JP2004533612A - インターロイキン可溶性三分子複合体を用いたスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、インビボにおいて、細胞表面で生じる、インターロイキンファミリー（ＩＬ）の１つのメンバー、対応する膜結合型インターロイキン受容体（ＩＬ−Ｒ）、および、膜結合型インターロイキンアクセサリータンパク質（ＩＬ−ＲＡｃＰ）との相互作用が、溶液中で形成されるという予想外の発見に基づくスクリーニング方法、分析、および試薬に関する。本発明は、ハイスループットスクリーニングに適した分析を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボにおいて細胞表面で生じるインターロイキン（ＩＬ）、膜結合型インターロイキン受容体（ＩＬ−Ｒ）および膜結合型インターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−ＲＡｃＰ）の相互作用が溶液中で形成できる、という予想外の発見に基づくスクリーニング方法、分析および試薬に関する。本発明は、ハイスループットスクリーニングに適した分析を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、免疫および炎症反応の介在において中心的な役割を有する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９６）。
【０００３】
ＩＬ−１とは、類似した生物活性を有するＩＬ−１αもしくはＩＬ−１β受容体アゴニスト、またはＩＬ−１受容体アンタゴニストＩＬ−１ｒａであり得る。３つのサイトカインは、応答細胞表面の特異的受容体に結合することによって、熱、睡眠、食欲低下または低血圧のような多数の生物学的作用に関与する。
【０００４】
異なる薬理学的特性を有する２つのＩＬ−１受容体であるＩ型（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．１９８８）およびII型（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９９１）はクローン化されている。ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａは全て、類似した親和性で８０ｋＤａのＩ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ）に結合する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９６）。その一方で、ＩＬ−１βは、ＩＬ−１受容体Ｉ型よりかなり高い親和性および選択性で６８ｋＤａのII型受容体（ＩＬ−１ＲＩＩ）に結合する（Ｃｏｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．１９９３）。その上、ＩＬ−１ＲＩは、ＩＬ−１シグナル伝達に必要である（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．１９９３）。ＩＬ−１ＲＩＩは、デコイ受容体として作用すると考えられている（Ｃｏｌｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．１９９３）。
【０００５】
受容体複合体の他の成分、インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）もクローン化されている（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）。ＩＬ−１ＲＡｃＰは、ＩＬ−１ＲＩと、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βのいずれかと三元複合体を形成するが、ＩＬ−１Ｒａとは形成しない。この三分子複合体形成により、ＩＬ−１βのＩＬ−１ＲＩに対する結合親和性が増加する。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩはＩＬ−１と結合できるが、ＩＬ−１ＲＡｃＰはＩＬ−１と結合しない（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）。しかしながら、ＩＬ−１ＲＡｃＰでのトランスフェクションは、ＩＬ−１ＲＡｃＰを発現しない哺乳動物細胞においてＩＬ−１反応性を回復させる（Ｋｏｒｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．１９９７）。それゆえに、ＩＬ−１ＲＡｃＰは、ＩＬ−１のＩＬ−１ＲＩへの結合を必要としないにもかかわらず、ＩＬ−１シグナル伝達に必須である。
【０００６】
内因性細胞表面受容体およびアクセサリータンパク質は膜結合型であり、疎水性の膜貫通ドメインを含む。このようなタンパク質は不溶性であり、インビトロでのハイスループットスクリーニングで用いるには不適切である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
本発明は、溶液中で生じるインターロイキン（ＩＬ）、膜結合型インターロイキン受容体（ＩＬ−Ｒ）および膜結合型インターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−ＲＡｃＰ）の相互作用に基づくスクリーニング方法、分析および試薬を提供する。
【０００８】
一つの全体的な観点において、本発明は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を調節する試験化合物の能力を決定するための分析方法を提供し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；および、
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【０００９】
最も好ましい実施形態において、本発明はまた、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法を提供し、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、定義された量の可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）ＩＬポリペプチドを試験（ｂ）で得られた混合物に加えること；および、
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【００１０】
本発明の他の全体的な観点は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法を提供し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬアンタゴニスト、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｃ）工程（ａ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であり、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）ＩＬポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【００１２】
本発明はまた、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、ＩＬ−Ｒアンタゴニスト、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｃ）工程（ａ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であり、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、ＩＬポリペプチド、ＩＬ−Ｒアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【００１４】
本発明のさらなる観点は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の安定性を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）定義された量のＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを含む三分子複合体を提供すること；
（ｂ）試験化合物と、前記三分子複合体とを接触させること；および、
（ｃ）工程（ｂ）後に存在する前記三分子複合体の量と、工程（ａ）で最初に存在する前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【００１５】
本発明の好ましい分析方法において、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、哺乳動物由来である。
【００１６】
本発明の最も好ましい分析方法において、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、ヒト、マウスまたはラット由来である。
【００１７】
本発明の全体的な観点において、ＩＬポリペプチドが、その成熟形態であり、１２〜１３個のβストランドから成るバレル型３次元構造を有し、細胞表面で三元（すなわち三分子）複合体が介在する細胞の活性を有する分析方法が提供される。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、上記分析方法は、ＩＬポリペプチドが、配列番号１、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する分析方法である。
【００１９】
本発明の他の全体的な観点は、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインからなり、前記ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含み；前記ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含み；前記ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む分析方法に関する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、上記分析方法は、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、配列番号１３、または配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６、または配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する分析方法である。
【００２１】
本発明のさらなる全体的な観点は、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインを含み、前記ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含み；前記ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含み；前記ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む分析方法に関する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、上記分析方法は、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、配列番号２１、または配列番号２２、または配列番号２３、または配列番号２４、または配列番号２５、または配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する分析方法である。
【００２３】
本発明はまた、以下の成分：
（ａ）ＩＬポリペプチド、
（ｂ）前記ＩＬポリペプチドに結合する可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、および、
（ｃ）ＩＬ−Ｒポリペプチド／ＩＬポリペプチド二元複合体に結合する可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド、
を含む、または、からなる可溶性三分子複合体に関する。
【００２４】
本発明の好ましい可溶性複合体は、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、哺乳動物由来である可溶性複合体である。
【００２５】
本発明の最も好ましい可溶性複合体は、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰが、ヒト、マウスまたはラット由来である可溶性複合体である。
【００２６】
最も好ましい可溶性複合体は、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲまたはｓＩＬ−ＲＡｃＰの少なくとも１つが、ヒト由来である可溶性複合体である。
【００２７】
本発明の特に好ましい可溶性複合体において、ＩＬポリペプチドは、配列番号１、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する。
【００２８】
本発明の他の特に好ましい可溶性複合体において、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、配列番号１３、または配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６、または配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する。
【００２９】
本発明のさらに特に好ましい可溶性複合体において、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、配列番号２１、または配列番号２２、または配列番号２３、または配列番号２４、または配列番号２５、または配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する。
【００３０】
添付図面において、
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、それぞれＩＬ−１β（Ａ）、ｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｃ）精製タンパク質と、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの相互作用を示す。
【００３１】
図２Ａおよび２Ｂは、予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体と、それぞれｓＩＬ−ＲＩ、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルにに加えられた過量のＩＬ−１β（Ａ）またはｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）との相互作用を示す。
【００３２】
図３Ａは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルへの、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な注入を示す。図３Ｂは、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６ＨｉｓのＮｉ−ＮＴＡチップ上での捕捉、および、予め混合したＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体またはＩＬ−１β単独の注入を示す。
【００３３】
図４は、解離プロセスの際にｓＩＬ−ＲＡｃＰを加えた場合の、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａと、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはｓＩＬ−１ＲＩを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの相互作用の比較を示す。
【００３４】
図５Ａおよび５Ｂは、それぞれｓＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはｓＩＬ−１ＲＩを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセル上への、ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチド（配列番号３５）の結合を示す。図５Ａにおいて、ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチドは、単独で加えられる。図５Ｂにおいて、予め混合したＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチド／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体は、過量のｓＩＬ−１ＲＩと共に加えられる。
【００３５】
図６Ａは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ型、ｓＩＬ−１ＲＩＩ型またはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルへの、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な添加を示す。図６Ｂは、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅ別々のフローセルへの、ｓＩＬ−１ＲＩＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な添加を示す。
【００３６】
図１〜６に関して、フローセル１にはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を結合させ、表示されたセンサーグラムでこのコントロールフローセルを他のフローセルから差し引く。
【００３７】
図７は、それぞれＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体（図７Ａ）およびＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ三元複合体（図７Ｂ）の結合反応速度論を示す。
【００３８】
図８は、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式のグラフ表示である。
【００３９】
図９は、本発明の直接の二元複合体ＨＴＲＦ分析様式のグラフ表示である。
【００４０】
図１０は、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式における三元複合体形成の反応速度論を示す。
【００４１】
図１１は、様々なＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５濃度の、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式を用いて得られたシグナルへの影響を示す。
【００４２】
図１２は、様々な濃度の非標識ｓＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式を用いて得られたシグナルへの影響を示す。
【００４３】
図１３は、様々な濃度のＩＬ−１ＲａおよびＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチド（配列番号３５の）の、本発明の直接の三元ＨＴＲＦ分析様式における三元複合体形成の阻害への影響を示す。
【００４４】
図１４は、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３１）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１０５５４）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｄ００４０３）のＩＬ−１αのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【００４５】
図１５は、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００８３６１）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｍ９８８２０）のＩＬ−１βのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【００４６】
図１６は、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ０７７６１１）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００８３６０）のＩＬ−１８のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【００４７】
図１７は、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６２）およびラット（全長タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｍ９５５７８）のＩＬ−１ＲＩ型、天然に存在する可溶性タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３１２３））、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４６３３）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１０５５５）のＩＬ−１ＲＩＩ型、ならびに、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５５）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６５）のＩＬ−１８Ｒのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。下線で示した配列は、タンパク質成熟の後に開裂するヒトＩＬ−１ＲＩタンパク質のシグナル配列を示す。
【００４８】
図１８は、ヒト（全長タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３）、天然に存在する可溶性タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６７３４３）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６４）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１２９６８）のＩＬ−１ＲＡｃＰ、ならびに、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５３）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１０５５３）のＩＬ−１８ＲＡｃＰのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。下線で示した配列は、タンパク質成熟の後に開裂するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質のシグナル配列を示す。
【００４９】
図１９は、ヒトＩＬ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）およびＩＬ−１８受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５５）の配列アラインメントを示す。
【００５０】
図２０は、ヒトＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３）およびＩＬ−１８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５３）受容体アクセサリータンパク質の配列アラインメントを示す。
【００５１】
図１９および２０において、太字および下線で示した配列は、タンパク質のシグナル配列を示し、膜貫通ドメインは斜線のボックスで囲ってある。
【００５２】
図２１および２２は、ヒトＩＬ−１ＲＩ（図２１Ａ）およびＩＬ−１８Ｒ（図２１Ｂ）、ＩＬ−１ＲＡｃＰ（図２２Ａ）およびＩＬ−１８ＲＡｃＰ（図２２Ｂ）の完全長配列の疎水性プロットを示す。
【００５３】
図２３は、ヒト細胞外インターロイキン１受容体Ｉ型およびインターロイキン１受容体アクセサリータンパク質の構造編成のグラフ表示である。
【００５４】
図２４は、ヒトインターロイキン１Ｉ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）およびヒトインターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ａｆ０２９２１３）の配列アラインメントを示す。各構造ドメインの最初と最後のシステインは、斜線と囲みで示される。下線で示した部分の配列、（------）、（−−−）および（〜〜〜）は、それぞれドメイン１、２および３の位置を示す。
【００５５】
図２５は、本発明の方法のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ分析様式のグラフ表示である。図２５Ａは、ニッケル−ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ様式を示し、図２５Ｂは、ストレプトアビジン−ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ様式を示す。
【００５６】
発明の詳述
本明細書で用いられるように、「可溶性」という用語は、ポリペプチドに適用された場合、膜結合型ではないポリペプチドのいずれかを意味する。
【００５７】
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＡｃＰの溶液中で相互作用する能力が、本願で初めて示される。成熟膜結合型タンパク質ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１ＲＡｃＰの結合活性が、細胞質ドメインと膜貫通ドメインとを欠き、細胞外ドメインのみからなる短いタンパク質（truncated protein）により複製できることは、驚くべきことであった。これらタンパク質の可溶性断片の相互作用により、ハイスループットスクリーニングに適切な分析の開発が可能になり、それによってタンパク質結合特性の直接的な測定が可能である。
【００５８】
前炎症性（pro-inflammatory）サイトカインＩＬ−１αおよびＩＬ−βは、ＩＬ−１受容体およびＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質と細胞表面で相互作用し、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＮＦκＢシグナル伝達カスケードを介する遺伝子の活性化によりさらなる前炎症性（pro-inflammatory）反応に導く（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９６）。現在のタンパク質に基づく療法は、ＩＬ−１受容体、および／または、ＩＬ活性の機能的なアンタゴニストとして作用するＩＬ−１受容体アンタゴニストの可溶性形態を静脈内投与することを含む（Ｒｏｓｅｎｗａｓｓｅｒ，１９９８）。このような療法の制限は、十分な生物活性に必要な大量のこれら組換えタンパク質を生産する費用と、静脈内投与の必要性とにある。
【００５９】
本明細書で説明する分析方法を用いた、ＩＬ三分子複合体の低分子物質阻害剤およびＩＬ−１生物活性の同定は、経口投与が可能であり、このような化合物の生産費用を、組換えタンパク質の生産費用に比べて低くすることができるため、上記経路に顕著な利益を提供し得る。
【００６０】
インターフェロン−γ誘導因子またはＩＬ−１８は、ヘルパーＩ型Ｔ細胞（Ｔｈ１）誘導サイトカインファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１βと多くの構造的および機能的な類似性がある。またこれらは、細胞表面で、ＩＬ−１８−受容体（またはＩＬ１Ｒｒｐ；ＩＬ−１８Ｒαとしても知られるＩＬ−１受容体関連タンパク質）と、ＩＬ−１８アクセサリータンパク質様受容体（ＡｃＰＬ）またはＩＬ−１８Ｒβ（またはＩＬ−１８ＲＡｃＰとして知られる）と共に三元複合体を形成する。ＩＬ−１と同様に、ＩＬ−１８シグナル伝達は、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＮＦκＢ経路を介して発生し、前炎症性（pro-inflammatory）刺激に導く（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９９ａ）。
【００６１】
クローン病は、消化管の慢性炎症が特徴である。クローン病におけるＩＬ−１８の過剰生産によるＩＦＮ−γの上流制御は、当該病気の病因に関与するようである（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ.，１９９９）。従って、適切なアンタゴニストによるＩＬ−１８活性阻害は、この病気のための可能な治療を代表するものである。ＩＬ−１８活性アンタゴニストのその他の可能な使用としては、喘息、自己免疫脱髄疾患、リウマチ様関節炎（Ｇｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ.，１９９９）および乾癬（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９９ｂ）の治療が挙げられる。
【００６２】
現在、ＩＬ−１８活性を減少させることができる療法は存在しない。従って、ＩＬ−１８ＲαとＩＬ−１８Ｒβとの相互作用を介するＩＬ−１８活性の低分子物質阻害剤、アンタゴニストが必要である。
【００６３】
逆に、ＩＬ−１８活性の強化はまた、臨床上の利益を有し得る。例えば、ＩＬ−１８は、Ｃ５７Ｂ１６／Ｊマウスの皮下に埋め込むと、初期のＴ２４１線維肉腫において抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有すると思われ、ＩＬ−１８アゴニストは経口的に投与することも可能である（ただし限定されない）。加えて、ＩＬ−１８活性の生理学的な「アゴニスト」はまた、菌類および細菌の感染から保護するための有用な療法であり得る（Ａｋｉｒａ，２０００）。
【００６４】
ＩＬ活性の阻害剤分子は、本発明のスクリーニング分析により得ることができ、上述したような治療目的、例えばクローン病、変形性関節症、炎症性の痛み、およびリウマチ様関節炎のような炎症に関連する病気の治療のためにデザインされ、用いられ得る。
【００６５】
また、ＩＬ活性の活性化物質または「アゴニスト」を同定することができ、適切な薬剤を得て、上述したような治療目的、例えば免疫不全の治療においてデザインし、用いることができる。
【００６６】
ＩＬ三分子複合体
本発明の１つの全体的な観点は、以下の成分：
（ａ）ＩＬポリペプチド、
（ｂ）前記ＩＬポリペプチドに結合する可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、および、
（ｃ）ＩＬ−Ｒポリペプチド／ＩＬポリペプチド二元複合体に結合する可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド、
からなる可溶性三分子複合体である。
【００６７】
本願において、「ＩＬ」という用語はＩＬポリペプチドを意味し、「ｓＩＬ−Ｒ」という用語は可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドを意味し、「ｓＩＬ−ＲＡｃＰ」という用語は可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを意味する。
【００６８】
ＩＬ三元複合体の３つのメンバーは、哺乳動物種間で高度に保存されている。その結果、本発明の分析において、三元複合体の成分、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、同じ種、例えばヒト、マウス、ラット由来でもよいし、または、異なる種由来でもよい。例えば、ヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰは、ラットＩＬ−１／マウスｓＩＬ−１Ｒの二分子複合体に結合して、三分子複合体を形成することができる。
【００６９】
本発明の好ましい分析において、三元複合体の成分、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、同じ哺乳動物種由来である。本発明の最も好ましい分析において、三元複合体の成分、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、ヒト、マウスまたはラット配列由来である。本発明の最も好ましい分析において、三元複合体の成分、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、ヒト配列由来である。
【００７０】
ＩＬポリペプチド
本発明において、ＩＬポリペプチドは、成熟形態において１２〜１４個のβストランドから成るバレル型３次元構造を有し、細胞活性が細胞表面で三元（すなわち三分子）複合体によって仲介されるポリペプチドと理解される。ＩＬポリペプチドとしては、ＩＬ−１およびＩＬ−１８ファミリーのメンバー、例えばヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３１）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１０５５４）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｄ００４０３）、未熟ＩＬ−１α、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００８３６１）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｍ９８８２０）未熟ＩＬ−１βおよびヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ０７７６１１）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００８３６０）、未熟ＩＬ−１８、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２００４９２）およびマウス未熟ＩＬ−１Ｈ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２００４９３）、ヒト未熟ＩＬ−１Ｈ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２００４９４）、マウス未熟ＩＬ−１Ｈ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２００４９５）、ヒト未熟ＩＬ−１Ｈ４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２００４９６）、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２３０３７７）およびマウス未熟ＩＬ−１５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２３０３７８）、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２４２７３８）およびマウス未熟ＩＬ−１Ｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２５０４２９）、ヒト未熟ＦＩＬ１デルタ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２０１８３０）、ヒト未熟ＦＩＬ１イータ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿００２３７５）、ヒト未熟ＦＩＬ１ゼータ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０１０７５９）、ヒト未熟ＦＩＬ１イプシロン（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０１０７５７）、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２０６６９６）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２０６６９７）未熟ＩＬ−１イプシロンが挙げられる。
【００７１】
ヒト、ラットおよびマウス由来のＩＬ−１αおよびＩＬ−１β、ならびに、ヒトおよびマウス由来のＩＬ−１８のアミノ酸配列をそれぞれ図１４、１５および１６の配列アラインメントで示す。
【００７２】
ＩＬポリペプチドはまた、ＩＬアミノ酸配列、または、ＩＬの生物活性を保持するそれらの断片、誘導体、類似体もしくは活性部分であり得る。「生物活性」が意図することは、ポリペプチドが、対応する受容体と受容体アクセサリータンパク質と共に三分子複合体を形成する能力を示すことである。
【００７３】
好ましくは、ＩＬは、ＩＬ−１またはＩＬ−１８である。
【００７４】
本発明の分析で用いられる好ましいＩＬポリペプチドは、可溶性ＩＬ受容体と可溶性ＩＬ受容体アクセサリータンパク質と共に可溶性三元複合体を形成する成熟ＩＬポリペプチドであり、例えばヒト（配列番号１）、マウス（配列番号５）およびラット（配列番号７）成熟ＩＬ−１α、ヒト（配列番号４）、マウス（配列番号６）およびラット（配列番号８）成熟ＩＬ−１β、およびヒト（配列番号９）およびマウス（配列番号１０）成熟ＩＬ−１８である。
【００７５】
本発明の分析で用いられる最も好ましいＩＬポリペプチドは、配列番号４のヒト成熟ＩＬ−１β配列、ならびに、配列番号９のヒト成熟ＩＬ−１８配列である。
【００７６】
ｈＩＬとは、ヒト形態のＩＬを示す。
【００７７】
ＩＬ−Ｒポリペプチド
・完全長ＩＬ−Ｒ
マウスＩＬ−１受容体を発現クローニング技術によりクローニングした（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ.，１９８８）。この遺伝子は、ＮＨ₂細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む受容体をコードする。配列解析により、ＩＬ−１受容体の細胞外の部分が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの同部分と同様に、３つのドメイン（Ｉｇ様ドメイン、図２３を参照）に組織されていることがさらに明らかになった。ヒトＩＬ−１受容体の細胞外ドメインとサイトカインＩＬ−１βとの共結晶化により、該タンパク質のこの部分に関する上記構造予測が確認された（Ｖｉｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ.，１９９７）。インターロイキン−１受容体タイプ１に結合した低分子アンタゴニストペプチド（ＥＴＰＦＴＷＥＥＳＮＡＹＹＷＱＰＹＡＬＰＬ、配列番号３７）のＸ線結晶構造が近年開示された（Ｖｉｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ.，２０００）。このペプチドは、配列番号３５の配列に近く、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａと、可溶性ＩＬ−１Ｒのドメイン１および２との相互作用に類似していた。
【００７８】
ＩＬ−１ＲＩをＩＬ−１Ｒａと共に結晶化した第二のグループは、Ｖｉｇｅｒｓ等（１９９７）が説明した配列と非常に類似した配列を有する３つのＩｇ様ドメインを説明している（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９９７）。
【００７９】
本願において、「ＩＬ−Ｒポリペプチド」とは、細胞内ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むポリペプチド意味する。細胞外ドメインは、３つのＩｇ様ドメインを含み、ＩＬ−ＲをＩＬおよびＩＬ−ＲＡｃＰに結合させる。ＩＬ−Ｒポリペプチドのシグナル伝達形式は、膜結合型である。
【００８０】
ＩＬ−Ｒポリペプチドとしては、ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１８Ｒファミリーのメンバーが挙げられ、例えば、ヒトＩＬ−１ＲＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）、マウスＩＬ−１ＲＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６２）、ラットＩＬ−１ＲＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｍ９５５７８）、天然に存在する可溶性ラットＩＬ−１Ｒタイプ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３１２３）、ヒトＩＬ−１８Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５５）、マウスＩＬ−１８Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６５）、ヒトＩＬ−１Ｒｒｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８４４３４）、マウスＩＬ−１Ｒｒｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８４４３３）、ヒトＴＩＧＩＲＲ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８４４３６）、マウスＴＩＧＩＲＲ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８４４３７）（Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ，（２０００），ＪＢＣ，２７５，２９９４６−２９９５４）である。
【００８１】
天然に存在する可溶性ラットＩＬ−１Ｒタイプ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３１２３）を除いては、上記で定義した完全長ＩＬ−Ｒは、通常、本発明の分析に適さない。
【００８２】
・可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド
「可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド（ｓＩＬ−Ｒ）」とは、完全長タンパク質の細胞外の結合活性（すなわち、その対応するＩＬとその対応する受容体アクセサリータンパク質と三分子複合体を形成する能力であり、これは可溶性でも膜結合でもよい）を保持するいずれかの完全長ＩＬ−Ｒの可溶性ポリペプチド断片を意味する。
【００８３】
本発明に従って使用するための好ましい可溶性ＩＬ−Ｒは、対応する内因性タンパク質の細胞外ドメイン、または、その結合能力を保持するそれらの部分もしくは断片を含む、または、からなる。適切な部分または断片は、内因性タンパク質と同じリガンドに結合する。膜結合型受容体またはアクセサリータンパク質の細胞外ドメインは、実施例１で説明された成熟配列の疎水性分析により同定された。ＩＬ−Ｒ細胞外ドメインは、本明細書において、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインを含む。ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含む。ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含む。ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む。ＩＬ−１ＲＩのドメイン構成に関しては、図２３を参照。
【００８４】
ＩＬ−１ＲＩのドメイン３は、ＩＬ−１βのＩＬ−１ＲＩへの高親和性結合に重要である（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９９７）。従って、ドメイン１および２のみからなるＩＬ−１ＲＩ受容体の可溶性形態は、ＩＬ−１βに対する親和性が著しく減少した（１０μＭ）。
【００８５】
・好ましい可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド
例示する目的で、本明細書で説明するｓＩＬ−Ｒポリペプチドは、ヒトｓＩＬ−１ＲＩおよびヒトｓＩＬ−１８Ｒであるが、図１７の補助により、当業者であれば、それから他のｓＩＬ−１Ｒポリペプチドを推測可能である。
【００８６】
本発明の一実施態様において、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、可溶性ＩＬ−１受容体ポリペプチド、好ましくは可溶性ＩＬ−１Ｉ型受容体ポリペプチドである。
【００８７】
本発明の好ましい実施態様において、可溶性受容体ポリペプチドは、完全長受容体の結合特性を保持し、配列番号１３アミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【００８８】
最も好ましい可溶性受容体ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１である場合、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、完全長受容体の結合特性を保持し、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有する。
【００９０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１である場合、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、配列番号１４または配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【００９１】
本発明の他の実施態様において、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、可溶性ＩＬ−１８Ｒポリペプチドである。
【００９２】
本発明の好ましい実施態様において、可溶性受容体ポリペプチドは、完全長タンパク質の結合特性を保持し、配列番号１７のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【００９３】
最も好ましい可溶性受容体ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【００９４】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１８である場合、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、完全長受容体の結合特性を保持し、配列番号１８のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有する。
【００９５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１８である場合、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【００９６】
欠失の範囲
ドメイン３の最後のシステイン残基の後のＩＬ−Ｒ細胞外ドメインのＣ末端セグメントの欠失により、完全長タンパク質の結合能力を保持する可能性のあるタンパク質が生産され得る。その上、ＩＬ−Ｒ細胞外ドメインのＮ末端部分からドメイン１の初めのシステインまでの欠失によっても、完全長タンパク質の結合能力を保持する可能性のあるタンパク質が生産され得る。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−Ｒ細胞外ドメインのＣ末端セグメントからの、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失により、完全長タンパク質の結合特性を保持する可能性のあるポリペプチドが生産され得る。
【００９８】
本発明の最も好ましいｓＩＬ−Ｒは、それ以上欠失がなされていない細胞外ドメイン（対応する内因性完全長ＩＬ−Ｒの）を含む、または、からなる。
【００９９】
ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド
・完全長インターロイキン受容体アクセサリータンパク質
本願において、「ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド」は、細胞内ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むポリペプチドを意味する。細胞外ドメインは３つのＩｇ様ドメインを含み、ＩＬ−ＲＡｃＰをＩＬ−Ｒ／ＩＬ二元複合体に結合させる。ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドのシグナル伝達形式は、膜結合型である。
【０１００】
