JP3476203B2 - カルシトニン擬似体 - Google Patents

カルシトニン擬似体

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    • C07D295/215Radicals derived from nitrogen analogues of carbonic acid

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の相互参照 この出願は、1997年2月24日付け出願の米国仮特許出
願第60/038,971号および1997年12月1日付け出願の米国
仮特許出願第60/067,037号の特典を主張するものであ
る。なおこれらの出願は本願に援用するものである。
発明の背景 骨は動的組織であるから、成人骨格の恒常性は、骨吸
収と骨形成の間の平衡を必要とする。破骨細胞と骨芽細
胞がこの平衡に重要な役割を果しており、破骨細胞は骨
吸収を起こし、骨芽細胞は新しい骨基質を合成して沈着
させる。骨の恒常性の平衡異常は、骨粗しょう症、パジ
ェット病、および上皮小体機能亢進症などの症状に関連
がある。
破骨細胞と骨芽細胞の活動は、全身ホルモン類と、成
長因子類およびサイトカイン類の局所産生との間の複雑
な相互作用によって調節される。カルシトニン、すなわ
ち哺乳類の甲状腺と胸腺が分泌するペプチドホルモン
が、骨の恒常性を維持するのに重要な役割を果してい
る。カルシトニンは、破骨細胞の特異的なカルシトニン
受容体に結合してこれを活性化することによって骨吸収
を抑制して(The Calcitonins−Physiology and Pharma
cology,Azria編、Karger、スイス バーゼル、1989
年)、骨が血清中に放出するカルシウムの量が減少す
る。骨吸収のこの抑制作用は、例えば、痛みを伴う衰弱
骨折を起こすことがない骨格質量の減少を特徴とする疾
患である骨粗しょう症の治療薬としてカルシトニンを使
用することによって、利用されている。また、カルシト
ニンはパジェット病の治療にも使用され、この場合、こ
の疾患に付随する一次症状であることが多い骨痛を迅速
に軽減する。また、この鎮痛効果は、骨粗しょう症また
は転移性の骨疾患が見られる患者でも実証されており、
そして糖尿病性神経障害、癌、片頭痛および子宮摘出後
にみられる痛みを軽減すると報告されている。骨痛の減
少が起こった後、骨吸収が低下する。
サケのカルシトニンは、ヒト型のカルシトニンより、
骨吸収を阻止するのにかなり有効であることが報告され
ている。この観察結果を説明するために以下のいくつも
の仮説が提示されている。すなわち、1)サケのカルシ
トニンは耐分解性が高い;2)サケのカルシトニンは代謝
クリアランス速度(MCR)が低い;そして3)サケのカ
ルシトニンは、立体配座がわずかに異なり、その結果、
骨吸収部位に対する親和性が高い。
サケのカルシトニンをヒトに使用すると利点があるに
もかかわらず、欠点もある。例えば、骨粗しょう症を治
療する場合、平均費用は1週間当たり75ドルを超え、そ
して予防投与を、毎日、5年間以上行わねばならない。
米国では、カルシトニンは注射で投与しなければなら
ず、この薬剤に対する適応症は、通常、命にかかわる疾
患ではないので、患者の服薬遵守度が低いことである。
さらに、カルシトニンを長期間使用すると、カルシト
ニン療法に対する耐性が起こることがある。この耐性、
すなわち「逸脱現象(escape現象)」の引金になるもの
が何であるか分かっていない(BileziKian他編「Princi
ples of Bone Biology」1093頁、米国ニューヨークAcad
emic Press;Raisz他、Am.J.Med.、43巻684〜690頁、196
7年;McLeod & Raisz、Endocrine Res.Comm.、8巻49〜
59頁、1981年;Wener他、Endocrinology、90巻752〜759
頁、1972年;およびTashjian他、Recent Prog.Horm.Re
s.、34巻285〜303頁、1978年参照)。カルシトニン擬似
体を、天然のカルシトニンの代わりにまたは天然のカル
シトニンとともに順に使用すると、長期間の使用中にか
ような治療に対する耐性が発生するのを避けるのに役立
つであろう。その上に、いくらかの患者には、非ヒトカ
ルシトニンに対する抗体が生成する。このような患者に
対して、カルシトニン擬似体は有用であろう。
当該技術分野で要望されているのは、骨吸収を抑制す
る別の方法である。驚くべきことに、この発明は、これ
らの目的およびその外の目的を達成しているのである。
発明の要約 この発明は、カルシトニン擬似体である化合物を単離
して提供するものである。用語「カルシトニン擬似体」
は、この明細書で使用する場合、カルシトニンとカルシ
トニン受容体の相互作用によって生成する効果に似せた
性能を有し、このような相互作用によって、アデニル酸
シクラーゼ゛によるGタンパク質依存性活性化反応(G
−protein−mediated activation)を刺激する化合物を
意味する。したがって、これらの化合物は、カルシトニ
ンが仲介する疾患を治療するのに有用である。この発明
のカルシトニン疑似体として、ピペラジン誘導体があ
り、そのピペラジン環の窒素原子は各々置換アリール基
によってアルキル化またはアシル化されている。
この発見に基づき、この発明は、骨粗しょう症、パジ
ェット病、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、歯周欠損
(骨損失の予防)、悪性高カルシウム血症、幼児の特発
性高カルシウム血症などの疾患を治療するのに有用な骨
吸収の抑制方法を提供するものである。また、この発明
のカルシトニン疑似体は、急性膵炎および胃腸障害を治
療する際に胃液分泌を抑制するのに使用できるし、特に
骨痛に用いる鎮痛薬として使用することもできる。この
明細書に記載されているカルシトニン疑似体は、単独で
または他の治療薬剤と組み合わせて使用できる。
他の側面で、この発明は、一つの固体支持体に連結さ
れているかまたは多数の固体支持体に結合されているカ
ルシトニン疑似体のライブラリーを提供するものであ
る。この発明は、さらに、これらライブラリーの製造方
法、および前記連結されたピペラジン誘導体のカルシト
ニン受容体に対する相対的結合効率を測定するためライ
ブラリーを選別する方法を提供するものである。
図面の簡単な説明 図1と2は、この発明の化合物類を製造するための合
成図式である。
図3は、この発明の化合物類を、個々にまたはライブ
ラリーのメンバーとして固相合成する一方法を示す。
図4A〜4Cは、カルシトニンの逸脱を測定する頭蓋冠検
定法に用いる累積全カルシウム量(mg%)対インキュベ
ーション時間(hr)のグラフを示す。
発明の詳細な説明 I.略語 この明細書では以下の略語を使用する。
Boc:t−ブトキシカルボニル;DCM:ジクロロメタン;DM
E:ジメトキシエタン;DMF:ジメチルホルムアミド;EtOAc:
酢酸エチル;Fmoc:フルオレニルメトキシカルボニル;TF
A:トリフルオロ酢酸。
II.カルシトニン擬似体 この発明に有用なカルシトニン擬似体は、カルシトニ
ンとその受容体の相互作用に似た性能を有し、この似て
いることによって、アデニル酸シクラーゼのGタンパク
質依存性活性化反応を刺激する化合物である。これらの
擬似体は下記式で表される。
上記式において、文字AとBは各々独立して、アリー
ル基、置換アリール基、炭素環式リング、置換炭素環式
リング、複素環式リング、置換複素環式リングまたはこ
れらの基を結合させた基を示す。その結合は、縮合結合
でも共有結合でもよい。炭素環式基と複素環式基の例と
しては、ミクロヘキシル、ミクロヘキセニル、ピペラジ
ニル、ピラジニル、モルホリニル、イミダゾリル、トリ
アゾリルおよびチアゾリルがある。上記のように、Aと
Bは各々アリール基でもよい。用語「アリール」は、芳
香族置換基を意味し、単一のリングでもよく、または、
ともに縮合されているか、共有結合されているかまたは
エチレン若しくはメチレンの部分などの共通の基に連結
されている多重リングでもよい。これらの芳香族リング
は各々ヘテロ原子を含有していてもよい。アリール基の
例としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェ
ニルメチル、2,2−ジフェニル−1−エチル、チエニ
ル、ピリジルおよびキノキサリルがある。さらに、これ
らアリール基は、他の場合には水素原子が占有してい
る、アリール基の任意の位置で、分子の他の部分に連結
させてもよい(例えば、2−ピリジル、3−ピリジルお
よび4−ピリジルなど)。
また、これらアリール基は、任意の炭素環式基または
複素環式基とともに、任意に置換されていてもよい。こ
れら置換基は、一般に、ハロゲン、ハロアルキル、ヒド
ロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキ
シ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジ
アルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキル、ま
たは付加アリール基である。用語「アルキル」は、この
明細書で使用する場合、飽和炭化水素基を意味し、直鎖
若しくは分枝鎖(例えば、エチル、イソプロピル若しく
はt−アミル)または環式(例えば、シクロブチル、シ
クロプロピル若しくはシクロペンチル)でもよい。好ま
しいアルキル基は、1〜6個の炭素原子を含有するアル
キル基である。この明細書および特許請求の範囲の数値
の範囲は、すべてその上限と下限を含むものとする。用
語「アルコキシ」は、他の炭化水素基に共有結合できる
酸素置換基を有する上記アルキル基を意味する(例え
ば、メトキシ、エトキシおよびt−ブトキシ)。
記号R1とR2は各々、独立して、水素または1〜6個の
炭素原子を有するアルキル基である。いくつかの実施態
様で、R1とR2はともに結合して、飽和または不飽和の4
員、5員、6員または7員のリングであるリングを形成
してもよい。リングが不飽和であるこれら実施態様の場
合、そのリングは、芳香族リング(例えば、フェニル若
しくはナフチル)またはヘテロ芳香族リング(例えば、
ピリジル、チエニル、イミダゾリル)でもよい。
記号Y1とY2は各々、独立して、単結合(bond)または
2価の基、すなわち、−CH2−、−NHC(O)−、−NRC
(O)−、−NHC(S)−、−NRC(S)−、−NHC(=N
H)−、−OC(O)−、−C(O)−若しくは−C
(S)−を示す。なお、これらの基の中のRは1〜6個
の炭素原子を有する低級アルキル基である。好ましい実
施態様で、Y2は2価の基であり、それぞれ−C(O)
−、−C(S)−または−CH2−で表されるカルボニ
ル、チオカルボニルまたはメチレンである。他の好まし
い実施態様で、Y1は−NHC(O)−、−NRC(O)−、−
C(O)−、または−C(S)−である。
文字nはゼロ〜4の整数を示す。
一群の好ましい実施態様のカルシトニン擬似体は、下
記式で表されるピペラジンベースの化合物である。
この式において、記号Y1とY2は上記意味をもってい
る。記号S11、S12、S13、S14、S15およびS16は各々、独
立して連結されている芳香族リングの置換基であり、水
素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオ
キシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、
アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシ
ルオキシ、アシル、アルキルおよびアリールである。特
に好ましい実施態様において、Y1は−NHC(O)−また
は−CH2−であり、Y2は−CH2−であり、そしてS11
S12、S13、S14、S15およびS16は各々独立して、水素、
ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハ
ロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノまたはジア
ルキルアミノを示す。特定の好ましい実施態様におい
て、各芳香族リングの置換基の少なくとも一つそして好
ましくは少なくとも二つは水素以外の基である。最も好
ましくは、これら置換基はハロゲン、トリフルオロメチ
ル、ヒドロキシおよびメトキシである。
この発明に用いられるカルシトニン擬似体は、当業技
術者に知られている標準の合成方法で製造することがで
きる。ピペラジン誘導体を目標とする一般的な合成図式
を図1に示す。すなわち、モノ保護ピペラジン(例えば
t−BOC−ピペラジン)を、アリールイソシアネートで
処理して尿素1aを提供できる。1aから保護基を除くと1b
が得られ、その1bは、通常の方法によって、例えば、ほ
ぼ置換ハロゲン化ベンジルまたは置換塩化ベンゾイルで
アルキル化またはアシル化してそれぞれ1cと1dを提供す
ることができる。あるいは、t−Bocピペラジンを、図
2に示すような還元的アミノ化のルートを用いてアルキ
ル化してもよい。例えば、芳香族アルデヒドで還元的ア
ルキル化を行った後、その保護基を除いて、次いで、残
っているピペラジンの窒素をアリールイソシアネートま
たはアルキルイソシアネートによってアシル化すること
ができる。米国特許第5,286,728号および同第5,384,319
号に、類縁化合物の製造について記載されているのと類
似のさらに他の製造方法を利用できる。なお、これら特
許の開示内容はこの明細書に援用するものである。
この発明のカルシトニン擬似体を目標とする他の合成
法では、まず、適切に置換されたヒドロキシベンズアル
デヒドを、Wang樹脂などの固体支持体に連結させる。次
に、その遊離アルデヒド基を、BOC−ピペラジンなどの
モノ保護ジアシンを用いて、還元的アルキル化反応に付
す。次にその保護基を除き、次いで前記樹脂に結合させ
た化合物を、各種の薬剤、例えばカルボン酸類、イソシ
アネート類、イソチオシアネート類またはハロゲンかス
ルホニル類などでアシル化する。ピペラジン類を含むこ
れらモノ保護ジアシン類は、市販されているかまたは有
機合成の当業技術者に知られている各種の方法で製造す
ることができる。一つの方法では、4−ヒドロキシ−3
−メトキシベンズアルデヒドを、トリフェニルホスフィ
ンおよびジエチルアゾジカルボキシレートを利用するMi
tsonobuアルキル化法でWang樹脂に連結させる。次に、
上記樹脂に結合させた化合物の遊離アルデヒド基を、ボ
ラン−ピペラジン錯体を用いて、BOCピペラジンで還元
的にアルキル化する。次に、そのBOC基を、10%TFA/DCM
を用いて選択的に除き、次いで、その遊離窒素をアリー
ルイソシアネートでアシル化する。得られた化合物を、
次に、例えば50%TFA/DCMを30分間用いる標準の方法で
開裂させる。当業技術者は、例えば、March著「Advance
d Organic Chemistry」第四版、米国ニューヨークWiley
−Interscience、1992年に記載されているアシル化反応
およびカップリング反応用の他の試薬を用いて、樹脂上
での合成の順序を逆にすることを含めて、この発明の化
合物の別の製造方法がいくつも存在することが分かるで
あろう。なお、上記著書はこの明細書に援用するもので
ある。
III.生体外での使用 この発明の化合物は、ヒトを含む温血動物に投与され
て、カルシトニンとその受容体の生体内での相互作用を
まねることができる。この発明の一つの側面において、
この発明のカルシトニン擬似体は、カルシトニンが有用
な欠陥の治療に用いると有利であると考えられる。特
に、この発明のカルシトニン擬似体は、骨の代謝を調節
しかつ血清カルシウムを減らすのに有用である。この発
明のカルシトニン擬似体は、ヒトを含む温血動物に投与
されて、カルシトニンとその受容体の生体内での相互作
用をまねることができる。したがって、この発明には、
骨に関連する障害の治療方法が含まれる。このような骨
に関連する障害としては、限定されないが、骨粗しょう
症、パジェット病、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、歯
周欠損(骨損失)、悪性高カルシウム血症、幼児の特発
性高カルシウム血症および他の類縁疾患がある。また、
カルシトニン疑似体は、特に、骨痛を軽減するための鎮
痛剤として有用であると考えられる。カルシトニン擬似
体は、さらに、骨吸収を抑制するのに有利であると考え
られる。また、この発明のカルシトニン擬似体は、急性
膵炎および胃腸障害を治療する際、胃液分泌を抑制する
のに使用することもできる。この発明の上記方法は、こ
れらの症状を、その急性または慢性の段階で治療するの
に使用できる。
この発明のカルシトニン擬似体の医薬としてまたは治
療面で有効な量を、非経口、経口、鼻腔内、直腸内、局
所、経皮などの投与を行うための医薬としてまたは治療
の面で許容される担体と共に、、通常の方法で配合する
ことができる。配合物は、さらに1種以上の希釈剤、充
填剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、添加剤などを含有して
いてもよく、例えば、液剤、粉末剤、乳剤、坐剤、リポ
ソーム剤、経皮吸収パッチ剤および錠剤などの形態で提
供できる。いくつもの生体重合体のうちのいずれかを含
有する徐放すなわち延長放出の送達システム(生物学ベ
ースのシステム)、リポソーム類を利用するシステムお
よび重合体送達システムも、この明細書に記載されてい
る組成物と共に利用して、カルシトニン擬似体の連続的
なまたは長期間の供給源を提供できる。このような徐放
システムは、例えば、経口、局所および非経口の用途に
使う配合物に利用できる。用語「医薬としてまたは治療
面で許容できる担体」は、有効成分の生物活性の効力を
阻害することなく、かつ宿主または患者に対して有毒で
ない担体媒体を意味する。当業技術者は、適当な方式
で、かつ、Gennaro編「Remington's Pharmaceutical Sc
iences」Mack Publishing Co.、米国ペンシルベニア
州、1990年に開示されているような許容される常法にし
