JP3431160B2 - 尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイ - Google Patents

尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、尾部を有する結合剤、特にオリゴヌクレオ
チド尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイに関す
る。これらの結合アッセイは、液体サンプル中の被検体
の濃度を決定するのに有用である。
技術的背景 固体支持体上に固定化され、被検体に特異的な結合部
位を有する結合剤に液体サンプルを接触させ、結合した
被検体を有する結合剤を分離し、そして被検体により占
有されている結合剤の結合部位のフラクションを表す値
を測定することにより、液体サンプル中の薬又はホルモ
ンのような被検体の濃度を測定することが知られてい
る。典型的には、その後、被検体の周知の濃度を含む一
連の標準溶液から得られ値に対して、被検体により占有
された結合部位のフラクションを表現する値を比較する
ことによって、液体サンプル中の被検体の濃度が決定さ
れ得る。
過去においては、いわゆる競合又は非競合法のいずれ
かを用いる標識された発現試薬での逆滴定により占有さ
れた結合部位のフラクションの測定が通常行われてい
た。
競合法においては、結合した被検体を有する結合剤は
典型的にはその被検体の標識されたものであるか又はそ
の結合剤の空の結合部位を認識することができる抗イデ
ィオタイプ抗体である標識された発現試薬を用いて、同
時又は連続的のいずれかで逆滴定される。発現剤は、濃
度が測定されている被検体と結合剤上の結合部位につい
て競合すると表現され得る。標識された被検体で占有さ
れるに至った結合部位のフラクションは、その後上述の
ように被検体の濃度に関連し得る。
非競合法においては、結合した被検体を有する結合剤
は、結合した被検体に、又は結合剤上の占有された結合
部位のいずれかに結合することができる標識された発現
剤で逆滴定される。被検体により占有された結合部位の
フラクションは、その後標識された発現剤の存在を検出
することにより測定され得、ちょうど競合アッセイを用
いるように、上述のように液体サンプル中の被検体の濃
度に関連し得る。
競合及び非競合法の両方において、発現剤は該発現剤
が検出され得るようにマーカーで標識される。過去にお
いて種々のマーカー、例えば放射性同位体、酵素、化学
発光マーカー及び蛍光マーカーが用いられている。
イムノアッセイの分野において、競合アッセイは、バ
ーソン及びヤロー（Berson and Yalow）により説かれ
る、即ち“Methods in Investigative and Diagnostic
Endocrinology"（1973）111〜116頁における設計原理に
従って一般に行われている。バーソン及びヤローは、競
合イムノアッセイの実行において、結合剤の量がおおよ
そ30〜50％の低濃度の検出されるべき被検体に結合する
のに用いられる時に最大の感度が達成されることを提案
した。非競合イムノアッセイにおいて、液体サンプル中
の100％に近い被検体に結合するのに十分な結合剤を用
いて、最大の感受性が達成されると一般的に考えられ
る。しかしながら、両方の場合において、これらの広く
受け入れられている指針に従って設計されたイムノアッ
セイは、知られているサンプルの量並びに正確に知られ
て、もしくは一定であることが知られて用いられる結合
剤の量を要求する。
国際特許出願WO84/01031号において、液体サンプル中
の被検体の濃度は、被検体に特異的な結合部位を有する
少量の結合剤に、液体サンプルを接触させることにより
測定され得ることを私は開示した。この“周囲の被検体
（ambient analyte）”法において、結合剤の量が液体
サンプル中の被検体の濃度に不十分な影響しか与えない
程度の少量であるなら、被検体により占有される結合剤
上の結合部位のフラクションがサンプルの量と効果的に
無関係である。
このアプローチは、EP304,202において更に精密化さ
れる。これは、WO84/010131におけるアッセイ中の感度
及び発現の容易さが、Ｖがサンプルの容量でありＫが被
検体に対する結合剤のアフィニティー定数である、固体
支持体上の小さな領域（又は“ミクロスポット”）上に
位置した0.1V/Kより少ない量の結合剤を用いることによ
り改良されることを開示する。両方のこれらの引用にお
いて、被検体により占有された結合部位のフラクション
は、上述のように競合又は非競合技術のいずれかを用い
て測定される。
発明の概要 アッセイをより迅速かつ容易に行うことができる増加
された速度を有する結合アッセイを開発することの絶え
間ない必要性がある。加えて、アッセイの使用者が異な
る群の被検体を検出するのに容易に適合させられ得る結
合アッセイを提供することが要求されるであろう。
従って、第１の態様において、本発明は液体サンプル
中の被検体の濃度を決定する方法であって、 （ａ）固体支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステ
ップであって、各々の捕獲剤が、供された結合剤に特異
的に結合することができることを特徴とするステップ
と、 （ｂ）１以上の結合剤に前記液体サンプルを接触させる
