JP3467058B2 - 媒介物質の検出および測定方法 - Google Patents
媒介物質の検出および測定方法Info
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Description
【０００１】本発明は媒介物質（mediator）および／ま
たはそれらの誘導体の検出および測定方法に関する。媒
介物質は、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−１、
ＴＮＦ、ＩＬ−８またはＩＬ−４、サイトカイン、例え
ばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭｅｇ−ＣＳＦ、あ
るいはエリスロポエチンである。媒介物質は体の特定の
細胞例えばリンパ球により分泌される重要なシグナルタ
ンパク質であり、そしてそれら同じ細胞あるいは体の他
の細胞に対して調節的に作用し得る。かかる媒介物質は
この調節機能を極めて低い濃度で発揮し得る。異常病態
にあっては、様々な媒介物質の自然の協調が乱されるこ
とがある。これらの状況下では、平均的健常者における
媒介物質の平均濃度に比べてこれら媒介物質濃度が高か
ったり低かったりすることがある。診断的観点からは、
体液中、または他の給源例えば臓器ホモジネート中の特
定の媒介物質の濃度を測定することは重要である。さら
に、治療または予防目的に、患者を特定の媒介物質で処
置できる。この場合にも、診断的観点からは、既投与媒
介物質の、あるいはその既投与媒介物質の影響により濃
度変化を受ける他の媒介物質の濃度を測定することが極
めて重要である。すなわち、例えば、アレルギー性疾患
または感染症患者におけるＩＬ−４の出現は健常人に比
べ異常に変化する。その理由は、かかる疾病においてよ
く起こるＴＨ２サブポピュレーションのＴ−リンパ球の
出現増加によるものとすることができ、そしてＴＨ２サ
ブポピュレーションは、ＴＨ１サブポピュレーションに
比べ、インターロイキン−４を優先的に生産する（S. R
omagnani, Immunology Today, Vol. 12, No. 8, 256−2
57, 1991; Else および Grencis, Parasitology Today,
Vol. 7, No. 11, 313−316, 1991）。加えて、リンパ
球または他の細胞の細胞培養上清中の媒介物質を測定す
ることは、診断的観点から重要である。
たはそれらの誘導体の検出および測定方法に関する。媒
介物質は、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−１、
ＴＮＦ、ＩＬ−８またはＩＬ−４、サイトカイン、例え
ばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭｅｇ−ＣＳＦ、あ
るいはエリスロポエチンである。媒介物質は体の特定の
細胞例えばリンパ球により分泌される重要なシグナルタ
ンパク質であり、そしてそれら同じ細胞あるいは体の他
の細胞に対して調節的に作用し得る。かかる媒介物質は
この調節機能を極めて低い濃度で発揮し得る。異常病態
にあっては、様々な媒介物質の自然の協調が乱されるこ
とがある。これらの状況下では、平均的健常者における
媒介物質の平均濃度に比べてこれら媒介物質濃度が高か
ったり低かったりすることがある。診断的観点からは、
体液中、または他の給源例えば臓器ホモジネート中の特
定の媒介物質の濃度を測定することは重要である。さら
に、治療または予防目的に、患者を特定の媒介物質で処
置できる。この場合にも、診断的観点からは、既投与媒
介物質の、あるいはその既投与媒介物質の影響により濃
度変化を受ける他の媒介物質の濃度を測定することが極
めて重要である。すなわち、例えば、アレルギー性疾患
または感染症患者におけるＩＬ−４の出現は健常人に比
べ異常に変化する。その理由は、かかる疾病においてよ
く起こるＴＨ２サブポピュレーションのＴ−リンパ球の
出現増加によるものとすることができ、そしてＴＨ２サ
ブポピュレーションは、ＴＨ１サブポピュレーションに
比べ、インターロイキン−４を優先的に生産する（S. R
omagnani, Immunology Today, Vol. 12, No. 8, 256−2
57, 1991; Else および Grencis, Parasitology Today,
Vol. 7, No. 11, 313−316, 1991）。加えて、リンパ
球または他の細胞の細胞培養上清中の媒介物質を測定す
ることは、診断的観点から重要である。
【０００２】例えば前掲のような媒介物質は、膜に存在
する受容体（receptor）を介してそれらの正または負の
作用を発揮する。これらの受容体は、規定された結合部
位を介して媒介物質の規定されたエピトープに結合す
る。次に、その受容体および／または関連分子を介して
細胞内へのシグナル伝達が起こり、その結果生物学的作
用が細胞内で生じる。従って、かかる媒介物質の生物学
的作用は、膜に存在する受容体上の結合部位への至適結
合と厳密に連関している。例えば、結合部位には直接結
合しないが受容体上の他のエピトープに直接結合する物
質または媒介物質はシグナル伝達を全く引き起さない可
能性がある。
する受容体（receptor）を介してそれらの正または負の
作用を発揮する。これらの受容体は、規定された結合部
位を介して媒介物質の規定されたエピトープに結合す
る。次に、その受容体および／または関連分子を介して
細胞内へのシグナル伝達が起こり、その結果生物学的作
用が細胞内で生じる。従って、かかる媒介物質の生物学
的作用は、膜に存在する受容体上の結合部位への至適結
合と厳密に連関している。例えば、結合部位には直接結
合しないが受容体上の他のエピトープに直接結合する物
質または媒介物質はシグナル伝達を全く引き起さない可
能性がある。
【０００３】今般、驚くべきことに、液体中媒介物質の
存在および濃度の検出に、これら媒介物質に対する組換
え可溶性受容体を使用できることが見出された。従って
本発明は、検出すべき媒介物質の組換え可溶性受容体を
該媒介物質を含有する可能性のある検体と接触させ、そ
してその受容体に結合した媒介物質を該媒介物質に特異
的な抗体により直接または間接に検出することより成
る、液体中の媒介物質および／またはそれらの誘導体の
検出および測定方法に関する。
存在および濃度の検出に、これら媒介物質に対する組換
え可溶性受容体を使用できることが見出された。従って
本発明は、検出すべき媒介物質の組換え可溶性受容体を
該媒介物質を含有する可能性のある検体と接触させ、そ
してその受容体に結合した媒介物質を該媒介物質に特異
的な抗体により直接または間接に検出することより成
る、液体中の媒介物質および／またはそれらの誘導体の
検出および測定方法に関する。
【０００４】有利な一方法においては、媒介物質の二量
体または多量体、またはそれらの誘導体を測定する。有
利な他の一方法においては、受容体またはその誘導体を
固相に結合させる。有利な他の一方法においては、受容
体および抗体のＦｃ部分またはその誘導体より成る組換
え融合タンパク質をＦｃ−特異的抗体を介して固相に結
合させる。特に有利な一方法においては、受容体または
その誘導体を特異的抗体を介して固相に結合させ、次い
で測定すべき相当する媒介物質を含有する検体材料を適
用し、そしてその媒介物質を該媒介物質に対する特異性
を有する標識抗体または抗血清を用いて検出する。
体または多量体、またはそれらの誘導体を測定する。有
利な他の一方法においては、受容体またはその誘導体を
固相に結合させる。有利な他の一方法においては、受容
体および抗体のＦｃ部分またはその誘導体より成る組換
え融合タンパク質をＦｃ−特異的抗体を介して固相に結
合させる。特に有利な一方法においては、受容体または
その誘導体を特異的抗体を介して固相に結合させ、次い
で測定すべき相当する媒介物質を含有する検体材料を適
用し、そしてその媒介物質を該媒介物質に対する特異性
を有する標識抗体または抗血清を用いて検出する。
【０００５】格別に有利な一方法においては、受容体お
よび抗体のＦｃ部分、またはその誘導体より成る組換え
融合タンパク質をＦｃ−特異的抗体を介して固相に結合
させ、次いで測定すべき相当する媒介物質、またはその
誘導体、を含有する検体材料を適用し、そして結合した
媒介物質を該媒介物質に対する特異性を有する標識抗体
または血清を用いて検出する。他の有利な一方法におい
ては、適切な測定系における検出に適した物質に結合さ
れた受容体またはその誘導体より成る接合体を用いて、
例えば特異的抗体を介して、固相に結合された媒介物質
および／またはその誘導体を検出する。
よび抗体のＦｃ部分、またはその誘導体より成る組換え
融合タンパク質をＦｃ−特異的抗体を介して固相に結合
させ、次いで測定すべき相当する媒介物質、またはその
誘導体、を含有する検体材料を適用し、そして結合した
媒介物質を該媒介物質に対する特異性を有する標識抗体
または血清を用いて検出する。他の有利な一方法におい
ては、適切な測定系における検出に適した物質に結合さ
れた受容体またはその誘導体より成る接合体を用いて、
例えば特異的抗体を介して、固相に結合された媒介物質
および／またはその誘導体を検出する。
【０００６】本発明はさらに、かかる方法を、媒介物質
の、または受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを
検索するために使用することに関する。本発明はまた、
かかる方法を、媒介物質とその受容体との間の親和性を
測定するために使用することに関する。本発明は同様
に、かかる方法を、修飾された媒介物質（“ムティン”
(mutein)）または媒介物質の部分（例えばオリゴペプチ
ド）を同定しそして分析するために用いることに関す
る。
の、または受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを
検索するために使用することに関する。本発明はまた、
かかる方法を、媒介物質とその受容体との間の親和性を
測定するために使用することに関する。本発明は同様
に、かかる方法を、修飾された媒介物質（“ムティン”
(mutein)）または媒介物質の部分（例えばオリゴペプチ
ド）を同定しそして分析するために用いることに関す
る。
【０００７】この関係で述べれば、本方法を、病原生物
（例えばウイルスまたは細菌）と細胞受容体との相互作
用に影響する物質を同定しそして分析するのに用いるの
が有利である。かかる方法を細胞粘着分子の相互作用に
影響する物質を同定するために用いるのが特に有利であ
る。特に有利な一方法においては、受容体はサイトカイ
ン受容体、成長ホルモン受容体、ホルモン受容体、神経
伝達物質受容体、病原生物例えばウイルスに対する細胞
受容体である。
（例えばウイルスまたは細菌）と細胞受容体との相互作