たがって、この発明の配合物を配合することができる
(なお、この文献はすべて本明細書に援用するものであ
る)。これらの化合物は経口または非経口で投与するこ
とが好ましい。
かようなカルシトニン擬似体の「医薬としてまた治療
面で有効な量」とは、この明細書で使用する場合、所望
の生物学の成果を誘発するのに十分な量である。その成
果は、疾患の徴候、症状若しくは原因の軽減、または生
物システムのその外の望ましい変化である。例えば、カ
ルシトニン擬似体の有効量は、自覚症状が軽減するか、
または臨床医などの視覚のある観察者が客観的に確認で
きる改善を行う量である。特にカルシトニン擬似体のか
ような有効量によって、血清カルシウムが減少し、骨吸
収が抑制され、胃液分泌が抑制されまたは他の有益な効
果が得られる。カルシトニン擬似体の有効量は、治療さ
れる疾患または症状によって、広範囲にわたって変える
ことができる。カルシトニン擬似体の投与量と、配合物
中の濃度は、選択される賦形剤、投与経路、特定の擬似
体の効力、患者の臨床症状、配合物中の化学物の副作用
および安定性によって決まる。したがって、臨床医は、
当該患者または類似の患者による臨床経験によって、配
合物の投与量のみならず、配合物中に適量な濃度の有効
成分を含有する適当な製剤を採用する。このような量
は、一部、患者の治療すべき特定の症状、年齢、体重お
よび一般的健康状態、ならびに当業技術者にとって明ら
かな他の因子によって決まる。一般に、投与量は、患者
の体重1kg当たり0.1〜100mgの範囲内である。好ましく
は0.5〜50mg/患者体重kgである。特定の化合物の投与量
は、実験動物に対する生体外(vitro)または半ビボ(e
x vivo)の試験結果から決定することができる。生体外
または半ビボで有効であることが確認された化合物の濃
度が、動物実験に対する指標を与え、作用部位に類似の
濃度を与える投与量が算出される。実験動物で有効であ
ることが確認された投与量によって、一般にヒトに対す
る投与量が一桁の範囲内で予測される。
カルシトニン擬似体の生体内の効力を試験するのに、
十分確立された動物モデルを利用できる。例えば、低カ
ルシウム血症のラットのモデルは、血清カルシウムに対
する合成カルシトニン擬似体の作用を確認するために使
用することができ、そして卵巣を摘出されたラットまた
はマウスは、骨粗しょう症に対するモデル系として使用
できる。エストロゲン欠乏症の初期段階で、これらのモ
デルとヒトに見られる骨の変化は、定期的に類似してい
る。カルシトニンは、卵巣を摘出されたヒトおよびラッ
トにおける骨の損失を防止するのに有効な薬剤であるこ
とが報告されている(Mazzuoli他、Calcif.Tissue In
t.、47巻209〜214頁、1990年;Wrongski他、Endocrinolo
gy、129巻2246〜2250頁、1991年)。
この発明の組成物は、投与するのに単位剤形で提供す
ることが好ましい。用語「単位剤形」は、ヒトの患者と
動物に対する単位投与量として適切な物理的に別個の単
位を意味し、各単位は、必要な医薬希釈剤、担体または
賦形剤と組み合わせて所望の医薬作用をもたらすために
算出された、予め決められた量の活性物質を含有してい
る。単位剤形の例としては、バイアルびん、アンプル、
錠剤、カプレット、ピル、粉末、顆粒、点眼液、経口若
しくは点眼用の液剤および懸濁剤、眼科用軟膏、および
水中油型乳剤がある。製造法、配合法および投与法は、
当業技術者には知られている(一般にRemington's Phar
maceutical Science、第15版、米国ペンシルベニア州イ
ーストン所在のMack Publishing Co.、1990年参照)。
この発明を実施するのに使用されるこの発明の化合物
の投与量は、所望の効果をもたらすのに有効な投与量で
ある。個々の患者に対し適当な有効投与量の推定は、処
方を行う通常の医師または他の適当な開業医の技倆の範
囲内で十分に行える。臨床医は、指針として、Physicia
n's Desk Reference、第48版、Medical Economics Data
Production Co.、米国ニュージャージー州07645−1742
モントベール、1994年などの情報源から通常入手できる
アドバイスを利用できる。
IV.カルシトニン擬似体のライブラリー この発明は、別の側面で、カルシトニン擬似体のライ
ブラリーを提供するものであり、そのライブラリーの各
メンバーは下記式で表される。
上記式中、S0は固体支持体を表し、Lは単結合、スペ
ーサーまたは連結基を表し、そしてA、B、R1、R2
Y1、Y2およびnは前記式Iで表される化合物について先
に述べた基を表す。
上記固体支持体は、生物、非生物、有機物、無機物ま
たはこれらを組み合わせた支持体でもよく、粒子、スト
ランド、沈殿物、ゲル、シート、チュービング、球体、
容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレー
ト、スライドガラスなどとして存在している。固体支持
体は平坦でもよいが、別の表面形態にあってもよい。例
えば、固体支持体は、合成が行われる凸領域または凹領
域を有していてもよい。実施態様によっては、固体支持
体は、適当な光吸収特性を提供するものが選択される。
例えば、固体支持体は、重合させたラングミュアーブロ
ジェット膜、官能基化ガラス(functional glass)、S
i、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改質ケイ素、または
(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビニリデン
ジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート若しく
はその組み合わせなどの各種のゲル若しくは重合体の中
の一つでもよい。その外の適切な固体支持体の材料は、
当業技術者であれば容易に分かるであろう。他の実施態
様で、固体支持体の表面は、反応性基を有しており、そ
の反応性基はカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チ
オールなどでもよい。好ましい固体支持体は、有機重合
体のビーズである。
固体支持体には、任意のスペーサーまたは連結基Lが
結合されている。スペーサーの分子としては、メンバー
が全部そろったライブラリー中の受容体リガンドを、そ
のライブラリーに暴露された受容体と自由に相互作用さ
せるのに十分な長さの分子が好ましい。スペーサーは、
存在する場合、一般に6〜50個の原子の長さを有し、連
結される受容体リガンドを十分に暴露させる。スペーサ
ーまたは連結基Lは、表面連結部分とリガンド連結部位
を有している。表面連結部分は、固体支持体に直接連結
するLの部分である。この部分は、例えば(ポリ)トリ
フルオロクロロエチレンの表面を有する支持体を用いて
炭素−炭素結合を介して、または好ましくはシロキサン
結合によって(例えば固体支持体としてガラスまたは酸
化ケイ素を用いて)固体支持体に連結することができ
る。支持体の表面とのシロキサン結合は、一実施態様
で、トリクロロシリル基またはトリアルコキシシリル基
を有する表面連結部分の反応を介して形成される。スペ
ーサーまたは連結基もリガンド連結部位を有している。
受容体リガンドに連結するのに適している官能基として
は、アミン類、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキ
シルがある。表面連結部分とリガンド連結部位は、アル
キレン基類(例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン
など)、2〜14個のモノマー単位を含有するエチレング
リコールオリゴマー類、ジアミン類、二酸類、アミノ酸
類、ペプチド類またはその組み合わせを含む各種の基に
よって引き離すことができる。さらに、スペーサーのこ
の部分は、その親水性/疎水性に基づいて選択して、受
容体に対するリガンドの提示を改善することができる。
Lのこの部分は、ポリエチレングリコール類、アルキレ
ン、多価アルコール、ポリエステル、ポリアミン、ポリ
ホスホジエステルおよびその組合せで構築することがで
きる。
Lの遠位末端に連結される受容体リガンドは、この明
細書では、カルシトニン擬似体とも呼称する。固体支持
体の予め選択された領域に或いは個々の固体支持体に連
結されるリガンドは、各々独立して、上記式(I)で表
される化合物である。これらの化合物は、各々、一般
に、前記擬似体の「A」リングに存在するヒドロキシル
官能性(−OH)を通じて、連結基またはスペーサーに連
結される。
ライブラリーは、事実上、任意の数の異なるメンバー
を有し、そして与えられた用途において選別したい化合
物の数または種類によって、および専門家の合成能力に
よってのみ限定される。一群の実施態様において、ライ
ブラリーは2〜100のメンバーを有している。他の群の
実施態様では、一つの固体支持体上に、100〜10,000の
メンバー、好ましくは10,000〜1,000,000のメンバーを
