JP3437244B2 - 化学発光化合物およびそれを試験検定に使用する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は簡単な化学処理により緑
または黄の光を発光する新たな類の化学発光芳香族環融
合アクリジニウム化合物（ＡＦＡＣ）に関するものであ
る。本発明はまたＡＦＡＣおよび結合パートナー、例え
ば生物学的分子から形成される接合体、並びに該接合体
を利用する試験検定に関するものである。さらに本発明
は、２つ以上の化学発光接合体が有する識別可能な非干
渉発光特性により、試験試料中の２つ以上の物質または
分析物の検出および／または定量を同時に行なえる試験
検定に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】異なる波長最大値を有し重複が最小であ
るが、発光スペクトルが補正可能な光を放出する化学発
光化合物は、分析検定、特に工業検定、および多数の物
質、例えば多数分析物（multi-analyte ）測定のための
臨床診断検定において非常に有用である。そのような化
合物は、結合パートナー、例えば、抗原、抗体、および
核酸のような生物学的分子をタグ付けまたは標識付けす
るのに用いられ、相互に非干渉の、または重複が最小限
の発光信号またはスペクトルを放出できる接合体または
トレーサを形成できる。その信号またはスペクトルによ
り、試験試料中の多数の物質を同時に検出および／また
は定量できる。２つの化学発光化合物は、ピーク高さの
５％より大きい信号強度を有するスペクトル領域が約10
0 −250 ｎｍに亘る発光スペクトルを有するが、信号が
識別できるように発光の最大値が異なるので、例えば、
ある患者の試料からの黄体化ホルモン（ＬＨ）および卵
胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の血清水準の同時測定が可能
であり、これを以下に記載する。ある実施例において、
抗−ＬＨおよび抗−ＦＳＨを標識付けまたはタグ付けす
るためには、２つの化学発光信号の発光最大値は、約60
ｎｍ、好ましくは80ｎｍ以上異なる。ここに記載する方
法により同時測定が可能なさらなる実施例は、増幅核酸
配列、例えば、悪性転換に関連する癌遺伝子の検定につ
いてである。本出願人に譲渡され、ここに参照文献とし
て包含するヨーロッパ特許公開第0 481704 号（米国特
許出願第598,269 号（10/16/90）およびこの中に述べら
れた参照文献を優先権とする）を参照のこと。そのよう
な検定においては、同一の検定容器または反応媒質中の
公知の異なる標的配列のために正の調節として並行な
（parallel）内部参照材料を含有することが、例えば、
疑似的な負の結果（false negative result ）を保障す
るため、検定性能にとって重要であると認識されてい
る。別の検定方式においては、公知の対照物質を含有し
て検定性能を評価するのに役立てている。

【０００３】試験試料中の２つ以上の物質、例えば分析
物を測定および／または定量する実験的必要性と経済的
な利益が、本発明の多数トレーサ（multiple-tracer ）
検定を開発する２つの主要な基本的動機であった。さら
に、理想的な多数トレーサシステムが同一の化学条件下
で多数の波長信号を放出することを予見した。信号を発
するために他の化学物質または酵素を使用する、ルミノ
ール系（luminol series）または安定なジオキシエタン
（dioxetane ）と対になるアクリジニウム化合物のよう
な２つの異なる種類の化学発光化合物を用いる場合のよ
うに、２つの異なる信号発生機構、条件およびタイミン
グの組を必要とする複数分析物検定システムにおいて２
つの化学発光トレーサを組み合わせることは望ましくな
く、扱いにくいことが分かった。さらに、２つ以上の異
なる化学発光化合物または接合体は、１桁以下の大きさ
しか異ならない発光効率を有さなければならない。

【０００４】さらに基本的な必要条件は、水性媒質また
は環境における化学発光化合物の適切な安定性であっ
た。この安定性によって、化合物はキットの状態にされ
たときの市販製品の出荷条件に耐える。

【０００５】発光最大値において深色シフト（bathochr
omic shift）を示し、同一の化学処理により同等の効率
を有する光を放出する同一の一般級にある安定化学発光
類似体を開発することにより、これらの目的を達成し
た。

【０００６】過酸化水素および金属水酸化物の処理によ
り青光を放出することをここに示した化学発光アクリジ
ニウム化合物について詳しく記載する。米国特許第4,74
5,181 号、第4,918,192 号、第5,110,932 号、米国特許
出願第07/826,186号および第07/871,601号は、安定多置
換（polysubstituted ）アリールアクリジニウムエステ
ルを記載している。これらの文献は全て、本出願人に譲
渡され、参照文献としてここに包含する。そのようなア
クリジニウム化合物を、一般的に「参照アクリジニウム
エステル」または「アクリジニウムエステル」と称する
ことにする。上述したような化合物は、アクリジニウム
環系を含み、その化合物の用法に応じて、例えば、本発
明の検定を含む試験検定に使用するための接合体を形成
する物質に標識を付着させるための、適切な官能基をさ
らに含む。

【０００７】バトマンゲリッヒ等、ヨーロッパ特許公開
第0 478 626 号（イギリス国特許第2,233,450 号（6/24
/89 ）を優先権主張とする）は、異なるトレーサ接合体
を調製するために発光が変化する、すなわち、速い持続
時間および遅い持続時間（fast and slow duration）の
アクリジニウム化合物を使用して、２つ以上の異なる分
析物の「実質的に同時の」定量を行なうことを記載して
いる。しかしながら、この手法はいくつかの重大な欠点
を有する。第一に、アクリジニウムエステルの１つは、
発光の非常に短い持続時間を達成するために、すなわ
ち、１秒で発光または発光最大値を完了するために、フ
ェノール部位に電子求引性置換基を含む。しかしなが
ら、この種の化合物、例えば、オルト−ジハロゲン化ア
リールアクリジニウムエステルは、水性環境においては
安定性が欠如するかもしれない。第二に、発光の重複期
間中に２つのトレーサにより個々に帰属する発光を区別
するために、発光運動学を注意深く試験して正確に補正
しなければならない。記載された方法は、光強度の順次
積分（sequential integration）のための２つの別々の
時間窓（time window ）に放出される光子の測定による
ものである。発光重複が比較的小さくない場合には、そ
のような補正は、特に大きく異なる濃度を有する２つの
分析物の検出については、不十分な検定精度の潜在的な
源となり得る。より小さな発光の重複を必要条件とする
と、代わりに、一方が非常に短い持続時間の発光を有
し、他方が非常に長い持続時間の発光を有する一組の化
学発光化合物を利用することが必要となり、安定性に問
題があるか、または過剰に長引いた信号集積時間により
二重分析物検定を非実用的にする化合物に導かれる。

【０００８】信号集積時間が延長する場合には、１つの
試験試料において２つの検定を行なう利点が失われる。
化学発光検出および／または定量を用いたある自動分析
器において、最初の試験結果は、15分後に得られ、その
後操作中に20秒毎に結果が得られることを言及してお
く。本出願人に譲渡され、ここに参照文献として包含さ
れるヨーロッパ特許公開第0 502 638 号（米国特許出願
第665,196 号（3/4/91）を優先権とする）を参照のこ
と。

【０００９】バトマンゲリッヒ等はまた、異なるトレー
サ接合体を調製するための、異なる発光スペクトルを有
するアクリジニウム化合物について記載した。彼等が用
いた手法は、アクリジニウム核の電子接合（electronic
conjugation）を延長して、特許のアクリジニウムエス
テル（化合物２ａ）と比較して、発光最大値において約
80ｎｍ深色シフトした３−（４−カルボキシブタジエニ
ル）−アクリジニウムエステル（化合物２ｂ）を得るこ
とであった。アクリジニウム核の電子接合の延長によ
り、二重分析物免疫学的検定を構成するのに実際に必要
とされる発光最大値における主要な深色シフトあるいは
発光効率の減少が必ずしも導かれるわけではない。その
ような検定において使用するベンズアクリジニウム化学
発光化合物について、何も教示されていなかった。

【００１０】マックカプラ等のヨーロッパ特許公開第0
322 926 号（米国特許出願第140,040 号（12/31/87）お
よび第291,843 号（12/29/88）を優先権とする）は、環
または環系の炭素原子の１つに結合したエステル結合、
アミド結合を有する複素環式環または環系からなる「化
学発光部分」を示唆した。この化学発光化合物は、ベン
ズ［ａ］アクリジニウム、ベンズ［ｂ］アクリジニウ
ム、およびベンズ［ｃ］アクリジニウムを含有すると言
われたが、これらの化合物または接合体の合成および構
造は記載されていなかった。これらの構造物の発光波長
最大値、または発光効率のいずれも予言しておらず、ま
た、検定法において少なくとも２つの化学発光化合物ま
たは接合体を使用すること、そして発光スペクトルに基
づいて検定を行なう場合にそのような化合物を利用する
ことも予言していなかった。

【００１１】本出願に開示するベンズ［ａ］アクリジニ
ウムおよびベンズ［ｂ］アクリジニウムの命名法は、有
機化合物の命名法に関する委員会による1957年の報告書
における国際純粋および応用化学連合（International
Union of Pure and AppliedChemistry ）発行の有機化
合物の命名法に関する決定規則の規則21.5に基づく。

【００１２】ベンズ［ａ］アントラセンの実施例による
と、アクリジニウム核（下記の構造）の周辺側にベンゼ
ン環を融合することにより生じた化合物は、したがって
アクリジニウム核の側ａ、ｂ、またはｃのいずれがベン
ゼン環と融合するかにより命名すべきである。

【００１３】

【化６】

【００１４】以下の省略形を本発明の開示に用いる： １． ＡＢＡＣ： 核間ベンズ［ａ］アクリジニウ
ム化合物 ２． ＡＦＡＣ： 芳香族環融合（aromatic ring
fused ）アクリジニウム化合物 ３． ＥｔＯ： エトキシ ４． ＤＭＡＥ： ジメチルアクリジニウムエステ
ル ５． ＤＩＰＡＥ： ジイソプロピルアクリジニウム
エステル ６． ＬＢＡＣ： 鎖状ベンズ［ｂ］アクリジニウ
ム化合物 ７． ＬＥＡＣ： 長期発光（longer emission ）
アクリジニウム化合物 ８． ＬＥＡＥ： 長期発光アクリジニウムエステ
ル ９． ＭｅＯ： メトキシ １０． ＮＳＥ： Ｎ−スルホエチル １１． ＮＳＰ： Ｎ−スルホプロピル １２． ＰＣＴ： 漏話百分率（percent cross ta
lk） １３． ＰＭＰ： 常磁性粒子 １４． ＱＡＥ： 第四アンモニウムエトキシ １５． ＲＬＵ： 相対光単位（relative light u
nit ）

【００１５】

【発明の構成】少なくとも２つの化学発光接合体の発光
信号を同時に検出することからなる、試験試料中の少な
くとも２つの物質の検出および／または定量のための方
法を提供するが、ここで各化学発光接合体は、試験試料
中で検出および／または定量すべき物質と結合してい
る。化学発光接合体のそれぞれの発光信号はスペクトル
発光により識別できるので、物質が検出および／または
定量できる。

【００１６】本発明の検定に使用する化学発光化合物を
以下に記載する：

【００１７】

【化７】

【００１８】ここでＷは炭素であり、あるいは、Ｃ₇ 、
Ｗ、Ｃ₉ またはＣ₁₀は−Ｎ＝と置換でき；またはＷを省
き、Ｃ₇ をＣ₉ に結合させ、Ｃ₇ 、Ｃ₉ またはＣ₁₀は−
Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ−と置換でき；
Ｙは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
または下記の化学式の多置換アリール部分である：

【００１９】

【化８】

【００２０】Ｒ₁ は必要に応じて20のヘテロ原子を含有
するアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキ
ルを含む；Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₉ およびＲ₁₀は、水素、置換
または非置換アリル（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲン化
物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−ＳＲ、
−ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）
ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される同一の
群または異なる群のものである；Ｒ₂ はＣ_1-4 で１つま
たは多数の置換基を含む；Ｒ₂ はまた、ヘテロ原子を有
するかまたは有さない融合芳香環であってもよい； Ｒ
₃ はＣ₇ 、Ｗ、Ｃ₉ またはＣ₁₀で１つまたは多数の置換
基を含む；Ａ−は、ＣＨ₃ ＳＯ₄ ^- 、ＦＳＯ₃ ^- 、ＣＦ
₃ ＳＯ₄ ^- 、Ｃ₄ Ｆ₉ ＳＯ₃ ^- 、ＣＨ₃ Ｃ₆ Ｈ₄ ＳＯ₃
^- およびハロゲン化物を含む対イオンである；Ｘは窒
素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、Ｘが酸素
または硫黄のときにＺが省かれ、Ｘが窒素のときにＺが
−ＳＯ₂ −Ｙ′であり、そしてＹ′がＹと等しい場合に
は、ＹとＹ′の置換基は同一である必要はない；Ｒ₄ お
よびＲ₈ はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコ
キシル、アルキルチオールまたはアミドである、Ｒ₅ お
よびＲ₇ は上述したＲ₃ 、Ｒ₉ およびＲ₁₀である； Ｒ₆ ＝−Ｒ₁₁−Ｒ₁₂、 Ｒ₁₁は、必要条件ではないが、必要に応じて、20までの
ヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖アルキ
ル、置換または非置換アリールまたはアラルキルであ
る；そしてＲ₁₂は、リービング基（leaving group ）、
またはリービング基もしくは−Ｑ−Ｒ−Ｎｕ、−Ｑ−Ｒ
（Ｉ）_n Ｎｕ、−Ｑ−Ｎｕ、−Ｒ−Ｎｕ、または−Ｎｕ
に結合する求電子官能基を含み、ここでｎは少なくとも
１であり、Ｎｕは求核基であり、Ｑは官能結合であり、
Ｉはイオンまたはイオン化基である；Ｒ₅ とＲ₆ 、およ
びＲ₆ とＲ₇ は相互に交換可能である；Ｒは必要に応じ
て20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキルである。

【００２１】化学発光化合物または接合体は、化学処理
により該化合物または接合体が、識別できる発光スペク
トルピークまたは最大値を有する青−緑、緑、黄、橙お
よび赤−橙の光を放出する点で特徴付けられる。ある実
施態様、すなわちある化合物において、発光最大値は、
480 ｎｍ以上であり、好ましい実施態様においては、51
5 ｎｍ以上である。

【００２２】試験試料中の、１つ以上の核酸配列を含有
する標的配列の増幅方法は、１つ以上の標的配列を含有
すると思われる試験試料を調製し、その試験試料に内部
参照を加え、標的配列を増幅し、それぞれの化学発光接
合体が標的配列および内部参照と結合する、少なくとも
２つの化学発光接合体を調製し、化学発光接合体の発光
により増幅した標的配列および内部参照を同時に検出お
よび／または定量することからなる。

【００２３】したがって、本発明の主な目的は、それぞ
れ識別可能な発光スペクトルを有する少なくとも２つの
異なる化学発光化合物または接合体を使用することによ
り、試験試料中の少なくとも２つの物質を同時に検出お
よび／または定量する方法を提供することにある。

【００２４】本発明の別の目的は、単一の試験媒質また
は移送管中の分析物および内標準または対照を同時に検
出および／または定量する検定方法を提供することにあ
る。

【００２５】本発明のさらに別の目的は、単一反応媒質
または移送管中の試験試料について２つの検定を同時に
行なう準備をすることにより、自動分析器の効率を高め
ることにある。

【００２６】本発明のさらなる目的は、化学発光化合物
およびそのような化学発光化合物を合成するのに用いる
中間体生成物を合成する方法を提供することにある。

【００２７】本発明の目的は、緑または黄の光を放出す
る化学発光の芳香族環融合アクリジニウム化合物（arom
atic ring-fused acridinium compound ；ＡＦＡＣ）を
提供することにある。

【００２８】本発明の別の目的は、515 ｎｍ以上の波長
最大値またはピークを有する緑または黄の光を放出する
芳香族環融合アクリジニウム化合物（ＡＦＡＣ）を提供
することにある。

【００２９】本発明のさらに別の目的は、同時の二重化
学発光標識検定方法を提供することにある。

【００３０】本発明のさらなる目的は、他のミクロ分子
または巨大分子との共有結合またはリポソーム内のカプ
セル封じを形成するのに有用な反応官能基を有する、ま
たは有さない１つ以上のイオン基および／またはイオン
化可能基を担持する親水性ＡＦＡＣを提供することにあ
る。

【００３１】本発明の目的は、直接的または間接的に結
合パートナー、例えば生物学的分子を有するＡＦＡＣの
間に形成されたＡＦＡＣ接合体を提供することにある。

【００３２】本発明の別の目的は、アクリジニウムエス
テルおよびＡＦＡＣ接合体を使用することを含む試験検
定方法を提供することにある。

【００３３】本発明のさらに別の目的は、混合物として
試料中に存在する２つ以上の分析物または物質またはそ
の組合せの測定が、２つ以上の異なる化学発光トレーサ
または化合物により生成される、相互非干渉、または重
複が最小であるが補正可能な光信号により、同一の反応
媒質または転移管中で同時に行なえる多分析物検定方法
を提供することにある。

【００３４】本発明のさらなる目的は、二重化学発光標
識試験検定を行なう試験キットを提供することにある。

【００３５】本発明の目的は、試験試料中の少なくとも
２つの物質を同時に検定する２つ以上の化学発光試薬を
有する試験キットを提供することにある。

【００３６】本発明の別の目的は、分析検定に使用する
標識の合成に利用する中間体化合物を提供することにあ
る。

【００３７】本発明のさらに別の目的は、ピーク高さの
５％より大きい信号強度を有するスペクトル領域が約10
0 −250 ｎｍに亘る発光スペクトルを有する化学発光化
合物を提供することにある。

【００３８】これらと他の目的から当業者には明らかな
ように、本発明は、明細書に記載し、特許請求の範囲に
包含される要素の組合せにある。

【００３９】

【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。

【００４０】本発明のＡＦＡＣは、鎖状ベンズ［ｂ］ア
クリジニウム（ＬＢＡＣ）、フラノアクリジニウム、チ
オフェノアクリジニウム、ピロアクリジニウム化合物お
よびピリドアクリジニウム化合物からなる。アクリジニ
ウム核に融合した芳香族環の特異的な位置によって、予
期せぬことに、ＬＢＡＣが、核間ベンズ［ａ］アクリジ
ニウム化合物（ＡＢＡＣ）より、そして対応する「参照
アクリジニウムエステル」、すなわち、ＤＭＡＥ−Ｂ
ｚ、ＤＩＰＡＥ−Ｂｚおよび３−ＭｅＯ−ＤＭＡＥ−Ｂ
ｚよりかなり大きな深色シフトを有する化学発光信号を
生じることが分かった。図１および２参照のこと。

【００４１】ＡＦＡＣの一般的な構造を式Ｉにより示
す。

【００４２】

【化９】

【００４３】鎖状ベンズ［ｂ］アクリジニウム化合物お
よび異性体、フラノ−、チオフェノ−、ピロ−およびピ
リド−アクリジニウム化合物の一般的な構造を、式II、
IIIＡ−III Ｃ、およびIVＡ−IVＤにそれぞれ示す。