用に影響する物質を同定しそして分析するのに用いるの
が有利である。かかる方法を細胞粘着分子の相互作用に
影響する物質を同定するために用いるのが特に有利であ
る。特に有利な一方法においては、受容体はサイトカイ
ン受容体、成長ホルモン受容体、ホルモン受容体、神経
伝達物質受容体、病原生物例えばウイルスに対する細胞
受容体である。
【０００８】格別に有利な一方法においては、受容体は
インターロイキン−４受容体またはその誘導体、エリス
ロポエチン受容体またはその誘導体、インターロイキン
１受容体タイプＩまたはタイプIIまたはその誘導体、イ
ンターロイキン７受容体またはその誘導体、ＧＭ−ＣＳ
Ｆまたはその誘導体、またはＩＬ−８受容体またはＴＮ
Ｆ受容体またはその誘導体である。本発明はまた、ＴＨ
２ Ｔ−細胞の出現増を示す疾病、例えばアレルギー性
疾患または感染症におけるインターロイキン−４の診断
検出のためのこのタイプの方法にも関する。
インターロイキン−４受容体またはその誘導体、エリス
ロポエチン受容体またはその誘導体、インターロイキン
１受容体タイプＩまたはタイプIIまたはその誘導体、イ
ンターロイキン７受容体またはその誘導体、ＧＭ−ＣＳ
Ｆまたはその誘導体、またはＩＬ−８受容体またはＴＮ
Ｆ受容体またはその誘導体である。本発明はまた、ＴＨ
２ Ｔ−細胞の出現増を示す疾病、例えばアレルギー性
疾患または感染症におけるインターロイキン−４の診断
検出のためのこのタイプの方法にも関する。
【０００９】天然の、生物学的に重要な受容体結合部位
を相当する媒介物質の検出に用いることが特に有利であ
る。何故ならば、膜に存在する天然の受容体にも結合す
る。したがって生物学的に活性である媒介物質分子だけ
が測定されるからである。本発明においては、受容体は
相当する媒介物質を特異的に結合できる全ての変種およ
び誘導体を意味するものと理解される。
を相当する媒介物質の検出に用いることが特に有利であ
る。何故ならば、膜に存在する天然の受容体にも結合す
る。したがって生物学的に活性である媒介物質分子だけ
が測定されるからである。本発明においては、受容体は
相当する媒介物質を特異的に結合できる全ての変種およ
び誘導体を意味するものと理解される。
【００１０】検出は、適当な条件の下に、組換え可溶性
受容体を検出系の固相、例えばミクロタイトレーション
プレートの合成材料に結合させることにより行うことが
できる。かかる固相は自体、当業者に知られている。有
利な固相は次のとおりである：磁性粒子、天然または合
成ポリマーで構成された粒子、例えばいわゆるラテック
ス粒子またはイオン交換樹脂またはコバレント（covale
nt）なまたはくぼみのある物品の形の合成ポリマー例え
ばミクロタイトレーションプレートまたは球状体など。
可磁化性粒子、ラテックス粒子またはミクロタイトレー
ションプレートが特に有利である。ミクロタイトレーシ
ョンは格別に有利である。受容体はそれが膜内に存在し
ている形では存在しないが、驚くべきことにそれは相当
する媒介物質上の相当するエピトープを、天然の膜結合
受容体の親和性をもって結合する。次いでその結合した
媒介物質を自体当業者に知られた方法により検出するこ
とができる。そのために、検出した媒介物質を、媒介物
質上の更なるエピトープに対する一以上のモノクローナ
ル抗体、または媒介物質上のいくつかの更なるエピトー
プに対する抗血清とカップリングさせることができる。
受容体を検出系の固相、例えばミクロタイトレーション
プレートの合成材料に結合させることにより行うことが
できる。かかる固相は自体、当業者に知られている。有
利な固相は次のとおりである：磁性粒子、天然または合
成ポリマーで構成された粒子、例えばいわゆるラテック
ス粒子またはイオン交換樹脂またはコバレント（covale
nt）なまたはくぼみのある物品の形の合成ポリマー例え
ばミクロタイトレーションプレートまたは球状体など。
可磁化性粒子、ラテックス粒子またはミクロタイトレー
ションプレートが特に有利である。ミクロタイトレーシ
ョンは格別に有利である。受容体はそれが膜内に存在し
ている形では存在しないが、驚くべきことにそれは相当
する媒介物質上の相当するエピトープを、天然の膜結合
受容体の親和性をもって結合する。次いでその結合した
媒介物質を自体当業者に知られた方法により検出するこ
とができる。そのために、検出した媒介物質を、媒介物
質上の更なるエピトープに対する一以上のモノクローナ
ル抗体、または媒介物質上のいくつかの更なるエピトー
プに対する抗血清とカップリングさせることができる。
【００１１】結合した抗血清または結合したモノクロー
ナル抗体を検出するために、後者は、相当する物質また
はタンパク質に直接カップリングさせることができる。
かかるシグナル発生成分は自体当業者に知られている；
それらは、例えば、放射性核種を用いる等して定量的検
出を可能にする、あるいは例えばカップリングされたペ
ルオキシダーゼを用いる等して酵素的に触媒される呈色
反応を可能にする、あるいはルミネセンスまたは蛍光に
よる検出を可能にする物質の酵素的に触媒される生産を
可能にする物質またはタンパク質である。ルミネセンス
標識を用いるのが有利であり、またこの関係で云えばＥ
Ｐ ０,２５７,５４１およびＥＰ ０,３３０,０５０に記
載の化合物を用いるのが特に有利である。抗血清または
モノクローナル抗体を可磁化性粒子にカップリングさせ
ることもできる。
ナル抗体を検出するために、後者は、相当する物質また
はタンパク質に直接カップリングさせることができる。
かかるシグナル発生成分は自体当業者に知られている；
それらは、例えば、放射性核種を用いる等して定量的検
出を可能にする、あるいは例えばカップリングされたペ
ルオキシダーゼを用いる等して酵素的に触媒される呈色
反応を可能にする、あるいはルミネセンスまたは蛍光に
よる検出を可能にする物質の酵素的に触媒される生産を
可能にする物質またはタンパク質である。ルミネセンス
標識を用いるのが有利であり、またこの関係で云えばＥ
Ｐ ０,２５７,５４１およびＥＰ ０,３３０,０５０に記
載の化合物を用いるのが特に有利である。抗血清または
モノクローナル抗体を可磁化性粒子にカップリングさせ
ることもできる。
【００１２】放射性核種を用いた検出には、例えば Sie
kierka, J. J. および De Gudicibus, S., Anal. Bioch
em. Vol. 172 (1988), 514−517の方法を用いることが
できる。呈色反応による検出には、抗血清または一以上
のモノクローナル抗体をビオチン化することもできる
（King および Catino, Anal. Biochem. Vol. 188 (199
0), 97−100)。次にそのビオチンは、前掲の検出方法を
可能にする物質またはタンパク質をカップリングさせた
抗−ビオチンまたはアビジンにより検出することができ
る。例えばこれはアビジンとペルオキシダーゼとの接合
体であってよい。
kierka, J. J. および De Gudicibus, S., Anal. Bioch
em. Vol. 172 (1988), 514−517の方法を用いることが
できる。呈色反応による検出には、抗血清または一以上
のモノクローナル抗体をビオチン化することもできる
（King および Catino, Anal. Biochem. Vol. 188 (199
0), 97−100)。次にそのビオチンは、前掲の検出方法を
可能にする物質またはタンパク質をカップリングさせた
抗−ビオチンまたはアビジンにより検出することができ
る。例えばこれはアビジンとペルオキシダーゼとの接合
体であってよい。
【００１３】相当する組換え可溶性受容体の検出は、固
相、例えばミクロタイトレーションプレート、に特異結
合性タンパク質を介して間接的に結合した受容体の変種
を用いることによって行うこともできる。このような変
種は、受容体の細胞外ドメインまたはその一部と免疫グ
ロブリンのＦｃ部分またはその一部、例えば同種のまた
は異種のＩｇＧ−Ｆｃ、との間の組換え融合タンパク質
であってよい。この場合には、融合タンパク質のＦｃ部
分と特異的に反応する一以上のモノクローナル抗体、ま
たは抗血清をまず固相、例えばミクロタイトレーション
プレート、に結合させることができる。このモノクロー
ナル抗体またはこの抗血清は次いで受容体融合タンパク
質を特異的に結合する。これには、受容体のコンホメー
ションがより効果的に保存されるという長所がある。
相、例えばミクロタイトレーションプレート、に特異結
合性タンパク質を介して間接的に結合した受容体の変種
を用いることによって行うこともできる。このような変
種は、受容体の細胞外ドメインまたはその一部と免疫グ
ロブリンのＦｃ部分またはその一部、例えば同種のまた
は異種のＩｇＧ−Ｆｃ、との間の組換え融合タンパク質
であってよい。この場合には、融合タンパク質のＦｃ部
分と特異的に反応する一以上のモノクローナル抗体、ま
たは抗血清をまず固相、例えばミクロタイトレーション
プレート、に結合させることができる。このモノクロー
ナル抗体またはこの抗血清は次いで受容体融合タンパク
質を特異的に結合する。これには、受容体のコンホメー
ションがより効果的に保存されるという長所がある。
【００１４】さらに、同種Ｆｃ部分に代えて異種からの
一つまたは複数のＦｃ部分を受容体との組換え融合に用
いると、Ｆｃを有するタンパク質を含有する可能性もあ
る生理学的体液からり媒介物質を検出する際の交又反応
が排除される。相当する組換え可溶性受容体を用いた媒
介物質の検出は、相当する受容体以外の媒介物質上の他
の、またはいくつかの他のエピトープと反応する一以上
のモノクローナル抗体、または抗血清をまず固相、例え
ばミクロタイトレーションプレート、に結合させること
により行うこともできる。次いでその媒介物質は固相の
特異的抗体に結合される。次にその結合した媒介物質に
相当する受容体が結合される。既に説明したように定量
的検出を可能にする物質またはタンパク質を受容体にカ
ップリングすることができる。
一つまたは複数のＦｃ部分を受容体との組換え融合に用
いると、Ｆｃを有するタンパク質を含有する可能性もあ
る生理学的体液からり媒介物質を検出する際の交又反応
が排除される。相当する組換え可溶性受容体を用いた媒
介物質の検出は、相当する受容体以外の媒介物質上の他
の、またはいくつかの他のエピトープと反応する一以上
のモノクローナル抗体、または抗血清をまず固相、例え
ばミクロタイトレーションプレート、に結合させること
により行うこともできる。次いでその媒介物質は固相の
特異的抗体に結合される。次にその結合した媒介物質に
相当する受容体が結合される。既に説明したように定量
的検出を可能にする物質またはタンパク質を受容体にカ
ップリングすることができる。
【００１５】前述のように、受容体のＦｃ−融合タンパ
ク質を用いれば、その受容体タンパク質は、直接定量測
