JPH08508093A - 膵臓線維症又はｃｆｔｒ遺伝子の突然変異の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的試料中のヒトＰＡＰの濃度を定量する、ＣＦＴＲ遺伝子の変化に関連する膵臓の状態のインビトロ検出のための方法。定量を行うのに適した抗体も同様に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 膵臓線維症又はＣＦＴＲ遺伝子の突然変異の検出 本出願は、ＰＡＰ（膵炎関連タンパク質）の定量を用いた、膵臓線維症、又は 膵臓疾患に関連する膵臓線維症の原因である遺伝子の突然変異の検出を目的とす る。 ＰＡＰは、ヒトにおいて単離・精製され、特徴づけされており、９１／１６４ ２８という番号で１９９１年１０月３１日に公示されたＰＣＴ特許出願の中で記 載されている。この先行出願においては、ＰＡＰは、１つの定められた病理、つ まり急性膵炎の検出方法として提案されていた。 本発明者は、今日、膵臓線維症の特徴的症状を発生させる可能性のある遺伝子 異常を、ヒトにおいて信頼性ある形で、しかも出生と共に直ちに、ＰＡＰの異常 発現と相関させることができる、ということを証明してきた。 英語で「cystic fibrosis（嚢胞性線維症）」とも呼ばれる膵臓線維症（ムコ ビシドーシス）は、膵臓及び肺、そして一般的には外分泌腺からの外分泌の包括 的な不良を特徴とする、ある種の集団において非常に頻繁に起こる遺伝性疾患で ある。臨床的には、この病気は過度に粘度の高い分泌に結びつけられ、ここで形 成される粘液は、気管支を閉塞し、重傷の又は致死的な障害を誘発する可能性が ある。 膵臓線維症の遺伝子は、ヒト第７染色体上に局在している。ＣＦＴＲ（「嚢胞 性線維症膜貫通型コンダクタンス調節物質」）遺伝子と呼ばれるこの遺伝子は、 膵臓線維症を患う患者において、異 なる領域内で突然変異を呈する。同じタイプの突然変異は、病気の臨床的徴候を 示していない「キャリヤ」と呼ばれる個体において２つの第７染色体のうちの一 方だけに検出することができる。このような人々は、ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異 について異型接合体である。 異型接合体突然変異の場合であっても、キャリヤ個体は分泌腺の変性に特徴的 なある種の障害に苦しむ可能性がある。例えばキャリヤ個体は膵臓レベルでの障 害を患う可能性がある。 膵臓線維症の診断は、まず最初に、この病気にかかっている可能性のある患者 、特に子供の汗の中の塩素及びナトリウムを定量することから成る「汗試験」と 呼ばれる試験によって行われていた。６０〜１８０mEq/lの塩素率の表示は、正 常な乳幼児においてこの率が約４０mEq/lである限りにおいて、病気と相関させ ることができた。 他のタイプの複数の試験が連続的に提案された（Berry，H.K.et al.，Am．J． Dis．Chi1d．1980，134:930；Crossley，J．R.，et al.，Lancet 1977，ii:1093 ; Forrest，D.C.，et al.，Arch．Dis．Chi1d．1981 56:156；Green，M.N．et a l.，Pediatrics1968 41:989；Robinson，P.G．et al.，Arch．Dis．Child．1976 51:301；Shwachman，H.，et al.，Pediatrics 1949 4:222）が、新生児における トリプシンの血清定量（Farriaux，J.P.，et al.， いて現行のものとなるだけの充分な利点を立証したにすぎない（Farrell，P.M. ，et al.，Ped．Pulmonol．1991，補遺（Sup1.） 7:11）。この放射線免疫定量は、現在系統的に検診されているその他の遺伝子疾 患、つまりフェニールケトン尿症及び甲状腺機能低下を追跡する目的で新生児か ら採取された、厚紙上に沈着させた血液斑について行われる。それでも、フラン スの大規模評価プログラムの結果に基づいて最近フランス検診協会がそれを義務 としないことになったことから、血清トリプシンによる追跡は非常に不完全なも のにとどまっている（Farriaux，J.P．