ステップであって、各々の結合剤が、結合部位のフラク
ションが被検体により占有されるに至るように供された
前記被検体に特異的な前記結合部位と、対応する捕獲剤
に結合するのに適合した尾部と、を有することを特徴と
するステップと、 （ｃ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に結合するに
至るように、ステップ（ｂ）と同時又は連続的のいずれ
かで、前記固定化された捕獲剤に前記液体サンプルを接
触させるステップと、 （ｄ）被検体により占有された結合剤の前記結合部位の
前記フラクションを測定して前記サンプル中の前記被検
体の濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法を提供する。
従って、本発明は、被検体の結合が固体基体の表面よ
りむしろ液相において起こることを特徴とするアッセイ
を提供する。これは被検体と結合剤との反応の速度を増
加させる。
これにより、１つの実施形態において、結合及び捕獲
剤に液体サンプルを同時に接触させることにより、例え
ばただ一つの反応容器を用いて、ただ一つのステップに
おいてアッセイを行うことが可能になる。あるいは特に
液体が血清又は血液であり、非特異的結合が誤差の重要
な原因である場合に、結合剤及び捕獲剤の連続的な接触
が好ましい。これらの場合において、結合剤は第１の容
器において液体サンプルに最初に接触され得、その後サ
ンプルは、捕獲剤が結合剤に結合して固体支持体に結合
するのを許容する第２の容器に移される。
第２の態様において、本発明は、支持体上に１以上の
結合剤を固定化する方法であって、各々の結合剤が、供
された被検体に特異的な結合部位及び捕獲剤に結合する
のに適合した尾部を有し、 （ａ）支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステップ
であって、各々の捕獲剤が、供された結合剤の尾部に結
合することができることを特徴とするステップと、 （ｂ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に該捕獲剤の
尾部を通して特異的に結合するに至るように、支持体上
に固定化された前記捕獲剤を有する前記支持体に前記結
合剤を接触させるステップと、を含むことを特徴とする
方法を提供する。
上述の方法は、結合剤を支持体上に固定化された捕獲
剤にさらす前に、前記結合剤に前記尾部を付着させるス
テップを更に含むことができる。
このように異なる群の被検体を測定すること、及び結
合剤がその尾部によって個々に結合することができる、
支持体上に固定化された捕獲剤を有する一般的な前記支
持体と共に適合された結合剤を用いることにおいて、ア
ッセイの使用者が使用のために結合剤を適合させること
が可能である。
本発明のこの態様において、結合剤が捕獲剤に結合さ
れるに至った後に、液体サンプルに支持体をさらすこと
によりアッセイが行われる。
いずれの態様においても、本発明は、結合剤がその尾
部を通して基体に固定化された捕獲剤に間接的に結合す
ることを特徴とするアッセイを提供する。
好ましくは、前記捕獲剤は、前記結合剤の尾部を含む
相補的配列にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチ
ド配列である。捕獲剤又は結合剤の尾として作用するオ
リゴヌクレオチドは、アッセイ中に用いられる厳重な条
件下において強くかつ特異的なハイブリッド形成を供す
るのに十分に長い。典型的には、少なくとも約８又は９
ヌクレオチドの長さの相補性オリゴヌクレオチドが用い
られる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチ
ドは好ましくは８〜30塩基、更に好ましくは16〜20塩基
の長さである。しかしながら極めて長いポリヌクレオチ
ドを用いることは好ましくない。というのは、これらは
異なる捕獲剤に結合する特異性の消滅又は自己ハイブリ
ッド形成を導き、ヘアピンループ（二重鎖領域）を形成
し得るからである。しかしながらアッセイ条件のセット
に適したオリゴヌクレオチドの長さ及び配列は、当業者
により容易に決定され得る。
都合よくは、結合剤は被検体に特異的な結合部位を有
する抗体である。従って、支持体上の捕獲剤が液相の結
合剤にさらされた時、結合剤は固体支持体に結合するに
至る。あるいは、被検体が核酸配列である場合、結合剤
はオリゴヌクレオチドであり得る。このように、本実施
形態において、結合剤は、被検体とハイブリッド形成す
ることができる第１の配列と尾部として作用する第２の
配列とを有する。
好ましくは、液体サンプルの容量を知る必要がないよ
うに、WO84/01031又はEP304,202に開示されるアッセイ
に従って少量の結合剤が用いられる。このように液体サ
ンプル中の被検体の周囲の濃度に重要な影響を与えない
ように、結合剤の量は十分に小さくあるべきである。典
型的には、５％未満の被検体に結合する量の結合剤を用
いることが好ましい。しかしながら、例えば２％又は１
％の被検体に結合する、より少量の結合剤を用いること
は、更に、被検体の周囲の濃度を乱すことを削減し、被
検体濃度を決定することにおいて誤差を最小化すること
を助ける。
0.1V/Kモル未満の結合剤を用いてEP304,202に従って
アッセイを行う場合、結合剤に対する被検体の結合のア