ＩＬ−１ＲＡｃＰにおけるこれら３つのＩｇ様ドメインの位置に関する予測がＧｒｅｅｎｆｅｄｅｒ等によりなされた（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９９５）。彼らは、ＩＬ−１ＲＡｃＰのＩｇ様ドメインの境界線を、各ドメインのＮおよびＣ末端に近接して発見することができる唯一のシスチル（‘Ｃ’）残基の位置により定義した（図２４で概説）。図２４は、ヒトインターロイキン１Ｉ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）およびヒトインターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ａｆ０２９２１３）の配列アラインメントを示す。各ドメインの最初と最後のシステインは、斜線と囲みで示す。（------）、（−−−）および（〜〜〜）で示される、下線で示した配列部分は、ドメイン１、２および３それぞれの位置を示す。
【０１０１】
ＹｏｏｎおよびＤｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９８）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰの第３のドメインのセグメントに向けられたモノクローナル抗体が、ＩＬ−１βシグナル伝達を阻害できることを示した。
【０１０２】
ＩＬ−１ＲＩのＩｇ様ドメインは、ＩＬ−１ＲＡｃＰに関してＧｒｅｅｎｆｅｄｅｒ等（１９９５）の説明に従って決定された。
【０１０３】
ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドとしては、ＩＬ−１ＲＡｃＰ様ファミリーポリペプチドおよびＩＬ−１８ＲＡｃＰファミリー様ポリペプチドのメンバーが挙げられ、例えば、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６４）、またはラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１２９６８）未熟ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５３）またはマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ ０１０５５３）未熟ＩＬ−１８ＲＡｃＰ、ヒトＩＬ−１Ｒ９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２１２０１６）（Ｃａｒｒｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９９）、２３，２５−３１、および、Ｓａｎａ ｅｔ ａｌ.，（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６９，２５２−２６２）、ヒトＴＩＧＩＲＲ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８４４３５）、ヒトＩＬ１ＲＡＰＬ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１４２７１）、天然に存在する可溶性ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６７３４３）である。
【０１０４】
天然に存在する可溶性ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６７３４３）を除いては、上記で定義した完全長ＩＬ−ＲＡｃＰは、通常、本発明の分析には適さない。
【０１０５】
・可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド
「可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド(ｓＩＬ−ＲＡｃＰ)」は、完全長タンパク質の細胞外の結合活性(すなわちその対応するＩＬ−Ｒ／ＩＬ複合体と三分子複合体を形成する能力であり、可溶性でも膜結合でもよい)を保持する完全長ＩＬ−ＲＡｃＰの可溶性ポリペプチド断片のいずれかを意味する。
【０１０６】
本発明に従って使用するための好ましい可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰは、内因性タンパク質の細胞外ドメイン、または、その結合能力を保持する部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなる。適切な部分または断片は、内因性タンパク質と同じリガンドに結合する。
【０１０７】
ＩＬ−ＲＡｃＰの細胞外ドメインは、本明細書において、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインを含む。ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含む。ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含む。ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む。ＩＬ−１ＲＡｃＰのドメイン構成に関しては、図２３を参照。
【０１０８】
・好ましい可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド
説明する目的で、本明細書で説明される好ましい可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、ヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰおよびヒトｓＩＬ−１８ＲＡｃＰであるが、図１８の補助により、当業者であれば、それから他のｓＩＬ−１ＲＡｃＰポリペプチドを推測可能である。
【０１０９】
本発明の一実施態様において、ｓＩＬ−ＲＡｃＰは可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰポリペプチドである。
【０１１０】
本発明の好ましい実施態様において、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、完全長受容体アクセサリータンパク質の結合特性を保持し、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１１１】
最も好ましい可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【０１１２】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１である場合、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、完全長受容体アクセサリータンパク質の結合特性を保持し、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２６のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１１３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１である場合、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２６のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【０１１４】
本発明の他の実施態様において、ｓＩＬ−ＲＡｃＰは可溶性ＩＬ−１８ＲＡｃＰポリペプチドである。
【０１１５】
本発明の他の好ましい実施態様において、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、完全長受容体アクセサリータンパク質の結合特性を保持し、配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１１６】
最も好ましい可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【０１１７】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１８である場合、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、完全長受容体アクセサリータンパク質の結合特性を保持し、配列番号２５のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１１８】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ＩＬポリペプチドがＩＬ−１８である場合、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列、または、完全長タンパク質の結合特性を保持する類似体、誘導体、活性部分もしくはそれらの断片を含む、または、からなるポリペプチドである。
【０１１９】
欠失の範囲
ドメイン３の最後のシステイン残基の後の、ＩＬ−ＲＡｃＰの細胞外ドメインのＣ末端セグメントの欠失により、完全長タンパク質の結合能力を保持する可能性のあるタンパク質が生産され得る。その上、ＩＬ−ＲＡｃＰの細胞外ドメインのＮ末端部分からドメイン１の初めのシステインまでの欠失によっても、完全長タンパク質の結合能力を保持する可能性のあるタンパク質が生産され得る。
【０１２０】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−ＲＡｃＰの細胞外ドメインのＣ末端セグメントからの１〜３０個のアミノ酸、好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失により、完全長タンパク質の結合特性を保持する可能性のあるポリペプチドが生産される。
【０１２１】
本発明の最も好ましいｓＩＬ−ＲＡｃＰは、それ以上欠失がなされていない細胞外ドメイン（対応する内因性完全長ＩＬ−ＲＡｃＰの）を含む、または、からなる。
【０１２２】
ファミリーメンバー
ＩＬ三元複合体の３つのメンバーは、哺乳動物種間で高度に保存されている。この様々な種間での高度な配列同一性は、少なくとも２つの実質的な重要性を有する：
ａ）ＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰの細胞外ドメインの３つの構造的部分は、様々な種から選択することができる。それゆえに、ある種由来のＩＬ複合体のメンバー１つと、他の種由来のＩＬ複合体の少なくとも他のメンバーとを含み得るＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰキメラを構築することが可能である。キメラはまた、図１４〜１８の異種間の配列アラインメントを参照することによる、単一のタンパク質中で異種間キメラを生させるような核酸配列の組み合わせも含む。Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ.，２０００（ＩＬ−１Ｒファミリーキメラの選択に関する）を参照。
【０１２３】
ｂ）ＩＬ−ＲまたはＩＬ−ＲＡｃＰいずれかにおける構造ドメインおよびＩｇ様ドメインの位置の予測、および、適切な結合能力を有するポリペプチドを生産するためのＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰいずれかから欠失させることができる構造ドメイン１および３の部分の決定は、例えば図２４のデータと組み合わせて図１７および１８の配列アラインメントを比較することによって当業者により決定することができる。
【０１２４】
図２４は、ヒトインターロイキン１Ｉ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ；ｘ１６８９６）およびヒトインターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ；ａｆ０２９２１３）の配列アラインメントを示す。各ドメインの最初と最後のシステインは、斜線と囲みで示す。（------）、（−−−）および（〜〜〜）で同定される、下線で示した配列部分は、それぞれドメイン１、２および３の位置を示す。
【０１２５】
結果として、上記で示した欠失の範囲は、ラットやマウス配列のような他の哺乳動物のＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰ配列にも適用可能である。
【０１２６】
ペプチド生産のためのシグナル配列
分泌シグナル配列は、小胞体およびゴルジ体を介してタンパク質を細胞膜外部に移動させるタンパク質配列のＮ末端の配列と定義される。それにより、分泌シグナル配列は酵素により特異的に開裂され、最終的には分泌タンパク質およびプロセシングされたタンパク質が生産される。シグナル配列および開裂部位は、タンパク質により変化する。シグナル配列の一般的な特徴は、その組成の疎水性である（通常、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＣおよびＰ残基が存在する）。シグナル配列の平均長は、２０個のアミノ酸残基である。これは、タンパク質を膜通過させ、分泌させるのに必要な長さと考えられる。細胞外のタンパク質を生産するために、当業者は、成熟タンパク質と、完全な分泌タンパク質を得るのに有効なシグナル配列とを融合させることができる。本発明の観点において、本発明で使用するための成熟ＩＬポリペプチドまたは／およびｓＩＬ−Ｒポリペプチドまたは／およびｓＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを生産するために、いかなるシグナル配列を用いることができる。好ましいシグナル配列は、既知のシグナル配列、例えばメリチン種（ＭＫＦＬＶＩＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ、配列番号３８）、ヒト膵リパーゼ種（ＭＷＬＬＬＴＭＡＳＬＩＳＶＬＧＴＴＨＧ、配列番号３９）、ヒトＩＬ−１ＲＩ種（ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡ、配列番号４０）またはヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ種（ＭＴＬＬＷＣＶＶＳＬＹＦＹＧＩＬＱＳＤＡ、配列番号４１）である。真核性の発現系（例えば昆虫細胞／バキュロウイルス系）において、シグナルのＤＮＡ配列コーディング領域の下流に標的タンパク質の成熟遺伝子を挿入することによって、分泌タンパク質が生産され得る。
【０１２７】
スクリーニング分析
タンパク質の可溶性形態を用いることの主な利益は、これら試薬により簡単にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）分析をフォーマットし、稼動させることができることである。相同分析および可溶性分析はまた、非常に小型化しやすく、ＨＴＳフォーマット化を促進することができる。このような分析はしばしば、それらの相同性の特徴により、より信頼できるデータを提供する。ＨＴＳモードにおいて、分析において活性なわずかな化合物を、自信を持って検出することが望まれるため（しばしば、一般的なＨＴＳでスクリーニングされた化合物総数の約０．３％）、これは非常に重要である。
【０１２８】
本発明の分析で用いられるＩＬ−Ｒポリペプチドは、可溶性である。内因性で活性な、機能的ＩＬ／ＩＬ−Ｒ／ＩＬ−ＲＡｃＰ複合体は、疎水性の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含む膜結合ＩＬ−Ｒを含む。このような膜結合型ＩＬ−Ｒポリペプチドは、不溶性であり、通常は本発明での使用に適さない。
【０１２９】
本発明の分析で用いられるＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、可溶性である。内因性で活性な、機能的ＩＬ／ＩＬ−Ｒ／ＩＬ−ＲＡｃＰ複合体は、疎水性の膜貫通ドメインを含む膜結合ＩＬ−ＲＡｃＰを含む。このような膜結合型ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、不溶性であり、通常は本発明での使用に適さない。
【０１３０】
本発明の一つの特定の一実施態様において、シグナル配列を依然として含む可溶性ＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを用いて分析を行うことができる。
【０１３１】
好ましいシグナル配列は、タンパク質の天然に存在するシグナル配列である。
【０１３２】
しかしながら、本発明の分析で用いられる最も好ましいｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドは、シグナル配列を含まない。
【０１３３】
本発明の他の実施態様において、可溶性ポリペプチドは、スクリーニングで使用するために、支持体に結合することができる。この支持体は、細胞膜への固定、または、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップへの固定を介していてよい。
【０１３４】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬポリペプチドは、天然に存在するシグナル配列の代わりに、ＡＴＧメチオニン開始コドンを含んでいてもよい。
【０１３５】
本発明は、ＩＬとＩＬ−Ｒとの相互作用、および／または、ＩＬ−ＲＡｃＰとＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体との相互作用を調節し、それによりＩＬ、ＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成および／または安定性を調節する薬剤のスクリーニング方法および分析における、本発明のＩＬ／ｓＩＬ−Ｒ／ｓＩＬ−ＲＡｃＰ三分子複合体の使用に関する。
【０１３６】
ＩＬとｓＩＬ−Ｒとの相互作用、または、ｓＩＬ−ＲＡｃＰｓとｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体との相互作用を調節することができる薬剤を得る方法は、試験物質の存在下および不存在下での可溶性成分の相互作用を評価するのに適切な終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）を用いる方法を含む。このような分析システムは、ＩＬのｓＩＬ−Ｒへの結合、ｓＩＬ−ＲＡｃＰのｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体への結合、または、すでに形成された三分子複合体の破壊を決定するために、本発明の分析で用いることができる。一般的に、最も興味深いのは、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰを含む三元複合体形成を調節することである。
【０１３７】
本発明で用いることができる様々なタイプのスクリーニング分析技術を、以下で簡単に説明する。
【０１３８】
・シンチレーション近接分析（ＳＰＡ）
シンチレーション近接分析において、ビオチン化タンパク質断片は、ストレプトアビジンでコーティングしたシンチラント含有ビーズ（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ社製のもの）に結合させることができる。続いて、放射線標識したポリペプチドの結合は、放射性ペプチドが固定化断片に結合することによって放射能誘導されたシンチレーションを決定することによって測定される。従って、測定されたシンチレーションにおいて調節を起こす（すなわち減少または増強）薬剤が、相互作用の調節因子（阻害剤、活性化物質）である。
【０１３９】
・ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）技術（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
終点決定方法としてＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）技術（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることもできる。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）マイクロタイタープレートのウェル表面は、シンチラントを含み、さらにＮｉ−ＮＴＡまたはストレプトアビジンのような材料でコーティングすることもでき、このような材料は、例えば６−Ｈｉｓタグまたはビオチン基を介してウェル表面に分子を固定させることができる。［³Ｈ］標識分子が表面に固定された分子と相互作用する場合、［³Ｈ］のシンチラントへの近接により、シンチラント活性化と光の放出が引き起こされる。この放出は、分子の相互作用の量に直接関連しており、マイクロプレートシンチレーションカウンターで測定することができる。相互作用の阻害剤またはエンハンサーは、それぞれシンチラントに近接する［³Ｈ］の量を減少または増強させ、それによりシグナルをそれぞれ減少または増強させる。
【０１４０】
試験化合物の分析は、試験分析のｃｐｍ（計数毎分）アウトプットにおける効果を、試験化合物を含まない以外は同一条件下の場合と比較して測定することによって行うことができる。
【０１４１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、ビオチン−ｓＩＬ−１ＲをストレプトアビジンＦｌａｓｈＰｌａｔｅに固定して、続いて、遊離ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと遊離¹²⁵ＩＩＬ−１β（またはより好ましくは³ＨＩＬ−１β）とを加える。他の好ましい構成において、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓは、６−Ｈｉｓタグを介してＮｉ−ＦｌａｓｈＰｌａｔｅに固定され、続いて、ＩＬ−１βに結合する［³Ｈ］標識ｓＩＬ−１Ｒを含む二元複合体を加える。
【０１４２】
・均一な時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）
均一な時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）は、特に本発明の分析における終点決定にに適切なデュアル標識蛍光技術である。当該技術は、分子が相互作用する場合、１つの分子上のドナー標識がアクセプター標識に接近するように、蛍光標識と相互作用するポリペプチドまたは複合体それぞれを標識することを含む。
【０１４３】
多くのデュアル標識蛍光技術が有する問題は、分析成分のバックグラウンドの蛍光である。エネルギードナーに隣接したエネルギーアクセプター分子からのシグナルは、ドナー分子から離れたアクセプター分子のような分析の他の成分からのシグナルにより部分的に弱められる。
【０１４４】
ＨＴＲＦは、ユウロピウムクリプテートのようなランタニドクリプテート分子は、特定の波長の光によって励起されると長時間にわたって蛍光を発するという発見に基づく（Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ １９９６，Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．１９９５）。ユウロピウムクリプテートのようなランタニドクリプテートが生物学的試験でエネルギードナー標識として用いられる場合、エネルギーは長時間にわたりアクセプター分子に移動する。遠方のアクセプターや他の分析成分からの短時間のシグナルは励起後急速に消滅するため、励起後短時間で測定されたシグナルは、ほぼ完全に、ドナー分子に近接しており、ドナーの長時間の蛍光によってまだ励起されているアクセプターによって生産されたものであり得る。従って、ドナー分子とアクセプター分子とでそれぞれ標識された２種の生体分子の近接を決定するのに分析を用いることができる。適切なエネルギードナー標識としてはユウロピウムクリプテートが挙げられ、適切なエネルギーアクセプター標識としては、シアニン５（Ｃｙ−５）およびＸＬ６６５（ＴＭ）が挙げられる（ＣＩＳ−Ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｒａｎｃｅから入手できる）。
【０１４５】
従って、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰは例えばＣｙ−５のようなエネルギーアクセプターで標識することができ、ｓＩＬ−１ＲＩはユウロピウムクリプテートのようなエネルギードナーで標識することができる。それにより、受容体とアクセサリータンパク質との近接は、６６５ｎｍで遅延した蛍光放出（Ｃｙ−５に関する）を測定することによって決定することができる。受容体とアクセサリータンパク質との近接は、ＩＬ−１、ｓＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ三分子複合体の存在を示す。
【０１４６】
・Ｏｒｉｇｅｎ（ＴＭ）技術 ( Ｉｇｅｎ )
本発明の分析における終点の方法としてＯｒｉｇｅｎ（ＴＭ）技術（Ｉｇｅｎ）を用いてもよい。相互作用対の１つの分子を、例えばＮｉ−ＮＴＡ／６−Ｈｉｓまたはビオチン／ストレプトアビジン結合によって磁気ビーズに付着させる。ルテニウム（ＩＩ）トリス−（ビピリジン）で標識した第二の分子を加え、分子間の相互作用により、ルテニウム（ＩＩ）トリス−（ビピリジン）標識を刺激電極に近接させる。電気化学的な刺激により、標識が化学発光を起こす。光のアウトプットは、分子間の相互作用の程度に関係する。
【０１４７】
例えば、１つの適切な構成において、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓは、６−Ｈｉｓタグを介してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズに固定され、続いて、ＩＬ−１βに結合したルテニウム（ＩＩ）トリス−（ビピリジン）標識ｓＩＬ−１Ｒを含む二元複合体を加える。続いて、電気化学的な刺激の後、標識からの光アウトプットを測定する。
【０１４８】
本発明の分析に加えることができる試験物質または化合物の量は、通常、用いられる化合物のタイプに応じた試行錯誤により決定される。典型的には、約０．００１ｎＭ〜１ｍＭの濃度の推定の阻害剤化合物が用いられ得る。好ましい濃度は、例えば０．０１ｎＭ〜１００μＭ、最も好ましくは０．１〜５０μＭ、特に約１０μＭである。ペプチドが試験物質である場合、より高い濃度が用いられ得る。
【０１４９】
特筆すべきは、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラスモン共鳴）またはＦｌａｓｈＰｌａｔｅの使用は、ＨＴＲＦの使用より生理学的であることである。Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを用いてｓＩＬ−１ＲＡｃＰを、Ｎｉ−ＮＴＡ ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップまたはＦｌａｓｈＰｌａｔｅ表面のいずれかに固定させることにより、その膜固定化完全長形態で膜に固定化された場合に用いられることが予測されるのと類似した様式でタンパク質を配向させる。これは、遊離溶液中でのタンパク質分析に比べて、分析をいくらかより典型的な生理的状況にすることができる。
【０１５０】
一次スクリーニング分析
・ＩＬ調節因子に関するスクリーニング分析
本明細書で用いられる「調節」は、ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰからなる三分子複合体の形成および／または安定性の増強、破壊または妨害を意味する。調節因子は、ＩＬとｓＩＬ−Ｒとの相互作用を、活性化、増強、破壊、減少、妨害させるか、または、全体的または部分的に失わせ、それによりｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体の形成に作用する、および／または、ＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体とｓＩＬ−ＲＡｃＰとの相互作用を活性化、増強、破壊、減少、妨害するか、または、全体的または部分的に失わせ、それによりＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成に作用する。調節因子はまた、すでに形成されたＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体を破壊することができる。
【０１５１】
１つの全体的な観点において、本発明は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を調節する試験化合物の能力を決定するための分析方法を提供し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；および、
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【０１５２】
最も好ましい実施態様において、本発明は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を調節する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、定義された量の可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）ＩＬポリペプチドを、工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；および、
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【０１５３】
他の観点において、本発明は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；および、
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【０１５４】
重要なことには、工程（ａ）でＩＬ、ｓＩＬ−Ｒ、ｓＩＬ−ＲＡｃＰと試験化合物とが接触する順番は変更することができることを特筆する。言いかえれば、試験化合物が添加される前に三分子複合体の形成が生じない限り、様々な成分のいかなる順番での追加も可能である。その上、試験化合物の取り込み前に三分子複合体が生じない限り、いかなる二分子複合体の前生成もまた許容できる。
【０１５５】
最も好ましい実施態様において、本発明はまた、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法を提供し、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、定義された量の可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）ＩＬポリペプチドを試験（ｂ）で得られた混合物に加えること；および、
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること、
を含む。
【０１５６】
本発明の最も好ましい実施態様において、分析で用いられるＩＬはヒト成熟ＩＬ−１またはヒト成熟ＩＬ−１８であり、分析で用いられるｓＩＬ−ＲはヒトｓＩＬ−１ＲＩまたはヒトｓＩＬ−１８Ｒであり、分析で用いられるｓＩＬ−ＲＡｃＰはヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはヒトｓＩＬ−１８ＲＡｃＰである。
【０１５７】
本発明の最も好ましい実施態様において、ＩＬはヒト成熟ＩＬ−１Ｒであり、ｓＩＬ−ＲはヒトｓＩＬ−１ＲＩであり、ｓＩＬ−ＲＡｃＰはヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰである。
【０１５８】
・ＩＬアンタゴニストを用いたＩＬ活性化物質のスクリーニング分析
ＩＬ、ＩＬアンタゴニスト、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰを含む反応媒体中で、ＩＬアンタゴニストとその相互作用からＩＬを切離すＩＬアンタゴニストに結合する実体の存在により、ＩＬ活性化剤様の効果が得られる。実際に、続いてＩＬはｓＩＬ−Ｒと結合することができ、ＩＬ／ｓＩＬ−Ｒ／ｓＩＬ−ＲＡｃＰ三元複合体形成に導く。
【０１５９】
それゆえに、本発明はまた、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬアンタゴニスト、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｃ）工程（ａ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１６０】
本発明の好ましい実施態様は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）ＩＬポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１６１】
本発明の最も好ましい実施態様は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、当該方法は：
（ａ）試験化合物と、ＩＬポリペプチドおよび可溶性ＩＬアンタゴニストとを接触させること；
（ｂ）可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを加えること；
（ｃ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｄ）工程（ｂ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１６２】
このスクリーニング分析の好ましい実施態様において、可溶性ＩＬアンタゴニストは、可溶性ＩＬアンタゴニストポリペプチドである。
【０１６３】
最も好ましい可溶性ＩＬアンタゴニストポリペプチドは、可溶性ＩＬ−１ＲＩＩまたはＩＬ−１８ＢＰである。
【０１６４】
・ＩＬ−１ＲＩＩ
適切な可溶性ＩＬ−１ＲＩＩポリペプチドとしては、完全長ＩＬ−ＲＩＩの結合特性を保持し、配列番号４２のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１６５】
これら分析で用いるための最も好ましい可溶性受容体ＩＩ型ポリペプチドは、配列番号４２のポリペプチド、または、完全長タンパク質の結合能力を保持する前記配列の類似体、誘導体、活性部分または断片である。
【０１６６】
本発明の他の実施態様において、上述の他のシグナル配列をＩＬ−ＲＩＩポリペプチドに加えてもよい。
【０１６７】
・ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）
適切なＩＬ−１８ＢＰポリペプチドは、完全長ＩＬ−１８ＢＰの結合特性保持し、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１６８】
この分析で用いるための最も好ましい可溶性ＩＬ−１８BPポリペプチドは、配列番号４３のポリペプチド、または、その完全長タンパク質の結合能力を保持する前記配列の類似体、誘導体、活性部分または断片である。
【０１６９】
・ＩＬ−Ｒアンタゴニストを用いた IL 活性化物質のスクリーニング分析
ＩＬ、ＩＬ−Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰを含む反応媒体中で、ＩＬ−Ｒアンタゴニストとのその相互作用からＩＬ−Ｒを切離すＩＬ−Ｒアンタゴニストに結合する実体の存在により、ＩＬ活性化剤様の効果が得られる。実際に、続いてｓＩＬ−ＲはＩＬに結合することができ、ＩＬ／ｓＩＬ−Ｒ／ｓＩＬ−ＲＡｃＰ三元複合体形成に導く。
【０１７０】
それゆえに、本発明はまた、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、ＩＬ−Ｒアンタゴニスト、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；
（ｂ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｃ）工程（ａ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１７１】
本発明の好ましい実施態様は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であり、当該方法は：
（ａ）試験化合物を提供すること；
（ｂ）試験化合物を、ＩＬポリペプチド、ＩＬ−Ｒアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
（ｃ）可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
（ｄ）形成された前記三分子複合体の量を測定すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）で形成された前記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された前記三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１７２】
このスクリーニング分析の好ましい実施態様において、ＩＬ−Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−Ｒアンタゴニストポリペプチドである。最も好ましいＩＬ−Ｒアンタゴニストポリペプチドは、ＩＬ−Ｒａである。
【０１７３】
・ＩＬ−１Ｒａ
適切なＩＬ−１Ｒａポリペプチドは、完全長ＩＬ−１Ｒａの結合特性を保持し、配列番号４４のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一性、または少なくとも８０％同一性、好ましくは８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、最も好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドである。
【０１７４】
この分析で用いるための最も好ましい可溶性ＩＬ−１Ｒａポリペプチドの１つは、配列番号４４のポリペプチド、または、完全長タンパク質の結合能力を保持する前記配列の類似体、誘導体、活性部分または断片である。
【０１７５】
その他の適切なＩＬ−１Ｒａポリペプチドとしては、ヒトＩＬ１ＨＹ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８６０９４）、マウスＩＬ１ＨＹ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１９４５１）およびマウスＩＬ−１Ｒｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ７４２９４）が挙げられる。
【０１７６】
上述の分析、方法が、ＩＬ、ＩＬ−ＲおよびＩＬ−ＲＡｃＰを含む三元複合体形成を、破壊、妨害または増強させることができる試験化合物のスクリーニングするための一次分析であると発明者に認識されることが好ましい。
【０１７７】
１またはそれ以上の一次スクリーニングを用いて、三分子複合体の形成を調節する能力を有することが同定された薬剤を、以下で説明する１またはそれ以上の二次スクリーニングを用いてさらに評価することができる。
【０１７８】
・二次スクリーニング分析
本発明による二次スクリーニング分析方法は、一次スクリーニング分析の一つで陽性と認められた試験化合物の、ＩＬと可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドとの二分子複合体における効果を試験することを含む。それにより、試験化合物によって影響を受けた相互作用を、ｓＩＬ−ＲとのＩＬ相互作用、または、ｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体とのｓＩＬ−ＲＡｃＰ相互作用のいずれかと同定することができる。
【０１７９】
本発明の特定の実施態様において、二次スクリーニング分析方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドと、上述の一次スクリーニングの一つで陽性と認められた試験化合物とを接触させること；および、
（ｂ）ＩＬポリペプチドと可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドとからなる二分子複合体の形成を決定すること、
を含む。
【０１８０】
例えば、試験化合物が阻害剤である場合、試験化合物により破壊した相互作用は、二分子複合体の形成と三分子複合体の形成とを比較することによって決定することができる。三分子複合体の形成だけが阻害されると、該化合物は、ｓＩＬ−ＲＡｃＰのｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体との相互作用を破壊させる。両方の複合体の形成が阻害されると、両方の相互作用がいずれも阻害されるか、またはＩＬとｓＩＬ−Ｒとの相互作用が阻害される。
【０１８１】
本発明の特定の実施態様は、二次スクリーニング分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドと、試験化合物とを接触させること；および、
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物中のＩＬポリペプチドと可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドとからなる二分子複合体の存在を分析すること、
を含む。
【０１８２】
本発明のさらなる観点は、ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の安定性を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための二次スクリーニング分析方法に関し、当該方法は：
（ａ）定義された量のＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを含む三分子複合体を提供すること；
（ｂ）試験化合物と、前記三分子複合体とを接触させること；および、
（ｃ）工程（ｂ）後に存在する前記三分子複合体の量と、工程（ａ）で最初に存在する三分子複合体の量とを比較すること、
を含む。
【０１８３】
本発明の最も好ましい実施態様において、分析で用いられるＩＬはヒト成熟ＩＬ−１またはヒト成熟ＩＬ−１８であり、分析で用いられるｓＩＬ−ＲはヒトｓＩＬ−１ＲＩまたはヒトｓＩＬ−１８Ｒであり、分析で用いられるｓＩＬ−ＲＡｃＰはヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはヒトｓＩＬ−１８ＲＡｃＰである。
【０１８４】
本発明の最も好ましい実施形態において、ＩＬはヒト成熟ＩＬ−１であり、ｓＩＬ−ＲはヒトｓＩＬ−１ＲＩであり、ｓＩＬ−ＲＡｃＰはヒトｓＩＬ−１ＲＡｃＰである。
【０１８５】
二次分析はまた、下流のＩＬエフェクターの誘導に関して試験することも含む。例えば、ＮＦκＢ活性化遺伝子の活性は、市販のＮＦκＢにより稼働するβ−ｌａｃレポーター（Ａｕｒｏｒａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＩＬ−１を刺激した後に分析することができる。
【０１８６】
上述したような、ＩＬとｓＩＬ−Ｒとの相互作用、または、ｓＩＬ−ＲＡｃＰとｓＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体との相互作用を調節することができる薬剤はまた、ＩＬと膜結合ＩＬ−ＲＡｃＰと膜結合ＩＬ−Ｒ／ＩＬ二分子複合体との相互作用を調節するのに用いることもできる。
【０１８７】
以下の図および実施例により本発明をさらに説明するが、決して限定されることはない。
【０１８８】
実施例
材料
オリゴヌクレオチドプライマーを、ＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成するか、または、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから直接得た。ヒト脳のＱｕｉｃｋ Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから得た。プラスミドｐＤＲ５４０中にヒトＩＬ−１βの成熟形態を最適なＥ．ｃｏｌｉコドン使用を伴いコードした合成遺伝子を用いた。制限酵素および他のＤＮＡ修飾酵素をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのいずれかより得た。組換えヒトＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１β、および可溶性ＩＬ−１受容体ＩＩ型（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ペプチドをＡｂａｃｈｅｍ Ｌｔｄ． Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａにより合成し、試薬をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄから得た。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）２０００を用いて、タンパク質間相互作用の結合反応速度論と親和性定数とを測定した。ＣＭ５およびＮＴＡ−チップ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｍ１−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド、およびエタノールアミンカップリング試薬（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、標準的なアミンカップリング法（Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９１）を用いてタンパク質をセンサー表面に固定した。
【実施例１】
【０１８９】
ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１ＲＡｃＰ細胞外ドメインの同定
膜結合型受容体またはアクセサリータンパク質の細胞外ドメインを、成熟配列のヒドロパシー分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）により同定した。膜貫通領域は、高いヒドロパシー指標を有する平均２０個の連続したアミノ酸残基を有する領域としてヒドロパシープロットで示される。
【０１９０】
ヒドロパシー指標は、膜貫通領域の指標を提供する。この分析に続いて、領域の正確な境界線が当業者既知の標準的な技術を用いてマッピングされる。図２１および２２は、完全長配列ヒトＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１８Ｒのヒドロパシープロット（図２１）ならびにヒトＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ−１８ＲＡｃＰのヒドロパシープロット（図２２）を示す。ＴＭｐｒｅｄプログラムにより、膜貫通領域とそれらの方向を予測する。アルゴリズムは、ＴＭｂａｓｅ、天然に存在する膜貫通タンパク質のデータベースの統計学的分析に基づく。予測は、スコアリングのため数種の重量−基質の組み合わせを用いてなされる（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ＆Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ，１９９３）。
【０１９１】
垂直の破線は、タンパク質の単一の膜貫通ドメインと予測される領域の境界を定める（タンパク質配列のこの領域において顕著に正の疎水性指標から判断できる）。このようにして、残基は、ヒトＩＬ−１ＲおよびヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインの始まりの直前において、これらタンパク質の可溶性形態をコードする最後の残基となるように選択された（および、実際にこれらＣ末端が欠失したタンパク質は、昆虫細胞／バキュロウイルス系での発現で分泌された）。これらＣ末端が欠失したタンパク質はまた、細菌または酵母で発現させることも可能である。図１７および１８は、それぞれヒト、ラットおよびマウス由来のＩＬ−１ＲＩ型およびＩＬ−１ＲＩＩ型、ＩＬ−１ＲＡｃＰおよびＩＬ−１８ＲＡｃＰのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【０１９２】
図１７および１８において、ヒトインターロイキンＩ受容体Ｉ型およびＩＩ型、ヒトインターロイキンＩ受容体アクセサリータンパク質、ヒトインターロイキン１８受容体およびヒトインターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質の推定の膜貫通ドメインを、疎水性プロットにより得られた膜貫通ドメインの決定に従って、適切な太字の残基を含む透明なボックスで略記する。
【０１９３】
図１７および１８は、膜貫通ドメイン（ボックスで囲まれた）の一次配列における保存された位置を示し、従って、他の完全長ＩＬ−Ｒおよび完全長ＩＬ−ＲＡｃＰの類似のＣ末端が欠失した形態（例えば、ＩＬ−１ファミリー様受容体ポリペプチドおよびＩＬ−１ファミリー様受容体アクセサリータンパク質ポリペプチドの他のメンバーなど）もまた、昆虫細胞／バキュロウイルス系での発現で分泌される可能性が高い。
【実施例２】
【０１９４】
組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製
１）方法
１．１）ＩＬ−１β
ＩＬ−１β（配列番号３）をコードする合成遺伝子（配列番号２）を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＮｃｏＩ制限部位を５’開始コドンに導入することによって修飾した（プライマー：
【化１】