et al.，Immunoanal．Biol． トリプシンの血清定量によって提起される主要な問題は、偽陽性の問題（フラ ンスにおけるこの病気の罹患率が約０．０３％であるのに対して、偽陽性は人口 の約１％）である（Farriaux，J.P.，et 本発明は、膵臓線維症、又はＣＦＴＲ遺伝子の異型接合体突然変異の存在に関 連する疾患であるいくつかの外分泌腺疾患、特に膵臓の疾患の検出試験を実施す るための新しい手段を提案する。 本発明の手段は、今日までに知られてきた試験が示す欠点を有意な形で補正す ることを可能にし、特にこれらの手段は、偽陽性結果の数を著しく低減させ、ひ いては統計的にこれをなくする可能性を提供する。 ＰＡＰの研究によってＣＦＴＲ遺伝子の突然変異の結果としてもたらされる膵 臓疾患又は膵臓線維症を検出することが可能になったため、新生児検診の際、又 は小児もしくは成人における膵臓線維症の検診の際に応用することの可能な試験 を完成させることができた。 この試験は同様に、例えば膵臓疾患の進行を見極めるため病気の推移をたどる 目的でも実施することができる。 この試験は同様に、膵臓線維症の発症を導くわけではないものの成人又は小児 の患者において膵臓の疾患に相関させることのできる突然変異を有するＣＦＴＲ 遺伝子異型接合体の存在を検出するためにも実施することができる。 従って、本発明は、生物学的試料中のヒトＰＡＰ濃度を定量することを特徴と する、ＣＦＴＲ遺伝子の変化に関連する膵臓疾患のインビトロ検出のための方法 を目的とする。 本発明は同様に、ＰＡＰ濃度を定量することを特徴とする、膵臓線維症の生物 学的試料に対するインビトロ検出のための方法にも関する。 得られた濃度の値は、次に、いかなる病気も存在しない状態で又はＣＦＴＲ遺 伝子の異型接合体突然変異がない状態で同じ試験条件下で得られる値と比較され る。 本発明者は、特に乳幼児において、たとえ膵機能不全の場合でさえ急性膵炎に 必ずしも関連づけられない膵臓線維症のような病気において、ＰＡＰの率が正常 の率に比べ有意に、ひいては著しく増大しているのがわかる、ということを確認 した。この増大は正常値に比べ２〜３倍、最大でその１０倍に及ぶ可能性がある 。正常値は以下に規定するような中央値を基準にして決定される。 膵臓疾患又は膵臓線維症に関連するＣＦＴＲ遺伝子の変化の表示としての、提 案されている生物学的試料中のＰＡＰ濃度の定量は、新生児診断の枠内で利用可 能であるという利点を示す。 誕生時にある種の酵素が血液中を一時的に通過するという病的ではない既知の 現象にもかかわらず、ＰＡＰの定量は、実際上、膵臓線維症又は膵臓疾患に関連 するＣＦＴＲ遺伝子上の異型接合体突然変異を検出するために統計的に信頼のお けるものであり続けている。換言すると、新生児試験の際に生物学的試料、特に 血液で測定されたＰＡＰの率が異常である場合、そこから、膵臓線維症又はある 種のケースでは膵臓疾患に関連するＣＦＴＲ遺伝子の異常を演繹することができ る。従って本発明者は、新生児試験の際に血中に異常に高い率でＰＡＰが存在す ることと、「周産期ストレス」の現象に付随しうる血中の酵素分泌とを混同して はならないということを確認した。 「異常に高い率の」ＰＡＰという表現は、基準試料グループについて決定した ＰＡＰの率に基づいて計算した中央値の値の２倍以上のようなＰＡＰの値のこと を意味している。 本発明の第一の実施態様に従うと、膵臓疾患を伴うＣＦＴＲ遺伝子に関する異 型接合体突然変異又は膵臓線維症のインビトロ検出方法は、 − 生物学的試料中のＰＡＰ濃度を定量すること、 − 同一の条件下で予めＰＡＰを定量した規定の基準試料グループについて計算 した中央値の値と、得られた値とを比較すること、を特徴とする。 「基準試料グループ」というのは、好ましくはＣＦＴＲ遺伝子の突然変異につ いて異型接合体でない患者において得られた試料のことを言う。 前述の中央値は、一定の与えられた試料について得られ、試験された規定の試 料グループ内で、この値より下又は上の観察（測定値）が同じ数だけ存在するよ うな形で選ばれた測定値のことである。実施された測定回数が偶数である場合、 中央値は観察された２つの中央値の間で決定されない。 