フィニィー定数（Ｋ）は、標準的な実施に従って測定さ
れる。これは、どれだけの量の結合剤が0.1V/Kモルを構
成するかを決定するのに用いられるアフィニティー定数
が、アッセイにおいて用いられる条件（例えば反応物、
インキュベーションの時間、pH、温度等）下で得られる
値であることを意味する。
好ましくは各々の捕獲剤は、実質的に全ての供された
結合剤に結合するために過剰に用いられる。これはアッ
セイの感度を最大化して、そして用いられる結合剤の量
が知られる又は一定であることが知られる必要がある
時、アッセイの使用者はアッセイにおいて用いられる実
質的に全ての結合剤が支持体上のその捕獲剤に結合する
に至ることを確認することができることを確実にする。
好ましくは、捕獲剤の分子は、例えばミクロスポット
として、分離した位置において支持体上に固定化され
る。これは、支持体上の一連の位置における複数の異な
る捕獲剤を用いて、複数の異なる被検体が同時に測定さ
れることを許容する。捕獲剤がミクロスポットとして固
定化される場合、アッセイの感度は、高密度で捕獲剤を
固定化することが改良され得、これによりシグナル対ノ
ズル比が改良される（例えば我々の同時係属出願PCT/GB
94/02814を参照のこと）。0.1〜1.0mlの次数のサンプル
容量を仮定すると、ミクロスポットは好ましくは、1mm2
未満の領域と1000〜100000分子／μm2の結合剤の最終表
面密度とを有する。
あるいは、供された捕獲剤は、被検体の濃度の一連の
測定が同時に行われ得るように、複数の位置において支
持体上に固定化され得る。
好ましくは、被検体により占有される結合部位のフラ
クションは、上述のような競合及び／又は非競合法にお
いて発現剤を用いて検出される。発現剤は、結合剤の占
有された又は未占有の結合部位に、又は結合した被検体
に結合することができ、結合した発現剤が検出されるこ
とを可能にするために標識される。好ましくは発現剤は
標識された抗体である。
マーカーは、放射性同位体、酵素、化学発光マーカー
又は蛍光マーカーであり得る。蛍光染料マーカーを用い
ることが特に好ましい。というのは蛍光染料は検出のた
めの適切な色の範囲（励起及び発光波長）の蛍光を供す
るように選択され得るからである。蛍光染料は、クマリ
ン、フルオレセイン、ローダミン及びテキサスレッド
（Texas Red）を含む。長期の蛍光期間を有する蛍光染
料分子が用いられ得、これにより、バックグラウンドの
蛍光が減衰した後時間分解蛍光が蛍光シグナルの長さを
測定するのに用いられることを許容する。蛍光もしくは
他のマーカーを含む、又は表面上にそれらを有するラテ
ックス（Latex）ミクロスフィアーも本文脈において用
いられ得る。マーカーからのシグナルは、レーザー走査
共焦顕微鏡を用いて測定され得る。
あるいは化学発光標識のような他の高度に特異的な活
性標識を用いることもできる。化学発光標識の場合、結
合剤又は発現剤をマークするのに用いられる異なる化学
発光標識からのシグナルは、例えばチャージカップルド
（charge−coupled）装置（CCD）を用いて同時に検出さ
れ得る。
結合剤（又はその部分）は、例えば発蛍光団を用いて
便利に標識され得る。EP271,974に説かれる方法に従う
と、これはアッセイの使用者が結合剤の量を知ること又
はそれが一定であることを知ることが必要でないことを
意味する。これは、結合剤からのシグナル及び被検体に
より占有される結合剤の結合部位のフラクションを示す
シグナルの比率が、被検体により占有される結合剤の部
位のフラクションに依存するが全量の存在する結合剤に
は依存しないからである。
あるいは、アッセイの使用者がサンプルの容量を知っ
ているなら、アッセイが周囲の被検体条件下で行われな
いようにより大量の結合剤を用いることができる。これ
は、被検体の濃度が、発現剤上の１つの標識を用いて、
そして結合剤の量が一定であることを知るかもしくはそ
の量が知られているような第２のマーカーで結合剤を標
識するかのいずれかで決定されることを許容する。
（我々の同時係属出願PCT/GB94/02813に開示される）
このアプローチの変形において、２つの標識された発現
剤、即ち結合剤の未占有の結合部位に特異的に結合する
ことができる第１の発現剤、並びに占有された結合部位
もしくは結合した被検体に結合することができる第２の
発現剤を用いることができる。このように、いずれのマ
ーカーからのシグナルも被検体により占有された結合部
位のフラクションを表し、一方シグナルの総計は用いら
れた結合剤の全量を表す。
この方法は、固定化された結合剤の量における変化が
直ちに補正され得るので、結合剤の一定量が用いられる
ことを知る必要性を避けることもできる。これらの環境
下において、サンプル容量Ｖは知られているか、又は一
定であるかのいずれかでなければならない。これは、２
つの標識された発現剤がサンプル中の被検体の濃度にい
かに関係するかを示す以下の式から判断され得る。
占有された結合剤結合部位に対して向けられた発現剤
をマークする標識により発せられるシグナルをSoとし、 未占有の結合剤結合部位に対して向けられた発現剤を
マークする標識により発せられるシグナルをSuとし、 占有された又は未占有の部位に対する各々のシグナル
に関する定数を各々εｏ及びεｕとし、 Ｋ＝被検体と結合剤との間の反応を支配する有効平衡
定数とする。
