JP3437244B2 - 化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法 - Google Patents

化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法

Info

Publication number
JP3437244B2
JP3437244B2 JP05010994A JP5010994A JP3437244B2 JP 3437244 B2 JP3437244 B2 JP 3437244B2 JP 05010994 A JP05010994 A JP 05010994A JP 5010994 A JP5010994 A JP 5010994A JP 3437244 B2 JP3437244 B2 JP 3437244B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
chemiluminescent
benz
acridinium
test sample
carboxylate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP05010994A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08320319A (ja
Inventor
ロウ セイ−ジョン
ジャン キンピン
フィッシャー ウォルター
ティー ユンガー ジョン
ケイ クローデル エリザベス
Original Assignee
バイエル コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイエル コーポレーション filed Critical バイエル コーポレーション
Publication of JPH08320319A publication Critical patent/JPH08320319A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3437244B2 publication Critical patent/JP3437244B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/18Ring systems of four or more rings
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805Optical property

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は簡単な化学処理により緑
または黄の光を発光する新たな類の化学発光芳香族環融
合アクリジニウム化合物(AFAC)に関するものであ
る。本発明はまたAFACおよび結合パートナー、例え
ば生物学的分子から形成される接合体、並びに該接合体
を利用する試験検定に関するものである。さらに本発明
は、2つ以上の化学発光接合体が有する識別可能な非干
渉発光特性により、試験試料中の2つ以上の物質または
分析物の検出および/または定量を同時に行なえる試験
検定に関するものである。
【0002】
【従来の技術】異なる波長最大値を有し重複が最小であ
るが、発光スペクトルが補正可能な光を放出する化学発
光化合物は、分析検定、特に工業検定、および多数の物
質、例えば多数分析物(multi-analyte )測定のための
臨床診断検定において非常に有用である。そのような化
合物は、結合パートナー、例えば、抗原、抗体、および
核酸のような生物学的分子をタグ付けまたは標識付けす
るのに用いられ、相互に非干渉の、または重複が最小限
の発光信号またはスペクトルを放出できる接合体または
トレーサを形成できる。その信号またはスペクトルによ
り、試験試料中の多数の物質を同時に検出および/また
は定量できる。2つの化学発光化合物は、ピーク高さの
5%より大きい信号強度を有するスペクトル領域が約10
0 −250 nmに亘る発光スペクトルを有するが、信号が
識別できるように発光の最大値が異なるので、例えば、
ある患者の試料からの黄体化ホルモン(LH)および卵
胞刺激ホルモン(FSH)の血清水準の同時測定が可能
であり、これを以下に記載する。ある実施例において、
抗−LHおよび抗−FSHを標識付けまたはタグ付けす
るためには、2つの化学発光信号の発光最大値は、約60
nm、好ましくは80nm以上異なる。ここに記載する方
法により同時測定が可能なさらなる実施例は、増幅核酸
配列、例えば、悪性転換に関連する癌遺伝子の検定につ
いてである。本出願人に譲渡され、ここに参照文献とし
て包含するヨーロッパ特許公開第0 481704 号(米国特
許出願第598,269 号(10/16/90)およびこの中に述べら
れた参照文献を優先権とする)を参照のこと。そのよう
な検定においては、同一の検定容器または反応媒質中の
公知の異なる標的配列のために正の調節として並行な
(parallel)内部参照材料を含有することが、例えば、
疑似的な負の結果(false negative result )を保障す
るため、検定性能にとって重要であると認識されてい
る。別の検定方式においては、公知の対照物質を含有し
て検定性能を評価するのに役立てている。
【0003】試験試料中の2つ以上の物質、例えば分析
物を測定および/または定量する実験的必要性と経済的
な利益が、本発明の多数トレーサ(multiple-tracer )
検定を開発する2つの主要な基本的動機であった。さら
に、理想的な多数トレーサシステムが同一の化学条件下
で多数の波長信号を放出することを予見した。信号を発
するために他の化学物質または酵素を使用する、ルミノ
ール系(luminol series)または安定なジオキシエタン
(dioxetane )と対になるアクリジニウム化合物のよう
な2つの異なる種類の化学発光化合物を用いる場合のよ
うに、2つの異なる信号発生機構、条件およびタイミン
グの組を必要とする複数分析物検定システムにおいて2
つの化学発光トレーサを組み合わせることは望ましくな
く、扱いにくいことが分かった。さらに、2つ以上の異
なる化学発光化合物または接合体は、1桁以下の大きさ
しか異ならない発光効率を有さなければならない。
【0004】さらに基本的な必要条件は、水性媒質また
は環境における化学発光化合物の適切な安定性であっ
た。この安定性によって、化合物はキットの状態にされ
たときの市販製品の出荷条件に耐える。
【0005】発光最大値において深色シフト(bathochr
omic shift)を示し、同一の化学処理により同等の効率
を有する光を放出する同一の一般級にある安定化学発光
類似体を開発することにより、これらの目的を達成し
た。
【0006】過酸化水素および金属水酸化物の処理によ
り青光を放出することをここに示した化学発光アクリジ
ニウム化合物について詳しく記載する。米国特許第4,74
5,181 号、第4,918,192 号、第5,110,932 号、米国特許
出願第07/826,186号および第07/871,601号は、安定多置
換(polysubstituted )アリールアクリジニウムエステ
ルを記載している。これらの文献は全て、本出願人に譲
渡され、参照文献としてここに包含する。そのようなア
クリジニウム化合物を、一般的に「参照アクリジニウム
エステル」または「アクリジニウムエステル」と称する
ことにする。上述したような化合物は、アクリジニウム
環系を含み、その化合物の用法に応じて、例えば、本発
明の検定を含む試験検定に使用するための接合体を形成
する物質に標識を付着させるための、適切な官能基をさ
らに含む。
【0007】バトマンゲリッヒ等、ヨーロッパ特許公開
第0 478 626 号(イギリス国特許第2,233,450 号(6/24
/89 )を優先権主張とする)は、異なるトレーサ接合体
を調製するために発光が変化する、すなわち、速い持続
時間および遅い持続時間(fast and slow duration)の
アクリジニウム化合物を使用して、2つ以上の異なる分
析物の「実質的に同時の」定量を行なうことを記載して
いる。しかしながら、この手法はいくつかの重大な欠点
を有する。第一に、アクリジニウムエステルの1つは、
発光の非常に短い持続時間を達成するために、すなわ
ち、1秒で発光または発光最大値を完了するために、フ
ェノール部位に電子求引性置換基を含む。しかしなが
ら、この種の化合物、例えば、オルト−ジハロゲン化ア
リールアクリジニウムエステルは、水性環境においては
安定性が欠如するかもしれない。第二に、発光の重複期
間中に2つのトレーサにより個々に帰属する発光を区別
するために、発光運動学を注意深く試験して正確に補正
しなければならない。記載された方法は、光強度の順次
積分(sequential integration)のための2つの別々の
時間窓(time window )に放出される光子の測定による
ものである。発光重複が比較的小さくない場合には、そ
のような補正は、特に大きく異なる濃度を有する2つの
分析物の検出については、不十分な検定精度の潜在的な
源となり得る。より小さな発光の重複を必要条件とする
と、代わりに、一方が非常に短い持続時間の発光を有
し、他方が非常に長い持続時間の発光を有する一組の化
学発光化合物を利用することが必要となり、安定性に問
題があるか、または過剰に長引いた信号集積時間により
二重分析物検定を非実用的にする化合物に導かれる。
【0008】信号集積時間が延長する場合には、1つの
試験試料において2つの検定を行なう利点が失われる。
化学発光検出および/または定量を用いたある自動分析
器において、最初の試験結果は、15分後に得られ、その
後操作中に20秒毎に結果が得られることを言及してお
く。本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含さ
れるヨーロッパ特許公開第0 502 638 号(米国特許出願
第665,196 号(3/4/91)を優先権とする)を参照のこ
と。
【0009】バトマンゲリッヒ等はまた、異なるトレー
サ接合体を調製するための、異なる発光スペクトルを有
するアクリジニウム化合物について記載した。彼等が用
いた手法は、アクリジニウム核の電子接合(electronic
conjugation)を延長して、特許のアクリジニウムエス
テル(化合物2a)と比較して、発光最大値において約
80nm深色シフトした3−(4−カルボキシブタジエニ
ル)−アクリジニウムエステル(化合物2b)を得るこ
とであった。アクリジニウム核の電子接合の延長によ
り、二重分析物免疫学的検定を構成するのに実際に必要
とされる発光最大値における主要な深色シフトあるいは
発光効率の減少が必ずしも導かれるわけではない。その
ような検定において使用するベンズアクリジニウム化学
発光化合物について、何も教示されていなかった。
【0010】マックカプラ等のヨーロッパ特許公開第0
322 926 号(米国特許出願第140,040 号(12/31/87)お
よび第291,843 号(12/29/88)を優先権とする)は、環
または環系の炭素原子の1つに結合したエステル結合、
アミド結合を有する複素環式環または環系からなる「化
学発光部分」を示唆した。この化学発光化合物は、ベン
ズ[a]アクリジニウム、ベンズ[b]アクリジニウ
ム、およびベンズ[c]アクリジニウムを含有すると言
われたが、これらの化合物または接合体の合成および構
造は記載されていなかった。これらの構造物の発光波長
最大値、または発光効率のいずれも予言しておらず、ま
た、検定法において少なくとも2つの化学発光化合物ま
たは接合体を使用すること、そして発光スペクトルに基
づいて検定を行なう場合にそのような化合物を利用する
ことも予言していなかった。
【0011】本出願に開示するベンズ[a]アクリジニ
ウムおよびベンズ[b]アクリジニウムの命名法は、有
機化合物の命名法に関する委員会による1957年の報告書
における国際純粋および応用化学連合(International
Union of Pure and AppliedChemistry )発行の有機化
合物の命名法に関する決定規則の規則21.5に基づく。
【0012】ベンズ[a]アントラセンの実施例による
と、アクリジニウム核(下記の構造)の周辺側にベンゼ
ン環を融合することにより生じた化合物は、したがって
アクリジニウム核の側a、b、またはcのいずれがベン
ゼン環と融合するかにより命名すべきである。
【0013】
【化6】
【0014】以下の省略形を本発明の開示に用いる: 1. ABAC: 核間ベンズ[a]アクリジニウ
ム化合物 2. AFAC: 芳香族環融合(aromatic ring
fused )アクリジニウム化合物 3. EtO: エトキシ 4. DMAE: ジメチルアクリジニウムエステ
ル 5. DIPAE: ジイソプロピルアクリジニウム
エステル 6. LBAC: 鎖状ベンズ[b]アクリジニウ
ム化合物 7. LEAC: 長期発光(longer emission )
アクリジニウム化合物 8. LEAE: 長期発光アクリジニウムエステ
ル 9. MeO: メトキシ 10. NSE: N−スルホエチル 11. NSP: N−スルホプロピル 12. PCT: 漏話百分率(percent cross ta
lk) 13. PMP: 常磁性粒子 14. QAE: 第四アンモニウムエトキシ 15. RLU: 相対光単位(relative light u
nit )
【0015】
【発明の構成】少なくとも2つの化学発光接合体の発光
信号を同時に検出することからなる、試験試料中の少な
くとも2つの物質の検出および/または定量のための方
法を提供するが、ここで各化学発光接合体は、試験試料
中で検出および/または定量すべき物質と結合してい
る。化学発光接合体のそれぞれの発光信号はスペクトル
発光により識別できるので、物質が検出および/または
定量できる。
【0016】本発明の検定に使用する化学発光化合物を
以下に記載する:
【0017】
【化7】
【0018】ここでWは炭素であり、あるいは、C7
W、C9 またはC10は−N=と置換でき;またはWを省
き、C7 をC9 に結合させ、C7 、C9 またはC10は−
O−、−S−、−NH−、または−NR−と置換でき;
Yは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
または下記の化学式の多置換アリール部分である:
【0019】
【化8】
【0020】R1 は必要に応じて20のヘテロ原子を含有
するアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキ
ルを含む;R2 、R3 、R9 およびR10は、水素、置換
または非置換アリル(ArRまたはAr)、ハロゲン化
物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−SR、
−SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)
NHR、または−NHC(O)Rから選択される同一の
群または異なる群のものである;R2 はC1-4 で1つま
たは多数の置換基を含む;R2 はまた、ヘテロ原子を有
するかまたは有さない融合芳香環であってもよい; R
3 はC7 、W、C9 またはC10で1つまたは多数の置換
基を含む;A−は、CH3 SO4 - 、FSO3 - 、CF
3 SO4 - 、C4 9 SO3 - 、CH3 6 4 SO3
- およびハロゲン化物を含む対イオンである;Xは窒
素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、Xが酸素
または硫黄のときにZが省かれ、Xが窒素のときにZが
−SO2 −Y′であり、そしてY′がYと等しい場合に
は、YとY′の置換基は同一である必要はない;R4
よびR8 はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコ
キシル、アルキルチオールまたはアミドである、R5
よびR7 は上述したR3 、R9 およびR10である; R6 =−R11−R12、 R11は、必要条件ではないが、必要に応じて、20までの
ヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖アルキ
ル、置換または非置換アリールまたはアラルキルであ
る;そしてR12は、リービング基(leaving group )、
またはリービング基もしくは−Q−R−Nu、−Q−R
(I)n Nu、−Q−Nu、−R−Nu、または−Nu
に結合する求電子官能基を含み、ここでnは少なくとも
1であり、Nuは求核基であり、Qは官能結合であり、
Iはイオンまたはイオン化基である;R5 とR6 、およ
びR6 とR7 は相互に交換可能である;Rは必要に応じ
て20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキルである。
【0021】化学発光化合物または接合体は、化学処理
により該化合物または接合体が、識別できる発光スペク
トルピークまたは最大値を有する青−緑、緑、黄、橙お
よび赤−橙の光を放出する点で特徴付けられる。ある実
施態様、すなわちある化合物において、発光最大値は、
480 nm以上であり、好ましい実施態様においては、51
5 nm以上である。
【0022】試験試料中の、1つ以上の核酸配列を含有
する標的配列の増幅方法は、1つ以上の標的配列を含有
すると思われる試験試料を調製し、その試験試料に内部
参照を加え、標的配列を増幅し、それぞれの化学発光接
合体が標的配列および内部参照と結合する、少なくとも
2つの化学発光接合体を調製し、化学発光接合体の発光
により増幅した標的配列および内部参照を同時に検出お
よび/または定量することからなる。
【0023】したがって、本発明の主な目的は、それぞ
れ識別可能な発光スペクトルを有する少なくとも2つの
異なる化学発光化合物または接合体を使用することによ
り、試験試料中の少なくとも2つの物質を同時に検出お
よび/または定量する方法を提供することにある。
【0024】本発明の別の目的は、単一の試験媒質また
は移送管中の分析物および内標準または対照を同時に検
出および/または定量する検定方法を提供することにあ
る。
【0025】本発明のさらに別の目的は、単一反応媒質
または移送管中の試験試料について2つの検定を同時に
行なう準備をすることにより、自動分析器の効率を高め
ることにある。
【0026】本発明のさらなる目的は、化学発光化合物
およびそのような化学発光化合物を合成するのに用いる
中間体生成物を合成する方法を提供することにある。
【0027】本発明の目的は、緑または黄の光を放出す
る化学発光の芳香族環融合アクリジニウム化合物(arom
atic ring-fused acridinium compound ;AFAC)を
提供することにある。
【0028】本発明の別の目的は、515 nm以上の波長
最大値またはピークを有する緑または黄の光を放出する
芳香族環融合アクリジニウム化合物(AFAC)を提供
することにある。
【0029】本発明のさらに別の目的は、同時の二重化
学発光標識検定方法を提供することにある。
【0030】本発明のさらなる目的は、他のミクロ分子
または巨大分子との共有結合またはリポソーム内のカプ
セル封じを形成するのに有用な反応官能基を有する、ま
たは有さない1つ以上のイオン基および/またはイオン
化可能基を担持する親水性AFACを提供することにあ
る。
【0031】本発明の目的は、直接的または間接的に結
合パートナー、例えば生物学的分子を有するAFACの
間に形成されたAFAC接合体を提供することにある。
【0032】本発明の別の目的は、アクリジニウムエス
テルおよびAFAC接合体を使用することを含む試験検
定方法を提供することにある。
【0033】本発明のさらに別の目的は、混合物として
試料中に存在する2つ以上の分析物または物質またはそ
の組合せの測定が、2つ以上の異なる化学発光トレーサ
または化合物により生成される、相互非干渉、または重
複が最小であるが補正可能な光信号により、同一の反応
媒質または転移管中で同時に行なえる多分析物検定方法
を提供することにある。
【0034】本発明のさらなる目的は、二重化学発光標
識試験検定を行なう試験キットを提供することにある。
【0035】本発明の目的は、試験試料中の少なくとも
2つの物質を同時に検定する2つ以上の化学発光試薬を
有する試験キットを提供することにある。
【0036】本発明の別の目的は、分析検定に使用する
標識の合成に利用する中間体化合物を提供することにあ
る。
【0037】本発明のさらに別の目的は、ピーク高さの
5%より大きい信号強度を有するスペクトル領域が約10
0 −250 nmに亘る発光スペクトルを有する化学発光化
合物を提供することにある。
【0038】これらと他の目的から当業者には明らかな
ように、本発明は、明細書に記載し、特許請求の範囲に
包含される要素の組合せにある。
【0039】
【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。
【0040】本発明のAFACは、鎖状ベンズ[b]ア
クリジニウム(LBAC)、フラノアクリジニウム、チ
オフェノアクリジニウム、ピロアクリジニウム化合物お
よびピリドアクリジニウム化合物からなる。アクリジニ
ウム核に融合した芳香族環の特異的な位置によって、予
期せぬことに、LBACが、核間ベンズ[a]アクリジ
ニウム化合物(ABAC)より、そして対応する「参照
アクリジニウムエステル」、すなわち、DMAE−B
z、DIPAE−Bzおよび3−MeO−DMAE−B
zよりかなり大きな深色シフトを有する化学発光信号を
生じることが分かった。図1および2参照のこと。
【0041】AFACの一般的な構造を式Iにより示
す。
【0042】
【化9】
【0043】鎖状ベンズ[b]アクリジニウム化合物お
よび異性体、フラノ−、チオフェノ−、ピロ−およびピ
リド−アクリジニウム化合物の一般的な構造を、式II、
IIIA−III C、およびIVA−IVDにそれぞれ示す。
【0044】
【化10】
【0045】
【化11】
【0046】
【化12】
【0047】
【化13】
【0048】
【化14】
【0049】
【化15】
【0050】
【化16】
【0051】
【化17】
【0052】AFACのあるサブクラスは、上述した特
質を有する主要な化学発光化合物に加え、形成を可能に
する、すなわち、結合パートナー、特に生物学的分子と
の共有結合により、結合検定における非同位体トレーサ
として、または多分析物検定システムの主要な必須の部
分として有用な接合体を生成する反応官能基を含有す
る。AFACの別のサブクラスは、水性媒質中の化合物
の溶解度を高めることおよび/またはそれら化合物をリ
ポソーム内に漏れが少なくカプセル封じする1つ以上の
イオン基および/またはイオン化可能基を含有する。そ
のような親水性LBACを追加の反応官能基を担持する
ように修飾して、他のミクロ分子または巨大分子との接
合体を形成せしめられる。
【0053】上述した特性を有し、上述した効用に適し
た好ましいLBAC、フラノアクリジニウム化合物、チ
オフェノアクリジニウム化合物、ピロアクリジニウム化
合物およびピリドアクリジニウム化合部は、それぞれ上
述した式I、II、III A−III C、およびIVA−IVDに
示した化学発光化合物を含む。ここで:Wが炭素の場
合、式Iは式IIに示したようなLBACクラスの化学発
光化合物となる;またはWは省略でき、C7をC9に結
合させ、C7、C9またはC10のうちの1つを−O
−、−S−、−NH−、または−NR−と置換して、式
IIIA−Cに示したようなアクリジニウム核に線状に融
合した5員芳香環を形成できる;またはC7、W、C
9、またはC10は−N=と置換して、式IVA−Dに示
したようなアクリジニウム核に線状に融合した6員ピリ
ド環を形成できる;R1 は、20までのヘテロ原子、好ま
しくは窒素、酸素、ハロゲン、リンまたは硫黄を必要に
応じて含有するアルキル、アルケニル、アルキニル、ま
たはアラルキルである。
【0054】R2 、R3 、R9 およびR10は、水素、置
換または非置換アリール(ArRまたはAr)、ハロゲ