本発明の有利な実施方法は、さらに、ＰＡＰの血清濃度の定量に、 − 血液又は血清のような生物学的試料と、ヒトＰＡＰを認識する抗体とを接触 させること、 − ＰＡＰ−抗体タイプの免疫反応の形成を検出すること、 − ＰＡＰ−抗体複合体を定量すること、 が含まれていることを特徴とする。 この定量の実施のために利用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもモ ノクローナル抗体であってもよく、さらには、試験がサンドイッチ型の免疫試験 である場合にはこれら両方のタイプの抗体であってもよい。 好ましくは、ＰＡＰと免疫複合体を形成する抗体は、モノクローナル抗体であ る。有利には、これは、ヒトＰＡＰに特異的なモノクローナル抗体であり、従っ て、正常な生物学的試料中、特に正常な基準血液中に存在する成分との免疫反応 が欠如している。この抗体は、特に、血液のレクチンとの反応が欠如している。 「正常な血液」又は「正常な試料」と呼んでいるのは、ＰＡＰを極めて低い率 で含む試料のことである。 本発明のインビトロ検出試験の実施の枠内で、（正常血清又は正 常試料をこの抗体と接触させることによって測定可能な）バックグランドノイズ 信号が低い単数又は複数のＰＡＰ特異的抗体を選択するのが有利である。 本発明の実施のために特に有利な方法は、 − ＰＡＰを調べる血液又は血清試料のような生物学的試料を、ヒトＰＡＰを特 異的に認識するモノクローナル抗体（これがいわゆる「捕獲抗体」である）と、 定量される試料中にＰＡＰが存在する場合にこのＰＡＰと捕獲抗体との間の免疫 複合体の形成を可能にするような条件下で接触させる工程、 − 前工程で得られた反応媒質を、捕獲抗体により認識されるエピトープとは異 なるエピトープを認識する標識されたモノクローナル抗体（これを「検出抗体」 と呼ぶ）と、予め捕獲抗体に結合させた抗原と検出抗体との間の免疫複合体の形 成を可能にするような条件下で接触させる工程、 − 反応しなかった検出抗体を除去するために洗浄する工程、 − 捕獲抗体−ＰＡＰ抗原−検出抗体の複合体を検出する工程、 − ＰＡＰ濃度を測定し、場合によっては、それを、同一条件下で予めＰＡＰを 同様に定量した規定の基準試料グループについて計算した中央値と比較する工程 、 を含むことを特徴とする。 上述の方法の実施のためには、捕獲抗体がポリクローナル血清であり、検出抗 体がモノクローナル抗体であるような、捕獲抗体と検出抗体の対を使用すること ができる。同様に、捕獲抗体と検出抗体がＰＡＰ上の異なるエピトープを認識す るとして、全ての抗体がモ ノクローナルである捕獲抗体／検出抗体の対を利用することも可能である。 同様に、捕獲抗体がポリクローナル血清で、検出抗体も同様に同じ性質の、か つ場合によってはその調製に関し同じ由来をもつポリクローナル血清であるが、 ただし検出抗体の方は標識されている場合にも、全く満足のいく結果を得ること ができる。 ＰＡＰについて上述したサンドイッチタイプのＥＬＩＳＡ試験を実施する目的 で、捕獲抗体がマイクロタイトレーションプレートのウェルを被覆するためのも のであることがわかっていることから、モノクローナル抗体及び／又はポリクロ ーナル血清の選択を行わなければならない。 当業者であれば、これらの抗体の選択において、固体支持体への抗体の吸着が 分子のコンフォメーション変化から活性の喪失を導く可能性があるという事実を 考慮に入れることだろう。かくして当初は、選択した抗体又は選択した血清が、 支持体上に固定された後、天然ＰＡＰ及び／又は組換え型ＰＡＰを認識する能力 をもつことを確認することが必要となる可能性がある。 同様に、当業者は、例えば選択した２つの抗体の間の競合によるＰＡＰの検出 試験を実施する際、捕獲抗体により認識されるエピトープとの関係においてＰＡ Ｐ上の異なるエピトープを認識するモノクローナル検出抗体を選択することもで きるだろう。 一般に、捕獲抗体／検出抗体の対、又は捕獲及び検出の両方のために利用され るポリクローナル血清は、充分な感度を呈し、かつ有利な結果の再現性及び優れ た経時的な安定性（４℃での抗体貯蔵に ついて約６ヵ月）を可能にしなければならない。 