【００４４】

【化１０】

【００４５】

【化１１】

【００４６】

【化１２】

【００４７】

【化１３】

【００４８】

【化１４】

【００４９】

【化１５】

【００５０】

【化１６】

【００５１】

【化１７】

【００５２】ＡＦＡＣのあるサブクラスは、上述した特
質を有する主要な化学発光化合物に加え、形成を可能に
する、すなわち、結合パートナー、特に生物学的分子と
の共有結合により、結合検定における非同位体トレーサ
として、または多分析物検定システムの主要な必須の部
分として有用な接合体を生成する反応官能基を含有す
る。ＡＦＡＣの別のサブクラスは、水性媒質中の化合物
の溶解度を高めることおよび／またはそれら化合物をリ
ポソーム内に漏れが少なくカプセル封じする１つ以上の
イオン基および／またはイオン化可能基を含有する。そ
のような親水性ＬＢＡＣを追加の反応官能基を担持する
ように修飾して、他のミクロ分子または巨大分子との接
合体を形成せしめられる。

【００５３】上述した特性を有し、上述した効用に適し
た好ましいＬＢＡＣ、フラノアクリジニウム化合物、チ
オフェノアクリジニウム化合物、ピロアクリジニウム化
合物およびピリドアクリジニウム化合部は、それぞれ上
述した式Ｉ、II、III Ａ−III Ｃ、およびIVＡ−IVＤに
示した化学発光化合物を含む。ここで：Ｗが炭素の場
合、式Ｉは式IIに示したようなＬＢＡＣクラスの化学発
光化合物となる；またはＷは省略でき、Ｃ７をＣ９に結
合させ、Ｃ７、Ｃ９またはＣ１０のうちの１つを−Ｏ
−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ−と置換して、式
IIIＡ−Ｃに示したようなアクリジニウム核に線状に融
合した５員芳香環を形成できる；またはＣ７、Ｗ、Ｃ
９、またはＣ１０は−Ｎ＝と置換して、式IVＡ−Ｄに示
したようなアクリジニウム核に線状に融合した６員ピリ
ド環を形成できる；Ｒ₁ は、20までのヘテロ原子、好ま
しくは窒素、酸素、ハロゲン、リンまたは硫黄を必要に
応じて含有するアルキル、アルケニル、アルキニル、ま
たはアラルキルである。

【００５４】Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₉ およびＲ₁₀は、水素、置
換または非置換アリール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲ
ン化物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネー
ト、−Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−
ＳＲ、−ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ
（Ｏ）ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される
同一の群または異なる群のものである。

【００５５】Ｒは20までのヘテロ原子を必要に応じて含
有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、
またはアラルキルである。

【００５６】Ｒ₂ はＣ_1-4 で１つまたは多数の置換基を
含む。

【００５７】Ｒ₃ はＣ₇ 、Ｗ、Ｃ₉ またはＣ₁₀で１つま
たは多数の置換基を含む。

【００５８】Ｒ₂ はまた、ヘテロ原子を有するかまたは
有さない融合芳香環であってもよい。

【００５９】Ａ−は、ＣＨ₃ ＳＯ₄ −、ＦＳＯ₃ −、Ｃ
Ｆ₃ ＳＯ₄ −、Ｃ₄ Ｆ₉ ＳＯ₃ −、ＣＨ₃ Ｃ₆ Ｈ₄ ＳＯ
₃ −およびハロゲン化物を含む対イオンである。

【００６０】Ｘは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原
子であり、Ｘが酸素または硫黄のときにＺが省かれ、Ｘ
が窒素のときにＺが−ＳＯ₂ −Ｙ′である。

【００６１】Ｙは、必要に応じて20までの炭素原子を含
有する、ハロゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直
鎖アルキル、または式Ｖの多置換アリール部分である：

【００６２】

【化１８】

【００６３】Ｙ′はＹと等しい場合、ＹとＹ′の置換基
は同一である必要はない。

【００６４】Ｒ₄ 、およびＲ₈ は、アルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アルコキシル、アルキルチオ、アミ
ド、水性媒質または環境中でＡＦＡＣの安定性を良好に
確保するように位置した基である。商業化に適するＡＦ
ＡＣの安定性は、立体効果、電子効果、またはこれら２
つの群の存在により生じた組合せによるものである。Ｒ
₅ およびＲ₇ は、式ＩのＲ₃ 、Ｒ₉ 、およびＲ₁₀につい
て列挙したものと同様である。ＡＦＡＣを生物学的分子
に接合するために、Ｒ₆ は、リービング基（leaving gr
oup ）、またはリービング基により結合された求電子官
能基、もしくはスペーサにより環に直接結合または連結
したそのような反応基に容易に転化できる官能基であり
得る。「スペーサ」を、必要に応じて０−20のヘテロ原
子を含有する、側鎖または直鎖アルキル、置換または非
置換アリールまたはアラルキルとして定義する。そのよ
うな官能基の実施例は、

【００６５】

【化１９】

【００６６】−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ₂ ＋Ｕ
−、−Ｎ₃ 、−ＣＯＯＨ、−Ｕ、または−ＳＯ₂ Ｕ、こ
こでＵはハロゲン化物である。

【００６７】あるいは、Ｒ₆ は、スペーサによりＹに直
接結合または連結された保護または非保護求核性官能基
であり得る。したがって、Ｒ₆ は、−Ｑ−Ｒ−Ｎｕ、−
Ｑ−Ｒ（Ｉ）ｎ−Ｎｕ、−Ｑ−Ｎｕ、−Ｒ−Ｎｕ、また
は−Ｎｕであり、ここでＲは上述のように定義したもの
である。

【００６８】Ｑは、初めはそれぞれＹおよびＲまたはＮ
ｕの置換基として存在する２つの官能基の間の共有結合
により生じた官能結合である。Ｒ₆ への構成物中へのＱ
の導入は、Ｒ−Ｎｕ、Ｒ（Ｉ）ｎ−ＮｕまたはＮｕをプ
リフォームＡＦＡＣに直接結合できるモジュール概念を
示す。Ｑの実施例は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ
−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ
−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ
（Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｎ＋Ｈ₂ ）ＮＨ−、−ＳＯ
₂ −、−ＳＯ₃ −を含む。

【００６９】（Ｉ）ｎは、制限するものではないが、第
４アンモニウム、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ₃ Ｈ、−ＳＯ
₄ Ｈ、−ＰＯ₃ Ｈ₂ 、および−ＰＯ₄ Ｈ₂ 、を含有する
イオン基またはイオン化可能基であり、ｎは１以上の整
数である。

【００７０】イオン基またはイオン化可能基が存在する
と、ＡＦＡＣの親水性および水性媒質中での用途の適合
性が高まる。そのようなイオン基またはイオン化可能基
を選択し位置させると、生物学的分子／ＡＦＡＣ接合体
を生物学的分子の対応する結合パートナーに結合させる
のを高められるという利点がある。

【００７１】Ｎｕは、結合のための求核基を欠如するか
もしれないが、求電子性基またはその容易に転化される
前駆体を有するかもしれない生物学的分子を有する化合
物の接合を促進する化合物の求核基である。保護求核性
官能基の実施例またはグルーピングは、ｔ−ブチルオキ
シカルボニルアミノおよび３−（２−ピリジニルジチ
オ）−プロピオニル（ＰＤＰ）を含有する。

【００７２】

【化２０】

【００７３】ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏ
ｃ）は、酸、例えば、トリフルオロ酢酸の処理により除
去できるアミノ上の保護基である。ＰＤＰ中のＳ−２−
ピリジニル基は、適切なｐＨでのジチオスレオトール
（ＤＴＴ）の処理により除去して遊離−ＳＨ基を生成で
きる保護部分である。−ＮＨ₂ および−ＳＨ求核性基の
これらの保護基の用法は、有機化学の当業者に知られて
いる。非保護の求核性官能基の実施例は、アミノ、チオ
ール、ヒドロキシル、強い電子求引性基である有機金属
部分に隣接した活性メチレンを含む。そのような求核性
Ｒ₆ グルーピングの実施例、生物学的分子への接合、お
よび接合体の効用がヨーロッパ特許公開第0 361 817 号
（米国特許出願第249,620 号（9/26/88 ）を優先権とす
る）に記載されており、この特許は、本出願人に譲渡さ
れ、参照文献としてここに包含する。

【００７４】信号増大ルミソーム（signal-enhancing l
umisome ）を構成することを目的としてリポソーム内に
カプセル封じできる多くの親水性化合物を提供するため
に、Ｒ₂ 、Ｒ₃ またはＲ₆ は、スペーサにより芳香環に
直接結合したまたはより適切に連結した強力なイオン化
可能基であり得る。強力なイオン化可能基は、ホスフェ
ート、ホスホネート、スルフェート、およびスルホネー
トを含む。そのようなＲ₆ グルーピングの実施例、親水
性化学発光分子のリポソームへの取り込み、および生成
したルミソームの効用がヨーロッパ特許公開第0 361 81
7 号（米国特許出願第249,620 号（9/26/88 ）を優先権
とする）に記載されており、この特許は、本出願人に譲
渡され、参照文献としてここに包含する。同様に、生物
学的分子に直接接合できる親水性ＡＦＡＣを提供するた
めに、Ｒ₂ および／またはＲ₃ は、スペーサにより芳香
環融合アクリジニウム核に直接結合したまたはより適切
に連結したイオン基または強力なイオン化可能基であり
得、Ｒ₆ は上述したような反応性官能基含有側鎖であり
得る。全てのＡＦＡＣにおけるＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₅ および
Ｒ₆ の位置、そしてＲ₆ とＲ₇ の置換基は相互に交換で
きる。

【００７５】ＡＦＡＣとなる可能性のある前駆体の１つ
は、Ｒ₆ の置換基が水素またはＲであり、Ｒが上述のよ
うに定義されるＡＦＡＣである。

【００７６】Ｘが窒素である場合、Ｙは１から20の炭素
原子の側鎖または直鎖アルキルまたは上述したような全
ての可能性のある置換基を有する式Ｖに等しい部分であ
ってもよく、そしてＺは以下の式VIにより示される： Ｚ＝−ＳＯ２−Ｙ′ （式ＶＩ） ここでＹ′は１から20の炭素原子のハロゲン化または非
ハロゲン化、側鎖または直鎖アルキル、または上述した
可能性のある置換基の全てを有する式Ｖと等しい部分で
ある。ＹおよびＹ′両者の置換基は必ずしも同一である
必要はない。

【００７７】好ましい芳香環融合アクリジニウム化合物
（ＡＦＡＣ）は、上述したものである。より好ましく
は、ＡＦＡＣは以下の置換基を有するＬＢＡＣ系であ
る：Ｒ₁はメチル基、スルホプロピル基またはスルホエ
チル基である；Ｒ₉ 、Ｒ₁₀は水素、メトキシ基またはハ
ロゲンである；Ｒ₂ は水素、２−ＭｅＯ基、２−第四ア
ンモニウムアルコキシ基、３−ＭｅＯ基、３−ＥｔＯ
基、３−第四アンモニウムアルコキシ基、または３−カ
ルボキシアルキルオキシ基である；Ｒ₃ 、Ｒ₅ およびＲ
₇ は水素である；Ｘが酸素または硫黄である場合、Ｒ₄
およびＲ₈ はメチル基、エチル基、イソプロピル基であ
る；Ｒ₆ は式Ｖの４の位置に結合した以下の基のうちの
１つである、カルボキシレート、Ｎ−サクシンイミジル
オキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｎ
−アミノアルキルカルバモイル基、スルホメチルカルバ
モイル基、Ｎ−［Ｎ−（２−アミノ−３−Ｓ−（３′−
スルホプロピル）−チオプロピオニル）−２−アミノエ
チル］カルバモイル基、Ｎ−７−（１、３−ジスルホナ
フタレニル）カルバモイル基、Ｎ−［１−カルボキシル
−２−（３−スルホプロピルチオ）エチル］カルバモイ
ル基、Ｎ−（２−スルホニルオキシエチル）カルバモイ
ル基、Ｎ−（２−ホスホノエチル）カルバモイル基、Ｎ
−（２−ホスホンオキシエチル）カルバモイル基および
アルコキシイミノエチル基；Ｘが窒素である場合、Ｙは
Ｒ₅ およびＲ₇ が水素であり、Ｒ₆ がカルボキシレー
ト、Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル基、Ｎ−サ
クシンイミジルオキシカルボニルアルキル基、ベンジル
オキシカルボニル基、またはＮ−アミノアルキルカルバ
モイル基である式Ｖを示す；ＺはＹ′がアルキル基また
はフェニル基である式VIを示す。

【００７８】本発明の化学発光化合物を合成するのに用
いる中間体化合物は下記の式の中間体を含む：

【００７９】

【化２１】

【００８０】ここでＷは炭素；あるいは、Ｃ₇ 、Ｗ、Ｃ
₉ またはＣ₁₀は−Ｎ＝と置換でき；またはＷを省き、Ｃ
₇ をＣ₉ に結合させ、Ｃ₇ 、Ｃ₉ またはＣ₁₀は−Ｏ−、
−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ−と置換でき；Ｒ₂ 、
Ｒ₃ 、Ｒ₉ およびＲ₁₀は、水素、置換または非置換アリ
ール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲン化物、アミノ、ヒ
ドロキシル、ニトロ、スルホネート、−Ｒ、−ＣＮ、−
ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＳＲ、−Ｃ
（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、または
−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される同一の群または異なる
群のものである；Ｒ₂ はＣ_1-4 で１つまたは多数の置換
基を含む；Ｒ₃ はＣ₇ 、Ｗ、Ｃ₉ またはＣ₁₀で１つまた
は多数の置換基を含む；Ｒ₂ はまた、ヘテロ原子を有す
るまたは有さない融合芳香環であってもよい；Ｒは必要
に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルであ
る。

【００８１】下記の式の中間体：

【００８２】

【化２２】

【００８３】ここでＷは炭素であり、あるいは、Ｃ₇ 、
Ｗ、Ｃ₉ またはＣ₁₀は−Ｎ＝と置換でき；またはＷを省
き、Ｃ₇ をＣ₉ に結合させ、Ｃ₇ 、Ｃ₉ またはＣ₁₀は−
Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ−と置換でき；
Ｙは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
または下記の化学式の多置換アリール部分である：

【００８４】

【化２３】

【００８５】Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₉ およびＲ₁₀は、水素、置
換または非置換アリール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲ
ン化物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネー
ト、−Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−
ＳＲ、−ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ
（Ｏ）ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される
同一の群または異なる群のものである；Ｒ₂ はＣ_1-4 で
１つまたは多数の置換基を含む；Ｒ₃ はＣ₇ 、Ｗ、Ｃ₉
またはＣ₁₀で１つまたは多数の置換基を含む；Ｒ₂ はま
た、ヘテロ原子を有するまたは有さない融合芳香環であ
ってもよい；Ｘは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原
子であり、Ｘが酸素または硫黄のときにＺが省かれ、Ｘ
が窒素のときにＺが−ＳＯ₂ −Ｙ′であり、そしてＹ′
がＹと等しい場合には、ＹとＹ′の置換基は同一である
必要はない；Ｒ₄ およびＲ₈ はアルキル、アルケニル、
アルキニル、アルコキシル、アルキルチオールまたはア
ミドである、Ｒ₅ およびＲ₇ は上述したＲ₃ 、Ｒ₉ およ
びＲ₁₀である； Ｒ₆ ＝−Ｒ₁₁−Ｒ₁₂、 Ｒ₁₁は、必要条件ではないが、必要に応じて、20までの
ヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖アルキ
ル、置換または非置換アリールまたはアラルキルであ
る；そしてＲ₁₂は、リービング基（leaving group ）、
またはリービング基もしくは−Ｑ−Ｒ−Ｎｕ、−Ｑ−Ｒ
（Ｉ）_n Ｎｕ、−Ｑ−Ｎｕ、−Ｒ−Ｎｕ、または−Ｎｕ
に結合する求電子官能基を含み、ここでｎは少なくとも
１であり、Ｎｕは求核基であり、Ｑは官能結合であり、
Ｉはイオンまたはイオン化基である；Ｒ₅ とＲ₆ 、およ
びＲ₆ とＲ₇ は相互に交換可能である；Ｒは必要に応じ
て20までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキルである。

【００８６】以下の実施例は、本発明の好ましい化合物
および中間体の合成について記載したものであり、その
構造を図１および２に示す。実施例は説明を意図したも
のであり、限定を意図するものではなく、実施例に示し
た置換基以外の置換基を有する化合物を当業者が合成す
るガイドとして用いてもよい。

【００８７】実施例１． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチル）フェニル５−メチル−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート（ＬＥＡＥ−Ｂｚ）の調製３−アニリノ−２−ナフトエ酸 ３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸（アルドリッヒ カタ
ログ＃Ｈ４６００−７）（376 ｇ、2.0 モル）およびア
ニリン（376 ｍｌ、4.1 モル）の混合物を窒素雰囲気で
撹拌しながら16時間に亘り170 ℃で加熱した。生成した
混合物を、熱いうちに１Ｎ ＨＣｌ（2.5 ｍｌ）中に注
ぎ入れ、100 ℃に加熱し、この温度で５分間撹拌した。
この混合物を熱いうちに濾過し、固体を0.2 Ｎ ＨＣｌ
（600 ｍｌ）で洗浄した。湿った材料を沸騰させ、0.5
Ｎのカルボン酸ナトリウム（6.0ｍｌ）で10分間に亘り
機械的に撹拌し、冷却して濾過した。撹拌しながら赤み
がかった濾液に５Ｎ ＨＣｌを滴下して〜ｐＨ７とし
た。生成した黄色の沈殿物を集積し、少量の水で洗浄
し、エタノール（400 ｍｌ）により結晶化し、３−アニ
リノ−２−ナフトエ酸（36ｇ、７％）．Ｒｆ 0.6 （シ
リカゲル、ＥＭアート．５７１５、20％ メタノール／
クロロホルム）、ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ264 （Ｍ）を得
た。

【００８８】１２−クロロ−ベンズ［ｂ］アクリジン ３−アニリノ−２−ナフトエ酸（10.0ｇ、37.98 ｍモ
ル）およびオキシ塩化リン（35.4ｍｌ、379.8 ｍモル）
の混合物を窒素雰囲気で撹拌しながら２時間に亘り150
℃で還流した。生成した紫色の混合物を冷却し、減圧下
で乾燥するまで蒸発させた。含有物を撹拌しながらクロ
ロホルム／氷／濃縮水酸化アニモニウム（200 ｍｌ／20
0 ｇ／200 ｍｌ）の混合物に加えた。クロロホルム層を
分離し、塩化カルシウムにより乾燥した。減圧下で溶剤
を除去して、１２−クロロ−ベンズ［ｂ］アクリジン
（9.4 ｇ、95％）．Ｒｆ 0.8 （シリカゲル、ヘキサン
／酢酸エチル２：１）．ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ２６３
（Ｍ）を得た。

【００８９】１２−シアノ−ベンズ［ｂ］アクリジン 無水メタノール（16ｍｌ）中で１２−クロロ−ベンズ
［ｂ］アクリジン（2.3ｇ、8.68ｍモル）、シアン化カ
リウム（620 ｍｇ、9.55ｍモル）およびシアン化銅
（Ｉ）（391 ｍｇ、4.43ｍモル）の混合物を１分間窒素
で泡立て、密封管中に保持した。混合物を撹拌しながら
4.5 時間に亘り160 ℃に加熱して、冷却した。赤−茶色
の混合物を蒸発させ、残留物を、ヘキサンを充填したシ
リカカラム（ベイカーシリカゲル、カタログ＃７０２４
−１）上でフラッシュ−クロマトグラフ（flash-chroma
tographed ）し（Ｗ．Ｃ．スティル等：Ｊ．有機化学、
43、2923、（1978））、10％の酢酸エチル／ヘキサンに
より溶出し、赤色の１２−シアノ−ベンズ［ｂ］アクリ
ジン（1.54ｇ、70％）．Ｒｆ 0.7 （シリカゲル、ヘキ
サン／酢酸エチル２：１）．ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセ
ロールマトリックス）：ｍ／ｚ255 （Ｍ＋１）を得た。

