JP3414289B2 - タンパク質の分析装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、流れ分析方法に基
づいて液中のタンパク質を分画定量する装置に関し、特
に電解液またはメッキ液中に含まれる膠やゼラチンなど
の微量のタンパク質を、試料液が管路を流れる間に短時
間に分画し定量する分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】電解液やメッキ液には、電着金属の光沢
化やメッキ層の硬化、メッキ面の平滑化など種々の目的
に応じて添加剤が加えられる。添加剤としては、電解精
錬では膠が多く用いられ、メッキではゼラチンがしばし
ば用いられており、これらの濃度を一定の範囲内に保つ
ことが品質管理上極めて重要である。例えば、膠は電着
面を平滑化するために用いられるが、濃度が過剰になる
と分極を著しく高め、ビスマス等の不純物が析出しやす
くなるなどの問題がある。

【０００３】しかし、一般に知られているタンパク質の
定量分析法は、弱酸性から弱アルカリ性の条件下で行わ
れるものが多く、電解液やメッキ液などのｐＨが１以下
であるような強酸性の試料溶液に適用できる例は少な
い。従来、電解液やメッキ液などに含まれる膠やゼラチ
ンなどのタンパク質は、電位差滴定法やケルダール蒸留
法などにより測定されているが、いずれも特殊な装置が
必要である上、操作が煩雑であった。また、ケルダール
蒸留法は膠をアンモニア態窒素に分解してから測定を行
なうものであるが、通常、電解液にはタンパク質以外の
窒素化合物が含まれるため正確な測定が困難な場合が多
い。

【０００４】この他に、強酸性溶液中のゼラチン・膠定
量法として、ゼラチンまたは膠をメンブランフィルター
に捕集して特定の試薬(アミドブラック１０Ｂ色素)と結
合させ、過剰の色素を洗浄した後、色素を溶出してゼラ
チン等を検出する方法（特開平2-69660号公報）、ある
いはゼラチン等を捕集したフィルターを乾燥させ反射率
を利用して検出する方法（特開平6-337247号公報）など
が報告されている。しかし、これらの方法は膠の捕集量
がフィルターの孔径に著しく左右されると云う問題があ
る。またフィルターの捕集に濾過装置を必要とし、操作
も煩雑であり、しかもフィルターが使い捨てであるため
に分析コストが嵩む等の問題がある。

【０００５】また、電解液やメッキ液などの強酸性溶液
中ではタンパク質の変質・分解が経時的に生じるため、
これらに含まれるタンパク質の定量分析においては、出
来るだけ短時間に定量分析することが必要である。ま
た、電解液やメッキ液に添加する膠やゼラチンは分子サ
イズによってその効果が影響されることから、信頼性の
高い分析を行うには分子サイズに応じた定量分析が求め
られる。

【０００６】

【発明の解決課題】本発明は、従来のタンパク質測定方
法における上記問題を解決したものであって、強酸性の
溶液でも、液中のゼラチンや膠などのタンパク質を短時
間に迅速に定量でき、しかもタンパク質の分子サイズに
応じてこれを分画し、各々の濃度を定量することのでき
る連続流れ分析装置を提供するものである。

【０００７】

【課題の解決手段】本発明は、連続流れ分析装置におい
て、タンパク質を分画するフィルターと、分画したタン
パク質を吸着して一時的に保持する吸着カラムとを併用
することにより、タンパク質の分画と定量を連続的に行
うことのできるようにしたものである。

【０００８】すなわち、本発明は以下の構成を有するタ
ンパク質分析装置に関する。 （１）試料液の導入部、試薬添加部、反応部および検出
部が測定管路によって順次一体に連通され、試料液が測
定管路を流れる間に試薬との反応および分析が連続的に
行なわれる流れ分析装置であって、試料液導入部にタン
パク質を含有する試料液を一定量導入する手段を有し、
さらに試料液導入部と試薬添加部との間に、タンパク質
を分画して捕集する手段を有し、該分画捕集手段はタン
パク質を分画するフィルター部と、分画されたタンパク
質を捕集するカラム吸着部および該フィルター部とカラ
ム吸着部を通じる管路を有し、上記カラム吸着部はタン
パク質を吸着する疎水性の無極性ないし中間極性の吸着
樹脂を充填したカラムと、該カラムにタンパク質の溶離
液を流して試薬添加部に導く管路と、タンパク質を分離
した試料液を系外に導く管路とを有し、この溶離液用管
路は該カラムのコンデショニング用管路を兼用し、かつ
試料液の導入部から樹脂充填カラムを経て系外に通じる
管路と、該カラムに溶離液を流して試薬添加部に導く管
路とが切替自在に形成されており、試料液が上記フィル
ター部と上記カラム吸着部に導かれてタンパク質が分離
された後に、該カラムに導入された溶離液によって分離
されたタンパク質が上記試薬添加部および上記反応部を
経て検出部に導かれ、定量分析されることを特徴とする
タンパク質の分析装置。