定を可能にする、あるいはさらにかかる定量測定を可能
にする物質またはタンパク質にカップリングされる適当
なＦｃ−特異的物質またはタンパク質により検出するこ
とができる。例えば、組換え融合タンパク質の一つのま
たは複数のＦｃ部分は、それ自体アビジン−ペルオキシ
ダーゼ接合体により検出することができる。かかるＦｃ
−特異的検出は、例えば、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインに
対するビオチン化モノクローナル抗体を用いて行われ得
る。さらに、異種よりのＦｃ部分またはその一部を同種
Ｆｃ部分に代えて受容体との組換え融合に用いれば、Ｆ
ｃを有するタンパク質をも含有する生理学的体液よりの
媒介物質を検出する際の交又反応も排除される。
ク質を用いれば、その受容体タンパク質は、直接定量測
定を可能にする、あるいはさらにかかる定量測定を可能
にする物質またはタンパク質にカップリングされる適当
なＦｃ−特異的物質またはタンパク質により検出するこ
とができる。例えば、組換え融合タンパク質の一つのま
たは複数のＦｃ部分は、それ自体アビジン−ペルオキシ
ダーゼ接合体により検出することができる。かかるＦｃ
−特異的検出は、例えば、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインに
対するビオチン化モノクローナル抗体を用いて行われ得
る。さらに、異種よりのＦｃ部分またはその一部を同種
Ｆｃ部分に代えて受容体との組換え融合に用いれば、Ｆ
ｃを有するタンパク質をも含有する生理学的体液よりの
媒介物質を検出する際の交又反応も排除される。
【００１６】組換え受容体は、相当する媒介物質の生理
学的に活性な二量体または多量体の検出にも用いられ
る。例えば腫瘍壊死因子アルファは生理学的条件下では
三量体として存在する。媒介物質の二量体または三量体
は合成的にまたは組換え手段により調製することもでき
る。かかる二量体またはオリゴマーの検出は、その二量
体またはオリゴマーを固相に結合するため、および利用
可能なまま残っているエピトープを介してその上に結合
された二量体またはオリゴマーを検出するために組換え
受容体をサンドイッチ型アッセイに用いることにより行
われる。検出は、様々な検出物質で標識された受容体ま
たはその変種を用いることにより行うこともできる。
学的に活性な二量体または多量体の検出にも用いられ
る。例えば腫瘍壊死因子アルファは生理学的条件下では
三量体として存在する。媒介物質の二量体または三量体
は合成的にまたは組換え手段により調製することもでき
る。かかる二量体またはオリゴマーの検出は、その二量
体またはオリゴマーを固相に結合するため、および利用
可能なまま残っているエピトープを介してその上に結合
された二量体またはオリゴマーを検出するために組換え
受容体をサンドイッチ型アッセイに用いることにより行
われる。検出は、様々な検出物質で標識された受容体ま
たはその変種を用いることにより行うこともできる。
【００１７】二量体またはオリゴマーの検出は、二量体
の場合には一つのエピトープを、あるいはオリゴマーの
場合には、一以上のエピトープを、相応に標識されるか
または固相に結合される受容体により結合し、そして利
用可能なまま残っているエピトープを、相当する媒介物
質の生理学的作用を中和しそして検出目的に適切に標識
されたモノクローナル抗体により検出することによって
も行うことができる。例えば、ＭＴＰ（ミクロタイトレ
ーションプレート）を５μｇ／mlの濃度を有するＰＢＳ
中モノクローナルまたはポリクローナル抗−ヒトＩｇＧ
抗体を１穴あたり１００μｌ用いて重層することができ
る。室温で２４時間のインキュベーション時間の経過
後、そのＭＴＰを緩衝液で数回洗浄し、乾燥しそして乾
燥剤と共に気密に個別包装することができる。これら使
用準備の整ったＭＴＰは比較的長期にわたって保存する
ことができる。
の場合には一つのエピトープを、あるいはオリゴマーの
場合には、一以上のエピトープを、相応に標識されるか
または固相に結合される受容体により結合し、そして利
用可能なまま残っているエピトープを、相当する媒介物
質の生理学的作用を中和しそして検出目的に適切に標識
されたモノクローナル抗体により検出することによって
も行うことができる。例えば、ＭＴＰ（ミクロタイトレ
ーションプレート）を５μｇ／mlの濃度を有するＰＢＳ
中モノクローナルまたはポリクローナル抗−ヒトＩｇＧ
抗体を１穴あたり１００μｌ用いて重層することができ
る。室温で２４時間のインキュベーション時間の経過
後、そのＭＴＰを緩衝液で数回洗浄し、乾燥しそして乾
燥剤と共に気密に個別包装することができる。これら使
用準備の整ったＭＴＰは比較的長期にわたって保存する
ことができる。
【００１８】ＥＰＯ二量体の検出には、テスト開始前
に、これらプレートを洗浄液（０.０５％ Tween ２０を
含むＰＢＳより成るＷＢ）で２回洗浄する。次に１００
μｌのＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ溶液（ＷＢ中１００mg／ml）を
全穴に分注しそしてプレートを３７℃で３０分間インキ
ュベートする。次に残るすべての遊離Ｆｃ−結合部位を
１０％ヒト血清（Behringwerke Marburg、ドイツ連邦共
和国）でブロックする。数回洗浄後、生物活性ＥＰＯ二
量体(組換えヒトＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質)の連続希
釈剤１００μｌを各々ピペットで穴にとる。次いで室温
で２時間の間、検体中のＥＰＯ二量体の結合が行われ
る。ＷＢで数回洗浄後、結合したＥＰＯ−ＦｃをＥＰＯ
−受容体−酵素接合体の添加により検出する。このため
に、１００μｌのＥＰＯ−受容体−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ接合体（ＷＢ＋２％牛アルブミン中０.５μｇ
／ml）を各穴に分注する。室温で１時間インキュベーシ
ョン後、ＭＴＰを数回洗浄する。次に、固定ペルオキシ
ダーゼを用いてｏ−フェニレンジアミンを酸化すること
によりシグナルを発生させる。
に、これらプレートを洗浄液（０.０５％ Tween ２０を
含むＰＢＳより成るＷＢ）で２回洗浄する。次に１００
μｌのＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ溶液（ＷＢ中１００mg／ml）を
全穴に分注しそしてプレートを３７℃で３０分間インキ
ュベートする。次に残るすべての遊離Ｆｃ−結合部位を
１０％ヒト血清（Behringwerke Marburg、ドイツ連邦共
和国）でブロックする。数回洗浄後、生物活性ＥＰＯ二
量体(組換えヒトＥＰＯ−Ｆｃ融合タンパク質)の連続希
釈剤１００μｌを各々ピペットで穴にとる。次いで室温
で２時間の間、検体中のＥＰＯ二量体の結合が行われ
る。ＷＢで数回洗浄後、結合したＥＰＯ−ＦｃをＥＰＯ
−受容体−酵素接合体の添加により検出する。このため
に、１００μｌのＥＰＯ−受容体−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ接合体（ＷＢ＋２％牛アルブミン中０.５μｇ
／ml）を各穴に分注する。室温で１時間インキュベーシ
ョン後、ＭＴＰを数回洗浄する。次に、固定ペルオキシ
ダーゼを用いてｏ−フェニレンジアミンを酸化すること
によりシグナルを発生させる。
【００１９】前掲の組換え受容体またはその変種を用い
た媒介物質検出の可能性は多くの方法で用いることがで
きる。天然または組換え媒介物質を検出することができ
る。媒介物質は、適当な試験液に希釈された純粋な形
で、あるいは天然の体液から、例えば血漿、血清、全
血、尿、糞便検体、眼液、胃液、脳脊髄液または喀痰か
ら、あるいは適切に調製された臓器ホモジネート中で、
あるいは適切に調製された形の体細胞の細胞培養液の上
清中で検出することができる。
た媒介物質検出の可能性は多くの方法で用いることがで
きる。天然または組換え媒介物質を検出することができ
る。媒介物質は、適当な試験液に希釈された純粋な形
で、あるいは天然の体液から、例えば血漿、血清、全
血、尿、糞便検体、眼液、胃液、脳脊髄液または喀痰か
ら、あるいは適切に調製された臓器ホモジネート中で、
あるいは適切に調製された形の体細胞の細胞培養液の上
清中で検出することができる。
【００２０】それら検出方法は、更に、次の目的に使用
できる： −受容体検索を行う、すなわち媒介物質とその相当する
受容体との間の相互作用を阻害しまたは促進するアゴニ
ストまたはアンタゴニストを見出す； −受容体またはリガンドの結合活性を測定する； −修飾された媒介物質（“ムテイン”）または媒介物質
の部分（例えばオリゴペプチド）を同定しそして分析す
る； −病原生物（例えばウイルスまたは細菌）とそれらの細
胞受容体との相互作用に影響する物質を同定しそして分
析する； −細胞粘着分子の相互作用に影響する物質を同定する。 以下の実施例は本発明を例説するためのものであって、
本発明を限定するものではない。
できる： −受容体検索を行う、すなわち媒介物質とその相当する
受容体との間の相互作用を阻害しまたは促進するアゴニ
ストまたはアンタゴニストを見出す； −受容体またはリガンドの結合活性を測定する； −修飾された媒介物質（“ムテイン”）または媒介物質
の部分（例えばオリゴペプチド）を同定しそして分析す
る； −病原生物（例えばウイルスまたは細菌）とそれらの細
胞受容体との相互作用に影響する物質を同定しそして分
析する； −細胞粘着分子の相互作用に影響する物質を同定する。 以下の実施例は本発明を例説するためのものであって、
本発明を限定するものではない。
【００２１】
使用略語：
ＢＨＫ 幼ハムスター腎細胞
ＢＳＡ 牛血清アルブミン
ＥＰＯ エリスロポエチン
ＥＰＯＲ−Ｆｃ エリスロポエチン受容体のヒトＩｇ
Ｇ１−Ｆｃとの融合タンパク質（組換え体で可溶性） Ｇ−ＣＳＦ 顆粒球コロニー刺激因子 ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子 ＩＬ−１ インターロイキン−１ ＩＬ−２ インターロイキン−２ ＩＬ−４ インターロイキン−４ ＩＬ−４Ｒ インターロイキン−４受容体（組換
え体で可溶性） ＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ インターロイキン−４受容体の免疫
グロブリンＦｃ−部分との融合タンパク質（組換え体で
可溶性） ＩＬ−６ インターロイキン−６ ＩＬ−７ インターロイキン−７ Ｍｅｇ−ＣＳＦ 巨核球コロニー刺激因子 ＭＴＰ ミクロタイトレーションプレート ＰＢＳ ホスフェート緩衝食塩水 ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＯＤ ペルオキシダーゼ ＴＨ１ タイプ１ Ｔ−ヘルパーリンパ球 ＴＨ２ タイプ２ Ｔ−ヘルパーリンパ球 ＴＭＢ テトラメチルベンジジン ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＷＢＡ 洗浄液Ａ ＷＢＢ 洗浄液Ｂ