有する。好ましい実施態様において、ライブラリーは1c
m2当たりの既知の位置に100のメンバーを超える密度を
有し、好ましくは、1cm2当たり1,000を越え、そしてよ
り好ましくは1cm2当たり10,000を超える密度を有してい
る。
ライブラリーの製造 この発明のライブラリーは、当業技術者に知られてい
る各種の固相法を用いて製造できる。その製造方法を、
図3に参照して一般的に説明する。
図3(単一化合物の合成だけを例示する)に示すよう
に、連結基が固体支持体に連結され、複数の利用可能な
リガンド連結部位を有する誘導体化固体支持体を提供す
る。その誘導体化支持体の前記部位に、適切に置換され
たヒドロキシベンズアルデヒドが連結される。次に、そ
の遊離アルデヒド基は、BOC−ピペラジンなどのモノ保
護されたジアミンを用いて、還元的アルキル化がなされ
る。次に、その保護基が除去されて、その樹脂に結合さ
れた化合物は、各種の薬剤、例えばカルボン酸類、イソ
シアネート類、イソチオシアネート類、またはハロゲン
化スルホニル類でアシル化される。ピペラジン類を含む
前記モノ保護されたジアミン類は、商業的に入手できる
が、有機合成の当業技術者に知られている各種の方法に
よっても製造できる。一群の実施態様で、前記ライブラ
リーの化学的に別個の各メンバーが別個の固体支持体上
に合成される。
各種の固相法の一層詳細な考察は、後記の諸特許およ
び諸刊行物に見られる。
基板上のライブラリー ライトディレクテッド法(light−directed method) 単一の固体支持体を用いるこれらの実施態様の場合、
この発明の受容体リガンドのライブラリーは、例えば、
「ライトディレクテッド」法「VLSIPS(登録商標)法と
して知られる一群の方法のうちの一方法」を使って製造
できる。これらの方法は、米国特許第5,143,854号に記
載されている。なお、この特許はこの明細書に援用する
ものである。
フローチャネル(flow channel)法またはスポッティン
グ(Spotting)法 単一の基板上にライブラリーを合成するのに利用でき
る追加の方法は、米国特許第5,384,261号に記載されて
いる。なお、この特許は全目的のためこの明細書に援用
するものである。この特許に開示されている方法では、
(1)予め決められた領域上に「スポッティング」を行
うことによって、薬剤が基板に送達される。しかし、ス
ポッティングと流動を組み合わせることのみならず他の
方法も利用できる。各々の場合は、基板の特定の活性化
された領域は、モノマーの溶液が各種反応部位に送達さ
れるとき、他の領域から機械的に分離される。
ピンベース法(pin−based法) この発明の化合物とライブラリーを製造するのに有用
な他の方法として「ピンベース法」がある。この方法
は、米国特許第5,288,514号に詳細に記載されている。
なお、この特許はこの明細書に援用するものである。こ
の方法は、複数のピンなどの延出部を有する基板を利用
する。これらのピンは、各々、トイレ中の個々の薬剤容
器中に同時に挿入される。通常の実施態様で、96個ピン
/容器のアレイが使用される。
ビーズベースの方法(bead based法) この発明の化合物とライブラリーを合成するのに有用
な他の方法として「ビーズベース合成法」がある。ビー
ズベース合成法の一般的な取り組みは、公開された国際
特許願第PCT/US93/04145号(1993年4月28日出願)に記
載されている。なお、この特許願の開示内容はこの明細
書に援用するものである。
一群の好ましい実施態様で、カルシトニン擬似体のラ
イブラリーがビーズベースの合成法を用いて製造され
る。簡単に述べると、ビーズは、スペーサーまたは連結
基、例えば、アミノアルキルトリエトキシシランで適切
に修飾されて、合成開始部位としてアミノ基を有するビ
ーズが得られる。連結基が、これらのアミノ基に連結さ
れて、下記式で表される誘導体化ビーズが得られる。
−L−S0 上記式中、S0は固体支持体であり、そしてLはスペー
サー(アミノアルキルシラン)と連結基の結合体であ
る。その連結基に、リガンドを連続して構築するのに適
した官能性を有する「A」リング(例えば、芳香族リン
グ)を連結する。いくつかの実施態様で、上記官能性
は、例えばそのFMOCカルバメートとして保護される。当
業技術者であれば、この発明のライブラリーを製造する
のに使用するため、いくつもの保護基を利用できること
が分かるであろう。用語「保護基」は、この明細書で使
用する場合、分子中の一つの反応性部位を塞ぐよう設計
されているいずれかの基を意味し、一方、化学反応は他
の反応性部位で行われる。さらに詳しく述べると、この
発明で用いられる保護基は、Greene他著、「Protective
Groups In Organic Chemistry」第二版、John Wiley
& Sons、米国ニューヨーク、1991年に記載のいずれか
の基でよい。なお、この文献はこの明細書に援用するも
のである。特定の合成法に用いる保護基の適正な選択
は、その合成法に用いられる全体の方法によって決ま
る。例えば、以下に考察される「ライトディレクテッ
ド」合成法の場合、その保護基は、3,4−ジメトキシ−
6−ニトロベンジルカルバメートなどの光不安定性保護
基であり、このような保護基は、公開された国際特許願
第PCT/US93/10162号(1993年10月22日付け出願)に記載
されている。なお、この特許願はこの明細書に援用する
ものである。他の方法の場合、保護基は化学的法で除く
ことができ、Fmoc、Dmtなどの当業技術者に知られてい
る基がある。これら保護基の選択は、合成されているラ
イブラリーのメンバーの他の特徴とのこれら保護基の適
合性のみならず、これら保護基を選択的に除去する条件
によって決める。例えば、光不安定性の官能性がある場
合、その保護基は、化学的な手段(すなわち、希釈され
た酸若しくは塩基または水素化分解法の利用)によって
選択的に除去可能でなければならない。したがって、Fm
ocとBocは、選択的に除去可能な保護基の二つの例にす
ぎない。固体支持体上のリンカーに、適切に保護された
「A」リングを連結した後、、その「A」リングを選択
的に誘導体化することができる。この誘導体化は、まず
保護基を除去し、次に所望の窒素含有複素環を合成部位
に連結することによって達成される。次いで、その複素
環部分の第二の保護基を除去して、適当な構築ブロック
の遊離アミンをその部位に共有結合させる。例えば、こ
のルートで合成できるピペラジン誘導体の多様なこと
は、使用できる構築ブロックのコンビナトリアルアレイ
の結果である。たとえアミノアルキルトリエトキシシラ
ン、これら構築ブロックは、アミノ酸とペプチド、カル
ボン酸およびイソシアネートを含む各種の官能基を有す
る化合物から選択することができる。
例えば、CRE−ルシフェラーゼ検定法によって検定さ
れるようなカルシトニン様活性を保持するこれらの化合
物だけがこの発明の範囲内に入っている。カルシトニン
の受容体は、Gタンパク質の受容体のファミリーのメン
バーであり、アデニル酸シクラーゼの活性化を通じてシ
グナルを伝達して、細胞cAMPのレベルを上昇させる(Li
n他、Science、254巻1022〜1024頁、1991年)。この検
定システムは、カルシトニンの受容体を刺激してシグナ
ルの伝達を開始できるカルシトニンではない他の分子を
検出するカルシトニン受容体の性能を利用している。
受容体の活性化は、(1)アデニル酸シクラーゼの活
性の測定(Salomon他、Anal.Biochem.、58巻541〜548頁
1974年;AlvarezおよびDaniels,Anal.Biochem.、187巻98
〜103頁1990年);(2)通常の放射線免疫検定法を用
いて行う、細胞内cAMPのレベルの変化の測定(Steiner
他、J.Biol.Chem.、247巻1106〜1113頁1972年;Harperお
よびBrooker,J.Cyc.Nucl.Res.、1巻207〜218頁1975
年);または(3)cAMPシンチレーション近接検定(cA
MP scintillation proximity assay)(SPA)法(Amers
ham Corp.、米国イリノイ州アーリントンハイツ)の使
用によって検出できる。これらの方法は感度と精度を提
供するが、検定を行う前にかなりの試料処理を必要と
し、時間がかかり、放射性同位元素の使用を要すること
があり、大規模のスクリーニング検定法としては扱いに
くいであろう。
別の検定システム「国際特許願公開第WO96/31536号
(この特許願は全体をこの明細書に援用するものであ
る)に記載のシステム」は、cAMPのレベルが高いため、
サイクリックAMP応答配列(CRE)−ルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子の発現を、カルシトニン受容体を発現する
細胞内では誘発できるが、カルシトニン受容体の発現を
欠いている細胞内で誘発できない物質を選ぶ必要があ
る。このような細胞としては、例えば、Boris/KS10−3
ハムスターカルシトニン受容体および幼ハムスターの腎
臓細胞(BHK570細胞)内のCRE−ルシフェラーゼレポー
