ES2250978T3 - Nuevo metodo de identificacion y examen de moleculas con actividad bilogica. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A MATERIALES, METODOS Y APLICACIONES RELATIVAS A LA MULTIMERIZACION DE MEDIADORES DE PROTEINA DE SUCESOS BIOLOGICOS MEDIANTE AGENTES DE DIMERIZACION SINTETICOS, PREFERIBLEMENTE NO PEPTIDICOS, O CIDS.

Description

Nuevo método de identificación y de examen de moléculas con actividad biológica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a materiales, métodos y aplicaciones de los mismos en relación con la multimerización de mediadores de proteínas en eventos biológicos mediante el empleo de agentes dimerizantes sintéticos, preferiblemente no peptídicos.

Antecedentes de la invención

Existe una considerable cantidad de investigaciones dirigidas a la identificación y caracterización de interacciones proteína-proteína implicadas en la mediación de una serie de eventos biológicos. Existe un creciente número de grupos de investigación en laboratorios académicos e industriales que han enfocado su trabajo a la inhibición de determinadas interacciones proteína-proteína que según se cree son mediadoras de procesos patológicos. Otras investigaciones se han centrado en parte en la dimerización de receptores quiméricos. Los aspectos de dicho trabajo se describen en Spencer y cols., 12 de noviembre 1993, Science 262: 1019-1024 y WO 94/18317 y WO 95/02684.

El tema de la presente invención parte de los trabajos mencionados en varios aspectos. Tiene relación con la promoción de interacciones entre proteínas endógenas que son mediadoras de un evento biológico deseado. La expresión proteínas "endógenas", tal como se utiliza aquí, se refiere a proteínas que se originan sobre una célula o dentro de ella o el organismo invasor de la misma, en contraposición con proteínas "quiméricas" que son el resultado de la expresión de una secuencia de ADN recombinante.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método para identificar un agente capaz de llevar a efecto un evento biológico en una célula, estando mediado dicho evento (o pudiendo estar mediado) por la asociación de dos o más mediadores de proteína, siendo al menos una y normalmente ambas, endógenas. El método implica las etapas de identificación de un primer compuesto capaz de unirse a uno de los mediadores de proteína y un segundo compuesto capaz de unirse al otro mediador de proteína. Los dos compuestos se unen después covalentemente entre sí para formar un inductor químico de dimerización (CID) que es capaz de unirse a ambos mediadores tal como se representa de manera esquemática en la figura 1. Se proporcionan métodos de ensayo para identificar los compuestos de unión monomérica y para evaluar y optimizar los CID producidos a partir de ellos.

En los modos de realización en los que el evento biológico de interés está mediado por la asociación de dos o más copias de la misma especie de mediador, v.g., un receptor para una citoquina, factor de crecimiento u otra hormona, los compuestos primero y segundo pueden ser el mismo compuesto. En dichos casos, el CID es típicamente un homodímero de ese compuesto. Entre los ejemplos de dichos mediadores se incluyen factores de trascripción como por ejemplo la proteína STAT-91 y receptores para las hormonas y factores de crecimiento polipéptido tal como se ilustra en la tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Mediador	Tipo de receptor	Ligando	Aplicación terapéutica
Receptor EPO	Citoquina Clase I	EPO	Anemia
Receptor G-CSF	Citoquina Clase I	G-CSF	Neutropenia
Receptor TPO (c-Mpl)	Citoquina Clase I	TPO	Trombocitopenia
Receptor GH	Citoquina Clase I	GH	Deficiencia GH
Receptor IL-2	Citoquina Clase I	IL-2	Cáncer
Receptor IFN-alfa	Citoquina Clase II	IFN-alfa	Hepatitis C
Receptor IFN-beta	Citoquina Clase II	IFN-beta	Esclerosis múltiple
Receptor de insulina	Tirosina cinasa	Insulina	Diabetes
Receptores Trk	Tirosina cinasa	NTF	Enfermedades SNC

Los factores de crecimiento de polipéptido, citoquinas y hormonas, como insulina, eritropoyetina (EPO), hormona del crecimiento (GH) y factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) activan procesos intracelulares tras la unión a receptores de superficie celular específicos (Ullrich, A. y Schlessinger, J., "Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity", Cell, 61: 203-212 (1990)); Kishimoto, T. Taga, T. y Akira, S., "Cytokine signal transduction", Cell, 76: 253-262 (1994)). Estos receptores están compuestos de tres dominios: un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio de transducción de señal intracelular. Algunos receptores como los receptores para GH y EPO, tienen el dominio de unión a ligando y el dominio de señalización en el mismo polipéptido. Otros, como los receptores para IL-3 e IL-6, tienen subunidades de transducción de señal y de unión a ligando distintas. Actualmente está claro que la transducción de señal mediante citoquinas y factores de crecimiento se lleva a cabo por dimerización de receptor mediada por ligando (Heldin, C.H., "Dimerization of cell surface receptors in signal transduction", Cell, 80: 213-223 (1995); Lemmon, M.A. y Schlessinger, J., "Regulation of signal transduction and signal diversity by receptor oligomerization", Trends Biol., Sci., 19: 459-463 (1994)). Por ejemplo, EGF se une a dos subunidades de receptor con el resultado de la dimerización de los dominios de tirosina cinasa citoplásmicos. Esta asociación de dominios intracelulares estimula la actividad de tirosina cinasa e inicia una cascada de procesos intracelulares. Los últimos trabajos sobre receptores de citoquina han demostrado que su transducción de señal también está mediada por la dimerización de receptor (Murakami, M. y cols., "IL-6-induced homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine kinase", Science, 260: 1808-1810 (1993)).

En contraste con los receptores acoplados a proteína G en los que se requieren cambios conformacionales inducidos por ligando precisos para la iniciación de eventos de señalización, los receptores que se activan por dimerización tan sólo requieren una agregación imprecisa de sus dominios citoplásmicos. Por ejemplo, las células que expresan una variante de receptor de EPO que contiene una cisteína extracelular adicional fueron activados constitutivamente en ausencia de EPO mediante la formación de dímeros de receptor unidos a disulfuro (Watowich y cols., "Homodimerization and constitutive activation of the erythropoietin receptor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2140-2144 (1992)). En otros estudios, anticuerpos bivalentes para receptor de hormona de crecimiento dimerizaron las subunidades de receptor y activaron la proliferación celular mediada por GH (Fuh, G. y cols., "Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor", Science, 256: 1677-1680 (1992)).

