DE69328376T2

DE69328376T2 - Feststellung der cystic fibrosis oder einer mutation des cftr gens

Info

Publication number: DE69328376T2
Application number: DE69328376T
Authority: DE
Inventors: Jean-Charles Dagorn; Juan-Lucio Iovanna; Volker Keim; Jacques Sarles
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1992-12-24
Filing date: 1993-12-23
Publication date: 2000-12-21
Anticipated expiration: 2013-12-24
Also published as: EP0676052B1; DE69328376D1; CA2152166A1; FR2700011B1; ATE191793T1; ES2148313T3; FR2700011A1; WO1994015218A1; JPH08508093A; EP0676052A1; CA2152166C; US5834214A

Description

Der Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Erkennung der Mucoviszidose oder einer Mutation des Gens, das für die Mucoviszidose, die mit einer Pankreas-Erkrankung verbunden ist, verantwortlich ist, mittels einer Bestimmung des PAP (Pancreatitis-Associated Protein).
Das PAP ist aus dem Menschen isoliert, gereinigt und charakterisiert worden und wurde in der PCT-Patentanmeldung, veröffentlicht am 31. Oktober 1991 unter der Nummer 91/16428, beschrieben. In dieser früheren Anmeldung ist das PAP als Mittel zum Nachweis einer bestimmten Pathologie, der akuten Pankreatitis, vorgeschlagen worden.
Die Erfinder haben jetzt bewiesen, daß genetische Anomalien, die zu charakteristischen Krankheitsmerkmalen der Mucoviszidose führen, zuverlässig beim Menschen mit einer abnormalen Expression des PAPs und das seit der Geburt korreliert werden können.
Die Mucoviszidose, auch "cystic fibrosis" im Englischen genannt, ist eine bei bestimmten Bevölkerungen sehr häufige genetische Krankheit, die durch eine allgemeine Insuffizienz exokriner Sekretionen des Pankreas und der Lunge und allgemein der exokrinen Drüsen charakterisiert ist. Klinisch ist die Krankheit mit zu viskosen Sekretionen verbunden, wobei der gebildete Schleim die Bronchien verstopfen und schwere oder tödliche Störungen hervorrufen kann.
Das Gen der Mucoviszidose wurde auf dem menschlichen Chromosom 7 lokalisiert. Dieses Gen, CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator")- Gen genannt, besitzt Mutationen in verschiedenen Bereichen bei den an Mucoviszidose erkrankten Personen. Mutationen des gleichen Typs können auf einem einzigen der zwei Chromosomen 7 bei Personen, die als "Träger" bezeichnet werden, aber keine klinischen Zeichen der Krankheit zeigen, nachgewiesen werden. Diese Personen sind für die Mutation des CFTR-Gens heterozygot.
Im Falle einer heterozygoten Mutation kann der Träger manchmal an gewissen Störungen leiden, die für eine Veränderung sekretorischer Drüsen charakteristisch sind. Der Träger kann zum Beispiel von Störungen des Pankreas betroffen sein.
Die Diagnostik der Mucoviszidose wurde zuerst mit einem Test, "Schweißtest" genannt, durchgeführt, der in der Bestimmung der Konzentration an Chlor und Natrium im Schweiß der Personen besteht, insbesondere der Kinder, die empfänglich sind, von dieser Krankheit betroffen zu sein. Die Indikation eines Prozentsatzes an Chlor zwischen 60 und 180 mEq/l konnte mit der Krankheit korreliert werden, insoweit als dieser Prozentsatz ungefähr 40 mEq/l beim normalen Säugling beträgt.
Mehrere Tests eines anderen Typs sind nach und nach vorgeschlagen worden (Berry, H. K. et al., Am. J. Dis. Child. 1980 134: 930; Crossley, J. R. et al., Lancet 1977 ii: 1093; Forrest, D. C. et al., Arch. Dis. Child. 1981 56: 156; Green, M. N. et al., Pediatrics 1968 41: 989; Robinson, P. G. et al., Arch. Dis. Child. 1976 51: 301; Shwachman, H. et al., Pediatrics 1949 4: 222), aber nur die Bestimmung der Konzentration an Trypsin im Serum des Neugeborenen (Farriaux, J. P. et al., Immunoanal. Biol. Spéc. 1992 33: 71) zeigte genug Interesse, um noch in einigen Ländern angewendet zu werden (Farrel, P. M. et al., Ped. Pulmonol. 1991 Supplement 7: 11). Diese radioimmunologische Konzentrationsbestimmung wird auf Blutflecken durchgeführt, Blut, das auf Papierscheiben aufgebracht und dem Neugeborenen zur Erkennung anderer genetischer Krankheiten, die zur Zeit systematisch untersucht werden, die Phenylketonurie und der Hypothyreose, entnommen wurde. Die Erkennung mittels Trypsin im Serum bleibt dennoch sehr unvollständig, da die Ergebnisse eines französischen Bewertungsprogrammes in großem Maßstab die Association Francaise de Depistage kürzlich veranlaßt haben, sie nicht obligatorisch zu machen (Farriaux, J. P. et al., Immunoanal. Biol. Spec. 1992 33: 71).
Das Hauptproblem der Konzentrationsbestimmung an Trypsin im Serum sind die Falsch-Positiven (etwa 1% der Bevölkerung, während das Vorkommen der Krankheit in Frankreich etwa 0.03% beträgt (Farriaux, J. P. et al., Immunoanal. Biol. Spec. 1992 33: 71).