太字で示されるＮｃｏＩ部位を伴う（配列番号２７）、および、５’−ＣＡＧＣＴＴＡＴＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴ−３’、これは、ＩＬ−１β遺伝子より遠位のｐＤＲ５４０領域に対応する（配列番号２８））。生産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し（遺伝子中の２つのタンデム停止コドンの直後の部位で）、ｐＱＥ−６０にサブクローニングした（Ｑｉａｇｅｎ）。得られた構築物（ｐＱＥ−ｈｒＩＬ−１β）は、確認のために配列解析し、Ｎ末端メチオニン残基を追加されたＩＬ−１βタンパク質の成熟形態（配列番号４の配列）を発現させるために設計された。ｐＱＥ−ｈｒＩＬ−１βを、ＩＬ−１β発現をきつく調節するためのｌａｃリプレッサーをコードしたプラスミドｐＲＥＰ４を含むＭ１５Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ）。
【０１９５】
形質転換されたＭ１５Ｅ．ｃｏｌｉを標準的な方法で培養し、続いて最終濃度２ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）で誘導した。培養して４時間後、細胞を、４０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ ２１、ＪＡ１４ローター、５５００ｒｐｍ）、４℃で３０分間、遠心分離で回収した。上清を取り除き、ペレットを必要になるまで−７０℃で保存した。１リットルの培養液から、約４ｇの細胞（湿重量）が生産された。細胞ペレットを、５０ｍｌの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび２５０μｇのリゾチーム／ｍｌ（緩衝液Ａ）に再懸濁した。懸濁液を穏やかに混合し、２５℃で２０分間インキュベートした。２５μｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５ｍｌの緩衝液Ｂ（１．５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＣａＣｌ₂、０．１ＭのＭｇＣｌ₂、および１ｍＭのＰＭＳＦ）を加えた。その混合物を細胞溶解産物が低い粘性を示すまでインキュベートした。
【０１９６】
その混合物を１７，０００ｇで１時間、４℃で遠心分離し、上清を取り除き、４００ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）（緩衝液Ｃ）で希釈した。１７，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した後（沈殿を取り除くため）、上清を、緩衝液Ｃを流速２５０ｍｌ／ｈで用いて平衡化したＳＰ−セファロースファスト−フロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）カラム（５ｃｍ ｉ．ｄ．２．５ｃｍ）にローディングした。２２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）で溶出させた。溶出液を３ｍｌに濃縮し、緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４または１００ｍＭのＮａＨＣＯ₃、ｐＨ８．３）で平衡化したＧ７５セファデックスカラム（２．５×９０ｃｍ）に３０ｍｌ／ｈでローディングした。ＩＬ−１βを含む分画を貯蔵し、５ｍｌに濃縮した。還元条件の４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのｈＩＬ−１βの予測Ｍ_r（〜１７，４００Da）によれば、Ｇ７５−セファデックスからの最後のピーク分画から単一のバンドが得られた。
【０１９７】
ＩＬ−１βアフィニティカラムは、製造元の説明どおりに、上記で精製したヒト組換えＩＬ−１β（２０ｍｇ）をＣＮＢｒ−活性化セファロース−４Ｂマトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１ｇに架橋することにより行われた。
【０１９８】
１．２）ｓＩＬ−１ＲＩ
ヒトＩＬ−１ＲＩ（配列番号１２）をコードする完全長ｃＤＮＡ（配列番号１１）（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、開始コドンの前にＪＢｃｏＲＩ部位を導入し、Ｈｉｓ³³⁶（推定の膜貫通領域の最初の残基）に関するコドンの代わりに停止コドンを導入し、続いてＸｈｏＩ部位を導入することによって修飾した。
【０１９９】
プライマー配列は：
【化２】