ン化物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネー
ト、−R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−
SR、−SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C
(O)NHR、または−NHC(O)Rから選択される
同一の群または異なる群のものである。
【0055】Rは20までのヘテロ原子を必要に応じて含
有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
またはアラルキルである。
【0056】R2 はC1-4 で1つまたは多数の置換基を
含む。
【0057】R3 はC7 、W、C9 またはC10で1つま
たは多数の置換基を含む。
【0058】R2 はまた、ヘテロ原子を有するかまたは
有さない融合芳香環であってもよい。
【0059】A−は、CH3 SO4 −、FSO3 −、C
3 SO4 −、C4 9 SO3 −、CH3 6 4 SO
3 −およびハロゲン化物を含む対イオンである。
【0060】Xは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原
子であり、Xが酸素または硫黄のときにZが省かれ、X
が窒素のときにZが−SO2 −Y′である。
【0061】Yは、必要に応じて20までの炭素原子を含
有する、ハロゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直
鎖アルキル、または式Vの多置換アリール部分である:
【0062】
【化18】
【0063】Y′はYと等しい場合、YとY′の置換基
は同一である必要はない。
【0064】R4 、およびR8 は、アルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アルコキシル、アルキルチオ、アミ
ド、水性媒質または環境中でAFACの安定性を良好に
確保するように位置した基である。商業化に適するAF
ACの安定性は、立体効果、電子効果、またはこれら2
つの群の存在により生じた組合せによるものである。R
5 およびR7 は、式IのR3 、R9 、およびR10につい
て列挙したものと同様である。AFACを生物学的分子
に接合するために、R6 は、リービング基(leaving gr
oup )、またはリービング基により結合された求電子官
能基、もしくはスペーサにより環に直接結合または連結
したそのような反応基に容易に転化できる官能基であり
得る。「スペーサ」を、必要に応じて0−20のヘテロ原
子を含有する、側鎖または直鎖アルキル、置換または非
置換アリールまたはアラルキルとして定義する。そのよ
うな官能基の実施例は、
【0065】
【化19】
【0066】−N=C=S、−N=C=O、−N2 +U
−、−N3 、−COOH、−U、または−SO2 U、こ
こでUはハロゲン化物である。
【0067】あるいは、R6 は、スペーサによりYに直
接結合または連結された保護または非保護求核性官能基
であり得る。したがって、R6 は、−Q−R−Nu、−
Q−R(I)n−Nu、−Q−Nu、−R−Nu、また
は−Nuであり、ここでRは上述のように定義したもの
である。
【0068】Qは、初めはそれぞれYおよびRまたはN
uの置換基として存在する2つの官能基の間の共有結合
により生じた官能結合である。R6 への構成物中へのQ
の導入は、R−Nu、R(I)n−NuまたはNuをプ
リフォームAFACに直接結合できるモジュール概念を
示す。Qの実施例は、−C(O)−、−C(O)NH
−、−NHC(O)−、−NHC(O)O−、−NH
−、−O−、−S−、−NHC(O)NH−、−NHC
(S)NH−、−C(=N+H2 )NH−、−SO
2 −、−SO3 −を含む。
【0069】(I)nは、制限するものではないが、第
4アンモニウム、−COOH、−SO3 H、−SO
4 H、−PO3 2 、および−PO4 2 、を含有する
イオン基またはイオン化可能基であり、nは1以上の整
数である。
【0070】イオン基またはイオン化可能基が存在する
と、AFACの親水性および水性媒質中での用途の適合
性が高まる。そのようなイオン基またはイオン化可能基
を選択し位置させると、生物学的分子/AFAC接合体
を生物学的分子の対応する結合パートナーに結合させる
のを高められるという利点がある。
【0071】Nuは、結合のための求核基を欠如するか
もしれないが、求電子性基またはその容易に転化される
前駆体を有するかもしれない生物学的分子を有する化合
物の接合を促進する化合物の求核基である。保護求核性
官能基の実施例またはグルーピングは、t−ブチルオキ
シカルボニルアミノおよび3−(2−ピリジニルジチ
オ)−プロピオニル(PDP)を含有する。
【0072】
【化20】
【0073】t−ブチルオキシカルボニル(t−Bo
c)は、酸、例えば、トリフルオロ酢酸の処理により除
去できるアミノ上の保護基である。PDP中のS−2−
ピリジニル基は、適切なpHでのジチオスレオトール
(DTT)の処理により除去して遊離−SH基を生成で
きる保護部分である。−NH2 および−SH求核性基の
これらの保護基の用法は、有機化学の当業者に知られて
いる。非保護の求核性官能基の実施例は、アミノ、チオ
ール、ヒドロキシル、強い電子求引性基である有機金属
部分に隣接した活性メチレンを含む。そのような求核性
6 グルーピングの実施例、生物学的分子への接合、お
よび接合体の効用がヨーロッパ特許公開第0 361 817 号
(米国特許出願第249,620 号(9/26/88 )を優先権とす
る)に記載されており、この特許は、本出願人に譲渡さ
れ、参照文献としてここに包含する。
【0074】信号増大ルミソーム(signal-enhancing l
umisome )を構成することを目的としてリポソーム内に
カプセル封じできる多くの親水性化合物を提供するため
に、R2 、R3 またはR6 は、スペーサにより芳香環に
直接結合したまたはより適切に連結した強力なイオン化
可能基であり得る。強力なイオン化可能基は、ホスフェ
ート、ホスホネート、スルフェート、およびスルホネー
トを含む。そのようなR6 グルーピングの実施例、親水
性化学発光分子のリポソームへの取り込み、および生成
したルミソームの効用がヨーロッパ特許公開第0 361 81
7 号(米国特許出願第249,620 号(9/26/88 )を優先権
とする)に記載されており、この特許は、本出願人に譲
渡され、参照文献としてここに包含する。同様に、生物
学的分子に直接接合できる親水性AFACを提供するた
めに、R2 および/またはR3 は、スペーサにより芳香
環融合アクリジニウム核に直接結合したまたはより適切
に連結したイオン基または強力なイオン化可能基であり
得、R6 は上述したような反応性官能基含有側鎖であり
得る。全てのAFACにおけるR2 、R3 、R5 および
6 の位置、そしてR6 とR7 の置換基は相互に交換で
きる。
【0075】AFACとなる可能性のある前駆体の1つ
は、R6 の置換基が水素またはRであり、Rが上述のよ
うに定義されるAFACである。
【0076】Xが窒素である場合、Yは1から20の炭素
原子の側鎖または直鎖アルキルまたは上述したような全
ての可能性のある置換基を有する式Vに等しい部分であ
ってもよく、そしてZは以下の式VIにより示される: Z=−SO2−Y′ (式VI) ここでY′は1から20の炭素原子のハロゲン化または非
ハロゲン化、側鎖または直鎖アルキル、または上述した
可能性のある置換基の全てを有する式Vと等しい部分で
ある。YおよびY′両者の置換基は必ずしも同一である
必要はない。
【0077】好ましい芳香環融合アクリジニウム化合物
(AFAC)は、上述したものである。より好ましく
は、AFACは以下の置換基を有するLBAC系であ
る:R1はメチル基、スルホプロピル基またはスルホエ
チル基である;R9 、R10は水素、メトキシ基またはハ
ロゲンである;R2 は水素、2−MeO基、2−第四ア
ンモニウムアルコキシ基、3−MeO基、3−EtO
基、3−第四アンモニウムアルコキシ基、または3−カ
ルボキシアルキルオキシ基である;R3 、R5 およびR
7 は水素である;Xが酸素または硫黄である場合、R4
およびR8 はメチル基、エチル基、イソプロピル基であ
る;R6 は式Vの4の位置に結合した以下の基のうちの
1つである、カルボキシレート、N−サクシンイミジル
オキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、N
−アミノアルキルカルバモイル基、スルホメチルカルバ
モイル基、N−[N−(2−アミノ−3−S−(3′−
スルホプロピル)−チオプロピオニル)−2−アミノエ
チル]カルバモイル基、N−7−(1、3−ジスルホナ
フタレニル)カルバモイル基、N−[1−カルボキシル
−2−(3−スルホプロピルチオ)エチル]カルバモイ
ル基、N−(2−スルホニルオキシエチル)カルバモイ
ル基、N−(2−ホスホノエチル)カルバモイル基、N
−(2−ホスホンオキシエチル)カルバモイル基および
アルコキシイミノエチル基;Xが窒素である場合、Yは
5 およびR7 が水素であり、R6 がカルボキシレー
ト、N−サクシンイミジルオキシカルボニル基、N−サ
クシンイミジルオキシカルボニルアルキル基、ベンジル
オキシカルボニル基、またはN−アミノアルキルカルバ
モイル基である式Vを示す;ZはY′がアルキル基また
はフェニル基である式VIを示す。
【0078】本発明の化学発光化合物を合成するのに用
いる中間体化合物は下記の式の中間体を含む:
【0079】
【化21】
【0080】ここでWは炭素;あるいは、C7 、W、C
9 またはC10は−N=と置換でき;またはWを省き、C
7 をC9 に結合させ、C7 、C9 またはC10は−O−、
−S−、−NH−、または−NR−と置換でき;R2
3 、R9 およびR10は、水素、置換または非置換アリ
ール(ArRまたはAr)、ハロゲン化物、アミノ、ヒ
ドロキシル、ニトロ、スルホネート、−R、−CN、−
COOH、−SCN、−OR、−SR、−SSR、−C
(O)R、−C(O)OR、−C(O)NHR、または
−NHC(O)Rから選択される同一の群または異なる
群のものである;R2 はC1-4 で1つまたは多数の置換
基を含む;R3 はC7 、W、C9 またはC10で1つまた
は多数の置換基を含む;R2 はまた、ヘテロ原子を有す
るまたは有さない融合芳香環であってもよい;Rは必要
に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルであ
る。
【0081】下記の式の中間体:
【0082】
【化22】
【0083】ここでWは炭素であり、あるいは、C7
W、C9 またはC10は−N=と置換でき;またはWを省
き、C7 をC9 に結合させ、C7 、C9 またはC10は−
O−、−S−、−NH−、または−NR−と置換でき;
Yは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
または下記の化学式の多置換アリール部分である:
【0084】
【化23】
【0085】R2 、R3 、R9 およびR10は、水素、置
換または非置換アリール(ArRまたはAr)、ハロゲ
ン化物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネー
ト、−R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−
SR、−SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C
(O)NHR、または−NHC(O)Rから選択される
同一の群または異なる群のものである;R2 はC1-4
1つまたは多数の置換基を含む;R3 はC7 、W、C9
またはC10で1つまたは多数の置換基を含む;R2 はま
た、ヘテロ原子を有するまたは有さない融合芳香環であ
ってもよい;Xは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原
子であり、Xが酸素または硫黄のときにZが省かれ、X
が窒素のときにZが−SO2 −Y′であり、そしてY′
がYと等しい場合には、YとY′の置換基は同一である
必要はない;R4 およびR8 はアルキル、アルケニル、
アルキニル、アルコキシル、アルキルチオールまたはア
ミドである、R5 およびR7 は上述したR3 、R9 およ
びR10である; R6 =−R11−R12、 R11は、必要条件ではないが、必要に応じて、20までの
ヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖アルキ
ル、置換または非置換アリールまたはアラルキルであ
る;そしてR12は、リービング基(leaving group )、
またはリービング基もしくは−Q−R−Nu、−Q−R
(I)n Nu、−Q−Nu、−R−Nu、または−Nu
に結合する求電子官能基を含み、ここでnは少なくとも
1であり、Nuは求核基であり、Qは官能結合であり、
Iはイオンまたはイオン化基である;R5 とR6 、およ
びR6 とR7 は相互に交換可能である;Rは必要に応じ
て20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキルである。
【0086】以下の実施例は、本発明の好ましい化合物
および中間体の合成について記載したものであり、その
構造を図1および2に示す。実施例は説明を意図したも
のであり、限定を意図するものではなく、実施例に示し
た置換基以外の置換基を有する化合物を当業者が合成す
るガイドとして用いてもよい。
【0087】実施例1. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチル)フェニル5−メチル−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート(LEAE−Bz)の調製3−アニリノ−2−ナフトエ酸 3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸(アルドリッヒ カタ
ログ#H4600−7)(376 g、2.0 モル)およびア
ニリン(376 ml、4.1 モル)の混合物を窒素雰囲気で
撹拌しながら16時間に亘り170 ℃で加熱した。生成した
混合物を、熱いうちに1N HCl(2.5 ml)中に注
ぎ入れ、100 ℃に加熱し、この温度で5分間撹拌した。
この混合物を熱いうちに濾過し、固体を0.2 N HCl
(600 ml)で洗浄した。湿った材料を沸騰させ、0.5
Nのカルボン酸ナトリウム(6.0ml)で10分間に亘り
機械的に撹拌し、冷却して濾過した。撹拌しながら赤み
がかった濾液に5N HClを滴下して〜pH7とし
た。生成した黄色の沈殿物を集積し、少量の水で洗浄
し、エタノール(400 ml)により結晶化し、3−アニ
リノ−2−ナフトエ酸(36g、7%).Rf 0.6 (シ
リカゲル、EMアート.5715、20% メタノール/
クロロホルム)、MS(EI):m/z264 (M)を得
た。
【0088】12−クロロ−ベンズ[b]アクリジン 3−アニリノ−2−ナフトエ酸(10.0g、37.98 mモ
ル)およびオキシ塩化リン(35.4ml、379.8 mモル)
の混合物を窒素雰囲気で撹拌しながら2時間に亘り150
℃で還流した。生成した紫色の混合物を冷却し、減圧下
で乾燥するまで蒸発させた。含有物を撹拌しながらクロ
ロホルム/氷/濃縮水酸化アニモニウム(200 ml/20
0 g/200 ml)の混合物に加えた。クロロホルム層を
分離し、塩化カルシウムにより乾燥した。減圧下で溶剤
を除去して、12−クロロ−ベンズ[b]アクリジン
(9.4 g、95%).Rf 0.8 (シリカゲル、ヘキサン
/酢酸エチル2:1).MS(EI):m/z263
(M)を得た。
【0089】12−シアノ−ベンズ[b]アクリジン 無水メタノール(16ml)中で12−クロロ−ベンズ
[b]アクリジン(2.3g、8.68mモル)、シアン化カ
リウム(620 mg、9.55mモル)およびシアン化銅
(I)(391 mg、4.43mモル)の混合物を1分間窒素
で泡立て、密封管中に保持した。混合物を撹拌しながら
4.5 時間に亘り160 ℃に加熱して、冷却した。赤−茶色
の混合物を蒸発させ、残留物を、ヘキサンを充填したシ
リカカラム(ベイカーシリカゲル、カタログ#7024
−1)上でフラッシュ−クロマトグラフ(flash-chroma
tographed )し(W.C.スティル等:J.有機化学、
43、2923、(1978))、10%の酢酸エチル/ヘキサンに
より溶出し、赤色の12−シアノ−ベンズ[b]アクリ
ジン(1.54g、70%).Rf 0.7 (シリカゲル、ヘキ
サン/酢酸エチル2:1).MS(FAB、チオグリセ
ロールマトリックス):m/z255 (M+1)を得た。
【0090】ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン
酸ヒドロクロライド 50%の硫酸(容量/容量、50ml)中で12−シアノ−
ベンズ[b]アクリジン(557 mg、2.19mモル)およ
びテトラブチルアンモニウム臭化物(71mg、0.22mモ
ル)の混合物を窒素雰囲気で撹拌しながら44時間に亘り
160 −170 ℃に加熱して、冷却した。生成した混合物を
氷水(500 ml)中に注ぎ入れた。紫色の沈殿物を集積
し、水で洗浄した。湿った物質を2N NaOH(100
ml)中で暖めて溶解させ、濾過した。濾液を氷水浴中
で濃縮HClによりpH3−4に酸性化し、紫色のベン
ズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロライ
ド(510 mg、75%).Rf 0.4 (シリカゲル、クロ
ロホルム/メタノール/水65:25:4).MS(FA
B、チオグリセロールマトリックス):m/z 274
(M+1)を得た。
【0091】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニルベンズ[b]アクリジン−12−
カルボキシレート 無水ピリジン(50ml)中でベンズ[b]アクリジン−
12−カルボン酸ヒドロクロライド(370 mg、1.2 m
モル)の懸濁液を5分間に亘り60℃で暖めた。やや濁っ
た溶液を0℃に冷却し、10分間に亘り0℃で、もう15分
間室温でp−トルエンスルホニル塩化物(388 mg、2.
33mモル)により処理し、最初の反応混合物を得た。こ
の反応混合物をさらにベンジル2、6−ジメチル−4−
オキシ安息香酸塩(694 mg、2.71mモル)(米国特許
第4,745,181 号を参照のこと)で処理し、第二の反応混
合物を得た。この混合物を窒素雰囲気で40時間に亘り室
温で撹拌し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。ヘキサ
ンを充填したシリカカラム上で残留物をフラッシュ−ク
ロマトグラフして、50%のエーテル−ヘキサンにより溶
出し、橙−赤色の(4−ベンジルオキシカルボキシル−
2、6−ジメチル)フェニル ベンズ[b]アクリジン
−12−カルボキシレート(450 mg)、74%).Rf
0.6 (シリカゲル、20%酢酸エチル/トルエン).M
S(FAB、チオグリセロールマトリックス):m/z
512 (M+1)を得た。
【0092】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル5−メチル−ベンズ[b]アクリ
ジニウム−12−カルボキシレートフルオロスルホネー
ト(LEAE−Bz) 無水塩化メチレン(5ml)中の(4−ベンジルオキシ
カルボニル−2、6−ジメチル)フェニル ベンズ
[b]アクリジン−9−カルボキシレート(115 mg、
0.23mモル)に、フルオロスルホン酸メチル(0.128 m
l、2.25mモル)を加えた。この溶液を窒素雰囲気で20
時間に亘り室温で撹拌し、無水エーテル(10ml)で処
理した。生成した沈殿物を集積し、エーテル(100 m
l)で洗浄し、暗茶色の(4−ベンジルオキシカルボニ
ル−2、6−ジメチル)フェニル5−メチル−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート(136 mg、97%).MS(FAB、チ
オグリセロールマトリックス):m/z526 (M)を得
た。
【0093】実施例2. (2、6−ジメチル−4−N
−サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル 5−
メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキ
シレートフルオロスルホネート(LEAE−NHS)の
調製(4−カルボキシ−2、6−ジメチル)フェニル ベン
ズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート臭化水素
酸塩 30%無水臭化水素−酢酸(5ml)中の実施例1におい
て調製した(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−
ジメチル)フェニル ベンズ[b]アクリジン−12−
カルボキシレート(198 mg、0.39mモル)の溶液を窒
素雰囲気で4時間に亘り55−60℃で撹拌した。混合物を
無水エーテル(20ml)で処理した。沈殿物を集積し、
エーテル(100 ml)で洗浄し、定量的に(4−カルボ
キシ−2、6−ジメチル)フェニル ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート臭化水素酸塩.Rf
0.4 (シリカゲル、5%メタノール/クロロホルム).
MS(EI):m/z 421 (M)を得た。
【0094】(2、6−ジメチル−4−N−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル)フェニルベンズ[b]アクリ
ジン−12−カルボキシレート 無水N、N−ジメチルホルムアミド(5ml)中の(4
−カルボキシ−2、6−ジメチル)フェニル ベンズ
[b]アクリジン−12−カルボキシレート臭化水素酸
塩(108 mg、0.22mモル)の溶液に、0℃でジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(111 mg、0.54mモル)を加
えた。この温度で30分間に亘り撹拌した後、N−ヒドロ
キシルサクシンイミド(62mg、0.54mモル)を加え
た。この溶液を窒素雰囲気で10分間に亘り0℃で、次い
で24時間に亘り室温で撹拌した。生成した混合物を酢酸
(3滴)で処理し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物をクロロホルムで抽出し、クロロホルム抽出物を
減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を充填したシ
リカカラム上でフラッシュ−クロマトグラフし、エーテ
ルで溶出して(2、6−ジメチル−4−N−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル)フェニル ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート(20mg、18%).R
f 0.6 (シリカゲル、20%).MS(EI):m/z
518 (M)を得た。
【0095】(2、6−ジメチル−4−N−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル)フェニル5−メチル−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート(LEAE−NHS) 無水塩化メチレン(1ml)中の(2、6−ジメチル−
4−N−サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル
ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート
(14mg、0.026 mモル)溶液に、フルオロ硫酸メチル
(0.021 ml、0.26mモル)を加えた。生成した茶色の
溶液を窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹拌し、無水エ
ーテル(1ml)で処理した。沈殿物を集積し、エーテ
ル(40ml)で洗浄し、(2、6−ジメチル−4−N−
サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル 5−メ
チル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシ
レートフルオロスルホネート(11mg、65%).MS
(FAB、チオグリセロールマトリックス):m/z53
3 (M)を得た。
【0096】実施例3. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジイソプロピル)フェニル 5−メチル
−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレー
トフルオロスルホネート(DIP−LEAE−Bz)の
調製3、5−ジイソプロピル−4−オキシ安息香酸 この酸をW.H.ミーク等のJ.化学および工学デー
タ、14(3)、388 、(1969)の方法により調製した。
無水N、N−ジメチルアセトアミド(150 ml)中の
2、6−ジイソプロピルフェノール(アルドリッヒ カ
タログ#D12660−8)(37.0ml、0.20モル)溶
液に、ナトリウムメトキシド(16.2g、0.30モル)を加
えた。続いての反応期間に亘り、二酸化炭素を混合物に
通過させた。混合物を撹拌しながら加熱し、ポットの温
度が180 ℃に達するまで、2時間に亘りゆっくりと蒸留
して溶剤を除去した。混合物をさらに1.5 時間に亘り18
0 ℃で撹拌し続け、次いで90℃に冷却した。二酸化炭素
の供給を停止し、水(400 ml)を加えた。さらに室温
まで冷却した後、混合物をトルエン(4×60ml)で洗
浄し、氷水浴中でpH3まで濃縮塩酸で処理した。生成
した混合物をジエチルエーテル(2×150 ml)で抽出
した。エーテル抽出物を塩水(100 ml)で洗浄し、無
水硫酸マグネシウムにより乾燥させた。減圧下で溶剤を
除去して、3、5−ジイソプロピル−4−オキシ安息香
酸(10.4g、23%).Rf 0.5 (シリカゲル、50%ジ
エチルエーテル/ヘキサン).MS(CI、CH4):
m/z223 (M+1)を得た。
【0097】ベンジル3、5−ジイソプロピル−4−オ
キシベンゾエート メタノール(25ml)中の3、5−ジイソプロピル−4
−オキシ安息香酸(1.223 g、5.50mモル)に、水(5
ml)中の水酸化カリウム(308 mg、5.50mモル)を
加えた。生成した溶液を窒素雰囲気で1時間に亘り室温
で撹拌し、減圧下で乾燥するまで完全に蒸発させた。こ
のカリウム塩を、無水アセトニトリル(30ml)および
N、N−ジメチルホルムアミド(15ml)中に溶解さ
せ、ジベンゾ−18−クラウン−6(198 mg、0.55m
モル)で処理した。窒素雰囲気下の80℃での撹拌から30
分後、溶液をさらに臭化ベンジル(0.712 ml、6.05m
モル)で処理した。撹拌を窒素雰囲気下の80℃で4時間
に亘り続けた。冷却した後、生成した混合物を濾過し
た。濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物
を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッシュク
ロマトグラフして20%の酢酸エチル/ヘキサンで溶出
し、結晶ベンジル、3、5−ジイソプロピル−4−オキ
シベンゾエート(1.35g、79%)、Rf 0.6 (シリカ
ゲル、20%酢酸エチル/トルエン)、MS(EI)、m
/z 312 (M)を得た。
【0098】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジイソプロピル)フェニル ベンズ[b]アクリジン
−12−カルボキシレート 無水ピリジン(30ml)中の実施例1からのベンズ
[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロライド
の懸濁液(200 ml、0.65mモル)を5分間に亘り60℃
で暖めた。次いでやや濁った溶液を0℃に冷却し、p−
トルエンスルホニル塩化物(247 mg、1.29mモル)で
処理した。その溶液を40分間に亘り0℃で、さらに10分
間室温で撹拌し、そこにベンジル2、6−ジイソプロピ
ル−4−オキシベンゾエート(202 mg、0.65mモル)
を加えた。この反応混合物を窒素雰囲気で20時間に亘り
室温で撹拌し続け、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッ
シュクロマトグラフして25%のエーテル/ヘキサンで溶
出し、橙色の(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジイソプロピル)フェニル ベンズ[b]アクリジン
−12−カルボキシレート(187 mg、51%)、Rf
0.6 (シリカゲル、20%酢酸エチル/トルエン)、MS
(CI、CH4):m/z 570 (M+3)を得た。
【0099】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジイソプロピル)フェニル5−メチル−ベンズ[b]
アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオロスル
ホネート(DIP−LEAE−Bz) 無水塩化メチレン(3ml)中の(4−ベンジルオキシ
カルボニル−2、6−ジイソプロピル)フェニル ベン
ズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート(50m
g、0.088 mモル)の溶液に、フルオロスルホン酸メチ
ル(0.072 ml、0.088 mモル)を加えた。茶色の溶液
を窒素雰囲気下で24時間に亘り室温で撹拌し、次いで無
水エーテル(4ml)で処理した。生成した沈殿物を集
積し、エーテル(10ml)で洗浄し、暗茶色の(4−ベ
ンジルオキシカルボニル−2、6−ジイソプロピル)フ
ェニル5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12
−カルボキシレートフルオロスルホネート(39mg、64
%)、MS(FAB、チオグリセロールマトリック
ス):m/z 582 (M)を得た。
【0100】実施例4. N−(4−メトキシフェニル
−N−[3−(ベンジルオキシカルボニル)フェニルス
ルホニル]5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−
12−カルボキシアミドフルオロスルホネート(LEA
C−Bz)の調製3−[N−(4−メトキシフェニル)スルファミド]安
息香酸 無水塩化メチレン(40ml)中の3−(クロロスルホニ
ル)安息香酸(コダック カタログ#1188655)
(4.4 g、20.00 mモル)およびトリエチルアミン(2.
78ml、20.00 mモル)の溶液に、0℃で4−アニシジ
ン(2.46g、200 mモル)を加えた。0℃での10分間の
撹拌後、大量の沈殿物が溶液中に形成した。混合物を、
窒素雰囲気下で2時間に亘り室温で撹拌し続けた。濾過
後、わずかに灰色がかった白色の、集積した固体を水
(50ml)で洗浄し、次いでエーテル(50ml)で洗浄
し、3−[N−(4−メトキシフェニル)スルファミ
ド]安息香酸(4.50g、74%)、Rf 0.5 (シリカゲ
ル、クロロホルム/メタノール/水 65:25:4)、M
S(CI、CH4):m/z 308 (M+1)を得た。
【0101】ベンジル3−[N−(4−メトキシフェニ
ル)スルファミド]ベンゾエート N、N−ジメチルホルムアミド(20ml)中の3−[N
−(4−メトキシフェニル)スルファミド]安息香酸
(2.00g、6.52mモル)の溶液に、水(5ml)中の水
酸化ナトリウム(260.6 mg、6.52mモル)溶液を加え
た。生成した溶液を窒素雰囲気で1時間に亘り室温で撹
拌し、次いで減圧下で乾燥するまで完全に蒸発させた。
このナトリウム塩を、無水アセトニトリル(40ml)お
よびN、N−ジメチルホルムアミド(20ml)中に溶解
させ、ジベンゾ−18−クラウン−6(235 mg、0.65
mモル)で処理した。窒素雰囲気下での80℃での撹拌か
ら30分後、溶液をさらに臭化ベンジル(0.852 ml、7.
27mモル)で処理した。窒素雰囲気下の80℃で撹拌を4
時間に亘り続けた。冷却後、生成した混合物を濾過し
た。白色の固体を少量のアセトニトリルで洗浄した。ア
セトニトリルと濾液の混合物を減圧下で乾燥するまで蒸
発させた。残留物を、ヘキサンを充填したシリカカラム
上でフラッシュクロマトグラフし、15%の酢酸エチル/
ヘキサンで溶出し、結晶ベンジル3−[N−(4−メト
キシフェニル)スルファミド]ベンゾエート(2.00g、
77%)、Rf 0.5 (シリカゲル、20%酢酸エチル/ト
ルエン)、MS(CI、CH4):m/z 397 (M+
1)を得た。
【0102】N−(4−メトキシフェニル)−N−[3
−(ベンジルオキシカルボニル)フェニルスルホニル]
ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシアミド 無水ピリジン(30ml)中のベンズ[b]アクリジン−
12−カルボン酸ヒドロクロライド(200 mg、0.65m
モル)の懸濁液を5分間に亘り60℃で暖めた。わずかに
濁った溶液を0℃に冷却し、p−トルエンスルホニル塩
化物(247 mg、1.29mモル)で処理した。この溶液
を、0℃で40分間、さらに室温で10分間撹拌し、ベンジ
ル3−[N−(4−メトキシフェニル)スルファミド]
ベンゾエート(257 mg、0.65mモル)を加えた。この
反応混合物を、窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹拌し
続け、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物
を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッシュク
ロマトグラフし、25%のヘキサン−エーテルで溶出し、
N−(4−メトキシフェニル)−N−[3−(ベンジル
オキシカルボニル)フェニルスルホニル]ベンズ[b]
アクリジン−12−カルボキシアミド(177 mg、68
%)、Rf 0.4 (シリカゲル、20%酢酸エチル/トル
エン)、MS(CI、CH4):m/z 653 (M+
1)を得た。
【0103】N−(4−メトキシフェニル)−N−[3
−(ベンジルオキシカルボニル)フェニルスルホニル]
5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カル
ボキシアミドフルオロスルホネート(LEAC−Bz) 無水塩化メチレン(3ml)中のN−(4−メトキシフ
ェニル)−N−[3−(ベンジルオキシカルボニル)フ
ェニルスルホニル]ベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシアミド(50mg、0.077 mモル)に、フルオロ
スルホン酸メチル(0.062 ml、0.77mモル)を加え
た。暗茶色の溶液を窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹
拌し、次いで無水エーテル(10ml)で処理した。生成
した沈殿物を集積し、エーテル(10ml)で処理し、青
黒色のN−(4−メトキシフェニル)−N−[3−(ベ
ンジルオキシカルボニル)フェニルスルホニル]5−メ
チル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシ
アミドフルオロスルホネート(38mg、65%)、MS
(FAB、チオグリセロールマトリックス):m/z66
7 (M)を得た。
【0104】実施例5. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチル)フェニル3−エトキシ−5−
メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキ
シレートフルオロスルホネート(3−EtO−LEAE
−Bz)の調製ベンゾ[5、6]イサチン A.エチエネおよびA.ステヘリン、Bull.Soc.Chim.フ
ランス、6、743 、(1954)の方法にしたがって、ベン
ゾ[5、6]イサチンを調製した。
【0105】3−ヒドロキシ−ベンズ[b]アクリジン
−12−カルボン酸 n−ブタノール(2ml)および水(2ml)中のベン
ゾ[5、6]イサチン(500 mg、2.54mモル)および
水酸化カリウム(996 mg、17.78 mモル)の混合物を
撹拌しながら100 ℃まで加熱して、均質な溶液とし、続
いてレソルシノール(1.95g、17.78 mモル)を加え
た。溶液をさらに140 ℃に加熱し、30分間の期間に窒素
により溶剤を徐々にとばした後、さらに2mlの水およ
び1mlのn−ブタノールを加えた。溶液の温度を140
℃に保持しつつ、窒素の吹付けを合計で2時間に亘り続
けた。粘着性の混合物を冷却し、100 mlの水に溶解さ
せた。この溶液を氷水浴中で濃縮塩酸によりpH2に酸
性化した。生成した沈殿物を集積し、水で洗浄し、クロ
ロホルムを充填したシリカカラム上でフラッシュクロマ
トグラフして、20%のメタノール−クロロホルムで、続
いてクロロホルム−メタノール−水(65:25:4)で溶
出し、3−ヒドロキシ−ベンズ[b]アクリジン−12
−カルボン酸(210 mg、29%)、Rf 0.3 (シリカ
ゲル、クロロホルム/メタノール/水 65:25:4)、
MS(FAB、チオグリセロールマトリックス):m/
z 290 (M+1)を得た。
【0106】エチル3−エトキシ−ベンズ[b]アクリ
ジン−12−カルボキシレート メチルスルホキシド(3.5 ml)中の3−ヒドロキシ−
ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸(90mg、
0.28mモル)および炭酸セシウム(451 mg、1.38mモ
ル)の混合物に、ブロモエタン(207 ul、2.77mモ
ル)を加えた。混合物を窒素雰囲気で4時間に亘り25℃
で撹拌し、次いで水(10ml)で処理した。混合物を5
%のHClでpH5に調整し、生成した沈殿物を集積し
て水で洗浄した。粗生成物を、クロロホルムを充填した
シリカカラム上で精製し、5%のメタノール−クロロホ
ルムで溶出し、エチル3−エトキシ−ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート(36mg、38%)、R
f 0.5 (シリカゲル、ジエチルエーテル/ヘキサン
3:1)、MS(FAB、チオグリセロールマトリック
ス):m/z 346 (M+1)を得た。
【0107】3−エトキシ−ベンズ[b]アクリジニウ
ム−12−カルボン酸ヒドロクロライド メタノール(3ml)および16%の水酸化ナトリウム
(1ml)中のエチル3−エトキシ−ベンズ[b]アク
リジニウム−12−カルボキシレート(35mg、0.10m
モル)の溶液を窒素雰囲気で2日間に亘り25℃で、さら
に4時間に亘り40℃で撹拌し、次いで減圧下で乾燥す
るまで蒸発させた。残留物を水(20ml)中に懸濁さ
せ、氷水浴中で濃縮HClによりpH3に調整した。沈
殿物を集積し、水で洗浄して3−エトキシ−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボン酸ヒドロクロラ
イド(30mg、83%)、Rf 0.8 (シリカゲル、クロ
ロホルム/メタノール/水 65:25:4)、MS(C
I、CH4):m/z 318 (M+1)を得た。
【0108】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−エトキシ−ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート N、N′−ジメチルプロピレン尿素(DMPR、1.5 m
l)およびピリジン(1ml)中の3−エトキシ−ベン
ズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロライ
ド(19mg、0.054 mモル)のわずかに濁った溶液を0
℃で冷却し、p−トルエンスルホニル塩化物(21mg、
0.11mモル)を加えた。20分間の撹拌後、ベンジル3、
5−ジメチル−4−オキシベンゾエート(14mg、0.05
5 mモル)およびN、N′−ジメチルアミノピリジン
(1mg)を加えた。混合物を窒素雰囲気で20時間に亘
り25℃で撹拌し、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発させ
た。残留物を水(5ml)で処理し、エーテル(5×5
ml)で抽出した。混合したエーテル層を水(1×10m
l)、塩水(1×10ml)で洗浄し、硫酸マグネシウム
により乾燥させた。減圧下で溶剤を除去して粗混合物を
得た。この混合物を、エーテル/ヘキサン(3:2)で
展開することにより、準備(preparative )TLC板
(2mmシリカゲル、EMアート、5717)上で分離
した。主に橙色の帯を集積し、10%のメタノール/エー
テルで抽出した。減圧下で溶剤を除去して、橙色の(4
−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメチル)フェ
ニル3−エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシレート(5mg、17%)、Rf 0.6 (シリカ
ゲル、ジエチルエーテル/ヘキサン)、MS(FAB、
チオグリセロールマトリックス):m/z 556 (M+
1)を得た。
【0109】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−エトキシ−5−メチル−ベン
ズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフル
オロスルホネート(3−EtO−LEAE−Bz) 塩化メチレン(1ml)中の(4−ベンジルオキシカル
ボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−エトキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート(9m
g、0.0162mモル)に、フルオロスルホン酸メチル(1
3.1ul、0.162mモル)を加えた。この溶液を窒素雰囲
気で36時間に亘り25℃で撹拌し、次いでジエチルエーテ
ル(10ml)で処理した。沈殿物を集積し、ジエチルエ
ーテル´(20ml)で洗浄し、(4−ベンジルオキシカ
ルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−エトキシ−
5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カル
ボキシレートフルオロスルホネート(3−EtO−LE
AE−Bz、7mg、65%)MS(CI、CH4):m
/z 570 (M+2)を得た。
【0110】実施例6. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチル)フェニル3−(N、N−ジエ
チル−N−メチル−アンモニウム)エトキシ−5−メチ
ル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレ
ートジフルオロスルホネート(3−QAE−LEAE−
Bz)の調製N、N−ジエチルアミノエチル3−(N、N−ジエチル
アミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシレート メチルスルホキシド(12ml)中の3−ヒドロキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸(415 mg、
1.28mモル)の溶液を10分間に亘り25℃で炭酸セシウム
(5g、15.4mモル)により処理し、ジエチルアミノエ
チル臭化物臭化水素酸塩(1.5 g、6.4 mモル)を加え
た。混合物を窒素雰囲気で4時間に亘り25℃で処理し、
水(100 ml)で冷却した。沈殿物を集積し、水(50m
l)で洗浄した。粗生成物を、20%のメタノール/クロ
ロホルムを展開させることにより4つの準備TLC板
(2mmシリカゲル)上で分離した。橙色の帯を集積
し、10%のメタノール/クロロホルムで抽出した。減圧
下で溶剤を除去することにより、N、N−ジエチルアミ
ノエチル3−(N、N−ジエチルアミノ)エトキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート(73m
g、12%)、Rf 0.6(シリカゲル、20%メタノール
/クロロホルム)、MS(CI、CH4):m/z 48
8 (M+1)を得た。
【0111】3−(N、N−ジエチルアミノ)エトキシ
−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロク
ロライド メタノール(12ml)および4Nの水酸化ナトリウム
(4ml)中のN、N−ジエチルアミノエチル3−
(N、N−ジエチルアミノ)エトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボキシレート(60mg、0.123 m
モル)の溶液を窒素雰囲気で16時間に亘り65℃で撹拌
し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を水(10
ml)中に溶解させた。この溶液を、氷水浴中で濃縮H
ClによりpH4まで注意深く酸性化した。生成した沈
殿物を集積し、ジエチルエーテル(5ml)で洗浄し、
3−(N、N−0ジエチルアミノ)エトキシ−ベンズ
[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロライド
(32mg、61%)、Rf 0.3 (シリカゲル、クロロホ
ルム/メタノール/水 65:25:4)を得た。
【0112】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−(N、N−ジエチルアミノ)
エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシ
レート ピリジン(12ml)中の3−(N、N−ジエチルアミ
ノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボ
ン酸ヒドロクロライド(29mg、0.069 mモル)および
p−トルエンスルホニル塩化物(29mg、0.152 mモ
ル)の混合物を5分間に亘り80℃で撹拌した。生成した
均質な溶液を25℃に冷却し、さらにベンジル4−ヒドロ
キシ−3、5−安息香酸ジメチル(20mg、0.078 mモ
ル)で処理した。窒素雰囲気で16時間に亘り25℃で撹拌
した後、溶剤を減圧下で除去した。残留物を、15%のメ
タノール/クロロホルムで展開することにより準備TL
C板(2mmシリカゲル)上で精製した。橙色の帯を集
積し、10%のメタノール/クロロホルムで抽出した。減
圧下で溶剤を除去することにより、(4−ベンジルオキ
シカルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−(N、
N−ジエチルアミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジ
ン−12−カルボキシレート(17mg、39%)、Rf
0.6 (シリカゲル、10%メタノール/クロロホルム)、
MS(FAB、グリセロールマトリックス):m/z
627 (M+1)を得た。