Die Erfindung liefert neue Mittel, um einen Test zur Erkennung der Mucoviszidose oder einer Erkrankung bestimmter exokriner Drüsen durchzuführen, insbesondere des Pankreas, eine Krankheit, die mit dem Vorkommen einer heterozygoten Mutation des CFTR-Gens verbunden ist.
Die Mittel der Erfindung ermöglichen eine bedeutende Verbesserung der Nachteile, die die bis jetzt bekannten Tests zeigen, und insbesondere bieten diese Mittel die Möglichkeit, die Anzahl der falsch-positiven Ergebnisse beträchtlich zu verringern, ja sogar statistisch aufzuheben.
Die Möglichkeit, die Mucoviszidose oder eine Pankreas-Erkrankung, die aus einer Mutation des CFTR-Gens folgt, zu erkennen, dank der Erforschung des PAP, hat die Entwicklung eines zur Anwendung während der neonatalen Erkennung oder während der Erkennung der Mucoviszidose beim Kind oder Erwachsenen geeigneten Tests ermöglicht.
Dieser Test kann ebenso in der Absicht durchgeführt werden, den Verlauf der Krankheit zu verfolgen, zum Beispiel um den Verlauf der Pankreas-Erkrankung zu bestimmen.
Ein solcher Test kann ebenso verwendet werden, um die Anwesenheit des mutierten heterozygoten CFTR-Gens nachzuweisen, das nicht zum Erscheinungsbild einer Mucoviszidose führt, aber mit einer Pankreas-Erkrankung bei einem erwachsenen Patienten oder einem Kind korreliert werden kann.
Die Erfindung beschreibt also ein Verfahren zum in vitro-Nachweis einer Pankreas-Erkrankung, die mit einer Veränderung des CFTR-Gens verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des menschlichen PAP in einer biologischen Probe bestimmt.
Die Erfindung betrifft spezieller ein Verfahren zur in vitro-Erkennung der Mtxcoviszidose, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bestimmung der Konzentration des menschlichen PAP in einer biologischen Probe umfaßt.
Der Wert der erhaltenen Konzentration kann dann mit einem Wert verglichen werden, den man unter den gleichen Testbedingungen erhält, in Abwesenheit jeglicher Pathologie oder in Abwesenheit der heterozygoten Mutation des CFTR-Gens.
Die Erfinder haben festgestellt, daß man in einer Pathologie wie der Mucoviszidose, die nicht notwendigerweise, insbesondere beim Neugeborenen, mit einer akuten Pankreatitis, sogar im Falle einer Pankreas-Insuffizienz, verbunden ist, eine signifikante, ja sogar beträchtliche Erhöhung, des Prozentsatzes des PAP im Vergleich zum normalen Prozentsatz bemerkt. Diese Erhöhung kann zwei- bis dreifach im Vergleich zum normalen Wert sein, bis zum 100fachen dieses Wertes. Der normale Wert wird durch Bezug auf den Mittelwert bestimmt, wie nachstehend definiert.
Die vorgeschlagene Konzentrationsbestimmung des PAP in einer biologischen Probe, als Indikation einer Veränderung des CFTR-Gens, verbunden mit einer Pankreas- Erkrankung oder einer Mucoviszidose, stellt den Vorteil dar, im Rahmen der Neugeborenen-Diagnostik verwendet werden zu können.
Trotz des bekannten und nicht-pathologischen Erscheinungsbildes des vorübergehenden Auftretens bestimmter Enzyme im Blut zum Zeitpunkt der Geburt, bleibt die Bestimmung des PAP in der Tat statistisch zuverlässig, um die Mucoviszidose oder eine heterozygote Mutation im CFTR-Gen, verbunden mit einer Pankreas- Erkrankung, nachzuweisen. Mit anderen Worten, wenn der Prozentsatz des in einer biologischen Probe und insbesondere im Blut gemessenen PAP während eines neonatalen Tests abnormal ist, kann man eine Anomalie des CFTR-Gens ableiten, die mit der Mucoviszidose oder in bestimmten Fällen mit einer Störung des Pankreas verbunden ist. Die Erfinder haben also festgestellt, daß die Anwesenheit eines abnormal erhöhten Prozentsatzes des PAP im Blut während eines neonatalen Tests nicht mit der Sekretion von Enzymen im Blut, die das Phänomen des "perinatalen Stresses" begleiten kann, verwechselt werden kann.
Unter dem Begriff "abnormal erhöhter Prozentsatz" des PAP versteht man einen Wert des PAP zum Beispiel zweimal höher als der Mittelwert, der ausgehend vom Prozentsatz des PAP berechnet wurde, der aus einer Gruppe von Referenzproben bestimmt wurde.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren zur in vitro- Erkennung der Mucoviszidose durch folgendes gekennzeichnet:
- die Bestimmung der Konzentration des PAP in der biologischen Probe,
- den Vergleich des erhaltenen Wertes mit dem Mittelwert, berechnet aus einer bestimmten Gruppe von Referenzproben, mit denen vorher unter den gleichen Bedingungen eine PAP-Bestimmung durchgeführt wurde.
Unter "Gruppe von Referenzproben" versteht man bevorzugt aus für die Mutation des CFTR-Gens nicht-homozygoten Patienten erhaltene Proben.
Der Mittelwert, von dem vorstehend gesprochen wird, ist der Wert der erhaltenen Messung für eine gegebene und so gewählte Probe, daß es eine gleiche Zahl von Beobachtungen (Messungen) unterhalb und oberhalb dieses Wertes in der bestimmten Gruppe von getesteten Proben gibt. Wenn die Zahl der durchgeführten Messungen gerade ist, ist der Mittelwert zwischen den zwei zentralen beobachteten Werten unbestimmt.