【００９０】ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン
酸ヒドロクロライド 50％の硫酸（容量／容量、50ｍｌ）中で１２−シアノ−
ベンズ［ｂ］アクリジン（557 ｍｇ、2.19ｍモル）およ
びテトラブチルアンモニウム臭化物（71ｍｇ、0.22ｍモ
ル）の混合物を窒素雰囲気で撹拌しながら44時間に亘り
160 −170 ℃に加熱して、冷却した。生成した混合物を
氷水（500 ｍｌ）中に注ぎ入れた。紫色の沈殿物を集積
し、水で洗浄した。湿った物質を２Ｎ ＮａＯＨ（100
ｍｌ）中で暖めて溶解させ、濾過した。濾液を氷水浴中
で濃縮ＨＣｌによりｐＨ３−４に酸性化し、紫色のベン
ズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロライ
ド（510 ｍｇ、75％）．Ｒｆ 0.4 （シリカゲル、クロ
ロホルム／メタノール／水65：25：４）．ＭＳ（ＦＡ
Ｂ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 274
（Ｍ＋１）を得た。

【００９１】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニルベンズ［ｂ］アクリジン−１２−
カルボキシレート 無水ピリジン（50ｍｌ）中でベンズ［ｂ］アクリジン−
１２−カルボン酸ヒドロクロライド（370 ｍｇ、1.2 ｍ
モル）の懸濁液を５分間に亘り60℃で暖めた。やや濁っ
た溶液を０℃に冷却し、10分間に亘り０℃で、もう15分
間室温でｐ−トルエンスルホニル塩化物（388 ｍｇ、2.
33ｍモル）により処理し、最初の反応混合物を得た。こ
の反応混合物をさらにベンジル２、６−ジメチル−４−
オキシ安息香酸塩（694 ｍｇ、2.71ｍモル）（米国特許
第4,745,181 号を参照のこと）で処理し、第二の反応混
合物を得た。この混合物を窒素雰囲気で40時間に亘り室
温で撹拌し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。ヘキサ
ンを充填したシリカカラム上で残留物をフラッシュ−ク
ロマトグラフして、50％のエーテル−ヘキサンにより溶
出し、橙−赤色の（４−ベンジルオキシカルボキシル−
２、６−ジメチル）フェニル ベンズ［ｂ］アクリジン
−１２−カルボキシレート（450 ｍｇ）、74％）．Ｒｆ
0.6 （シリカゲル、20％酢酸エチル／トルエン）．Ｍ
Ｓ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ
512 （Ｍ＋１）を得た。

【００９２】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリ
ジニウム−１２−カルボキシレートフルオロスルホネー
ト（ＬＥＡＥ−Ｂｚ） 無水塩化メチレン（５ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシ
カルボニル−２、６−ジメチル）フェニル ベンズ
［ｂ］アクリジン−９−カルボキシレート（115 ｍｇ、
0.23ｍモル）に、フルオロスルホン酸メチル（0.128 ｍ
ｌ、2.25ｍモル）を加えた。この溶液を窒素雰囲気で20
時間に亘り室温で撹拌し、無水エーテル（10ｍｌ）で処
理した。生成した沈殿物を集積し、エーテル（100 ｍ
ｌ）で洗浄し、暗茶色の（４−ベンジルオキシカルボニ
ル−２、６−ジメチル）フェニル５−メチル−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート（136 ｍｇ、97％）．ＭＳ（ＦＡＢ、チ
オグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ526 （Ｍ）を得
た。

【００９３】実施例２． （２、６−ジメチル−４−Ｎ
−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル ５−
メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキ
シレートフルオロスルホネート（ＬＥＡＥ−ＮＨＳ）の
調製（４−カルボキシ−２、６−ジメチル）フェニル ベン
ズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート臭化水素
酸塩 30％無水臭化水素−酢酸（５ｍｌ）中の実施例１におい
て調製した（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−
ジメチル）フェニル ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−
カルボキシレート（198 ｍｇ、0.39ｍモル）の溶液を窒
素雰囲気で４時間に亘り55−60℃で撹拌した。混合物を
無水エーテル（20ｍｌ）で処理した。沈殿物を集積し、
エーテル（100 ｍｌ）で洗浄し、定量的に（４−カルボ
キシ−２、６−ジメチル）フェニル ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート臭化水素酸塩．Ｒｆ
0.4 （シリカゲル、５％メタノール／クロロホルム）．
ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 421 （Ｍ）を得た。

【００９４】（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル）フェニルベンズ［ｂ］アクリ
ジン−１２−カルボキシレート 無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中の（４
−カルボキシ−２、６−ジメチル）フェニル ベンズ
［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート臭化水素酸
塩（108 ｍｇ、0.22ｍモル）の溶液に、０℃でジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（111 ｍｇ、0.54ｍモル）を加
えた。この温度で30分間に亘り撹拌した後、Ｎ−ヒドロ
キシルサクシンイミド（62ｍｇ、0.54ｍモル）を加え
た。この溶液を窒素雰囲気で10分間に亘り０℃で、次い
で24時間に亘り室温で撹拌した。生成した混合物を酢酸
（３滴）で処理し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物をクロロホルムで抽出し、クロロホルム抽出物を
減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を充填したシ
リカカラム上でフラッシュ−クロマトグラフし、エーテ
ルで溶出して（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル）フェニル ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート（20ｍｇ、18％）．Ｒ
ｆ 0.6 （シリカゲル、20％）．ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ
518 （Ｍ）を得た。

【００９５】（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル）フェニル５−メチル−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
ロスルホネート（ＬＥＡＥ−ＮＨＳ） 無水塩化メチレン（１ｍｌ）中の（２、６−ジメチル−
４−Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル
ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート
（14ｍｇ、0.026 ｍモル）溶液に、フルオロ硫酸メチル
（0.021 ｍｌ、0.26ｍモル）を加えた。生成した茶色の
溶液を窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹拌し、無水エ
ーテル（１ｍｌ）で処理した。沈殿物を集積し、エーテ
ル（40ｍｌ）で洗浄し、（２、６−ジメチル−４−Ｎ−
サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル ５−メ
チル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシ
レートフルオロスルホネート（11ｍｇ、65％）．ＭＳ
（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ53
3 （Ｍ）を得た。

【００９６】実施例３． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジイソプロピル）フェニル ５−メチル
−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレー
トフルオロスルホネート（ＤＩＰ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ）の
調製３、５−ジイソプロピル−４−オキシ安息香酸 この酸をＷ．Ｈ．ミーク等のＪ．化学および工学デー
タ、14（３）、388 、（1969）の方法により調製した。
無水Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（150 ｍｌ）中の
２、６−ジイソプロピルフェノール（アルドリッヒ カ
タログ＃Ｄ１２６６０−８）（37.0ｍｌ、0.20モル）溶
液に、ナトリウムメトキシド（16.2ｇ、0.30モル）を加
えた。続いての反応期間に亘り、二酸化炭素を混合物に
通過させた。混合物を撹拌しながら加熱し、ポットの温
度が180 ℃に達するまで、２時間に亘りゆっくりと蒸留
して溶剤を除去した。混合物をさらに1.5 時間に亘り18
0 ℃で撹拌し続け、次いで90℃に冷却した。二酸化炭素
の供給を停止し、水（400 ｍｌ）を加えた。さらに室温
まで冷却した後、混合物をトルエン（４×60ｍｌ）で洗
浄し、氷水浴中でｐＨ３まで濃縮塩酸で処理した。生成
した混合物をジエチルエーテル（２×150 ｍｌ）で抽出
した。エーテル抽出物を塩水（100 ｍｌ）で洗浄し、無
水硫酸マグネシウムにより乾燥させた。減圧下で溶剤を
除去して、３、５−ジイソプロピル−４−オキシ安息香
酸（10.4ｇ、23％）．Ｒｆ 0.5 （シリカゲル、50％ジ
エチルエーテル／ヘキサン）．ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：
ｍ／ｚ223 （Ｍ＋１）を得た。

【００９７】ベンジル３、５−ジイソプロピル−４−オ
キシベンゾエート メタノール（25ｍｌ）中の３、５−ジイソプロピル−４
−オキシ安息香酸（1.223 ｇ、5.50ｍモル）に、水（５
ｍｌ）中の水酸化カリウム（308 ｍｇ、5.50ｍモル）を
加えた。生成した溶液を窒素雰囲気で１時間に亘り室温
で撹拌し、減圧下で乾燥するまで完全に蒸発させた。こ
のカリウム塩を、無水アセトニトリル（30ｍｌ）および
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（15ｍｌ）中に溶解さ
せ、ジベンゾ−１８−クラウン−６（198 ｍｇ、0.55ｍ
モル）で処理した。窒素雰囲気下の80℃での撹拌から30
分後、溶液をさらに臭化ベンジル（0.712 ｍｌ、6.05ｍ
モル）で処理した。撹拌を窒素雰囲気下の80℃で４時間
に亘り続けた。冷却した後、生成した混合物を濾過し
た。濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物
を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッシュク
ロマトグラフして20％の酢酸エチル／ヘキサンで溶出
し、結晶ベンジル、３、５−ジイソプロピル−４−オキ
シベンゾエート（1.35ｇ、79％）、Ｒｆ 0.6 （シリカ
ゲル、20％酢酸エチル／トルエン）、ＭＳ（ＥＩ）、ｍ
／ｚ 312 （Ｍ）を得た。

【００９８】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジイソプロピル）フェニル ベンズ［ｂ］アクリジン
−１２−カルボキシレート 無水ピリジン（30ｍｌ）中の実施例１からのベンズ
［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロライド
の懸濁液（200 ｍｌ、0.65ｍモル）を５分間に亘り60℃
で暖めた。次いでやや濁った溶液を０℃に冷却し、ｐ−
トルエンスルホニル塩化物（247 ｍｇ、1.29ｍモル）で
処理した。その溶液を40分間に亘り０℃で、さらに10分
間室温で撹拌し、そこにベンジル２、６−ジイソプロピ
ル−４−オキシベンゾエート（202 ｍｇ、0.65ｍモル）
を加えた。この反応混合物を窒素雰囲気で20時間に亘り
室温で撹拌し続け、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッ
シュクロマトグラフして25％のエーテル／ヘキサンで溶
出し、橙色の（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジイソプロピル）フェニル ベンズ［ｂ］アクリジン
−１２−カルボキシレート（187 ｍｇ、51％）、Ｒｆ
0.6 （シリカゲル、20％酢酸エチル／トルエン）、ＭＳ
（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 570 （Ｍ＋３）を得た。

【００９９】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジイソプロピル）フェニル５−メチル−ベンズ［ｂ］
アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオロスル
ホネート（ＤＩＰ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ） 無水塩化メチレン（３ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシ
カルボニル−２、６−ジイソプロピル）フェニル ベン
ズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート（50ｍ
ｇ、0.088 ｍモル）の溶液に、フルオロスルホン酸メチ
ル（0.072 ｍｌ、0.088 ｍモル）を加えた。茶色の溶液
を窒素雰囲気下で24時間に亘り室温で撹拌し、次いで無
水エーテル（４ｍｌ）で処理した。生成した沈殿物を集
積し、エーテル（10ｍｌ）で洗浄し、暗茶色の（４−ベ
ンジルオキシカルボニル−２、６−ジイソプロピル）フ
ェニル５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２
−カルボキシレートフルオロスルホネート（39ｍｇ、64
％）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリック
ス）：ｍ／ｚ 582 （Ｍ）を得た。

【０１００】実施例４． Ｎ−（４−メトキシフェニル
−Ｎ−［３−（ベンジルオキシカルボニル）フェニルス
ルホニル］５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−
１２−カルボキシアミドフルオロスルホネート（ＬＥＡ
Ｃ−Ｂｚ）の調製３−［Ｎ−（４−メトキシフェニル）スルファミド］安
息香酸 無水塩化メチレン（40ｍｌ）中の３−（クロロスルホニ
ル）安息香酸（コダック カタログ＃１１８８６５５）
（4.4 ｇ、20.00 ｍモル）およびトリエチルアミン（2.
78ｍｌ、20.00 ｍモル）の溶液に、０℃で４−アニシジ
ン（2.46ｇ、200 ｍモル）を加えた。０℃での10分間の
撹拌後、大量の沈殿物が溶液中に形成した。混合物を、
窒素雰囲気下で２時間に亘り室温で撹拌し続けた。濾過
後、わずかに灰色がかった白色の、集積した固体を水
（50ｍｌ）で洗浄し、次いでエーテル（50ｍｌ）で洗浄
し、３−［Ｎ−（４−メトキシフェニル）スルファミ
ド］安息香酸（4.50ｇ、74％）、Ｒｆ 0.5 （シリカゲ
ル、クロロホルム／メタノール／水 65：25：４）、Ｍ
Ｓ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 308 （Ｍ＋１）を得た。

【０１０１】ベンジル３−［Ｎ−（４−メトキシフェニ
ル）スルファミド］ベンゾエート Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（20ｍｌ）中の３−［Ｎ
−（４−メトキシフェニル）スルファミド］安息香酸
（2.00ｇ、6.52ｍモル）の溶液に、水（５ｍｌ）中の水
酸化ナトリウム（260.6 ｍｇ、6.52ｍモル）溶液を加え
た。生成した溶液を窒素雰囲気で１時間に亘り室温で撹
拌し、次いで減圧下で乾燥するまで完全に蒸発させた。
このナトリウム塩を、無水アセトニトリル（40ｍｌ）お
よびＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（20ｍｌ）中に溶解
させ、ジベンゾ−１８−クラウン−６（235 ｍｇ、0.65
ｍモル）で処理した。窒素雰囲気下での80℃での撹拌か
ら30分後、溶液をさらに臭化ベンジル（0.852 ｍｌ、7.
27ｍモル）で処理した。窒素雰囲気下の80℃で撹拌を４
時間に亘り続けた。冷却後、生成した混合物を濾過し
た。白色の固体を少量のアセトニトリルで洗浄した。ア
セトニトリルと濾液の混合物を減圧下で乾燥するまで蒸
発させた。残留物を、ヘキサンを充填したシリカカラム
上でフラッシュクロマトグラフし、15％の酢酸エチル／
ヘキサンで溶出し、結晶ベンジル３−［Ｎ−（４−メト
キシフェニル）スルファミド］ベンゾエート（2.00ｇ、
77％）、Ｒｆ 0.5 （シリカゲル、20％酢酸エチル／ト
ルエン）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 397 （Ｍ＋
１）を得た。

【０１０２】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−［３
−（ベンジルオキシカルボニル）フェニルスルホニル］
ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシアミド 無水ピリジン（30ｍｌ）中のベンズ［ｂ］アクリジン−
１２−カルボン酸ヒドロクロライド（200 ｍｇ、0.65ｍ
モル）の懸濁液を５分間に亘り60℃で暖めた。わずかに
濁った溶液を０℃に冷却し、ｐ−トルエンスルホニル塩
化物（247 ｍｇ、1.29ｍモル）で処理した。この溶液
を、０℃で40分間、さらに室温で10分間撹拌し、ベンジ
ル３−［Ｎ−（４−メトキシフェニル）スルファミド］
ベンゾエート（257 ｍｇ、0.65ｍモル）を加えた。この
反応混合物を、窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹拌し
続け、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物
を、ヘキサンを充填したシリカカラム上でフラッシュク
ロマトグラフし、25％のヘキサン−エーテルで溶出し、
Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−［３−（ベンジル
オキシカルボニル）フェニルスルホニル］ベンズ［ｂ］
アクリジン−１２−カルボキシアミド（177 ｍｇ、68
％）、Ｒｆ 0.4 （シリカゲル、20％酢酸エチル／トル
エン）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 653 （Ｍ＋
１）を得た。

【０１０３】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−［３
−（ベンジルオキシカルボニル）フェニルスルホニル］
５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カル
ボキシアミドフルオロスルホネート（ＬＥＡＣ−Ｂｚ） 無水塩化メチレン（３ｍｌ）中のＮ−（４−メトキシフ
ェニル）−Ｎ−［３−（ベンジルオキシカルボニル）フ
ェニルスルホニル］ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシアミド（50ｍｇ、0.077 ｍモル）に、フルオロ
スルホン酸メチル（0.062 ｍｌ、0.77ｍモル）を加え
た。暗茶色の溶液を窒素雰囲気で20時間に亘り室温で撹
拌し、次いで無水エーテル（10ｍｌ）で処理した。生成
した沈殿物を集積し、エーテル（10ｍｌ）で処理し、青
黒色のＮ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−［３−（ベ
ンジルオキシカルボニル）フェニルスルホニル］５−メ
チル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシ
アミドフルオロスルホネート（38ｍｇ、65％）、ＭＳ
（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ66
7 （Ｍ）を得た。

【０１０４】実施例５． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチル）フェニル３−エトキシ−５−
メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキ
シレートフルオロスルホネート（３−ＥｔＯ−ＬＥＡＥ
−Ｂｚ）の調製ベンゾ［５、６］イサチン Ａ．エチエネおよびＡ．ステヘリン、Bull.Soc.Chim.フ
ランス、６、743 、（1954）の方法にしたがって、ベン
ゾ［５、６］イサチンを調製した。

【０１０５】３−ヒドロキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン
−１２−カルボン酸 ｎ−ブタノール（２ｍｌ）および水（２ｍｌ）中のベン
ゾ［５、６］イサチン（500 ｍｇ、2.54ｍモル）および
水酸化カリウム（996 ｍｇ、17.78 ｍモル）の混合物を
撹拌しながら100 ℃まで加熱して、均質な溶液とし、続
いてレソルシノール（1.95ｇ、17.78 ｍモル）を加え
た。溶液をさらに140 ℃に加熱し、30分間の期間に窒素
により溶剤を徐々にとばした後、さらに２ｍｌの水およ
び１ｍｌのｎ−ブタノールを加えた。溶液の温度を140
℃に保持しつつ、窒素の吹付けを合計で２時間に亘り続
けた。粘着性の混合物を冷却し、100 ｍｌの水に溶解さ
せた。この溶液を氷水浴中で濃縮塩酸によりｐＨ２に酸
性化した。生成した沈殿物を集積し、水で洗浄し、クロ
ロホルムを充填したシリカカラム上でフラッシュクロマ
トグラフして、20％のメタノール−クロロホルムで、続
いてクロロホルム−メタノール−水（65：25：４）で溶
出し、３−ヒドロキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２
−カルボン酸（210 ｍｇ、29％）、Ｒｆ 0.3 （シリカ
ゲル、クロロホルム／メタノール／水 65：25：４）、
ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／
ｚ 290 （Ｍ＋１）を得た。