かくして、１９９２年１２月２３日付で９２１２２３１０という番号でＥＣＡ ＣＣ（European Collection of Animal Cell Culture，Porton Down，Salisbury ，Wiltshirte SP4，OJG,英国）に寄託されたハイブリドーマにより産生される６ Ｆ３Ｅ４という呼称のモノクローナル捕獲抗体が、有利に使用される。同様にし て、特に有利な検出抗体は、１９９２年１２月２３日付で９２１２２３０９とい う番号でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体１６Ｆ４ Ｂ８である。 ポリクローナル検出抗体又は血清は、検出試験の際に形成される捕獲抗体−Ｐ ＡＰ抗原−検出抗体複合体の検出を可能にするべく適切なあらゆる標識で標識さ れる。参考としては、放射性標識又は酵素標識を利用することができる。例えば 、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた標識が挙げられる。 抗体を利用する上述の検出方法は、捕獲抗体及び／又は検出抗体を、その可変 フラグメント又はこれらの可変フラグメントの一部分で置き換えるような形で、 改変することができる。一例を挙げると、反応を実施させるためＦ（ａｂ′）₂ 又はＦａｂフラグメントを利用することが可能である。 本発明はさらに、固体支持体上に吸着された場合に、精製された天然の及び／ 又は組換え型のヒトＰＡＰを認識することを特徴とするモノクローナル抗体にも 関する。 ＰＡＰについては、上述のＰＣＴ出願の中で記載されている。又そのヌクレオ チド配列及びアミノ酸配列は、図３に記されてい る。 これらの条件を満たす有利な抗体は、上述の抗体６Ｆ３Ｅ４又は１６Ｆ４Ｂ８ である。 最後に、本発明は、ヒトＰＡＰの異なるエピトープに対して特異的な少なくと も２つのモノクローナル抗体を含み、これら２つのモノクローナル抗体のうちの 少なくとも１つが固体支持体上に固定された際にヒトＰＡＰを認識する（捕獲抗 体）ようなキットをも目的としている。 一般的に言うと、本発明は、膵臓線維症、又はＣＦＴＲ遺伝子に関する異型接 合体突然変異に関連する膵臓疾患のインビトロ検出のための、ヒトＰＡＰを特異 的に認識するモノクローナル抗体の利用を目的とする。 同様に本発明の範囲内に入るのは、 − 標識されたもの（検出抗体）を１つ含む、上述のモノクローナル及び／又は ポリクローナル抗体、 − 検出抗体を明らかにすることを可能にする試薬、 − 陰性対照、 を含む、ＣＦＴＲ遺伝子に関する異型接合体突然変異に関連する膵臓疾患又は膵 臓線維症のインビトロ検出のためのキットである。 本発明の実施のための好ましいキットは、捕獲抗体として抗体６Ｆ３Ｅ４を、 検出抗体として抗体１６Ｆ４Ｂ８を含む。 別の特に有利なキットは、ＰＡＰの検出のためにポリクローナル血清を含んで いる。この血清の一部分はＰＡＰの捕獲を目的とし、その他の部分はサンドイッ チタイプの試験においてＰＡＰ−抗体タ イプの複合体の存在を明らかにするため標識された抗体を含んでいる。 精製されたＰＡＰを投与したウサギのような動物において、適切なポリクロー ナル血清を調製することが可能である。 かくして、有利なキットには、 − ヒトＰＡＰを認識するポリクローナル血清、 − 場合によっては、標識された抗体を有する、ヒトＰＡＰを認識するポリクロ ーナル血清、 − 標識された抗体を明らかにすることを可能にする試薬、 − 陰性対照、 が含まれる。 本発明は同様に、ＥＣＡＣＣでNo．９２１２２３１０という番号をもつ、抗体 ６Ｆ３Ｅ４を産生するハイブリドーマ、ならびにＥＣＡＣＣでNo．９２１２２３ ０９という番号をもつ、抗体１６Ｆ４Ｂ８を産生するハイブリドーマをも目的と する。 本発明のその他の特徴及び利点は、以下の例及び図の中で明らかにされている 。 図１ ウサギにおいて得られ、精製されたヒトＰＡＰを認識するポリクローナル抗体 を利用する競合ＥＬＩＳＡタイプの試験を用いた、血清ＰＡＰ定量の結果。 図２ 新生児におけるＰＡＰの定量。 図３ ヒトＰＡＰのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。 Ａ）実験的定量 １．膵臓線維症を患う患者におけるＰＡＰの定量： プロトコール：汗試験（Shwachman，H．