Ein vorteilhaftes Verfahren der Durchführung der Erfindung wird auch dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Serumkonzentration des PAP folgendes umfaßt:
- das Inkontaktbringen einer biologischen Probe, zum Beispiel des Blutes oder des Serums, mit Antikörpern, die das menschliche PAP erkennen,
- den Nachweis des Auftretens einer immunologischen Reaktion des Typs PAP-Antikörper,
- die Bestimmung des Komplexes PAP-Antikörper.
Die zur Durchführung dieser Bestimmung verwendeten Antikörper können polyclonale oder monoclonale Antikörper sein, sogar diese zwei Typen von Antikörpern, wenn der Test ein immunologischer Test vom Sandwich-Typ ist.
Bevorzugt ist der Antikörper, der den immunologischen Komplex mit dem PAP bildet, ein monoclonaler Antikörper. Vorteilhafterweise handelt es sich um einen für das menschliche PAP spezifischen monoclonalen Antikörper, der folglich keine immunologische Reaktion mit den in der normalen biologischen Probe und insbesondere im normalen Referenzblut vorhandenen Bestandteilen zeigt; dieser Antikörper zeigt insbesondere keine Reaktion mit den Lektinen des Bluts.
Man nennt "normales Blut" oder normale Probe" eine Probe, die einen sehr geringen Prozentsatz an PAP enthält.
Man wird im Rahmen der Ausführung des in vitro-Erkennungstests der Erfindung Interesse haben, einen Antikörper oder spezifische Antikörper des PAP auszuwählen, der ein schwaches Hintergrundssignal gibt (meßbar, indem man ein normales Serum oder eine normale Probe mit diesem Antikörper in Kontakt bringt).
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren für die Durchführung der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
- das Inkontaktbringen einer bestimmten Menge einer biologischen Probe, zum Beispiel einer Blut- oder Serumprobe, in welcher das PAP gesucht wird, mit einem monoclonalen Antikörper (d. h. einem "Einfangantikörper"), der spezifisch menschliches PAP unter Bedingungen erkennt, die die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen Einfangantikörpern und dem PAP erlauben, wenn es in der zu bestimmenden Probe vorhanden ist,
- das Inkontaktbringen des Reaktionsmediums, das im vorstehenden Schritt erhalten wurde, mit einem monoclonalen Antikörper (d. h. einem "Entwicklungsantikörper"), der ein anderes Epitop als das Epitop, das vom Einfangantikörper erkannt wird, erkennt, wobei der Entwicklungsantikörper markiert ist, unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Entwicklungsantikörper und dem Antigen, das vorher an den Einfangantikörper gebunden war, erlauben,
- das Waschen, um Entwicklungsantikörper, die nicht reagiert haben, zu entfernen,
- den Nachweis der Komplexe aus Einfangantikörper-Antigen PAP- Entwicklungsantikörper,
- die Bestimmung der PAP-Konzentration und gegebenenfalls ihren Vergleich mit einem Mittelwert, der für eine bestimmte Gruppe von Referenzproben bestimmt wurde, mit denen vorher die gleiche Bestimmung des PAP unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde.
Zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens kann man ein Einfangantikörper/Entwicklungsantikörper-Paar verwenden, in dem der Einfangantikörper ein polyclonales Serum wäre und der Entwicklungsantikörper ein monoclonaler Antikörper wäre. Man kann ebenso ein Einfangantikörper/Entwicklungsantikörper-Paar verwenden, in dem alle Antikörper monoclonal sind, wobei klar ist, daß der Einfangantikörper und der Entwicklungsantikörper verschiedene Epitope auf dem PAP erkennen.
Vollständig zufriedenstellende Ergebnisse können auch erhalten werden, wenn der Einfangantikörper ein polyclonales Serum und der Entwicklungsantikörper ebenfalls ein polyclonales Serum ist, des gleichen Typs und gegebenenfalls des gleichen Ursprungs seiner Herstellung, wobei letzterer immer markiert ist.
Um den ELISA-Test vom vorstehend für das PAP beschriebenen Sandwich-Typ durchzuführen, muß eine Auswahl monoclonaler Antikörper und/oder polyclonaler Seren gemacht werden, wobei der Einfangantikörper dazu bestimmt ist, Microtitrations- Lochplatten zu beschichten.
Der Fachmann wird in der Auswahl dieser Antikörper die Tatsache berücksichtigen, daß die Absorption eines Antikörpers auf einem festen Träger zu einem Verlust der Aktivität aufgrund von Konformationsänderungen des Moleküls führen kann. Auf diese Weise kann es nötig sein, zuerst zu überprüfen, daß der gewählte Antikörper oder das gewählte Serum in der Lage ist, das natürliche PAP und/oder das rekombinante PAP zu erkennen, nachdem er/es auf einem Träger fixiert wurde.