そして、サンプル中の被検体濃度をＹとすると、 Ｙ＝（S0/εｏ）〔εu/（KSu）＋1/V〕 Ｖが知られていると仮定すると、この等式は２つの未
知の定数、So及びεu/Kを含む。一連の周知の被検体濃
度についてシグナルSo及びSuを決定することにより、こ
れらの定数は決定され得、未知の被検体濃度は、対応す
るSo及びSuの決定から見積もられる。このようにこのア
ッセイは周知の被検体条件下で作業を行う必要がない。
周囲の被検体条件下において、1/V項は無視すること
ができ、So/Suは周囲の被検体濃度に比例する。
第１のキットの態様において、本発明は、上述のよう
な方法において、液体サンプル中の１以上の被検体の濃
度を決定するためのキットであって、該キットが、 （ａ）固体基材に付着し、結合剤に特異的に結合するこ
とができる捕獲剤を複数の位置に有する前記固体基材
と、 （ｂ）１以上の結合剤であって、各々の結合剤が被検体
に特異的な結合部位と、１以上の捕獲剤に結合するのに
適合した尾部と、を有することを特徴とする結合剤と、 （ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合
した被検体又は未占有の結合剤結合部位に結合すること
ができるマーカーを有する１以上の発現剤と、 を含むことを特徴とするキットを提供する。
第２のキットの態様において、本発明は、１以上の被
検体の濃度を決定するためのアッセイを適合させるため
のキットであって、 （ａ）各々が結合剤への付着のためである１以上の尾部
と、 （ｂ）固体基材に付着され、尾部に特異的に結合するこ
とができる１以上の捕獲剤を複数の位置に有する固体基
材と、 を含み、アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付
着させることにより、前記捕獲剤が上述のような方法に
おいて付着された固体基材と共に用いられ得る結合剤を
供することを特徴とするキットを提供する。
図面の記載 本発明の好ましい実施形態は、以下に説明される添付
された概略図を参照することにより記載されるであろ
う： 図１は、捕獲剤が２つのミクロスポットにおいて固定
化されている、２種類の前記捕獲剤及び２種類の結合剤
を用いて液体サンプル中の２つの被検体を検出するため
のアッセイを示す； 図２は、捕獲剤が結合剤に結合するに至っている図１
のアッセイを示す； 図３は、第２の標識された抗体を用いて結合剤の占有
率を決定する非競合法を示す； 図４は、後述の実験的な例からのTSH濃度に対してプ
ロットされたシグナルのグラフを示す。
詳細な記載 図１〜３は、異なる被検体6,8に特異的な結合部位を
有する２種類の結合剤2,4が用いられる結合アッセイを
示す。各々の結合剤2,4はオリゴヌクレオチド尾部12,16
が供された抗体10,14を含む。オリゴヌクレオチド尾部
は異なるヌクレオチド配列を有し、その配列は、ミクロ
スポットの形態で固体支持体22上に固定化された捕獲剤
18,20の配列の１つに相補的である。この例において、
オリゴヌクレオチドは８ヌクレオチド長である。
このアッセイにおいて、サンプル中の２つの被検体6,
8は、該被検体6,8のフラクションが抗体10,14に結合す
るに至るように結合剤2,4にさらされる。この反応は液
相中でおこるので抗体10,14と被検体（抗原）6,8の間の
反応の速度は最適化される。
最初の抗体／被検体反応と同時又は連続的に、液体サ
ンプル及び結合剤は、固体支持体22上に固定化された捕
獲剤18,20を有する前記固体支持体22にさらされる。こ
れは結合剤2,4のヌクレオチド配列12,16が支持体22上に
固定化された捕獲剤18,20の相補性配列に結合すること
を許容する。これを図２に示す。しかしながら、捕獲剤
16,18な実質的に全ての結合剤10,14が支持体22に結合す
ることを確実にするため、一般的に過剰に用いられる。
このように、図２及び図３において、捕獲剤28の１分子
が未占有のものとして残る。
結合剤2,4の結合部位のフラクションは、その後慣用
の逆適定技術を用いて決定され得る。このように図３に
おいて標識された抗体24,26は、各々占有された結合剤
2,4の存在をマークするために、非競合技術において用
いられる。抗体24,26は、マーカー（非表示）で標識さ
れるので、結合剤2,4の結合部位のフラクションが、そ
の後決定され得る。次にこれは、例えば一連の周知の被
検体濃度の溶液を用いて得られた結果を参照することに
より、液体サンプル中の被検体の濃度が見い出されるこ
とを許容する。
図１〜３に示されるアッセイは、固体支持体22上に固
定化された捕獲剤18,20を有する同様の前記固体支持体2
2を用いて、被検体のいずれの対の濃度を測定するのに
適合され得る。これは、結合剤がミクロスフィアー18,2
0の１つに特異的に結合するであろうように、被検体を
オリゴヌクレオチド尾部12,16に結合させるのに適した
結合剤を提供することにより行われ得る。このように、
アッセイの使用者は、ミクロスポットの全部の配置と共
に、用いるための結合剤を適合させることができるであ
ろうことが考えられる。
実施例 試薬： １）Scottish Antibody Production Unit（SAPU）から
のマウスIgG（モノクローナル抗TSH）。
２）SigmaからのウサギIgG、ヤギ抗マウスIgG（全体の
分子）及びヤギ抗ウサギIgG（全体の分子）抗体。