【0113】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−(N、N−ジエチル−N−メ
チル−アンモニウム)エトキシ−5−メチル−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートジフル
オロスルホネート(3−QAE−LEAE−Bz) 塩化メチレン(1.9 ml)中の(4−ベンジルオキシカ
ルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−(N、Nジ
エチルアミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−1
2−カルボキシレート(13mg、0.0208mモル)をフル
オロスルホン酸メチル(25ul、0.308 mモル)で処理
した。窒素雰囲気で15時間に亘る25℃での撹拌後、反応
混合物をゆっくりとジエチルエーテル(5ml)に加え
た。沈殿物を集積し、エーテル(10ml)で洗浄し、
(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメチル)
フェニル3−(N、N−ジエチル−N−メチル−アンモ
ニウム)エトキシ−5−メチル−ベンズ[b]アクリジ
ニウム−12−カルボキシレートジフルオロスルホネー
ト(3−QAE−LEAE−Bz、9mg、53%)、M
S(FAB、グリセロールマトリックス):m/z 65
9 (M+3)を得た。
【0114】実施例7. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−5−
メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキ
シレートフルオロスルホネート(2−MeO−LEAE
−Bz)の調製3−(4−メトキシ)アニリノ−2−ナフトエ酸 p−アニシジン(84.7g、687.7 mモル)および3−ヒ
ドロキシ−2−ナフトエ酸(64.7g、343.9 mモル)の
混合物を、窒素雰囲気で22時間に亘り160 ℃で機械的に
撹拌した。130 ℃に冷却した後、混合物を熱い1Nの塩
酸(1000ml)で処理し、10分間に亘り130 ℃で撹拌
し、熱いうちに濾過した。生成したケーキを熱い0.5 N
の炭酸ナトリウム(2200ml)とともに15分間に亘り撹
拌し、熱いうちに濾過した。濾液を冷却し、氷水浴中で
濃縮HClによりpH6.5 に酸性化した。沈殿物を集積
し、メタノール(150 ml)で洗浄し、3−(4−メト
キシ)アニリノ−2−ナフトエ酸(14.8g、15%)、R
f 0.6 (シリカゲル、10%メタノール/クロロホル
ム)、MS(CI、CH4):m/z 294 (M+1)
を得た。
【0115】12−クロロ−2−メトキシ−ベンズ
[b]アクリジン 3−(4−メトキシ)アニリノ−2−ナフトエサン(1
5.4g、49.44 mモル)およびオキシ塩化リン(46m
l、494.4 mモル)の混合物を窒素雰囲気で3.5 時間に
亘り120 ℃で還流し、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発
させた。残留物を、クロロホルム(500 ml)/氷(45
0 g)/水酸化アンモニウム(450 ml)を含有する混
合溶剤中に加えた。生成した2つの層を分離した。水性
の層をクロロホルム(3×250 ml)で抽出した。混合
クロロホルム層を塩化カルシウムにより乾燥させ、減圧
下で乾燥するまで蒸発させ、12−クロロ−2−メトキ
シ−ベンズ[b]アクリジン(12.5g、86%)、Rf
0.8 (シリカゲル、60%ジエチルエーテル/ヘキサ
ン)、MS(CI、CH4):m/z 294 (M+1)
を得た。
【0116】12−シアノ−2−メチキシ−ベンズ
[b]アクリジン メタノール(3.7 ml)中の、12−クロロ−2−メト
キシ−ベンズ[b]アクリジン(562 mg、1.905 mモ
ル)、シアン化カリウム(136 mg、2.096 mモル)お
よびシアン化銅(I)(86mg、0.953 mモル)の混合
物を密封管中で4.5 時間に亘り170 ℃で撹拌した。生成
した混合物を濾過し、固体をクロロホルム/メタノール
(2:1、10ml)で洗浄した。混合濾液を減圧下で蒸
発させて残留物を得た。この残留物を、クロロホルムを
充填したシリカカラム上でフラッシュクロマトグラフ
し、1%のメタノール/クロロホルムで溶出し、12−
シアノ−2−メチキシ−ベンズ[b]アクリジン(477
mg、88%)、Rf 0.6(シリカゲル、1%メタノー
ル/クロロホルム)、MS(CI、CH4):m/z
285 (M+1)を得た。
【0117】2−ヒドロキシ−ベンズ[b]アクリジン
−12−カルボン酸ヒドロスルフェート 12−シアノ−2−メトキシ−ベンズ[b]アクリジン
(8.3 g、29.1mモル)および50%の硫酸(容量/容
量、280 ml)の混合物を窒素雰囲気で48時間に亘り16
0 ℃で機械的に撹拌した。生成した混合物を冷却し、氷
水中(1800ml)に注ぎ入れた。沈殿物を集積し、水
(200 ml)で洗浄し、クロロホルムを充填したシリカ
カラム上でフラッシュクロマトグラフを行ない、20%の
メタノール/クロロホルムと、続いてクロロホルム/メ
タノール/水(65:25:4)で溶出し、2−ヒドロキシ
−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロス
ルフェート(4.8 g、43%)、Rf 0.4 (シリカゲ
ル、クロロホルム/メタノール/水 65:25:4)を得
た。
【0118】メチル2−メトキシ−ベンズ[b]アクリ
ジン−12−カルボキシレート メチルスルホキシド(4ml)中の2−ヒドロキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロラ
イド(186 mg、0.572 mモル)の溶液に、炭酸セシウ
ム(746 mg、2.29mモル)およびヨードメタン(143
ul、2.29mモル)を加えた。生成した混合物を窒素雰
囲気で4時間に亘り25℃で撹拌し、次いで水(50ml)
で処理した。混合物を、氷水浴中で濃縮HClによりp
H6に酸性化した。生成した沈殿物を集積し、水(5m
l)で洗浄し、空気乾燥させた。粗混合物を、ジエチル
エーテル/ヘキサン(5:1)により展開した4つの準
備TLC板(2mmシリカゲル)上で精製した。主な橙
色の帯を集積し、10%のメタノール/クロホルムで抽出
した。減圧下で溶剤を除去することにより、メチル2−
メトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシ
レート(35mg、17%)、Rf 0.8 (シリカゲル、ジ
エチルエーテル/ヘキサン5:1)を得た。
【0119】2−メトキシ−ベンズ[b]アクリジン−
12−カルボン酸 メタノール(9ml)および4Nの水酸化ナトリウム
(3ml)中のメチル2−メトキシ−ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート(35mg、0.10mモ
ル)の溶液を65℃で15時間に亘り撹拌した。生成した混
合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を水
(40ml)に溶解させた。この水性溶液を、氷水浴中で
濃縮HClによりpH5に酸性化した。沈殿物を集積
し、水(5ml)で洗浄し、2−メトキシ−ベンズ
[b]アクリジン−12−カルボン酸(20mg、59%)
Rf 0.5 (シリカゲル、クロロホルム/メタノール/
水 65:25:4)、MS(CI、CH4):m/z 30
4 (M+1)を得た。
【0120】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル2−メトキシ−ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート ピリジン(5ml)中の2−メトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボン酸(18mg、0.0529mモル)
を、25℃で15分間に亘りp−トルエンスルホニル塩化物
(20mg、0.106 mモル)で処理し、次いでベンジル
3、5−ジメチル−4−オキシ−ベンゾエート(27m
g、0.106 mモル)を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘
り25℃で撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発させて
ピリジンを除去した。残留物をジエチルエーテル/ヘキ
サン(3:2)を展開させることにより準備TLC(2
mmシリカゲル)上で精製した。橙色の帯を集積し、5
%のメタノール/クロロホルムで抽出した。減圧下で溶
剤を除去して、(4−ベンジルオキシカルボニル−2、
6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボキシレート(2.7 mg、9
%)、Rf 0.5 (シリカゲル、60%ジエチルエーテル
/ヘキサン)を得た。
【0121】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル2−メトキシ−5−メチル−ベン
ズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフル
オロスルホネート(2−MeO−LEAE−Bz) 塩化メチレン(1ml)中の(4−ベンジルオキシカル
ボニル−2、6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボキシレート(2.5
ml、0.0046mモル)を窒素雰囲気で15時間に亘り25℃
で撹拌しながらフルオロスルホン酸メチル(3.7 ul、
0.56mモル)で処理した。反応混合物を無水ジエチルエ
ーテル(4ml)に加えた。精製した沈殿物を集積し、
ジエチルエーテル(5ml)で洗浄し、(4−ベンジル
オキシカルボニル−2、6−ジメチル)フェニル2−メ
トキシ−5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−1
2−カルボキシレートフルオロスルホネート(2−Me
O−LEAE−Bz)(1.5 mg、49%)、MS(FA
B、チオグリセロールマトリックス):m/z 556
(M)を得た。
【0122】実施例8. (2、6−ジメチル−4−サ
クシンイミジルオキシカルボニル)フェニル5−メチル
−2−(トリメチルアンモニウム)エトキシ−ベンズ
[b]アクリジニウム−12−カルボキシレートジフル
オロスルホネート(2−QAE−LEAE−NHS)の
調製N、N−ジメチルアミノエチル2−(N、N−ジメチル
アミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシレート メチルスルホキシド(11ml)中の2−ヒドロキシ−ベ
ンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸ヒドロクロラ
イド(360 mg、1.108 mモル)の溶液に、炭酸セシウ
ム(3.61g、11.08 mモル)およびN、N−ジメチルア
ミノエチル臭化物臭化水素酸塩(1.03g、4.432 mモ
ル)を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘り60℃で撹拌し
た後、反応混合物をメチルスルホキシド(20ml)で希
釈して、濾過し、不溶性不純物を除去した。濾液を減圧
下で小さな容量まで濃縮した。この濾液を、クロロホル
ム/メタノール/水(47:48:5)で展開することによ
り準備TLC板(2mmシリカゲル)上で分離した。所
望の橙色の帯を集積し、25%のメタノール/クロロホル
ムで抽出した。減圧下で溶剤を除去して、N、N−ジメ
チルアミノエチル2−(N、N−ジメチルアミノ)エト
キシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシレー
ト(86mg、18%)、Rf 0.6 (シリカゲル、クロロ
ホルム/メタノール/水 65:24:4)、MS(FA
B、グリセロールマトリックス):m/z 432 (M+
1)を得た。
【0123】2−(N、N−ジメチルアミノ)エトキシ
−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸 メタノール(22ml)および4Nの水酸化ナトリウム
(7.3 ml)中のN、N−ジエチルアミノエチル2−
(N、N−ジメチルアミノ)エトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボキシレート(86mg、0.20mモ
ル)を、1時間に亘り65℃で、15時間に亘り35℃で撹拌
した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物を水(5ml)で洗浄し、空気乾燥し、2−
(N、N−ジメチルアミノ)エトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボン酸(23mg、32%)、Rf
0.3 (シリカゲル、クロロホルム/メタノール/水 6
5:25:4)、MS(FAB、グリセロールマトリック
ス):m/z 361 (M+1)を得た。
【0124】サクシンイミジル3、5−ジメチル−4−
オキシベンゾエート N、N−ジメチルホルムアミド(150 ml)中の3、5
−ジメチル−4−オキシ安息香酸(5.0 g、30.0mモ
ル)の溶液を0℃に冷却し、N−ヒドロキシサクシンイ
ミド(3.45g、30.0mモル)および1、3−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(6.81g、33.0mモル)で処理し
た。溶液を窒素雰囲気で、2時間に亘り0℃で、16時間
に亘り25℃で撹拌した。生成した混合物を15分間に亘り
0.5 mlの酢酸とともに撹拌し、次いで濾過して不溶性
の尿素を除去した。濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発さ
せた。乾燥した物質をジエチルエーテル(100 ml)で
洗浄し、沸騰した酢酸エチル(200 ml)中に懸濁させ
た。この懸濁液を熱いうちに濾過し、不溶性不純物を除
去した。濾液を濃縮し、熱い酢酸エチル/塩化メチレン
(1:1、200 ml)中に懸濁させ、冷却して、2.91g
(37%)の灰色がかった白色の粉末Rf 0.6 (シリカ
ゲル、ジエチルエーテル)を得た。
【0125】(2、6−ジメチル−4−サクシンイミジ
ルオキシカルボニル)フェニル2−(N、N−ジメチル
アミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシレート ピリジン(4ml)中の2−(N、N−ジメチルアミ
ノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボ
ン酸(30mg、0.0833mモル)の溶液を25℃で10分間に
亘りp−トルエンスルホニル塩化物(31.8mg、0.166
mモル)で処理し、次いでサクシンイミジル3、5−ジ
メチル−4−オキシベンゾエート(32mg、0.0833mモ
ル)を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘る25℃での撹拌
後、溶液をクロロホルム(10ml)で希釈し、ただちに
水(3×4ml)で洗浄し、減圧下で乾燥するまで蒸発
させた。残留物を、10%のメタノール/クロロホルムに
より展開させた2つの準備TLC板(1mmシリカゲ
ル)上で精製した。所望の橙色の帯を集積し、10%のメ
タノール/クロロホルムにより抽出した。減圧下で溶剤
を除去し、(2、6−ジメチル−4−サクシンイミジル
オキシカルボニル)フェニル2−(N、N−ジメチルア
ミノ)エトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カル
ボキシレート(7mg、14%)、Rf 0.8 (シリカゲ
ル、10%のメタノール/クロロホルム)、MS(FA
B、チオグリセロールマトリックス):m/z 606
(M+1)を得た。
【0126】(2、6−ジメチル−4−サクシンイミジ
ルオキシカルボニル)フェニル5−メチル−2−(トリ
メチルアンモニウム)エトキシ−ベンズ[b]アクリジ
ニウム−12−カルボキシレートジフルオロスルホネー
ト(2−QAE−LEAE−NHS) 無水塩化メチレン(4ml)中の(2、6−ジメチル−
4−N−サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル
2−(N、N−ジメチルアミノ)エトキシ−ベンズ
[b]アクリジンカルボキシレート(1.9 mg、0.0031
mモル)の溶液をフルオロスルホン酸メチル(3.8 u
l、0.0465mモル)で処理した。溶液を窒素雰囲気で16
時間に亘り25℃で撹拌した。生成した沈殿物を集積し、
ジエチルエーテル(2ml)で洗浄し、(2、6−ジメ
チル−4−サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニ
ル5−メチル−2−(トリメチルアンモニウム)エトキ
シ−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレ
ートジフルオロスルホネート(2−QAE−LEAE−
NHS)(1.0 mg、39%)を得た。
【0127】実施例9. (4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチル)フェニル5−(3−スルホプ
ロピル)−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボ
キシレート(NSP−LEAE−Bz)の調製(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメチル)
フェニル5−(3−スルホプロピル)−ベンズ[b]ア
クリジウニム−12−カルボキシレート(NSP−LE
AE−Bz) 実施例1からの(4−ベンジルカルボキシル−2、6−
ジメチル)フェニルベンズ[b]アクリジン−12−カ
ルボキシレート(30mg、0.0587mモル)および1、3
−プロパンスルトン(600 mg、4.9 mモル)の混合物
を窒素でフラッシングし、密封管中に保持した。この管
を180 ℃で5時間に亘り撹拌しながら加熱し、次いで冷
却した。生成した混合物を、C−18カラム(YMC
SH−344−15、S−15、128)上の逆相準備
HPLCにより精製し、0から20分まで0.05Mの水性ト
リフルオロ酢酸中で25%から40%のアセトニトリルで、
5分間以上に亘り40%から90%で、さらに10分間は90%
のアセトニトリルを保持する傾斜条件で溶出した。17分
の保持時間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて3.2 g
の(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメチ
ル)フェニル5−(3−スルホプロピル)−ベンズ
[b]アクリジウニム−12−カルボキシレート(NS
P−LEAE−Bz)、MS(FAB、グリセロールマ
トリックス):m/z 634 (M+1)を得た。
【0128】実施例10. (2、6−ジメチル−4−
N−サクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル2−
メトキシ−5−(2−スルホエチル)−ベンズ[b]ア
クリジニウム−12−カルボキシレート(2−MeO−
NSE−LEAE−NHS)の調製(2、6−ジメチル−4−N−サクシンイミジルオキシ
カルボニル)フェニル2−メトキシ−ベンズ[b]アク
リジニウム−12−カルボキシレート ピリジン(20ml)中の実施例7からの2−メトキシ−
ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸(208 m
g、0.6118mモル)の混合物を25℃で10分間に亘りp−
トルエンスルホニル塩化物(233 mg、1.2235mモル)
で処理し、次いでサクシンイミジル3、5−ジメチル−
4−オキシベンゾエート(161 mg、0.6118mモル)を
加えた。窒素雰囲気で24時間に亘り25℃で撹拌した後、
減圧下での蒸発によりピリジンを除去した。生成した混
合物を、充填したシリカカラム上でフラッシュクロマト
グラフして、ジエチルエーテルで溶出した。集積した粗
生成物をさらに、ジエチルエーテルの溶出によりクロマ
トロン板(1mmシリカゲル)上で精製し、80mg(24
%)の純粋な生成物、Rf 0.8 (シリカゲル、酢酸エ
チル/ヘキサン2:1)、MS(FAB、チオグリセロ
ールマトリックス):549 (M+1)を得た。
【0129】(2、6−ジメチル−4−N−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル)フェニル2−メトキシ−5−
(2−スルホエチル)−ベンズ[b]アクリジニウム−
12−カルボキシレート(2−MeO−NSE−LEA
E−NHS) (2、6−ジメチル−4−N−サクシンイミジルオキシ
カルボニル)フェニル2−メトキシ−ベンズ[b]アク
リジン−12−カルボキシレート(23mg、0.04197 m
モル)およびエチレンスルホニル塩化物(C.S.ロン
デストレッドJr.、J.Amer.Chem.Soc.、76、1926、
(1954)の方法にしたがって調製した)(378 ul、4.
197 mモル)の混合物を窒素雰囲気で63時間に亘り25℃
で撹拌した。生成した混合物を、C−18カラム上の逆
相準備HPLCにより精製し、0.05Mの水性トリフルオ
ロ酢酸中のアセトニトリルで0から10分は35%で、10か
ら30分は35%から80%で、30から35分は80%から90%
で、さらに5分間は90%での傾斜条件で溶出した。25分
の保持時間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて、2.2
mg(8%)の(2、6−ジメチル−4−N−サクシン
イミジルオキシカルボニル)フェニル2−メトキシ−5
−(2−スルホエチル)−ベンズ[b]アクリジニウム
−12−カルボキシレート(2−MeO−NSE−LE
AE−NHS)、MS(FAB、チオグリセロールマト
リックス):m/z 657 (M+1)を得た。
【0130】実施例11. [2、6−ジメチル−4−
(2−メトキシイミノエチル)]フェニル2−メトキシ
−5−メチル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カ
ルボキシレート二塩化物(2−MeO−LEAE−イミ
デート)の調製(4−シアノエチル−2、6−ジメチル)フェニル2−
メトキシ−ベンズ[b]アクリジン−12−カルボキシ
レート ピリジン(15ml)中の実施例7からの2−メトキシ−
ベンズ[b]アクリジン−12−カルボン酸(100 m
g、0.2941mモル)を、0℃で40分間に亘りp−トルエ
ンスルホニル塩化物(112 mg、0.5882mモル)で処理
し、続いてトリエチルアミン(164 ul、1.1789mモ
ル)および4−シアノエチル−2、6−ジメチル−フェ
ノール(E.ジェクソバ等、CS158810、1975年7月15
日;CA84(13):898299の方法にしたがって調製し
た)(51mg、0.2914mモル)を加えた。窒素雰囲気で
18時間に亘り25℃で撹拌した後、反応溶液を減圧下で蒸
発させてピリジンを除去した。残留物を、酢酸エチル/
ヘキサン(3:4)を2度展開させた4つの準備TLC
板(2mmシリカゲル)上で精製した。主要な橙色の帯
を集積し、メタノール/クロロホルム(1:30)で抽出
した。減圧下で溶媒を除去して、(4−シアノエチル−
2、6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−ベンズ
[b]アクリジン−12−カルボキシレート(75mg、
55%)、Rf 0.5(シリカゲル、酢酸エチル/ヘキサ
