながら、結果は、室温で真空下
に照射されたデバイスも相当レベルの生物活性を示すこ
とを示している。

【０１３９】（実施例３最終滅菌デバイスの再現性）
標準処方プロトコルを用いて５つのロットのデバイスを
製造した。簡単に言えば、４７．５％エタノール／０．
０１％ＴＦＡに可溶化したＯＰ−１をウシコラーゲンキ
ャリアマトリックスと３時間インキュベートした。混合
物をＯＰ−１／マトリックススラリーとして凍結し、真
空下で乾燥した。処方後、各デバイスをガラス血清バイ
アルに移し、バイアルを真空下に密封し、２．５〜３．
０メガラドのガンマ線照射で滅菌した。デバイスはすべ
てガラス処方容器中で４℃で処方した。ＯＰ−１のマト
リックスへの結合の程度、および照射および非照射デバ
イスからのＯＰ−１の回収を示す結果を表６に示す。

【０１４０】３時間のインキュベーション後の溶液中に
残留するＯＰ−１の量（デバイスの凍結乾燥前）は、処
方に用いたＯＰ−１とキャリアマトリックスとの比に依
存し、ＯＰ−１の濃度が高いほどマトリックスに結合し
たＯＰ−１の割合が少なかった。臨床試験用デバイスを
処方するために使用された比として、２．５ｍｇのＯＰ
−１を１ｇのマトリックスと処方した場合、３時間のイ
ンキュベーション後５３〜６４％のＯＰ−１がマトリッ
クスに結合した。滅菌前および後にデバイスから回収さ
れたＯＰ−１の量はデバイスのロット間で一貫してお
り、デバイス製造の再現性を示している。表６．ＯＰ−１で処方したデバイス

【０１４１】

【表６】 ¹各デバイスの試料を８Ｍ尿素、０．３％Ｔｗｅｅｎ８
０、０．１ＭＮａＣｌおよび５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐ
Ｈ８．０で、室温で３０分間抽出した。抽出液のアリコ
ート一定量のＯＰ−１含有量についてをＨＰＬＣを用い
て分析した。

【０１４２】実施例１〜２に示したデータは、ある条件
下では照射はデバイスの生物学的効力を低下させ得るこ
とを示唆している。これらの実験を、ＯＰ−１とコラー
ゲンマトリックスキャリア材料とのより高い重量比で処
方したデバイスを評価するために拡張した。処方デバイ
スの生物活性に対する照射の影響を、ラット皮下アッセ
イで評価した。これらのデバイスはマトリックスで希釈
し、特に、照射デバイスを照射マトリックスで、非照射
マトリックスを非照射マトリックスで希釈し、３．１２
ｍｇのＯＰ−１と２５ｍｇのマトリックスとをラットに
移植するようにした。アッセイの飽和を避けるためにデ
バイスを希釈した。各アッセイの結果を表７に示す。照
射および非照射デバイスの生物活性には何らの違いも見
られなかった。表７照射および非照射デバイスの生物学的効力

【０１４３】

【表７】 ¹３．１２μｇのＯＰ−１および２５ｍｇのマトリック
スを移植するように、照射ＯＰデバイスを照射マトリッ
クスで希釈した。非照射デバイスは非照射マトリックス
で希釈した。これらの試料をラット皮下アッセイで評価
した。アッセイあたりのサンプル数を括弧内に示す。

【０１４４】²組織学解析結果を、骨形成の組織学的証
拠を有したインプラント数／評価インプラント総数で示
す。

【０１４５】（実施例４別なキャリア材料による処方
の希釈）照射に伴うデバイスの生物活性に何らかの変化
が起こったかどうかをさらに評価するため、最終処方濃
度で３．１μｇのＯＰ−１／２５ｍｇマトリックスおよ
び１．５μｇのＯＰ−１／２５ｍｇマトリックスとなる
ように、照射および非照射デバイスを照射マトリックス
および非照射マトリックスで希釈する実験を別途行っ
た。