である。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）にクローニングし、双方のストランドを配列解析した。続いて、ＥｃｏＲＩ〜ＸｈｏＩ断片をｐＦａｓｔＢａｃ１にサブクローニングし、これを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に部位特異的に移動させることによって組換えバキュロウイルスバクミドＤＮＡを得た。数種のクローンから得られたバクミドＤＮＡを精製し、これを用いて、ｓｆ９細胞をＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎを用いてトランスフェクトさせた。
【０２００】
昆虫細胞での最適なヒトインターロイキンＩ受容体タンパク質発現のために、本明細書で説明するようにＰＣＲを利用し、以下のＫｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列「ＧＣＣＡＣＣ」をＡＴＧ開始コドン直前に挿入した。
【０２０１】
このコンセンサス配列に関するバリエーションはまた、効率的な発現に影響を与えることができ、実際に、他の配列もハイレベルの翻訳を目的としてさらにより有効になり得る。
【０２０２】
４００ｍｌのＳＦ−９００ＩＩ ＳＦＭ無血清昆虫細胞培地を含む１リットル容ポリカーボネート製振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で１〜５×１０⁶細胞／ｍｌであるように、細胞を定期的に維持した。培養条件は、振盪インキュベーターで、２７℃で、１１０ｒｐｍの回転であった。タンパク質生産のために、細胞を５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度まで培養し、続いて、１：１００希釈の適切なバキュロウイルスＰ３ストックで感染させる直前に２×１０⁶細胞／ｍｌに希釈した。細胞をｓＩＬ−１ＲＩ発現バキュロウイルスで感染させ、さらに４日間培養し、続いて、１００、７０および５０ｍｍのナイロン製ふるいで連続してろ過し、その後、３倍容の０．２Ｍグルコースで希釈した。ＩｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌホスホラミドン、１ｍｇ／ｍｌのＥ６４、および１ｍＭのＥＤＴＡを含むプロテアーゼ阻害剤カクテルを混合物に加えた。
【０２０３】
粗ブロスを１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）で１／３に希釈し、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＳＰ−セファロースＸＬストリームライン−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）のベッド拡張したクロマトグラフィーカラム（直径２．５ｃｍ×高さ１００ｃｍ，２０ｃｍベッドを充填）に、２５ｍｌ／分で適用した。カラムを洗浄した後、３５０ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で溶出させた。可溶性ＩＬ−１ＲＩを含む溶出材料を、ＰＢＳで流速５ｍｌ／ｈで平衡化したＩＬ−１β−セファロースカラム（２．５ｍｇ、ＩＬ−１β／ｍｌのゲル）に適用した。続いて、カラムをＰＢＳで十分に洗浄し、１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出させた。分画（２ｍｌ）を２５０μｌの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で即座に中和した。
【０２０４】
各工程のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＩＬ−ＲＩ（Ｎ−２０）ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いたウェスタンブロッティングとで分析した。還元条件下の４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、受容体のグリコシル化により、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）溶出分画から〜４４，０００Ｄａに単一のバンドが得られた。非グリコシル化ヒトｓＩＬ−１ＲＩの推定Ｍ_rは、−３６，３８１Ｄａである。
【０２０５】
ＵＶ分光光度法で、理論上のモル吸光係数５０，８１０Ｍ^-1・ｃｍ^-1を用いて、タンパク質濃度を測定し、標準としてウシ血清アルブミンを用いたブラッドフォード分析によって確認した。
【０２０６】
生産されたｓＩＬ−１ＲＩは、配列番号１３の配列を有する。
【０２０７】
１．３）ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ
標準的な分子生物学的技術を用いて、多くのタグをタンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかに導入することができる。用いることができる精製タグの例としては、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニンＡ、Ｖ５、Ｅ−ｔａｇ、ＢｉｒＡ−ｔａｇおよび６Ｈｉｓが挙げられる。
【０２０８】
ヒト可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０２９２１３から生成、配列番号２０の核酸配列配列１９のアミノ酸配列）に関しては、６−Ｈｉｓタグを利用した。従って、最後のＧＡＡ（グルタミン酸）トリプレットコドン配列の後に、以下の配列を付加した： ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ（配列番号３６）。
【０２０９】
最後のＣＡＣを「ＴＧＡ」停止コドンの後に続けた。
【０２１０】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応に用いて、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ配列を増幅した。該プライマーは、公開されているＩＬ−１ＲＡｃＰ ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７））、５’−ＧＧＡＴＧＡＣＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧ−３’（配列番号３１）、および、５’−ＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＣＡＴＡＣＡ−３’（配列番号３２））に基づく。ＰＣＲ産物をＴａｑポリメラーゼを用いてヒト皮質ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。得られた産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、多数のクローンをＤＮＡ配列解析により特徴付けた。完全長クローン中に３つのミスマッチが見出され、そのうちの２つはコードされたアミノ酸に変化をもたらす。これらを部位特異的変異誘発により修正した。
【０２１１】
修正されたクローンをテンプレートとして用いて、ＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外の部分（残基１〜３５９）を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに、プライマー５’−ＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧ−３’（５／プライマー）（配列番号３３）および５’−ＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＧＣ−３’（３７プライマー）（配列番号３４）を用いたＰＣＲにより生産した。５’プライマーは、開始コドンに隣接するＫｏｚａｋコンセンサス配列を含み、一方で、３’プライマーは、６個のヒスチジン残基、停止コドンおよびＥｃｏＲＩ部位をコードし、その後にＩＬ−１ＲＡｃＰの最後の細胞外残基（Ｇｌｕ３５９）が続く。ＰＣＲ産物をポリヌクレオチドキナーゼで５’リン酸化し、精製し、続いて平滑化し、バキュロウイルストランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳｔｕＩ部位にクローニングした。ポリヘドリンプロモーターに関して正の方向にライゲートした遺伝子を有するクローンを単離し、配列解析で確認した。数種のクローンから得られたバクミドＤＮＡを精製し、これを用いて、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎを製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の説明どおりに用いてｓｆ９細胞にトランスフェクトさせた。
【０２１２】
昆虫細胞でのヒトインターロイキンＩ受容体アクセサリータンパク質の最適な発現のために、本明細書で説明するようにＰＣＲを利用し、以下のＫｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列「ＧＣＣＡＣＣ」をＡＴＧ開始コドン直前に挿入した。
【０２１３】
感染後に細胞を５日間培養したことを除いては本質的にｓＩＬ−１Ｒに関して上述したようにして、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰ（ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ）を昆虫細胞中で生産した。ストリームラインカラムでのクロマトグラフィーの前に、粗ブロスをグルコースで２倍に希釈し、０．５ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１０ｍｌ／分で溶出させた。この材料を、０．５ｍｌ／分でＮｉ²⁺チャージＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム（直径１ｃｍ×高さ４ｃｍ）にローディングした。続いて、安定なＡ₂₈₀ｎｍ基準線が達成されるまで、０．５ＭのＫＣｌ／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール、続いて１ＭのＫＣｌ／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、最後に０．５ＭのＫＣｌ／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾールで、逐次的に、４℃でカラムを洗浄した。６−Ｈｉｓでタグを付したｓＩＬ−１ＲＡｃＰを０．５Ｍイミダゾール／１００ｍＭのＫＣｌ／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出させ、ＰＢＳで十分に透析した。
【０２１４】
理論上のモル吸光係数５９，６３０Ｍ^-1・ｃｍ^-1を用いてタンパク質濃度を測定し、ブラッドフォードタンパク質分析で確認した。
【０２１５】
２）結果：
コロイド状青色染料（colloidal blue staining）を結合させたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％）と、適切な市販の抗体を用いたウェスタンブロッティングと、ハイブリダイゼーションとを行い、各精製スキームから得られたタンパク質の純度と、同一性とを調べた。ウェスタンブロッティングにより分子量を確認した。精製ＩＬ−１βの生物活性は、マイクロフィジオメトリー（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ.，１９９９で説明された）によって調べたところ、市販の源からの材料に類似していた。組換えＩＬ−１βの収率は、培養液１リットルあたり〜５ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された純度は＞９５％であった。ＩＬ−１βのマススペクトロメトリーにより、開始メチオニンの部分的プロセシングが明らかになった。
【０２１６】
ｓＩＬ−１ＲＩ精製の各工程からのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＩＬ−ＲＩ（Ｎ−２０）ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングとで分析した。−４４，０００Ｄａのバンドにより、可溶性グリコシル化ＩＬ−１ＲＩの存在が確認される。シグナル配列を欠く受容体の推定の分子量は、３６，３８１Ｄａである。
【０２１７】
検出用のペンタ−Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたところ、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの分子量は−４５，０００Ｄａであり、これは顕著なタンパク質のグリコシル化を示す。６−Ｈｉｓタグを含むｓＩＬ−１ＲＡｃＰの推定の分子量は３９，９３５Ｄａである。全体的に、両方のタンパク質の収率は、培養液上清１Ｌあたり１．５ｍｇであった。
【０２１８】
生産されたｓＩＬ−１ＲＡｃＰは、配列番号２１の配列を有していた。
【実施例３】
【０２１９】
表面プラスモン共鳴
１）方法：
１．１）タンパク質の固定
ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％のＰ２０界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン）（ＨＢＳ，ＢＩＡｃｏｒｅ）であった。等量の０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドを混合し、３５μｌを５μｌ／分でセンサーチップ表面上に注入し、カルボキシメチル化デキストランを活性化した。１０ｍＭアセテート（ｐＨ５）中のｈＩＬ−１βの５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）中のｓＩＬ−１ＲＩの１０μｇ／ｍｌ、および、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．５）中のｓＩＬ−１ＲＡｃＰの１０μｇ／ｍｌを、それぞれフローセル２、３および４に結合させた。各結合の後、３５μｌのエタノールアミンで残りの活性カルボキシル基をブロックした。固定工程を、２５℃で、５μｌ／分の一定流速で行った。フローセル１（固定コントロール）は、１０ｍＭアセテート（ｐＨ５．０）中のＢＳＡの１０μｇ／ｍｌを結合させた。
【０２２０】
１．２）ＢＩＡｃｏｒｅでの反応速度分析
全ての実験を、ＨＢＳ緩衝液中で、２５℃で、２０μｌ／分の一定流速で行った。４０μｌの分析物を２分間注入し（結合フェーズ）、続いてＨＢＳを５分間注入した（解離フェーズ）。また、擬似ブロック表面上にも等量の各タンパク質希釈液を注入し、バルクの屈折率指標バックグラウンドと、分析物の非特異的結合とを差し引くためのブランクのセンサーグラムとして役立たせた。
【０２２１】
全ての反応速度分析の後、２０μｌの１００ｍＭのＨＣｌを注入し、全ての残存結合リガンドを解離させた。低レベルの固定、速い流速（２０μｌ／分）、および適切な分析物濃度で実験を行い、質量輸送作用を制限した。さらに、ＢＩＡシュミレーションプログラムを用いて質量輸送制限を調べた。これらの分析で得られた曲線を用いて速度定数を得た。５種の濃度のリガンド（二連で）をランダムな順番で４つのフローセルに注入した。
【０２２２】
全てのタンパク質表面は、表面ＲＵ（共鳴単位）密度に比例したリガンドに対する高いキャパシティーと、長期安定性とが示された。概して、リガンド結合とＨＣｌでの再生とを１００サイクルした後でも、平均８５％超の結合能力が保存された。フローセル２上のＩＬ−１βの量は７６３ＲＵであった。フローセル３上のｓＩＬ−１ＲＩの量は２４１３ＲＵであり、フローセル４上のｓＩＬ−１ＲＡｃＰの量は１０９２ＲＵであった。
【０２２３】
１．３）データ分析
ＢＩＡ評価プログラム３．０（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて非線形最小二乗曲線を当てはめることによりセンサーグラムを分析した。ＢＩＡｃｏｒｅ実験からの結合曲線と解離曲線とを単一部位結合モデル（Ａ＋Ｂ＝ＡＢ）に当てはめることにより速度定数を得た。このモデルからは、χ²＜０．５で単一の指数関数当てはめが得られた。より複雑なモデルでの比較の当てはめからは、より優れたデータ解釈は得られなかった。
【０２２４】
方程式（１）：
【数１】