【０１０６】エチル３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリ
ジン−１２−カルボキシレート メチルスルホキシド（3.5 ｍｌ）中の３−ヒドロキシ−
ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸（90ｍｇ、
0.28ｍモル）および炭酸セシウム（451 ｍｇ、1.38ｍモ
ル）の混合物に、ブロモエタン（207 ｕｌ、2.77ｍモ
ル）を加えた。混合物を窒素雰囲気で４時間に亘り25℃
で撹拌し、次いで水（10ｍｌ）で処理した。混合物を５
％のＨＣｌでｐＨ５に調整し、生成した沈殿物を集積し
て水で洗浄した。粗生成物を、クロロホルムを充填した
シリカカラム上で精製し、５％のメタノール−クロロホ
ルムで溶出し、エチル３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート（36ｍｇ、38％）、Ｒ
ｆ 0.5 （シリカゲル、ジエチルエーテル／ヘキサン
３：１）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリック
ス）：ｍ／ｚ 346 （Ｍ＋１）を得た。

【０１０７】３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジニウ
ム−１２−カルボン酸ヒドロクロライド メタノール（３ｍｌ）および16％の水酸化ナトリウム
（１ｍｌ）中のエチル３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジニウム−１２−カルボキシレート（35ｍｇ、0.10ｍ
モル）の溶液を窒素雰囲気で２日間に亘り25℃で、さら
に４時間に亘り４０℃で撹拌し、次いで減圧下で乾燥す
るまで蒸発させた。残留物を水（２０ｍｌ）中に懸濁さ
せ、氷水浴中で濃縮ＨＣｌによりｐＨ３に調整した。沈
殿物を集積し、水で洗浄して３−エトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボン酸ヒドロクロラ
イド（30ｍｇ、83％）、Ｒｆ 0.8 （シリカゲル、クロ
ロホルム／メタノール／水 65：25：４）、ＭＳ（Ｃ
Ｉ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 318 （Ｍ＋１）を得た。

【０１０８】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート Ｎ、Ｎ′−ジメチルプロピレン尿素（ＤＭＰＲ、1.5 ｍ
ｌ）およびピリジン（１ｍｌ）中の３−エトキシ−ベン
ズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロライ
ド（19ｍｇ、0.054 ｍモル）のわずかに濁った溶液を０
℃で冷却し、ｐ−トルエンスルホニル塩化物（21ｍｇ、
0.11ｍモル）を加えた。20分間の撹拌後、ベンジル３、
５−ジメチル−４−オキシベンゾエート（14ｍｇ、0.05
5 ｍモル）およびＮ、Ｎ′−ジメチルアミノピリジン
（１ｍｇ）を加えた。混合物を窒素雰囲気で20時間に亘
り25℃で撹拌し、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発させ
た。残留物を水（５ｍｌ）で処理し、エーテル（５×５
ｍｌ）で抽出した。混合したエーテル層を水（１×10ｍ
ｌ）、塩水（１×10ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム
により乾燥させた。減圧下で溶剤を除去して粗混合物を
得た。この混合物を、エーテル／ヘキサン（３：２）で
展開することにより、準備（preparative ）ＴＬＣ板
（２ｍｍシリカゲル、ＥＭアート、５７１７）上で分離
した。主に橙色の帯を集積し、10％のメタノール／エー
テルで抽出した。減圧下で溶剤を除去して、橙色の（４
−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメチル）フェ
ニル３−エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシレート（５ｍｇ、17％）、Ｒｆ 0.6 （シリカ
ゲル、ジエチルエーテル／ヘキサン）、ＭＳ（ＦＡＢ、
チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 556 （Ｍ＋
１）を得た。

【０１０９】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−エトキシ−５−メチル−ベン
ズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフル
オロスルホネート（３−ＥｔＯ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ） 塩化メチレン（１ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシカル
ボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−エトキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート（９ｍ
ｇ、0.0162ｍモル）に、フルオロスルホン酸メチル（1
3.1ｕｌ、0.162ｍモル）を加えた。この溶液を窒素雰囲
気で36時間に亘り25℃で撹拌し、次いでジエチルエーテ
ル（10ｍｌ）で処理した。沈殿物を集積し、ジエチルエ
ーテル´（20ｍｌ）で洗浄し、（４−ベンジルオキシカ
ルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−エトキシ−
５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カル
ボキシレートフルオロスルホネート（３−ＥｔＯ−ＬＥ
ＡＥ−Ｂｚ、７ｍｇ、65％）ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ
／ｚ 570 （Ｍ＋２）を得た。

【０１１０】実施例６． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチル）フェニル３−（Ｎ、Ｎ−ジエ
チル−Ｎ−メチル−アンモニウム）エトキシ−５−メチ
ル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレ
ートジフルオロスルホネート（３−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−
Ｂｚ）の調製Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシレート メチルスルホキシド（12ｍｌ）中の３−ヒドロキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸（415 ｍｇ、
1.28ｍモル）の溶液を10分間に亘り25℃で炭酸セシウム
（５ｇ、15.4ｍモル）により処理し、ジエチルアミノエ
チル臭化物臭化水素酸塩（1.5 ｇ、6.4 ｍモル）を加え
た。混合物を窒素雰囲気で４時間に亘り25℃で処理し、
水（100 ｍｌ）で冷却した。沈殿物を集積し、水（50ｍ
ｌ）で洗浄した。粗生成物を、20％のメタノール／クロ
ロホルムを展開させることにより４つの準備ＴＬＣ板
（２ｍｍシリカゲル）上で分離した。橙色の帯を集積
し、10％のメタノール／クロロホルムで抽出した。減圧
下で溶剤を除去することにより、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ
ノエチル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）エトキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート（73ｍ
ｇ、12％）、Ｒｆ 0.6（シリカゲル、20％メタノール
／クロロホルム）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 48
8 （Ｍ＋１）を得た。

【０１１１】３−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）エトキシ
−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロク
ロライド メタノール（12ｍｌ）および４Ｎの水酸化ナトリウム
（４ｍｌ）中のＮ、Ｎ−ジエチルアミノエチル３−
（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボキシレート（60ｍｇ、0.123 ｍ
モル）の溶液を窒素雰囲気で16時間に亘り65℃で撹拌
し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を水（10
ｍｌ）中に溶解させた。この溶液を、氷水浴中で濃縮Ｈ
ＣｌによりｐＨ４まで注意深く酸性化した。生成した沈
殿物を集積し、ジエチルエーテル（５ｍｌ）で洗浄し、
３−（Ｎ、Ｎ−０ジエチルアミノ）エトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロライド
（32ｍｇ、61％）、Ｒｆ 0.3 （シリカゲル、クロロホ
ルム／メタノール／水 65：25：４）を得た。

【０１１２】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）
エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシ
レート ピリジン（12ｍｌ）中の３−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ
ノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボ
ン酸ヒドロクロライド（29ｍｇ、0.069 ｍモル）および
ｐ−トルエンスルホニル塩化物（29ｍｇ、0.152 ｍモ
ル）の混合物を５分間に亘り80℃で撹拌した。生成した
均質な溶液を25℃に冷却し、さらにベンジル４−ヒドロ
キシ−３、５−安息香酸ジメチル（20ｍｇ、0.078 ｍモ
ル）で処理した。窒素雰囲気で16時間に亘り25℃で撹拌
した後、溶剤を減圧下で除去した。残留物を、15％のメ
タノール／クロロホルムで展開することにより準備ＴＬ
Ｃ板（２ｍｍシリカゲル）上で精製した。橙色の帯を集
積し、10％のメタノール／クロロホルムで抽出した。減
圧下で溶剤を除去することにより、（４−ベンジルオキ
シカルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−（Ｎ、
Ｎ−ジエチルアミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジ
ン−１２−カルボキシレート（17ｍｇ、39％）、Ｒｆ
0.6 （シリカゲル、10％メタノール／クロロホルム）、
ＭＳ（ＦＡＢ、グリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ
627 （Ｍ＋１）を得た。

【０１１３】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチル−Ｎ−メ
チル−アンモニウム）エトキシ−５−メチル−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートジフル
オロスルホネート（３−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ） 塩化メチレン（1.9 ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシカ
ルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−（Ｎ、Ｎジ
エチルアミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１
２−カルボキシレート（13ｍｇ、0.0208ｍモル）をフル
オロスルホン酸メチル（25ｕｌ、0.308 ｍモル）で処理
した。窒素雰囲気で15時間に亘る25℃での撹拌後、反応
混合物をゆっくりとジエチルエーテル（５ｍｌ）に加え
た。沈殿物を集積し、エーテル（10ｍｌ）で洗浄し、
（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメチル）
フェニル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチル−アンモ
ニウム）エトキシ−５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジ
ニウム−１２−カルボキシレートジフルオロスルホネー
ト（３−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ、９ｍｇ、53％）、Ｍ
Ｓ（ＦＡＢ、グリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 65
9 （Ｍ＋３）を得た。

【０１１４】実施例７． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−５−
メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキ
シレートフルオロスルホネート（２−ＭｅＯ−ＬＥＡＥ
−Ｂｚ）の調製３−（４−メトキシ）アニリノ−２−ナフトエ酸 ｐ−アニシジン（84.7ｇ、687.7 ｍモル）および３−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸（64.7ｇ、343.9 ｍモル）の
混合物を、窒素雰囲気で22時間に亘り160 ℃で機械的に
撹拌した。130 ℃に冷却した後、混合物を熱い１Ｎの塩
酸（1000ｍｌ）で処理し、10分間に亘り130 ℃で撹拌
し、熱いうちに濾過した。生成したケーキを熱い0.5 Ｎ
の炭酸ナトリウム（2200ｍｌ）とともに15分間に亘り撹
拌し、熱いうちに濾過した。濾液を冷却し、氷水浴中で
濃縮ＨＣｌによりｐＨ6.5 に酸性化した。沈殿物を集積
し、メタノール（150 ｍｌ）で洗浄し、３−（４−メト
キシ）アニリノ−２−ナフトエ酸（14.8ｇ、15％）、Ｒ
ｆ 0.6 （シリカゲル、10％メタノール／クロロホル
ム）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 294 （Ｍ＋１）
を得た。

【０１１５】１２−クロロ−２−メトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジン ３−（４−メトキシ）アニリノ−２−ナフトエサン（1
5.4ｇ、49.44 ｍモル）およびオキシ塩化リン（46ｍ
ｌ、494.4 ｍモル）の混合物を窒素雰囲気で3.5 時間に
亘り120 ℃で還流し、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発
させた。残留物を、クロロホルム（500 ｍｌ）／氷（45
0 ｇ）／水酸化アンモニウム（450 ｍｌ）を含有する混
合溶剤中に加えた。生成した２つの層を分離した。水性
の層をクロロホルム（３×250 ｍｌ）で抽出した。混合
クロロホルム層を塩化カルシウムにより乾燥させ、減圧
下で乾燥するまで蒸発させ、１２−クロロ−２−メトキ
シ−ベンズ［ｂ］アクリジン（12.5ｇ、86％）、Ｒｆ
0.8 （シリカゲル、60％ジエチルエーテル／ヘキサ
ン）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 294 （Ｍ＋１）
を得た。

【０１１６】１２−シアノ−２−メチキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジン メタノール（3.7 ｍｌ）中の、１２−クロロ−２−メト
キシ−ベンズ［ｂ］アクリジン（562 ｍｇ、1.905 ｍモ
ル）、シアン化カリウム（136 ｍｇ、2.096 ｍモル）お
よびシアン化銅（Ｉ）（86ｍｇ、0.953 ｍモル）の混合
物を密封管中で4.5 時間に亘り170 ℃で撹拌した。生成
した混合物を濾過し、固体をクロロホルム／メタノール
（２：１、10ｍｌ）で洗浄した。混合濾液を減圧下で蒸
発させて残留物を得た。この残留物を、クロロホルムを
充填したシリカカラム上でフラッシュクロマトグラフ
し、１％のメタノール／クロロホルムで溶出し、１２−
シアノ−２−メチキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン（477
ｍｇ、88％）、Ｒｆ 0.6（シリカゲル、１％メタノー
ル／クロロホルム）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ
285 （Ｍ＋１）を得た。

【０１１７】２−ヒドロキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン
−１２−カルボン酸ヒドロスルフェート １２−シアノ−２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン
（8.3 ｇ、29.1ｍモル）および50％の硫酸（容量／容
量、280 ｍｌ）の混合物を窒素雰囲気で48時間に亘り16
0 ℃で機械的に撹拌した。生成した混合物を冷却し、氷
水中（1800ｍｌ）に注ぎ入れた。沈殿物を集積し、水
（200 ｍｌ）で洗浄し、クロロホルムを充填したシリカ
カラム上でフラッシュクロマトグラフを行ない、20％の
メタノール／クロロホルムと、続いてクロロホルム／メ
タノール／水（65：25：４）で溶出し、２−ヒドロキシ
−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロス
ルフェート（4.8 ｇ、43％）、Ｒｆ 0.4 （シリカゲ
ル、クロロホルム／メタノール／水 65：25：４）を得
た。

【０１１８】メチル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アクリ
ジン−１２−カルボキシレート メチルスルホキシド（４ｍｌ）中の２−ヒドロキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロラ
イド（186 ｍｇ、0.572 ｍモル）の溶液に、炭酸セシウ
ム（746 ｍｇ、2.29ｍモル）およびヨードメタン（143
ｕｌ、2.29ｍモル）を加えた。生成した混合物を窒素雰
囲気で４時間に亘り25℃で撹拌し、次いで水（50ｍｌ）
で処理した。混合物を、氷水浴中で濃縮ＨＣｌによりｐ
Ｈ６に酸性化した。生成した沈殿物を集積し、水（５ｍ
ｌ）で洗浄し、空気乾燥させた。粗混合物を、ジエチル
エーテル／ヘキサン（５：１）により展開した４つの準
備ＴＬＣ板（２ｍｍシリカゲル）上で精製した。主な橙
色の帯を集積し、10％のメタノール／クロホルムで抽出
した。減圧下で溶剤を除去することにより、メチル２−
メトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシ
レート（35ｍｇ、17％）、Ｒｆ 0.8 （シリカゲル、ジ
エチルエーテル／ヘキサン５：１）を得た。

【０１１９】２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−
１２−カルボン酸 メタノール（９ｍｌ）および４Ｎの水酸化ナトリウム
（３ｍｌ）中のメチル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート（35ｍｇ、0.10ｍモ
ル）の溶液を65℃で15時間に亘り撹拌した。生成した混
合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を水
（40ｍｌ）に溶解させた。この水性溶液を、氷水浴中で
濃縮ＨＣｌによりｐＨ５に酸性化した。沈殿物を集積
し、水（５ｍｌ）で洗浄し、２−メトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸（20ｍｇ、59％）
Ｒｆ 0.5 （シリカゲル、クロロホルム／メタノール／
水 65：25：４）、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／ｚ 30
4 （Ｍ＋１）を得た。

【０１２０】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート ピリジン（５ｍｌ）中の２−メトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボン酸（18ｍｇ、0.0529ｍモル）
を、25℃で15分間に亘りｐ−トルエンスルホニル塩化物
（20ｍｇ、0.106 ｍモル）で処理し、次いでベンジル
３、５−ジメチル−４−オキシ−ベンゾエート（27ｍ
ｇ、0.106 ｍモル）を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘
り25℃で撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発させて
ピリジンを除去した。残留物をジエチルエーテル／ヘキ
サン（３：２）を展開させることにより準備ＴＬＣ（２
ｍｍシリカゲル）上で精製した。橙色の帯を集積し、５
％のメタノール／クロロホルムで抽出した。減圧下で溶
剤を除去して、（４−ベンジルオキシカルボニル−２、
６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボキシレート（2.7 ｍｇ、９
％）、Ｒｆ 0.5 （シリカゲル、60％ジエチルエーテル
／ヘキサン）を得た。

【０１２１】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル２−メトキシ−５−メチル−ベン
ズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフル
オロスルホネート（２−ＭｅＯ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ） 塩化メチレン（１ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシカル
ボニル−２、６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート（2.5
ｍｌ、0.0046ｍモル）を窒素雰囲気で15時間に亘り25℃
で撹拌しながらフルオロスルホン酸メチル（3.7 ｕｌ、
0.56ｍモル）で処理した。反応混合物を無水ジエチルエ
ーテル（４ｍｌ）に加えた。精製した沈殿物を集積し、
ジエチルエーテル（５ｍｌ）で洗浄し、（４−ベンジル
オキシカルボニル−２、６−ジメチル）フェニル２−メ
トキシ−５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１
２−カルボキシレートフルオロスルホネート（２−Ｍｅ
Ｏ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ）（1.5 ｍｇ、49％）、ＭＳ（ＦＡ
Ｂ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 556
（Ｍ）を得た。

【０１２２】実施例８． （２、６−ジメチル−４−サ
クシンイミジルオキシカルボニル）フェニル５−メチル
−２−（トリメチルアンモニウム）エトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートジフル
オロスルホネート（２−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−ＮＨＳ）の
調製Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチル２−（Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシレート メチルスルホキシド（11ｍｌ）中の２−ヒドロキシ−ベ
ンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸ヒドロクロラ
イド（360 ｍｇ、1.108 ｍモル）の溶液に、炭酸セシウ
ム（3.61ｇ、11.08 ｍモル）およびＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノエチル臭化物臭化水素酸塩（1.03ｇ、4.432 ｍモ
ル）を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘り60℃で撹拌し
た後、反応混合物をメチルスルホキシド（20ｍｌ）で希
釈して、濾過し、不溶性不純物を除去した。濾液を減圧
下で小さな容量まで濃縮した。この濾液を、クロロホル
ム／メタノール／水（47：48：５）で展開することによ
り準備ＴＬＣ板（２ｍｍシリカゲル）上で分離した。所
望の橙色の帯を集積し、25％のメタノール／クロロホル
ムで抽出した。減圧下で溶剤を除去して、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノエチル２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エト
キシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレー
ト（86ｍｇ、18％）、Ｒｆ 0.6 （シリカゲル、クロロ
ホルム／メタノール／水 65：24：４）、ＭＳ（ＦＡ
Ｂ、グリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 432 （Ｍ＋
１）を得た。

【０１２３】２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシ
−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸 メタノール（22ｍｌ）および４Ｎの水酸化ナトリウム
（7.3 ｍｌ）中のＮ、Ｎ−ジエチルアミノエチル２−
（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボキシレート（86ｍｇ、0.20ｍモ
ル）を、１時間に亘り65℃で、15時間に亘り35℃で撹拌
した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。
残留物を水（５ｍｌ）で洗浄し、空気乾燥し、２−
（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボン酸（23ｍｇ、32％）、Ｒｆ
0.3 （シリカゲル、クロロホルム／メタノール／水 6
5：25：４）、ＭＳ（ＦＡＢ、グリセロールマトリック
ス）：ｍ／ｚ 361 （Ｍ＋１）を得た。

【０１２４】サクシンイミジル３、５−ジメチル−４−
オキシベンゾエート Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（150 ｍｌ）中の３、５
−ジメチル−４−オキシ安息香酸（5.0 ｇ、30.0ｍモ
ル）の溶液を０℃に冷却し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミド（3.45ｇ、30.0ｍモル）および１、３−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（6.81ｇ、33.0ｍモル）で処理し
た。溶液を窒素雰囲気で、２時間に亘り０℃で、16時間
に亘り25℃で撹拌した。生成した混合物を15分間に亘り
0.5 ｍｌの酢酸とともに撹拌し、次いで濾過して不溶性
の尿素を除去した。濾液を減圧下で乾燥するまで蒸発さ
せた。乾燥した物質をジエチルエーテル（100 ｍｌ）で
洗浄し、沸騰した酢酸エチル（200 ｍｌ）中に懸濁させ
た。この懸濁液を熱いうちに濾過し、不溶性不純物を除
去した。濾液を濃縮し、熱い酢酸エチル／塩化メチレン
（１：１、200 ｍｌ）中に懸濁させ、冷却して、2.91ｇ
（37％）の灰色がかった白色の粉末Ｒｆ 0.6 （シリカ
ゲル、ジエチルエーテル）を得た。