【０１４６】照射および非照射デバイス試料を照射マト
リックスおよび非照射マトリックスの双方で希釈した。
試料をラット皮下アッセイを用いて評価し、結果を表８
に示す。データは照射デバイスの生物学的効力を示す。

【０１４７】デバイスの照射に伴う変化を測定するまた
別な方法は、ＯＰ−１を照射デバイスから溶出し、それ
をＨＰＬＣ、免疫ブロットおよび細胞アッセイで解析す
ることであった。結果は、デバイスの照射が、ＨＰＬＣ
で溶出し検出される３０〜５０％量のＯＰ−１を減少さ
せることを示している。ＨＰＬＣからの画分を集め、免
疫ブロットで分析した。照射後のＯＰ−１溶出物は、Ｈ
ＰＬＣから照射前の試料と同じ位置に溶出した。従って
回収率の減少は照射ＯＰ−１の溶出位置の変化によるも
のではない。デバイスの試料を２％ＳＤＳで抽出し、こ
れらの抽出物を免疫ブロットおよび細胞アッセイで分析
した。ＳＤＳでデバイスから溶出されたＯＰ−１の免疫
ブロット解析によれば、免疫ブロット上のタンパク質パ
ターンは、照射の前および後で実質的に同じであるよう
に見え、最終滅菌後に溶出されたＯＰ−１の大部分に有
意な物理的変化がないことを示している。

【０１４８】２つのロットのコラーゲン含有デバイス
（すなわちロット番号ＰＯＯ２−３Ｍ１３Ｄ１（第１デ
バイス）およびＰＯＯ２−４，５Ｍ１３Ｄ４（第２デバ
イス））からのＯＰ−１を、２％ＳＤＳで抽出した。こ
れらの抽出物をラット骨芽細胞富化細胞アッセイでアッ
セイしたが、ＯＰ−１の添加はアルカリホスファターゼ
の増加をもたらした（図１）。双方の場合で、照射デバ
イスからの抽出物の活性は、非照射対照からの抽出物の
約７０％であった。さらに、非照射デバイスに対する照
射デバイスからのＯＰ−１の回収の割合は、ＨＰＬＣで
分析すると、ロット番号ＰＯＯ２−３Ｍ１３Ｄ１とＰＯ
Ｏ２−４，５Ｍ１３Ｄ４のデバイスでそれぞれ７５％お
よび６８％であった。表８照射前および後のロット番号１のデバイスに対す
る生物学的効力

【０１４９】

【表８】 ¹デバイスを本表に示した最終ＯＰ−１濃度にマトリッ
クスで希釈した。本実験に使用したデバイス、ロット番
号ＰＯＯ２−３，４Ｍ１５Ｄ１をマトリックス１グラム
当たり３．１２ｍｇのＯＰ−１で処方した。

【０１５０】²各組み合わせの８個の複製をラット皮下
アッセイで評価した。各インプラントの一部を組織学的
評価のために送付し、残りをＣａ²⁺分析のために使用し
た。すべてのインプラント（６４中６４）が骨形成の組
織学的証拠を示した。

【０１５１】哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性
デバイスが開示される。そのデバイスは生物活性骨原性
タンパク質と不溶性キャリアとの組み合わせを含み、組
み合わせ後、イオン化放射線への曝露、例えばガンマ線
または電子線への曝露により滅菌される。本発明の最終
滅菌デバイスは、それらが哺乳動物への移植後に、骨形
成を誘導することが特徴である。また、本発明の最終滅
菌デバイスを哺乳動物のあらかじめ選定された位置に移
植することにより、哺乳動物に骨形成を誘導する方法も
開示されている。また本発明の最終滅菌デバイスを調製
する方法が開示されている。

【０１５２】（等価性）本発明は、その精神または本質
的特徴から逸脱することなく他の特定の形態でも具象化
され得る。従って、本実施態様は、あらゆる局面で説明
のためのものであり、制限するものではなく、本発明の
範囲は上述の記載でなくむしろ添付の請求の範囲で示さ
れ、従って、請求の範囲と等価な意味および範囲内にあ
るすべての変更は、その中に包含されるものとする。