ト遺伝子を発現する)またはHollex1(国際特許願公開
第WO96/31536号に記載されているように、BHK細胞内で
ヒトカルシトニン受容体およびCRE−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子を発現する)またはKZ10−20−48/pLJ6
−4−25(BHK細胞内でヒトグルカゴン受容体およびCRE
−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する)があ
る。ヒトグルカゴン受容体は、アデニル酸シクラーゼに
よるcAMPの増大によってシグナルを伝達するGタンパク
質共役型受容体のファミリーの他のメンバーである。
このCRE−ルシフェラーゼ検定法は、カルシトニン擬
似体がGタンパク質共役型受容体カルシトニン受容体を
刺激するときに、トリガーされる多段階シグナル伝達経
路の最終結果を測定する。この経路は複雑であり、カル
シトニン受容体の下流の複数のポイントでルシフェラー
ゼの転写を誘発する多数の機構を提供するので、カルシ
トニン特異的でない(例えば、フォルスコリンによるア
デニル酸シクラーゼの直接活性化)。非特異的誘導物質
によってトリガーされているいずれの応答も、上記のカ
ルシトニン受容体陰性細胞系を用いて対抗選別(counte
r screening)することによって除かれる。
上記説明と下記実施例は、本来、例示を目的として提
供し、この発明を限定するものではない。この明細書に
記載のシステムの操作条件、材料、手順のステップなど
のパラメータが、この発明の精神と範囲から逸脱するこ
となく各種の方法でさらに変形または置換できること
は、当業技術者であれば容易に分かるであろう。
実施例 実施例1 1.1 擬似体3の合成 この実施例は、図2に示す図式を利用して、市販の出
発物質から、下記カルシトニン擬似体3の合成を示す。
t−Boc−ピペラジン(8.6g、100mmol)と、3,3,5−
トリメトキシベンズアルデヒド(100mmol)を無水MeOH
(150mL)と混合し、次いで、透明な溶液が得られるま
で攪拌した。酢酸(6.0g)を添加し、次に47gの分子ふ
るい(4Å)を添加した。ゆるやかに1時間攪拌した
後、混合物を氷中で冷却し、次いでゆるやかに攪拌しな
がら、NaCNBH4(6.1g、100mmol)を、少量ずつ、1.5時
間かけて添加した。攪拌を70時間続けた後、混合物を濾
過し、濾液を減圧下で蒸発させた。生成した油状残留物
を、水とNH4Cl 10gで処理した。得られた懸濁液を攪拌
し、固体のKHSO4を用いてpHを約4まで酸性にした。生
成した懸濁液をNaHCO3で中和し次いでEtOAcで徹底的に
抽出した。有機層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、次に
減圧下で濃縮して、半固体の残留物を得た。その残留物
を無水エーテルを用いて研和し、結晶性固体を濾別して
冷エーテルで洗浄した。その固体を、2時間風乾し、次
に2時間減圧下乾燥して、m.p.が153〜155℃の固体の化
合物1「FABMS:367(MH+)」8.63gを得た。
上記固体の一部分(7.28g、20mmol)を、冷却された9
5%TFA/H2O(50mL)に溶解した。その混合物を、氷中で
30分間攪拌し、次いでTFAを減圧下で除去した。残留物
を水で処理し、1N HClでpH3〜4まで酸性にし、エーテ
ルで油出した(3×20mL)。得られた水性層を氷中で冷
却し固体Na2CO3で中和し、次に1N NaOHでpHを10に調節
した。得られた溶液をEtOAcで抽出した(5×40mL)。
水性層をNaClで飽和し、次いで再びEtOAcで抽出した
(2×30mL)。EtOAc抽出液を合して、水、ブラインで
洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させて化合
物2を得た。化合物2は、減圧デシケータ内で一夜乾燥
し、無水DMF(35mL)に溶解し、次いで氷中で冷却し
た。化合物2の冷却攪拌溶液に、3−トリフルオロメチ
ルイソシアネート(3.74g、20mmol)を乾燥DMF(15mL)
に溶解した溶液を、少量ずつ添加した。この反応を、イ
ソシアネートの消費量および遊離アミノの消費量の両者
について監視した。イソシアネートを添加する毎に、反
応混合物を20分間攪拌してから一部分を取り出してTLC
で測定した。最後の添加を行った後、反応混合物を一夜
攪拌した。DMFを減圧下で除去し、残留物を10%Na2CO3
溶液(50mL)で処理した。得られた懸濁液を10分間攪拌
し次にEtOAcで抽出した(5×50mL)。有機層を、水
(2×25mL)、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、次
に減圧下で乾燥した。残留物をエーテルに溶解して数時
間保持したところその間に結晶塊が析出した。その結晶
塊を濾別し、冷エーテルで洗浄し次いで風乾した。減圧
デシケータで一夜さらに乾燥して、生成物の化合物3
(850−0277)(7.5g、m.p.79−82℃)を得た。スペク
トルデータは、提案された構造と一致した。
1.2 50−0231の合成 この実施例は、先に1.1章で示した図式を利用して、
市販の出発物質からのカルシトニン擬似体50−0231の合
成を示す。簡単に述べると、t−Boc−ピペラジン(8.6
g、100mmol)と酢酸バニリン(100mmol)を無水MeOH(1
50mL)と混合し、透明な溶液が得られるまで攪拌する。
酢酸(6.0g)を添加し、次に分子ふるい(4Å)47gを
添加する。ゆるやかに1時間攪拌した後、混合物を氷中
で冷却し、次いでゆるやかに攪拌しながら、NaCNBH
4(6.1g、100mmol)を、少量ずつ、1.5時間かけて添加
する。攪拌を70時間続け、混合物を濾過し、次いで濾液
を減圧下で蒸発させる。得られた油状残留物を水および
NH4Cl 10gで処理する。得られた懸濁液を攪拌し、固体
のKHSO4でpH約4まで酸性にする。得られた懸濁液をNaH
CO3で中和し、次いでEtOAcで徹底的に抽出する。有機層
を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、次に減圧下で濃縮して
半固体の残留物を得る。その残留物を無水エーテルで研
和し、次に結晶性固体を濾別して冷エーテルで洗浄す
る。得られた固体を2時間風乾し、次に2時間減圧乾燥
する。
得られた固体の一部分(20mmol)を、冷却された95%
TFA/H2O(50mL)に溶解する。得られた混合物を氷中で3
0分間攪拌し、次いでTFAを減圧下で除去する。残留物を
水で処理し、1N HClでpH3〜4まで酸性にし、次いでエ
ーテルで抽出した(3×20mL)。水性層を氷中で冷却し
固体Na2CO3で中和し、次に1N NaOHでpHを10に調節す
る。得られた溶液をEtOAcで抽出する(5×40mL)。水
性層をNaClで飽和させ、次にEtOAcで再び抽出する(2
×30mL)。EtOAcによる抽出液を合し、水、ブラインで
洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で乾燥
する。その化合物を、減圧デシケータ内で一夜乾燥し、
無水DMF(35mL)に溶解し、氷中で冷却する。上記の冷
却された攪拌溶液に、乾燥DMF(15mL)に3−トリフル
オロメチルイソシアネート(3.74g、20mmol)を溶解し
た溶液を、少量ずつ添加する。その反応を、イソシアネ
ートの消費量および遊離アミノの消費量の両者について
監視する。イソシアネートを添加する毎に、反応混合物
を20分間攪拌して後、一部分取り出してTLCによる測定
を行う。イソシアネートの最後の添加を行った後、その
反応混合物を一夜攪拌する。DMFを減圧下で除去し、次
にその残留物を10%Na2CO3溶液(50mL)で処理する。得
られた懸濁液を10分間攪拌し、次にEtOAcで抽出する
(5×50mL)。有機層を水(2×25mL)、ブラインで洗
浄し、Na2SO4で乾燥し、次いで減圧下で蒸発させる。残
留物をエーテルに溶解し、次に数時間保持し、その間に
結晶塊が析出する。その結晶塊を濾別し、冷エーテルで
洗浄し、次いで風乾する。追加の乾燥を減圧デシケータ
で一夜行い、下記生成物の化合物50−0231を得る。
実施例2 この実施例は、ピペラジンが二つのベンジル基で置換
されているカルシトニン擬似体の製造について述べる。
簡単に述べると、t−Boc−ピペラジンを、上記の還
元的アルキル化の条件を用いて、第一の置換アリールア
ルデヒドでアルキル化する。次に生成物を脱保護し、次
いで最初の還元的アルキル化の条件に類似の条件を用い
て、第二の置換アリールアルデヒドでアルキル化する。
この一般的な手順および実施例1の手順を用いて製造で
きる化合物類を、以下に述べるCRE−ルシフェラーゼ検
定法で測定した活性と共に以下の表に示す。
化合物850−0231は、この明細書では、化合物50−023
1、化合物850−0276および化合物50−0276とも呼称され
る。
実施例3 この実施例は、この明細書に記載されている化合物
を、治療法に使う場合および他のカルシトニン擬似体を