ン 2:3)、MS(FAB、チオグリセロールマトリ
ックス):m/z 461 (M+1)を得た。
【0131】(4−シアノエチル−2、6−ジメチル)
フェニル2−メトキシ−5−メチルベンズ[b]アクリ
ジニウム−12−カルボキシレートフルロオスルホネー
塩化メチレン(1ml)中の(4−シアノエチル−2、
6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−ベンズ[b]ア
クリジン−12−カルボキシレート(20mg、0.04338
mモル)の溶液を、窒素雰囲気で18時間に亘り25℃で撹
拌しながらフルオロスルホン酸エチル(17.5ul、0.21
69mモル)で処理した。反応混合物を無水ジエチルエー
テル(5ml)に加えた。生成した沈殿物を集積し、C
−18カラム上の逆相準備HPLCにより精製し、0.05
Mの水性トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルで0から
30分は40%から80%で、残りはさらに40分間80%のアセ
トニトリルでの傾斜条件により溶出した。24分の保持時
間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて、(4−シアノ
エチル−2、6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−5
−メチルベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキ
シレートフルロオスルホネート(15.7mg、65%)、M
S(FAB、チオグリセロールマトリックス):m/z
475 (M)を得た。
【0132】[2、6−ジメチル−4−(2−メトキシ
イミノエチル)]フェニル2−メトキシ−5−メチル
ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレート
二塩化物(2−MeO−LEAE−イミデート) 無水メタノール(0.5 ml)中の(4−シアノエチル−
2、6−ジメチル)フェニル2−メトキシ−5−メチル
ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシレー
トフルオロスルホネート(4mg、0.00697 mモル)の
溶液を、0℃で10分間に亘り無水塩化水素(気体)で処
理した。次いで反応溶液を、窒素を吹き付けることによ
り小さな容量に減少させた。濃縮物を無水ジエチルエー
テル(3ml)に加えた。生成した沈殿物を集積し、ジ
エチルエーテル(5ml)で洗浄し、[2、6−ジメチ
ル−4−(2−メトキシイミノエチル)]フェニル2−
メトキシ−5−メチル ベンズ[b]アクリジニウム−
12−カルボキシレート二塩化物(2−MeO−LEA
E−イミデート)(1.5 mg、37%)を得た。
【0133】アクリジニウムエステルの類似体の調製 実施例12. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、
6−ジイソプロピル)フェニル10−メチル−アクリジ
ニウム−9−カルボキシレートフルオロスルホネート
(DIPAE−Bz)の調製(4−ベンシルオキシスルボニル−2、6−ジイソプロ
ピル)フェニル アクリジン−9−カルボキシレート 塩化チオニル(3ml、41.1mモル)中のアクリジン−
9−カルボン酸ヒドロクロライド(74mg、0.33mモ
ル)の混合物を、窒素雰囲気で2時間に亘り110℃で還
流した。冷却後、溶液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ
た。固体を無水ジエチルエーテル(5ml)で洗浄し、
アクリジン−9−ホスゲンヒドロクロライドを得た。こ
の酸塩化物を無水ピリジン(4ml)中に溶解させ、次
いでベンジル3、5−ジイソプロピル−4−オキシ安息
香酸(102 mg、0.33mモル)および4−N、N−ジメ
チルアミノ−ピリジン(16mg、0.13mモル)を加え
た。窒素雰囲気で16時間に亘る25℃での撹拌後、溶液を
減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を、20%のジ
エチルエーテル/ヘキサンの溶出によりクロマトトロン
板(1mmシリカゲル)上で精製し、(4−ベンシルオ
キシスルボニル−2、6−ジイソプロピル)フェニル
アクリジン−9−カルボキシレート(64mg、38%)、
Rf 0.6 (シリカゲル、20%酢酸エチル/トルエ
ン)、MS(EI):m/z 517 (M)を得た。
【0134】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジイソプロピル)フェニル10−メチル−アクリジニ
ウム−9−カルボキシレートフルオロスルホネート(D
IPAE−Bz) 無水塩化メチレン(3ml)中の(4−ベンジルオキシ
カルボニル−2、6−ジイソプロピル)フェニル アク
リジン−9−カルボキシレート(62mg、0.120 mモ
ル)の溶液をフルオロスルホン酸メチル(97ul、1.19
8 mモル)で処理した。窒素雰囲気で21時間に亘る25℃
での撹拌後、溶液を無水ジエチルエーテル(10ml)で
処理した。生成した沈殿物を集積し、ジエチルエーテル
(20ml)で洗浄し、アセトニトリル/ジエチルエーテ
ルにより結晶化させて、(4−ベンジルオキシカルボニ
ル−2、6−ジイソプロピル)フェニル10−メチル−
アクリジニウム−9−カルボキシレートフルオロスルホ
ネート(DIPAE−Bz)(20mg、26%)を得た。
【0135】実施例13. (4−ベンジルオキシカル
ボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−メトキシ−1
0−メチル−アクリジニウム−9−カルボキシレートフ
ルオロスルホネート(3−MeO−DMAE−Bz)の
調製メチル3−メトキシ−アクリジン−9−カルボキシレー
メチルスルホキシド(50ml)中の3−ヒドロキシ−ア
クリジン−9−カルボン酸(2g、8.368 mモル)の溶
液に、25℃で炭酸セシウム(10.9g、33.47 mモル)を
加え、続いてヨードメタン(2.08ml、33.47 mモル)
をゆっくりと加えた。窒素雰囲気で2時間に亘る25℃で
の撹拌後、混合物を水(500 ml)中に注ぎ入れた。沈
殿物を集積し、水(200 ml)で洗浄し、空気乾燥させ
た。生成した混合物を、クロロホルムを充填したシリカ
カラム上でフラッシュクロマトグラフし、1%のメタノ
ール/クロロホルムで、続いて2%のメタノール/クロ
ロホルムで溶出し、粗生成物を得た。この粗生成物をさ
らに5%のメタノール/クロロホルムの溶出により6つ
の準備TLC板(2mmシリカゲル)上で精製した。主
要な帯を集積し、5%のメタノール/クロロホルムで抽
出した。減圧下で溶剤を除去して、メチル3−メトキシ
−アクリジン−9−カルボキシレート(1.05g、47%)、
Rf 0.7 (シリカゲル、5%メタノール/クロロホル
ム)を得た。
【0136】3−メトキシ−アクリジン−9−カルボン
酸ヒドロクロライド メタノール(30ml)および4Nの水酸化ナトリウム
(10ml)中のメチル3−メトキシ−アクリジン−9−
カルボキシレート(900 mg、3.37mモル)の溶液を窒
素雰囲気で14時間に亘り65℃で撹拌し、冷却し、減圧下
で乾燥するまで蒸発させた。固体を水(100 ml)中に
溶解させた。この水性溶液をジエチルエーテル(4×50
ml)で洗浄し、氷水浴中で濃縮HClによりpH3に
酸性化した。生成した沈殿物を集積し、水(200 ml)
で洗浄し、空気乾燥させ、3−メトキシ−アクリジン−
9−カルボン酸ヒドロクロライド(710 mg、73%)、
Rf0.6 (シリカゲル、クロロホルム/メタノール/水
65:25:4)を得た。
【0137】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−メトキシ−アクリジン−9−
カルボキシレート ピリジン(25ml)中の3−メトキシ−アクリジン−9
−カルボン酸ヒドロクロライド(150 mg、0.519 mモ
ル)の懸濁液に、0℃でp−トルエンスルホニル塩化物
(198 mg、1.038 mモル)を加えた。10分間の撹拌後
には懸濁液は均質になった。次いでベンジル3、5−ジ
メチル−4−オキシベンゾエート(132mg、0.519 m
モル)を加えた。溶液を窒素雰囲気で、2時間に亘り65
℃で、さらに20時間に亘り25℃で撹拌し、減圧下で乾燥
するまで蒸発させた。残留物をクロロホルム(100 m
l)中で懸濁させ、5%の水酸化アンモニウム(4×50
ml)、水(2×50ml)、塩水(1×50ml)で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥させた。減圧下で
クロロホルムを除去して、粗製混合物を得た。この混合
物を、トルエン/酢酸エチル(4:1)を展開した2つ
の準備TLC板(2mmシリカゲル)上で精製した。主
要な帯を集積し、10%のメタノール/クロロホルムで抽
出した。減圧下で溶剤を除去し、(4−ベンジルオキシ
カルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−メトキシ
−アクリジン−9−カルボキシレート、Rf 0.7 (シ
リカゲル、20%酢酸エチル/トルエン)、MS:(CI
CH4)m/z 492 (M+1)を得た。
【0138】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル3−メトキシ−10−メチル−ア
クリジニウム−9−カルボキシレートフルオロスルホネ
ート(3−MeO−DMAE−Bz) 無水塩化メチレン(2ml)中の(4−ベンジルオキシ
カルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−メトキシ
−アクリジン−9−カルボキシレート(45mg、0.0916
mモル)の溶液を、フルオロスルホン酸メチル(74u
l、0.916 mモル)で処理した。窒素雰囲気で19時間に
亘り25℃で撹拌した後、溶液を無水ジエチルーテル(6
ml)で処理した。生成した沈殿物を集積し、ジエチル
エーテル(20ml)で洗浄し、(4−ベンジルオキシカ
ルボニル−2、6−ジメチル)フェニル3−メトキシ−
10−メチル−アクリジニウム−9−カルボキシレート
フルオロスルホネート(3−MeO−DMAE−Bz)
(41mg、74%)、MS(FAB、チオグリセロールマ
トリックス):m/z 506 (M)を得た。
【0139】実施例14. ABACの合成 核間ベンズ[a]アクリジニウムエステル、(4−ベン
ジルオキシカルボニル−2、6−ジメチル)フェニル5
−メチル−ベンズ[a]アクリジニウム−12−カルボ
キシレートメトスルフェートおよび中間体の調製を以下
のように行なう:ベンズ[a]アクリジン−12−カルボン酸 マーチネット、J.およびダンセット、A.によりBul
l.Soc.Chim.、Fr. 、45、101 、(1929)に記載された
方法を基本的に用いる。
【0140】N−フェニル−β−ナフチルアミン(22.9
g、0.1 mモル)(アルドリッヒ、カタログ#17,805-
5)を5mlの酢酸中のジエチルケトマロン酸塩(18
g、0.1mモル)と混合し、油浴中で45分間に亘り150
℃で加熱した。反応混合物を冷却により凝固させた。固
体をフリット漏斗(fritted funnel)に移し、エチルア
ルコールで完全に洗浄し、真空下のデシケーター中で乾
燥させて、エチルフェニル−1−ベンゾ−4、5−ジオ
キシンドール−3−カルボキシレート:mp169 −170
℃を得た。この最初の中間体の一部(7g、0.02モル)
をさらに100 mlの10%KOHで処理し、90分間に亘り
還流により加熱し、一晩室温で放置した。この第2の反
応混合物に、200 mlの1N HClを加えた。生成し
た黄色の沈殿物を濾過し、沸騰したエタノールで洗浄
し、乾燥させて2.1 g(33.8%)のベンズ[a]アクリ
ジン−12−カルボン酸、MS(CI、CH4):m/
z 274(M+1)を得た。
【0141】ベンズ[a]アクリジン−12−ホスゲン 上述のようにして得たベンズ[a]アクリジン−12−
カルボン酸(1g、3.66mモル)に、10mlの塩化チオ
ニルを加えた。混合物を3時間に亘り95℃で加熱し、冷
却して、50mlのベンゼンで処理し、4℃で一晩貯蔵し
た。沈殿物を濾過により集積し、ベンゼン、次いでエチ
ルエーテルで洗浄し、真空下のデシケーター中で乾燥さ
せ、300 mg(28%)の酸塩化物を得た。
【0142】(4−ベンジルオキシカルボニル−2、6
−ジメチル)フェニル5−メチル−ベンズ[a]アクリ
ジニウム−12−カルボキシレートメトスルフェート 10ml中の乾燥ピリジン中の4−ベンジルオキシカルボ
ニル−2、6−ジメチルフェノール(0.27g、1mモ
ル)の溶液を、32mg、0.26mモルの4−ジメチルアミ
ノピリジン(アルドリッヒ、カタログ#10,770-0)で処
理した。この溶液に、上述のように調製したベンズ
[a]アクリジン−12−ホスゲンを加えた。溶液を3
時間に亘り100 ℃で加熱し、蒸発させて、残留物を得
た。この残留物は、トルエン/酢酸エチル(4:1)混
合物中の5%のメタノールの展開により3つの準備TL
C板(EMカタログ#5751)上で精製した。開始フェノ
ールのRfよりやや低いRfを有する発光帯を取り出
し、クロロホルム中の5%で溶出し、溶出物を蒸発させ
て、433 mgの黄色の中間体、(4−ベンジルオキシカ
ルボニル−2、6−ジメチル)フェニル ベンズ[a]
アクリジン−12−カルボキシレートを得た。
【0143】この中間体を20mlのトリクロロメタン中
に溶解させ、4mlの硫酸ジメチルで処理し、48時間に
亘り85℃で加熱して冷却した。黄色の沈殿物を濾過して
エーテルで洗浄し、222 mg(37%)の所望の生成物、
MS(FAB、チオグリセロールマトリックスマ):m
/z 526 (M)を得た。
【0144】接合体(conjugate )の調製 本発明の化学発光(chemiluminecsent)化合物におい
て、どの結合部位が選択されるかに依存して、好ましく
はR6 位置で、AFAC標識は、水性媒質または有機媒
質中の特定の結合パートナー、配位子、またはハプテン
と直接反応し得る。
【0145】化学発光化合物の別の位置も、結合パート
ナーと反応して接合体を形成する結合部位を有してもよ
いことは理解されよう。
【0146】化学発光標識は、適切なリービング基(le
aving group )、または物質と結合させるスペーサによ
り直接結合または連結して試験検定に利用する接合体を
形成するような反応基に容易に転化される官能基または
リービング基により結合する求電子官能基を含む。LE
AE−抗−TSH接合体を調製する実施例を以下に示
す。
【0147】LEAE−抗−TSH接合体の調製 1.36mlの0.1 Mリン酸塩緩衝液、pH8.0 中の単クロ
ーン性抗−TSH抗体の溶液(2mg、0.013 uモル)
を、1時間に亘りチャンバ温で240 ulのアセトニトリ
ル中のLEAE−NHSの溶液(43ug、0.067 uモ
ル)で処理した。0.5 mlの0.1 Mリン酸塩緩衝液、p
H8.0 中のリシンの溶液(10mg)を加えることによ
り、接合反応を停止させた。反応混合物を、充填済みの
セファデックスG−25カラム(1×20cm)を通過さ
せることにより、LEAE−接合抗−TSHを精製し、
10mMのリン酸塩、pH8で溶出した。ISCO UV
検出器によりこの溶出物を280 nmでモニタした。最初
の溶媒容量ピークが溶出したときに、所望の接合体を集
積した。
【0148】オリゴヌクレオチド接合体の調製 ポリヌクレオチドに発光標識の結合パーティー、ハプテ
ン、または配位子を接合する方法が、ヨーロッパ特許公
開第0 537 994 号(10/16/91に出願した米国特許出願第
775,399 号を優先権とする)に記載されており、この特
許は譲渡され、ここに参照文献として包含するものであ
る。
【0149】光発光スペクトル LBACおよび参照アクリジニウムエステルの光発光ス
ペクトルを、米国、カリフォルニア州、バーバンクの写
真研究所(コルモーゲン社の部門)の高速スペクトル走
査システム(FSSS)により測定した。実験は暗チャ
ンバ内で行なった。各試料を1mg/ml以上の濃度で
HPLC級のアセトニトリルに溶解させ、同一の溶媒で
希釈して明示した濃度の試料溶液を調製した。典型的な
測定には、核間ベンズ[a]アクリジニウムエステル
(2mg)を除いて、各化合物は10から100 ugで、13
×100 mmのホウケイ酸塩試験管中に含有された0.5 m
lのアセトニトリル中に別々に、もしくはともに混合し
て用いた。試験管を試験管ラックに配し、適切な高さに
掲げた。FSSS光学ヘッドを近接した距離で試験管の
正面に配し、レンズの焦点を試験管中の液体に合わせ
た。最初に、0.1 NのHNO3 および0.1 %のH2 2
を含有するフラッシング試薬(flashing reagent)#1
(チバコーニングダイアグナスティックス)0.35mlで
試料溶液を処理した。次いでチャンバ内を暗くし、0.25
NのNaOHおよび0.2 %のアーカッド(ARQUAD)を含
有するフラッシング試薬#2(チバコーニングダイアグ
ナスティックス)0.35mlを反応混合物にただちに加え
た。譲渡され、ここに参照文献として包含する米国特許
第4,927,769 号を参照のこと。試薬#2の添加後瞬時に
発せられた光を、試薬#2を加える前の分割秒(split
second)から開始して30秒間に亘り記録した2−MeO
−LEAE−イミデート(imidate )を除いて4秒間に
亘りFSSSにより記録した。様々な測定の結果を表I
に要約する。
【0150】
【表1】
【0151】記録した発光スペクトルを、図3A−3
E、図4A−4F、図5G−5J、および図6A−6D
に示す。図3A−3E、図4A−4F、および図5G−
5Jは、アクリジニウム環系を含む化学発光化合物およ
びベンズアクリジニウム環系を含む化学発光化合物の個
々の発光スペクトルを示している。アクリジニウムエス
テルとLBACの間の最大発光の差は、80から128 nm
の範囲に亘ることが分かったが、一方アクリジニウムエ
ステルとABACの間の差は約8から14nmであった。
図6A−6Dに示すように、アクリジニウムエステルと
LBACが試験管中で混合され、同時に発光した場合に
は、生じた組合せ発光スペクトル(combined emission
spedtra )は、これら2つの群の化学発光の発光信号が
非干渉の性質であることを示す、理想的に足し合わされ
たスペクトルプロファイルを示した。これらのデータ
は、利用する計測器およびその計測器の構成部品、特に
フィルタに依存して変化してもよいことが理解されよ
う。不変のままであった元の構成スペクトルの主要部分
は、実際に重複しないものであった。これらの重要な物
理特性は、試験試料中の少なくとも2つの物質を検出お
よび/または定量する試験検定、特に多数の分析物を検
出および/または定量する臨床診断検定に用いられる2
つ以上のサブクラスの化学発光化合物にとって必要な条
件を満たしている。好ましい方法において、検定法の1
つの成分として、ベンズアクリジニウム化合物、特に詳
しくは、N−アルキル化ベンズアクリジニウム化合物を
用いる。
【0152】光発光効率:約320 から650 nmの波長域
範囲を有するBG−38フィルタを装着したバーソルド
ルミノメータ(MLA−I)(チバコーニングダイアグ
ノスティック社)を用いて、20から97%の伝達効率で、
LBAC、ABAC、およびDMAE−Bzの光発光効
率を測定した(図6、パネルA)。別のフィルタをルミ
ノメータに組み込んで、伝達効率の範囲を広げてもよ
い。
【0153】各試料をアセトニトリル溶液中で1mg/
mlに調製し、続いてアセトニトリルで10ug/mlま
で希釈し、さらに、0.15MのNaCl、0.1 %のBS
A、0.05%のNaN3 を含有する10mMのリン酸塩緩衝
液、pH8中で1ng/ml、0.1 ng/mlおよび0.
01ng/mlの溶液を調製した。
【0154】光発光効率を測定するために、フラッシン
グ試薬#1および#2それぞれを続けて0.35mlずつ注
入することにより、25ulのブランク(緩衝液マトリッ
クス)または各試料を発光させた。光発光を2秒間集積
し、2回の測定の平均として算出した結果を表IIに示
す。
【0155】
【表2】
【0156】表IIに示したデータから、LBACの光発
光効率は、ベンズアクリジニウム核およびフェノキシ基
の置換基に依存して、DMAE−Bzの光発光効率の0.
21から1.39倍の範囲内であった。これらの測定は2秒の
信号集積に基づき、個々の化合物の発光速度論(flashi
ng kinetics )、例えば、いくつかの化合物は大部分の
信号を放出するのに2秒より長くかかる、光電子増倍管
の感度、およびスペクトル範囲の異なる点での光学フィ
ルタの伝達効率を考慮しなかったことに注意すべきであ
る。しかしながら、異性体ABACの極めて低い光発光
効率の点から見て、これらの発見はまったく予期せぬこ
とであった。この水準の光発光効率のために、LEAC
は、多数分析物検定を含む、感受性結合検定に有用であ
る。
【0157】光発光についての速度論(kinetics)研究 異なる置換基のフェノキシ部分、アクリジニウム核およ
びベンズアクリジニウム核への電子効果および/または
立体効果(steric effect )により、DMAEアナロ
グ、ABACおよびLEACの全てが同一条件下で同一
の発光速度(flashing rate )を有するわけではないこ
とが予測された。言い換えれば、2秒の信号集積時間内
では、異なる化合物は、放出可能な信号の合計に対して
異なる百分率を放出することが予測された。化合物を発
光させて、異なる長さの時間に亘り集積した信号の全て
を10秒の長さに亘り集積した信号に対して標準化するこ
とにより、10秒までの期間に亘る時間の経過についての
研究を行なってこれらの百分率を求めた。結果を表III
に要約する。
【0158】
【表3】
【0159】表III のデータにより示されるように、特
に0.5 秒と1秒の間隔において、発光速度論は、異なる
DMAEアナログ、ABACおよびLEACについて広
く変化する。放出百分率についてのこれらのデータは、
化学発光化合物を用いた様々な検定の発展のために化合
物の光発光効率を比較するのに用いるべきである。
【0160】相互に干渉しない光発光:上述したように
光発光のスペクトルが明確な相互非干渉特性を示すが、
複合タンパク質の形状にあるDMAEおよびLEAはま
た、登録された組合せ相対光単位(RLU)の減少も増
加もないことにより示されるように、閃光中の光発光に
おいて相互作用がないことを示す。
【0161】以下のように試験を行なった:DMAE−
抗−TSHおよびLEAE−抗−TSHを、0.15MのN
aCl、0.1 %のBSA、0.05%のNaN3 を有するリ
ン酸塩緩衝液(pH8)10mM中に2つの濃度で希釈し
たが、これは、その溶液が前述したように装備したバー
ソルドルミノメータを用いて同様な方法により発光した
ときに、25ulの溶液がそれぞれ約200,000 および1,00
0,000 RLUとなるように希釈を行なった。各試料(25
ul)の光発光を別々に測定し、次いでそれぞれ同容量
の試料を混合し、再度測定した。単独の試料測定におい
て、追加に等量の緩衝液を加えて混合した試料の測定と
同一の試料容量を維持した。この試験の結果を表IVに要
約する。
【0162】
【表4】
【0163】表IVの結果により、2つのトレーサの異な
る発光スペクトルは、光発光において互いにまったく干
渉しないことが分かった。この特徴により、これらのト
レーサが多数分析物結合検定(multi-analyte binding
assay )に利用できることが確認できる。好ましい方法
のLEAEは、N−アルキル化ベンズアクリジニウム化
合物である。
【0164】接合体LBACの安定性:LBAC−抗−
TSH接合体を調製し、水性媒質中での安定性について
試験した。DMAE−抗−TSH接合体もまた並行して