Ｇ１−Ｆｃとの融合タンパク質（組換え体で可溶性） Ｇ−ＣＳＦ 顆粒球コロニー刺激因子 ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子 ＩＬ−１ インターロイキン−１ ＩＬ−２ インターロイキン−２ ＩＬ−４ インターロイキン−４ ＩＬ−４Ｒ インターロイキン−４受容体（組換
え体で可溶性） ＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ インターロイキン−４受容体の免疫
グロブリンＦｃ−部分との融合タンパク質（組換え体で
可溶性） ＩＬ−６ インターロイキン−６ ＩＬ−７ インターロイキン−７ Ｍｅｇ−ＣＳＦ 巨核球コロニー刺激因子 ＭＴＰ ミクロタイトレーションプレート ＰＢＳ ホスフェート緩衝食塩水 ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＯＤ ペルオキシダーゼ ＴＨ１ タイプ１ Ｔ−ヘルパーリンパ球 ＴＨ２ タイプ２ Ｔ−ヘルパーリンパ球 ＴＭＢ テトラメチルベンジジン ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＷＢＡ 洗浄液Ａ ＷＢＢ 洗浄液Ｂ
【００２２】ＩＬ−４Ｒは、例えば国際特許出願ＷＯ
９０／０５１８３に従って調製することができる。
９０／０５１８３に従って調製することができる。
【００２３】実施例１：液体検体中のヒトＩＬ−４の存
在および濃度を測定するための免疫受容体アッセイ方法 実施例１および２には、メトトレキセートおよびＧ４１
８による二重選別後にＢＨＫ細胞を安定的に発現させる
ことにより培地中に可溶性タンパク質として分泌され
（ＥＰ−Ａ ０,３３０,９７７）そしてイムノアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製された、ヒトまた
はマウスＩＬ−４受容体（以下それぞれｈｕＩＬ−４Ｒ
およびｍｕＩＬ−４Ｒと記す）のIdzerda et al. （199
0, J. Exp.Med. 171, 861〜873）およびMaliszewski et
al. (1990, J. Immunol. 144, 30283033）において規
定された細胞外領域、あるいは天然に存在する可溶型を
用いた。さらに、ヒトＩｇＧ１分子のまたはマウスＩｇ
Ｇ２ｂ分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（Ze
ttlmeiβl et al. (1190）ＤＮＡおよび Cell Biol.9,
347−353）を有するヒトまたはマウスＩＬ−４受容体の
細胞外領域により成りそして同じくＢＨＦ細胞中で発現
された後プロティンＡ−Sepharoseアフィニティークロ
マトグラフィーを行うことにより精製された受容体／免
疫グロブリン融合タンパク質（ＥＰ−Ａ１−０,４６４,
５３３）を用いた（それぞれｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃおよ
びｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃと記す）。
在および濃度を測定するための免疫受容体アッセイ方法 実施例１および２には、メトトレキセートおよびＧ４１
８による二重選別後にＢＨＫ細胞を安定的に発現させる
ことにより培地中に可溶性タンパク質として分泌され
（ＥＰ−Ａ ０,３３０,９７７）そしてイムノアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製された、ヒトまた
はマウスＩＬ−４受容体（以下それぞれｈｕＩＬ−４Ｒ
およびｍｕＩＬ−４Ｒと記す）のIdzerda et al. （199
0, J. Exp.Med. 171, 861〜873）およびMaliszewski et
al. (1990, J. Immunol. 144, 30283033）において規
定された細胞外領域、あるいは天然に存在する可溶型を
用いた。さらに、ヒトＩｇＧ１分子のまたはマウスＩｇ
Ｇ２ｂ分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（Ze
ttlmeiβl et al. (1190）ＤＮＡおよび Cell Biol.9,
347−353）を有するヒトまたはマウスＩＬ−４受容体の
細胞外領域により成りそして同じくＢＨＦ細胞中で発現
された後プロティンＡ−Sepharoseアフィニティークロ
マトグラフィーを行うことにより精製された受容体／免
疫グロブリン融合タンパク質（ＥＰ−Ａ１−０,４６４,
５３３）を用いた（それぞれｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃおよ
びｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃと記す）。
【００２４】ＭＴＰを４℃で１６時間、１テスト穴あた
り１００μｌの量として５μｇ／mlの組換えヒトＩＬ−
４ＲまたはＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを含有するＰＢＳを用いて
コートした。次にそれらプレートを０.０５％（ｗ／
ｖ）Tween−２０および０.１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有
するＰＢＳ（以下洗浄緩衝液（ＷＢＡ）と記す）を用い
て３回洗浄して未結合コーティング材料を除去した。次
にそれらプレートを３７℃で、１テスト穴あたり緩衝液
量２００μｌとして、２時間、０.０５％（ｗ／ｖ）Twe
en−２０および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ
と共にインキュベートして遊離結合部位をブロックし
た。次に、ヒト組換えＩＬ−４（Immunex、シアトル、
米国、ロット１８９８−０２２）をＷＢＡ中で希釈して
所与のテスト濃度とし、そして適用した。次いでそれら
テストプレートを３７℃で９０分間インキュベートし
た。次いでそれらテストプレートを前述の如きＷＢＡで
３回洗浄して未結合ＩＬ−４を除去した。次に結合した
ＩＬ−４を検出するために、ヒトＩＬ−４（ＢＬ４Ｐ）
に対する特異性を有するウサギ抗血清（Genzyme、ケン
ブリッジ、米国）をＷＢＡ中で２μｇ／mlの濃度まで希
釈しそして１テスト穴あたり１００μｌの量として添加
した。次に３７℃で９０分間インキュベーションを行っ
た。次に、ＷＢＡで洗浄することにより未結合抗血清を
除去した。結合した抗血清を検出するために、ウサギ免
疫グロブリンに対する特異性を有するビオチン化ヤギ抗
血清（A0207, Vector Inc., Burlingame, 米国）をＷＢ
Ａ中で０.１５μｇ／mlの濃度まで希釈しそして１培養
穴あたり１００μｌの量として添加し、そしてそれらプ
レートを３７℃で１時間インキュベートした。未結合抗
血清を除去するためにそれらプレートを次いでＷＢＡで
３回洗浄した。次に、ＷＢＡ中で１：２０００のテスト
希釈化となるよう希釈されたストレプトアビジン−ＰＯ
Ｄ（RPN 1213，44B，Amersham，英国）を１テスト穴あ
たり１００μｌの量として添加し、そしてそれらプレー
トを３７℃で１時間インキュベートした。結合したスト
レプトアビジン−ＰＯＤ接合体を検出するために、従っ
て結合したＩＬ−４を酵素的に間接的に検出するため
に、クロモゲンＴＭＢ（OUVF 925, Behringwerke, Marb
urg, ドイツ連邦共和国）を Behring 基質緩衝液（Behr
ingwerke,Marburg，ドイツ連邦共和国，OUVG 945）で
１：１０希釈し、そして１培養穴あたり１００μｌの量
としてテストプレートに添加した。次に室温で１時間イ
ンキュベーションを行った。次に、０.５Ｎ硫酸を１培
養穴あたり１００μｌの量として用いて反応を止め、そ
して個々の培養穴の吸光度を４５０nm（基準波長６５０
nm）で測定した。
り１００μｌの量として５μｇ／mlの組換えヒトＩＬ−
４ＲまたはＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを含有するＰＢＳを用いて
コートした。次にそれらプレートを０.０５％（ｗ／
ｖ）Tween−２０および０.１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有
するＰＢＳ（以下洗浄緩衝液（ＷＢＡ）と記す）を用い
て３回洗浄して未結合コーティング材料を除去した。次
にそれらプレートを３７℃で、１テスト穴あたり緩衝液
量２００μｌとして、２時間、０.０５％（ｗ／ｖ）Twe
en−２０および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ
と共にインキュベートして遊離結合部位をブロックし
た。次に、ヒト組換えＩＬ−４（Immunex、シアトル、
米国、ロット１８９８−０２２）をＷＢＡ中で希釈して
所与のテスト濃度とし、そして適用した。次いでそれら
テストプレートを３７℃で９０分間インキュベートし
た。次いでそれらテストプレートを前述の如きＷＢＡで
３回洗浄して未結合ＩＬ−４を除去した。次に結合した
ＩＬ−４を検出するために、ヒトＩＬ−４（ＢＬ４Ｐ）
に対する特異性を有するウサギ抗血清（Genzyme、ケン
ブリッジ、米国）をＷＢＡ中で２μｇ／mlの濃度まで希
釈しそして１テスト穴あたり１００μｌの量として添加
した。次に３７℃で９０分間インキュベーションを行っ
た。次に、ＷＢＡで洗浄することにより未結合抗血清を
除去した。結合した抗血清を検出するために、ウサギ免
疫グロブリンに対する特異性を有するビオチン化ヤギ抗
血清（A0207, Vector Inc., Burlingame, 米国）をＷＢ
Ａ中で０.１５μｇ／mlの濃度まで希釈しそして１培養
穴あたり１００μｌの量として添加し、そしてそれらプ
レートを３７℃で１時間インキュベートした。未結合抗
血清を除去するためにそれらプレートを次いでＷＢＡで
３回洗浄した。次に、ＷＢＡ中で１：２０００のテスト
希釈化となるよう希釈されたストレプトアビジン−ＰＯ
Ｄ（RPN 1213，44B，Amersham，英国）を１テスト穴あ
たり１００μｌの量として添加し、そしてそれらプレー
トを３７℃で１時間インキュベートした。結合したスト
レプトアビジン−ＰＯＤ接合体を検出するために、従っ
て結合したＩＬ−４を酵素的に間接的に検出するため