Der Fachmann wird ebenfalls abwägen, einen monoclonalen Entwicklungsantikörper auszuwählen, der ein unterschiedliches Epitop auf dem PAP erkennt im Vergleich zu dem Epitop, das vom Einfangantikörper erkannt wird, wenn man zum Beispiel einen Nachweistest des PAP mittels Kompetition zwischen den zwei gewählten Antikörpern durchführt.
Allgemein muß das Einfangantikörper/Entwicklungsantikörper-Paar oder das verwendete polyclonale Serum, sowohl für das Einfangen als auch die Entwicklung eine zufriedenstellende Empfindlichkeit zeigen, sowie eine interessante Reproduzierbarkeit der Resultate und eine gute Stabilität über die Zeit (etwa 6 Monate für eine Lagerung der Antikörper bei 4ºC) erlauben.
So wird man vorteilhafterweise einen monoclonalen Einfangantikörper verwenden, mit der Bezeichnung 6F3E4, der von dem Hybridom produziert wird, das bei der ECACC (European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wiltshirte SP4 OJG, Grande Bretagne) unter der Nummer 92122310 am 23. Dezember 1992 hinterlegt wurde. Ebenso ist ein besonders interessanter Entwicklungsantikörper der Antikörper 16F4B8, der von dem Hybridom produziert wird, das bei der ECACC unter der Nummer 92122309 am 23. Dezember 1992 hinterlegt wurde.
Der Antikörper oder das polyclonale Serum für die Entwicklung werden mit irgendeinem geeigneten Marker markiert sein, um den Nachweis des Komplexes aus Einfangantikörper - Antigen PAP - Entwicklungsantikörper, der während des Nachweistests gebildet wird, zu erlauben. Es ist darauf hinzuweisen, daß man radioaktive Marker oder auch enzymatische Marker verwenden kann. Als Beispiel kann man die Markierung mit Hilfe der Meerrettichperoxidase anbringen.
Das vorstehende Nachweisverfahren in Frage, das die Antikörper betrifft, kann auf die Weise modifiziert werden, daß der Einfangantikörper und/oder der Entwicklungsantikörper durch ihre variablen Fragmente oder einen Teil dieser variablen Fragmente ersetzt werden. Zum Beispiel kann man zur Durchführung der Reaktion die Fragmente F(ab')&sub2; oder Fab verwenden.
Die Erfindung beschreibt außerdem einen monoclonalen Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er das natürliche menschliche PAP, gereinigt und/oder rekombinant, erkennt, wenn es auf einem festen Träger adsorbiert ist.
Das PAP ist in der vorstehend zitierten PCT-Anmeldung beschrieben worden; seine Nucleotidsequenz und seine Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 nochmal aufgeführt.
Vorteilhafte Antikörper, die diesen Bedingungen entsprechen, sind die untenstehend beschriebenen Antikörper 6F3E4 oder 16F4B8.
Die Erfindung beschreibt ebenfalls einen Kit, der mindestens zwei monoclonale Antikörper umfaßt, die spezifisch gegen verschiedene Epitope des menschlichen PAP gerichtet sind, wobei mindestens der eine der zwei monoclonalen Antikörper (Einfangantikörper) das menschliche PAP erkennt, wenn es auf einem festen Träger fixiert ist.
Allgemein zielt die Erfindung auf die Verwendung monoclonaler Antikörper, die das menschliche PAP spezifisch erkennen, zur in vitro-Erkennung der Mucoviszidose oder einer Pankreas-Erkrankung, die mit einer heterozygoten Mutation des CFTR-Gens verbunden ist.
Die Erfindung beschreibt auch einen Kit zur in vitro-Erkennung der Mucoviszidose oder einer Pankreas-Erkrankung, die mit einer heterozygoten Mutation des CFTR-Gens verbunden ist, umfassend:
- die vorstehend beschriebenen monoclonalen und/oder polyclonalen Antikörper, wobei der eine dieser Antikörper (Entwicklungsantikörper) markiert ist,
- ein Reagens, das den Entwicklungsantikörper nachweisen kann,
- eine Negativkontrolle.
Ein bevorzugter Kit zur Durchführung der Erfindung umfaßt als Einfangantikörper den Antikörper 6F3E4 und als Entwicklungsantikörper den Antikörper 16F4B8.
Ein anderer, besonders interessanter Kit enthält zum Nachweis des PAP ein polyclonales Serum. Ein Teil dieses Serums ist zum Einfangen des PAP bestimmt, der andere Teil enthält markierte Antikörper für den Nachweis in einem Test des Sandwich- Typs der Anwesenheit eines Komplexes des Typs PAP-Antikörper.
Die geeigneten polyclonalen Seren können in Tieren hergestellt werden, zum Beispiel Kaninchen, denen man gereinigtes PAP verabreicht hat.
Ein interessanter Kit umfaßt folglich:
- ein polyclonales Serum, das das menschliche PAP erkennt,
- gegebenenfalls ein polyclonales Serum, das das menschliche PAP erkennt,
dessen Antikörper markiert sind,
- ein Reagens, das die Erkennung der markierten Antikörper erlaubt,
- eine Negativkontrolle.
Die Erfindung beschreibt auch das Hybridom, das den Antikörper 6F3E4 produziert, das die Nummer 92122310 bei der ECACC besitzt, sowie das Hybridom, das den Antikörper 16F4B8 produziert, das die Nummer 92122309 bei der ECACC besitzt.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung erscheinen in den Beispielen und in den Figuren, die folgen.