試験した。様々なpHで(0.1%のBSAを含有するク
エン酸塩−リン酸塩緩衝液を用いた)温度を関数とした
化学発光活性度の保持について、7日間に亘りモニタし
た。適切な濃度(0.8 −1.4 ×106 RLU/25ul)の
上述した接合体を、二組の異なる緩衝液(pH7.4 、8.
0 、8.5 、および9.0 )中に配した。一組を対照として
4−8℃に保持し、一方もう一組を37℃に設定した。緩
衝した試料(25ul)を上述したように定期的に発光さ
せた。結果を表Vに要約する。
【0165】
【表5】
【0166】表Vに要約した安定性の研究により、オル
ト置換のフェノキシ環への安定化効果は、アクリジニウ
ムエステルのクラスにも適応されるだけでなく、市販の
結合検定産物に要求されるような長期の熱ストレス条件
下のpH8辺りでの水性媒質中の化学発光活性度を保持
することについて、ほぼ同程度に一連のLBACにも効
果が見られる。pH8での非−オルト−置換アクリジニ
ウムエステル接合体の安定性データが顕著な対照として
記載されている。非−オルト−置換LEACもおそらく
水性媒質中で乏しい安定性しか有さない。
【0167】結合検定における信号対雑音:LEAE−
抗−TSHをTSH検定におけるトレーサとして用い
た。信号対雑音(S/N)比を測定することにより、性
能を評価した。DMAE−抗−TSHの性能も並べて比
較した。検定は以下のように構成した:100 マイクロリ
ットルの上述した接合体のいずれかを、100 マイクロリ
ットルのTSH標準物(MA、ミッドフィールド、チバ
コーニングダイアグノスティックス社)により、チャン
バ温で2時間に亘り培養した。0、0.5 、1.0 、16また
は100 uIu/mlのTSHのいずれかを含有する5つ
の標準物について、培養は別々に行なった。ヒツジ抗−
TSH(チバコーニングダイアグノスティックス社)に
固定化されたマジック(登録商標)磁気粒子500 ulを
上述した混合物に加え、次いでチャンバ温で30分間放置
することにより、2回目の培養を行なった。
【0168】溶液から粒子を磁気的に分離し、その溶液
にデカンテーションを行ない、次いで500 ulの水を加
えることにより最初に洗浄を行ない、その後もう1度磁
気分離を行なった。洗浄した粒子を100 ulの水中に懸
濁させた。上述した方法に従って、発光と計数を行なっ
た。TSHを含有するTSH標準の計数にゼロTSH基
準の比率を用いて、結果を表VIに示す。
【0169】
【表6】
【0170】表VIに示した結果により、LEAE接合体
を免疫学的検定方式に利用して容量−応答曲線が得ら
れ、従って、検定を有用なものにできることが分かっ
た。
【0171】二重分析物同時免疫学的検定: 装置の使用:DPLのハードウェアを説明するのに用い
た二重−PMTルミノメータ(DPL)のある実施態様
は、少なくとも2つの光電子増倍管(PMT)アッセン
ブリ、フラッシング試薬#2の注入ポンプ、および使捨
てキュベットを保持するために設計した立方体型光機密
チャンバを含む。チャンバの2つの対面する側では、2
つの管状PMT管を、キュベット内で生じる2つの異な
るスペクトル範囲の光がPMTアッセンブリにより個々
に記録できるように、別々に備え付けた。キュベット保
持チャンバの上面はヒンジ構造となっており、キュベッ
トを手動で挿入して取り出すことができる。さらに、上
面はまた、キュベットにフラッシング試薬#2を注入す
ることを目的として備え付けた固定プローブを有する。
各PMTアッセンブリ内において、光学フィルタを特定
のスペクトル範囲に選択し、キュベットとPMT管の間
に挿入する。
【0172】DPLの別の実施態様および配置を、試験
試料中の2つ以上の化学発光化合物または接合体の半自
動および自動検出のために設計してもよい。自動分析器
の構成物としてのルミノメータが上述したヨーロッパ特
許公開番号第0 502 638 号に記載されている。
【0173】適切な波長を遮断する光学フィルタを複数
選択することは、2つ以上の発光光スペクトルの識別に
必要不可欠である。
【0174】この種のフィルタは、業者から容易に得ら
れ、積層により変更したり、接合体のスペクトル信号の
検出および/または定量のためのPMTアッセンブリに
組み込むように特別に製造してもよい。フィルタを注意
深く選択することにより、発光信号を認識する能力を高
め、適切な修正により、発光が重複する多数の信号を識
別できるようにしてもよい。
【0175】以下に開示するように、同時LH/FSH
二重免疫学的検定を行なうために、長波長域フィルタ
(long pass filter)(MA、ホリストン、コリオンの
P/NLL−500)および短波長域フィルタ(short
pass filter )(コリオンのP/N P70−450)
を、一組のトレーサ、LEAE−抗−LHおよびDMA
E−抗−FSHから発せられた光の2つの異なるスペク
トル範囲に適合するように選択した。これらのトレーサ
は、それぞれLEAE−抗−TSHおよびDMAE−抗
−TSHについて上述したのと同様な方法で調製した。
2つのフィルタの透過率曲線を図7のパネルBおよびC
に示す。光学フィルタを選択する際には、最大信号透過
率および最小信号漏話の必要条件を考慮すべきである。
より望ましい透過率プロファイルおよび遮断を有する光
学フィルタを選択して、トレーサから発せられた光の透
過率を最大にしてもよく、および/または前述したよう
な漏話百分率(PCT)を改良するために特定の化学発
光化合物の発光スペクトル範囲と良好に適合させてもよ
い。DMAEおよびLEAEトレーサの組の測定のため
の長波長域フィルタと適合する短波長域フィルタとして
のフィルタP70−450は、例えばコリオンの積層C
S550/CS600フィルタ(図7、パネルD)と代
替することが好ましいことが分かった。このフィルタを
使用した結果、DMAEトレーサの記録RLUが2倍以
上も増加しただけでなく、表VII に示すように、漏話百
分率も著しく改良された。さらに、いっそう長い発光最
大値を有する多くのLEAE誘導体、例えば2−MeO
−LEAEを用いるときに、PCTをさらに減少させる
ためには、フィルタLL−500よりもLL−520
(図8E)のような長波長域フィルタを選択したほうが
よい。
【0176】一般的にパラメータの設定、発光の実行と
記録、使用するフィルタおよび利用する化学発光化合物
の関数として以下に記載するような信号補正、およびデ
ータの表示の基本機能を含むシステムをコントロールす
るために、適切なソフトウェアを含むパーソナルコンピ
ュータ装置を利用して、DPLに接続する。
【0177】漏話百分率(PCT)の測定:上述したよ
うに、DPLの2つのPMTアッセンブリに備えられた
2つの光学フィルタは、2つの異なるスペクトル範囲の
発光光を透過させるように意図したものである:長波長
域フィルタは、LEAEトレーサからの長波長の発光に
適合したものであり、短波長域フィルタはDMAEトレ
ーサからの短波長の発光に適合したものである。しかし
ながら、図4、5および6に示したように、透過率曲線
と交差試験対(cross-matching pair )の発光スペクト
ルとの間のわずかな重複のために、一方のトレーサによ
り発せられた信号は、この信号を検出するように意図し
た第1のPMTにより検出されるだけでなく、他方のト
レーサを検出するように意図した第2のPMTによって
もわずかに検出され得る。そして、その逆もまた同様で
ある。一方のトレーサの信号のその部分は第2のPMT
により記録され得るが、2つのトレーサが同一管中で同
時に発光したときに、みかけのRLUを補正して各PM
Tアッセンブリにより検出される各トレーサの純粋な信
号を得るように、それらのトレーサを二重分析物免疫学
的検定に使用する前に各トレーサについて百分率でその
部分を別々に定量しなければならない。
【0178】表VII はいくつかのトレーサの組について
測定したPCTを示す。以下に記載する同時のLH/F
SH二重分析物検定において、抗−FSH−DMAEお
よび抗−LH−LEAEを用いた。発光最大値が大きく
離れたアクリジニウム化合物とベンズアクリジニウム化
合物を選択し、光学フィルタを適切に選択したことによ
り、多分析物検定に理想の最小PCTが実現できること
を説明するために、他のトレーサの組を含んだ。それぞ
れの場合において、第2のPMTからの微小信号を第1
のPMTからの主要信号で割り、その結果に100 %をか
けることにより、PCTを得た。
【0179】試料の濃度を、第1の信号が25ulの試料
当たり100,000 から1,500,000 RLUの範囲に入るよう
に、適当に選択した。25ulの第1のトレーサ溶液、30
0 ulのフラッシング試薬#1をピペットを用いて連続
してキュベットに測り取り、精製した溶液を簡単に混ぜ
合わせ、このキュベットをPMTハウジングに挿入し、
キーボードを操作して300 ulのフラッシング試薬#2
を注入することにより試料を発光させて、各測定を行な
った。
【0180】
【表7】
【0181】広域のRLUに亘りPCTが不変であるこ
とが、多分析物検定信号補正には重要である。表VIII
は、積層CS550/CS600フィルタとLL520
フィルタを、それぞれ短波長域信号と長波長域信号を通
過させるのに用いた場合、抗体−TSH−DMAEにつ
いてのPCTは、10,000から7,000,000 計数のRLU範
囲もしくはそれより広い範囲に亘り0.16%の標準偏差で
2.96%の平均値を有し、一方抗−CKMB−LEAEに
ついてのPCTは、50,000から7,000,000 計数のRLU
範囲もしくはそれより広い範囲に亘り0.23%の標準偏差
で4.79%の平均値を有することを示している。
【0182】
【表8】
【0183】二重トレーサ測定における漏話によりみか
けのRLUを補正するための等式DMAEおよびLEA
Eの誘導体またはトレーサを混合し、同時に発光させる
場合、観察した長波長域信号と短波長域信号は以下のよ
うに分類できる:
【0184】
【数1】
【0185】S(s)およびS(l)がそれぞれ観察し
た短波長域信号と長波長域信号である場合、S(DMA
E)およびS(LEAE)は、それぞれ観察した短波長
域信号と長波長域信号におけるDMAEおよびLEAE
による信号部分である。それらの信号もまた補正DMA
E信号および補正LEAE信号と称する。S′(LEA
E)およびS′(DMAE)は、それぞれDMAEおよ
びLEAE漏話による長波長域信号と短波長域信号の部
分である。b1およびb2は、それぞれDMAEトレー
サおよびLEAEトレーサの存在しない場合の検定成分
とシステムのノイズによる混合信号である。
【0186】PCT(以下にk1およびk2により示
す)はどの特定のDMAEトレーサおよびLEAEトレ
ーサにも一定であるので、以下の関係式が成立する:
【0187】
【数2】
【0188】k1およびk2は、それぞれSMAEトレ
ーサおよびLEAEトレーサのPCTである。
【0189】式(4)を式(1)に代入すると:
【0190】
【数3】
【0191】式(5)を式(3)に、式(3)を式
(2)に代入すると:
【0192】
【数4】
【0193】これを整理すると:
【0194】
【数5】
【0195】式(5)および(6)により、それぞれD
MAEトレーサによる補正短波長域信号およびLEAE
トレーサにより長波長域信号が得られる。同時のLH/
FSH二重分析物検定を行なう実行可能性を示すことを
目的として、混合マトリックスおよびシステムのノイ
ズ、b1およびb2の測定は重要ではないことが分かっ
た。従って、以下の二重分析物検定の実施例において
は、それらのノイズは両者とも信号補正に0の値を設定
した。
【0196】黄体化ホルモン(LH)および卵胞刺激ホ
ルモン(FSH)の同時免疫学的検定:本発明の目的の
1つは、2つの異なる化学発光標識または接合体を用い
ることにより、1つの試料中の2つ以上の物質または分
析物を同時に検出および/または定量する方法を提供す
ることにある。
【0197】ある実施態様において、検定システムはD
MAE標識FSH抗体およびLEAE標識LH抗体を利
用する。以下の実施例は、1つの化学発光トレーサを検
定システム中に導入することにより各分析物を単独の分
析物として検定する場合、または2つの化学発光トレー
サを用いる二重分析物システムにおいて各分析物を単独
の分析物として検定する場合、LHおよびFSH標準曲
線と試料の回収率(sample recovery )は実験誤差の範
囲内では同一であることを示している。実施例はさら
に、対応する結合パートナー、例えば抗体が得られる2
つの物質の同時検定において一組のDMAEおよびLE
ACから調製したトレーサが利用できることを示してい
る。
【0198】実施例15.二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた単一FSH検定:トレーサの選択により単
一または二重分析物検定として検定が行なえるように、
マジックライトFSHキットの成分およびプロトコル
(チバコーニングダイアグノスティックス)を改良し
た。抗−FSH抗体に結合した常磁性粒子(PMP)お
よび抗−LH抗体に結合したPMPからなる固相を、マ
ジックライトFSHキットの固相から緩衝液希釈物を除
去し、マジックライトLHキットの固相(チバコーニン
グダイアグノスティックス)中にこれらの粒子を懸濁さ
せることにより調製した。キットトレーサ、抗−FSH
−DMAEを、マジックライトLHキットトレーサ緩衝
液により1:2に希釈した。目盛定めのための標準物
は、FSHおよびLHの両方を含有した。既知の濃度の
精製ヒトFSHおよびヒトLHをウマ血清ベースプール
(basepool)中に加えることにより標準物を調製した。
公称標準値は0、0.9 、2.2 、4.4 、8.8 、21.9、43.
8、87.5、140.0 、201.0 mIu/mlのFSHであっ
た。公称LH濃度は、0、1.0 、2.5 、5.0 、10.0、2
5.0、50.0、100.0 、160.0 、230.0 mIu/mlのL
Hであった。精製ヒトFSHおよびヒトLHの両者の様
々な濃度のヒト血清プールを加えることにより、分析の
試料を調製した。さらに、ヒトFSHおよびヒトLHを
含有する血清ベースの多成分キャリブレータを試料とし
て用いた。
【0199】検定を行なうために、50ulの各標準また
は試料および200 ulの希釈FSHトレーサをうず流混
合して(vortex mixed)室温で30分間に亘り培養した。
500ulの結合抗−FSH/抗−LH固相を加え、うず
流混合し、室温で30分間に亘り培養した。マジックライ
トラック(チバコーニングダイアグノスティックス)中
で反応した固相を磁気的に3分間に亘り分離し(ヨーロ
ッパ特許第136126号を参照のこと)、上澄液をデカンタ
ーに移した。次に、反応させた固相を1.0 mlの蒸留水
で洗浄し、3分間に亘り分離した。上澄液をデカンター
に移して、100ulの上流水を加えた。各試料を手動で
キュベットに移し、上述したDPL上で5秒間計測し
た。短波長透過(DMAE)チャンネルから得た結果
(RLU)を用いて、各試料におけるFSH濃度を計算
した。スプラインデータ整理ルーチン(spline data re
duction routine )による10点目盛定めを使用して、濃
度を計算した。各標準と試料を三重に検定した。この検
定のRLUおよび%CVCを、FSH単一分析物検定と
いう項目の表IXに示す。FSH試料回収率を、FSH単
一分析物検定という項目の表Xに示す。%B/Bmax
対log FSH濃度として示したFSH標準曲線をF
SH単一分析物検定として示した図11に示す。
【0200】実施例16.二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた単一LH検定 実施例15に記載した固相試薬、標準、および試料を用
いてLH検定を行なった。抗−FSH−DMAEトレー
サを、マジックライトFSHキットトレーサ希釈物で
1:2に希釈した抗−LH−LEAEトレーサと置き換
えた。長波長透過(LEAE)チャンネルから得たRL
Uの結果を用いてLH試料濃度を計算したことを除いて
は、実施例13に記載した検定方法論をこの検定に適応
した。
【0201】1.0 mIu/mlのLH標準を除外した、
実施例15に記載した9の標準を用いて検定の目盛を定
めた。LH単一分析物検定という項目で、この検定の結
果を表XIおよび表XII に記載した。標準曲線をLH単一
分析物検定として示した図12に示す。
【0202】実施例17.二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた同時LH/FSH検定:実施例15および
16に記載した固相試薬、標準、および試料を用いて1
つの試験管中で二重標識LH/FSH検定を行なった。
トレーサは、マジックライトFSHキットトレーサ、す
なわち抗−LH−LEAEトレーサ中で1:2に希釈し
た抗−FSH−DMAEからなる。検定方法論は、実施
例15に記載したものど同一であった。濃度の計算の前
に、各チャンネルからの元のRLUを漏話について数学
的に補正した。これらの補正RLUから生じた補正RL
Uりおよび濃度を表IXからXII に示し、二重分析物検定
として示す。表X−XII におけるt検定により、単一分
析物検定対二重分析物検定についての平均試料回収率を
比較する。FSHおよびLH標準曲線を図11および1
2に示し、それぞれFSHおよびLH二重分析物検定と
して示す。
【0203】検定および検定方式 本発明は化学発光化合物に関し、より詳しくは、試験試
料中の2つ以上の物質を同時に検出するための2つ以上
の化学発光接合体を使用する使用方法に関するものであ
る。この開示には、そのような検定に、ベンズアクリジ
ニウム化合物、および好ましくはN−アルキル化ベンズ
アクリジニウム化合物を使用することが教示されてい
る。
【0204】試験物質は試験試料中で検出および/また
は定量したいいかなる成分または分析物を含み、制限さ
れるものではないが、単一の構造の2つ以上、例えば核
酸配列または染色体、ゲノムまたは分子の異なる座の2
つ以上を含み、この場合、成分または分析物は、適切な
検定方法がそれに対して構成できる核酸、タンパク質、
配位子、ハプテンまたは他の材料のような生物学上の源
または工業上の源であってもよい。試験試料および/ま
たは物質を前処理して試験法により検定可能にする必要
があってもよいことが理解されよう。検出すべき試験物
質および量によって、例えば、検出のための化学発光標
識の使用のためではなく、感受性に関することのため
に、行なえる検定の種類が制限されるかもしれない。様
々な内標準または対照を検出および/または定量のため
の試験試料に加えて、検定の性能を評価してもよい。免
疫学的検定により例証した診断検定、ハイブリタイゼー
ション検定および増幅検定では、その方式に化学発光標
識をますます多く含むようになっている。そのような検
定の設計および方式は当業者によく知られており、技術
文献および特許文献に広く発表されている。例えば、検
定方式は、反応生成物または非反応試薬を分離して、検
出および/または定量のための移送管(transfer tube
)へ移すことを必要としてもよい。そのような分離技
術は競合検定、固相検定のために、または干渉を制限す
るのに有用であろう。
【0205】本発明のある実施態様において、2つ以上
の化学発光接合対を増幅検定における標識として利用す
る。代表的な増幅検定は、制限すべきではないが、ポリ
メラーラゼチェーンリアクション(PCR)、組換えR
NAの自己触媒複製およびミディバリアント(midivari
ant )DNAまたはRNAの増幅を含む。本出願人に譲
渡され、ここに参照文献として包含するヨーロッパ特許
公開第481 704 号(米国特許出願598,269 号(10/16/9
0)を優先権とする)を参照のこと。技術文献および特
許文献に教示されたような方法を、化学発光標識、特に
関心のある標的配列の検出のための2つ以上の化学発光
標識を含有するように適応してもよい。多数標識方法
(multi-label method)を用いることの利点は、複数の
標的配列または1つ以上の標的配列および内標準を検出
および/または定量することにある。そのような方法の
実施例は、1つ以上の標的配列を含有すると思われる試
験試料を調製すること、その標的配列を増幅すること、
それぞれが標的配列と関連するような少なくとも2つの
化学発光接合体を調製すること、および少なくとも2つ
の化学発光接合体の発光により増幅した標的配列を同時
に検出および/または定量することを含む。本方法の別
の工程において、内参照、対照または対照システムを検
定に加えて、検定性能および結果を確認してもよい。内
参照は、標的配列と同様に増幅してもよい。
【0206】そのような検定のために化学発光標識を使
用することにより、本発明の有用性が説明できる。
【0207】本発明の化学発光化合物は市販のためのキ
ットの形態にパッケージするように適応できる。これら
キットの化学発光標識は、試験試料中で検出しようとす
る物質に特異的な適切な物質または材料に接合してもよ
い。適切な官能基を、様々な検定および他の用途に使用
するための化学発光化合物に加えてもよい。本発明の方
法を利用してもよい検定の実施例は、限定するものでは
ないが、少なくとも2つの異なる特異性の抗体を含む検
定;少なくとも2つの抗原を含む検定、少なくとも1つ
の抗原および少なくとも1つの抗体を含む検定;および
癌、感染病、遺伝的異常、遺伝的気質、遺伝的評価を示
す分子および医薬治療をモニタする分子の検定を含む。
【0208】この開示により、本発明の範囲と材料から
逸脱することなく、様々な他の変更が当業者にとっては
明確であり、容易に行なえることが理解されよう。しか
しながら、請求の範囲はここに述べた記載を制限するも
のではなく、本発明に属する特許性を有する新規事項の
すべてを包含するものとして構成したことを意図する。
この請求の範囲は、本発明に関する同等物として当業者
にみなされる全ての特徴を含む。ここに記載した実施例
は説明を意図するものであり、制限を意図するものでは
ないことに注意されたい。
【0209】
【表9】
【0210】
【表10】
【0211】
【表11】
【0212】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【図1】代表的なアクリジウニムエステル、ABAC、
およびLBACの構造式
【図2】代表的なアクリジウニムエステル、ABAC、
およびLBACの構造式
【図3】アクリジニウムエステルおよびABACの発光
スペクトルを示すグラフ
【図4】LBACの発光スペクトルを示すグラフ
【図5】LBACの発光スペクトルを示すグラフ
【図6】アクリジニウムエステルとLBACの混合物の
発光スペクトルを示すグラフ
【図7】様々な光学フィルタの透過率曲線
【図8】様々な光学フィルタの透過率曲線
【図9】光学フィルタ(コリオンLL500)の透過率
曲線とDMAE−Bzの発光スペクトルとの間の重複区
域を示すグラフ
【図10】光学フィルタ(コリオンP70−450)の
透過率曲線とLEAE−Bzの発光スペクトルとの間の
重複区域を示すグラフ
【図11】二重PMTルミノメータで読み取ったFSH
標準曲線検定を示すグラフ
【図12】二重PMTルミノメータで読み取ったLH標
準曲線検定を示すグラフ
フロントページの続き (72)発明者 ウォルター フィッシャー スイス国 シーエイチ−4153 ライナッ ハ フォーゲーゼンシュトラーセ 77 (72)発明者 ジョン ティー ユンガー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02052 メッドフィールド ウィチタ ロード 29 (72)発明者 エリザベス ケイ クローデル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02174 アーリントン オーヴァールッ ク ロード 84 (56)参考文献 特表 平4−506403(JP,A) 国際公開92/013264(WO,A1) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/48 - 33/98 C07D 219/04 C07D 221/18