に、クロモゲンＴＭＢ（OUVF 925, Behringwerke, Marb
urg, ドイツ連邦共和国）を Behring 基質緩衝液（Behr
ingwerke,Marburg，ドイツ連邦共和国，OUVG 945）で
１：１０希釈し、そして１培養穴あたり１００μｌの量
としてテストプレートに添加した。次に室温で１時間イ
ンキュベーションを行った。次に、０.５Ｎ硫酸を１培
養穴あたり１００μｌの量として用いて反応を止め、そ
して個々の培養穴の吸光度を４５０nm（基準波長６５０
nm）で測定した。
【００２５】各々について、２回測定の平均値を変動係
数（C.V.％単位）と共に示す。結果を表１に示す。同じ
コーティング濃度において、ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを用
いた場合には、ｈｕＩＬ−４Ｒに比べ、いくらか高いバ
ックグラウンドおよびより高い吸光度が全体にみられ
た。しかしながらこのことはヒトＩＬ−４の検出感度に
影響しない。反応は極めて特異的であった。ヒトＩＬ−
４に代えてマウスＩＬ−４を用いた場合には反応は起き
なかった。さらに、他の媒介物質、例えばヒトＩＬ−１
−α、ＩＬ−１−β、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−
β、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−７は
反応を示さなかった。これらコントロールはコーティン
グ材料としてＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを用いて行われ、そして
表２に示される。各場合について、２回測定の平均値を
変動係数（C.V. 、％単位）と共に示す。コントロール
では、吸光度を標準曲線を用いて濃度（pg／ml）に変換
したがそれぞれバックグラウンドより低かった。ヒトＩ
Ｌ−４が例えば培地または血清中に存在していても検出
を行うことができる。
数（C.V.％単位）と共に示す。結果を表１に示す。同じ
コーティング濃度において、ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを用
いた場合には、ｈｕＩＬ−４Ｒに比べ、いくらか高いバ
ックグラウンドおよびより高い吸光度が全体にみられ
た。しかしながらこのことはヒトＩＬ−４の検出感度に
影響しない。反応は極めて特異的であった。ヒトＩＬ−
４に代えてマウスＩＬ−４を用いた場合には反応は起き
なかった。さらに、他の媒介物質、例えばヒトＩＬ−１
−α、ＩＬ−１−β、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−
β、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−７は
反応を示さなかった。これらコントロールはコーティン
グ材料としてＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを用いて行われ、そして
表２に示される。各場合について、２回測定の平均値を
変動係数（C.V. 、％単位）と共に示す。コントロール
では、吸光度を標準曲線を用いて濃度（pg／ml）に変換
したがそれぞれバックグラウンドより低かった。ヒトＩ
Ｌ−４が例えば培地または血清中に存在していても検出
を行うことができる。
【００２６】実施例２：液体検体中のマウスＩＬ−４の
存在および濃度を測定するための免疫受容体アッセイ方
法 マウスＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを実施例１に記載の如く調製し
た。ＭＴＰを４℃で１６時間、１テスト穴あたり１００
μｌの量として５μｇ／mlの組換えマウスＩＬ−４Ｒ／
Ｆｃを含有するＰＢＳを用いてコートした。次にそれら
プレートを０.０５％（ｗ／ｖ）Tween−２０および０.
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下ＷＢＡと
記す）を用いて３回洗浄して未結合コーティング材料を
除去した。次にそれらプレートを３７℃で、１テスト穴
あたり緩衝液量を２００μｌとして２時間、０.０５％
（ｗ／ｖ）Tween−２０および２％ ＢＳＡを含有するＰ
ＢＳと共にインキュベートして遊離結合部位をブロック
した。次にマウス組換えＩＬ−４（ロット 2871-023、I
mmunex、シアトル、米国）をＷＢＡ中で希釈して所与の
テスト濃度とし、そして適用した。次いでそれらテスト
プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。次い
でそれらテストプレートを前述の如きＷＢＡで３回洗浄
して未結合ＩＬ−４を除去した。結合されたＩＬ−４を
検出するために、マウスＩＬ−４に対する特異性を有す
るラットモノクローナル抗体（MM450D ロット 103023,
Endogen, ボストン，米国）をＷＢＡ中で２μｇ／mlの
濃度まで希釈しそして１テスト穴あたり１００μｌの量
として添加した。次に３７℃で９０分間インキュベーシ
ョンを行った。次に、ＷＢＡで３回洗浄することにより
未結合モノクローナル抗体を除去した。結合した抗体を
検出するために、ラット免疫グロブリンに対する特異性
を有するビオチン化ヤギ抗血清（3010-08 ロットB022 N
222，Southern Biotechnology Assoc., バーミンガム，
米国）をＷＢＡ中で０.２５μｇ／mlの濃度まで希釈し
そして１培養穴あたり１００μｌの量として添加し、そ
して次にそれらプレートを３７℃で１時間インキュベー
トした。未結合抗血清を除去するためにそれらプレート
を次いでＷＢＡで３回洗浄した。次に、ＷＢＡ中で１：
２０００のテスト希釈比となるよう希釈されたストレプ
トアビジン−ＰＯＤ（RPN 1213, 44 B, Amersham, 英
国）を、１テスト穴あたり１００μｌの量として添加
し、そしてそれらプレートを３７℃で１時間インキュベ
ートした。結合したストレプトアビジン−ＰＯＤ接合体
を、従って結合したＩＬ−４を酵素的に検出するため
に、クロモゲンＴＭＢ（Behringwerke Marburg, ドイツ
連邦共和国，OUVF 925）をBehring 基質緩衝液（Behrin
gwerke Marbury, ドイツ連邦共和国, OUVG 945）で１：
１０希釈し、そして１培養穴あたり１００μｌの量とし
てテストプレートに添加した。次にそれらプレートを室
温で１時間インキュベートした。次に０.５Ｎ硫酸を１
培養穴あたり１００μｌの量として用いて反応を止め、
そして個々の培養穴の吸光度を４５０nm（基準波長６５
０nm）で測定した。結果を表３に示す。反応は極めて特
異的であった。マウスＩＬ−４に代えてヒトＩＬ−４ま
たは他の媒介物質、例えばマウスＩＬ−１−α、マウス
ＩＬ−１−βまたはマウスＴＮＦ−αなどを用いたとき
は反応は起きなかった。これらのコントロールを表４に
示す。各場合について２回測定の平均値を変動係数（C.
V.、単位％）と共に示す。コントロールでは、吸光度を
標準曲線を用いて濃度（pg／ml）に変換したがそれぞれ
バックグウンドより低かった。マウスＩＬ−４が例えば
培地または血清中に存在していても検出を行うことがで
きる。
存在および濃度を測定するための免疫受容体アッセイ方
法 マウスＩＬ−４Ｒ／Ｆｃを実施例１に記載の如く調製し
た。ＭＴＰを４℃で１６時間、１テスト穴あたり１００
μｌの量として５μｇ／mlの組換えマウスＩＬ−４Ｒ／
Ｆｃを含有するＰＢＳを用いてコートした。次にそれら
プレートを０.０５％（ｗ／ｖ）Tween−２０および０.
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下ＷＢＡと
記す）を用いて３回洗浄して未結合コーティング材料を
除去した。次にそれらプレートを３７℃で、１テスト穴
あたり緩衝液量を２００μｌとして２時間、０.０５％
（ｗ／ｖ）Tween−２０および２％ ＢＳＡを含有するＰ
ＢＳと共にインキュベートして遊離結合部位をブロック
した。次にマウス組換えＩＬ−４（ロット 2871-023、I
mmunex、シアトル、米国）をＷＢＡ中で希釈して所与の
テスト濃度とし、そして適用した。次いでそれらテスト
プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。次い
でそれらテストプレートを前述の如きＷＢＡで３回洗浄
して未結合ＩＬ−４を除去した。結合されたＩＬ−４を
検出するために、マウスＩＬ−４に対する特異性を有す
るラットモノクローナル抗体（MM450D ロット 103023,
Endogen, ボストン，米国）をＷＢＡ中で２μｇ／mlの
濃度まで希釈しそして１テスト穴あたり１００μｌの量
として添加した。次に３７℃で９０分間インキュベーシ
ョンを行った。次に、ＷＢＡで３回洗浄することにより
未結合モノクローナル抗体を除去した。結合した抗体を
検出するために、ラット免疫グロブリンに対する特異性
を有するビオチン化ヤギ抗血清（3010-08 ロットB022 N
222，Southern Biotechnology Assoc., バーミンガム，
米国）をＷＢＡ中で０.２５μｇ／mlの濃度まで希釈し
そして１培養穴あたり１００μｌの量として添加し、そ
して次にそれらプレートを３７℃で１時間インキュベー
トした。未結合抗血清を除去するためにそれらプレート
を次いでＷＢＡで３回洗浄した。次に、ＷＢＡ中で１：
２０００のテスト希釈比となるよう希釈されたストレプ
トアビジン−ＰＯＤ（RPN 1213, 44 B, Amersham, 英
国）を、１テスト穴あたり１００μｌの量として添加
し、そしてそれらプレートを３７℃で１時間インキュベ
ートした。結合したストレプトアビジン−ＰＯＤ接合体
を、従って結合したＩＬ−４を酵素的に検出するため
に、クロモゲンＴＭＢ（Behringwerke Marburg, ドイツ
連邦共和国，OUVF 925）をBehring 基質緩衝液（Behrin
gwerke Marbury, ドイツ連邦共和国, OUVG 945）で１：
１０希釈し、そして１培養穴あたり１００μｌの量とし
てテストプレートに添加した。次にそれらプレートを室
温で１時間インキュベートした。次に０.５Ｎ硫酸を１
培養穴あたり１００μｌの量として用いて反応を止め、
そして個々の培養穴の吸光度を４５０nm（基準波長６５
０nm）で測定した。結果を表３に示す。反応は極めて特
異的であった。マウスＩＬ−４に代えてヒトＩＬ−４ま
たは他の媒介物質、例えばマウスＩＬ−１−α、マウス
ＩＬ−１−βまたはマウスＴＮＦ−αなどを用いたとき
は反応は起きなかった。これらのコントロールを表４に
示す。各場合について２回測定の平均値を変動係数（C.