３）Molecular Probesからの0.1μｍ径で黄色／緑色蛍
光（ex 490:em 515nm）のスルフェートフルオスフィア
ー（Sulfate Fluospheres）及び0.1μｍ径で赤色蛍光
（ex 580:em 605nm）のスルフェートフルオスフィアー
（Sulfate Fluospheres）。
４）Oswell DNA Serviceからのオリゴヌクレオチド： ａ）５′−ビオチン修飾を有するCACACACACACACACACA
（ポリ−CA） ｂ）５′ホスホロチオエート修飾を有するGTGTGTGTGT
GTGTGTGT（ポリ−GT） ｃ）５′−ビオチン修飾を有するGAGAGAGAGAGAGAGAGA
（ポリ−GA） ｄ）５′−ホスホロチオエート修飾を有するCTCTCTCT
CTCTCTCTCT（ポリ−CT） ５）Pierceからのスルホ−LC−SPDP｛スルホスクシニミ
ジル６−〔３′−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン
アミド〕ヘキサノエート｝。
６）PharmaciaからのPD10カラム及びセフアデックスG20
0（Sephadex G200）。
７）SigmaからのRIAグレードウシ血清アルブミン（BS
A）、Tween20、アジ化ナトリウム、無水オルトリン酸水
素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、EDTA
及びTrizma。
８）Vector LaboratoriesからのアビジンDX（Avidin D
X）。
９）Amiconからのセントリコン−30（Centricon−30）
及びセントリプレップー30（Centriprep−30）濃縮器。
10）NIH USAからの甲状腺刺激ホルモン（TSH）。
スルフェートフルオスフィアーへの抗マウスIgG及び
抗ウサギIgG抗体の吸着 １）２％（10mg）の0.1μｍ黄色／緑色フルオスフィア
ーの0.5ml分割量を、0.5mlの0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中
に溶解された2mgのヤギ抗マウスIgG抗体に添加した。２
％（10mg）の0.1μｍ赤色フルオスフィアーの0.5ml分割
量を0.5mlの0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中に溶解された2mg
のヤギ抗ウサギIgG抗体に添加した。両方の標品を室温
で一晩振とうした。
２）この２つの標品を、MSE高回転21超遠心機（MSE Hig
h−Spin21 Ultra−centrifuge）において、８℃で10分
間遠心した。
３）各々のペレットを１％BSAを含むリン酸緩衝液2mg中
に分散させ、室温で１時間振とうし、上述のように遠心
した。
４）各々のペレットを0.5％Tween20を含むリン酸緩衝液
2ml中に分散させ、室温で30分間振とうし、上述のよう
に遠心した。
５）各々のペレットを2mlのリン酸緩衝液中に分散さ
せ、上述のように遠心した。
６）各々のペレットを2mlのリン酸緩衝液中に分散さ
せ、上述のように遠心した。
７）各々のペレットを0.1％アジ化ナトリウムを含む１
％BSAの2ml中に分散させ、４℃で保存した。
オリゴヌクレオチドへのマウスモノクローナルIgG及
びウサギIgGの接合 １）3mgのスルホ−LC−SPDPを1mlのPBS/EDTA中に溶解さ
れた4.6mgのマウス抗TSHモノクローナル又はウサギIgG
に添加して室温で30分間振とうした。
２）この活性化された抗体をPD10カラムで未処理のSPDP
から分離した。このサンプルをPBS/EDTAで溶出して0.5m
lフラクションを収集した。
３）この活性化された抗体を含む第１のピークからのフ
ラクションをプールして、セントリコン−30濃縮器を用
いておおよそ10μｌまで濃縮した。
４）５′−ホスホロチオエート修飾されたポリ−GTオリ
ゴヌクレオチド100nMを活性化されたマウスモノクロー
ナルIgG 14.8nMに添加した。５′−ホスホロチオネート
修飾されたポリ−CTオリゴヌクレオチド58.3nMを活性化
されたウサギIgG 8.7nMに添加した。両方の標品をPBS/E
DTAで1mlにして、室温で一晩振とうした。
５）オリゴヌクレオチド接合マウスおよびウサギIgG標
品をセファデックスG200カラム（1.5×45cm）で未反応
のオリゴヌクレオチドから分離した。このサンプルをPB
S/EDTAで溶出して2mlフラクションを収集した。
６）オリゴヌクレオチド接合抗体を含む第１のピークか
らのフラクションをプールして、セントリプレップ−30
濃縮器を用いておおよそ500μｌに濃縮して４℃で保存
した。
オリゴヌクレオチド接合抗体が、ミクロスポットとし
て固相上に配された相補的オリゴヌクレオチドのみとハ
イブリッド形成するであろうことの論証 １）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイタ
ーウエル（Dynatech black Microfluor microtitre wel
ls）を0.1M重炭酸緩衝液pH8.5中のアビジンDX 50μｌで
５μg/mlの濃度で室温で５分間コートした。
２）0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した後、アジビンコート