【０１２５】（２、６−ジメチル−４−サクシンイミジ
ルオキシカルボニル）フェニル２−（Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシレート ピリジン（４ｍｌ）中の２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボ
ン酸（30ｍｇ、0.0833ｍモル）の溶液を25℃で10分間に
亘りｐ−トルエンスルホニル塩化物（31.8ｍｇ、0.166
ｍモル）で処理し、次いでサクシンイミジル３、５−ジ
メチル−４−オキシベンゾエート（32ｍｇ、0.0833ｍモ
ル）を加えた。窒素雰囲気で15時間に亘る25℃での撹拌
後、溶液をクロロホルム（10ｍｌ）で希釈し、ただちに
水（３×４ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥するまで蒸発
させた。残留物を、10％のメタノール／クロロホルムに
より展開させた２つの準備ＴＬＣ板（１ｍｍシリカゲ
ル）上で精製した。所望の橙色の帯を集積し、10％のメ
タノール／クロロホルムにより抽出した。減圧下で溶剤
を除去し、（２、６−ジメチル−４−サクシンイミジル
オキシカルボニル）フェニル２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ミノ）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カル
ボキシレート（７ｍｇ、14％）、Ｒｆ 0.8 （シリカゲ
ル、10％のメタノール／クロロホルム）、ＭＳ（ＦＡ
Ｂ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ 606
（Ｍ＋１）を得た。

【０１２６】（２、６−ジメチル−４−サクシンイミジ
ルオキシカルボニル）フェニル５−メチル−２−（トリ
メチルアンモニウム）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジ
ニウム−１２−カルボキシレートジフルオロスルホネー
ト（２−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−ＮＨＳ） 無水塩化メチレン（４ｍｌ）中の（２、６−ジメチル−
４−Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル
２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジンカルボキシレート（1.9 ｍｇ、0.0031
ｍモル）の溶液をフルオロスルホン酸メチル（3.8 ｕ
ｌ、0.0465ｍモル）で処理した。溶液を窒素雰囲気で16
時間に亘り25℃で撹拌した。生成した沈殿物を集積し、
ジエチルエーテル（２ｍｌ）で洗浄し、（２、６−ジメ
チル−４−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニ
ル５−メチル−２−（トリメチルアンモニウム）エトキ
シ−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレ
ートジフルオロスルホネート（２−ＱＡＥ−ＬＥＡＥ−
ＮＨＳ）（1.0 ｍｇ、39％）を得た。

【０１２７】実施例９． （４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチル）フェニル５−（３−スルホプ
ロピル）−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボ
キシレート（ＮＳＰ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ）の調製（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメチル）
フェニル５−（３−スルホプロピル）−ベンズ［ｂ］ア
クリジウニム−１２−カルボキシレート（ＮＳＰ−ＬＥ
ＡＥ−Ｂｚ） 実施例１からの（４−ベンジルカルボキシル−２、６−
ジメチル）フェニルベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
ルボキシレート（30ｍｇ、0.0587ｍモル）および１、３
−プロパンスルトン（600 ｍｇ、4.9 ｍモル）の混合物
を窒素でフラッシングし、密封管中に保持した。この管
を180 ℃で５時間に亘り撹拌しながら加熱し、次いで冷
却した。生成した混合物を、Ｃ−１８カラム（ＹＭＣ
ＳＨ−３４４−１５、Ｓ−１５、１２８）上の逆相準備
ＨＰＬＣにより精製し、０から20分まで0.05Ｍの水性ト
リフルオロ酢酸中で25％から40％のアセトニトリルで、
５分間以上に亘り40％から90％で、さらに10分間は90％
のアセトニトリルを保持する傾斜条件で溶出した。17分
の保持時間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて3.2 ｇ
の（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメチ
ル）フェニル５−（３−スルホプロピル）−ベンズ
［ｂ］アクリジウニム−１２−カルボキシレート（ＮＳ
Ｐ−ＬＥＡＥ−Ｂｚ）、ＭＳ（ＦＡＢ、グリセロールマ
トリックス）：ｍ／ｚ 634 （Ｍ＋１）を得た。

【０１２８】実施例１０． （２、６−ジメチル−４−
Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル２−
メトキシ−５−（２−スルホエチル）−ベンズ［ｂ］ア
クリジニウム−１２−カルボキシレート（２−ＭｅＯ−
ＮＳＥ−ＬＥＡＥ−ＮＨＳ）の調製（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイミジルオキシ
カルボニル）フェニル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジニウム−１２−カルボキシレート ピリジン（20ｍｌ）中の実施例７からの２−メトキシ−
ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸（208 ｍ
ｇ、0.6118ｍモル）の混合物を25℃で10分間に亘りｐ−
トルエンスルホニル塩化物（233 ｍｇ、1.2235ｍモル）
で処理し、次いでサクシンイミジル３、５−ジメチル−
４−オキシベンゾエート（161 ｍｇ、0.6118ｍモル）を
加えた。窒素雰囲気で24時間に亘り25℃で撹拌した後、
減圧下での蒸発によりピリジンを除去した。生成した混
合物を、充填したシリカカラム上でフラッシュクロマト
グラフして、ジエチルエーテルで溶出した。集積した粗
生成物をさらに、ジエチルエーテルの溶出によりクロマ
トロン板（１ｍｍシリカゲル）上で精製し、80ｍｇ（24
％）の純粋な生成物、Ｒｆ 0.8 （シリカゲル、酢酸エ
チル／ヘキサン２：１）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロ
ールマトリックス）：549 （Ｍ＋１）を得た。

【０１２９】（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイ
ミジルオキシカルボニル）フェニル２−メトキシ−５−
（２−スルホエチル）−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−
１２−カルボキシレート（２−ＭｅＯ−ＮＳＥ−ＬＥＡ
Ｅ−ＮＨＳ） （２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイミジルオキシ
カルボニル）フェニル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］アク
リジン−１２−カルボキシレート（23ｍｇ、0.04197 ｍ
モル）およびエチレンスルホニル塩化物（Ｃ．Ｓ．ロン
デストレッドＪｒ．、J.Amer.Chem.Soc.、76、1926、
（1954）の方法にしたがって調製した）（378 ｕｌ、4.
197 ｍモル）の混合物を窒素雰囲気で63時間に亘り25℃
で撹拌した。生成した混合物を、Ｃ−１８カラム上の逆
相準備ＨＰＬＣにより精製し、0.05Ｍの水性トリフルオ
ロ酢酸中のアセトニトリルで０から10分は35％で、10か
ら30分は35％から80％で、30から35分は80％から90％
で、さらに５分間は90％での傾斜条件で溶出した。25分
の保持時間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて、2.2
ｍｇ（８％）の（２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシン
イミジルオキシカルボニル）フェニル２−メトキシ−５
−（２−スルホエチル）−ベンズ［ｂ］アクリジニウム
−１２−カルボキシレート（２−ＭｅＯ−ＮＳＥ−ＬＥ
ＡＥ−ＮＨＳ）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマト
リックス）：ｍ／ｚ 657 （Ｍ＋１）を得た。

【０１３０】実施例１１． ［２、６−ジメチル−４−
（２−メトキシイミノエチル）］フェニル２−メトキシ
−５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カ
ルボキシレート二塩化物（２−ＭｅＯ−ＬＥＡＥ−イミ
デート）の調製（４−シアノエチル−２、６−ジメチル）フェニル２−
メトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシ
レート ピリジン（15ｍｌ）中の実施例７からの２−メトキシ−
ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カルボン酸（100 ｍ
ｇ、0.2941ｍモル）を、０℃で40分間に亘りｐ−トルエ
ンスルホニル塩化物（112 ｍｇ、0.5882ｍモル）で処理
し、続いてトリエチルアミン（164 ｕｌ、1.1789ｍモ
ル）および４−シアノエチル−２、６−ジメチル−フェ
ノール（Ｅ．ジェクソバ等、ＣＳ158810、1975年７月15
日；ＣＡ84(13）：898299の方法にしたがって調製し
た）（51ｍｇ、0.2914ｍモル）を加えた。窒素雰囲気で
18時間に亘り25℃で撹拌した後、反応溶液を減圧下で蒸
発させてピリジンを除去した。残留物を、酢酸エチル／
ヘキサン（３：４）を２度展開させた４つの準備ＴＬＣ
板（２ｍｍシリカゲル）上で精製した。主要な橙色の帯
を集積し、メタノール／クロロホルム（１：30）で抽出
した。減圧下で溶媒を除去して、（４−シアノエチル−
２、６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−ベンズ
［ｂ］アクリジン−１２−カルボキシレート（75ｍｇ、
55％）、Ｒｆ 0.5（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサ
ン ２：３）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリ
ックス）：ｍ／ｚ 461 （Ｍ＋１）を得た。

【０１３１】（４−シアノエチル−２、６−ジメチル）
フェニル２−メトキシ−５−メチルベンズ［ｂ］アクリ
ジニウム−１２−カルボキシレートフルロオスルホネー
ト 塩化メチレン（１ｍｌ）中の（４−シアノエチル−２、
６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−ベンズ［ｂ］ア
クリジン−１２−カルボキシレート（20ｍｇ、0.04338
ｍモル）の溶液を、窒素雰囲気で18時間に亘り25℃で撹
拌しながらフルオロスルホン酸エチル（17.5ｕｌ、0.21
69ｍモル）で処理した。反応混合物を無水ジエチルエー
テル（５ｍｌ）に加えた。生成した沈殿物を集積し、Ｃ
−１８カラム上の逆相準備ＨＰＬＣにより精製し、0.05
Ｍの水性トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルで０から
30分は40％から80％で、残りはさらに40分間80％のアセ
トニトリルでの傾斜条件により溶出した。24分の保持時
間の画分を集積し、減圧下で蒸発させて、（４−シアノ
エチル−２、６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−５
−メチルベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキ
シレートフルロオスルホネート（15.7ｍｇ、65％）、Ｍ
Ｓ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス）：ｍ／ｚ
475 （Ｍ）を得た。

【０１３２】［２、６−ジメチル−４−（２−メトキシ
イミノエチル）］フェニル２−メトキシ−５−メチル
ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレート
二塩化物（２−ＭｅＯ−ＬＥＡＥ−イミデート） 無水メタノール（0.5 ｍｌ）中の（４−シアノエチル−
２、６−ジメチル）フェニル２−メトキシ−５−メチル
ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレー
トフルオロスルホネート（４ｍｇ、0.00697 ｍモル）の
溶液を、０℃で10分間に亘り無水塩化水素（気体）で処
理した。次いで反応溶液を、窒素を吹き付けることによ
り小さな容量に減少させた。濃縮物を無水ジエチルエー
テル（３ｍｌ）に加えた。生成した沈殿物を集積し、ジ
エチルエーテル（５ｍｌ）で洗浄し、［２、６−ジメチ
ル−４−（２−メトキシイミノエチル）］フェニル２−
メトキシ−５−メチル ベンズ［ｂ］アクリジニウム−
１２−カルボキシレート二塩化物（２−ＭｅＯ−ＬＥＡ
Ｅ−イミデート）（1.5 ｍｇ、37％）を得た。

【０１３３】アクリジニウムエステルの類似体の調製 実施例１２． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、
６−ジイソプロピル）フェニル１０−メチル−アクリジ
ニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート
（ＤＩＰＡＥ−Ｂｚ）の調製（４−ベンシルオキシスルボニル−２、６−ジイソプロ
ピル）フェニル アクリジン−９−カルボキシレート 塩化チオニル（３ｍｌ、41.1ｍモル）中のアクリジン−
９−カルボン酸ヒドロクロライド（74ｍｇ、0.33ｍモ
ル）の混合物を、窒素雰囲気で２時間に亘り110℃で還
流した。冷却後、溶液を減圧下で乾燥するまで蒸発させ
た。固体を無水ジエチルエーテル（５ｍｌ）で洗浄し、
アクリジン−９−ホスゲンヒドロクロライドを得た。こ
の酸塩化物を無水ピリジン（４ｍｌ）中に溶解させ、次
いでベンジル３、５−ジイソプロピル−４−オキシ安息
香酸（102 ｍｇ、0.33ｍモル）および４−Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノ−ピリジン（16ｍｇ、0.13ｍモル）を加え
た。窒素雰囲気で16時間に亘る25℃での撹拌後、溶液を
減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残留物を、20％のジ
エチルエーテル／ヘキサンの溶出によりクロマトトロン
板（１ｍｍシリカゲル）上で精製し、（４−ベンシルオ
キシスルボニル−２、６−ジイソプロピル）フェニル
アクリジン−９−カルボキシレート（64ｍｇ、38％）、
Ｒｆ 0.6 （シリカゲル、20％酢酸エチル／トルエ
ン）、ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 517 （Ｍ）を得た。

【０１３４】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジイソプロピル）フェニル１０−メチル−アクリジニ
ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート（Ｄ
ＩＰＡＥ−Ｂｚ） 無水塩化メチレン（３ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシ
カルボニル−２、６−ジイソプロピル）フェニル アク
リジン−９−カルボキシレート（62ｍｇ、0.120 ｍモ
ル）の溶液をフルオロスルホン酸メチル（97ｕｌ、1.19
8 ｍモル）で処理した。窒素雰囲気で21時間に亘る25℃
での撹拌後、溶液を無水ジエチルエーテル（10ｍｌ）で
処理した。生成した沈殿物を集積し、ジエチルエーテル
（20ｍｌ）で洗浄し、アセトニトリル／ジエチルエーテ
ルにより結晶化させて、（４−ベンジルオキシカルボニ
ル−２、６−ジイソプロピル）フェニル１０−メチル−
アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホ
ネート（ＤＩＰＡＥ−Ｂｚ）（20ｍｇ、26％）を得た。

【０１３５】実施例１３． （４−ベンジルオキシカル
ボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−メトキシ−１
０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフ
ルオロスルホネート（３−ＭｅＯ−ＤＭＡＥ−Ｂｚ）の
調製メチル３−メトキシ−アクリジン−９−カルボキシレー
ト メチルスルホキシド（50ｍｌ）中の３−ヒドロキシ−ア
クリジン−９−カルボン酸（２ｇ、8.368 ｍモル）の溶
液に、25℃で炭酸セシウム（10.9ｇ、33.47 ｍモル）を
加え、続いてヨードメタン（2.08ｍｌ、33.47 ｍモル）
をゆっくりと加えた。窒素雰囲気で２時間に亘る25℃で
の撹拌後、混合物を水（500 ｍｌ）中に注ぎ入れた。沈
殿物を集積し、水（200 ｍｌ）で洗浄し、空気乾燥させ
た。生成した混合物を、クロロホルムを充填したシリカ
カラム上でフラッシュクロマトグラフし、１％のメタノ
ール／クロロホルムで、続いて２％のメタノール／クロ
ロホルムで溶出し、粗生成物を得た。この粗生成物をさ
らに５％のメタノール／クロロホルムの溶出により６つ
の準備ＴＬＣ板（２ｍｍシリカゲル）上で精製した。主
要な帯を集積し、５％のメタノール／クロロホルムで抽
出した。減圧下で溶剤を除去して、メチル３−メトキシ
−アクリジン−９−カルボキシレート（1.05g、47％）、
Ｒｆ 0.7 （シリカゲル、５％メタノール／クロロホル
ム）を得た。

【０１３６】３−メトキシ−アクリジン−９−カルボン
酸ヒドロクロライド メタノール（30ｍｌ）および４Ｎの水酸化ナトリウム
（10ｍｌ）中のメチル３−メトキシ−アクリジン−９−
カルボキシレート（900 ｍｇ、3.37ｍモル）の溶液を窒
素雰囲気で14時間に亘り65℃で撹拌し、冷却し、減圧下
で乾燥するまで蒸発させた。固体を水（100 ｍｌ）中に
溶解させた。この水性溶液をジエチルエーテル（４×50
ｍｌ）で洗浄し、氷水浴中で濃縮ＨＣｌによりｐＨ３に
酸性化した。生成した沈殿物を集積し、水（200 ｍｌ）
で洗浄し、空気乾燥させ、３−メトキシ−アクリジン−
９−カルボン酸ヒドロクロライド（710 ｍｇ、73％）、
Ｒｆ0.6 （シリカゲル、クロロホルム／メタノール／水
65：25：４）を得た。

【０１３７】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−メトキシ−アクリジン−９−
カルボキシレート ピリジン（25ｍｌ）中の３−メトキシ−アクリジン−９
−カルボン酸ヒドロクロライド（150 ｍｇ、0.519 ｍモ
ル）の懸濁液に、０℃でｐ−トルエンスルホニル塩化物
（198 ｍｇ、1.038 ｍモル）を加えた。10分間の撹拌後
には懸濁液は均質になった。次いでベンジル３、５−ジ
メチル−４−オキシベンゾエート（132ｍｇ、0.519 ｍ
モル）を加えた。溶液を窒素雰囲気で、２時間に亘り65
℃で、さらに20時間に亘り25℃で撹拌し、減圧下で乾燥
するまで蒸発させた。残留物をクロロホルム（100 ｍ
ｌ）中で懸濁させ、５％の水酸化アンモニウム（４×50
ｍｌ）、水（２×50ｍｌ）、塩水（１×50ｍｌ）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムにより乾燥させた。減圧下で
クロロホルムを除去して、粗製混合物を得た。この混合
物を、トルエン／酢酸エチル（４：１）を展開した２つ
の準備ＴＬＣ板（２ｍｍシリカゲル）上で精製した。主
要な帯を集積し、10％のメタノール／クロロホルムで抽
出した。減圧下で溶剤を除去し、（４−ベンジルオキシ
カルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−メトキシ
−アクリジン−９−カルボキシレート、Ｒｆ 0.7 （シ
リカゲル、20％酢酸エチル／トルエン）、ＭＳ：（ＣＩ
ＣＨ４）ｍ／ｚ 492 （Ｍ＋１）を得た。

【０１３８】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル３−メトキシ−１０−メチル−ア
クリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネ
ート（３−ＭｅＯ−ＤＭＡＥ−Ｂｚ） 無水塩化メチレン（２ｍｌ）中の（４−ベンジルオキシ
カルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−メトキシ
−アクリジン−９−カルボキシレート（45ｍｇ、0.0916
ｍモル）の溶液を、フルオロスルホン酸メチル（74ｕ
ｌ、0.916 ｍモル）で処理した。窒素雰囲気で19時間に
亘り25℃で撹拌した後、溶液を無水ジエチルーテル（６
ｍｌ）で処理した。生成した沈殿物を集積し、ジエチル
エーテル（20ｍｌ）で洗浄し、（４−ベンジルオキシカ
ルボニル−２、６−ジメチル）フェニル３−メトキシ−
１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート
フルオロスルホネート（３−ＭｅＯ−ＤＭＡＥ−Ｂｚ）
（41ｍｇ、74％）、ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマ
トリックス）：ｍ／ｚ 506 （Ｍ）を得た。