開発するための結合検定法の標準として使う場合につい
て評価するのに利用できる生体外および半ビボの検定法
の両者を提供する。
3.1 カルシトニン擬似体の活性の検定法:カルシトニ
ン擬似体のCRE−ルシフェラーゼ検定法 受容体陽性細胞系と受容体陰性細胞系を、増殖培地
「10%の熱失活ウシ胎仔血清(HI−FCS)、2mMのL−グ
ルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、250nMのMTXお
よび1mg/mL G418を補充されたDMEM」中で、連続継代で
維持した。検定を行う1日前に、トリプシン処理を行
い、増殖培地内で2×105細胞/mLに調節し、不透明白色
のDynatech Microlite微量滴定組織培養プレートに100
μL/ウェル(2×104細胞)でプレートし、一夜、全面
密集増殖まで増殖させた(37℃、5%CO2の雰囲気)。
被検物質を、DMSO中に、最終の所望の検定濃度の100
倍の濃度で調製した。検定培地(10%のHI−FCS、2mMの
L−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび20m
M Hepes、pH7.25を補充したDMEM)中の1:100または1:1
000の比率で希釈された被検物質を1ウェル当たり100μ
L添加して誘導(induction)を開始した(最初のラウ
ンドのスクリーニング抽出液のみ1:100の比率で希釈し
た)。対照すなわち未処理ウェル(basal)、25mMフォ
ルスコリンおよび100mMヒトカルシトニンを各プレート
に入れた。DMSO中に調製した被検物質の場合、同濃度の
DMSOを対照のウェルに入れた(最終検定濃度の2%DMSO
を越えずに好ましい最高濃度1%で)。これらプレート
を、37℃にて、5%CO2の雰囲気中で3〜8時間(好ま
しくは4時間)インキュベートした。
誘導に続いて、ルシフェラーゼの活性を、Promegaル
シフェラーゼ検定法キット(E1500)を使用し、その検
定キットのプロトコルに従って、測定した。簡単に述べ
ると、検定培地を取り出し、次に細胞をリン酸緩衝食塩
水(PBS)で1回洗浄した。この洗浄を行った後、溶菌
(lysis)緩衝液25μLを各ウェルに添加し、それらプ
レートを室温で15分間インキュベートした。50μLのLu
ciferase Assay Substrate(Promega,Corp.)を各ウェ
ルに添加し、それらプレートを、Labsystems Lumiscan
微量滴定ルミノメーター(mirotiter luminometer)に
移した。ルミネセンスの量(相対光単位、RLU)を、0.1
秒/ウェルのシグナルインテグレーションの後「Fastsc
an」によって測定した。基本の(未誘導の)ルシフェラ
ーゼシグナルを、すべての測定値から差引いて、被検試
料によって誘導されたルシフェラーゼシグナルを、カル
シトニンとフォルスコリンの対照のシグナルの百分率と
して示した。カルシトニン受容体陽性細胞系に対するル
シフェラーゼ誘導の特異性は、カルシトニン受容体陽性
細胞系(Hollex−2)のパーセントコントロール値(pe
rcent control value)を、カルシトニン受容体陰性細
胞系(KZ10−20−48/Zem228)およびグルカコン受容体
陽性細胞系(KZ10−20−48/pLJ6−4−25)に観察され
たパーセントコントロール値と比較することによって求
めた。基本レベルを超えるシグナルを誘導する試料を選
択して、その後の特性決定に用いた。
3.2 頭蓋冠検定 4日齢の新生CD−1マウス由来の頭蓋冠(妊娠マウス
は米国メリーランド州ウィルミントン所在のCharles Ri
ver Laboratoriesから受領した)を、先端の小さい鋏
(fine−tipped scissors)でトリムして、矢状縫合部
を含む壁領域を除いた。これらのトリムした骨を、4.5g
/Lのグルコース、0.29mg/mLのL−グルタシン、1mMのピ
ルビン酸ナトリウム、15%の熱失活ウマ血清および抗生
物質類(ペニシリンG50μg/mL、ストレプトマイシン50
μg/mLおよびネオマイシン100μg/mL)を含有する増殖
培地(DMEM、BioWhittaker、米国メリーランド州ウォー
カーズビル)が1mL/ウェル入っている6ウェル細胞培養
クラスタープレート(Costar、米国カリフォルニア州プ
レザントン)中に、1ウェル当たり1個ずつ入れ、ゆる
やかに振盪させながら「RedRocker(登録商標)、model
PR50−115V,Hoefer、米国カリフォルニア州サンフラン
シスコ」、5%CO2の湿潤インキュベーター内で37℃に
て24時間プレインキュベーションを行った。
プレインキュベーションに続いて、培地を除き、1nM
の上皮小体ホルモン(PTH)1−34(Sigma)を含有する
増殖培地(1.5mL/ウェル)と取り替えて、骨吸収を刺激
した。PTHで誘発される骨吸収を抑制するカルシトニン
擬似体の性能を評価するため、DMSO中の擬似体化合物
を、1〜400μg/mLの範囲内の濃度で、増殖培地に添加
した(DMSOの最終検定濃度は1%未満かまたは1%に等
しい)。各試験で、ヒトカルシトニン(0.02〜20nM、好
ましくは0.2〜2nM)を、正の対照として、PTHで処理し
た骨に添加した。PTH、ヒトカルシトニンまたはカルシ
トニン擬似体を受け取らなかった対照ウェルを、未処理
の骨からのカルシウムの放出を測定するために含めた。
これらすべての対照ウェルに、カルシトニン擬似体で処
理したウェル中に存在するのと等しい最終検定濃度のDM
SOを含有させた。
各試料群に5個の骨を含めた。骨は、PTHを添加した
後、75時間インキュベートして、骨吸収を起こさせた。
一般的な外観、健康状態(healthiness)、および起こ
りうる毒性の可能な指標としてのインキュベーション中
に頭蓋冠から移行する細胞の数を観察した。試験される
頭蓋冠を、10%の中性緩衝ホルマリン10mLが入っている
ガラス製シンチレーションバイアルに、組織学的に移し
た。培地をウェルから取り出し、Nova7/7+7 Electroly
te Analyzer(Nova Biomedical、米国マサチューセッツ
州ウォルサム)を使用し製造メーカーの仕様書にしたが
って、全カルシウムを測定した。PTHによる骨吸収の誘
発は、骨基質の分解によって増殖培地中のカルシウム濃
度が増大することから分かる。ヒトカルシトニンおよび
生物学的に活性のカルシトニン擬似体は、PTHだけで処
理した骨と比べたとき、培地中のカルシウムが低いこと
によって示されるように、上記骨の吸収プロセスを阻害
する。
3.3 頭蓋冠の組織学 培養マウス頭蓋冠からのカルシウム放出を利用する頭
蓋冠骨吸収検定での前記知見を確認するため、選択され
た骨を、10%中性緩衝ホルマリンで固定し、次いで5%
ホルマリンを含有する5%ギ酸中で脱塩した。これらの
骨を、一連の濃度が上昇するエタノールで脱水し、グリ
コールメタクリレート中にインフィルトレートし(infi
ltrate)、JB−4埋包キット(PolySciences、米国ペン
シルベンニア州シォーリントン)を用いて埋包した(Li
u他、J.Bone Mineral Res.、5巻973〜982頁、1990
年)。5μmに切断された頭蓋冠の断面を得て、染色
し、タータレート耐性酸性ホスファターゼ(tartrate−
resistant acid phosphatase)(TRAP)の活性を測定
し、そしてメチルグリーンとチオニンで対比染色して細
胞の形態を観察した(Liu他の前掲文献)。破骨細胞
を、TRAP染色、多核化、大きい細胞の大きさおよび不規
則な細胞形態で確認した。破骨細胞の数を、頭蓋内およ
び頭蓋外側の骨の面から計数し、数/mm周長で表した。
計数された破骨細胞全部の大きさも、Bone Morphometry
プログラムを用いて測定した(Liu他の前掲文献;Bain
他、J.Bone Miner.Res.、8巻435〜442頁、1993年)。
この組織形態計測法は、ヒト上皮小体ホルモン(PTH
1−34)による処理で破骨細胞の数と大きさが増大する
ことを示した。このPTHによって誘発される増大は、ヒ
トカルシトニンによる処理によって抑制された。
カルシトニン擬似体の化合物を、PTHで誘発される破
骨細胞の数と大きさの増大を抑制するそれらの性能につ
いて類似の方法で評価した。細胞毒性(または細胞死)
も、少数の骨細胞における核濃縮症の核の出現で評価し
た。毒性のレベルが増大すると、これらの核濃縮症の核
の数のさらなる増大、骨表面からの細胞の剥離、および
細胞質のステイン(cytoplasmic stain)と細胞境界の
喪失が観察された。また骨溶解性間隙も空のようであっ
た。
比較する場合のヒトカルシトニンのIC50は約0.2〜0.5nM
である。
3.4 ラットにおける低カルシウム血症の誘発 この検定法は、カルシトニンの破骨細胞に対する生体
外の急性作用に基づいており、カルシトニンは、骨表面
からの破骨細胞の急速な後退を起こして(一般に30分以
内)、骨吸収が減少する(Taylor編、「Endocrinology