V.、単位％）と共に示す。コントロールでは、吸光度を
標準曲線を用いて濃度（pg／ml）に変換したがそれぞれ
バックグウンドより低かった。マウスＩＬ−４が例えば
培地または血清中に存在していても検出を行うことがで
きる。
【００２７】実施例３：固相に結合した抗−ＥＰＯ抗体
（モノクローナルまたはポリクローナル）およびＥＰＯ
−受容体−酵素接合体より成る組合せを用いた、液体検
体中の生物活性ＥＰＯの存在および濃度を測定するため
の免疫受容体アッセイ方法 ヒトＥＰＯ受容体をコードするｃＤＮＡが最近単離され
ている(Winkelmann etal., (1990), Blood 76, 24−3
0）。それぞれ、ＥＰＯ受容体ｃＤＮＡの５′−非翻訳
領域の配列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（Ａ：5′AGG CAGCTG CTG ACC AAG CTT TGG ACT GTG CC
G GGG GC 3′）およびコーティング領域の配列とハイブ
リダイズできるオリゴヌクレオチド（Ｂ：5′AGA GCC T
CA GGA TGA GGG GAT CCA GGT CGC TAG CGC 3′）を合成
した。オリゴヌクレオチドＡはコーディング鎖と一部相
同でありそしてＨｉｎｄ III制限部位を含み；オリゴヌ
クレオチドＢは非コーディング鎖と一部相同でありそし
てＢａｍＨ Ｉ制限部位を含む。二つのオリゴヌクレオ
チドＡおよびＢを用いてＥＰＯ受容体ｃＤＮＡ上でＰＣ
Ｒを行うと、ＥＰＯ受容体の細胞外領域の完全なコーデ
ィング配列を含むＤＮＡ断片が得られる。オリゴヌクレ
オチドＢにより導入されるＢａｍＨ Ｉ制限部位におけ
る読み枠は、ヌクレオチド配列ＧＡＴがアスパラギン酸
として翻訳されるようになっている。そのＰＣＲ断片を
Ｈｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨ Ｉで処理しそして、Ｈｉ
ｎｄ IIIおよびＢａｍＨ Ｉで開裂済みのｐＣＤ４Ｅガ
ンマ１Ｈ−ベクターバックボーンに組込んだ。生成プラ
スミドにはｐＥＰＯＲＦｃという呼称を付与した。ｐＣ
Ｄ４Ｅガンマ１Ｈは、ＥＰ ０,３２５,２６２ Ａ２より
知られるベクターｐＣＤ４Ｅガンマ−１において、ユニ
ークなＢａｍＨ Ｉ制限部位の下流に位置するＨｉｎｄ
III制限部位をＨｉｎｄ IIIで部分的制限することによ
り欠失させ、Ｈｉｎｄ III突出末端を Klenow 酵素を用
いて充填しそして再結合させたものである。ｐＥＰＯＲ
ＦｃはヒトＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３
ドメインに融合させたヒトＥＰＯ受容体の細胞外領域よ
り成るタンパク質ＥＰＯＲＦｃをコードする（ＥＰ ０,
４６４,５３３ Ａ１）。ｐＥＰＯＲＦｃはＢＨＫ細胞内
に移入させ、またメトトレキセートおよびＧ４１８によ
る二重選別によって安定クローンを得た（ＥＰ ０,３３
０,９７７）。典型的発現率は上清１mlあたり５μｇの
領域にあり、そこからプロティンＡ−Sepharoseでのク
ロマトグラフィーによりＥＰＯＲＦｃを単離した（ＥＰ
０,４６４,５３３ Ａ１）。
（モノクローナルまたはポリクローナル）およびＥＰＯ
−受容体−酵素接合体より成る組合せを用いた、液体検
体中の生物活性ＥＰＯの存在および濃度を測定するため
の免疫受容体アッセイ方法 ヒトＥＰＯ受容体をコードするｃＤＮＡが最近単離され
ている(Winkelmann etal., (1990), Blood 76, 24−3
0）。それぞれ、ＥＰＯ受容体ｃＤＮＡの５′−非翻訳
領域の配列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド
（Ａ：5′AGG CAGCTG CTG ACC AAG CTT TGG ACT GTG CC
G GGG GC 3′）およびコーティング領域の配列とハイブ
リダイズできるオリゴヌクレオチド（Ｂ：5′AGA GCC T
CA GGA TGA GGG GAT CCA GGT CGC TAG CGC 3′）を合成
した。オリゴヌクレオチドＡはコーディング鎖と一部相
同でありそしてＨｉｎｄ III制限部位を含み；オリゴヌ
クレオチドＢは非コーディング鎖と一部相同でありそし
てＢａｍＨ Ｉ制限部位を含む。二つのオリゴヌクレオ
チドＡおよびＢを用いてＥＰＯ受容体ｃＤＮＡ上でＰＣ
Ｒを行うと、ＥＰＯ受容体の細胞外領域の完全なコーデ
ィング配列を含むＤＮＡ断片が得られる。オリゴヌクレ
オチドＢにより導入されるＢａｍＨ Ｉ制限部位におけ
る読み枠は、ヌクレオチド配列ＧＡＴがアスパラギン酸
として翻訳されるようになっている。そのＰＣＲ断片を
Ｈｉｎｄ IIIおよびＢａｍＨ Ｉで処理しそして、Ｈｉ
ｎｄ IIIおよびＢａｍＨ Ｉで開裂済みのｐＣＤ４Ｅガ
ンマ１Ｈ−ベクターバックボーンに組込んだ。生成プラ
スミドにはｐＥＰＯＲＦｃという呼称を付与した。ｐＣ
Ｄ４Ｅガンマ１Ｈは、ＥＰ ０,３２５,２６２ Ａ２より
知られるベクターｐＣＤ４Ｅガンマ−１において、ユニ
ークなＢａｍＨ Ｉ制限部位の下流に位置するＨｉｎｄ
III制限部位をＨｉｎｄ IIIで部分的制限することによ
り欠失させ、Ｈｉｎｄ III突出末端を Klenow 酵素を用
いて充填しそして再結合させたものである。ｐＥＰＯＲ
ＦｃはヒトＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３
ドメインに融合させたヒトＥＰＯ受容体の細胞外領域よ
り成るタンパク質ＥＰＯＲＦｃをコードする（ＥＰ ０,
４６４,５３３ Ａ１）。ｐＥＰＯＲＦｃはＢＨＫ細胞内
に移入させ、またメトトレキセートおよびＧ４１８によ
る二重選別によって安定クローンを得た（ＥＰ ０,３３
０,９７７）。典型的発現率は上清１mlあたり５μｇの
領域にあり、そこからプロティンＡ−Sepharoseでのク
ロマトグラフィーによりＥＰＯＲＦｃを単離した（ＥＰ
０,４６４,５３３ Ａ１）。
【００２８】受容体結合部位とは異なるまたそれから独
立したエピトープを認識するモノクローナルまたはポリ
クローナル抗−ＥＰＯ抗体を５μｇ／ml濃度で含有する
等張ＰＢＳを用いて、１穴あたり１００μｌの量として
ＭＴＰをコートした。室温で２４時間のインキュベーシ
ョン時間の後、ＭＴＰを０.０５Ｍ Tris／クエン酸塩で
数回洗浄し、乾燥し、そして乾燥剤と共に気密に個別包
装した。これら使用準備の整ったＭＴＰは比較的長期に
わたり保存することができる。アッセイ開始前にプレー
トをＷＢＢ（０.０５％ Tween２０含有ＰＢＳより成
る）で２回洗浄した。次に、組替えヒトＥＰＯの連続希
釈剤を各々１００μｌ、ピペットで穴にとる。検体中の
ＥＰＯの結合は室温で２時間にわたって行われる。ＷＢ
Ｂで数回洗浄後、結合したＥＰＯをＥＰＯ−受容体−酵
素接合体の添加により検出した。このために、１００μ
ｌのＥＰＯ−受容体−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ接合体（ＷＢＢ＋２％ＢＳＡ中０.５μｇ／ml）を各
穴に分注した。室温で１時間インキュベート後、ＭＴＰ
を数回洗浄した。ｏ−フェニレンジアミンをＰＯＤを用
いて酸化することによりシグナルを発生させた。次に４
９２nm（基準波長６５０nm）での吸光度を測定すること
ができた。
立したエピトープを認識するモノクローナルまたはポリ
クローナル抗−ＥＰＯ抗体を５μｇ／ml濃度で含有する
等張ＰＢＳを用いて、１穴あたり１００μｌの量として
ＭＴＰをコートした。室温で２４時間のインキュベーシ
ョン時間の後、ＭＴＰを０.０５Ｍ Tris／クエン酸塩で
数回洗浄し、乾燥し、そして乾燥剤と共に気密に個別包
装した。これら使用準備の整ったＭＴＰは比較的長期に
わたり保存することができる。アッセイ開始前にプレー
トをＷＢＢ（０.０５％ Tween２０含有ＰＢＳより成
る）で２回洗浄した。次に、組替えヒトＥＰＯの連続希
釈剤を各々１００μｌ、ピペットで穴にとる。検体中の
ＥＰＯの結合は室温で２時間にわたって行われる。ＷＢ
Ｂで数回洗浄後、結合したＥＰＯをＥＰＯ−受容体−酵
素接合体の添加により検出した。このために、１００μ
ｌのＥＰＯ−受容体−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ接合体（ＷＢＢ＋２％ＢＳＡ中０.５μｇ／ml）を各
穴に分注した。室温で１時間インキュベート後、ＭＴＰ
を数回洗浄した。ｏ−フェニレンジアミンをＰＯＤを用
いて酸化することによりシグナルを発生させた。次に４
９２nm（基準波長６５０nm）での吸光度を測定すること
ができた。
【００２９】ＥＰＯ−受容体−Ｆｃ−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ接合体は次のようにして合成した：受容体−
Ｆｃ−融合タンパク質をまず、Tanimore et al., J. Im
munol. Meth. 62, pp. 123−131 (1983）の方法により
マレイミド誘導体に転化した。並行して、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（Boehringer-Mannheim, マンハイム)を
King et al., Biochemistry 17, pp. 1499−1506 (197
8）に従ってＳＨ−活性化し、そしてマレイミド−ＥＰ
Ｏ−受容体融合タンパク質に添加して安定な酵素接合体
を形成させた。表５〜７はこのＥＰＯの“サンドイッチ
型”免疫受容体アッセイの結果を示している。検出には
ＥＰＯ−受容体−Ｆｃ−融合−タンパク質−ペルオキシ
ダーゼ接合体が、また固相に結合された様々なモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体が用いられた。結果が
示すようにこのタイプのテストシステムは、下は２pg／
ml以下までの生物活性ＥＰＯの存在および濃度を検出す
ることができる。
キシダーゼ接合体は次のようにして合成した：受容体−
Ｆｃ−融合タンパク質をまず、Tanimore et al., J. Im
munol. Meth. 62, pp. 123−131 (1983）の方法により
マレイミド誘導体に転化した。並行して、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（Boehringer-Mannheim, マンハイム)を