【０１３９】実施例１４． ＡＢＡＣの合成 核間ベンズ［ａ］アクリジニウムエステル、（４−ベン
ジルオキシカルボニル−２、６−ジメチル）フェニル５
−メチル−ベンズ［ａ］アクリジニウム−１２−カルボ
キシレートメトスルフェートおよび中間体の調製を以下
のように行なう：ベンズ［ａ］アクリジン−１２−カルボン酸 マーチネット、Ｊ．およびダンセット、Ａ．によりBul
l.Soc.Chim.、Fr. 、45、101 、（1929）に記載された
方法を基本的に用いる。

【０１４０】Ｎ−フェニル−β−ナフチルアミン（22.9
ｇ、0.1 ｍモル）（アルドリッヒ、カタログ＃17,805-
5）を５ｍｌの酢酸中のジエチルケトマロン酸塩（18
ｇ、0.1ｍモル）と混合し、油浴中で45分間に亘り150
℃で加熱した。反応混合物を冷却により凝固させた。固
体をフリット漏斗（fritted funnel）に移し、エチルア
ルコールで完全に洗浄し、真空下のデシケーター中で乾
燥させて、エチルフェニル−１−ベンゾ−４、５−ジオ
キシンドール−３−カルボキシレート：ｍｐ169 −170
℃を得た。この最初の中間体の一部（７ｇ、0.02モル）
をさらに100 ｍｌの10％ＫＯＨで処理し、90分間に亘り
還流により加熱し、一晩室温で放置した。この第２の反
応混合物に、200 ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを加えた。生成し
た黄色の沈殿物を濾過し、沸騰したエタノールで洗浄
し、乾燥させて2.1 ｇ（33.8％）のベンズ［ａ］アクリ
ジン−１２−カルボン酸、ＭＳ（ＣＩ、ＣＨ４）：ｍ／
ｚ 274（Ｍ＋１）を得た。

【０１４１】ベンズ［ａ］アクリジン−１２−ホスゲン 上述のようにして得たベンズ［ａ］アクリジン−１２−
カルボン酸（１ｇ、3.66ｍモル）に、10ｍｌの塩化チオ
ニルを加えた。混合物を３時間に亘り95℃で加熱し、冷
却して、50ｍｌのベンゼンで処理し、４℃で一晩貯蔵し
た。沈殿物を濾過により集積し、ベンゼン、次いでエチ
ルエーテルで洗浄し、真空下のデシケーター中で乾燥さ
せ、300 ｍｇ（28％）の酸塩化物を得た。

【０１４２】（４−ベンジルオキシカルボニル−２、６
−ジメチル）フェニル５−メチル−ベンズ［ａ］アクリ
ジニウム−１２−カルボキシレートメトスルフェート 10ｍｌ中の乾燥ピリジン中の４−ベンジルオキシカルボ
ニル−２、６−ジメチルフェノール（0.27ｇ、１ｍモ
ル）の溶液を、32ｍｇ、0.26ｍモルの４−ジメチルアミ
ノピリジン（アルドリッヒ、カタログ＃10,770-0）で処
理した。この溶液に、上述のように調製したベンズ
［ａ］アクリジン−１２−ホスゲンを加えた。溶液を３
時間に亘り100 ℃で加熱し、蒸発させて、残留物を得
た。この残留物は、トルエン／酢酸エチル（４：１）混
合物中の５％のメタノールの展開により３つの準備ＴＬ
Ｃ板（ＥＭカタログ＃5751）上で精製した。開始フェノ
ールのＲｆよりやや低いＲｆを有する発光帯を取り出
し、クロロホルム中の５％で溶出し、溶出物を蒸発させ
て、433 ｍｇの黄色の中間体、（４−ベンジルオキシカ
ルボニル−２、６−ジメチル）フェニル ベンズ［ａ］
アクリジン−１２−カルボキシレートを得た。

【０１４３】この中間体を20ｍｌのトリクロロメタン中
に溶解させ、４ｍｌの硫酸ジメチルで処理し、48時間に
亘り85℃で加熱して冷却した。黄色の沈殿物を濾過して
エーテルで洗浄し、222 ｍｇ（37％）の所望の生成物、
ＭＳ（ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックスマ）：ｍ
／ｚ 526 （Ｍ）を得た。

【０１４４】接合体（conjugate ）の調製 本発明の化学発光（chemiluminecsent）化合物におい
て、どの結合部位が選択されるかに依存して、好ましく
はＲ₆ 位置で、ＡＦＡＣ標識は、水性媒質または有機媒
質中の特定の結合パートナー、配位子、またはハプテン
と直接反応し得る。

【０１４５】化学発光化合物の別の位置も、結合パート
ナーと反応して接合体を形成する結合部位を有してもよ
いことは理解されよう。

【０１４６】化学発光標識は、適切なリービング基（le
aving group ）、または物質と結合させるスペーサによ
り直接結合または連結して試験検定に利用する接合体を
形成するような反応基に容易に転化される官能基または
リービング基により結合する求電子官能基を含む。ＬＥ
ＡＥ−抗−ＴＳＨ接合体を調製する実施例を以下に示
す。

【０１４７】ＬＥＡＥ−抗−ＴＳＨ接合体の調製 1.36ｍｌの0.1 Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ8.0 中の単クロ
ーン性抗−ＴＳＨ抗体の溶液（２ｍｇ、0.013 ｕモル）
を、１時間に亘りチャンバ温で240 ｕｌのアセトニトリ
ル中のＬＥＡＥ−ＮＨＳの溶液（43ｕｇ、0.067 ｕモ
ル）で処理した。0.5 ｍｌの0.1 Ｍリン酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ8.0 中のリシンの溶液（10ｍｇ）を加えることによ
り、接合反応を停止させた。反応混合物を、充填済みの
セファデックスＧ−２５カラム（１×20ｃｍ）を通過さ
せることにより、ＬＥＡＥ−接合抗−ＴＳＨを精製し、
10ｍＭのリン酸塩、ｐＨ８で溶出した。ＩＳＣＯ ＵＶ
検出器によりこの溶出物を280 ｎｍでモニタした。最初
の溶媒容量ピークが溶出したときに、所望の接合体を集
積した。

【０１４８】オリゴヌクレオチド接合体の調製 ポリヌクレオチドに発光標識の結合パーティー、ハプテ
ン、または配位子を接合する方法が、ヨーロッパ特許公
開第0 537 994 号（10/16/91に出願した米国特許出願第
775,399 号を優先権とする）に記載されており、この特
許は譲渡され、ここに参照文献として包含するものであ
る。

【０１４９】光発光スペクトル ＬＢＡＣおよび参照アクリジニウムエステルの光発光ス
ペクトルを、米国、カリフォルニア州、バーバンクの写
真研究所（コルモーゲン社の部門）の高速スペクトル走
査システム（ＦＳＳＳ）により測定した。実験は暗チャ
ンバ内で行なった。各試料を１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で
ＨＰＬＣ級のアセトニトリルに溶解させ、同一の溶媒で
希釈して明示した濃度の試料溶液を調製した。典型的な
測定には、核間ベンズ［ａ］アクリジニウムエステル
（２ｍｇ）を除いて、各化合物は10から100 ｕｇで、13
×100 ｍｍのホウケイ酸塩試験管中に含有された0.5 ｍ
ｌのアセトニトリル中に別々に、もしくはともに混合し
て用いた。試験管を試験管ラックに配し、適切な高さに
掲げた。ＦＳＳＳ光学ヘッドを近接した距離で試験管の
正面に配し、レンズの焦点を試験管中の液体に合わせ
た。最初に、0.1 ＮのＨＮＯ₃ および0.1 ％のＨ₂ Ｏ₂
を含有するフラッシング試薬（flashing reagent）＃１
（チバコーニングダイアグナスティックス）0.35ｍｌで
試料溶液を処理した。次いでチャンバ内を暗くし、0.25
ＮのＮａＯＨおよび0.2 ％のアーカッド（ARQUAD）を含
有するフラッシング試薬＃２（チバコーニングダイアグ
ナスティックス）0.35ｍｌを反応混合物にただちに加え
た。譲渡され、ここに参照文献として包含する米国特許
第4,927,769 号を参照のこと。試薬＃２の添加後瞬時に
発せられた光を、試薬＃２を加える前の分割秒（split
second）から開始して30秒間に亘り記録した２−ＭｅＯ
−ＬＥＡＥ−イミデート（imidate ）を除いて４秒間に
亘りＦＳＳＳにより記録した。様々な測定の結果を表Ｉ
に要約する。

【０１５０】

【表１】

【０１５１】記録した発光スペクトルを、図３Ａ−３
Ｅ、図４Ａ−４Ｆ、図５Ｇ−５Ｊ、および図６Ａ−６Ｄ
に示す。図３Ａ−３Ｅ、図４Ａ−４Ｆ、および図５Ｇ−
５Ｊは、アクリジニウム環系を含む化学発光化合物およ
びベンズアクリジニウム環系を含む化学発光化合物の個
々の発光スペクトルを示している。アクリジニウムエス
テルとＬＢＡＣの間の最大発光の差は、80から128 ｎｍ
の範囲に亘ることが分かったが、一方アクリジニウムエ
ステルとＡＢＡＣの間の差は約８から14ｎｍであった。
図６Ａ−６Ｄに示すように、アクリジニウムエステルと
ＬＢＡＣが試験管中で混合され、同時に発光した場合に
は、生じた組合せ発光スペクトル（combined emission
spedtra ）は、これら２つの群の化学発光の発光信号が
非干渉の性質であることを示す、理想的に足し合わされ
たスペクトルプロファイルを示した。これらのデータ
は、利用する計測器およびその計測器の構成部品、特に
フィルタに依存して変化してもよいことが理解されよ
う。不変のままであった元の構成スペクトルの主要部分
は、実際に重複しないものであった。これらの重要な物
理特性は、試験試料中の少なくとも２つの物質を検出お
よび／または定量する試験検定、特に多数の分析物を検
出および／または定量する臨床診断検定に用いられる２
つ以上のサブクラスの化学発光化合物にとって必要な条
件を満たしている。好ましい方法において、検定法の１
つの成分として、ベンズアクリジニウム化合物、特に詳
しくは、Ｎ−アルキル化ベンズアクリジニウム化合物を
用いる。

【０１５２】光発光効率：約320 から650 ｎｍの波長域
範囲を有するＢＧ−３８フィルタを装着したバーソルド
ルミノメータ（ＭＬＡ−Ｉ）（チバコーニングダイアグ
ノスティック社）を用いて、20から97％の伝達効率で、
ＬＢＡＣ、ＡＢＡＣ、およびＤＭＡＥ−Ｂｚの光発光効
率を測定した（図６、パネルＡ）。別のフィルタをルミ
ノメータに組み込んで、伝達効率の範囲を広げてもよ
い。

【０１５３】各試料をアセトニトリル溶液中で１ｍｇ／
ｍｌに調製し、続いてアセトニトリルで10ｕｇ／ｍｌま
で希釈し、さらに、0.15ＭのＮａＣｌ、0.1 ％のＢＳ
Ａ、0.05％のＮａＮ₃ を含有する10ｍＭのリン酸塩緩衝
液、ｐＨ８中で１ｎｇ／ｍｌ、0.1 ｎｇ／ｍｌおよび0.
01ｎｇ／ｍｌの溶液を調製した。

【０１５４】光発光効率を測定するために、フラッシン
グ試薬＃１および＃２それぞれを続けて0.35ｍｌずつ注
入することにより、25ｕｌのブランク（緩衝液マトリッ
クス）または各試料を発光させた。光発光を２秒間集積
し、２回の測定の平均として算出した結果を表IIに示
す。

【０１５５】

【表２】

【０１５６】表IIに示したデータから、ＬＢＡＣの光発
光効率は、ベンズアクリジニウム核およびフェノキシ基
の置換基に依存して、ＤＭＡＥ−Ｂｚの光発光効率の0.
21から1.39倍の範囲内であった。これらの測定は２秒の
信号集積に基づき、個々の化合物の発光速度論（flashi
ng kinetics ）、例えば、いくつかの化合物は大部分の
信号を放出するのに２秒より長くかかる、光電子増倍管
の感度、およびスペクトル範囲の異なる点での光学フィ
ルタの伝達効率を考慮しなかったことに注意すべきであ
る。しかしながら、異性体ＡＢＡＣの極めて低い光発光
効率の点から見て、これらの発見はまったく予期せぬこ
とであった。この水準の光発光効率のために、ＬＥＡＣ
は、多数分析物検定を含む、感受性結合検定に有用であ
る。

【０１５７】光発光についての速度論（kinetics）研究 異なる置換基のフェノキシ部分、アクリジニウム核およ
びベンズアクリジニウム核への電子効果および／または
立体効果（steric effect ）により、ＤＭＡＥアナロ
グ、ＡＢＡＣおよびＬＥＡＣの全てが同一条件下で同一
の発光速度（flashing rate ）を有するわけではないこ
とが予測された。言い換えれば、２秒の信号集積時間内
では、異なる化合物は、放出可能な信号の合計に対して
異なる百分率を放出することが予測された。化合物を発
光させて、異なる長さの時間に亘り集積した信号の全て
を10秒の長さに亘り集積した信号に対して標準化するこ
とにより、10秒までの期間に亘る時間の経過についての
研究を行なってこれらの百分率を求めた。結果を表III
に要約する。

【０１５８】

【表３】

【０１５９】表III のデータにより示されるように、特
に0.5 秒と１秒の間隔において、発光速度論は、異なる
ＤＭＡＥアナログ、ＡＢＡＣおよびＬＥＡＣについて広
く変化する。放出百分率についてのこれらのデータは、
化学発光化合物を用いた様々な検定の発展のために化合
物の光発光効率を比較するのに用いるべきである。

【０１６０】相互に干渉しない光発光：上述したように
光発光のスペクトルが明確な相互非干渉特性を示すが、
複合タンパク質の形状にあるＤＭＡＥおよびＬＥＡはま
た、登録された組合せ相対光単位（ＲＬＵ）の減少も増
加もないことにより示されるように、閃光中の光発光に
おいて相互作用がないことを示す。

【０１６１】以下のように試験を行なった：ＤＭＡＥ−
抗−ＴＳＨおよびＬＥＡＥ−抗−ＴＳＨを、0.15ＭのＮ
ａＣｌ、0.1 ％のＢＳＡ、0.05％のＮａＮ₃ を有するリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ８）10ｍＭ中に２つの濃度で希釈し
たが、これは、その溶液が前述したように装備したバー
ソルドルミノメータを用いて同様な方法により発光した
ときに、25ｕｌの溶液がそれぞれ約200,000 および1,00
0,000 ＲＬＵとなるように希釈を行なった。各試料（25
ｕｌ）の光発光を別々に測定し、次いでそれぞれ同容量
の試料を混合し、再度測定した。単独の試料測定におい
て、追加に等量の緩衝液を加えて混合した試料の測定と
同一の試料容量を維持した。この試験の結果を表IVに要
約する。

【０１６２】

【表４】

【０１６３】表IVの結果により、２つのトレーサの異な
る発光スペクトルは、光発光において互いにまったく干
渉しないことが分かった。この特徴により、これらのト
レーサが多数分析物結合検定（multi-analyte binding
assay ）に利用できることが確認できる。好ましい方法
のＬＥＡＥは、Ｎ−アルキル化ベンズアクリジニウム化
合物である。

【０１６４】接合体ＬＢＡＣの安定性：ＬＢＡＣ−抗−
ＴＳＨ接合体を調製し、水性媒質中での安定性について
試験した。ＤＭＡＥ−抗−ＴＳＨ接合体もまた並行して
試験した。様々なｐＨで（0.1％のＢＳＡを含有するク
エン酸塩−リン酸塩緩衝液を用いた）温度を関数とした
化学発光活性度の保持について、７日間に亘りモニタし
た。適切な濃度（0.8 −1.4 ×10⁶ ＲＬＵ／25ｕｌ）の
上述した接合体を、二組の異なる緩衝液（ｐＨ7.4 、8.
0 、8.5 、および9.0 ）中に配した。一組を対照として
４−８℃に保持し、一方もう一組を37℃に設定した。緩
衝した試料（25ｕｌ）を上述したように定期的に発光さ
せた。結果を表Ｖに要約する。

【０１６５】

【表５】

【０１６６】表Ｖに要約した安定性の研究により、オル
ト置換のフェノキシ環への安定化効果は、アクリジニウ
ムエステルのクラスにも適応されるだけでなく、市販の
結合検定産物に要求されるような長期の熱ストレス条件
下のｐＨ８辺りでの水性媒質中の化学発光活性度を保持
することについて、ほぼ同程度に一連のＬＢＡＣにも効
果が見られる。ｐＨ８での非−オルト−置換アクリジニ
ウムエステル接合体の安定性データが顕著な対照として
記載されている。非−オルト−置換ＬＥＡＣもおそらく
水性媒質中で乏しい安定性しか有さない。

【０１６７】結合検定における信号対雑音：ＬＥＡＥ−
抗−ＴＳＨをＴＳＨ検定におけるトレーサとして用い
た。信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比を測定することにより、性
能を評価した。ＤＭＡＥ−抗−ＴＳＨの性能も並べて比
較した。検定は以下のように構成した：100 マイクロリ
ットルの上述した接合体のいずれかを、100 マイクロリ
ットルのＴＳＨ標準物（ＭＡ、ミッドフィールド、チバ
コーニングダイアグノスティックス社）により、チャン
バ温で２時間に亘り培養した。０、0.5 、1.0 、16また
は100 ｕＩｕ／ｍｌのＴＳＨのいずれかを含有する５つ
の標準物について、培養は別々に行なった。ヒツジ抗−
ＴＳＨ（チバコーニングダイアグノスティックス社）に
固定化されたマジック（登録商標）磁気粒子500 ｕｌを
上述した混合物に加え、次いでチャンバ温で30分間放置
することにより、２回目の培養を行なった。

【０１６８】溶液から粒子を磁気的に分離し、その溶液
にデカンテーションを行ない、次いで500 ｕｌの水を加
えることにより最初に洗浄を行ない、その後もう１度磁
気分離を行なった。洗浄した粒子を100 ｕｌの水中に懸
濁させた。上述した方法に従って、発光と計数を行なっ
た。ＴＳＨを含有するＴＳＨ標準の計数にゼロＴＳＨ基
準の比率を用いて、結果を表VIに示す。

【０１６９】

【表６】

【０１７０】表VIに示した結果により、ＬＥＡＥ接合体
を免疫学的検定方式に利用して容量−応答曲線が得ら
れ、従って、検定を有用なものにできることが分かっ
た。

【０１７１】二重分析物同時免疫学的検定： 装置の使用：ＤＰＬのハードウェアを説明するのに用い
た二重−ＰＭＴルミノメータ（ＤＰＬ）のある実施態様
は、少なくとも２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）アッセン
ブリ、フラッシング試薬＃２の注入ポンプ、および使捨
てキュベットを保持するために設計した立方体型光機密
チャンバを含む。チャンバの２つの対面する側では、２
つの管状ＰＭＴ管を、キュベット内で生じる２つの異な
るスペクトル範囲の光がＰＭＴアッセンブリにより個々
に記録できるように、別々に備え付けた。キュベット保
持チャンバの上面はヒンジ構造となっており、キュベッ
トを手動で挿入して取り出すことができる。さらに、上
面はまた、キュベットにフラッシング試薬＃２を注入す
ることを目的として備え付けた固定プローブを有する。
各ＰＭＴアッセンブリ内において、光学フィルタを特定
のスペクトル範囲に選択し、キュベットとＰＭＴ管の間
に挿入する。