1971−Proceedings of the Third International Sympo
sium」、Heinemann Medical、ロンドン79−88頁、1972
年のMillsの報告、およびSinger他、Clin.Endocrinol、
5(Supp):333s−340s、1976年参照。なお、これら文
献はこの明細書に援用するものである)。この検定法
は、SturtridgeおよびKumar、Lancet、545巻725〜726
頁、1968年に記載されている方法を変形したものであ
り、この文献の開示内容はこの明細書に援用するもので
ある。
低カルシウム血症の活性を検定するため、雄の離乳仔
のHoltzman Sprague−Dawleyラット(22日齢)に、媒質
(1mMのHClと0.1%のBSAを含有するPBS)、カルシトニ
ンまたはカルシトニン擬似体を尾の静脈から注入する。
1時間後、眼窩洞穿刺法によって血液試料を集めて、血
清のカルシウムレベルを測定する。血清のカルシウムが
低いのは低カルシウム血症の応答を示す。その低カルシ
ウム血症の応答は、このモデルでサケのカルシトニン
(0.5、2.5、5、50および100ng/ラット)を用いて測定
すると投与量依存性である。
3.5 TPTXラットにおいてPTHが誘発する高カルシウム血
症の抑制 甲状腺上皮細胞を切除した(TPTX)ラットにPTHを連
続的に注入すると、高範囲の骨の破壊と重篤な高カルシ
ウム血症をもたらす(Thompson他、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、85巻5673〜5677頁、1988年参照。この文献はこ
の明細書に援用するものである)。動物モデルの樹立に
成功している(Liu他、J.Bone Mineral Res.、11(Supp
l.1):S206、1996年参照。この文献はこの明細書に援用
するものである)。
生体内検定の場合、雄のSprague−Dawleyラット(体
重約150g)の甲状腺上皮小体を除去し、手術の成功を血
清のカルシウムレベルを測定することによって確認す
る。8mg/dl未満の血清カルシウムのレベルで手術に成功
した動物を、低カルシウムの飼料(0.02%Caおよび0.6
%P、ICN特別飼料)で維持し、媒質(1mMのHClと0.1%
BSAを含有するPBS)、PTH(75μgヒトPTH 1−34/kg
体重/日)、PTH+カルシトニン(サケカルシトニン50U
/kg体重/日)、またはPTH+カルシトニン擬似体を、Al
zetオスモティックミニポンプ(Model 1003D、Alza Cor
p.、米国カリフォルニア州パロアルト)によって、皮下
に(S.C.)注入する。注入してから2日後、動物を殺
し、血液試料を採取して、PTHで誘発される高カルシウ
ム血症の応答が、カルシトニンまたはカルシトニン擬似
体の同時投与によって抑制されるかどうかを決定する。
さらに、脛骨の試料を集めて破骨細胞の骨吸収を確認
しそして腎臓の試料を集めて腎石灰症を確認して、血清
の化学組成の知見を確認する。PTHで誘発された重篤な
高カルシウム血症は、処置してからわずか2日後に、破
骨細胞の数と大きさの増大、広範囲の骨の破壊および腎
臓の石灰化(腎石灰)が起こることが報告されている
(Liu他の前掲文献参照)。血清、骨および腎臓の変化
は、CTの同時投与によって低下した。
3.6 ラットの卵巣切除と不動化の組合せによって誘発
される骨損失 エストロゲン欠失と不動化は共に、ヒトや実験動物に
骨損失を誘発する。その組み合わせ効果によって重篤な
骨減少症が起こる(Strachan他、J.Bone Mineral Res.1
1(suppl.1):S456、1996年参照。この文献はこの明細
書に援用するものである)。また、いくつもの研究論文
は、カルシトニンが、卵巣切除と不動化の組み合わせに
伴う骨損失を軽減するのに有効であることを報告してい
る(Hayashi他、Bone、10巻25〜28頁1989年およびMcShe
ehy他、Bone、16巻435〜444頁1995年参照。これらの文
献の開示内容はこの明細書に援用するものである)。最
近、少し改変した方法を使用して、上記結果が再現さ
れ、そして、pQCTまたはラットの組織形態計測で評価し
た場合、カルシトニンが組み合わせ手術に伴う骨損失を
減らすのに非常に有効であることが示されている(Stra
chan他、J.Bone Mineral Res.、11(Suppl.1):S456,19
96年参照)。
骨損失を誘発させるため、2ヶ月齢のSprague−Dawle
yラット(体重約200g)の卵巣を切除し、かつその左後
足の坐骨神経を切離して不動化する。その不動化された
動物を、媒質(1mMのHClと0.1%のBSAを含有するPB
S)、カルシトニン(15U/kg体重/日)またはカルシト
ニン擬似体で、6週間処理した。カルシトニンの注射
(15mg/kg体重/日)は、殺す前の9日目と2日目に腹
腔内に行う。骨の組織形態計測をすでに報告されている
のと同様にして実施して(Liu他、J.Bone Mineral Re
s.、5巻973〜982頁1990年参照)、カルシトニンとカル
シトニン擬似体の効果を確認する。
3.7 カルシトニンの逸脱現象を確認する頭蓋冠の検定 4日齢の新生のCD−1マウス(妊娠マウスはCharles
River Laboratoriesから受け入れた)由来の頭蓋冠を、
先端の細い鋏でトリムして、矢状縫合部を含む頭頂領域
を除いた。これらのトリムされた骨を、増殖培地が1mL/
ウェルずつ入っている6ウェル培養クラスタープレート
(Costar)中に、一つのウェル当たり1個ずつ入れた。
なお、その増殖培地は、4.5g/Lのグルコース、0.29mg/m
LのL−グルタシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、15%
の熱失活ウマ血清、抗生物質類(ペニシリンG 50μg/
mL、ストレプトマイシン50μg/mLおよびネオマイシン10
0μg/mL)、ならびに5nMの上皮小体ホルモン(PTH)1
−34(Sigma)を含有する基礎培地「イーグルの塩を含
有するイーグル培地(GIBCO BRL、米国メリーランド州
ガイサーズバーグ」である。次にそのプレートを、37℃
にて5%CO2の湿潤インキュベーター中でゆるやかに振
盪させて(RedRocker)、17.5時間のプレインキュベー
ションを行った。PTHの濃度は最大の骨吸収を保証する
ように選択した。対照と指定した頭蓋冠を、PTHなしの
培地内でプレインキュベートした。
プレインキュベーションに続いて、培地を除いて、DM
SO中にカルシトニン擬似体850−0231を20μg/mLまたは3
0μg/mL含有する上記増殖培地1mL/ウェルと取り替えて
(DMSOの最終検定濃度は1%未満かまたは1%に等し
い)、そして、0.5、1.0、5.0または10nMで試験したヒ
トカルシトニン(hCT)および0.01、0.02、0.05または
0.2nMで試験したサケカルシトニン(sCT)と比較した。
PTH、ヒト若しくはサケのカルシトニン、またはカルシ
トニン擬似体を入れなかった対照ウェルを、未処理の骨
からのカルシウム放出を測定するために含めた。対照の
ウェルは、すべてカルシトニン擬似体で処理したウェル
中に存在しているのと等しい最終検定濃度のDMSOを含有
させた。
各試料グループに、骨を5個ずつ使用した。骨は合計
98時間インキュベートした。タイムポイントを、4、
8、11、24、50.5、72.5および98時間にとった。各タイ
ムポイントでPTHを含有する培地を除いて、化合物の新
しい希釈液を含有する培地を、頭蓋冠に添加した。前記
培地を除いた後、Nova7/7+7 Electrolyte Analyzer(N
ova Biomedical)を使用し、製造メーカーの仕様書にし
たがって、全カルシウム量を測定した。PTHによって骨
吸収が誘発されることは、骨基質が分解するため、増殖
培地中のカルシウムの濃度が増大することから分かる。
ヒトおよびサケのカルシトニンならびに生物学的に活
性のカルシトニン擬似体は、PTHだけで処理された骨と
比較して、増殖培地中のカルシウムが少ないことによっ
て実証されているように、骨吸収プロセスを阻害する。
しかし、表3に示すように、hCTとsCTの抑制作用は約24
時間後に失われ、次いで吸収率(rate of resorption)
はPTHのみの場合と同じスロープをたどる。カルシトニ
ン擬似体850−0231にはこのような逸脱現象はなく、30
μg/mLで98時間を通じて骨吸収を抑制し続けたのであ
る。
五つの試料の平均値であり、対照の値を差引いた。
最終のタイムポイントで頭蓋冠を肉眼で観察したとこ
ろ、PTHで処理した頭蓋冠は明白な骨吸収を受けたこと
が分かった。ヒトおよびサケのカルシトニンならびに85
0−0231カルシトニン擬似体で処理された頭蓋冠は骨吸
収が少なかった。そしてカルシトニン擬似体で処理され
た頭蓋冠は、外観が、未処理の頭蓋冠とほとんど同一で
あった。その上に、対照の頭蓋冠および850−0231で処
理した頭蓋冠から同数の細胞が移行したということは、
この化合物が細胞に対して毒性でないことを示した。