されたマイクロタイターウェルを室温で１時間、200μ
ｌの１％BSAでブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄し
て乾燥させた。
３）0.1％BSA中で0.025nM/mlの濃度の２つの５′−ビオ
チン修飾されたポリ−CA及びポリ−GAオリゴヌクレオチ
ドの各々の0.25μｌドロップレットを、アジビンコート
されたマイクロタイターウェルの反対側に配し、湿った
雰囲気下で30分間、反応させた。その後、ドロップレッ
トを吸収して、このマイクロタイターウェルをリン酸緩
衝液で洗浄した。
４）ポリ−GT接合マウスモノクローナルIgG及びポリ−C
T接合ウサギIgGの各々0.25μg/mlを含むTris−HClアッ
セイ緩衝液の50μｌ分割量を対照マイクロタイターウェ
ル（かわりに未接合のマウス及びウサギIgGを含むアッ
セイ緩衝液50μｌを対照ウェルに添加した）以外全てに
添加し、湿った雰囲気下で１時間、振とうして、0.05％
Tween20を含むリン酸緩衝液で洗浄した。
５）0.3μg/mlヤギ抗マウスIgG抗体接合黄色／緑色フル
オスフィアー及び0.6μg/mlヤギ抗ウサギIgG抗体接合赤
色フルオスフィアーを含むTris−HClアッセイ緩衝液の2
00μｌ分割量を全マイクロタイターウェルに添加し、室
温で１時間振とうし、リン酸−Tween20緩衝液で洗浄し
て、アルゴン／クリプトン（Argon/Krypton）レーザー
を備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。
結果 励起:488DF10 発光:525DF35サンプル 黄色／緑色シグナル 対照 13.3±0.5 アビジン…Ｂ−ポリ−CA…ポリ− GT−マウスIgGミクロスポット 100.9±10.9 アビジン…Ｂ−ポリ−GA…ポリ− CT−ウサギIgGミクロスポット 16.9±0.3 励起:568DF10 発光:585EFLPサンプル 赤色シグナル 対照 22.0±0.2 アビジン…Ｂ−ポリ−CA…ポリ−GT−マ ウスIgGミクロスポット 24.0±0.4 アビジン…Ｂ−ポリ−GA…ポリ−CT−ウ サギIgGミクロスポット 99.8±2.7 結論 （１）ポリ−GTオリゴヌクレオチドで標識されたマウス
IgGは、相補的ビオチン化ポリ−CAとのみハイブリッド
形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相
補的ビオチン化ポリ−GAオリゴヌクレオチドミクロスポ
ットとはハイブリッド形成しなかった。
（２）ポリ−CTオリゴヌクレオチドで標識されたウサギ
IgGは、相補的ビオチン化ポリ−GAとのみハイブリッド
形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相
補的ビオチン化ポリ−CAオリゴヌクレオチドミクロスポ
ットとはハイブリッド形成しなかった。
オリゴヌクレオチド標識された抗体ミクロスポットの
抗原結合の論証 １）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイタ
ーウェルを0.1M重炭酸緩衝液pH8.5中のアビジンDX 50μ
ｌで５μg/mlの濃度で室温で５分間、コートした。
２）0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコート
されたマイクロタイターウェルを室温で１時間、200μ
ｌの１％BSAでブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄し
て乾燥させた。
３）0.1％BSA中で0.025nM/mlの濃度の５′−ビオチン修
飾されたポリ−CAオリゴヌクレオチドの0.25ドロップレ
ットをアビジンコートされた各々のマイクロタイターウ
ェル上に配し、湿った雰囲気下で30分間反応させた。そ
の後、ドロップレットを吸引して、このマイクロタイタ
ーウェルをリン酸緩衝液で洗浄した。
４）ポリ−GT接合抗TSHマウスモノクローナルIgG 0.25
μg/mlを含むTris−HClアッセイ緩衝液の50μｌ分割量
をこのマイクロタイターウェルに添加し、湿った雰囲気
下で１時間、振とうして、0.05％Tween20を含むリン酸
緩衝液で洗浄した。
５）Tris−HClアッセイ緩衝液中のTSH標準の200μｌ分
割量（0,0.1,0.3及び1.0μU/ml）を３回重複でウェルに
添加し、室温で１時間インキュベートしてリン酸−Twee
n20緩衝液で洗浄した。
６）50μg/ml抗TSH発現抗体接合黄色／緑色スルフェー
トフルオスフィアーの200μｌ分割量を全マイクロタイ
ターウェルに添加し、室温で１時間振とうし、リン酸−
Tween20緩衝液で洗浄して、アルゴン／クリプトンレー
ザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。
結果及び結論 ポリ−GTオリゴヌクレオチド標識された抗TSHマウス
モノクローナルIgGは、それを、アビジンコートされた
マイクロタイターウェルに結合したビオチン化された相
補的ポリ−CAオリゴヌクレオチドを通して固相に配され
た結合抗体として用いた時、標準曲線の作成が成功した
ことにより証明されるように十分に機能することができ