Fig. 1.

Ergebnis einer Bestimmung des PAP im Serum mittels eines Tests des Typs kompetitiver ELISA unter Verwendung polyclonaler Antikörper, die im Kaninchen erhalten wurden und die gereinigtes menschliches PAP erkennen. Diese Bestimmung ist bei an Mucoviszidose erkrankten Patienten durchgeführt worden.

Fig. 2.

Bestimmung des PAP beim Neugeborenen.

Fig. 3.

Nucleotid- und Aminosäuresequenz des menschlichen PAP.

A/EXPERIMENTELLE BESTIMMUNG

1. Bestimmung des PAP bei an Mucoviszidose erkrankten Patienten:

Protokoll: Blutproben sind bei 66 Patienten im Alter von 15 Tagen bis 40 Jahren analysiert worden, bei denen die Diagnostik der Mucoviszidose mittels des Schweißtests (Shwachman, H. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1962 93: 600) und/oder der genetischen Analyse (Collins, F. S. Cystic fibrosis: Molecular biology and therapeutic implications. Science 1992 256: 774) bestätigt worden ist. Eine Reihe von gesunden Individuen von entsprechendem Alter ist parallel dazu untersucht worden. Das PAP ist in diesen Proben mittels der folgenden Bestimmung bestimmt worden:
Bestimmung der PAP im Serum: Diese Bestimmung, des Typs kompetitiver ELISA, verwendet polyclonale Antikörper, die im Kaninchen durch wiederholte Injektionen von gereinigtem menschlichem PAP erhalten wurden (Keim, V. et al., Gastroenterology 1992 103: 248). Proteine aus dem menschlichen Pankreassaft, die das PAP enthalten, sind auf Microtitrationsplatten adsorbiert worden (100 ng Protein pro Loch). Die Serumprobe (50 ul) wird in Gegenwart von 0,5 ul Immunserum in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben und in einem Endvolumen von 100 ul 100 mM Tris pH 7,4, 1% Tween®20, 1,5% Rinderserumalbumin für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wird anschließend in ein Microtitrationsloch gegeben, das wie vorstehend beschrieben behandelt wurde, und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Loch wird dann dreimal mit 300 ul PBS gewaschen, das 0,5% Tween 20 enthält. Die Entwicklung erfolgt mit Hilfe eines Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpers, der mit Peroxidase markiert ist (100 ul zu 0,2 ug/ml). Die Referenzkurve ist mit Hilfe gereinigter PAP erstellt worden.
Ergebnisse: Die in Fig. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen,
- daß bei den an Mucoviszidose erkrankten Patienten die Serumkonzentration von PAP immer höher als die der Kontrollen ist. Die Werte der Kontrollen verteilen sich zwischen 1 und 10 ng/ml, die der Patienten zwischen 11 und 1900 ng/ml.
- daß die höchsten Werte bei den jüngsten Patienten beobachtet werden.