を解離フェーズに用い、式中、Ｒ_tは、時間ｔでＲＵに残存して結合したリガンドの量であり、ｔ₀は、解離フェーズの開始である。最終的な解離速度定数、ｋ_offは、一連の注入で得られた値の平均から計算された。
【０２２５】
結合フェーズを分析するため、方程式（２）：
【数２】

を用い、式中、Ｒ_eqは、平衡状態の結合リガンドの量（ＲＵでの）であり、ｔ₀は、注入開始時間であり、ｋ_s＝ｋ_on・Ｃ＋ｋ_offであり、ここでＣは、センサーチップ表面に注入された分析物の濃度である。結合速度定数、ｋ_onは、ｋ_s値Ｃのプロットの傾斜から決定された。見かけの平衡解離定数Ｋ_Dは、これら２つの速度定数（ｋ_off／ｋ_on）の割合から決定された。
【０２２６】
初めに、データをコントロールから差し引いて、ＢＩＡ評価３．０ソフトウェア（ＢｌＡｃｏｒｅ）を用いてゼロにあわせ、その後、包括的に二分子反応モデルに当てはめた。速度方程式を得て、続いて、全体のデータ群について同時に数的に統合した。全体のデータ群に関する結合速度定数（ｋ_on）および解離速度定数（ｋ_off）、ならびに、残差Ｓ．Ｄ．（標準偏差）値、複製Ｓ−Ｄ．値、および相関係数を得た。質量輸送モデルを用いてもあてはめは改善されなかった。
【０２２７】
２）結果：
２．１）ＩＬ三分子複合体メンバー間での相互作用
センサーチップ上でのＩＬ−１βとｓＩＬ−１ＲＩとの相互作用
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰと結合したＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの、それぞれＩＬ−１β（Ａ）、ｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｃ）精製タンパク質の相互作用を示す。
【０２２８】
ＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたチャンネル２、３、および４は、それぞれ（------）、（―――）、および（−−−）線で表記される。遊離リガンドに用いられたタンパク質濃度は、ＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰにおいて、それぞれ５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌである。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの相互作用を示す。
【０２２９】
図１Ａ〜Ｃは、チップ上のその同種の受容体に特異的に結合する各リガンドのの能力を示す。従って、ｈＩＬ−１βは、フローセル３に固定されたｓＩＬ−１ＲＩを認識し、一方で、遊離ｓＩＬ−１ＲＩは、フローセル２上のＩＬ−１βを認識する。どのタンパク質も固定化ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと相互作用しない。その上、遊離ｓＩＬ−１ＲＡｃＰは、それ自身とある程度相互作用できる（フローセル４）にもかかわらず、固定化ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＩ（それぞれフローセル２および３）を認識しない。
【０２３０】
ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−ＲＡｃＰ三元複合体形成
図２Ａおよび２Ｂは、予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体と、それぞれｓＩＬ−ＲＩ、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１ＲＡｃＰと結合したＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルに加えられた過量のＩＬ−１β（Ａ）またはｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）との相互作用を示す。
【０２３１】
２種のタンパク質を、異なる比率で、室温で１５分間、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした。図２Ａおよび２Ｂは、過量（約２：１）のＩＬまたはＩＬ−Ｒが適用された場合の複合体とセンサーチップとの相互作用を示し、（------）、（―――）、および（−−−）線はそれぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたャンネル２、３、および４を示す。
【０２３２】
図２で示すように、予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体は、固定化ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと相互作用して三元複合体を形成する。
複合体形成の逐次的なメカニズムを実証するために、ＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを連続して注入した。両方の方法を用いて、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＩチップ表面で三元複合体を得たが、すなわち、これら分子の細胞表面での推定の相互作用、すなわち初めにＩＬ−１βがｓＩＬ−１ＲＩに結合し、ｓＩＬ−ＲＡｃＰがＩＬ−１β／ＩＬ−ＲＩ複合体に結合するという相互作用が模倣された。
【０２３３】
図３は、２つの異なる方法を用いた三元複合体形成を示す。図３Ａは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルへのＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な注入を示す。ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＩ（図示されていない）は、チップ上のそれらそれぞれの特異的分子に結合し、二元複合体を形成し、続いて、解離フェーズの前にｓＩＬ−１ＲＡｃＰが注入され、三元複合体（ＢＩＡｃｏｒｅの共注入コマンド）が形成される。用いられたＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの二元複合体への結合を分析したところ、ｓＩＬ−１ＲＩチップのＩＬ−１βに対する親和性定数（Ｋ_D）（図３Ａ）、および、ＩＬ−１βチップのｓＩＬ−１ＲＩに対する親和性定数（Ｋ_D）（図示されていない）がそれぞれ１．３７ｎＭおよび４．２８ｎＭであることがわかった。図３Ｂは、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６ＨｉｓのＮｉ−ＮＴＡチップ上への捕捉、続いて二元複合体ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ（―――）またはＩＬ−１β単独（−−−）の添加を示す。
【０２３４】
図３Ｂにおいて、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを介する固定が三元複合体形成を防ぐかどうかを試験した。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰがＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ²⁺−ニトリロ酢酸）センサーチップに補足され、予め形成されたＩＬ−１ｌＳ／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体を注入したところ、三元複合体形成が観察されたが、ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＩ（図示されていない）が単独で注入された場合は、シグナルは観察されなかった。
【０２３５】
ＩＬ−１Ｒａとの相互作用
ＩＬ−１Ｒａは、細胞表面受容体にこれら薬剤と競合させることによってＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの生物学的作用を阻害する。ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１Ｒａは全て、ＩＬ−１ＲＩと匹敵する親和性で結合する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９６）。ＩＬ−１ＲａｃＰは、ＩＬ−１ＲＩと、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βのいずれかと三元複合体を形成するが、ＩＬ−１Ｒａとは形成しない（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）。これは、ＩＬ−１Ｒａ／ｓＩＬ−１ＲＩがｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成できないことを示す図４で確認された。
【０２３６】
図４は、解離プロセスの際にｓＩＬ−ＲＡｃＰを加えた場合の、それぞれｓＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはｓＩＬ−１ＲＩを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの、ＩＬ−１βの相互作用、および、ＩＬ−１Ｒａの相互作用の比較を示す。
【０２３７】
サイトカインの濃度は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａそれぞれに対して０．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの濃度は１０μｇ／ｍｌであった。（------）、（―――）、および（−−−）線は、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたチャンネル２、３、および４を示す。
【０２３８】
同様に、ＩＬ−１Ｒａ／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体の解離フェーズの際のｓＩＬ−１ＲＡｃＰ添加は、解離速度に影響を与えなかった。しかしながら、解離速度（ｋ_off）は、ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体の解離速度よりかなり低い（表２を参照）。
【０２３９】
配列番号３５のペプチドとｓＩＬ−１ＲＩとの相互作用
ペプチドＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬ（ＡＦ１１３７７）配列番号３５（ファージディスプレイにより同定された）は、ｓＩＬ−１ＲＩとの強固な複合体を形成することができる（Ｙａｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
【０２４０】
図５Ａおよび５Ｂは、ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチドのＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上への結合を示す。図５Ａは、該ペプチドと異なるチャンネルとの相互作用を示す。図５Ｂは、ペプチドと過量のｓＩＬ−１ＲＩとの予め混合された複合体の相互作用を示す。（------）、（―――）、および（−−−）線は、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩ、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたチャンネル２、３、および４を示す。
【０２４１】
図５Ａにおいては、ｓＩＬ−１ＲＩと配列番号３５のペプチドとの相互作用が確認される。予め形成されたペプチド／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体は、固定化ＩＬ−１βと相互作用できず（図５Ｂ）、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成することもできない。
【０２４２】
可溶性ＩＬ−１ＲＩＩ型との相互作用
図６は、ＩＬ−１Ｒ複合体におけるデコイＩＬ−１ＲＩＩ型の可溶性形態の関与を示す。図６Ａは、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの共注入と、それに続くサイトカイン注入による、ｓＩＬ−１ＲＩＩフローセル（------）への、ｓＩＬ−１ＲＩフローセル（―――）への、およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰフローセル（−−−）への、ＩＬ−１βの結合の比較を示す。図６Ｂは、以前の実験と同じチップを用いて、ｓＩＬ−１ＲＩＩと、結合したＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの相互作用を示す。これは、ＩＬ−１βと二元複合体を形成するｓＩＬ−１ＲＩＩの能力を示すが、この可溶性受容体との二元複合体は、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成することはできなかった。ＩＬ−１βに関するｓＩＬ−１ＲＩＩのｋ_onがｓＩＬ−１ＲＩに関するｋ_onより低いにもかかわらず、ＩＬ−１βに関するｓＩＬ−１ＲＩＩのｋ_offは、ｓＩＬ−１ＲＩに関するｋ_offよりかなり低いということが特筆される。生理学的な観点において、このデコイ受容体ＩＩ型は循環ＩＬ−１βを捕捉するのがＩＬ−１ＲＩより遅いが、一度ＩＩ型二元複合体が形成されると、この複合体の解離は非常に遅く、それを安定化するためのアクセサリータンパク質の必要がない。
【０２４３】
２．２）反応速度研究
図７は、ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体（図７Ａ）およびＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ（図７Ｂ）の結合反応速度論を示す。図７Ａにおいて、遊離ｓＩＬ−１ＲＩを、５種の異なる濃度（上から下への曲線にかけてそれぞれ１１９、５９．５、２９．８、１４．９、および７．４ｎＭ）でＩＬ−１βチップ上に流した。図７Ｂでは、ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体におけるｓＩＬ−１ＲＡｃＰの結合反応速度論を示す。図７Ｂは、遊離ＩＬ−１β(５０μg／ml)でのＩＬ−１β捕捉工程の後の、受容体チップのsＩＬ−１ＲＡｃＰ濃度の範囲を示す。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ濃度の範囲は、上から下への曲線にかけてそれぞれ１１９ｎＭ、２９．８ｎＭ、１４．９ｎＭ、および７．４ｎＭであった。示されたセンサーグラム（図７Ａおよび７Ｂに対応する）は、コントロールから差し引かれたものである。結果に関しては表２を参照。
【０２４４】
ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体
図７Ａは、ｓＩＬ−１ＲＩ（濃度範囲７．４〜１１９ｎＭ）とＩＬ−１βチップとの相互作用に関する反応速度データを示す。観察されたＫＤは、１．５３ｎＭであった。受容体チップで遊離ＩＬ−１β（濃度範囲０．１２〜５０ｎＭ）を用いた逆の実験で、類似の値が観察された。
【０２４５】
ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ三元複合体
２つのプロトコールを用いて、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰのＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体における速度定数を決定した。第一に、予め形成された二元複合体（２：１、ＩＬ−１βのモルが過剰）をｓＩＬ−１ＲＡｃＰチップで濃度範囲にわたり試験した。第二に、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰを適用する前に、ＩＬ−１βを受容体チップ上で捕捉した（図７Ｂ）。この反応速度分析において、受容体が固定されれば三元複合体形成がより顕著であるため、ＩＬ−１βチップのなかでも受容体チップが優先された。
【０２４６】
ＩＬ−１シグナル伝達に関与する分子の反応速度論
ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップを用いたＳＰＲ実験で得られたデータを表２に示す。最初の２つの列（実験１および２）は、図７Ａに示すＩＬまたはｓＩＬ−Ｒの単一の反応速度論に関する速度定数（Ｋ_onおよびＫ_off）および平衡結合定数（Ｋ_D）を示す。列３および４は、遊離ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−Ｒの各サンプルにおける、一定濃度のｓＩＬ−１ＲＡｃＰ（１０μｇ／ｍｌ〜２５０ｎＭ）の存在下での同反応速度論を示す。列５および６は、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰチップ上の予め形成された二元複合体（太字が過剰のタンパク質）の反応速度論の結合定数を示す。二元複合体の濃度範囲は、実験５および６についてそれぞれ７．４ｎＭ〜１１９ｎＭおよび２．９〜４５．８ｎＭであった。実験７（図７Ｂ）は、一定濃度のＩＬ−１β（５μｇ／ｍｌ）のｓＩＬ−Ｒチップ上への第一の捕捉、続いて、濃度範囲（７．４ｎＭ〜１１９ｎＭ）のｓＩＬ−１ＲＡｃＰの注入による、２段階の反応速度を示す。ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ複合体と相互作用する分子の結合分析：列８は、インターロイキン１受容体アンタゴニストのｓＩＬ−Ｒチップへの結合データを示す。適用された濃度範囲は、１．８２〜２９．２ｎＭであった。列９は、可溶性ＩＬ−１受容体ＩＩ型のＩＬ−１βチップへの結合データを示す。適用された濃度範囲は、４．２〜６７．８ｎＭであった。列１０は、ＡＦ１１７３３ペプチド（ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬ−ＯＨ、配列番号３５）のｓＩＬ−Ｒチップへの結合データを示す。適用された濃度範囲は、２４０−７７６０ｎＭであった。
【０２４７】
全ての定数を本明細書で説明したように計算した。実験１０（表２の列１０）を除いては、標準偏差は０．１未満であり、χ²パラメーターは０．１未満であった。
【０２４８】
【表１】