た（図４を参照のこと）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エキンズ，ロジャー フィリップ イギリス国，ロンドン ダブリュ１エヌ ８エーエー，モリティマー ストリー ト（番地なし）．スクール オブ メデ ィスン，ユニバーシティ カレッジ ア ンド ミドルセックス，デパートメント オブ モレキュラー エンドクリノロ ジー，マルティライト リミティド (56)参考文献 特開 平４−273065（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−232465（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／027150（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579 C12Q 1/68

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体サンプル中の複数の被検体の濃度を決
    定するための方法であって、該方法が、 複数の異なる捕獲剤が分離された位置に固定化されてい
    る１つの固体支持体と、 複数の結合剤であって、各々の結合剤は供された被検体
    に特異的な結合部位を有し、かつ前記捕獲剤の１つに結
    合するのに適合した尾部を有することを特徴とする結合
    剤 を用い、 （ａ）複数の結合剤に前記液体サンプルを接触させるス
    テップであって、各々の結合剤が、結合部位の部分が供
    された被検体により占有されるに至るようにすることを
    特徴とするステップと、 （ｂ）前記ステップ（ａ）と同時又は連続的のいずれか
    において、前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に結合す
    るに至るように、前記固定化された捕獲剤に前記液体サ
    ンプルを接触させるステップと、 （ｃ）被検体により占有された供された結合剤の前記結
    合部位の前記部分を表現する値を決定することにより、
    前記液体サンプル中の被検体の濃度を決定するステッ
    プ、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部にお
    ける相補的配列とハイブリッド形成することができる配
    列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    方法。
  2. 【請求項２】前記方法が、前記支持体に前記結合剤を固
    定化する前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステッ
    プを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記オリゴヌクレオチドが８〜30塩基の長
    さであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】前記結合剤が、被検体に特異的な結合部位
    を有する抗体であることを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれか一に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記結合剤が、核酸被検体とハイブリッド
    形成することができるオリゴヌクレオチドである請求項
    １〜３のいずれか一に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記結合剤が特異的である前記被検体の周
    辺濃度が有意に乱されないように、各々の少量の結合剤
    が用いられることを特徴とする請求項１〜５のいずれか
    一に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記少量の結合剤が0.1V/Kモル未満であ
    り、ここでＶは、前記サンプルの容量であり、Ｋは、前
    記被検体が前記結合剤に結合することについての有効ア
    フィニティー定数であることを特徴とする請求項６に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】各々の捕獲剤が、実質的に全ての供された
    結合剤に結合するために、過剰に用いられることを特徴
    とする請求項１〜７のいずれか一に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記分離された位置がミクロスポット（mi
    crospots）であることを特徴とする請求項１〜８のいず
    れか一に記載の方法。
  10. 【請求項１０】供された被検体の濃度の一連の測定を同
    時に行い得るように、供された捕獲剤が、複数の位置に
    おいて前記支持体上に固定化されることを特徴とする請
    求項１〜９のいずれか一に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記被検体により占有される結合部位の
    部分を表現する値が、競合及び／又は非競合法において
    現像剤を用いて決定され、前記現像剤がマーカーで標識