【０１５３】

【発明の効果】哺乳動物のあらかじめ選ばれた位置に移
植した場合、その位置に骨を生成し得る最終滅菌骨原性
デバイスを提供する。デバイスの生物活性および／また
は生体適合性を損なわずに骨原性デバイスの最終滅菌の
一般的プロセスを提供する。また、哺乳動物のあらかじ
め選ばれた位置に、本発明の最終滅菌デバイスを用いて
骨形成を誘導する方法を提供する。

【０１５４】付属する図面と共に読めば、本発明の上記
およびその他の目的、その様々な特徴、ならびに発明そ
れ自体を、以下の説明からより完全に理解し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はラット骨芽細胞アッセイにおけるアルカ
リホスファターゼ活性を刺激するための、照射および非
照射骨原性デバイスから抽出された試料の能力を示すグ
ラフである。黒塗り三角形を有する線はＯＰ−１を含ま
ない対照マトリックスから抽出された試料を表す。黒塗
り正方形を有する線は、未処理ＯＰ−１の試料を示す。
十字印を有する線は第１の未照射ＯＰ−１含有デバイス
から抽出された試料を示す。アスタリスクを有する線
は、第１の照射ＯＰ−１含有デバイスから抽出された試
料を示す。白抜き正方形を有する線は、第２の未照射Ｏ
Ｐ−１含有デバイスから抽出された試料を示す。斜め十
字印を有する線は、第２の照射ＯＰ−１含有デバイスか
ら抽出された試料を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マジョリーエム．タッカーアメリカ合衆国マサチューセッツ 01746，ホリストン，ロバートロード 132 (72)発明者デイビッドシー．ルーガーアメリカ合衆国マサチューセッツ 01748，ホプキントン，ダウニーストリート 19 (72)発明者クバーティー．サンパスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02053，メドウェイ，スプリングストリート６ (56)参考文献特開平６−296677（ＪＰ，Ａ) 特表平３−500655（ＪＰ，Ａ) ＰｕｏｌａｋｋａｉｎｅｎＰＡｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ, 1993年，Ｖｏｌ．33，Ｎｏ．８，ｐ. 679−85 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61L 27/00 A61L 2/08 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性のキャリア物質、および哺乳動物
に移植したとき、軟骨内骨形成または関節軟骨形成を誘
導し得る単離された生物活性骨原性タンパク質、とを組
み合わせて含む最終滅菌骨原性デバイスであって、ここ
で該デバイスは、空気の枯渇した環境において、イオン
化放射線に曝露されることにより最終滅菌されている、
デバイス。
【請求項２】前記キャリアが生分解性である、請求項
１に記載のデバイス。
【請求項３】前記キャリアが、前記哺乳動物に移植さ
れた場合に遊走原始細胞の浸潤、増殖、および分化を可
能にする寸法の、天然または合成ポリマー材料を含む、
請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】前記骨原性タンパク質が、ジスルフィド
結合した１対のポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載
のデバイス。
【請求項５】請求項４に記載の骨原性デバイスであっ
て、前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、各Ｘがア
ミノ酸である以下の６システイン骨格配列【化１】または以下の７システイン骨格配列【化２】を有するアミノ酸配列を含む、骨原性デバイス。
【請求項６】前記デバイスが１０ ^−６の滅菌保証レベ
ルを達成する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】前記イオン化放射線がガンマ線である、
請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】前記イオン化放射線が電子線である、請
求項１に記載のデバイス。
【請求項９】前記イオン化放射線が０．５〜４．０メ
ガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項１に記載の
デバイス。
【請求項１０】前記イオン化放射線が２．０〜３．５
メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項１の記載
のデバイス。
【請求項１１】前記キャリアが多孔性粒子を含む、請
求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】前記キャリアが孔を含む、請求項１に
記載のデバイス。
【請求項１３】前記キャリアが充填粒子を含む、請求
項１に記載のデバイス。
【請求項１４】前記キャリアが７０〜８５０ミクロン
の範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請求項１に
記載のデバイス。
【請求項１５】前記不溶性キャリアが１２５〜４５０
ミクロンの範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請