2. Bestimmung des PAP bei Neugeborenen: Die anatomisch-pathologische

Analyse des an Mucoviszidose erkrankten Fötus hat in allen Fällen eine Erkrankung des Pankreas gezeigt (Boué, A. et al., Hum. Genet. 1988 74: 288). Die Erfinder haben davon abgeleitet, daß die Konzentration des PAP schon im Blut der an Mucoviszidose erkrankten Neugeborenen erhöht sein konnte.
Protokoll: Das konnte durch folgende Versuchreihe gezeigt werden:
Die Bestimmung des PAP ist ausgehend von Papierscheiben, die von Bestimmungszentren stammen und getrocknete Blutproben tragen, durchführt worden. Die Papierscheiben entsprachen vier Gruppen von Individuen:
Gruppe 1: Kontrollen (normale Trypsinkonzentration bei der Geburt) (n = 50).
Gruppen 2, 3 und 4: Kinder, die eine erhöhte Trypsinkonzentration bei der Geburt zeigen.
Gruppe 2: "Falschpositive" Kinder (keine Anomalie des CFTR-Gens, negativer Schweißtest) (n = 60).
Gruppe 3: Für das mutierte CFTR-Gen heterozygote Kinder (Nicht-Erkrankte, negativer Schweißtest) (n = 33).
Gruppe 4: An Mucoviszidose erkrankte Kinder (für das mutierte CFTR-Gen Homozygote, positiver Schweißtest) (n = 11).
Bestimmung: Die Bestimmung ist auf folgende Weise durchgeführt worden:
Die Hinterlegungen von Blut auf den verwendeten Papierscheiben stammen mindestens von vor zwei Monaten. Die Papierscheiben entsprachen den durch die Association Francaise de Dépistage definierten Normen.
Eine Scheibe von 6 mm Durchmesser wurde von jeder Papierscheibe ausgeschnitten, auf Höhe des Blutflecks. Die Menge an entsprechendem Blut ist etwa 10 ul.
Jede Scheibe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml Gesamtvolumen überführt, das 150 ul einer Lösung aus 100 mM Tris, pH 7,4, 1% Tween 20, 1,5% Rinderserumalbumin enthält, und auf einem Multivortexer für 8 h bei Raumtemperatur geschüttelt (Amersham France S. A.). Die Gesamtheit der Lösung, die das gelöste Blut enthält, wurde zu 50 ul einer Lösung von Tris pH 7,4, 1% Tween 20, 1,5% Rinderserumalbumin, die 0,5 ul Anti- PAP-Antiserum (Gesamtvolumen 200 ul) enthält, zugegeben und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die weitere Bestimmung wird genauso wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Ergebnisse: Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden:
1) Die Kinder, die Trypsin-negativ sind (Kontrollen, Gruppe 1) besitzen eine Serumkonzentration des PAP zwischen 0,01 und 0,1 ng/10 ul Blut (Mittelwert 0,065).
2) Die Kinder der Gruppe 2 (Trypsin-positiv, aber nicht erkrankt) zeigen die gleichen Werte wie die Kontrollen.
3) Ein Drittel (11/33) der Kinder der Gruppe 3 (Heterozygote) zeigten eine Serumkonzentration des PAP zwischen 0,18 und 0,75 ng/10 ul Blut.
4) Alle an Mucoviszidose erkrankten Kinder (11/11) zeigten eine Serumkonzentration des PAP zwischen 0,22 und 0,90 ng/10 ul Blut.

Schlußfolgerung:

1) Kein Kontrollkind zeigte eine Blutkonzentration des PAP höher als 0,1 ng/10 ul Blut. Diese Erfahrung zeigt, daß jeder Wert höher als zweimal der Mittelwert (höher als 0,11 ng/10 ul Blut) abnormal ist.
2) Überdies zeigten alle an Mucoviszidose erkrankten Kinder Werte des PAP im Blut höher als diese Schwelle.
3) Im Gegensatz zum auf der Trypsinbestimmung basierenden System scheint die Bestimmung des PAP nur die Kinder auszuwählen, die Mucoviszidose haben, und die unter den Heterozygoten für das veränderte Gen, bei denen die Pankreas-Erkrankung am deutlichsten ist.
Der vorgeschlagene Test besitzt also die für seine Anwendung zur neonatalen Erkennung der Mucoviszidose erforderlichen Qualitäten.