En los modos de realización en los que el evento biológico de interés está mediado por la asociación de dos o más proteínas mediadoras diferentes, los compuestos del primer y segundo componente de un CID serán normalmente dos compuestos diferentes. Entre los ejemplos de eventos biológicos que pueden estar mediados por la asociación de diferentes proteínas mediadoras se incluyen activación transcripcional (mediada por asociación de una proteína que contiene un dominio de unión a ADN con una proteína que contiene un dominio de activación transcripcional), el redireccionamiento de una proteína a una localización particular (mediada por asociación de la proteína que se va a redirigir con una proteína de redireccionamiento), incluyendo el redireccionamiento de una proteína para degradación vía el proteosoma, etc.

Cuando los mediadores del evento biológico de interés están presentes dentro de una célula, el contacto de dichas células con una cantidad del CID eficaz para producir la asociación de la(s) proteína(s) mediador(as) tiene como resultado que tenga lugar el evento biológico de interés, v.g. en transcripción genética, localización de proteína, señalización de receptor, etc. El contacto de las células con el agente de dimerización se lleva a efecto por adición del CID al medio de cultivo en el que están desarrollándose las células o, si las células están o pueden estar presentes dentro de un organismo, por administración del CID al organismo. El organismo puede ser una planta o un animal, y en este último caso puede ser un insecto, un mamífero (incluyéndose entre otros, roedores como ratones y ratas, y primates, incluyendo el ser humano) u otro animal. En los casos en los que se administra CID a un animal o un ser humano, se puede administrar en forma de una composición veterinaria o farmacéutica que contiene el CID y uno o más diluyentes, vehículos, adyuvantes adecuados, y similares, tal como se conoce dentro de la especialidad. Dichas composiciones pueden contener vehículos convencionales para los diversos modos de administración incluyendo administración oral y parenteral. Las directrices adicionales sobre dichas composiciones y su administración se pueden adaptar a partir de los detalles descritos en WO 94/18317 (consultar sobre todo pp. 46-48).

Mediadores y eventos biológicos

Los procesos celulares que se pueden disparar por oligomerización incluyen un cambio de estado, como por ejemplo un estado físico, v.g., cambio conformacional, cambio en el socio de unión, muerte celular, iniciación de trascripción, apertura de canal, liberación de ión, v.g., Ca^{+2}, etc. o un estado químico, como por ejemplo una reacción química, v.g., acilación, metilación, hidrólisis, fosforilación o desfosforilación, cambio de estado redox, reorganización, o similar. Cualquiera de estos procesos que se pueden disparar a través de la asociación u oligomerización de constituyentes celulares endógenos entra dentro del marco de la presente invención, incluyendo por ejemplo, señalización disparada por la asociación de mediadores como, por ejemplo, receptores de factor de crecimiento y el "avance" de un constituyente endógeno hacia el entorno celular o destino de otro constituyente endógeno utilizando un agente de dimerización capaz de unirse a otros constituyentes.

Compuestos capaces de unirse a los mediadores: características y métodos para su obtención

Se conocen ya muchos compuestos capaces de unirse a diversos mediadores de proteína de eventos biológicos. Por ejemplo, se conocen muchas benzodiazepinas, prostaglandinas, miméticos de giro-beta, bloqueadores alfa- y beta-, FK506 (y compuestos relacionados como rapamicina y sus análogos), esteroides, retinoides, inhibidores de topoisomerasa y otros ligandos que se unen a sus receptores correspondientes o socios de unión. Otros compuestos capaces de unirse a estos receptores y a otros constituyentes endógenos se pueden identificar fácilmente mediante el uso de una serie de métodos, incluyendo despliegue de fago y otros métodos biológicos para identificar compuestos de unión a peptidilo; diversidad de síntesis o métodos combinatorios (consultar, v.g., Gordon y cols., 1994, J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 y 37(10):1385-1401); y DeWitt y cols., 1993, PNAS USA 90:6909-6913) y programas de detección selectiva o de síntesis convencionales. Al contrario que los programas para diseñar o detectar selectivamente compuestos biológicamente activos como, por ejemplo, inhibidores de enzima o agonistas o antagonistas de receptor, los compuestos de unión para su uso en la presente invención pueden unirse, aunque no tienen por qué necesariamente, al mediador de un modo preciso necesario para inhibir, agonizar o antagonizar (solamente tienen que unirse al mediador). Los compuestos capaces de unirse a una proteína de interés se pueden identificar a través de diversos métodos de purificación de afinidad o por ensayos de unión directa o competitiva, incluyendo ensayos que implican la unión de la proteína a compuestos inmovilizados sobre soportes sólidos como horquillas, perlas, copos, etc.) Ver por ejemplo Gordon y cols., supra.

Por ejemplo, se puede utilizar un ligando conocido para un receptor del siguiente modo para identificar compuestos que se unen al receptor de ligando que se puede utilizar en los CID de la presente invención. Expresado de manera genérica, el método de este modo de realización emplea: (1) un péptido que contiene un dominio de unión a ligando de un receptor de interés (que puede ser receptor intacto, el dominio de unión a ligando del mismo o una proteína de fusión que contiene el dominio de unión a ligando del receptor fundido con la secuencia de proteína heteróloga, colectivamente denominado "receptor" en la explicación que se expone a continuación), (2) un ligando para el receptor que es capaz de unirse selectivamente al receptor para formar un complejo ligando-receptor y (3) un compuesto ("la sustancia de ensayo") que se va a evaluar para determinar su capacidad de unión competitiva al receptor. El método se lleva a cabo combinando los tres componentes que se han mencionado, o composiciones que los contienen; incubando la mezcla de ensayo resultante en condiciones que permitan la formación de un complejo ligando-receptor; y midiendo la capacidad de la sustancia de ensayo para competir con el ligando por la unión al receptor o para bloquear si no la formación o reducir el nivel observado de complejo receptor-ligando. Este método es un método potente y general, y deberá ser aplicable a cualquier pareja receptor-ligando y susceptible de diversas configuraciones, incluyendo formatos tanto in vitro como in vivo. Dependiendo de la configuración de ensayo específica, puede ser importante utilizar concentraciones de receptor, ligando y/o sustancia de ensayo conocidas. Con fines comparativos, se puede llevar a cabo el ensayo también en ausencia de la sustancia de ensayo o en presencia de diversas concentraciones de la sustancia de ensayo. Es posible llevar a cabo la etapa de medida sometiendo a ensayo el complejo receptor-ligando, receptor sin formar complejo y/o sustancia de ensayo sin formar complejo o midiendo la ocurrencia de un evento mediado por la presencia o formación del complejo receptor-ligando, o un complejo receptor-sustancia de ensayo. Por ejemplo, en un modo de realización, se inmoviliza y se incuba un ligando para un receptor, en condiciones que permitan la unión receptor-ligando, con un receptor etiquetado, o un péptido etiquetado que contiene un dominio de unión a ligando del receptor, en presencia y ausencia de una sustancia de ensayo o composición que contiene una sustancia de ensayo. La presencia de una sustancia de ensayo que compite con el ligando por la unión de receptor está correlacionada con una disminución del receptor etiquetado (o dominio etiquetado) unido al ligando inmovilizado, o con un aumento del receptor etiquetado sin unir (o dominio etiquetado). Se conocen diversas etiquetas adecuadas para dichos propósitos dentro de la especialidad, pudiendo seleccionarse en función de factores como el coste, la disponibilidad, la comodidad y la familiaridad por parte del médico.