et al.，Ann.，N.Y.Acad．Sci．1962 ，93:600）及び／又は遺伝子解析（Collins，F.S.嚢胞性線維症：分子生物学及 び治療上の解釈。Science 1992,256:774）によって膵臓線維症の診断が確認され ていた生後１５日目から４０才までの６６名の患者からの採血を分析した。対応 する健常な一連の個体を並行して研究した。以下の定量法によりこれらの採血中 のＰＡＰを定量した。 血清ＰＡＰの定量：競合ＥＬＩＳＡタイプのこの定量法は、精製されたヒトＰ ＡＰの反復的注射によりウサギにて得られたポリクローナル抗体を利用する（Ke im，V．et al.，Gastroentero1ogy，1992，103:248）。マイクロタイトレーショ ンプレート上に、ＰＡＰを含むヒト膵液タンパク質を吸着させた（１ウェルあた り１００ｎｇのタンパク質）。免疫血清０．５μｌの存在下でエッペンドルフタ イプの試験管の中に血清試料（５０μｌ）を入れ、周囲温度で２時間、最終体積 １００μｌの１００mMトリス、pH７．４、１％Tween２０、１．５％ウシ血清ア ルブミン中でインキュベートする。次に、混合物を上述のとおり処理したマイク ロタイトレーションウェル内に入れ、周囲温度で２時間インキュベートする。次 に、０．５％Tween２０を含む３００μｌのＰＢＳでウェルを３回洗浄する。検 出は、ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用いて 行う（０．２μg/mlで１００μｌ）。基準曲 線を、精製されたＰＡＰを用いて作成する。 結果：図１に示す結果は、次のことを示している。 ＊膵臓線維症を患う患者において、ＰＡＰの血清濃度は常に対照のものより高 い。対照の値は１〜１０ng/mlの幅があり、患者の値は１１〜１９００ng/mlの幅 がある。 ＊最高値は、最も若い患者において観察される。 ２．新生児におけるＰＡＰの定量：膵臓線維症を患う胎児の病理 A．et al.，Hum．Genet．1988，74:288）。このことから、本発明者は、膵臓線 維症の新生児の血液中ではＰＡＰ濃度がすでに高いものであり得たということを 演繹した。 プロトコール：このことを、以下の実験により証明することができた。 検診センターから来た乾燥血試料のついた厚紙に基づいて、ＰＡＰ定量を実施 した。これらの厚紙は、４グループの個体に対応していた。すなわち、 グループ１：対照（出生時点で正常なトリプシン）（ｎ＝５０）。 グループ２、３及び４：出生時に高いトリプシンを呈した小児。 グループ２：「偽陽性」の小児（ＣＦＴＲ遺伝子には異常なし、汗試験は陰 性）。（ｎ＝６０）。 グループ３：突然変異したＣＦＴＲ遺伝子に関して異型接合体の小児（未罹 患）、汗試験は陰性。（ｎ＝３３）。 グループ４：膵臓線維症にかかった小児（突然変異したＣＦＴＲ遺伝子に関 して異型接合体、汗試験陽性）（ｎ＝１１）。 定量：定量は、以下の要領で行った。 利用済み厚紙上の血液沈着物は２ケ月以内の時間が経ったものであった。厚紙 は、フランス検診協会が規定した規格に対応していた。 各々の厚紙から血斑のレベルで直径６mmの円盤を切り取った。対応する血液量 は約１０μｌである。 １５０μｌの１００mMトリス、pH７．４、１％Tween２０、１．５％ウシ血清 アルブミンを含む溶液を入れた合計１．５mlの体積のエッペンドルフタイプの試 験管の中に、各々の円盤を人れ、周囲温度で８時間、Multivortexer装置（Amers ham France S．A.）上で撹拌した。脱着された血液を含む溶液全部を、０．５μ ｌの抗ＰＡＰ抗血清を含む５０μｌのトリス、pH７．４、１％Tween２０、１． ５％ウシ血清アルブミンの溶液に添加し（合計体積２００μｌ）、周囲温度で２ 時間インキュベートする。定量のその後の作業は、まさに上述のとおりに行う。 結果：図２に示す結果は、以下のように要約することができる。 １）トリプシン陰性の小児（対照、グループ１）は、血液１０μｌ中０．０１ 〜０．１ng（中央値０．０６５）の血液ＰＡＰ濃度を有する。 ２）グループ２の小児（トリプシン陽性であるが、罹串していな い）は、対照と同じ値を示している。 ３）グループ３の小児（異型接合体）の３分の１（１１／３３）は、血液１０ μｌあたり０．１８〜０．７５ngのＰＡＰ血清濃度を示した。 ４）膵臓線維症の全ての小児（１１／１１）が、血液１０μｌあたり０．２２ 〜０．９０ngのＰＡＰ血清濃度を示した。 結論： １）対照の小児は、いずれも血液１０μｌあたり０．１ngを上回るＰＡＰ血中 濃度を示さなかった。この実験は、中央値の２倍を上回る（血液１０μｌあたり ０．１１ｎｇを上回る）全ての値が異常であることを示している。 ２）一方、膵臓線維症の全ての小児は、この閾値を上回る血中ＰＡＰ値を示し た。 ３）トリプシン定量に基づくシステムとは異なり、ＰＡＰ定量は、膵臓線維症 を有する小児、及び変化した遺伝子に関する異型接合体のうちその膵臓疾患が最 も顕著である小児しか選択しないように思われる。 従って、提案されている試験は、膵臓線維症の新生児検診でのその応用のため に必要とされる長所を有するものである。 Ｂ）工業的定量 １．モノクローナル抗体を用いて ＰＡＰのための「サンドイッチ」タイプのＥＬＩＳＡ試験を完成させるために は、抗原上で異なる２つのエピトープを認識する２つのモノクローナル抗体を選 択することが必要であった。すなわち、 ・マイクロタイトレーションプレートのウェルを被覆することを目的とするもの （捕獲抗体）、 ・ウェル上に吸着された抗原を明らかにすることを目的とする、酵素にカップリ ングされたもの（検出抗体）。 この選択は、腹水として産生され、かつＩｇＧのためのプロテイン−Ａ−セフ ァロースカラム又はＩｇＭのための免疫吸着剤カラム（セファロースマトリック スにカップリングされたラット抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体）でのアフィ ニティクロマトグラフィによって精製されたモノクローナル抗体を用いて行った 。 固体支持体上の免疫グロブリンの吸着は、分子の活性喪失をひき起こしうるコ ンフォメーシヨン変化の形で現れうる。従って、実験室内で得られた抗−ＰＡＰ モノクローナル抗体の全てを、マイクロタイトレーションプレート（NUNC maxis orp）上への吸着後の天然及び組換え型ＰＡＰの認識能力について試験した。イ ンキュベーション後、抗原−抗体複合体は、ｏ−フェニレンジアミンを酵素の基 質として利用することによって、ペルオキシダーゼとコンジュゲート化された抗 −ＰＡＰウサギ免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを用いて明らかにした。 この能力を保っていた全てのグロブリンを潜在的な捕獲抗体として留保し、ビ オチンにカップリングした。 これらのビオチニル化された抗体を、モノクローナル検出抗体を選択するため の競合試験で利用した。 これらの試験は、抗ＰＡＰウサギＩｇＧで被覆したマイクロタイトレーション プレートのウェル上に吸着されたＰＡＰ（天然及び 組換え型）を用いて行った。抗原上へのビオチニル化されたモノクローナル抗体 の固定を、試験すべき異なるモノクローナル抗体の過剰量が存在する又は存在し ない状態で測定した。 ビオチニル化された抗体のうちの少なくとも１つと競合しない、従って異なる エピトープを認識するモノクローナル抗体を全て、潜在的な検出抗体として選択 した。 その後、ＰＡＰの定量用ＥＬＩＳＡ試験の最終的形態の完成のために利用する 前に、Ｆａｂ′フラグメントの形でＰＯＤにこれらのモノクローナルをカップリ ングさせた。 この完成のためには、試験の最高の感度、結果の最良の再現性及び試薬の最高 の経時的安定性を得ることを可能にする捕獲抗体−検出抗体の対を探し求めるこ とが必要であった。 次の２つの抗体が、これらの選択基準全体を満足した。すなわち、 ・捕獲に利用される、抗体６Ｆ３Ｅ４、 ・検出に利用される、抗体１６Ｆ４Ｂ８。 ２．ポリクローナル血清を用いて 検診条件に適合させたサンドイッチタイプのＰＡＰ ＥＬＩＳＡ定量法を完成 した。その特徴は以下のとおりである。 抗体の産生： 抗原は、以下の技術に従って高度に精製されたヒトＰＡＰであった。