King et al., Biochemistry 17, pp. 1499−1506 (197
8）に従ってＳＨ−活性化し、そしてマレイミド−ＥＰ
Ｏ−受容体融合タンパク質に添加して安定な酵素接合体
を形成させた。表５〜７はこのＥＰＯの“サンドイッチ
型”免疫受容体アッセイの結果を示している。検出には
ＥＰＯ−受容体−Ｆｃ−融合−タンパク質−ペルオキシ
ダーゼ接合体が、また固相に結合された様々なモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体が用いられた。結果が
示すようにこのタイプのテストシステムは、下は２pg／
ml以下までの生物活性ＥＰＯの存在および濃度を検出す
ることができる。
【００３０】実施例４：固相に結合した抗−ヒトＩｇＧ
抗体、ＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質、および受容体
部位のそれとは異なるエピトープを認識する様々なＥＰ
Ｏ−抗体−酵素接合体より成る組合せを用いた、液体検
体中の生物活性ＥＰＯの存在および濃度を測定するため
の免疫受容体アッセイ方法ＭＴＰを、モノクローナルま
たはポリクローナル抗−ヒトＩｇＧ抗体を５μｇ／mlの
濃度で含有するＰＢＳを用いて、１穴あたり１００μｌ
としてコートした。室温で２４時間のインキュベーショ
ン時間の後、ＭＴＰを０.０５Ｍ Tris／クエン酸塩で数
回洗浄し、乾燥し、そして乾燥剤と共に気密に個別包装
した。これら使用準備の整ったＭＴＰは、比較的長期に
わたり保存することができる。アッセイ開始前に、プレ
ートをＷＢＢ（０.０５％ Tween２０含有ＰＢＳより成
る）で２回洗浄した。１００μｌのＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ溶
液（ＷＢＢ中１００ng／ml）を全穴に分注し、そしてそ
れらプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
プレートを数回洗浄後、組換えヒトＥＰＯの連続希釈剤
を各々１００μｌ、ピペットで穴にとった。検体中のＥ
ＰＯの結合は室温で２時間にわたって行った。それらプ
レートをＷＢＢで数回洗浄後、結合したＥＰＯを抗−Ｅ
ＰＯ−抗体−酵素接合体（Behringwerke, Marburg, ド
イツ連邦共和国）の添加により検出した。このために、
１００μｌの抗−ＥＰＯ−抗体−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ接合体（ＷＢ＋２％ＢＳＡ中０.５μｇ／ml）を
各穴に分注した。室温で１時間のインキュベーションの
後、ＭＴＰを数回洗浄した。ｏ−フェニレンジアミンを
そのＰＯＤを用いて酸化することによりシグナルを発生
させた。
抗体、ＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質、および受容体
部位のそれとは異なるエピトープを認識する様々なＥＰ
Ｏ−抗体−酵素接合体より成る組合せを用いた、液体検
体中の生物活性ＥＰＯの存在および濃度を測定するため
の免疫受容体アッセイ方法ＭＴＰを、モノクローナルま
たはポリクローナル抗−ヒトＩｇＧ抗体を５μｇ／mlの
濃度で含有するＰＢＳを用いて、１穴あたり１００μｌ
としてコートした。室温で２４時間のインキュベーショ
ン時間の後、ＭＴＰを０.０５Ｍ Tris／クエン酸塩で数
回洗浄し、乾燥し、そして乾燥剤と共に気密に個別包装
した。これら使用準備の整ったＭＴＰは、比較的長期に
わたり保存することができる。アッセイ開始前に、プレ
ートをＷＢＢ（０.０５％ Tween２０含有ＰＢＳより成
る）で２回洗浄した。１００μｌのＥＰＯ−Ｒ−Ｆｃ溶
液（ＷＢＢ中１００ng／ml）を全穴に分注し、そしてそ
れらプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
プレートを数回洗浄後、組換えヒトＥＰＯの連続希釈剤
を各々１００μｌ、ピペットで穴にとった。検体中のＥ
ＰＯの結合は室温で２時間にわたって行った。それらプ
レートをＷＢＢで数回洗浄後、結合したＥＰＯを抗−Ｅ
ＰＯ−抗体−酵素接合体（Behringwerke, Marburg, ド
イツ連邦共和国）の添加により検出した。このために、
１００μｌの抗−ＥＰＯ−抗体−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ接合体（ＷＢ＋２％ＢＳＡ中０.５μｇ／ml）を
各穴に分注した。室温で１時間のインキュベーションの
後、ＭＴＰを数回洗浄した。ｏ−フェニレンジアミンを
そのＰＯＤを用いて酸化することによりシグナルを発生
させた。
【００３１】抗−ＥＰＯ−抗体−ＰＯＤ接合体はＥＰＯ
−受容体融合タンパク質について既に前述した如く合成
した。表８〜１１はＥＰＯに対するこの“サンドイッチ
型”免疫受容体アッセイの結果を示している。固相に結
合した抗−ヒトＩｇＧ抗体に結合したＥＰＯ−受容体−
Ｆｃ融合タンパク質、および様々な抗−ＥＰＯ−抗体−
ペルオキシダーゼ接合体が用いられた。結果が示すよう
に、このタイプのテストシステムは実施例３と同様、下
は２pg／ml以下まで生物活性ＥＰＯの存在および濃度を
検出することができる。
−受容体融合タンパク質について既に前述した如く合成
した。表８〜１１はＥＰＯに対するこの“サンドイッチ
型”免疫受容体アッセイの結果を示している。固相に結
合した抗−ヒトＩｇＧ抗体に結合したＥＰＯ−受容体−
Ｆｃ融合タンパク質、および様々な抗−ＥＰＯ−抗体−
ペルオキシダーゼ接合体が用いられた。結果が示すよう
に、このタイプのテストシステムは実施例３と同様、下
は２pg／ml以下まで生物活性ＥＰＯの存在および濃度を
検出することができる。
【００３２】実施例５：ＥＰＯに対する受容体の結合を
拮抗阻害できるモノクローナル抗体を用いた、実施例１
または２による液体検体中の生物活性ＥＰＯ二量体また
はオリゴマーの存在および濃度を検出するための免疫受
容体アッセイ 本実施例は実施例４に記載の如く行ったが、ただし、Ｅ
ＰＯ−Ｒ／Ｆｃと共にインキュベーション後、すべての
残留遊離Ｆｃ結合部位は１０％ヒト血清（Behringwerk
e, Marburg, ドイツ連邦共和国）と共にインキュベーシ
ョンすることによりブロックし、そして使用したモノク
ローナル抗体（８９−１４６−０５７）はエリスロポエ
チンに対する受容体の結合を拮抗的に阻害できる。細胞
内生合成中に二量体化されるヒトＥＰＯおよびヒトＦｃ
−ガンマ（１）断片より成る融合タンパク質（ＥＰ ０,
４６４,５３３ Ａ１）を活性ＥＰＯ二量体として用い
た。この融合タンパク質はプロティンＡアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製され、また生物学的に活
性である。生物学的に不活性な二量体／オリゴマーを調
製するたれに、組換えヒトＥＰＯをグルタルジアルデヒ
ドで架橋しそしてそれら二量体／オリゴマーを次にゲル
浸透クロマトグラフィーにより残るＥＰＯ単量体から分
離した。
拮抗阻害できるモノクローナル抗体を用いた、実施例１
または２による液体検体中の生物活性ＥＰＯ二量体また
はオリゴマーの存在および濃度を検出するための免疫受
容体アッセイ 本実施例は実施例４に記載の如く行ったが、ただし、Ｅ
ＰＯ−Ｒ／Ｆｃと共にインキュベーション後、すべての
残留遊離Ｆｃ結合部位は１０％ヒト血清（Behringwerk
e, Marburg, ドイツ連邦共和国）と共にインキュベーシ
ョンすることによりブロックし、そして使用したモノク
ローナル抗体（８９−１４６−０５７）はエリスロポエ
チンに対する受容体の結合を拮抗的に阻害できる。細胞
内生合成中に二量体化されるヒトＥＰＯおよびヒトＦｃ
−ガンマ（１）断片より成る融合タンパク質（ＥＰ ０,
４６４,５３３ Ａ１）を活性ＥＰＯ二量体として用い
た。この融合タンパク質はプロティンＡアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製され、また生物学的に活
性である。生物学的に不活性な二量体／オリゴマーを調
製するたれに、組換えヒトＥＰＯをグルタルジアルデヒ
ドで架橋しそしてそれら二量体／オリゴマーを次にゲル
浸透クロマトグラフィーにより残るＥＰＯ単量体から分
離した。
【００３３】この、生物学的に活性なＥＰＯ二量体／オ
リゴマーの存在および濃度を測定するための免疫受容体
アッセイの相当するデータを表１２にまとめる。固相に
結合した抗−ヒトＩｇＧ抗体に結合されたＥＰＯ−受容
体−Ｆｃ融合タンパク質、および中和抗−ＥＰＯ抗体８
９−１４６−０５７のペルオキシダーゼ接合体が用いら
れた。結果が示すように、このテストシステムは、生物
学的に活性な、および非活性なＥＰＯ二量体／オリゴマ
ーを識別することができ、そして下は１pg／ml以下まで
生物活性二量体／オリゴマーの存在および濃度を検出す
ることができる。
リゴマーの存在および濃度を測定するための免疫受容体
アッセイの相当するデータを表１２にまとめる。固相に
結合した抗−ヒトＩｇＧ抗体に結合されたＥＰＯ−受容
体−Ｆｃ融合タンパク質、および中和抗−ＥＰＯ抗体８
９−１４６−０５７のペルオキシダーゼ接合体が用いら
れた。結果が示すように、このテストシステムは、生物
学的に活性な、および非活性なＥＰＯ二量体／オリゴマ
ーを識別することができ、そして下は１pg／ml以下まで
生物活性二量体／オリゴマーの存在および濃度を検出す
ることができる。
【００３４】実施例６：ＧＭ−ＣＳＦ−受容体／Ｆｃ融
合タンパク質によるＧＭ−ＣＳＦの検出 プラスミドｐＧＭ−ＣＳＦＲ／ＦｃはＤＥ−Ａ−４０
２０ ６０７に知られている。それは、ヒトＩｇＧ１分
子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合された
ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体の細胞外領域より成るタンパク
質ＧＭ−ＣＳＦＲ／Ｆｃをコードする（ＥＰ ０,４６
４,５３３ Ａ１）。ｐＧＭ−ＣＳＦＲ／ＦｃをＢＨＫ細
胞に移入しそしてメトトレキセートおよびＧ４１８によ
り二重選別によって安定クローンを得た（ＥＰ ０,３３
０,９７７）。典型的発現率は上清１mlあたり１０μｇ