La sustancia de ensayo puede estar presente en una solución, que se denominará solución de ensayo. Alternativamente, especialmente para ensayos in vitro, la sustancia de ensayo puede estar presente en una mezcla de ensayo que consiste en una emulsión, suspensión y otra mezcla; expuesta sobre la superficie de una célula, virus, fago, etc.; o inmovilizada sobre un soporte sólido.

En un formato in vitro, se lleva a cabo un ensayo de unión para identificar un compuesto capaz de unirse al receptor en presencia de un ligando para ese receptor o, si no, capaz de bloquear la formación o reducir el nivel observado de complejo receptor-ligando. En un modo de realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitivo en el que se combinan los tres componentes y se incuban en condiciones que permitan la formación de un complejo receptor-ligando. Se determina la capacidad de la sustancia de ensayo para unirse al receptor seleccionado o, si no, bloquear la interacción mediada por receptor en presencia del ligando de receptor.

La unión al receptor o, si no, el bloqueo de la interacción mediada por receptor pueden medirse directa o indirectamente (v.g., BIAcore® y otras tecnologías SPR (BIAtecnhology Handbook; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia, 1994), anisotropía de fluorescencia y tecnologías asociadas (Luminescent Spectroscopy of Proteins, 164 pp. E.A. Permyakov, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1992), citometría de flujo y tecnologías asociadas (Flow Cytometry and Cell Sorting, 223 pp. A Radbruch, ed. Springer-Verlag, Nueva York, NY, 1992), ELISA, RIA y metodologías asociadas (An Introduction of Radioimmunoassays and Related Tecniques, 290 pp. T. Chard, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Países Bajos, 1990), interacciones de afinidad competitivas y no competitivas (Immobilized Affinity Ligand Techniques, 454 pp., G.T. Hermanson, A.K. Mallia and P.K. Smith, eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1992).

En ensayos de unión competitiva, si la unión del receptor y su ligando tiene lugar en un menor grado en presencia de la sustancia de ensayo que en su ausencia, por ejemplo, si la presencia de la sustancia de ensayo reduce la concentración de complejo receptor-ligando o aumenta la concentración de receptor o ligando sin formar complejo (es decir, entre sí), entonces la sustancia de ensayo es un agente de unión a receptor. Si la estructura del agente de unión así identificado no se sabe aún, el compuesto puede aislarse entonces de los demás componentes de ensayo y caracterizarse. Se puede volver a evaluar, si se desea, empleando ensayos de unión similares con diferentes parejas receptor-ligando para confirmar la selectividad de la interacción con el receptor con el que se identificó. Si se desea, puede caracterizarse bioquímicamente la unión del agente de unión con el receptor con el que se había identificado, v.g., a través del uso de tecnología BIAcore®, que se describirá más adelante con más detalle. Se puede someter a ensayo el agente de unión así identificado en un ensayo in vivo, tal como se describe más adelante y se puede evaluar posteriormente en monómero y/o forma CID para determinar su actividad farmacológica en diversos ensayos in vitro y/o in vivo, según se desee.

Los ensayos in vivo se pueden llevar a cabo de manera análoga utilizando células que contienen el dominio de unión a ligando de interés y un ligando del mismo. Se cultivan las células o se mantienen en un medio adecuado para el crecimiento celular. Se añade la sustancia de ensayo a las células, v.g., al medio en el que se cultivan las células y se incuba el cultivo en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el receptor y su ligando. Si la unión del receptor y su ligando tiene lugar en un menor grado en presencia de la sustancia de ensayo que en su ausencia, por ejemplo, si la presencia de la sustancia de ensayo reduce la concentración del complejo receptor-ligando o aumenta la concentración de un ligando sin formar complejo, entonces la sustancia de ensayo es un agente de unión. La presencia o ausencia de complejo receptor-ligando puede medirse directa o indirectamente (v.g., midiendo la ocurrencia de un evento mediado por la presencia o formación del complejo receptor-ligando o un complejo receptor-sustancia de ensayo).

Un formato in vivo ilustrativo se basa en células obtenidas por ingeniería genética capaces de expresar un gen informador bajo control trascripcional mediado por receptor. Estas células contienen y son capaces de expresar ADNs recombinantes que codifican una proteína de fusión que comprende, entre otras regiones de componente, al menos un dominio de unión a ligando del receptor de interés. Las proteínas de fusión son capaces de unirse al ligando para el receptor y en presencia del ligando son capaces de formar un complejo (dimerización) entre sí, tal como se ilustra en la figura 6. En presencia del ligando, v.g., cuando se mantienen en un medio de cultivo que contiene ligando, las células expresan el gen informador (a no ser que esté presente una sustancia que se una al dominio de receptor o, si no, bloquee la asociación de las proteínas de fusión necesaria para la trascripción del gen informador). En este ensayo, se cultivan las células o se mantienen en un medio de cultivo adecuado al que se añade una cantidad de ligando seleccionada para establecer una línea de referencia para la expresión del gen informador. A continuación, se añade la sustancia de ensayo al medio del cultivo y se mide la capacidad de la sustancia de ensayo de inhibir la expresión del gen informador. Si se reduce el nivel de expresión de gen informador en presencia de la sustancia de ensayo, la sustancia de ensayo es un agente de bloqueo con respecto a las moléculas receptoras quiméricas implicadas en el control trascripcional. Si la estructura del agente de bloqueo así identificado sigue sin conocerse, se puede aislar entonces el compuesto de los demás componentes de ensayo y caracterizar. Se puede re-evaluar, si se desea, utilizando células obtenidas por ingeniería que contienen una proteína de fusión basada en un receptor diferente, en medio que contiene ligando para ese receptor, para confirmar la selectividad de la interacción con el dominio de receptor con el que fue identificado. Si se desea, se puede determinar la afinidad de unión del agente de bloqueo para el receptor con el que fue determinado, por ejemplo a través del uso de tecnología BIAcore®. El agente de bloqueo así identificado puede ser sometido a ensayo en un ensayo de unión in vitro, tal como se ha descrito, y puede ser evaluado posteriormente para determinar su actividad farmacológica en diversos ensayos in vitro y/o in vivo, según se desee, también en este caso en forma de monómero y/o CID (es decir, dimerizado).