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の化学式で表される化学発光化合
    物: 【化1】 ここでWは炭素であり、 あるいは、C、W、CまたはC10は−N=と
    置換でき; あるいは、Wを省いてCをCに結合させ、C
    、CまたはC10は−O−、−S−、−NH
    −、または−NR−と置換でき; Rは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するア
    ルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルを含
    み; R、R、RおよびR10は、水素、置換ま
    たは非置換アリール(ArRまたはAr)、ハロゲン化
    物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
    R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−SR、
    −SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)
    NHR、または−NHC(O)Rから選択される同一の
    基または異なる基であり; RはC1−4 で1つまたは多数の置換基を含み; Rはまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
    合芳香環であってもよく; RはC、W、CまたはC10で1つまたは
    多数の置換基を含み; A−は対イオンであり; Xは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、X
    が酸素または硫黄のときにZが省かれ、Xが窒素のとき
    にZが−SO−Y′であり、Y′がYと等しく、Y
    とY′の置換基は同一である必要はなく; Yは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
    ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
    または式: 【化2】 の多置換アリール部分を含むものであり; RおよびRはアルキル、アルケニル、アルキニ
    ル、アルコキシル、アルキルチオールまたはアミドを含
    み、 RおよびRは上述したR、RおよびR
    10のいずれかであり; R=−R11−R12、 ここでR11は、必要条件ではないが、必要に応じて、
    20までのヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖
    アルキル、置換または非置換アリールまたはアラルキル
    であり; R12は、リービング基、またはリービング基もしくは
    −Q−R−Nu、−Q−R(I)Nu、−Q−N
    u、−R−Nu、または−Nuに結合する求電子官能基
    を含み、ここでnは少なくとも1であり、Nuは求核基
    であり、Qは官能結合であり、Iはイオン基またはイオ
    ン化基であり; RとR、およびRとRは相互に交換で
    き; Rは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
    ルである。
  2. 【請求項2】 前記対イオンが、CHSO−、
    FSO−、CFSO−、CSO
    −、CHSO−およびハロゲ
    ン化物を含むことを特徴とする請求項1記載の化学発光
    化合物。
  3. 【請求項3】 異性部分環、フラノ部分環、チオフェノ
    部分環、ピロ部分環またはピリド部分環が、Rから
    なる置換基を有することを特徴とする請求項1記載の化
    学発光化合物。
  4. 【請求項4】 a. (4−ベンジルオキシカルボニル
    −2、6−ジメチル)フェニル5−メチル−ベンズ
    [b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
    ロスルホネート、 b. (2、6−ジメチル−4−N−サクシンイミジル
    オキシカルボニル)フェニル5−メチル−ベンズ[b]
    アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオロスル
    ホネート、 c. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジイ
    ソプロピル)フェニル5−メチル−ベンズ[b]アクリ
    ジニウム−12−カルボキシレートフルオロスルホネー
    ト、 d. N−(4−メトキシフェニル−N−[3−(ベン
    ジルオキシカルボニル)フェニルスルホニル]5−メチ
    ル−ベンズ[b]アクリジニウム−12−カルボキシア
    ミドフルオロスルホネート、 e. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメ
    チル)フェニル3−エトキシ−5−メチル−ベンズ
    [b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
    ロスルホネート、 f. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメ
    チル)フェニル3−(N、N−ジエチル−N−メチル−
    アンモニウム)エトキシ−5−メチル−ベンズ[b]ア
    クリジニウム−12−カルボキシレートジフルオロスル
    ホネート、 g. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメ
    チル)フェニル2−メトキシ−5−メチル−ベンズ
    [b]アクリジニウム−12−カルボキシレートフルオ
    ロスルホネート、 h. (2、6−ジメチル−4−サクシンイミジルオキ
    シカルボニル)フェニル5−メチル−2−(トリメチル
    アンモニウム)エトキシ−ベンズ[b]アクリジニウム
    −12−カルボキシレートジフルオロスルホネート、 i. (4−ベンジルオキシカルボニル−2、6−ジメ
    チル)フェニル5−(3−スルホプロピル)−ベンズ
    [b]アクリジニウム−12−カルボキシレート、 j. (2、6−ジメチル−4−N−サクシンイミジル
    オキシカルボニル)フェニル2−メトキシ−5−(2−
    スルホエチル)−ベンズ[b]アクリジニウム−12−
    カルボキシレート、 k. [2、6−ジメチル−4−(2−メトキシイミノ
    エチル)]フェニル2−メトキシ−5−メチル−ベンズ
    [b]アクリジニウム−12−カルボキシレート二塩化
    物、 からなる群より選択されることを特徴とする請求項1記
    載の化学発光化合物。
  5. 【請求項5】 試験検定に使用するために結合パートナ
    ーと接合されることを特徴とする請求項1記載の化学発
    光化合物。
  6. 【請求項6】 a. ベンズ[b]アクリジン−12−
    カルボン酸ヒドロクロライド、 b. 3−EtO−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
    ルボン酸、 c. 3−ヒドロキシ−ベンズ[b]アクリジン−12
    −カルボン酸、 d. 2−MeO−ベンズ[b]アクリジン−12−カ
    ルボン酸、 e. 2−ヒドロキシ−ベンズ[b]アクリジン−12
    −カルボン酸、 からなる群より選択される、請求項1記載の化学発光化
    合物を合成するのに使用される中間体化合物。
  7. 【請求項7】 請求項1記載の化学発光化合物の合成に
    用いられる中間体化合物であって、式: 【化3】 で表され、 ここでWは炭素であり、 あるいは、C、W、CまたはC10は−N=と
    置換でき; あるいは、Wを省いてCをCに結合させ、C
    、CまたはC10は−O−、−S−、−NH
    −、または−NR−と置換でき; R、R、RおよびR10は、水素、置換ま
    たは非置換アリール(ArRまたはAr)、ハロゲン化
    物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
    R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−SR、
    −SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)
    NHR、または−NHC(O)Rから選択される同一の
    基または異なる基であり; RはC1−4 で1つまたは多数の置換基を含み; Rはまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
    合芳香環であってもよく; RはC、W、CまたはC10で1つまたは
    多数の置換基を含み; Rは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
    ルであることを特徴とする中間体化合物。
  8. 【請求項8】 請求項1記載の化学発光化合物の合成に
    用いる中間体化合物であって、式: 【化4】 で表され、 ここでWは炭素であり、 あるいは、C、W、CまたはC10は−N=と
    置換でき; あるいは、Wを省いてCをCに結合させ、C
    、CまたはC10は−O−、−S−、−NH
    −、または−NR−と置換でき; R、R、RおよびR10は、水素、置換ま
    たは非置換アリール(ArRまたはAr)、ハロゲン化
    物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
    R、−CN、−COOH、−SCN、−OR、−SR、
    −SSR、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)
    NHR、または−NHC(O)Rから選択される同一の
    基または異なる基であり; RはC1−4 で1つまたは多数の置換基を含み; Rはまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
    合芳香環であってもよく; RはC、W、CまたはC10で1つまたは
    多数の置換基を含み; Xは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、X
    が酸素または硫黄のときにZが省かれ、Xが窒素のとき
    にZが−SO−Y′であり、Y′がYと等しく、Y
    とY′の置換基は同一である必要はなく; Yは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
    ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
    または式: 【化5】 の多置換アリール部分を含むものであり; RおよびRはアルキル、アルケニル、アルキニ
    ル、アルコキシル、アルキルチオールまたはアミドを含
    み、 RおよびRは上述したR、RおよびR
    10のいずれかであり; R=−R11−R12、 ここでR11は、必要条件ではないが、必要に応じて、
    20までのヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖
    アルキル、置換または非置換アリールまたはアラルキル
    であり; R12は、リービング基、またはリービング基もしくは
    −Q−R−Nu、−Q−R(I)Nu、−Q−N
    u、−R−Nu、または−Nuに結合する求電子官能基
    を含み、ここでnは少なくとも1であり、Nuは求核基
    であり、Qは官能結合であり、Iはイオン基またはイオ
    ン化基であり; RとR、およびRとRは相互に交換で
    き; Rは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
    ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
    ルであることを特徴とする中間体化合物。
  9. 【請求項9】 試験試料中の少なくとも2つの物質を検
    出および/または定量する方法であって、それぞれが前
    記試験試料中の物質と関係付けられている少なくとも2
    つの異なる化学発光化合物の発光信号を同時に検出する
    工程からなり、前記化学発光化合物の各々の発光信号を
    それぞれの発光スペクトルにより識別して前記物質を検
    出および/または定量し、前記化学発光化合物の少なく
    とも1つが請求項1記載の化学発光化合物であることを
    特徴とする検出および/または定量方法。
  10. 【請求項10】 前記化学発光化合物の少なくとも1つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項9
    記載の検出および/または定量方法。
  11. 【請求項11】 前記化学発光化合物の各々が、試験物
    質に対して特異的で該試験物質に結合する結合パートナ
    ーに接合して前記試験試料中で検出および/または定量
    される反応生成物を形成することを特徴とする請求項9
    記載の検出および/または定量方法。
  12. 【請求項12】 前記化学発光接合体の発光スペクトル
    は、各発光最大値同士が、各接合体の信号を識別するの
    に十分な程離れている点で識別可能であることを特徴と
    する請求項11記載の検出および/または定量方法。
  13. 【請求項13】 前記化学発光接合体の発光スペクトル
    は、各発光最大値同士が約60ナノメートルよりも大きく
    離れている点で識別可能であることを特徴とする請求項
    11記載の検出および/または定量方法。
  14. 【請求項14】 前記発光スペクトルの各々が約100 か
    ら250 nmの幅を有することを特徴とする請求項9記載
    の検出および/または定量方法。
  15. 【請求項15】 検出および/または定量のための前記
    試験試料中に追加の試験物質を導入して、該追加の物質
    を対照または内部参照として機能させることを特徴とす
    る請求項9記載の検出および/または定量方法。
  16. 【請求項16】 前記方法が1つの反応媒質または移送
    管中で行なわれることを特徴とする請求項9記載の検出
    および/または定量方法。
  17. 【請求項17】 前記方法が、工業検定および臨床診断
    検定を含む分析検定を行なうのに有用であることを特徴
    とする請求項9記載の検出および/または定量方法。
  18. 【請求項18】 免疫学的検定、雑種形成検定および増
    幅検定が含まれることを特徴とする請求項17記載の検
    出および/または定量方法。
  19. 【請求項19】 前記免疫学的検定が同種免疫学的検定
    または異種免疫学的検定であることを特徴とする請求項
    18記載の検出および/または定量方法。
  20. 【請求項20】 試験試料中の標的配列を増幅させる方
    法であって、 a. 1つ以上の標的配列を含有すると思われる試験試
    料を用意し、 b. 該試験試料に内部参照または対照を加え、 c. 前記標的配列を増幅させ、 d. それぞれが標的配列および前記内部参照と関係つ
    けられる少なくとも2つの異なる化学発光接合体を用意
    し、 e. 該2つの化学発光接合体の発光により、増幅した
    標的配列および内部参照を同時に検出および/または定
    量する各工程からなり、 前記化学発光接合体の少なくとも1つが請求項1記載の
    化学発光化合物を含むことを特徴とする増幅方法。
  21. 【請求項21】 前記化学発光接合体の少なくとも1つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項2
    0記載の増幅方法。
  22. 【請求項22】 前記試験試料を、前記方法に使用する
    前に予備処理することを特徴とする請求項20記載の増
    幅方法。
  23. 【請求項23】 前記内部参照が、増幅を行なわない標
    的配列であることを特徴とする請求項20記載の増幅方
    法。
  24. 【請求項24】 前記内部参照が、増幅を行なう標的配
    列であることを特徴とする請求項20記載の増幅方法。
  25. 【請求項25】 前記試験試料の標的配列に対して特異
    的な少なくとも1つの結合反応を行なう工程を含むこと
    を特徴とする請求項20記載の増幅方法。
  26. 【請求項26】 前記内部参照に対して特異的な少なく
    とも1つの結合反応を行なう工程を含むことを特徴とす
    る請求項20記載の増幅方法。
  27. 【請求項27】 前記結合反応が雑種形成反応であるこ
    とを特徴とする請求項25または26記載の増幅方法。
  28. 【請求項28】 試験試料中の標的配列を増幅させる方
    法であって、 a. 1つ以上の標的配列を含有すると思われる試験試
    料を用意し、 b. 該標的配列を増幅させ、 c. それぞれが標的配列と関係付けられる少なくとも
    2つの異なる化学発光接合体を用意し、 d. 該少なくとも2つの化学発光接合体の発光によ
    り、増幅した標的配列を検出および/または定量する各
    工程からなり、 前記化学発光接合体の少なくとも1つが、請求項1記載
    の化学発光化合物を含むことを特徴とする増幅方法。
  29. 【請求項29】 前記化学発光接合体の少なくとも1つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項2
    8記載の増幅方法。
  30. 【請求項30】 試験試料中の少なくとも2つの物質を
    検出および/または定量する化学発光標識検定方法であ
    って、 a. 前記試験試料中の1つの試験物質に対して特異的
    な請求項1記載の化学発光化合物を含む第1の化学発光
    試薬を前記試験試料に加え、 b. 前記試験試料中のもう1つの試験物質に対して特
    異的なアクリジニウム環系を含む第2の化学発光試薬を
    前記試験試料に加え、 c. 前記化学発光試薬を活性化して、前記試験物質を
    検出および/または定量するための識別可能な発光信号
    を得る各工程からなることを特徴とする化学発光標識検
    定方法。
  31. 【請求項31】 前記方法が結合工程を含み、前記化学
    発光試薬の各々が前記試験試料中の試験物質に対して特
    異的な接合分子を含んでおり、反応生成物が形成される
    ように試験物質との結合反応を生じさせることを特徴と
    する請求項30記載の方法。
  32. 【請求項32】 試験試料中の2つ以上の物質を検出お
    よび/または定量するキットであって、少なくとも2つ
    の異なる化学発光化合物からなり、各化合物が試験試料
    中の少なくとも1つの物質に対して特異的である結合パ
    ートナーに接合し、前記化学発光化合物の少なくとも1
    つが請求項1記載の化学発光化合物であることを特徴と
    するキット。
  33. 【請求項33】 試験試料中の2つ以上の物質について
    同時に検定を行なうための試験キットであって、 a. 請求項1記載の化学発光化合物を含む第1の化学
    発光試薬、および b. アクリジニウム環系を含む第2の化学発光試薬を
    含有することを特徴とする試験キット。
  34. 【請求項34】 試験試料中の2つ以上の物質について
    同時に検定を行なうための試験キットであって、少なく
    とも2つの異なる化学発光試薬からなり、該化学発光試
    薬の少なくとも1つが請求項1記載の化学発光化合物を
    含み、各試薬が前記試験物質を検出および/または定量
    するための識別可能な発光スペクトルを有することを特
    徴とする試験キット。
  35. 【請求項35】 前記化学発光試薬の少なくとも1つ
    は、アクリジニウム環系であることを特徴とする請求項
    34記載の試験キット。
JP05010994A 1993-03-19 1994-03-22 化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法 Expired - Lifetime JP3437244B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US035130 1993-03-19
US08/035,130 US5395752A (en) 1993-03-19 1993-03-19 Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08320319A JPH08320319A (ja) 1996-12-03
JP3437244B2 true JP3437244B2 (ja) 2003-08-18