移植され た膵臓の凍結乾燥された膵液から、イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、Mo noSカラム）による最初の分離によって、ＰＡＰを含むピークと高分子量の夾雑 物質とを分離する ことができた。このピークを、次に、分子ふるいにより解像した（ＨＰＬＣ、セ ファクリル２００ＨＲ）。このとき、均質な画分の形でＰＡＰが回収された。 ＳＤＳゲルでの電気泳動及び銀染色により行った検査により、９８％を超える 純度を保証することができた。 免疫は、Keim V．et al．（Gastroenterology，1992，103:248）により記載さ れている実験室の通常の技法に従って行った。 免疫血清の品質は、連続希釈のウェスタンブロットを利用することによって試 験した。 ＥＬＩＳＡの構成： ここで問題となっているのは、ポリクローナル／ポリクローナルのサンドイッ チＥＬＩＳＡ法である。 免疫血清の免疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースカラム上でアフィ ニティにより精製した。 検出を目的とした免疫グロブリンは、当業者にとっては既知の通常の技術に従 ってビオチンで標識した。検出システムには、ＰＯＤアビジンを介入させた。 試験の感度は、５０pg/mlである。 得られた結果： 健全な新生児の厚紙上への４０の採血を試験した。そこでのＰＡＰ濃度は全て ６０pg/ml未満であった。膵臓線維症の新生児は８００pg/mlの値を有していた。 同様に厚紙上に採血した、病気にかかった６人の小児（生後３カ月〜１０才）は 、０．５ng/ml〜１．８ng/mlの幅のある値を示した。 これらの結果は、モノクローナル抗体を用いて行った定量ですでに観察された 差異を確認するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダゴルン，ジャン−シャルル フランス国、エフ―13009、マルセイユ、 バティマン・アシュ、ブルヴァール・デ ュ・ルドン、77 (72)発明者 カイム，フォルカー ドイツ連邦共和国、デー―6805 ヘーデス ハイム、キルシュ・ブリューテンシュトラ ーセ 33 (72)発明者 サルル，ジャック フランス国、エフ―13420 ジェムノ、シ ュマン・ドゥ・ラ・ミン（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的試料中のヒトＰＡＰの濃度を定量することを特徴とする、ＣＦＴＲ 遺伝子の変化に関連する膵臓疾患のインビトロ検出のための方法。 ２．ＰＡＰ濃度を定量することを特徴とする、膵臓線維症の生物学的試料につい てインビトロ検出するための、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．膵臓線維症の検出が新生児試験の際に行われることを特徴とする、請求の範 囲第１項及び第２項のいずれか１項記載の検出方法。 ４．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の、ＣＦＴＲ遺伝子に関する 異型接合体突然変異に関連する膵臓疾患又は膵臓線維症のインビトロ検出方法で あって、 − 生物学的試料中のＰＡＰ濃度を定量すること、 − 同一条件下で予めＰＡＰを定量した規定の基準試料グループについて計算し た中央値の値と、得られた値とを比較すること、 を特徴とする方法。 ５．ＰＡＰ血清濃度の定量に、 − 血液又は血清のような生物学的試料と、ヒトＰＡＰを認識する抗体と接触さ せること、 − ＰＡＰ−抗体タイプの免疫反応の形成を検出すること、 − ＰＡＰ−抗体複合体を定量すること、 を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の方法 。 ６．抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求の範囲第５項記載 の方法。 ７．モノクローナル抗体が、ヒトＰＡＰに特異的であり、従って基準の正常血中 又は正常な生物学的試料中に存在する成分との免疫反応が欠如していること、そ して特に血液のレクチンとの反応が欠如していることを特徴とする、請求の範囲 第６項記載の方法。 ８．