【０１７２】ＤＰＬの別の実施態様および配置を、試験
試料中の２つ以上の化学発光化合物または接合体の半自
動および自動検出のために設計してもよい。自動分析器
の構成物としてのルミノメータが上述したヨーロッパ特
許公開番号第0 502 638 号に記載されている。

【０１７３】適切な波長を遮断する光学フィルタを複数
選択することは、２つ以上の発光光スペクトルの識別に
必要不可欠である。

【０１７４】この種のフィルタは、業者から容易に得ら
れ、積層により変更したり、接合体のスペクトル信号の
検出および／または定量のためのＰＭＴアッセンブリに
組み込むように特別に製造してもよい。フィルタを注意
深く選択することにより、発光信号を認識する能力を高
め、適切な修正により、発光が重複する多数の信号を識
別できるようにしてもよい。

【０１７５】以下に開示するように、同時ＬＨ／ＦＳＨ
二重免疫学的検定を行なうために、長波長域フィルタ
（long pass filter）（ＭＡ、ホリストン、コリオンの
Ｐ／ＮＬＬ−５００）および短波長域フィルタ（short
pass filter ）（コリオンのＰ／Ｎ Ｐ７０−４５０）
を、一組のトレーサ、ＬＥＡＥ−抗−ＬＨおよびＤＭＡ
Ｅ−抗−ＦＳＨから発せられた光の２つの異なるスペク
トル範囲に適合するように選択した。これらのトレーサ
は、それぞれＬＥＡＥ−抗−ＴＳＨおよびＤＭＡＥ−抗
−ＴＳＨについて上述したのと同様な方法で調製した。
２つのフィルタの透過率曲線を図７のパネルＢおよびＣ
に示す。光学フィルタを選択する際には、最大信号透過
率および最小信号漏話の必要条件を考慮すべきである。
より望ましい透過率プロファイルおよび遮断を有する光
学フィルタを選択して、トレーサから発せられた光の透
過率を最大にしてもよく、および／または前述したよう
な漏話百分率（ＰＣＴ）を改良するために特定の化学発
光化合物の発光スペクトル範囲と良好に適合させてもよ
い。ＤＭＡＥおよびＬＥＡＥトレーサの組の測定のため
の長波長域フィルタと適合する短波長域フィルタとして
のフィルタＰ７０−４５０は、例えばコリオンの積層Ｃ
Ｓ５５０／ＣＳ６００フィルタ（図７、パネルＤ）と代
替することが好ましいことが分かった。このフィルタを
使用した結果、ＤＭＡＥトレーサの記録ＲＬＵが２倍以
上も増加しただけでなく、表VII に示すように、漏話百
分率も著しく改良された。さらに、いっそう長い発光最
大値を有する多くのＬＥＡＥ誘導体、例えば２−ＭｅＯ
−ＬＥＡＥを用いるときに、ＰＣＴをさらに減少させる
ためには、フィルタＬＬ−５００よりもＬＬ−５２０
（図８Ｅ）のような長波長域フィルタを選択したほうが
よい。

【０１７６】一般的にパラメータの設定、発光の実行と
記録、使用するフィルタおよび利用する化学発光化合物
の関数として以下に記載するような信号補正、およびデ
ータの表示の基本機能を含むシステムをコントロールす
るために、適切なソフトウェアを含むパーソナルコンピ
ュータ装置を利用して、ＤＰＬに接続する。

【０１７７】漏話百分率（ＰＣＴ）の測定：上述したよ
うに、ＤＰＬの２つのＰＭＴアッセンブリに備えられた
２つの光学フィルタは、２つの異なるスペクトル範囲の
発光光を透過させるように意図したものである：長波長
域フィルタは、ＬＥＡＥトレーサからの長波長の発光に
適合したものであり、短波長域フィルタはＤＭＡＥトレ
ーサからの短波長の発光に適合したものである。しかし
ながら、図４、５および６に示したように、透過率曲線
と交差試験対（cross-matching pair ）の発光スペクト
ルとの間のわずかな重複のために、一方のトレーサによ
り発せられた信号は、この信号を検出するように意図し
た第１のＰＭＴにより検出されるだけでなく、他方のト
レーサを検出するように意図した第２のＰＭＴによって
もわずかに検出され得る。そして、その逆もまた同様で
ある。一方のトレーサの信号のその部分は第２のＰＭＴ
により記録され得るが、２つのトレーサが同一管中で同
時に発光したときに、みかけのＲＬＵを補正して各ＰＭ
Ｔアッセンブリにより検出される各トレーサの純粋な信
号を得るように、それらのトレーサを二重分析物免疫学
的検定に使用する前に各トレーサについて百分率でその
部分を別々に定量しなければならない。

【０１７８】表VII はいくつかのトレーサの組について
測定したＰＣＴを示す。以下に記載する同時のＬＨ／Ｆ
ＳＨ二重分析物検定において、抗−ＦＳＨ−ＤＭＡＥお
よび抗−ＬＨ−ＬＥＡＥを用いた。発光最大値が大きく
離れたアクリジニウム化合物とベンズアクリジニウム化
合物を選択し、光学フィルタを適切に選択したことによ
り、多分析物検定に理想の最小ＰＣＴが実現できること
を説明するために、他のトレーサの組を含んだ。それぞ
れの場合において、第２のＰＭＴからの微小信号を第１
のＰＭＴからの主要信号で割り、その結果に100 ％をか
けることにより、ＰＣＴを得た。

【０１７９】試料の濃度を、第１の信号が25ｕｌの試料
当たり100,000 から1,500,000 ＲＬＵの範囲に入るよう
に、適当に選択した。25ｕｌの第１のトレーサ溶液、30
0 ｕｌのフラッシング試薬＃１をピペットを用いて連続
してキュベットに測り取り、精製した溶液を簡単に混ぜ
合わせ、このキュベットをＰＭＴハウジングに挿入し、
キーボードを操作して300 ｕｌのフラッシング試薬＃２
を注入することにより試料を発光させて、各測定を行な
った。

【０１８０】

【表７】

【０１８１】広域のＲＬＵに亘りＰＣＴが不変であるこ
とが、多分析物検定信号補正には重要である。表VIII
は、積層ＣＳ５５０／ＣＳ６００フィルタとＬＬ５２０
フィルタを、それぞれ短波長域信号と長波長域信号を通
過させるのに用いた場合、抗体−ＴＳＨ−ＤＭＡＥにつ
いてのＰＣＴは、10,000から7,000,000 計数のＲＬＵ範
囲もしくはそれより広い範囲に亘り0.16％の標準偏差で
2.96％の平均値を有し、一方抗−ＣＫＭＢ−ＬＥＡＥに
ついてのＰＣＴは、50,000から7,000,000 計数のＲＬＵ
範囲もしくはそれより広い範囲に亘り0.23％の標準偏差
で4.79％の平均値を有することを示している。

【０１８２】

【表８】

【０１８３】二重トレーサ測定における漏話によりみか
けのＲＬＵを補正するための等式ＤＭＡＥおよびＬＥＡ
Ｅの誘導体またはトレーサを混合し、同時に発光させる
場合、観察した長波長域信号と短波長域信号は以下のよ
うに分類できる：

【０１８４】

【数１】

【０１８５】Ｓ（ｓ）およびＳ（ｌ）がそれぞれ観察し
た短波長域信号と長波長域信号である場合、Ｓ（ＤＭＡ
Ｅ）およびＳ（ＬＥＡＥ）は、それぞれ観察した短波長
域信号と長波長域信号におけるＤＭＡＥおよびＬＥＡＥ
による信号部分である。それらの信号もまた補正ＤＭＡ
Ｅ信号および補正ＬＥＡＥ信号と称する。Ｓ′（ＬＥＡ
Ｅ）およびＳ′（ＤＭＡＥ）は、それぞれＤＭＡＥおよ
びＬＥＡＥ漏話による長波長域信号と短波長域信号の部
分である。ｂ１およびｂ２は、それぞれＤＭＡＥトレー
サおよびＬＥＡＥトレーサの存在しない場合の検定成分
とシステムのノイズによる混合信号である。

【０１８６】ＰＣＴ（以下にｋ１およびｋ２により示
す）はどの特定のＤＭＡＥトレーサおよびＬＥＡＥトレ
ーサにも一定であるので、以下の関係式が成立する：

【０１８７】

【数２】

【０１８８】ｋ１およびｋ２は、それぞれＳＭＡＥトレ
ーサおよびＬＥＡＥトレーサのＰＣＴである。

【０１８９】式（４）を式（１）に代入すると：

【０１９０】

【数３】

【０１９１】式（５）を式（３）に、式（３）を式
（２）に代入すると：

【０１９２】

【数４】

【０１９３】これを整理すると：

【０１９４】

【数５】

【０１９５】式（５）および（６）により、それぞれＤ
ＭＡＥトレーサによる補正短波長域信号およびＬＥＡＥ
トレーサにより長波長域信号が得られる。同時のＬＨ／
ＦＳＨ二重分析物検定を行なう実行可能性を示すことを
目的として、混合マトリックスおよびシステムのノイ
ズ、ｂ１およびｂ２の測定は重要ではないことが分かっ
た。従って、以下の二重分析物検定の実施例において
は、それらのノイズは両者とも信号補正に０の値を設定
した。

【０１９６】黄体化ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）の同時免疫学的検定：本発明の目的の
１つは、２つの異なる化学発光標識または接合体を用い
ることにより、１つの試料中の２つ以上の物質または分
析物を同時に検出および／または定量する方法を提供す
ることにある。

【０１９７】ある実施態様において、検定システムはＤ
ＭＡＥ標識ＦＳＨ抗体およびＬＥＡＥ標識ＬＨ抗体を利
用する。以下の実施例は、１つの化学発光トレーサを検
定システム中に導入することにより各分析物を単独の分
析物として検定する場合、または２つの化学発光トレー
サを用いる二重分析物システムにおいて各分析物を単独
の分析物として検定する場合、ＬＨおよびＦＳＨ標準曲
線と試料の回収率（sample recovery ）は実験誤差の範
囲内では同一であることを示している。実施例はさら
に、対応する結合パートナー、例えば抗体が得られる２
つの物質の同時検定において一組のＤＭＡＥおよびＬＥ
ＡＣから調製したトレーサが利用できることを示してい
る。

【０１９８】実施例１５．二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた単一ＦＳＨ検定：トレーサの選択により単
一または二重分析物検定として検定が行なえるように、
マジックライトＦＳＨキットの成分およびプロトコル
（チバコーニングダイアグノスティックス）を改良し
た。抗−ＦＳＨ抗体に結合した常磁性粒子（ＰＭＰ）お
よび抗−ＬＨ抗体に結合したＰＭＰからなる固相を、マ
ジックライトＦＳＨキットの固相から緩衝液希釈物を除
去し、マジックライトＬＨキットの固相（チバコーニン
グダイアグノスティックス）中にこれらの粒子を懸濁さ
せることにより調製した。キットトレーサ、抗−ＦＳＨ
−ＤＭＡＥを、マジックライトＬＨキットトレーサ緩衝
液により１：２に希釈した。目盛定めのための標準物
は、ＦＳＨおよびＬＨの両方を含有した。既知の濃度の
精製ヒトＦＳＨおよびヒトＬＨをウマ血清ベースプール
（basepool）中に加えることにより標準物を調製した。
公称標準値は０、0.9 、2.2 、4.4 、8.8 、21.9、43.
8、87.5、140.0 、201.0 ｍＩｕ／ｍｌのＦＳＨであっ
た。公称ＬＨ濃度は、０、1.0 、2.5 、5.0 、10.0、2
5.0、50.0、100.0 、160.0 、230.0 ｍＩｕ／ｍｌのＬ
Ｈであった。精製ヒトＦＳＨおよびヒトＬＨの両者の様
々な濃度のヒト血清プールを加えることにより、分析の
試料を調製した。さらに、ヒトＦＳＨおよびヒトＬＨを
含有する血清ベースの多成分キャリブレータを試料とし
て用いた。

【０１９９】検定を行なうために、50ｕｌの各標準また
は試料および200 ｕｌの希釈ＦＳＨトレーサをうず流混
合して（vortex mixed）室温で30分間に亘り培養した。
500ｕｌの結合抗−ＦＳＨ／抗−ＬＨ固相を加え、うず
流混合し、室温で30分間に亘り培養した。マジックライ
トラック（チバコーニングダイアグノスティックス）中
で反応した固相を磁気的に３分間に亘り分離し（ヨーロ
ッパ特許第136126号を参照のこと）、上澄液をデカンタ
ーに移した。次に、反応させた固相を1.0 ｍｌの蒸留水
で洗浄し、３分間に亘り分離した。上澄液をデカンター
に移して、100ｕｌの上流水を加えた。各試料を手動で
キュベットに移し、上述したＤＰＬ上で５秒間計測し
た。短波長透過（ＤＭＡＥ）チャンネルから得た結果
（ＲＬＵ）を用いて、各試料におけるＦＳＨ濃度を計算
した。スプラインデータ整理ルーチン（spline data re
duction routine ）による10点目盛定めを使用して、濃
度を計算した。各標準と試料を三重に検定した。この検
定のＲＬＵおよび％ＣＶＣを、ＦＳＨ単一分析物検定と
いう項目の表IXに示す。ＦＳＨ試料回収率を、ＦＳＨ単
一分析物検定という項目の表Ｘに示す。％Ｂ／Ｂｍａｘ
対ｌｏｇ ＦＳＨ濃度として示したＦＳＨ標準曲線をＦ
ＳＨ単一分析物検定として示した図１１に示す。

【０２００】実施例１６．二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた単一ＬＨ検定 実施例１５に記載した固相試薬、標準、および試料を用
いてＬＨ検定を行なった。抗−ＦＳＨ−ＤＭＡＥトレー
サを、マジックライトＦＳＨキットトレーサ希釈物で
１：２に希釈した抗−ＬＨ−ＬＥＡＥトレーサと置き換
えた。長波長透過（ＬＥＡＥ）チャンネルから得たＲＬ
Ｕの結果を用いてＬＨ試料濃度を計算したことを除いて
は、実施例１３に記載した検定方法論をこの検定に適応
した。

【０２０１】1.0 ｍＩｕ／ｍｌのＬＨ標準を除外した、
実施例１５に記載した９の標準を用いて検定の目盛を定
めた。ＬＨ単一分析物検定という項目で、この検定の結
果を表XIおよび表XII に記載した。標準曲線をＬＨ単一
分析物検定として示した図１２に示す。

【０２０２】実施例１７．二重分析物免疫学的検定シス
テムを用いた同時ＬＨ／ＦＳＨ検定：実施例１５および
１６に記載した固相試薬、標準、および試料を用いて１
つの試験管中で二重標識ＬＨ／ＦＳＨ検定を行なった。
トレーサは、マジックライトＦＳＨキットトレーサ、す
なわち抗−ＬＨ−ＬＥＡＥトレーサ中で１：２に希釈し
た抗−ＦＳＨ−ＤＭＡＥからなる。検定方法論は、実施
例１５に記載したものど同一であった。濃度の計算の前
に、各チャンネルからの元のＲＬＵを漏話について数学
的に補正した。これらの補正ＲＬＵから生じた補正ＲＬ
Ｕりおよび濃度を表IXからXII に示し、二重分析物検定
として示す。表Ｘ−XII におけるｔ検定により、単一分
析物検定対二重分析物検定についての平均試料回収率を
比較する。ＦＳＨおよびＬＨ標準曲線を図１１および１
２に示し、それぞれＦＳＨおよびＬＨ二重分析物検定と
して示す。

【０２０３】検定および検定方式 本発明は化学発光化合物に関し、より詳しくは、試験試
料中の２つ以上の物質を同時に検出するための２つ以上
の化学発光接合体を使用する使用方法に関するものであ
る。この開示には、そのような検定に、ベンズアクリジ
ニウム化合物、および好ましくはＮ−アルキル化ベンズ
アクリジニウム化合物を使用することが教示されてい
る。

【０２０４】試験物質は試験試料中で検出および／また
は定量したいいかなる成分または分析物を含み、制限さ
れるものではないが、単一の構造の２つ以上、例えば核
酸配列または染色体、ゲノムまたは分子の異なる座の２
つ以上を含み、この場合、成分または分析物は、適切な
検定方法がそれに対して構成できる核酸、タンパク質、
配位子、ハプテンまたは他の材料のような生物学上の源
または工業上の源であってもよい。試験試料および／ま
たは物質を前処理して試験法により検定可能にする必要
があってもよいことが理解されよう。検出すべき試験物
質および量によって、例えば、検出のための化学発光標
識の使用のためではなく、感受性に関することのため
に、行なえる検定の種類が制限されるかもしれない。様
々な内標準または対照を検出および／または定量のため
の試験試料に加えて、検定の性能を評価してもよい。免
疫学的検定により例証した診断検定、ハイブリタイゼー
ション検定および増幅検定では、その方式に化学発光標
識をますます多く含むようになっている。そのような検
定の設計および方式は当業者によく知られており、技術
文献および特許文献に広く発表されている。例えば、検
定方式は、反応生成物または非反応試薬を分離して、検
出および／または定量のための移送管（transfer tube
）へ移すことを必要としてもよい。そのような分離技
術は競合検定、固相検定のために、または干渉を制限す
るのに有用であろう。

【０２０５】本発明のある実施態様において、２つ以上
の化学発光接合対を増幅検定における標識として利用す
る。代表的な増幅検定は、制限すべきではないが、ポリ
メラーラゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）、組換えＲ
ＮＡの自己触媒複製およびミディバリアント（midivari
ant ）ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅を含む。本出願人に譲
渡され、ここに参照文献として包含するヨーロッパ特許
公開第481 704 号（米国特許出願598,269 号（10/16/9
0）を優先権とする）を参照のこと。技術文献および特
許文献に教示されたような方法を、化学発光標識、特に
関心のある標的配列の検出のための２つ以上の化学発光
標識を含有するように適応してもよい。多数標識方法
（multi-label method）を用いることの利点は、複数の
標的配列または１つ以上の標的配列および内標準を検出
および／または定量することにある。そのような方法の
実施例は、１つ以上の標的配列を含有すると思われる試
験試料を調製すること、その標的配列を増幅すること、
それぞれが標的配列と関連するような少なくとも２つの
化学発光接合体を調製すること、および少なくとも２つ
の化学発光接合体の発光により増幅した標的配列を同時
に検出および／または定量することを含む。本方法の別
の工程において、内参照、対照または対照システムを検
定に加えて、検定性能および結果を確認してもよい。内
参照は、標的配列と同様に増幅してもよい。

【０２０６】そのような検定のために化学発光標識を使
用することにより、本発明の有用性が説明できる。

【０２０７】本発明の化学発光化合物は市販のためのキ
ットの形態にパッケージするように適応できる。これら
キットの化学発光標識は、試験試料中で検出しようとす
る物質に特異的な適切な物質または材料に接合してもよ
い。適切な官能基を、様々な検定および他の用途に使用
するための化学発光化合物に加えてもよい。本発明の方
法を利用してもよい検定の実施例は、限定するものでは
ないが、少なくとも２つの異なる特異性の抗体を含む検
定；少なくとも２つの抗原を含む検定、少なくとも１つ
の抗原および少なくとも１つの抗体を含む検定；および
癌、感染病、遺伝的異常、遺伝的気質、遺伝的評価を示
す分子および医薬治療をモニタする分子の検定を含む。