Los agentes de unión identificados a partir de dichos métodos para su uso en la construcción de CIDs según la presente invención se pueden identificar a partir de bibliotecas de péptido así como a partir de las sustancias de ensayo obtenidas a partir de un amplio abanico de fuentes incluyendo, v.g., caldos de cultivo microbianos; extractos celulares; medios acondicionados a partir de líneas celulares o a partir de células huésped transformadas con bibliotecas genéticas; colecciones de compuestos sintéticos; bibliotecas combinatorias o programas de síntesis basados en métodos de química médica convencionales o de diseño de fármacos basados en estructura.

La presente invención proporciona por lo tanto un medio para identificar la unión selectiva o agentes de bloqueo. Los compuestos así identificados se pueden unir covalentemente utilizando fracciones de unión, v.g., adaptando los métodos descritos en WO 94/18317 y WO 95/02864 para formar los CID de la presente invención. Las fracciones del agente de unión no tienen por qué contener elementos esenciales para la unión de los mediadores de interés, y se pueden seleccionar a partir de una amplia gama de tipos estructurales. Las fracciones preferibles incluyen alquilo de C_{2}-C_{20}, arilo o estructuras de dialquilarillo.

Se pretende que alquilo incluya hidrocarburos alifáticos policíclicos, cíclicos, de cadena lineal o ramificada, saturados o insaturados, que pueden contener oxígeno, azufre o nitrógeno en lugar de uno o más átomos de carbono y que están sustituidos opcionalmente por uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi de C_{1}-C_{8}, aciloxi, carbamoílo, amino, N-acilamino, cetona, halógeno, ciano, carboxilo y arilo (a no ser que se especifique de otra forma, los grupos alquilo, alcoxi y acilo contienen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono alifáticos contiguos).

Se pretende que arilo incluya fracciones de C_{3}-C_{14} cíclicas, heterocíclicas, policíclicas y poliheterocíclicas insaturadas, estables, incluyéndose entre sus ejemplos, sin limitarse sólo a ellas fenilo, bifenilo, naftilo, piridilo, furilo, tiofenilo, imidazoílo, pirimidinilo y oxazoílo; que pueden estar sustiutidas con uno a cinco miembros seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi de C_{1}-C_{8}, alquilo de cadena lineal o ramificada de C_{1}-C_{8}, aciloxi, carbamoílo, amino, N-acilamino, nitro, halógeno, trifluorometilo, ciano y carboxilo (consultar, v.g., Katritzky, Handbook of Heterocyclic Chemistry).

Las fracciones del agente de unión pueden estar unidas convenientemente a las fracciones de unión a través de grupos funcionales como éteres, amidas, ureas, carbamatos y ésteres; o a través de uniones carbono-carbono alquilo-alquilo, alquilo-arilo o arilo-arilo. Asimismo, las fracciones del agente de unión pueden optimizarse (v.g., por modificación de longitud de cadena y/o sustituyentes) para potenciar las propiedades farmacocinéticas del agente de multimerización. En los casos en los que los compuestos se identifican mientras están inmovilizados, se pueden unir convenientemente utilizando los grupos funcionales mediante los cuales se han inmovilizado. Los compuestos peptidilo pueden unirse a través de uniones péptido, si bien los agentes preferibles de la presente invención no son polipéptidos u oligopéptidos. Los agentes de dimerización divalentes de la presente invención retienen la capacidad de unión en relación con las dos proteínas de interés. Según esto, se someterán a ensayo normalmente los CID unidos convalentemente (v.g., como se ha mencionado) para confirmar la retención de la capacidad de unión con respecto a cada una de las proteínas de interés y/o en los ensayos basados en células tal como se describe a continuación.

Los autores de la presente invención han advertido que en el diseño de los CID, la selección de compuestos que se unen a las proteínas de interés a partir de bibliotecas combinatorias inmovilizadas sobre soportes sólidos, como por ejemplo perlas, proporciona una útil ventaja. Si bien esto sigue entrañando la identificación de un nuevo ligando para la proteína de interés en lugar de la selección de un compuesto conocido previamente, el propio hecho de descubrirlo explica de manera precisa cómo es posible unir el tetero covalente para unir los dos compuestos para formar el CID. Esto es así porque los miembros de una biblioteca combinatoria inmovilizada están ya unidos covalentemente a su soporte. Según esto, se puede utilizar la misma química para ensamblar el CID que la que fue utilizada para inmovilizar los miembros individuales de la biblioteca. Por otra parte, dado que los miembros de la biblioteca seleccionada se seleccionan por su capacidad para unirse a sus receptores correspondientes (u otros socios de unión a proteína), necesariamente, el agente de unión que une covalentemente al miembro de la biblioteca con el soporte no debe interferir con la interacción de unión entre el miembro de biblioteca y la proteína de interés.