    されることを特徴とする請求項１〜10のいずれか一に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】前記マーカーが蛍光又は化学発光マーカ
    ーであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】請求項１〜12のいずれか一に記載の方法
    において、液体サンプル中の複数の被検体の濃度を決定
    するためのキットであって、該キットが、 （ａ）１つの固体支持体に付着され、供された結合剤に
    特異的に結合することができる複数の異なる捕獲剤を複
    数の位置に有する前記固体支持体と、 （ｂ）複数の結合剤であって、各々の結合剤が、供され
    た被検体に特異的な結合部位を有し、そして１又は複数
    の捕獲剤に結合するのに適合した尾部を有することを特
    徴とする結合剤と、 （ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合
    した被検体又は未占有の結合剤結合部位に結合すること
    ができるマーカーを有する１又は複数の現像剤と、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部にお
    ける相補的配列とハイブリッド形成することができる配
    列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    キット。
  14. 【請求項１４】液体サンプル中の１又は複数の被検体の
    濃度を決定するためのアッセイ用のキットであって、該
    キットが、 （ａ）複数の尾部であって、各々の尾部が結合剤への付
    着のためであることを特徴とする尾部と、 （ｂ）１つの固体支持体に付着され、尾部に特異的に結
    合することができる複数の異なる捕獲剤を複数の位置に
    有する前記固体支持体と、 を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部にお
    ける相補的配列とハイブリッド形成することができる配
    列を有するオリゴヌクレオチドであり、前記アッセイの
    使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることによ
    り、請求項１〜12のいずれか一に記載の方法において、
    前記捕獲剤が付着された前記固体支持体と共に用い得る
    結合剤を供することを特徴とするキット。
  15. 【請求項１５】液体サンプル中の複数の被検体の濃度を
    決定するための方法であって、該方法が、 複数の異なる捕獲剤が分離された位置に固定化されてい
    る１つの固体支持体と、 複数の結合剤であって、各々の結合剤は供された被検体
    に特異的な結合部位を有し、かつ前記捕獲剤の１つに結
    合するのに適合した尾部を有することを特徴とする結合
    剤、 を用い、 （ａ）前記固体支持体上の分離された位置に複数の異な
    る捕獲剤を固定化するステップであって、各々の捕獲剤
    が供された結合剤の尾部に結合できることができること
    を特徴とするステップと、 （ｂ）前記複数の結合剤を、前記複数の捕獲剤が固定化
    された固体支持体と接触させて、前記結合剤がその尾部
    によりその各々の捕獲剤と特異的に結合するに至るよう
    にするステップであって、前記捕獲剤が、対応する結合
    剤の前記尾部における相補的配列とハイブリッド形成で
    きる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴
    とするステップと、 （ｃ）前記固定化された結合剤に前記液体サンプルを接
    触させるステップであって、各々の結合体の結合部位の
    部分が前記被検体により占有されるに至ることを特徴と
    するステップと、 （ｄ）被検体により占有された供された結合剤の前記結
    合部位の前記部分を表現する値を決定することにより、
    前記液体サンプル中の被検体の濃度を決定するステップ
    と、 を含む方法。
  16. 【請求項１６】前記方法が、前記支持体に前記結合剤を
    固定化する前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステ
    ップを更に含むことを特徴とする請求項15に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】前記結合剤が、被検体に特異的な結合部
    位を有する抗体であることを特徴とする請求項15または
    16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記結合剤が核酸被検体とハイブリッド
    形成できるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    請求項15または16に記載の方法。
  19. 【請求項１９】分離された位置がミクロスポットである
    ことを特徴とする請求項15〜18のいずれか１項に記載の
    方法。
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