Family

ID=21880831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP05010994A Expired - Lifetime JP3437244B2 (ja) 1993-03-19 1994-03-22 化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法

Country Status (6)

Country Link
US (3) US5395752A (ja)
JP (1) JP3437244B2 (ja)
AU (1) AU677259B2 (ja)
CA (1) CA2118891A1 (ja)
PL (1) PL178927B1 (ja)
WO (1) WO1994021823A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111148572A (zh) * 2017-06-06 2020-05-12 西北大学 跨界面磁性分离

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3750503T2 (de) * 1986-10-22 1995-02-09 Abbott Lab Chemilumineszierende Acridinium- und Phenantridiniumsalze.
US6083689A (en) * 1990-10-16 2000-07-04 Bayer Corporation Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable DNA templates
US5395752A (en) * 1993-03-19 1995-03-07 Ciba Corning Diagnostics Corp. Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
AU679008B2 (en) * 1993-05-06 1997-06-19 Chiron Diagnostics Corporation Mixed luminescent conjugate test assays
US5801008A (en) * 1995-05-31 1998-09-01 Kyowa Medex Co., Ltd. Method of quantitative determination of peroxide, a peroxidation-active substance or a pyrazolopyridopyridazine derivative
US5783453A (en) * 1995-06-29 1998-07-21 Chiron Diagnostics Corporation Non-separation specific binding chemiluminescent assay
US6602657B1 (en) 1995-12-28 2003-08-05 Tropix, Inc. Multiple reporter gene assay
US5874216A (en) * 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
US6436666B1 (en) * 1996-10-17 2002-08-20 Chiron Corporation Protease regulator screening assay
US6146836A (en) * 1997-05-19 2000-11-14 Bayer Corporation Immunoassays using anti-allotypic monoclonal antibodies
US6165800A (en) * 1997-05-30 2000-12-26 Bayer Corporation Chemiluminescent energy transfer conjugates and their uses as labels in binding assays
EP1021719B1 (en) 1997-09-22 2007-02-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Method for detecting antibodies in a sample
US20030135122A1 (en) * 1997-12-12 2003-07-17 Spectrx, Inc. Multi-modal optical tissue diagnostic system
US6055451A (en) 1997-12-12 2000-04-25 Spectrx, Inc. Apparatus and method for determining tissue characteristics
EP0959372A3 (en) * 1998-05-22 2000-07-19 Rohm And Haas Company Light pipe composition
ES2320055T3 (es) 1998-08-11 2009-05-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compuestos de uso acridino quiminolumicentes en el infrarrojo cercano y sus usos.
JP4474050B2 (ja) * 1998-09-11 2010-06-02 スペクトルックス・インコーポレイテッド マルチモード光学組織診断システム
US6673560B1 (en) 1998-11-25 2004-01-06 Bayer Corporation Measurement of hydride using chemiluminescent acridinium compounds and applications thereof
US6013291A (en) * 1998-12-11 2000-01-11 General Mills, Inc. Microwave popcorn with liquid fat and method of preparation
GB9902659D0 (en) * 1999-02-05 1999-03-31 Microbiological Res Authority Assay with reduced background
US7209836B1 (en) * 1999-07-16 2007-04-24 Perkinelmer Las, Inc. Method and system for automatically creating crosstalk-corrected data of a microarray
US6346384B1 (en) 2000-03-27 2002-02-12 Dade Behring Inc. Real-time monitoring of PCR using LOCI
EP1305632B1 (en) 2000-05-04 2011-07-27 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Methods for detection of multiple analytes
EP1430017A2 (en) * 2001-09-26 2004-06-23 Theravance, Inc. Substituted phenol compounds useful for anesthesia and sedation
US6723851B2 (en) * 2001-10-31 2004-04-20 Quest Diagnostics Investment Incorporated Chemiluminescent compounds and use thereof
US7319041B2 (en) * 2002-09-27 2008-01-15 Siemens Medical Solutions Diagnostic Applications of acridinium compounds and derivatives in homogeneous assays
CA2522548A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-07 General Mills, Inc. Microwave popcorn with visous liquid fat and method of preparation
KR100697332B1 (ko) 2004-12-14 2007-03-20 네오뷰코오롱 주식회사 적색 유기 발광화합물 및 이를 포함하는 유기 발광 다이오드
WO2006116687A2 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanoassays
WO2006116683A1 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanostructure enhanced luminescence
WO2006116686A2 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanostructure enhanced luminescent devices
US20060281104A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 Macevicz Stephen C Leuco dye particles and uses thereof
ATE493652T1 (de) 2005-08-11 2011-01-15 Siemens Healthcare Diagnostics Quantitative assays für pdgfr-beta- in körperflüssigkeiten
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
ES2628395T3 (es) 2007-08-15 2017-08-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anticuerpo regulado por proteasa
KR100946411B1 (ko) * 2008-03-28 2010-03-09 다우어드밴스드디스플레이머티리얼 유한회사 신규한 유기 발광 화합물 및 이를 발광재료로서 채용하고있는 유기 발광 소자
CA2768391C (en) 2009-07-21 2016-09-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range
WO2011161687A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Harman Finochem Limited Process for preparing extra pure 2, 6-diisopropyl phenol
WO2014145581A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Hycor Biomedical, Inc. Automated immunoanalyzer system for performing diagnostic assays for allergies and autoimmune diseases
CN103951694A (zh) * 2014-04-14 2014-07-30 上海大学 吖啶或苯并吖啶衍生物及其合成方法
CN107365309B (zh) * 2017-07-14 2019-08-16 浙江大学 天然产物衍生物6-甲基玫瑰树碱的合成方法
WO2019116234A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Nestec S.A. Methods for determining microbiome ribosomal rna composition changes

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2981731A (en) * 1961-04-25 Acridine derivatives
FR825489A (fr) * 1936-08-13 1938-03-03 Appareil détecteur de gaz
US2902403A (en) * 1956-12-03 1959-09-01 Parke Davis & Co Substituted amino-benz [b] acridines
US3352791A (en) * 1965-01-22 1967-11-14 American Cyanamid Co Generation of light by the reaction of peroxide with heterocyclic derivatives
US3689391A (en) * 1970-05-13 1972-09-05 Synvar Ass Method for chemically initiating photochemical reactions
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3849653A (en) * 1973-09-27 1974-11-19 Bausch & Lomb Multichannel bioluminescent sensors
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4334069A (en) * 1978-07-24 1982-06-08 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates
DE2901919A1 (de) * 1979-01-18 1980-07-24 Berthold Lab Prof Dr Anwendung eines - insbesondere automatischen - verfahrens zur lichtmessung sowie weiterbildungen dieses verfahrens und vorrichtungen zu dessen ausfuehrung
US4385126A (en) * 1980-11-19 1983-05-24 International Diagnostic Technology, Inc. Double tagged immunoassay
DE3279029D1 (en) * 1981-12-11 1988-10-20 Welsh Nat School Med Luminescent labelling materials and procedures
US5179938A (en) * 1983-02-17 1993-01-19 The Trylon Corporation Apparatus for endoscopic examination of body cavity using chemiluminescent light source
US4584277A (en) * 1983-04-05 1986-04-22 Syntex (U.S.A.) Inc. Fluorescent multiparameter particle analysis
US4713348A (en) * 1983-04-05 1987-12-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Fluorescent multiparameter particle analysis
CA1220168A (en) * 1983-09-09 1987-04-07 Henry J. Rahn Magnetic separator for solid phase immunoassays
JPS6156944A (ja) * 1984-07-25 1986-03-22 Nippon Thermo Erekutoron Kk 化学発光分析方法および装置
EP0194132A3 (en) * 1985-03-06 1988-08-03 Murex Corporation Imaging immunoassay detection system and method
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA1279008C (en) * 1985-10-11 1991-01-15 Smith Kline & French Canada Ltd. Methods and reagents for performing subset analysis
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5110932A (en) * 1986-10-06 1992-05-05 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
US4745181A (en) * 1986-10-06 1988-05-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
US4918192A (en) * 1986-10-06 1990-04-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
DE3750503T2 (de) * 1986-10-22 1995-02-09 Abbott Lab Chemilumineszierende Acridinium- und Phenantridiniumsalze.
SE458968B (sv) * 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US4927769A (en) * 1987-07-08 1990-05-22 Ciba Corning Diagnostics Corp. Method for enhancement of chemiluminescence
GB8803000D0 (en) * 1988-02-10 1988-03-09 Ekins Roger Philip Determination of ambient concentrations of several analytes
US5151518A (en) * 1987-10-02 1992-09-29 Abbott Laboratories N-arylation of isatins
US5321136A (en) * 1987-12-31 1994-06-14 London Diagnostics, Inc. Peri substituted fused ring chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom
NZ227506A (en) * 1987-12-31 1992-06-25 London Diagnostics Inc Specific binding assays using chemiluminescent compounds
US5284952A (en) * 1987-12-31 1994-02-08 London Diagnostics, Inc. Sulfonyl substituted chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom
US5338847A (en) * 1987-12-31 1994-08-16 London Diagnostics, Inc. Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom by adduct formation
IL90104A (en) * 1988-04-28 1994-08-26 Igen Inc Apparatus for conducting a plurality of simultaneous measurements of electrochemiluminescent phenomena
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
AU634716B2 (en) * 1988-08-01 1993-03-04 Ciba Corning Diagnostics Corp. Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes
US5227489A (en) * 1988-08-01 1993-07-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Stable hydrophilic acridinium esters suitable for liposome encapsulation
CA1339491C (en) * 1988-09-26 1997-10-07 Say-Jong Law Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester and uses thereof
US5241070A (en) * 1988-09-26 1993-08-31 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof
AU630122B2 (en) * 1988-11-15 1992-10-22 Abbott Laboratories N-arylation of isatins
US5656207A (en) * 1989-06-24 1997-08-12 Gen Probe Incorporated Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques
GB2233450B (en) * 1989-06-24 1993-06-30 Univ Wales Medicine Detecting or quantifing multiple analytes with luminescent reagents
AU6602890A (en) * 1989-10-05 1991-04-28 Exoxemis, Inc. Haloperoxidase acid optimum chemiluminescence assay system
CA2046713A1 (en) * 1990-10-16 1992-04-17 Richard M. Martinelli Amplification of midivariant dna templates
GB9024775D0 (en) * 1990-11-14 1991-01-02 Axis Research Chemical compounds
JPH06504374A (ja) * 1990-12-28 1994-05-19 アボット・ラボラトリーズ 時間分解不均一化学ルミネッセンスアッセイを用いた複数の分析対象物の同時決定
FR2672128B1 (fr) * 1991-01-28 1995-08-18 Cis Bio Int Procede de mesure de la luminescence emise dans un dosage par luminescence.
CA2384514C (en) * 1991-03-04 2006-07-25 Bayer Corporation Automated analyzer
US5206179A (en) * 1991-03-25 1993-04-27 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassays for multiple analytes using sequential addition of tracers
JP3390468B2 (ja) * 1991-10-16 2003-03-24 バイエル コーポレーション 新規の無水混合物法による遺伝子プローブの結合方法
US5393469A (en) * 1992-03-20 1995-02-28 Lumigen, Inc. Polymeric phosphonium salts providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US5340714A (en) * 1992-05-08 1994-08-23 Monitor Diagnostics, Inc. Use of nonmetallic tetrapyrrole molecules and novel signal solutions in chemiluminescent reactions and assays
US5395752A (en) * 1993-03-19 1995-03-07 Ciba Corning Diagnostics Corp. Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
AU687363B2 (en) * 1993-03-19 1998-02-26 Ciba Corning Diagnostics Corp. Luminometer

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111148572A (zh) * 2017-06-06 2020-05-12 西北大学 跨界面磁性分离

Also Published As

Publication number Publication date
PL178927B1 (pl) 2000-06-30
JPH08320319A (ja) 1996-12-03
AU5501894A (en) 1994-09-22
PL306210A1 (en) 1995-03-06
WO1994021823A1 (en) 1994-09-29
US5702887A (en) 1997-12-30
US5395752A (en) 1995-03-07
AU677259B2 (en) 1997-04-17
CA2118891A1 (en) 1994-09-20
US5879894A (en) 1999-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3437244B2 (ja) 化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法
CA1341637C (en) Chemiluminescent acridinium salts
US7611909B1 (en) Near infrared chemiluminescent acridinium compounds and uses thereof
US5854008A (en) Europium and terbium chelators for the time-resolved fluorometric assays
JP7394895B2 (ja) マルチ色素キノンメチド及びチラミドコンジュゲートによる発色性ihc及びish染色のための新規の色
US8993246B2 (en) Luminescence assay method
Krasnoperov et al. Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids
US11982619B2 (en) Method for detecting biomaterial using linear upconversion fluorescent property
JP2009167191A (ja) ハロレピジンから誘導できるヘリウム−ネオン励起性網状赤血球染色用色素
JP3964374B2 (ja) 均一系アッセイにおけるアクリジニウム化合物および誘導体の新規用途
Karhunen et al. Homogeneous detection of avidin based on switchable lanthanide luminescence
Kessler et al. Laser-induced fluorometric determination of albumin using longwave absorbing molecular probes
JPH04506403A (ja) 標識技術を用いた複数分析物の検出または定量
CN111675674A (zh) 一种aie分子及其合成方法
EP0617288B1 (en) Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
JP2001002951A (ja) 新規な蛍光色素およびその蛍光マーカーとしての使用
CA2319187A1 (en) Measurement of hydride using chemiluminescent acridinium compounds
JP4465121B2 (ja) 新規のアミドピリリウム蛍光染料
US10029996B2 (en) Class of cyano-substituted asymmetric cyanine dyes, synthesizing method and application thereof
JP6735665B2 (ja) 安定性が改善され迅速に発光する親水性高量子収率アクリジニウムエステル
EP2726633B1 (en) Process and apparatus for quantifying nucleic acid in a sample

Legal Events

Date Code Title Description
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20030527

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080606

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080606

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090606

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100606

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120606

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130606

Year of fee payment: 10

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term