第二の頭蓋冠骨吸収/逸脱現象の検定を、4、8、1
2、16、24、49および73時間のタイムポイントで先に述
べたのと同様にして実施した。ヒトとサケのカルシトニ
ンは、やはり、その阻害作用を、16時間と24時間の間に
失い、そしてカルシトニン擬似体850−0231は73時間を
通じて骨吸収を阻害し続けることができた(図4)。PT
Hで処理した頭蓋冠と、30μg/mLのカルシトニン擬似体
で処理した頭蓋冠についてヒストロジー(histology)
を実施した。PTHで処理した試料はほとんど完全に吸収
されたが、一方、カルシトニン擬似体で処理された頭蓋
冠は無傷でかつ毒性の徴候は最小であった。
五つ試料の平均値であり、対照の値を差引いた。
第三の頭蓋冠の骨吸収/逸脱現象の検定を、下記のよ
うに変えて、先に述べたように実施した。カルシトニン
擬似体を、5、10および20μg/mLで試験した。PTHを10n
Mで使用して最大の骨吸収を保証し、hCTを2nMと8nMで試
験し、sCTは含めなかった。頭蓋冠は、PTHで19.75時間
前処理した。BrdU(プロモデオキシウリジン、最終濃度
10μM)を、最終の17.5時間に、増殖培地中に添加し
て、増殖する細胞を確認した。850−0231に毒性がない
ことは、頭蓋冠の組織学的セクションに増殖しているBu
dU+細胞の数を定量することによって実証される。タイ
ムポイントを、4、8、11、24.5、48および77時間にと
った。Nova CRT10+Electrolyte Analyzer(Nova Biome
dical)を用いて、上記タイムポイントの試料を分析し
た。
最終のタイムポイントにおいて、骨吸収の程度および
毒性の尺度としての頭蓋冠細胞からの移行を知るため、
肉眼による観察を行い、かつ写真をとった。やはり、ヒ
トカルシトニンは11時間の間にその阻害作用を失った
(表5)。5μg/mLおよび10μg/mLのカルシトニン擬似
体で処理した頭蓋冠も11時間と24時間の間で阻害作用を
失った。20μg/mLの850−0231で処理した場合、骨吸収
は全タイムポイントで有意に阻害されたが、その程度
は、前記のように30μg/mLの850−0231で処理した頭蓋
冠ほとんどではなかった。
五つの試料の平均値であり、対照の値を差引いた。
上記説明はこの発明を例示するものでこの発明を限定
するものではない。当業技術者は、この開示内容を見れ
ば、この発明の多くの変形が明らかになるであろう。し
たがって、この発明の範囲は、上記説明によって決定さ
れるべきではなく、この発明の均等物の全範囲とともに
後記特許請求の範囲によって決定されるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C07D 295/20 C07D 295/20 A (72)発明者 ラブルー, ビレンダ アメリカ合衆国 98012 ワシントン州 ミル クリーク ワンハンドレッドシ ックスティーサード プレース サウス イースト 2814 (72)発明者 ストロープ, スティーブン アメリカ合衆国 98155 ワシントン州 シアトル サーティーシックスズ ア ベニュー ノースイースト 16018 (72)発明者 ベイゲル, ステファニ アメリカ合衆国 98112 ワシントン州 シアトル トゥエンティーシックスズ アベニュー イースト 2039 (72)発明者 マルティネス, テレサ アメリカ合衆国 98253 ワシントン州 グリーンバンク ハネムーン ベイ ロード 4591 (72)発明者 ペトリー, チャールズ アメリカ合衆国 98073 ワシントン州 ウッディンビル ノースイースト ワ ンハンドレッドナインティーシックスズ プレース 18459 (72)発明者 オルメ, マーク, ダブリュー. アメリカ合衆国 98103 ワシントン州 シアトル ナンバー 203 フランシ ス ネイブ ノース 4235 (72)発明者 マッケルナン, パトリシア, エイ. アメリカ合衆国 98073 ワシントン州 ウッディンビル ノースイースト ワ ンハンドレッドナインティーシックスズ プレース 18459 (72)発明者 ムーア, エンマ, イー. アメリカ合衆国 98199 ワシントン州 シアトル サーティース アベニュー ウェスト 3507 (56)参考文献 特開 平2−3678(JP,A) 特開 平5−255089(JP,A) 特開 昭50−19759(JP,A) 特開 平9−28583(JP,A) Eur.J.Med.Chem.,C him.Ther.,1984年,Vol. 19,No.2,p.131−135 Yaoxue Xuebao,1986 年,Vol.21,No.5,p.345− 355 Med.Chem.Res.,1996 年,Vol.6,No.2,p.69−80 Indian J.Pharm., 1974年,Vol.36,No.2,p.40 −43 Indian J.Chem.,Se ct.B,1984年,Vol.23B,N o.7,p.650−654 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07D 295/00 - 295/32 A61K 31/495 CA(STN) CAOLD(STN) REGISTRY(STN)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記式I: で表される化合物であって、式中 Aは下記式で表される基から選択され; BはOH、OCH3、CH3、Brから選択される2つ以上の置換
    基を有する置換フェニルであり; R1とR2は各々、水素原子であり; Y1とY2は各々、独立して、−CH2−、−NHC(O)−、−
    NRC(O)−、−NHC(S)−、−NRC(S)−、−NHC
    (=NH)−、−OC(O)−、−C(O)−および−C
    (S)−からなる群から選択される二価の基(これらの
    基のRは1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル基で
    ある)であり;そして nはゼロ〜4の整数である;化合物。
  2. 【請求項2】骨に関連する障害を治療するために、骨に
    関連する障害が見られる被検者に投与される化合物であ
    って、下記式I: で表され、式中、Aは下記式で表される基から選択さ
    れ; BはOH、OCH3、CH3、Brから選択される2つ以上の置換
    基を有する置換フェニルであり; R1とR2は各々、水素原子であり; Y1とY2は各々、独立して、単結合または−CH2−、−NHC
    (O)−、−NRC(O)−、−NHC(S)−、−NRC
    (S)−、−NHC(=NH)−、−OC(O)−、−C
    (O)−および−C(S)−からなる群から選択される
    二価の基(これらの基のRは1〜6個の炭素原子を有す
    る低級アルキル基である)であり;そして nはゼロ〜4の整数である;化合物。
  3. 【請求項3】前記骨に関連する障害が、骨粗しょう症、
    パジェット病、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、歯周ア
    プリケーション(骨損失)、悪性の高カルシウム血症お
    よび幼児の高カルシウム血症からなる群から選択される
    請求項2に記載の化合物。
  4. 【請求項4】骨吸収を抑制するために、骨吸収を抑制す
    る必要がある被検者に投与される化合物であって、下記
    式I: で表され、式中、Aは下記式で表される基から選択さ
    れ; BはOH、OCH3、CH3、Brから選択される2つ以上の置換
    基を有する置換フェニルであり; R1とR2は各々、水素原子であり; Y1とY2は各々、独立して、単結合または−CH2−、−NHC
    (O)−、−NRC(O)−、−NHC(S)−、−NRC
    (S)−、−NHC(=NH)−、−OC(O)−、−C
    (O)−および−C(S)−からなる群から選択される
    二価の基(これらの基のRは1〜6個の炭素原子を有す
    る低級アルキル基である)であり;そして nはゼロ〜4の整数である;化合物。
  5. 【請求項5】下記式I: 「式中、Aは下記式で表される基から選択され; BはOH、OCH3、CH3、Brから選択される2つ以上の置換
    基を有する置換フェニルであり; R1とR2は各々、水素原子であり; Y1とY2は各々、独立して、−CH2−、−NHC(O)−、−
    NRC(O)−、−NHC(S)−、−NRC(S)−、−NHC
    (=NH)−、−OC(O)−、−C(O)−および−C
    (S)−からなる群から選択される二価の基(これらの
    基のRは1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル基で
    ある)であり;そして nはゼロ〜4の整数である」で表される化合物の有効量
    を、医薬として許容される担体中に、単位剤形で含有す
    る医薬組成物。
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