求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】前記キャリアがポリ乳酸、ポリ酪酸、
ポリグリコール酸、およびそれらの組み合わせからなる
群から選択されるポリマーを含む、請求項１に記載のデ
バイス。
【請求項１７】前記キャリアがヒドロキシアパタイ
ト、リン酸三カルシウム、コラーゲン、カルボキシメチ
ルセルロース、グリセロール、ポリエチレングリコー
ル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され
る分子を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１８】前記コラーゲンがＩ型コラーゲンであ
る、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】前記骨原性タンパク質がＯＰ−１、Ｏ
Ｐ−２、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ
−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、
Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１およびそれらの機能的等価物からな
る群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】前記骨原性タンパク質がホモダイマー
である、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】前記最終滅菌骨原性デバイスが、最終
滅菌の前の該骨原性デバイスの生物活性の少なくとも１
７％を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】前記最終滅菌骨原性デバイスが、哺乳
動物における無血管位置で関節軟骨形成の誘導能を有す
る、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】前記骨原性タンパク質が、ＴＧＦ−β
様タンパク質のスーパーファミリーのサブクラスのメン
バーである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】前記キャリアが、同種異系骨または異
種骨である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】前記骨原性タンパク質が組換えタンパ
ク質である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】最終滅菌骨原性デバイスの製造方法で
あって：（ａ）不溶性のキャリア物質、および哺乳動物に移植し
たとき、軟骨内骨形成または関節軟骨形成を誘導し得る
単離された生物活性骨原性タンパク質、とを組み合わせ
て含む骨原性デバイス、を空気の枯渇した環境に提供す
る工程；および（ｂ）工程（ａ）の該骨原性デバイスを、該タンパク質
の生物学的活性を維持しながら、該デバイスの滅菌に十
分な量のイオン化放射線に曝露して、哺乳動物において
軟骨内骨形成または関節軟骨形成を誘導し得る最終滅菌
骨原性デバイスを製造する、工程を含む、方法。
【請求項２７】前記骨原性タンパク質が、ＯＰ−１、
ＯＰ−２、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭ
Ｐ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＤＰ
Ｐ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１およびそれらの機能的等価物か
らなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記骨原性タンパク質が、軟骨内骨形
成または関節軟骨形成の誘導能を有する、ジスルフィド
結合した１対のポリペプチド鎖を含み、そしてここで該
ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、各Ｘがアミノ酸で
ある以下の６システイン骨格配列【化３】または以下の７システイン骨格配列【化４】を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方
法。
【請求項２９】前記骨原性タンパク質が、ジスルフィ
ド結合した一対のポリペプチド鎖を含む、請求項２６に
記載の方法。
【請求項３０】前記骨原性タンパク質がホモダイマー
である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】前記キャリアが生分解性である、請求
項２６に記載の方法。
【請求項３２】前記キャリアが、哺乳動物に移植した
とき、遊走原始細胞の浸潤、増殖および分化を可能にす
る寸法の、天然のまたは合成ポリマー材料を含む、請求
項２６に記載の方法。
【請求項３３】前記キャリアが多孔性粒子を含む、請
求項２６に記載の方法。
【請求項３４】前記キャリアが細孔を含む、請求項２
６に記載の方法。
【請求項３５】前記キャリアが充填粒子を含む、請求
項２６に記載の方法。
【請求項３６】前記キャリアが７０〜８５０ミクロン
の範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請求項２６
に記載の方法。
【請求項３７】前記キャリアが１２５〜４５０ミクロ
ンの範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請求項３