Ensayos para evaluación funcional de CIDs

Los autores de la invención también proporcionan métodos de ensayo a base de células generales para la caracterización funcional de los CID. Dichos ensayos se basan en células obtenidas por ingeniería genética con arreglo al sistema descrito en WO 94/18317. Las células se diseñan por ingeniería para que contengan y sean capaces de expresar ADNs recombinantes que codifican proteínas quiméricas capaces, tras su asociación o dimerización, de activar la transcripción, directa o indirectamente, de un gen informador bajo el control transcripcional de un promotor, potenciador u otro elemento regulador transcripcional, que responda a la asociación de proteínas quiméricas. Dichos materiales, métodos y diseños y principios de construcción para constructos relevantes y su uso se describen en WO 94/18317 y pueden adaptarse para su uso en la práctica de la presente invención tal como se ilustra en el ejemplo que se expone a continuación. En un modo de realización, se obtienen por ingeniería genética células Jurkat para que contengan un gen informador, como por ejemplo fosfatasa alcalina secretada (si bien se puede utilizar cualquier informador convenientemente detectado, incluyendo beta-galactosidasa o luciferasa, por ejemplo) bajo el control de expresión del sistema NF-AT, cuyos detalles se proporcionan en el documento PCT antes mencionado. Las células descritas en el documento PCT fueron diseñadas por ingeniería para que contuvieran y expresaran una secuencia de ADN recombinante que codifica una proteína quimérica que comprende una señal de miristoílación, la cola citoplásmica de la cadena zeta del receptor de célula T y uno o más dominios de unión a ligando derivados de FKBP12. Se prepararon las células del ensayo de los autores de la invención de manera análoga, pero que expresaban una o más proteínas quiméricas que contenían, en lugar del dominio FKBP12, parte o todo el mediador de proteína de interés. Cuando interesa la dimerización de dos mediadores de proteína diferentes, se diseñan por ingeniería las células para que expresen una proteína quimérica, tal como se ha descrito, que corresponde a cada uno de los mediadores de proteína de interés. La presencia de un CID que sea capaz de unirse a dos moléculas de la(s) proteína(s) quimérica(s) induce la asociación o dimerización de las proteínas quiméricas. Dicha dimerización dispara una señal de activación transcripcional que se recibe mediante los elementos de control transcripcionales para el gen informador y se detecta fácilmente midiendo la expresión de la molécula informadora tal como se representa esquemáticamente en la figura 2. Los detalles completos y las directrices generales para el ensamblaje de dichos constructos, ingeniería de las células y detección de la molécula informadora se exponen en el documento PCT. Ver v.g., Figs. 14,15 y 18-21 y los ejemplos correspondientes en dicho documento. También en este caso, la adaptación de dicho sistema para proporcionar células para someter a ensayo los CID de la presente invención se lleva a cabo fácilmente reemplazando la(s) secuencia(s) de ADN que codifican los dominios FKBP con la secuencia de ADN que codifica el mediador de proteína de interés (por ejemplo el dominio intracelular o extracelular del receptor para insulina o eritropoyetina, u otro factor de crecimiento) teniendo cuidado de que la región de codificación completa de cada constructo resultante quede en el
marco.

Con el empleo de dichas células diseñadas por ingeniería se pueden caracterizar funcionalmente los CID de la presente invención desarrollando las células diseñadas por ingeniería en cultivo, exponiéndolas a los CID de interés por adición de una cantidad (normalmente una cantidad determinada previamente) del CID de interés al medio de cultivo y detectando la cantidad del informador producida como respuesta al CID. Pueden evaluarse comparativamente los CID candidato que contienen una o más variaciones estructurales en sus fracciones de unión a componente o fracción de unión y, de esta forma, se pueden optimizar los CIDs para aplicaciones concretas.

Como método alternativo para células diseñadas por ingeniería genética para dichos propósitos de ensayo, se puede utilizar un diseño modificado para "receptores" quiméricos que se unan a los CID y disparar la trascripción del gen informador. En este método, los receptores quiméricos contienen una fracción de señalización como, por ejemplo, la cadena zeta, como se ha mencionado, un dominio de extensión de membrana y, como dominio extracelular, una o más copias de un dominio que corresponde al mediador de proteína de interés de las proteínas quiméricas. Se puede llevar a cabo el ensayo tal como se ha descrito anteriormente. No obstante, en esta modificación, se seleccionan los CID extracelularmente, en lugar de intracelularmente, tal como se describe esquemáticamente en la figura 3. Este método será preferible normalmente para evaluar peptidilo u otros CID que no entran fácilmente en las células.

Tal como se ha mencionado al principio, hay una amplia variedad de pares receptor/ligando que participan en una serie de eventos importantes farmacológicamente entre los que se incluyen anemia, neutropenia, trombocitopenia, cáncer, MS, diabetes, trastornos de SNC, etc. y su tratamiento. Por consiguiente, los CID de la presente invención pueden ser útiles para diversos fines clínicamente importantes, así como para propósitos de investigación para sondear la biología de fenómenos mediados por receptor.

En términos generales, los CID de la presente invención se pueden emplear para promover el que tengan lugar eventos biológicos que son el resultado de interacciones moleculares mediadas por un receptor de interés. La presente invención proporciona pues un método y reactivos para promover la interacción entre proteínas endógenas y así promover una actividad biológica mediada por dicha interacción. En este método, se combina o se pone en contacto un CID de la presente invención con el receptor de interés, por ejemplo introduciendo el CID en una célula en la que se ha de promover la interacción medida por receptor. Tras la introducción del CID, se promueve la asociación mutua o dimerización de la proteína endógena a la que se une CID, tal como se puede detectar fácilmente. La promoción de dichas interacciones puede ser útil en la investigación dirigida a una mejor comprensión de la biología de los eventos mediados por receptor.

Dichos CID serían útiles, por ejemplo, para el diagnóstico, prevención o tratamiento de estados patológicos o enfermedades que se pueden curar, o cuyos síntomas se pueden aliviar total o parcialmente, mediante el suceso de procesos celulares mediados por una interacción mediada por receptor. Por ejemplo, se puede tratar a un paciente para prevenir o aliviar el suceso o progresión de anemia, trombocitopenia o neutropenia mediante la administración de un CID capaz de promover la dimerización de moléculas de receptor para EPO, TPO o G-CSF, respectivamente.

Se puede formular un CID de la presente invención en una composición farmacéutica que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro(s) excipiente(s) utilizando materiales y medios convencionales. Dicha composición se puede administrar a un animal, ya sea humano o no, para la terapia de una enfermedad o estado patológico que responda a la promoción de eventos celulares que impliquen la mutua interacción de moléculas de proteínas endógenas. La administración de dichas composiciones puede llevarse a cabo a través de cualquiera de las rutas convencionales (parenteral, oral, inhalación y similares) utilizando formulaciones apropiadas, tal como se conoce en la técnica. Los CID pueden emplearse en combinación con excipientes convencionales, es decir, sustancias de vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración parenteral.

La presente invención no ha de limitarse en su marco a los modos de realización ilustrativos específicos que se han descrito. A este respecto, para las personas especializadas en este campo serán evidentes diversas modificaciones de la invención aparte de las aquí mencionadas en la descripción expuesta. Se pretende que dichas modificaciones entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Se han citado en el presente documento diversas publicaciones cuyas descripciones se incorporan como referencia en él en su totalidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Potenciación de la actividad de fármacos conocidos o compuestos recién seleccionados, o que imparten una actividad, mediante la incorporación de un CID

En este método, se desvía una proteína que funciona sustancialmente únicamente en un solo compartimiento celular, v.g., el citoplasma, a través de la unión con un CID apropiado a un compartimiento celular alternativo en el que carece de bioactividad.