の領域にあり、そこからプロティンＡ−Sepharoseでの
クロマトグラフィーによりＧＭ−ＣＳＦＲ／Ｆｃが単離
された（ＥＰ ０,４６４,５３３Ａ１）。ＭＴＰをヒト
ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインに対するウサギ抗血清で
予めコートした（ＤＥ Ｐ ４０２０ ６０７.６）。ＧＭ
−ＣＳＦＲ／Ｆｃ（１００μｌ、１０％ ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ中３μｇ／ml）をこの固相に結合した（室温、１時
間）。０.０５％ Tween−２０含有ＰＢＳ（ＷＢＢ）で
プレートを３回洗浄後、固相上のすべての残留遊離ＣＨ
２結合部位を１０％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中の２０％ヒト
血清（１００μｌ、室温、１時間）と共にインキュベー
ションすることにより飽和させた。その後、表１３に示
された、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中組換えヒトＧＭ−Ｃ
ＳＦの濃度を用いてインキュベーションを行った（１０
０μｌ、室温、１時間）。ＷＢＢでプレートを３回洗浄
後、結合したＧＭ−ＣＳＦの検出は、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識モノクローナル抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体９
３２／６９８（Behringwerke, Marburg, ドイツ連邦共
和国）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中所与の希釈駅として用
い（１００μｌ、室温、３０分）、次いで１００μｌの
ＴＭＢ基質溶液（Behringwerke, Marburg, ドイツ連邦
共和国）中で発色させることにより行った。表１３はこ
のテストの設定では、抗体−接合体の使用濃度に依存し
て、ＧＭ−ＣＳＦを約１０pg／mlの濃度より検出できる
ことを示している。
合タンパク質によるＧＭ−ＣＳＦの検出 プラスミドｐＧＭ−ＣＳＦＲ／ＦｃはＤＥ−Ａ−４０
２０ ６０７に知られている。それは、ヒトＩｇＧ１分
子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合された
ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体の細胞外領域より成るタンパク
質ＧＭ−ＣＳＦＲ／Ｆｃをコードする（ＥＰ ０,４６
４,５３３ Ａ１）。ｐＧＭ−ＣＳＦＲ／ＦｃをＢＨＫ細
胞に移入しそしてメトトレキセートおよびＧ４１８によ
り二重選別によって安定クローンを得た（ＥＰ ０,３３
０,９７７）。典型的発現率は上清１mlあたり１０μｇ
の領域にあり、そこからプロティンＡ−Sepharoseでの
クロマトグラフィーによりＧＭ−ＣＳＦＲ／Ｆｃが単離
された（ＥＰ ０,４６４,５３３Ａ１）。ＭＴＰをヒト
ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインに対するウサギ抗血清で
予めコートした（ＤＥ Ｐ ４０２０ ６０７.６）。ＧＭ
−ＣＳＦＲ／Ｆｃ（１００μｌ、１０％ ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ中３μｇ／ml）をこの固相に結合した（室温、１時
間）。０.０５％ Tween−２０含有ＰＢＳ（ＷＢＢ）で
プレートを３回洗浄後、固相上のすべての残留遊離ＣＨ
２結合部位を１０％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中の２０％ヒト
血清（１００μｌ、室温、１時間）と共にインキュベー
ションすることにより飽和させた。その後、表１３に示
された、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中組換えヒトＧＭ−Ｃ
ＳＦの濃度を用いてインキュベーションを行った（１０
０μｌ、室温、１時間）。ＷＢＢでプレートを３回洗浄
後、結合したＧＭ−ＣＳＦの検出は、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識モノクローナル抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体９
３２／６９８（Behringwerke, Marburg, ドイツ連邦共
和国）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中所与の希釈駅として用
い（１００μｌ、室温、３０分）、次いで１００μｌの
ＴＭＢ基質溶液（Behringwerke, Marburg, ドイツ連邦
共和国）中で発色させることにより行った。表１３はこ
のテストの設定では、抗体−接合体の使用濃度に依存し
て、ＧＭ−ＣＳＦを約１０pg／mlの濃度より検出できる
ことを示している。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】サンドイッチ免疫エリスロポエチン受容体アッセイ
様々なイディオタイプを有する、固相に結合した抗−Ｅ
ＰＯ抗体。すべての抗体は受容体結合部位とは異なるエ
ピトープを認識する。結合したエリスロポエチンはペル
オキシダーゼにカップリングされたＥＰＯ−受容体−Ｆ
ｃ融合タンパク質を用いて検出された（表５〜７）。
ＰＯ抗体。すべての抗体は受容体結合部位とは異なるエ
ピトープを認識する。結合したエリスロポエチンはペル
オキシダーゼにカップリングされたＥＰＯ−受容体−Ｆ
ｃ融合タンパク質を用いて検出された（表５〜７）。
【００４０】
【表５】
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】サンドイッチ免疫エリスロポエチン受容体結合アッセイ
固相に結合した抗−ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（５
μｇ／ml）。エリスロポエチン受容体−Ｆｃ−融合タン
パク質（１００ng／ml−３０分／室温）。結合したエリ
スロポエチンは西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリ
ングした抗−ＥＰＯ抗体を用いて検出された（表８〜１
１）。
μｇ／ml）。エリスロポエチン受容体−Ｆｃ−融合タン
パク質（１００ng／ml−３０分／室温）。結合したエリ
スロポエチンは西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリ
ングした抗−ＥＰＯ抗体を用いて検出された（表８〜１
１）。
【００４４】
【表８】
【００４５】
【表９】
【００４６】
【表１０】
【００４７】
【表１１】
【００４８】
【表１２】
【００４９】
【表１３】
フロントページの続き
(72)発明者 クラウス−デイーター・ラングナー
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．リンデンヴエーク14
(72)発明者 レアンダー・ラウフアー
ドイツ連邦共和国デー−3554グラデンバ
ハ．シユロスアレー25
(72)発明者 ヨーゼフ−ウルバーン・パウリ
ドイツ連邦共和国デー−3557エプスドル
フアーグルント８．アム・ランゲンラー
ゼン10
(72)発明者 フリードリヒ−ローベルト・ザイラー
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．オーベラーアイヒヴエーク10
(56)参考文献 特開 昭53−75323（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/543
G01N 33/53
Claims (8)
- 【請求項１】 液体中の媒介物質および／またはそれら
の誘導体の検出および測定方法において； 検出すべき媒介物質の受容体および抗体のＦｃ部分から
なる可溶性組換え融合タンパク質またはその誘導体を固
相に結合する工程、 該媒介物質またはその誘導体を含有する可能性のある検
体と接触させる工程、および、 該受容体に結合した媒介物質を、該媒介物質に特異的な
抗体により直接または間接に検出する工程を含む検出お
よび測定方法。 - 【請求項２】 液体中の媒介物質および／またはそれら
の誘導体の検出および測定方法において； 検出すべき媒介物質に特異的な抗体を固相に結合する工
程、 該媒介物質またはその誘導体を含有する可能性のある検
体と接触させる工程、および、 該抗体に結合した媒介物質を、該媒介物質の受容体およ
び抗体のＦｃ部分からなる可溶性組換え融合タンパク質
またはその誘導体により直接または間接に検出する工程
を含む検出および測定方法。 - 【請求項３】 前記可溶性組換え融合タンパク質または
その誘導体を、Ｆｃ−特異的抗体を介して固相に結合さ
せることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 媒介物質またはそれらの誘導体の二量体
または多量体が測定される請求項１〜３のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項５】 検出すべき媒介物質が、インターロイキ
ン−１、インターロイキン−４、インターロイキン−
７、インターロイキン−８、エリスロポエチン、ＧＭ−
ＣＳＦまたはＴＮＦである、請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 検出すべき媒介物質の受容体および抗体
のＦｃ部分からなる可溶性組換え融合タンパク質または
その誘導体を結合させた固相材料よりなる、請求項１、
３〜５のいずれかに記載の測定方法のための測定器具。 - 【請求項７】 固相材料がミクロタイトレーションプレ
ートである、請求項６記載の測定器具。 - 【請求項８】 検出すべき媒介物質の受容体および抗体
のＦｃ部分からなる可溶性組換え融合タンパク質または
その誘導体に、発色反応を触媒する酵素を結合させた、
請求項２、４、５のいずれかに記載の測定方法のための
測定試薬。
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