６に記載の方法。
【請求項３８】前記キャリアがポリ乳酸、ポリ酪酸、
ポリグリコール酸、およびそれらの組み合わせからなる
群から選択されるポリマーを含む、請求項２６に記載の
方法。
【請求項３９】前記キャリアがヒドロキシアパタイ
ト、リン酸三カルシウム、コラーゲン、カルボキシメチ
ルセルロース、グリセロール、ポリエチレングリコー
ル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され
る分子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】前記コラーゲンがＩ型コラーゲンであ
る、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記キャリアが、同種異系骨または異
種骨である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】前記キャリアおよび骨原性タンパク質
は、１：１〜２５０，０００：１の範囲の重量比で組み
合わされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】前記キャリアおよび骨原性タンパク質
は、４０：１〜５０，０００：１の範囲の重量比で組み
合わされる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】前記イオン化放射線がガンマ線であ
る、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】前記イオン化放射線が電子線である、
請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】前記イオン化放射線への曝露が１０
^−６の滅菌保証レベルを有するデバイスを作製する、請
求項２６に記載の方法。
【請求項４７】前記イオン化放射線が０．５〜４．０
メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項２６に記
載の方法。
【請求項４８】前記イオン化放射線が２．０〜３．５
メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項４７の記
載の方法。
【請求項４９】前記最終滅菌骨原性デバイスが、最終
滅菌の前の該骨原性デバイスの生物活性の少なくとも１
７％を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】哺乳動物のあらかじめ選定した位置で
の軟骨内骨または関節軟骨の形成の誘導に使用するため
の、請求項１に記載の最終滅菌骨原性デバイス。
【請求項５１】前記関節軟骨形成が哺乳動物の無血管
位で行われる、請求項５０に記載のデバイス。
【請求項５２】前記骨原性タンパク質がＯＰ−１また
はその機能的等価物である、請求項５０に記載のデバイ
ス。
【請求項５３】哺乳動物のあらかじめ選定した位置で
軟骨内骨または関節軟骨の形成を誘導するための医薬の
製造のための、請求項１に記載の最終滅菌骨原性デバイ
スの使用。
【請求項５４】前記関節性軟骨形成が哺乳動物の無血
管位で行われる、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】前記骨原性タンパク質がＯＰ−１また
はその機能的等価物である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５６】哺乳動物のあらかじめ選定した位置で
軟骨内骨または関節軟骨の形成を誘導するための医薬の
製造における、最終滅菌骨原性デバイスの使用であっ
て、該最終滅菌骨原性デバイスが、不溶性のポリマーキ
ャリア材料、および該デバイスが該哺乳動物に移植され
た場合、軟骨内骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有
する、該キャリア中に配置された、単離された生物活性
骨原性タンパク質とを含み、ここで、該デバイスが、空
気の枯渇した環境において、イオン化放射線に曝露する
ことによって最終滅菌されている、使用。
【請求項５７】前記該骨原性タンパク質が、ＴＧＦ−
βスーパーファミリーのＶｇ／ｄｐｐサブファミリーの
メンバーである、請求項１に記載の最終滅菌骨原性デバ
イス。
【請求項５８】前記骨原性タンパク質が、ＴＧＦ−β
スーパーファミリーのＶｇ／ｄｐｐサブファミリーのメ
ンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項５９】前記骨原性タンパク質が、ＴＧＦ−β
スーパーファミリーのＶｇ／ｄｐｐサブファミリーのメ
ンバーである、請求項５６に記載の使用。
【請求項６０】前記骨原性タンパク質が、保存された
６つまたは７つのシステイン骨格を、Ｖｇ／ｄｐｐサブ
ファミリーの他のメンバーと共有する、請求項５７に記
載の最終滅菌骨原性デバイス。
【請求項６１】請求項５８に記載の方法であって、前
記骨原性タンパク質は、保存された６つまたは７つのシ
ステイン骨格を、Ｖｇ／ｄｐｐサブファミリーの他のメ
ンバーと共有する、方法。
【請求項６２】請求項５９に記載の使用であって、前
記骨原性タンパク質が、保存された６つまたは７つのシ
ステイン骨格を、Ｖｇ／ｄｐｐサブファミリーの他のメ
ンバーと共有している、使用。
【請求項６３】前記キャリアおよび骨原性タンパク質
が、４０：１〜５０，０００：１の範囲の重量比で組み
合わされている、請求項１に記載の最終滅菌骨原性デバ
イス。