Para diseñar dicho CID, se selecciona un primer compuesto capaz de unirse a la proteína diana. Entre los ejemplos de proteínas diana que funcionan solamente en el citoplasma y no en el núcleo, se incluyen por ejemplo VIH proteasa y diversas proteínas de señalización como zap70, syk y similares. En el caso de VIH proteasa, se han desarrollado inhibidores de VIH proteasa permeables a las células a través de una serie de grupos y son conocidos en la bibliografía. Véase por ejemplo Lam y cols., 1994, Science 263(5145):380-4 y WO 94/08977.

Se selecciona a continuación un segundo compuesto que se une a un constituyente del compartimiento celular alternativo. También en este caso, la localización de la proteína diana en el compartimiento alternativo no se corresponde con la función biológica de la proteína diana. Cuando el compartimiento alternativo es el núcleo, entre los constituyentes relevantes se incluyen las topoisomerasas a las que se unen etoposida, camptotecina y compuestos relacionados. La síntesis de camptotecina y análogos del mismo es conocida, al igual que se evaluación como inhibidores de topoisomersasa I. Ver por ejemplo Corey y cols., 1975, J. Org. Chem. 40:2140 (síntesis total); Sugimori y cols., 1994, J. Med. Chem. 37(19), 3033-9 (análogos ilustrativos); Prost y cols., 1994, Biochem. Pharmacol. 48(5), 975-84 (experimentos con topo I). Las dianas nucleares alternas incluyen ADN, para los que se conocen numerosos agentes de intercalación. Las dianas alternativas para dirigir una proteína diana a las mitocondrias incluyen citocromos que están presentes solamente en ese compartimiento.

Los compuestos primero y segundo se pueden seleccionar entre compuestos conocidos capaces de unirse a las proteínas correspondientes o se pueden seleccionar a partir de bibliotecas combinatorias, tal como se ha descrito anteriormente. En cualquier caso, se unen covalentemente a través de una fracción de unión, tal como se ha mencionado anteriormente de tal modo que no anulen ninguna de las dos interacciones de unión individuales (es decir, ninguna de las dos proteínas). EL CID resultante se puede evaluar fácilmente para confirmar la retención de un comportamiento de unión adecuado.

Para ilustrar este método, los autores de la invención han diseñado un CID a base de un inhibidor de VIH proteasa y un análogo de camptotecina para su unión a la proteasa VIH y su translocalización al núcleo. La compartimentación incorrecta de la proteasa que resulta de la translocalización tiene como objetivo inactivar de manera efectiva la VIH proteasa. Dichos CID se pueden unir al sitio activo de proteasa e inhibir su actividad enzimática al igual que lo hacen otras moléculas de inhibidor de HIV proteasa. Pero ya lo hagan o no, estos CID están diseñados para anular la actividad de proteasa por translocalización de un compartimiento celular incorrecto.

En nuestro método ilustrativo, se obtienen S-10-hidroxicamptotecina (3) y otros análogos de camptotecina a través de procedimientos conocidos. Véase v.g., Kingsbury y cols. 1991, J. Med. Chem., 34(1), 98-107. Véase también, Luzzio y cols., Eur. Pat. Appl. EP 540099. Se puede unir hidroxicamptotecina a un inhibidor de HIV proteasa (2) (véase Lam y cols. y WO 94/08977, ambas supra, para formar el CID (1).

1

tal como se representa esquemáticamente a continuación (véase Kingsbury y cols.):

2

Ejemplo 2

El método del ejemplo 1 se puede aplicar a otras dianas citoplásmicas, v.g., zap70, para ilustrar el redireccionamiento de un mediador de transducción de señal. Si bien algunos grupos están investigando activamente ya para hallar compuestos que se unen e inhiben específicamente zap70, un CID según la presente invención que contenga una molécula de unión a zap70 (incluso una molécula que no inhiba sola las interacciones de zap70 o la actividad biológica) unida a una fracción de redireccionamiento como, por ejemplo, una fracción camptotecina o similar o una fracción de redireccionamiento de protesoma (véase más adelante) translocalizaría la diana a un compartimiento incorrecto, es decir, una localización celular, que no se correspondería con su funcionamiento biológico normal, o al proteosoma en el que se puede eliminar del sistema por degradación.

Ejemplo 3

Un ejemplo ilustrativo adicional implica el redireccionamiento de una proteína celular o componente de virus como VIH a los trayectos de degradación proteosómicas utilizando CIDs. Estos CIDs tienen un componente, moléculas conocidas (o seleccionadas) para su unión a proteínas virales como AZT y, como segundo componente, una molécula que se une a los componentes de proteosoma como LMP7, LMP2 (Martínez and Monoco, Nature 353:664, 1991) u otros componentes responsables, al menos parcialmente, de la función proteosoma y la especificidad de sustrato (Gaszynska, M. y cols. Nature 365.264, 1993; A. Skiyama y cols., FEBS-Lett. 343: 85-88, 1994; y Shimbara y cols. J. Biochem. 115:257, 1994). Al igual que en los otros modos de realización de la presente invención se pueden seleccionar los compuestos de unión a partir de compuestos conocidos previamente que, según se sabe o se cree, poseen las propiedades de unión deseables, o se pueden seleccionar utilizando ensayos de unión convencionales u otros ensayos a partir de colecciones de compuestos seleccionados por detección selectiva frente a la proteína de interés (expresada por ejemplo empleando métodos y materiales convencionales). Estos CID se diseñan para que induzcan la proximidad física de las proteínas virales o celulares objetivo para el proteosoma, con el resultado de la rápida destrucción de la proteína celular o viral.

Así pues, las moléculas que se unen a la proteosoma pueden identificarse por detección selectiva de las colecciones de compuestos o a través de los diversos métodos que se han descrito. Asimismo, se pueden seleccionar los compuestos a partir de bibliotecas combinatorias o a partir del almacenamiento de compuestos conocidos previamente que sean capaces de unirse a proteínas VIH esenciales, incluyendo AZT y análogos de los mismos y cualquiera de las registradas que se unen a VIH proteasa. A continuación se une covalentemente un compuesto que se une a un componente proteosoma a uno de los compuestos capaces de unirse al componente VIH diana.