【０２４９】
表２は、表面プラスモン共鳴とこの相互作用に慣用する分子とを用いたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ相互作用の結合分析結果を示す。
【０２５０】
・ＩＬ−１Ｒａ
ＩＬ−１Ｒａは、ｓＩＬ−１ＲＩと相互作用するが、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの三元複合体は形成しない（図４）。濃度範囲１．８２〜２９．２ｎＭにわたるＩＬ−１Ｒａを、ｓＩＬ−Ｒチップに適用した。ＩＬ−１ＲａとＩＬ−１βとの反応速度の差は、明らかであった。主な差は、ＩＬ−１βに比べて顕著に低いＩＬ−１Ｒａの解離プロセスによる（アンタゴニストのＫ_offは１．９×ｌ０^-4ｓ^-1であり、これに比べてアゴニストは２．５×１０^-3ｓ^-1である、表２を列１と８とを比較して参照）。しかしながら、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ存在下でのＩＬ−１βのｓＩＬ−Ｒに対する親和性は、ＩＬ−１Ｒａ／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体の親和性と類似している（表２）。
【０２５１】
・ｓＩＬ−１ＲＩＩ
ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１βと相互作用するが、本質的にＩＬ−１ＲＩＩにおける細胞質ドメインの欠失により、細胞中でこの複合体の形成によるシグナル伝達は生じない（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．１９９６）。可溶性ＩＬ−１ＲＩＩの濃度範囲（４．２〜６７．８ｎＭ）がＩＬ−１βチップに適用された。これにより、ＩＬ−１βとこれら２つの受容体タイプとの相互作用、および、シグナル伝達メカニズムにおけるその関係を比較することができる。ＩＬ−１βとｓＩＬ−１ＲＩＩとの相互作用は、ｓＩＬ−１ＲＩよりも約１０倍弱い（Ｋ_D＝１３．５ｎＭ）。これは、ＩＩ型受容体が、アゴニスト結合に関してＩ型と弱く競合するデコイ受容体として作用するという事実と一致する。
【０２５２】
・配列配列３５のペプチド
固定化ｓＩＬ−１ＲＩに対するファージディスプレイ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．１９９６）により得られたペプチドＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ１１７３３）を、受容体チップ（２４０〜７７６０ｎＭ）に適用した。図５で観察されたように、このペプチドは、ＩＬ−１βとの二元複合体形成を阻害する（表２を参照）。ペプチド／ｓＩＬ−１ＲＩの結合定数、および、ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体の結合定数は類似していた。ＩＬ−１Ｒａ／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体のより低いＫＤは、主に、切離し速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）がより遅いことによる（表２）。
【０２５３】
本願において、ＩＬ−１β／ＩＬ−１ＲＩ／ＩＬ−１ＲＡｃＰ複合体を相互作用させ、溶液中またはセンサーチップ上でで安定な二元および三元複合体を形成することに関する組換え細胞外ドメインの能力（図１〜３）が証明された。完全長タンパク質に関して以前に報告されたように（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｙｏｏｎ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９８））、ＩＬ−１βとｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの相互作用、および、ｓＩＬ−１ＲＩとｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの直接の相互作用はない。遊離ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと固定化ｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの弱い相互作用が示された（図１Ｃ）。
【０２５４】
ＩＬ−１βおよびsＩＬ−１ＲＡｃＰのｓＩＬ−１ＲＩチップへの逐次的な注入の後、または、ｓＩＬ−１ＲＩおよびsＩＬ−１ＲＡｃＰのＩＬ−１βチップへの注入の後、三元複合体を形成することができた。前者の場合において、三元複合体形成がより顕著であるが（図３Ｂ）、チップ表面の固定は、モル単位で同レベルであった。これはおそらく、ＩＬ−１βがチップに肯定された際の不都合な方向でのＩＬ−１βの結合を反映している。三元複合体はまた、予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体をｓＩＬ−１ＲＡｃＰチップへ加えた後にも得られた（図２）。
【０２５５】
アクセサリータンパク質を欠く細胞中のＩＬ−１β／ＩＬ−１ＲＩ二元複合体に関するＫ_Dは、２ｎＭであった（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｌａｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを共発現する細胞において、顕著な複合体の安定化が、親和性５倍増し（ＫＤ〜０．４ｎＭ）で観察された（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５）。ｓＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰを用いた我々のＳＰＲ実験からの反応速度データによれば、固定化ＩＬ−１βにおける遊離ｓＩＬ−１ＲＩ、および、固定化ｓＩＬ−１ＲＩにおける遊離ＩＬ−１βに対して、それぞれ１．５３ｎＭおよび３．６１ｎＭのＫＤが得られた。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ存在下で分析物がローディングされた場合、見かけのＫＤ値は、１．１ｎＭおよび２．３２ｎＭであり、従って、アクセサリータンパク質の二元複合体における安定化効果が確認された。
【０２５６】
予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体と、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰセンサーチップとの相互作用では、顕著に高い親和性が得られた（ＫＤ＝０．８５ｎＭ）。さらに三元複合体形成を研究するために、我々は、２段階プロトコールを用いた。初めにＩＬ−１βを受容体チップに捕捉し、即座にｓＩＬ−１ＲＡｃＰの様々な濃度を適用した（表２、列７を参照）。得られたＫ_D７７ｎＭは、ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−１ＲＡｃＰとを発現する異なる細胞系で得られた値（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５による）と良好な関連を示した。
【０２５７】
ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１ＲＩと強く相互作用するが、シグナル伝達を誘導することはできず、競合的なＩＬ−１のアンタゴニストとして作用する。結晶学的な研究により、ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１αと同じ方法で最初の受容体の２つのドメインと相互作用することが証明された（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９９７）。しかしながら、アゴニストとは異なり、アクセサリータンパク質と三元複合体を形成するための重要な工程である、第３のドメインとの相互作用が不可能である。予想通り（図４）、ＩＬ−１Ｒａは、可溶性受容体Ｉ型と強く相互作用する（Ｋ_D＝０．７５ｎＭ）が、ＩＬ−１ＲＡｃＰとの三元複合体は形成できない。
【０２５８】
ＩＬ−１ＲＩＩは、デコイ受容体として知られており、シグナル伝達に重要な意味のある細胞内ドメインを含まない。我々のデータは、ＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩＩ二元複合体とｓＩＬ−１ＲＡｃＰとの相互作用がないという証拠を提供する（図６）。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰチップとの三元複合体を生じるｓＩＬ−１ＲＩについて以前に採用された条件と同一の条件を用いたところ、予め形成されたｓＩＬ−１ＲＩＩ／ＩＬ−１β複合体を注入してもシグナルは検出されなかった。この結果を確認するために、ｓＩＬ−１ＲＩＩはＩＬ−１βチップ上を通過させ、ＩＬ−１βはｓＩＬ−１ＲＩＩチップ上を通過させたところ、双方とも二元複合体が形成され、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ注入はさらなるシグナルは生じなかった。Ｌａｎｇ等（１９９８）は、キメラＩＬ−１ＲＩＩ細胞外／ＩＬ−１ＲＩ細胞質受容体は、ＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成することができ、ＩＬ−１β刺激の後にシグナルを誘導することを示した。Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｙ等（１９９８）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰの存在は、アゴニストがＩＬ−１ＲＩＩへ結合するのに必要であることを示した。その一方で、本願は、可溶性ＩＬ−１ＲＩＩはＩＬ−１βを結合させるが、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体は形成しないという証拠を提供する。近年の発表（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.，（２０００））によれば、どのようにして細胞表面ＩＬ−１ＲＩＩ／ＩＬ−１β二元複合体はＩＬ−１ＲａｃＰとの三元複合体を形成できないか、それによって細胞内のシグナル伝達が生じないかが実証された。この発見は、ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１「スカベンジャー」−ＩＬとして、すなわち１Ｒの競合物としての役割を有し、最終的には、ＩＬ−１βの、ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−１ＲａｃＰとの三元複合体（従ってシグナル）形成の阻害をもたらす、という仮説を支持する。
【０２５９】
我々の結果は、ｓＩＬ−１ＲＩＩが、アゴニストを補充して、ｓＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１β二元複合体（Ｋ_D１．５３ｎＭ）と比べて９倍高いＫ_D（１３．５ｎＭ）で非シグナル伝達複合体を形成することによってＩＬ−１シグナル伝達を調節する可能性を有する、ということを確認する。しかしながら、いくつかのＩＩ型受容体は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１ＲａよりＩＬ−１βに対して優先的に、より高い親和性を示した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．１９９６）。しかしながら、ｓＩＬ−１ＲＩＩ／ＩＬ−１β二元複合体のｋ_offは、Ｉ型二元複合体のｋ_offより顕著に低く、これはＩＩ型受容体に関する生理学的な役割を示す。
【実施例４】
【０２６０】
ＨＴＲＦ分析のためのタンパク質標識化の最適化
１）方法
上記で特徴付けられた相互作用を適合させ、ＨＴＲＦ（Ｒ）技術に基づく分析で用いるために発展させた。
【０２６１】
タンパク質
以下の濃度のタンパク質を分析に用いた。
【０２６２】
‐ＩＬ−１β（Ｍｗ１７，４００）
濃度＝１．４２ｍｇ／ｍｌ、
‐ＩＬ−１ＲＩ型（ｓＩＬ−１ＲＩ）の細胞外ドメイン（Ｍｗ４４，０００）
濃度＝１．４９ｍｇ／ｍｌ、
‐Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＩＬ−１ＲＡｃＰ（ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ）の細胞外ドメイン（Ｍｗ４５，０００）
濃度＝１．５８ｍｇ／ｍｌ、
‐インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）（Ｍｗ１７，１００）、
濃度＝２０μｇ／ｍｌ、
‐ペプチドＡＦ１１３７７（配列番号３５）（Ｍｗ１，８５８）、
濃度＝１ｍＭ。
【０２６３】
試薬の標識
試薬を、アミン基を介し、ヘテロ二官能価試薬を用いて、活性化ユウロピウムクリプテート、活性化ＸＬ６６５または活性化ＣＹ５で標識し、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製し、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化を介するアミンカップリングの標準的なプロトコールに従って未反応試薬を除去した。
【０２６４】
クリプテート標識
‐ｓＩＬ−１受容体Ｉ型：
ｓＩＬ−１受容体を、濃度０．１３０ｍｇ／ｍｌ、Ｒｍｆ＝２．０５Ｋ／受容体（染料Ｃｙ５／タンパク質の割合）で標識した。０．１％BSAと０．１％Tween20とを含む１００ｍＭ（ｐＨ７．０）のリン酸緩衝液中に生成物を溜め、−８０℃で、１０μのアリコートで保存した。
【０２６５】
ＣＹ５標識
‐ｓＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質：
ｓＩＬ−１ＲＡｃＰを、濃度０．０６５ｍｇ／ｍｌで、Ｒｍｆ＝２．６で標識した。ＣＹ５／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰを０．１％ＢＳＡを含む１００ｍＭ（ｐＨ７．０）のリン酸緩衝液中に溜め、−８０℃で、１０μｌのアリコートで保存した。
【０２６６】
１．１）半直接分析
半直接的なシステムは、６Ｈｉｓ親和性タグでｓＩＬ−１ＲＡｃＰにタグを付すことで構成された。しかしながら、このタンパク質は、その抗６Ｈｉｓ−Ｋ結合物には結合できなかった。
【０２６７】
１．２）直接分析
続いて、数種の直接分析様式が試された。
【０２６８】
試された最初の直接分析において、ｓＩＬ−１ＲＩは、クリプテートで直接的に標識され、ｓＩＬ−ＩＲＡｃＰは、ＸＬ６６５で標識される。
【０２６９】
しかしながら、三分子複合体が形成されたとき、ＸＬ６６５で得られた最大シグナルは非常に低かった（約３０％）。低いシグナルは、顕著な立体障害が原因である可能性がある。
【０２７０】
第二の分析システムにおいて、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰは、クリプテートで直接的に標識され、ｓＩＬ−１Ｒは、ＸＬ６６５で標識された。これら条件下では、シグナルは検出されなかった。
【０２７１】
試された第３の分析システムは、ＸＬ６６５がＣＹ５で置き換えられた第一の直接分析システムに相当する。これら条件化で、約１２００％の最大の特異的シグナルが得られた。
【０２７２】
この第３の分析システムが選択された。
【実施例５】
【０２７３】
ＨＴＲＦ直接分析システム
図８で示した直接分析様式を、ユウロピウムクリプテートで直接的に標識されたｓＩＬ−１ＲＩ、および、ＣＹ５で直接的に標識されたｓＩＬ−１ＲＡｃＰに関して設計した。
【０２７４】
相互作用反応は一段階法または二段階法（二元複合体形成、それに続く三元複合体形成）で行うことができる。以下に示すように試験した結果、二段階法は、一段階法のみを続けて用いた場合と同等の結果を示した。
【０２７５】
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．２ＭのＫＦで、全ての試薬を希釈した。
【０２７６】
１）プロトコール
以下のように分析を準備した：
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）、
５０μｌのクリプテート結合物、
５０μｌのＣＹ５結合物、
５０μｌの緩衝液。
【０２７７】
反応を室温で少なくとも１５分間インキュベートし、約１時間後に平衡に達した（図１０を参照）。検出器具（Ｐａｃｋａｒｄ）で、ＨＴＲＦ測定の標準条件（遅延時間５０μｓ、ゲート４００μｓ）で、データを読み取った。
【０２７８】
２）結果
結果をデルタＦで表示した：
Ｒ＝割合＝（Ｆ_665nm／Ｆ_620nm）×１０^-4、
デルタＦ（％）＝［（Ｒ_positive−Ｒ_negative）／Ｒ_negative］×１００、
ネガティブ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝ＩＬ−１βリガンド非含有の全試薬、
ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝ＩＬ−１βリガンド含有の全試薬。
【０２７９】
分析結果の評価
第一の実験を以下の条件で行った：
ＩＬ−１βを最終濃度５０ｎＭで用いた。
【０２８０】
ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５または５ｎＭで用いた。
【０２８１】
ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０または５０ｎＭで用いた。
【０２８２】
得られた結果を以下の表３に示す。
【０２８３】
【表２】