B/INDUSTRIELLE BESTIMMUNG

1. Mit Hilfe monoclonaler Antikörper

Die Entwicklung eines ELISA-Tests des "Sandwich"-Typs für das PAP erforderte, zwei monoclonale Antikörper auszuwählen, die zwei verschiedene Epitope auf dem Antigen erkennen:
- einer zur Beschichtung der Löcher von Microtitrationsplatten (Einfangantikörper),
- der andere, mit einem Enzym verbunden, zum Nachweis des auf die Löcher adsorbierten Antigens (Entwicklungsantikörper).
Diese Auswahl wurde mit monoclonalen Antikörpern durchgeführt, die im Aszites produziert und mittels Affinitätschromatographie auf einer Protein-A Sepharose-Säule für IgG oder auf einer Immunoadsorbanz-Säule für IgM (monoclonale Antikörper der Ratte Anti-IgM der Maus, gekoppelt an eine Sepahrosematrix) gereinigt wurden.
Die Adsorption eines Immunglobulins auf einem festen Träger führt zu Konformationsänderungen, die einen Aktivitätsverlust des Moleküls nach sich ziehen können. Alle monoclonalen Anti-PAP Antikörper, die im Labor erhalten wurden, wurden also zuerst, nach Adsorption auf Microtitrationsplatten (NUNC Maxisorp), auf ihre Fähigkeit getestet, das natürliche und rekombinante PAP zu erkennen. Nach Inkubation wurden die Antigen-Antikörper-Komplexe mit Hilfe von Fab-Fragmenten der Anti-PAP- Immunglobuline des Kaninchens, verbunden mit der Peroxidase, nachgewiesen, indem man als Enzymsubstrat o-Phenylendiamin verwendet.
Alle Immunglobuline, die diese Fähigkeit behalten haben, wurden als mögliche Einfangantikörper zurückgehalten und mit Biotin verbunden.
Diese biotinylierten Antikörper wurden in Kompetitionstests verwendet, um einen monoclonalen Entwicklungsantikörper auszuwählen.
Diese Tests wurden mit PAP (natürlich oder rekombinant) durchgeführt, das auf Löchern von Microtitrationsplatten, beschichtet mit Anti-PAP-IgG von Kaninchen, adsorbiert war. Die Fixierung biotinylierter monoclonaler Antikörper auf dem Antigen (nachgewiesen mit Hilfe eines Avidin-POD-Komplexes) wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Überschusses verschiedener zu testender monoclonaler Antikörper gemessen.
Alle monoclonalen Antikörper, die nicht in Kompetition mit mindestens einem der biotinylierten Antikörper (und also ein unterschiedliches Epitop erkannten) traten, wurden als mögliche Entwicklungsantikörper ausgewählt.
Sie wurden dann in Form eines Fab'-Fragments mit POD verbunden, bevor sie für die Entwicklung der endgültigen Form des ELISA-Tests zur Bestimmung des PAP verwendet wurden.
Diese Entwicklung erforderte die Suche des Einfangantikörper/Entwicklungsantikörper-Paares, das den Erhalt der besten Empfindlichkeit des Tests, die beste Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die beste Stabilität der Reagenzien über die Zeit ermöglichte.
Zwei monoclonale Antikörper erfüllten alle diese Auswahlkriterien:
- der Antikörper 6F3E4, der zum Einfang verwendet wird,
- der Antikörper 16F4B8, der zur Entwicklung verwendet wird.

2. Mit Hilfe polyclonaler Seren

Eine PAP-ELISA-Bestimmung des Sandwich-Typs, die den Erkennungsbestimmungen angepaßt wurde, ist entwickelt worden. Ihre Charakteristika sind die folgenden:

Herstellung der Antikörper:

Das Antigen bestand in sehr gereinigter menschlicher PAP, nach folgender Technik: ausgehend vom Saft transplantierten, lyophilisierten Pankreas, ermöglichte eine erste Auftrennung mittels Ionenaustauschchromatographie (HPLC, Säule MonoS) die Abtrennung eines Peaks, der das PAP und eine Verunreinigung mit hohem Molekulargewicht enthält. Dieser Peak wurde anschließend mittels Gelfiltration aufgetrennt (HPLC, Säule Sephacryl® 200 HR). Das PAP wurde also in Form einer homogenen Fraktion erhalten. Die mittels Elektrophorese im SDS-Gel und Silberfärbung durchgeführte Kontrolle ermöglichte eine Reinheit höher als 98% zu gewährleisten.
Die Immunisierung wurde nach der gewöhnlichen Labortechnik, beschrieben von Keim V. et al (Gastroenterology 1992 103: 248) durchgeführt.
Die Qualität des Immunserums wurde mittels Einsatz aufeinanderfolgender Verdünnungen in Western Blots getestet.