La eficacia de los CID de inducir la dimerización puede someterse a ensayo utilizando el ensayo basado en células que se ha descrito. Dicho método permite una evaluación comparativa de modificaciones del diseño de CID, incluyendo modificaciones de las moléculas de unión, fracción de unión y uniones específicas. Una vez confirmada la actividad deseada en la inducción de dimerización y activación de la quimera de cadena zeta, se pueden someter a ensayo los CID para determinar la actividad biológica pretendida, v.g,. la capacidad de deshacerse de células cultivadas de la proteína diana, utilizando ensayos como mancha de western y otros métodos o bioensayos estable-
cidos.

Ejemplo 4

Otra modificación ilustrativa más implica la selección de un compuesto capaz de unirse a una clase de proteínas denominadas enzimas E3 (véase Ciechanover, 1994, Cel 79:13-21 y los documentos de referencia ahí citados). Éstas hacen que las proteínas a las que se unen estén en todas partes y, por tanto, se redirijan para degradación de proteína. Un ejemplo de una proteína que actúa a través de este principio es la proteína E6 del virus papiloma. Se une a una proteína E3 denominada E6AP (proteína asociada a E6). E6 también se une a p53, quedando en íntima proximada p53 a E6AP y E3 ligasa hace que esté en todas partes que por tanto se degrade.

Los CID de este aspecto de la invención están diseñados para contener una fracción seleccionada por su capacidad para unirse a una enzima E3 covalentemente unida a una fracción seleccionada para unirse a proteína celular, viral u otra proteína que se va a eliminar (v.g., HIV proteasa, zap70 etc.). La unión del CID con la proteína redirigida pretende tener como resultado la ubicuización y por tanto la degradación de la proteína redirigida mediante la
célula.

Ejemplo 5 Ensayo de unión competitiva in vitro para la unión de compuestos para su uso en la preparación de CIDs

El dominio de unión de ligando extracelular se puede expresar y purificar empleando el ADNc de receptor clonado. La identificación del dominio extracelular de receptor se puede llevar a cabo llevando a cabo un análisis de Kyte-Doolittle sobre la secuencia de codificación. En el caso de los receptores de factor de crecimiento y citoquina, el dominio extracelular es N-terminal del dominio de extensión de transmembrana (TM). El dominio TM marca el extremo del dominio de unión a ligando y en el perfil de Kyte-Doolittle se demarca a través de un alto índice de hidrofobicidad a lo largo de una distancia de 20-30 aminoácidos. Para un ejemplo del análisis de Kyte-Doolittle de receptor de EPO consultar la patente EE.UU. Nº 5.278.065. Véase también la patente EE.UU. Nº 5.292.654 (mutante EPO-R). Para producir el dominio de unión a ligando de un receptor, se clona el ADNc que codifica el dominio extracelular en un vector de expresión apropiado como pET11a (Invitrogen) para E.coli, pVL1393 (Invitrogen) para células de insecto o pcADN (invitrogen) para células de mamífero. Se introduce un codón de parada en el primer aminoácido del dominio de TM o antes de él. Cuando se expresa el receptor soluble así denominado en levadura, células de insecto o células de mamífero, se secreta la proteína en el medio de cultivo celular (véase Kikuchi y cols., J. Immunol. Methods 167:289 1994). Alternativamente, cuando el dominio de unión de ligando se expresa en E.coli, el receptor soluble se recoge en el espacio periplásmico (véase Cunningham y cols., Science 254:821 1991). Para facilitar la purificación y los ensayos de unión se puede expresar el dominio extracelular fusionado con una etiqueta de epitopo como por ejemplo el epitopo para el anticuerpo anti-myc 9E10 o el epítopo "Flag" (IBI) (véase Kolodziej y Young, Methods Enzymol 194:508 (1991)). Alternativamente, el dominio de unión a ligando se puede expresar fusionado con la cadena pesada de una inmunoglobulina, tal como se describe en (Ashkenazi y cols., PNAS 88:10535 1991). El dominio de unión a ligando se puede expresar en E. coli, levadura, células de insecto, células de mamífero o producirse utilizando un sistema de transcripción/traducción in vitro (Promega). La expresión en células de mamífero se puede llevar a cabo utilizando expresión transitoria o por selección estable de clones mediante el uso de un fármaco seleccionable, como por ejemplo G418. Para los detalles sobre los sistemas de expresión, consultar Goeddel (ed.). Methods Enzymol vo. 185, 1990). Véase también la figura 7.

La purificación de la proteína expresada se puede llevar a cabo a través de métodos cromatográficos normales, por cromatografía de afinidad de ligando o a través del socio de fusión, como por ejemplo un epitopo de anticuerpo o cadena pesada de inmunoglobulina.

Para llevar a cabo el ensayo de los compuestos que bloquean las interacciones ligando-receptor, primero se inmoviliza el dominio de unión a ligando purificado en una placa de microvaloración con un compuesto de ensayo y un ligando radioetiquetado. Típicamente, se yoda el ligando por ejemplo, como en Pennica y cols. Biochemistry 31:1134 1992. Tras un período de incubación adecuado, se lavan los pocillos con tampón y se determina el ligando unido por centelleo o recuento gamma. Los compuestos que interfieren con la unión del ligando se detectan mediante una reducción de la radioactividad unida a la placa. El dominio de unión de ligando se puede diseñar por ingeniería para facilitar diversos aspectos de ensayo. Por ejemplo, si el dominio de unión de ligando a receptor se expresa como una proteína de fusión con una cadena pesada de inmunoglobulina, se puede unir la proteína a la placa de microvaloración a través de un anticuerpo con la región constante de cadena pesada. Alternativamente, se puede llevar a cabo el ensayo en solución y después separar el ligando unido y no unido por inmunoprecipitación utilizando sefarosa de proteína A o Pansorbina (Calbiochem), consultar Pennica y cols. Biochemistry 31:1134, 1992. Por otra parte, se pueden introducir las sustituciones de aminoácido en el ligando para prevenir la dimerización del receptor (véase Fuh y cols., Science 256:1677, 1992). Esto facilitará la detección de moléculas pequeñas orgánicas que interfieren con la unión de
ligando.

Pueden ser también ventajosas otras configuraciones de ensayo de unión. Por ejemplo, se puede unir el ligando a una placa e incubar después el compuesto de ensayo en solución con el receptor soluble. Transcurrido un tiempo adecuado, se lavan los pocillos y se detecta la cantidad de receptor unido. La detección se puede conseguir por radioetiquetado directo del receptor o a través de una etiqueta en el receptor. Por ejemplo, ELISA a través de una etiqueta de epítopo, ELISA a través de un epítopo de no interferencia o a través de biotina que se puede utilizar para etiquetar el receptor. Un ensayo alternativo utiliza el BIAcore en el que se inmoviliza el ligando en la célula de flujo ("chip") y se mide la unión del ligando en ausencia o presencia del compuesto de ensayo (véase Corcoran y cols., Eur. J. Biochem. 223:831 1994).