ヒトＰＡＰを認識する抗体がポリクローナル血清中に含まれていること、及 びＰＡＰ−抗体複合体の検出を、例えばビオチニル化のような標識された抗ＰＡ Ｐ抗体を含むポリクローナル血清を用いて行うことを特徴とする、請求の範囲第 ５項記載のインビトロ検出方法。 ９．請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の、ＣＦＴＲ遺伝子に関する 異型接合体突然変異に関連する膵臓疾患又は膵臓線維症のインビトロ検出方法で あって、以下の工程： − ＰＡＰを調べる血液又は血清試料のような生物学的試料を、ヒトＰＡＰを特 異的に認識するモノクローナル抗体（これを「捕獲抗体」と呼ぶ）と、定量され る試料中にＰＡＰが存在する場合にこのＰＡＰと捕獲抗体との間の免疫複合体の 形成を可能にするような条件下で接触させる工程、 − 前工程で得られた反応媒質を、捕獲抗体により認識されるエピトープとは異 なるエピトープを認識する標識されたモノクローナル抗体（これを「検出抗体」 と呼ぶ）と、予め捕獲抗体に結合させた抗原と検出抗体との間の免疫複合体の形 成を可能にするような条件下で接触させる工程、 − 反応しなかった検出抗体を除去するために洗浄する工程、 − 捕獲抗体−ＰＡＰ抗原−検出抗体の複合体を検出する工程、 − ＰＡＰ濃度を測定し、場合によっては、それを、同一条件下で予めＰＡＰを 同様に定量した規定の基準試料グループについて計算した中央値と比較する工程 、 を含むことを特徴とする方法。 １０．検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングされていることを 特徴とする、請求の範囲第９項記載の方法。 １１．検出抗体がそのＦ（ａｂ′）₂又はＦａｂ′フラグメントによって置き換 えられていることを特徴とする、請求の範囲第９項及び第１０項のいずれか１項 記載の方法。 １２．捕獲抗体が、１９９２年１２月２３日付で９２１２２３１０という番号で ＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体６Ｆ３Ｅ４であ ることを特徴とする、請求の範囲第９項〜第１１項のいずれか１項記載の方法。 １３．検出抗体が、１９９２年１２月２３日付で９２１２２３０９という番号で ＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体１６Ｆ４Ｂ８で あることを特徴とする、請求の範囲第９項〜第１２項のいずれか１項記載の方法 。 １４．検出及び捕獲モノクローナル抗体が、ヒトＰＡＰを認識するポリクローナ ル血清により置き換えられていることを特徴とする、請求の範囲第９項記載の方 法。 １５．固体支持体上に吸着された際、精製された天然の及び／又は組換え型のヒ トＰＡＰを認識することを特徴とする、モノクローナ ル抗体。 １６．抗体６Ｆ３Ｅ４又は抗体１６Ｆ４Ｂ８であることを特徴とする、請求の範 囲第１５項記載のモノクローナル抗体。 １７．ヒトＰＡＰの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つのモノク ローナル抗体を含むキットであって、２つのモノクローナル抗体のうちの少なく とも１つ（捕獲抗体）が固体支持体上に固定された際にヒトＰＡＰを認識する、 キット。 １８．ＣＦＴＲ遺伝子に関する異型接合体突然変異に関連する膵臓疾患又は膵臓 線維症のインビトロ検出のためのキットであって、 − 標識されたもの（検出抗体）を１つ含む、請求の範囲第１５項又は第１６項 記載のモノクローナル抗体、 − 検出抗体を明らかにすることを可能にする試薬、 − 陰性対照、 を含むキット。 １９．ＣＦＴＲ遺伝子に関する異型接合体突然変異と関連する膵臓疾患又は膵臓 線維症のインビトロ検出のためのキットであって、 − ヒトＰＡＰを認識するポリクローナル血清、 − 場合によっては、標識された抗体を有する、ヒトＰＡＰを認識するポリクロ ーナル血清、 − 標識された抗体を明らかにすることを可能にする試薬、 − 陰性対照、 を含むキット。 ２０．ＣＦＴＲ遺伝子に関する異型接合体突然変異に関連する膵臓疾患又は膵臓 線維症のインビトロ検出を目的とした、ヒトＰＡＰを 特異的に認識するモノクローナル抗体又はヒトＰＡＰを認識するポリクローナル 血清の利用。