【０２８４】
予想通り、我々は、ＩＬ−１βリガンドの不存在下では、ｓＩＬ−１ＲＩ−ＥｕｒおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹＢは、互いに相互作用せず、従ってネガティブではエネルギー移動シグナルも発生しなかった、ということを観察した。
【０２８５】
リガンド存在下で、形成された三元複合体は、高いエネルギー移動シグナルを発生させる。１０分間インキュベートした後、約１２００％のシグナルが観察された。
【０２８６】
シグナルの特異性
リガンドの不存在下では、エネルギー移動シグナルは生じなかった。
【０２８７】
我々はまた、ネガティブ（リガンド非含有）およびポジティブ（リガンド含有）ウェルの両方において、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを抗体−Ｅｕｒ結合物で置き換えるか、または、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を抗体−ＣＹ５結合物で置き換えるかのいずれかにより、シグナルの不存在を調査した。これら試薬は、我々が分析に用いた参照試薬の代わりに、クリプテートまたはＣＹ５において、ほぼ同じ濃度で用いられた。
【０２８８】
ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒの代わりに抗体−Ｅｕｒを用いた場合、非特異的シグナルは検出されなかった。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの代わりに抗体−ＣＹ５を用いた場合、非特異的シグナルは検出されなかった。
【０２８９】
シグナルの反応速度論および安定性
ｓＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用い、１０分間、３０分間、３時間および一晩後に読み取りを行った。
【０２９０】
得られた結果を、図１０に示す。
【０２９１】
１０分間後に室温で平衡に達する。室温で一晩インキュベートした後、１０％未満のシグナルが失われる。
【０２９２】
ＫＦ濃度の影響
ＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用いた。全試薬を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．１％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０およびＫＦ０．１Ｍ、０．２Ｍまたは０．４Ｍで、希釈した。
【０２９３】
得られた結果を、以下の表４に示す。
【０２９４】
【表３】

濃度０．１Ｍ〜０．４ＭのＫＦは、シグナルに影響を与えなかった。
【０２９５】
結合分析
ＩＬ−１β濃度の影響
ＩＬ−１βを０．１５６〜１０ｎＭの増加する最終濃度で用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用いた（データ示さず）。
【０２９６】
ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用いた。
【０２９７】
得られた結果を図１１に示す。
【０２９８】
得られたデルタＦとＩＬ−１β濃度との間には直接的な関係がある。最終濃度５ｎＭのＩＬ−１βで、シグナルはプラトーに達する。飽和結合曲線から、ＩＬ−１βに関するＫｄを約１．０ｎＭと推測した。
【０２９９】
s ＩＬ−１ＲＡｃＰ - ＣＹ５濃度の影響
ＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を０．０７８〜１０ｎＭの増加する最終濃度で用いた。
【０３００】
得られた結果を、図１１に示す。
【０３０１】
得られたデルタＦとｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５濃度との間には直接的な関係がある。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５の最終濃度１０ｎＭからプラトーに達する。飽和結合曲線から、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰに関するＫｄを約１．５ｎＭと推測した。
【０３０２】
ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ濃度の影響
ＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用いた。ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを０．３１２〜２０ｎＭの増加する最終濃度で用いた。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用いた。
【０３０３】
得られた特異的シグナル（６６５ｎＭで）とｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ濃度との間には直接的な関係がある。ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒの最終濃度１０ｎＭからプラトーに達する。飽和結合曲線から、ｓＩＬ−１ＲＩに関するＫｄを約３．５ｎＭと推測した。
【０３０４】
以下の表５で示すように、１．２５〜２．５ｎＭのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを用いて最大デルタＦ％を得た。
【０３０５】
【表４】

【０３０６】
非標識ｓＩＬ−１ＲＩ濃度の影響
ＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用いた。
【０３０７】
ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用いた。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用いた。非標識ｓＩＬ−１ＲＩを０．０９８〜５０ｎＭの増加する最終濃度で用いた。
【０３０８】
以下のように反応を準備した：
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ、
５０μｌの非標識ｓＩＬ−１ＲＩ、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５、
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）。
【０３０９】
結果を図１２に示す。
【０３１０】
濃度２５ｎＭの非標識ｓＩＬ−１ＲＩで５０％阻害が測定される。
【０３１１】
非標識ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ濃度の影響
ＩＬ−１βを最終濃度１０ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度２ｎＭで用いた、非標識ｓＩＬ−１ＲＡｃＰを０．７８〜１００ｎＭの増加する最終濃度で用いた。
【０３１２】
以下のように反応を準備した：
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）、
５０μｌの非標識ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＡＣＰ−ＣＹ５、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ。
【０３１３】
結果を図１２に示す。
【０３１４】
濃度１０ｎＭの非標識ｓＩＬ−１ＲＡｃＰで５０％阻害が測定される。
【０３１５】
ＩＬ１−ｒａの効果
ＩＬ−１βを最終濃度２ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用い、ＩＬ−１−ｒａアンタゴニストを０．０７８〜２０ｎＭの増加する最終濃度で用いた。
【０３１６】
以下のように反応を準備した：
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）、
５０μｌのＩＬ−１Ｒａ、５０μｌのｓＩＬ−１ＲＡＣＰ−ＣＹ５、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ。
【０３１７】
１５分間、１、３および５時間後に読み取りを行った。
【０３１８】
約３時間後に平衡に達する。平衡状態で、濃度約１ｎＭのＩＬ−１Ｒａで５０％阻害が測定される。
【０３１９】
これら結果を図１３に示す。
【０３２０】
ＡＦ１１３７７阻害剤ペプチドの効果
ＩＬ−１βを最終濃度２ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０ｎＭで用いた。
【０３２１】
ＡＦ１１３７７阻害剤ペプチド（配列番号３５）を０．７８〜２０ｎＭの増加する最終濃度で用いた。
【０３２２】
以下のように反応を準備した：
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）、
５０μｌのＡＦ１１３７７、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＡＣＰ−ＣＹ５、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ。
【０３２３】
１５分間、１、３および５時間後に読み取りを行った。
【０３２４】
約２時間後に平衡に達する。平衡状態で、濃度約２０ｎＭのＡＦ１１３７７ペプチドで５０％阻害が測定される。
【０３２５】
これら結果を図１３に示す。
【０３２６】
各試薬に関してＫ _D 付近の濃度で得られたシグナル
３種の試薬をＫ_D付近の濃度で用いて分析を行った。
【０３２７】
ＩＬ−１βを最終濃度２ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒを最終濃度１．２５ｎＭで用い、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度２ｎＭで用いた。
【０３２８】
以下の表６は、得られたシグナルを示す（ｃｐｓは計数毎秒を意味する）
【０３２９】
【表５】

【０３３０】
ＨＴＲＦ分析
概要
以下の表７は、本明細書で説明する開発作業に基づき、ＨＴＲＦ三元複合体分析で使用するための好ましい試薬濃度を示す。
【０３３１】
【表６】

【０３３２】
最終的な分析容量を２００μｌから１６μｌに減らし、分析を９６−ウェルから３８４−ウェル様式に移行させるため、さらなる最適化を内部的に行った。表７の濃度は分析のために維持するが、最終容量が１６μｌになるように各成分の容量を５０μｌ〜４μｌに減少させた。複合体のシグナルおよび安定性は、最初の様式と同一であった（データ示さず）。
【実施例６】
【０３３３】
ＨＴＲＦ直接分析システムの最良の内部的最適化
１）材料および方法
分析緩衝液
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、
０．２ＭのＫＦ、
０．１％ＢＳＡ、
ＮａＯＨにより２１℃でｐＨを７．４にする。
【０３３４】
全試薬および化合物の希釈に必要とされた。
【０３３５】
分析成分
１．ユウロピウムクリプテートで標識された可溶性ＩＬ１−受容体−１（ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ）
バッチ００２（Ｃｉｓ Ｂｉｏで標識された）、保存は−８０℃、
ストック濃度は２００μｇ／ｍｌ（４．７６２μＭ）、
１：１１９０に希釈し、４ｎＭを得る（分析では４倍に希釈し、最終濃度１ｎＭを得た）。
【０３３６】
２．Ｃｙ５で標識された可溶性ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５）
バッチ７（ＰＧＲＤ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅで標識された）、
ストック濃度は３．６μＭ、
１：９０に希釈し、４０ｎＭを得る（分析では４倍に希釈し、最終濃度１０ｎＭを得た）。
【０３３７】
３．ＩＬ−１β
バッチ１（ＰＧＲＤ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅにより生産された）、保存は−８０℃、
ストック濃度は５．０μＭ、
１：６２５に希釈し、８ｎＭを得る（分析では４倍に希釈し、最終濃度２ｎＭを得た）。
【０３３８】
４．試験化合物／緩衝液
最大限可能な容量を用いるために分析を以下のように行った：
‐１０％ＤＭＳＯ中の１．３μｌの化合物（２５０μＭのドータープレート）、
‐６．７μｌのＩＬ１β、初期濃度＝４．８ｎＭ、最終濃度２ｎＭ、
‐４／２μｌのｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ、初期濃度＝２ｎＭ、最終濃度１ｎＭ、
‐４μｌのｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５、初期濃度＝２０ｎＭ、最終濃度１０ｎＭ。
【０３３９】
マイクロタイタープレート
全ての分析を黒いプレートで行った。
【０３４０】
Ｂｌａｃｋ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（９６ウェル）、Ｐａｃｋａｒｄ社カタログ番号６００５２０７、
ボックスあたり６０プレート、
分析容量２００μｌ。
【０３４１】
Ｂｌａｃｋ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（３８４ウェル）、Ｐａｃｋａｒｄ社カタログ番号６００５２５６
ボックスあたり３０プレート、
分析容量６４μｌ。
【０３４２】
Ｂｌａｃｋ Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（３８４ウェル）、Ｐａｃｋａｒｄ社カタログ番号６００６２６０
ボックスあたり５０プレート、
分析容量１６μｌ。
【０３４３】
ブランクおよびシステムコントロール
ブランク／システムコントロールを、以下のように、二連で各プレートに取り入れた：
（全ての濃度は分析中の最終濃度を示す）
１．緩衝液、
２．ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５（１０ｎＭ）、
３．ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ（１．０ｎＭ）、
４．ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５（１０ｎＭ）＋ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ（１．０ｎＭ）、
５．ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５（１０ｎＭ）＋ｓＩＬ−１ＲＩ−Ｅｕｒ（１．０ｎＭ）＋ＩＬ−１β（２ｎＭ）。
【０３４４】
全ての計算に関してシステムブランクとしてコントロール４を用いた。
【０３４５】
コントロール５は、最大限可能なシグナルを生産する。
【０３４６】
２）プロトコール
以下の表に示すように分析を行った。
【０３４７】
試薬および試験化合物を全て分析緩衝液で適切な濃度に希釈した。各ウェルにおけるＤＭＳＯの％は、行われた全ての分析において＜１％であった。
【０３４８】
試薬を表に示す順番で分析に加えた。
【０３４９】
ＩＬ−１βを加えることにより（競合実験では２ｎＭ）三元複合体形成を開始させた。
【０３５０】
プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａ（Ｐａｃｋａｒｄ）で密封して蒸発を防ぎ、最低３時間、ただし一般的には一晩インキュベートし、その後読み取った。シグナルは少なくとも２４時間安定であった。
【０３５１】
分析組成物
以下の表８を参照。
【表７】