Ejemplo 6 Identificación de moléculas de unión a receptor a partir de bibliotecas de diversidad molecular sintéticas

Los nuevos ligandos se pueden identificar también utilizando bibliotecas combinatorias sintéticas inmovilizadas sobre perlas, (Gordon, E.M. Barrett, R.W. Dower, W.J. Fodor, S.P. y Gallop, M.A., "Applications of combinatorial tecnhologies to drug discovery. 2. Combinatorial organic synthesis, library screening strategies, and future directions", J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994) que contienen cada una de ellas un compuesto único. Empleando métodos y materiales conocidos, se pueden sintetizar bibliotecas de millones de péptidos y ligandos no péptido. Para la detección selectiva de la biblioteca, se etiqueta el dominio extracelular de receptor purificado, después se incuba con las perlas en un tampón apropiado. Después del lavado de la mezcla, se identifican las perlas que se han unido a receptor. Se aíslan las perlas seleccionadas y se determina la estructura del compuesto sobre la perla (véase figura 5). Se conocen diversos materiales y métodos en la especialidad que son adecuados para el etiquetado del receptor para que se pueda detectar la perla. Entre ellos se incluyen el etiquetado del receptor utilizando una molécula fluorescente, biotina o una etiqueta epítopo fusionadas con el dominio. La visualización se puede llevar a cabo por microscopía de fluorescencia o un ensayo de enzima unida utilizando un sustrato que hace observable la perla con receptor unido. Se han utilizado bibliotecas combinatorias inmovilizadas, por ejemplo, para identificar ligandos que se unen al dominio Src SH3 (Yu, H. Chen, J.K. Feng, S. Dalgarno, D.C. Brauer, A.W., y Schreiber, S.L. "Structural Basis or the binding of proline-rich peptides to SH3 domains", Cell, 76:933-945 (1994)).

Ejemplo 7 Antagonismo de activación celular mediada por ligando

La agregación del dominio intracelular de la cadena zeta de células T activa la producción de IL-2 en células T (Irving, B.A. and Weiss, A., "El dominio citoplásmico de la cadena z de receptor de células T es suficiente para acoplarse con trayectos de transducción de señal asociados a receptor", Cell, 64:891-901 (1991)). Se pueden establecer líneas celulares en las que la transducción de señal de células T y la producción de IL-2 (o la producción de un producto codificado por un gen informador bajo el control transcripcional NFAT) se estimula mediante la adición al medio en el que se están manteniendo las células de un factor de crecimiento como, por ejemplo, EPO. En dicha línea célular diseñada por ingeniería, el ligando dimeriza su receptor, agregando así el dominio intracelular de subunidad zeta y activando la transcripción controlada por NFAT.

Se construye una quimera de receptor por PCR o por mutagénesis de supresión específica de sitio para codificar la unión de ligando a receptor (dominio extracelular) fusionado con la transmembrana y el dominio intracelular de la cadena zeta de receptor de células T. Los métodos para crear dicho quimérico con la cadena zeta se describen en Irving y Weiss, Cell 64: 891 (1991) y Spencer y cols. Science 262, 1019 (1993). Los métodos adicionales para crear quimeras de receptor de citona se pueden encontrar en Fuh y cols. Science 256:1677 (1992). Un ADNc que codifica la quimera de cadena zeta-receptor se inserta en un vector de expresión de mamífero, tal como describe Spencer y cols. Se introduce el vector de expresión de receptor en células Jurkat, una línea de célula T, junto con un gen informador de IL-2 bajo el control del NFAT. Se seleccionan las células que expresan establemente tanto la quimera de receptor como el gen informador mediante selección G418 y la detección del receptor en la superficie celular mediante FACS.

Se incuban los compuestos de ensayo con las células en presencia del ligando. Los compuestos que se unen al receptor e interfieren con la unión de ligando (y la activación de receptor) bloquearán la producción de IL-2. Se pueden utilizar informadors alternativos para la expresión de gen dependiente de NFAT, como por ejemplo beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina o luciferasa, en lugar de IL-2. Se pueden llevar a cabo los controles apropiados para eliminar moléculas que actúan no específicamente. El acoplamiento de un receptor con la cadena zeta en una línea celular estable proporciona un ensayo funcional mucho más sensible que el uso de bioensayos de célula primarios. Esto también permite seleccionar un tipo de célula más robusta adecuado para la detección selectiva de bibliotecas químicas y de productos naturales.

Se pueden utilizar los sistemas celulares alternativos como, por ejemplo, la línea celular PFDC-P1, dependiente de G-CSF para su crecimiento (Fuh y cols., Science 256:1677 1992). La expresión en células FDC-P1 de un receptor quimérico que contiene un dominio de unión a ligando y la trasmembrana y el dominio intracelular del receptor G-CSF tienen como resultado células que son dependientes del ligando de interés para su proliferación. Los compuestos de ensayo que interfieren con la unión del ligando al dominio de receptor bloquearán la proliferación celular mediada por ligando.

Claims (7)

1. Un método para producir un agente no peptídico capaz de activar un trayecto de transducción de señal celular mediado por un polipéptido seleccionado entre un factor de crecimiento, citoquina y hormona, comprendiendo dicho método:

(a) identificar un primer compuesto no péptido capaz de unirse selectivamente a un receptor endógeno para dicho polipéptido;

(b) identificar un segundo compuesto no péptido capaz de unirse selectivamente a un receptor endógeno para dicho polipéptido; y

(c) unir covalentemente los compuestos no péptidos primero y segundo entre sí para formar un agente no peptídico que es capaz de unirse selectivamente a más de una de las moléculas de receptor.

2. Un método según la reivindicación 1 en el que los compuestos primero y segundo son el mismo.

3. Un método según la reivindicación 1 en el que los compuestos primero y segundo son diferentes.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el receptor es un receptor de superficie celular para una citoquina, factor de crecimiento u hormona.

5. Un método según las reivindicaciones 1 a 4 en el que el receptor es un receptor para EPO, G-CSF, TPO, GH, IL-2, interferón alfa, interferón beta, insulina o Trk.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente se une a una porción citoplásmica del receptor.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente se une a una porción extracelular del receptor.