Aufstellung des ELISAs:

Es handelt sich um einen polyclonal/polyclonal-Sandwich-ELISA.
Die Immunglobuline des Immunserums wurden mittels Affinitätschromatographie auf einer Protein A-Sepharose-Säule gereinigt.
Die zur Entwicklung bestimmten Immunglobuline sind nach der gewöhnlichen, dem Fachmann bekannten Technik mit Biotin markiert worden. Das Entwicklungssystem wendete Avidin-POD an.
Die Empfindlichkeit des Tests beträgt 50 pg/ml.
Erhaltene Ergebnisse:
Vierzig Proben von gesundenen Neugeborenen auf Papierscheiben wurden getestet. Die Konzentrationen der PAP lagen dort vollständig unter 60 pg/ml. Ein an Mucoviszidose erkranktes Neugeborenes hatte einen Wert von 800 pg/ml. Sechs Kinder (Alter 3 Monate - 10 Jahre), die von der Krankheit betroffen waren, deren Blut auch auf Papierscheiben entnommen worden war, zeigten Werte, die sich zwischen 0,5 ng/ml und 1,8 ng/ml verteilten.
Diese Ergebnisse bestätigen die Unterschiede, die schon mit der Bestimmung mittels der monoclonalen Antikörper beobachtet worden waren.

Claims

1. Verfahren zur in vitro-Erkennung der Mucoviszidose, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bestimmung der Konzentration des menschlichen PAP (pancreatitisassociated protein) in einer biologischen Probe umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennung der Mucoviszidose als ein neonataler Test durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe eine Blut- oder Serumprobe ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch:

- die Bestimmung der Konzentration des PAP in der biologischen Probe,

- den Vergleich des erhaltenen Wertes mit dem Mittelwert, berechnet aus einer bestimmten Gruppe von Referenzproben, mit denen vorher unter den gleichen Bedingungen eine PAP-Bestimmung durchgeführt wurde.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Bestimmung der Serumkonzentration des PAP und durch:

- das Inkontaktbringen der biologischen Probe, zum Beispiel des Blutes oder des Serums, mit Antikörpern, die das menschliche PAP erkennen, den Nachweis des Auftretens einer immunologischen Reaktion des Types PAP-Antikörper,

- die Bestimmung des Komplexes PAP-Antikörper.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoclonale Antikörper sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die monoclonalen Antikörper für das menschliche PAP spezifisch sind und folglich ohne immunologische Reaktion mit den Bestandteilen, die in normalem Blut und in einer normalen biologischen Referenzprobe vorhanden sind, und insbesondere, daß sie keine Reaktion mit den Lectinen des Bluts zeigen.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper, die menschliches PAP erkennen, in einem polyclonalen Serum enthalten sind, und daß der Nachweis der PAP-Antikörper-Komplexe mit Hilfe eines polyclonalen Serums erfolgt, das markierte anti-PAP-Antikörper enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die anti-PAP-Antikörper biotinyliert sind.

10. Verfahren zur in vitro-Erkennung der Mucoviszidose nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

- das Inkontaktbringen einer bestimmten Menge einer biologischen Probe, zum Beispiel einer Blut- oder Serumprobe, in welcher das PAP gesucht wird, mit einem monoclonalen Antikörper, der auf einem festen Träger fixiert ist (d. h. einem "Einfangantikörper"), der spezifisch menschliches PAP unter Bedingungen erkennt, die die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen Einfangantikörpern und dem PAP erlauben, wenn es in der zu bestimmenden Probe vorhanden ist,

- das Inkontaktbringen des Reaktionsmediums, das im vorstehenden Schritt erhalten wurde, mit einem monclonalen Antikörper (d. h. einem "Entwicklungsantikörper"), der ein anderes Epitop als das Epitop, das vom Einfangantikörper erkannt wird, erkennt, wobei der Entwicklungsantikörper markiert ist, unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Entwicklungsantikörper und dem Antigen, das vorher an den Einfangantikörper gebunden war, erlauben,

- das Waschen, um Entwicklungsantikörper, die nicht reagiert haben, zu entfernen,

- den Nachweis der Komplexe aus Einfangantikörper-Antigen PAP- Entwicklungsantikörper,

- die Bestimmung der PAP-Konzentration.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des PAP verglichen wird mit einem Mittelwert, der für eine bestimmte Gruppe von Referenzproben bestimmt wurde, mit denen vorher die gleiche Bestimmung des PAP unter gleichen Bedingungen durchgeführt wurde.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Entwicklungsantikörper an Meerrettichperoxidase gebunden ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Entwicklungsantikörper durch seine Fragmente F(ab')&sub2; oder Fab' ersetzt ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Einfangantikörper der Antikörper 6F3E4 ist, der von dem Hybridom produziert wird, das unter der Nummer 92122310 am 23. Dezember 1992 bei der ECACC hinterlegt wurde.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Entwicklungsantikörper der Antikörper 16F4B8 ist, der von dem Hybridom produziert wird, das unter der Nummer 92122309 am 23. Dezember 1992 bei der ECACC hinterlegt wurde.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die monclonalen Entwicklungs- und Einfangantikörper ersetzt sind durch polyclonale Seren, die das menschliche PAP erkennen.

17. Verwendung der monoclonalen Antikörper, die spezifisch menschliches PAP erkennen, oder der polyclonalen Seren, die menschliches PAP erkennen, zur in vitro-Erkennung der Mucoviszidose.