【０３５２】
プレートの読み取り
全ての確認研究実験（現在の試薬を用いた）を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーを用いて読み取った。
【０３５３】
簡単な分析確認が、検出プレートリーダーにおいてデフォルト設定を用いて行われた。標準的な３８４ウェルプレートでの最適な読み取りのためには、最低限の分析容量である６０μｌが必要であることを特記する。
【０３５４】
励起波長３３７ｎｍ、
放出波長６２０および６６５ｎｍ。
【実施例７】
【０３５５】
ＨＴＲＦ分析半直接的なシステム
半直接的な分析様式を、ビオチン化ｓＩＬ−１ＲＩおよびＣＹ５で直接的に標識されたｓＩＬ−１ＲＡｃＰを用いて設計した。ストレプトアビジンに結合させたユウロピウムクリプテートも使用された。
【０３５６】
相互作用反応を、ちょうど全ての成分を加えることにより一段階法で行った。全ての試薬を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．２Ｍ ＫＦで希釈した。
【０３５７】
１）プロトコール
以下のように分析を準備した：
５０μｌのＩＬ−１β（また、ネガティブ試験では緩衝液）、
５０μｌのビオチン化−ｓＩＬ−１ＲＩおよびストレプトアビジン−クリプテート結合物、
５０μｌのｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５結合物、
５０μｌの緩衝液。
【０３５８】
反応を室温で少なくとも１５分間インキュベートし、約１時間後に平衡に達した（図１０を参照）。検出器具（Ｐａｃｋａｒｄ）で、ＨＴＲＦ測定のための標準的な条件下（遅延時間５０μｓ、ゲート４００μｓ）で、読み取りを行った。
【０３５９】
２）結果
結果をデルタＦで表示した：
Ｒ＝割合＝（Ｆ_665nm／Ｆ_620nm）×１０⁴、
デルタＦ（％）＝［（Ｒ_positive−Ｒ_negative）／Ｒ_negative］×１００、
ネガティブ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）＝ＩＬ−１βリガンド非含有の全試薬、
ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝ＩＬ−１βリガンド含有の全試薬。
【０３６０】
分析結果の評価
最初の実験を以下の条件で行った：
ＩＬ−１βを最終濃度５ｎＭで用いた。ビオチン−ｓＩＬ−１ＲＩを最終濃度１．２５または５ｎＭで用いた。ストレプトアビジン−クリプテートを２０ｎｇ／ウェルで用いた。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−ＣＹ５を最終濃度１０または５０ｎＭで用いた。
【実施例８】
【０３６１】
ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ分析
Ｃ末端６Ｈｉｓでタグを付したｓＩＬ−１ＲＡｃＰを用いて、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ被覆ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＮＥＮが製造）に固定する。ＢＩＡｃｏｒｅデータから、この方向に固定すると、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰはＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体と相互作用することができ、三元複合体を形成することがすでにわかっている。従ってこの相互作用は、トリチウム（［³Ｈ］））標識ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＩのいずれかを用いることによって検出される。光（Ｐａｃｋａｒｄ社製のＴＯＰカウントβ−シンチレーションカウンターのような器具で検出可能である）は、放射線標識した二元複合体がｓＩＬ−１ＲＡｃＰへ結合する際にＦｌａｓｈＰｌａｔｅから放出される。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルに埋め込まれたシンチラントの励起は、放射性核種がウェル表面に十分に近接した場合にのみ、すなわち放射線標識した二元複合体が固定化ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成した場合にのみ、起こる。
【０３６２】
タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ被覆ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＮＥＮが製造）に固定するために、Ｃ末端６Ｈｉｓでタグを付したｓＩＬ−１ＲＩを用いることも可能である。初めにＩＬ−１βと二元複合体を形成し、その後ｓＩＬ−１ＲＡｃＰと三元複合体を形成するＩＬ−１ＲＩの能力が、ＢＩＡｃｏｒｅで、固定化ｓＩＬ−１ＲＩ（タンパク質のＣ末端を介して固定される必要は無い）を用いて実証された。従って、この様式において、二元および三元複合体の形成の両方に関して分析することができる。二元複合体形成を分析する際、［³Ｈ］標識ＩＬ−１βを用い、それにより、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅに固定されたｓＩＬ−１ＲＩとの相互作用におけるシンチレーションが生じる。［³Ｈ］で標識したｓＩＬ−１ＲＡｃＰを用いて三元複合体形成を分析する。
【０３６３】
従って、上記分析様式を適切に組み合わせて用いることで、二元または三元複合体の形成のいずれかを阻害することができる分子を分析する。
【０３６４】
あるいは、上述の分析は、ビオチン化ｓＩＬ−１ＲＩまたはビオチン化ｓＩＬ−１ＲＡｃＰのいずれかを用いてなされる。従って、タンパク質上のこれらビオチン部分の存在を利用して、それをストレプトアビジンＦｌａｓｈＰｌａｔｅに固定することができる。
【０３６５】
また、これら分子を［³Ｈ］標識する方法として、市販の［³Ｈ］−ビオチンを用いたビオチン化も用いられる。発現媒体中の［³Ｈ］−アミノ酸を用いた標識化も、非常に特異的な活性でこれらタンパク質を標識する方法である。
【０３６６】
同様に、上述のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ方法の代替法として、ＳＰＡビーズ技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いることができる。従って、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅは、適量のＳＰＡビーズを含む標準的なプラスチックプレート（９６または３８４ウェル）により置き換えることができる。
【実施例９】
【０３６７】
Ｏｒｉｇｅｎ（ＴＭ）技術分析（Ｉｇｅｎ）
ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓを、６−Ｈｉｓタグを介してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズに固定し、続いて、ＩＬ−１βと結合するルテニウム（ＩＩ）トリス−（ビピリジン）標識ｓＩＬ−１Ｒを含む二元複合体を加える。続いて、電気化学的な刺激の後で、標識からの光アウトプットを測定する。
【０３６８】
その他の可能性は、６−Ｈｉｓタグを介してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズに固定されたｓＩＬ−１Ｒ−６Ｈｉｓを用いて、続いて、ＩＬ−１βと結合するルテニウム（ＩＩ）トリス−（ビピリジン）標識ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ、または、ＩＬ−１ＲＡｃＰと結合する標識ＩＬ−１βを含む二元複合体を加えることである。続いて、電気化学的な刺激の後、標識からの光アウトプットを測定する。適切なタンパク質を磁気ビーズに固定するさらなる方法は、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて、必要に応じてｓＩＬ−１ＲまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰのいずれかをビオチン化することである。
【０３６９】
表９は、ＩＬ−１二分子および／または三分子複合体に関与するタンパク質をコードする核酸配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号示す。
【０３７０】
【表８】

【０３７１】
表１０は、ＩＬ−１８二分子および／または三分子複合体に関与するタンパク質をコードする核酸配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号示す。
【０３７２】
【表９】

【０３７３】
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【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、それぞれＩＬ−１β（Ａ）、ｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）およびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ（Ｃ）精製タンパク質と、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの相互作用を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、予め形成されたＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ複合体と、それぞれｓＩＬ−ＲＩ、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルに加えられた過量のＩＬ−１β（Ａ）またはｓＩＬ−１ＲＩ（Ｂ）との相互作用を示す。
【図３】図３Ａは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１βまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６Ｈｉｓを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルへの、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な注入を示す。図３Ｂは、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−６ＨｉｓのＮｉ−ＮＴＡチップ上での捕捉、および、予め混合したＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体またはＩＬ−１β単独の注入を示す。
【図４】解離プロセスの際にｓＩＬ−ＲＡｃＰを加えた場合の、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａと、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはｓＩＬ−１ＲＩを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルとの相互作用の比較を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれｓＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰまたはｓＩＬ−１ＲＩを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセル上への、ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチド（配列番号３５）の結合を示す。
【図６】図６Ａは、それぞれｓＩＬ−１ＲＩ型、ｓＩＬ−１ＲＩＩ型またはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅチップの別々のフローセルへの、ＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な添加を示す。図６Ｂは、それぞれＩＬ−１β、ｓＩＬ−１ＲＩまたはｓＩＬ−１ＲＡｃＰを結合させたＢＩＡｃｏｒｅ別々のフローセルへの、ｓＩＬ−１ＲＩＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの逐次的な添加を示す。
【図７】それぞれＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ二元複合体（図７Ａ）およびＩＬ−１β／ｓＩＬ−１ＲＩ／ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ三元複合体（図７Ｂ）の結合反応速度論を示す。
【図８】本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式のグラフ表示である。
【図９】本発明の直接の二元複合体ＨＴＲＦ分析様式のグラフ表示である。
【図１０】本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式における三元複合体形成の反応速度論を示す。
【図１１】様々なＩＬ−１βおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰ−Ｃｙ５濃度の、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式を用いて得られたシグナルへの影響を示す。
【図１２】様々な濃度の非標識ｓＩＬ−１ＲＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰの、本発明の直接の三元複合体ＨＴＲＦ分析様式を用いて得られたシグナルへの影響を示す。
【図１３】様々な濃度のＩＬ−１ＲａおよびＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬペプチド（配列番号３５の）の、本発明の直接の三元ＨＴＲＦ分析様式における三元複合体形成の阻害への影響を示す。
【図１４】ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３１）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１０５５４）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｄ００４０３）のＩＬ−１αのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１５】ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ｘ０２５３２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿３０８３６１）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｍ９８８２０）のＩＬ−１βのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１６】ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ０７７６１１）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００８３６０）のＩＬ−１８のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１７Ａ】ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６２）およびラット（全長タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｍ９５５７８）のＩＬ−１ＲＩ型、天然に存在する可溶性タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３１２３））、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４６３３）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１０５５５）のＩＬ−１ＲＩＩ型、ならびに、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５５）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６５）のＩＬ−１８Ｒのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａの続きである。
【図１７Ｃ】図１７Ｂの続きである。
【図１７Ｄ】図１７Ｃの続きである。
【図１８Ａ】ヒト（全長タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３）、天然に存在する可溶性タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６７３４３）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８３６４）およびラット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１２９６８）のＩＬ−１ＲＡｃＰ、ならびに、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５３）およびマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１０５５３）のＩＬ−１８ＲＡｃＰのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａの続きである。
【図１８Ｃ】図１８Ｂの続きである。
【図１９】ヒトＩＬ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）およびＩＬ−１８受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５５）の配列アラインメントを示す。
【図２０Ａ】ヒトＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９２１３）およびＩＬ−１８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５３）受容体アクセサリータンパク質の配列アラインメントを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２１】ヒトＩＬ−１ＲＩ（図２１Ａ）およびＩＬ−１８Ｒ（図２１Ｂ）の完全長配列の疎水性プロットを示す。
【図２２】ＩＬ−１ＲＡｃＰ（図２２Ａ）およびＩＬ−１８ＲＡｃＰ（図２２Ｂ）の完全長配列の疎水性プロットを示す。
【図２３】ヒト細胞外インターロイキン１受容体Ｉ型およびインターロイキン１受容体アクセサリータンパク質の構造編成のグラフ表示である。
【図２４】ヒトインターロイキン１Ｉ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｘ１６８９６）およびヒトインターロイキン受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ａｆ０２９２１３）の配列アラインメントを示す。
【図２５】本発明の方法のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ分析様式のグラフ表示である。図２５Ａは、ニッケル−ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ様式を示し、図２５Ｂは、ストレプトアビジン−ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ様式を示す。

Claims (28)

1. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を調節する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   （ａ）ＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドおよび試験化合物を接触させること；および、
   （ｂ）形成された上記三分子複合体の量を測定すること、
   を含む、上記の方法。
2. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   （ａ）試験化合物を提供すること；
   （ｂ）試験化合物を、所定量の可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
   （ｃ）ＩＬポリペプチドを、工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；および、
   （ｄ）形成された上記三分子複合体の量を測定すること、
   を含む、上記の方法。
3. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   ‐工程（ａ）で可溶性ＩＬアンタゴニストを加えること；および、
   ‐追加の工程（ｃ）で、工程（ａ）で形成された上記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された上記三分子複合体の量とを比較すること
   をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
4. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   （ａ）試験化合物を提供すること；
   （ｂ）試験化合物を、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、可溶性ＩＬアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
   （ｃ）ＩＬポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
   （ｄ）形成された上記三分子複合体の量を測定すること；および、
   （ｅ）工程（ｃ）で形成された上記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された上記三分子複合体の量とを比較すること、
   を含む、上記の方法。
5. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   ‐工程（ａ）でＩＬ−Ｒアンタゴニストを加えること；および、
   ‐追加の工程（ｃ）で、工程（ａ）で形成された上記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された上記三分子複合体の量とを比較すること
   をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
6. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の形成を増強する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   （ａ）試験化合物を提供すること；
   （ｂ）試験化合物を、ＩＬポリペプチド、ＩＬ−Ｒアンタゴニストおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドに接触させること；
   （ｃ）可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドを工程（ｂ）で得られた混合物に加えること；
   （ｄ）形成された上記三分子複合体の量を測定すること；および、
   （ｅ）工程（ｃ）で形成された上記三分子複合体の量と、試験化合物の不存在下で形成された上記三分子複合体の量とを比較すること、
   を含む、上記の方法。
7. ＩＬ、可溶性ＩＬ−Ｒおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰを含む三分子複合体の安定性を破壊または妨害する試験化合物の能力を決定するための分析方法であって、
   （ａ）定義された量のＩＬポリペプチド、可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドおよび可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドを含む三分子複合体を提供すること；
   （ｂ）試験化合物と、上記三分子複合体とを接触させること；および、
   （ｃ）工程（ｂ）の後に存在する上記三分子複合体の量と、工程（ａ）で最初に存在する上記三分子複合体の量とを比較すること、
   を含む、上記の方法。
8. ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは哺乳動物由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析方法。
9. ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰが、ヒト、マウスまたはラット由来である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
10. ＩＬポリペプチドが、ＩＬアミノ酸配列、または、ＩＬの生物活性を保持するそれらの断片、誘導体、類似体もしくは活性部分である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方法。
11. ＩＬポリペプチドが、その成熟形態であり、１２〜１３個のβストランドから成るバレル型３次元構造を有し、細胞表面で三元（すなわち三分子）複合体が介在する細胞の活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分析方法。
12. ＩＬポリペプチドが、ＩＬ−１またはＩＬ−１８ポリペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析方法。
13. ＩＬポリペプチドが、配列番号１、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、請求項１１に記載の分析方法。
14. 可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、完全長タンパク質の細胞外の結合活性を保持するいずれかの完全長ＩＬ−Ｒの可溶性ポリペプチド断片である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分析方法。
15. 可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインを含み、ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含み；ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含み；ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分析方法。
16. 可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１８Ｒポリペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分析方法。
17. 可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、配列番号１３、または配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６、または配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列、
    またはそれらの断片を有する、請求項１５に記載の分析方法。
18. 可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、完全長タンパク質の細胞外の結合活性を保持するいずれかの完全長ＩＬ−ＲＡｃＰの可溶性ポリペプチド断片である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の分析方法。
19. 可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、配列のＮ末端から始めてドメイン１、ドメイン２およびドメイン３と特定される３つの構造ドメインに含まれる３つのＩｇ様ドメインを含み、ドメイン１は、１つのＩｇ様ドメインと２つのジスルフィド結合とを含み；ドメイン２は、１つのＩｇ様ドメインと２つのオーバーラップするジスルフィド結合とを含み；ドメイン３は、１つのＩｇ様ドメインと１つのジスルフィド結合とを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の分析方法。
20. 可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、ＩＬ−１ＲＡｃＰまたはＩＬ−１８ＲＡｃＰポリペプチドである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の分析方法。
21. 可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、配列番号２１、または配列番号２２、または配列番号２３、または配列番号２４、または配列番号２５、または配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、請求項１９に記載の分析方法。
22. 以下の成分：
    （ａ）ＩＬポリペプチド、
    （ｂ）上記ＩＬポリペプチドに結合する可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチド、および、
    （ｃ）ＩＬ−Ｒポリペプチド／ＩＬポリペプチド二元複合体に結合する可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチド
    を含む、または、からなる可溶性三分子複合体。
23. ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰは、哺乳動物由来である、請求項２２に記載の可溶性複合体。
24. ＩＬ、ｓＩＬ−ＲおよびｓＩＬ−ＲＡｃＰが、ヒト、マウスまたはラット由来である、請求項２２に記載の可溶性複合体。
25. ＩＬ、ｓＩＬ−ＲまたはｓＩＬ−ＲＡｃＰの少なくとも１つが、ヒト由来である、請求項２２に記載の可溶性複合体。
26. ＩＬポリペプチドが、配列番号１、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の可溶性複合体。
27. 可溶性ＩＬ−Ｒポリペプチドが、配列番号１３、または配列番号１４、または配列番号１５、または配列番号１６、または配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の可溶性複合体。
28. 可溶性ＩＬ−ＲＡｃＰポリペプチドが、配列番号２１、または配列番号２２、または配列番号２３、または配列番号２４、または配列番号２５、または配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の可溶性複合体。

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