【０２０８】この開示により、本発明の範囲と材料から
逸脱することなく、様々な他の変更が当業者にとっては
明確であり、容易に行なえることが理解されよう。しか
しながら、請求の範囲はここに述べた記載を制限するも
のではなく、本発明に属する特許性を有する新規事項の
すべてを包含するものとして構成したことを意図する。
この請求の範囲は、本発明に関する同等物として当業者
にみなされる全ての特徴を含む。ここに記載した実施例
は説明を意図するものであり、制限を意図するものでは
ないことに注意されたい。

【０２０９】

【表９】

【０２１０】

【表１０】

【０２１１】

【表１１】

【０２１２】

【表１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】代表的なアクリジウニムエステル、ＡＢＡＣ、
およびＬＢＡＣの構造式

【図２】代表的なアクリジウニムエステル、ＡＢＡＣ、
およびＬＢＡＣの構造式

【図３】アクリジニウムエステルおよびＡＢＡＣの発光
スペクトルを示すグラフ

【図４】ＬＢＡＣの発光スペクトルを示すグラフ

【図５】ＬＢＡＣの発光スペクトルを示すグラフ

【図６】アクリジニウムエステルとＬＢＡＣの混合物の
発光スペクトルを示すグラフ

【図７】様々な光学フィルタの透過率曲線

【図８】様々な光学フィルタの透過率曲線

【図９】光学フィルタ（コリオンＬＬ５００）の透過率
曲線とＤＭＡＥ−Ｂｚの発光スペクトルとの間の重複区
域を示すグラフ

【図１０】光学フィルタ（コリオンＰ７０−４５０）の
透過率曲線とＬＥＡＥ−Ｂｚの発光スペクトルとの間の
重複区域を示すグラフ

【図１１】二重ＰＭＴルミノメータで読み取ったＦＳＨ
標準曲線検定を示すグラフ

【図１２】二重ＰＭＴルミノメータで読み取ったＬＨ標
準曲線検定を示すグラフ

フロントページの続き (72)発明者 ウォルター フィッシャー スイス国 シーエイチ−4153 ライナッ ハ フォーゲーゼンシュトラーセ 77 (72)発明者 ジョン ティー ユンガー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02052 メッドフィールド ウィチタ ロード 29 (72)発明者 エリザベス ケイ クローデル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02174 アーリントン オーヴァールッ ク ロード 84 (56)参考文献 特表 平４−506403（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／013264（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 C07D 219/04 C07D 221/18

Claims (35)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の化学式で表される化学発光化合
   物： 【化１】 ここでＷは炭素であり、 あるいは、Ｃ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｎ＝と
   置換でき； あるいは、Ｗを省いてＣ_７ をＣ_９ に結合させ、Ｃ
   _７ 、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
   −、または−ＮＲ−と置換でき； Ｒ_１ は必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するア
   ルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルを含
   み； Ｒ_２ 、Ｒ_３ 、Ｒ_９ およびＲ_１０は、水素、置換ま
   たは非置換アリール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲン化
   物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
   Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−ＳＲ、
   −ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）
   ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される同一の
   基または異なる基であり； Ｒ_２ はＣ_１−４ で１つまたは多数の置換基を含み； Ｒ_２ はまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
   合芳香環であってもよく； Ｒ_３ はＣ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０で１つまたは
   多数の置換基を含み； Ａ−は対イオンであり； Ｘは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、Ｘ
   が酸素または硫黄のときにＺが省かれ、Ｘが窒素のとき
   にＺが−ＳＯ_２ −Ｙ′であり、Ｙ′がＹと等しく、Ｙ
   とＹ′の置換基は同一である必要はなく； Ｙは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
   ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
   または式： 【化２】 の多置換アリール部分を含むものであり； Ｒ_４ およびＲ_８ はアルキル、アルケニル、アルキニ
   ル、アルコキシル、アルキルチオールまたはアミドを含
   み、 Ｒ_５ およびＲ_７ は上述したＲ_３ 、Ｒ_９ およびＲ
   _１０のいずれかであり； Ｒ_６ ＝−Ｒ_１１−Ｒ_１２、 ここでＲ_１１は、必要条件ではないが、必要に応じて、
   20までのヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖
   アルキル、置換または非置換アリールまたはアラルキル
   であり； Ｒ_１２は、リービング基、またはリービング基もしくは
   −Ｑ−Ｒ−Ｎｕ、−Ｑ−Ｒ（Ｉ）_ｎ Ｎｕ、−Ｑ−Ｎ
   ｕ、−Ｒ−Ｎｕ、または−Ｎｕに結合する求電子官能基
   を含み、ここでｎは少なくとも１であり、Ｎｕは求核基
   であり、Ｑは官能結合であり、Ｉはイオン基またはイオ
   ン化基であり； Ｒ_５ とＲ_６ 、およびＲ_６ とＲ_７ は相互に交換で
   き； Ｒは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
   ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
   ルである。
2. 【請求項２】 前記対イオンが、ＣＨ_３ ＳＯ_４ −、
   ＦＳＯ_３ −、ＣＦ_３ ＳＯ_４ −、Ｃ_４ Ｆ_９ ＳＯ
   _３ −、ＣＨ_３ Ｃ_６ Ｈ_４ ＳＯ_３ −およびハロゲ
   ン化物を含むことを特徴とする請求項１記載の化学発光
   化合物。
3. 【請求項３】 異性部分環、フラノ部分環、チオフェノ
   部分環、ピロ部分環またはピリド部分環が、Ｒ_３ から
   なる置換基を有することを特徴とする請求項１記載の化
   学発光化合物。
4. 【請求項４】 ａ． （４−ベンジルオキシカルボニル
   −２、６−ジメチル）フェニル５−メチル−ベンズ
   ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
   ロスルホネート、 ｂ． （２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイミジル
   オキシカルボニル）フェニル５−メチル−ベンズ［ｂ］
   アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオロスル
   ホネート、 ｃ． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジイ
   ソプロピル）フェニル５−メチル−ベンズ［ｂ］アクリ
   ジニウム−１２−カルボキシレートフルオロスルホネー
   ト、 ｄ． Ｎ−（４−メトキシフェニル−Ｎ−［３−（ベン
   ジルオキシカルボニル）フェニルスルホニル］５−メチ
   ル−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシア
   ミドフルオロスルホネート、 ｅ． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメ
   チル）フェニル３−エトキシ−５−メチル−ベンズ
   ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
   ロスルホネート、 ｆ． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメ
   チル）フェニル３−（Ｎ、Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチル−
   アンモニウム）エトキシ−５−メチル−ベンズ［ｂ］ア
   クリジニウム−１２−カルボキシレートジフルオロスル
   ホネート、 ｇ． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメ
   チル）フェニル２−メトキシ−５−メチル−ベンズ
   ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレートフルオ
   ロスルホネート、 ｈ． （２、６−ジメチル−４−サクシンイミジルオキ
   シカルボニル）フェニル５−メチル−２−（トリメチル
   アンモニウム）エトキシ−ベンズ［ｂ］アクリジニウム
   −１２−カルボキシレートジフルオロスルホネート、 ｉ． （４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメ
   チル）フェニル５−（３−スルホプロピル）−ベンズ
   ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレート、 ｊ． （２、６−ジメチル−４−Ｎ−サクシンイミジル
   オキシカルボニル）フェニル２−メトキシ−５−（２−
   スルホエチル）−ベンズ［ｂ］アクリジニウム−１２−
   カルボキシレート、 ｋ． ［２、６−ジメチル−４−（２−メトキシイミノ
   エチル）］フェニル２−メトキシ−５−メチル−ベンズ
   ［ｂ］アクリジニウム−１２−カルボキシレート二塩化
   物、 からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記
   載の化学発光化合物。
5. 【請求項５】 試験検定に使用するために結合パートナ
   ーと接合されることを特徴とする請求項１記載の化学発
   光化合物。
6. 【請求項６】 ａ． ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−
   カルボン酸ヒドロクロライド、 ｂ． ３−ＥｔＯ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
   ルボン酸、 ｃ． ３−ヒドロキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２
   −カルボン酸、 ｄ． ２−ＭｅＯ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２−カ
   ルボン酸、 ｅ． ２−ヒドロキシ−ベンズ［ｂ］アクリジン−１２
   −カルボン酸、 からなる群より選択される、請求項１記載の化学発光化
   合物を合成するのに使用される中間体化合物。
7. 【請求項７】 請求項１記載の化学発光化合物の合成に
   用いられる中間体化合物であって、式： 【化３】 で表され、 ここでＷは炭素であり、 あるいは、Ｃ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｎ＝と
   置換でき； あるいは、Ｗを省いてＣ_７ をＣ_９ に結合させ、Ｃ
   _７ 、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
   −、または−ＮＲ−と置換でき； Ｒ_２ 、Ｒ_３ 、Ｒ_９ およびＲ_１０は、水素、置換ま
   たは非置換アリール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲン化
   物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
   Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−ＳＲ、
   −ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）
   ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される同一の
   基または異なる基であり； Ｒ_２ はＣ_１−４ で１つまたは多数の置換基を含み； Ｒ_２ はまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
   合芳香環であってもよく； Ｒ_３ はＣ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０で１つまたは
   多数の置換基を含み； Ｒは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
   ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
   ルであることを特徴とする中間体化合物。
8. 【請求項８】 請求項１記載の化学発光化合物の合成に
   用いる中間体化合物であって、式： 【化４】 で表され、 ここでＷは炭素であり、 あるいは、Ｃ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｎ＝と
   置換でき； あるいは、Ｗを省いてＣ_７ をＣ_９ に結合させ、Ｃ
   _７ 、Ｃ_９ またはＣ_１０は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
   −、または−ＮＲ−と置換でき； Ｒ_２ 、Ｒ_３ 、Ｒ_９ およびＲ_１０は、水素、置換ま
   たは非置換アリール（ＡｒＲまたはＡｒ）、ハロゲン化
   物、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、−
   Ｒ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、−ＳＲ、
   −ＳＳＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）
   ＮＨＲ、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒから選択される同一の
   基または異なる基であり； Ｒ_２ はＣ_１−４ で１つまたは多数の置換基を含み； Ｒ_２ はまた、ヘテロ原子を有するかまたは有さない融
   合芳香環であってもよく； Ｒ_３ はＣ_７ 、Ｗ、Ｃ_９ またはＣ_１０で１つまたは
   多数の置換基を含み； Ｘは窒素、酸素または硫黄を含むヘテロ原子であり、Ｘ
   が酸素または硫黄のときにＺが省かれ、Ｘが窒素のとき
   にＺが−ＳＯ_２ −Ｙ′であり、Ｙ′がＹと等しく、Ｙ
   とＹ′の置換基は同一である必要はなく； Ｙは、必要に応じて20までの炭素原子を含有する、ハロ
   ゲン化または非ハロゲン化の側鎖または直鎖アルキル、
   または式： 【化５】 の多置換アリール部分を含むものであり； Ｒ_４ およびＲ_８ はアルキル、アルケニル、アルキニ
   ル、アルコキシル、アルキルチオールまたはアミドを含
   み、 Ｒ_５ およびＲ_７ は上述したＲ_３ 、Ｒ_９ およびＲ
   _１０のいずれかであり； Ｒ_６ ＝−Ｒ_１１−Ｒ_１２、 ここでＲ_１１は、必要条件ではないが、必要に応じて、
   20までのヘテロ原子を任意に含有する、側鎖または直鎖
   アルキル、置換または非置換アリールまたはアラルキル
   であり； Ｒ_１２は、リービング基、またはリービング基もしくは
   −Ｑ−Ｒ−Ｎｕ、−Ｑ−Ｒ（Ｉ）_ｎ Ｎｕ、−Ｑ−Ｎ
   ｕ、−Ｒ−Ｎｕ、または−Ｎｕに結合する求電子官能基
   を含み、ここでｎは少なくとも１であり、Ｎｕは求核基
   であり、Ｑは官能結合であり、Ｉはイオン基またはイオ
   ン化基であり； Ｒ_５ とＲ_６ 、およびＲ_６ とＲ_７ は相互に交換で
   き； Ｒは必要に応じて20までのヘテロ原子を含有するアルキ
   ル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキ
   ルであることを特徴とする中間体化合物。
9. 【請求項９】 試験試料中の少なくとも２つの物質を検
   出および／または定量する方法であって、それぞれが前
   記試験試料中の物質と関係付けられている少なくとも２
   つの異なる化学発光化合物の発光信号を同時に検出する
   工程からなり、前記化学発光化合物の各々の発光信号を
   それぞれの発光スペクトルにより識別して前記物質を検
   出および／または定量し、前記化学発光化合物の少なく
   とも１つが請求項１記載の化学発光化合物であることを
   特徴とする検出および／または定量方法。
10. 【請求項１０】 前記化学発光化合物の少なくとも１つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項９
    記載の検出および／または定量方法。
11. 【請求項１１】 前記化学発光化合物の各々が、試験物
    質に対して特異的で該試験物質に結合する結合パートナ
    ーに接合して前記試験試料中で検出および／または定量
    される反応生成物を形成することを特徴とする請求項９
    記載の検出および／または定量方法。
12. 【請求項１２】 前記化学発光接合体の発光スペクトル
    は、各発光最大値同士が、各接合体の信号を識別するの
    に十分な程離れている点で識別可能であることを特徴と
    する請求項１１記載の検出および／または定量方法。
13. 【請求項１３】 前記化学発光接合体の発光スペクトル
    は、各発光最大値同士が約60ナノメートルよりも大きく
    離れている点で識別可能であることを特徴とする請求項
    １１記載の検出および／または定量方法。
14. 【請求項１４】 前記発光スペクトルの各々が約100 か
    ら250 ｎｍの幅を有することを特徴とする請求項９記載
    の検出および／または定量方法。
15. 【請求項１５】 検出および／または定量のための前記
    試験試料中に追加の試験物質を導入して、該追加の物質
    を対照または内部参照として機能させることを特徴とす
    る請求項９記載の検出および／または定量方法。
16. 【請求項１６】 前記方法が１つの反応媒質または移送
    管中で行なわれることを特徴とする請求項９記載の検出
    および／または定量方法。
17. 【請求項１７】 前記方法が、工業検定および臨床診断
    検定を含む分析検定を行なうのに有用であることを特徴
    とする請求項９記載の検出および／または定量方法。
18. 【請求項１８】 免疫学的検定、雑種形成検定および増
    幅検定が含まれることを特徴とする請求項１７記載の検
    出および／または定量方法。
19. 【請求項１９】 前記免疫学的検定が同種免疫学的検定
    または異種免疫学的検定であることを特徴とする請求項
    １８記載の検出および／または定量方法。
20. 【請求項２０】 試験試料中の標的配列を増幅させる方
    法であって、 ａ． １つ以上の標的配列を含有すると思われる試験試
    料を用意し、 ｂ． 該試験試料に内部参照または対照を加え、 ｃ． 前記標的配列を増幅させ、 ｄ． それぞれが標的配列および前記内部参照と関係つ
    けられる少なくとも２つの異なる化学発光接合体を用意
    し、 ｅ． 該２つの化学発光接合体の発光により、増幅した
    標的配列および内部参照を同時に検出および／または定
    量する各工程からなり、 前記化学発光接合体の少なくとも１つが請求項１記載の
    化学発光化合物を含むことを特徴とする増幅方法。
21. 【請求項２１】 前記化学発光接合体の少なくとも１つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項２
    ０記載の増幅方法。
22. 【請求項２２】 前記試験試料を、前記方法に使用する
    前に予備処理することを特徴とする請求項２０記載の増
    幅方法。
23. 【請求項２３】 前記内部参照が、増幅を行なわない標
    的配列であることを特徴とする請求項２０記載の増幅方
    法。
24. 【請求項２４】 前記内部参照が、増幅を行なう標的配
    列であることを特徴とする請求項２０記載の増幅方法。
25. 【請求項２５】 前記試験試料の標的配列に対して特異
    的な少なくとも１つの結合反応を行なう工程を含むこと
    を特徴とする請求項２０記載の増幅方法。
26. 【請求項２６】 前記内部参照に対して特異的な少なく
    とも１つの結合反応を行なう工程を含むことを特徴とす
    る請求項２０記載の増幅方法。
27. 【請求項２７】 前記結合反応が雑種形成反応であるこ
    とを特徴とする請求項２５または２６記載の増幅方法。
28. 【請求項２８】 試験試料中の標的配列を増幅させる方
    法であって、 ａ． １つ以上の標的配列を含有すると思われる試験試
    料を用意し、 ｂ． 該標的配列を増幅させ、 ｃ． それぞれが標的配列と関係付けられる少なくとも
    ２つの異なる化学発光接合体を用意し、 ｄ． 該少なくとも２つの化学発光接合体の発光によ
    り、増幅した標的配列を検出および／または定量する各
    工程からなり、 前記化学発光接合体の少なくとも１つが、請求項１記載
    の化学発光化合物を含むことを特徴とする増幅方法。
29. 【請求項２９】 前記化学発光接合体の少なくとも１つ
    がアクリジニウム環系を含むことを特徴とする請求項２
    ８記載の増幅方法。
30. 【請求項３０】 試験試料中の少なくとも２つの物質を
    検出および／または定量する化学発光標識検定方法であ
    って、 ａ． 前記試験試料中の１つの試験物質に対して特異的
    な請求項１記載の化学発光化合物を含む第１の化学発光
    試薬を前記試験試料に加え、 ｂ． 前記試験試料中のもう１つの試験物質に対して特
    異的なアクリジニウム環系を含む第２の化学発光試薬を
    前記試験試料に加え、 ｃ． 前記化学発光試薬を活性化して、前記試験物質を
    検出および／または定量するための識別可能な発光信号
    を得る各工程からなることを特徴とする化学発光標識検
    定方法。
31. 【請求項３１】 前記方法が結合工程を含み、前記化学
    発光試薬の各々が前記試験試料中の試験物質に対して特
    異的な接合分子を含んでおり、反応生成物が形成される
    ように試験物質との結合反応を生じさせることを特徴と
    する請求項３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 試験試料中の２つ以上の物質を検出お
    よび／または定量するキットであって、少なくとも２つ
    の異なる化学発光化合物からなり、各化合物が試験試料
    中の少なくとも１つの物質に対して特異的である結合パ
    ートナーに接合し、前記化学発光化合物の少なくとも１
    つが請求項１記載の化学発光化合物であることを特徴と
    するキット。
33. 【請求項３３】 試験試料中の２つ以上の物質について
    同時に検定を行なうための試験キットであって、 ａ． 請求項１記載の化学発光化合物を含む第１の化学
    発光試薬、および ｂ． アクリジニウム環系を含む第２の化学発光試薬を
    含有することを特徴とする試験キット。
34. 【請求項３４】 試験試料中の２つ以上の物質について
    同時に検定を行なうための試験キットであって、少なく
    とも２つの異なる化学発光試薬からなり、該化学発光試
    薬の少なくとも１つが請求項１記載の化学発光化合物を
    含み、各試薬が前記試験物質を検出および／または定量
    するための識別可能な発光スペクトルを有することを特
    徴とする試験キット。
35. 【請求項３５】 前記化学発光試薬の少なくとも１つ
    は、アクリジニウム環系であることを特徴とする請求項
    ３４記載の試験キット。