【０００９】本発明の上記分析装置は以下の態様を含
む。 （２）上記フィルター部が切替バルブによって形成され
ており、該バルブは流路切替用の複数の通孔を有し、該
通孔の一部の間にタンパク質を分画するフィルターが設
けられていると共に他の通孔の一部に洗浄用管路が接続
されており、さらに該バルブは試料液導入部に通じる管
路とカラム吸着部に通じる管路および洗浄用管路の各管
路に対する上記通孔との接続部分が回動自在であり、該
バルブの回動により各通孔とこれらの管路との接続が切
り替え自在に形成されている上記(1)に記載する分析装
置。 （３）上記フィルター部に孔径の異なる複数のフィルタ
ーが設けられており、各フィルターは管路の上流側から
順にフィルター孔径の大きな順に配設されており、試料
液がフィルター部を通過する間に段階的にタンパク質が
分画される上記(1)または(2)に記載する分析装置。 （４）上記カラム吸着部が切替バルブによって形成され
ており、該バルブは流路切替用の複数の通孔を有し、該
通孔の一部の間に分画されたタンパク質を吸着する樹脂
を充填したカラムが設けられていると共に他の通孔の一
部に溶離液用管路が接続されており、さらに該バルブは
フィルター部に通じる管路と試薬添加部に通じる管路お
よび溶離液用管路の各管路に対する上記通孔との接続部
分が回動自在であり、該バルブの回動により各通孔とこ
れらの管路との接続が切り替え自在に形成されている上
記(1),(2)または(3)に記載する分析装置。 （５）ｐＨ１以下の強酸性の電解液またはメッキ液の微
量タンパク質を定量する装置であり、疎水性吸着樹脂と
して耐酸性のスチレン−ジビニルベンゼン系無極性樹脂
またはエステル系中間極性樹脂が用いられる上記(1)〜
(4)のいずれかに記載する分析装置。 （６）試料液の導入部、フィルター部、カラム吸着部、
試薬添加部および反応部に設けられている送液手段と管
路切替手段、検出部の操作手段を統一的に制御する自動
制御手段が設けられており、試料液の導入からタンパク
質の分画定量に至る一連の操作が自動的に行われる上記
(1)〜(5)のいずれかに記載する分析装置。

【００１０】

【発明の実施の態様】以下、本発明を図面に示す実施例
に基づいて具体的に説明する。図１は本発明に係る分析
装置の構成例を示す概念図である。図示するように、本
発明の分析装置は、試料液の導入部Ａ、試薬添加部Ｂ、
反応部Ｃおよび検出部Ｄが測定管路によって順次一体に
連通されており、さらに上記試料液導入部Ａと試薬添加
部Ｂとの間にタンパク質を分画して捕集する手段Ｅが介
設されている。この分画捕集手段Ｅはタンパク質を分画
するフィルター部Ｘと、分画したタンパク質を吸着し一
時的に保持するカラム吸着部Ｙによって形成されてい
る。以下、各部分について説明する。

【００１１】試料液の導入部Ａはキャリアー液の送液手
段Ａ1と試料液の導入手段Ａ2とを有する。送液手段Ａ1
としては送液ポンプを用いることができる。送液ポンプ
は脈流の少ないプランジャー式ポンプが適している。な
お、図１の装置例は、２つの送液ポンプ(Ｐ1,Ｐ2)によ
って送液手段Ａ1を形成したものであり、水を供給する
送液ポンプＰ1と、希硫酸液を供給する送液ポンプＰ5が
設けられている。これらの送液ポンプＰ1,Ｐ5には水が
流れる管路１,２と、希硫酸が流れる管路21,22が各々配
設されている。管路１,２は管路３に合流し、また管路2
1,22は管路23に合流し、さらに管路３に合流して試料液
の導入手段Ａ2に連通している。これら２種の送液ポン
プＰ1,Ｐ5を用いることにより、希硫酸液と水とを独立
に系内に導入することができ、例えば希硫酸液をキャリ
ヤー液として使用する場合、希硫酸液送液ポンプＰ5に
より試料液を分離手段であるフィルターおよびカラムに
流した後、該ポンプＰ5を止め、水の送液ポンプＰ1を稼
働させ系内に水を流すことにより、フィルターおよびカ
ラム内に残留する酸や金属イオンなどを洗い流すことが
できる。

【００１２】図１に示す例では、試料液の導入手段Ａ2
として一定量の試料液を保持するサンプルループを備え
た流路切替バルブ(六方バルブ)Ｖ1が用いられている。
このバルブＶ1には６個の通孔ａ〜ｆが設けられてお
り、相対向する通孔ｃ,ｆの間に一定量の試料液を保持
するサンプルループ４が設けられている。通孔ａはキャ
リアー液の管路３に連通しており、通孔ｂはタンパク質
の分離手段Ｅに接続している。また通孔ｄは管路５を通
じて試料液の送液ポンプＰ2に連通しており、通孔ｅは
系外に通じている。

【００１３】上記バルブＶ1は、予め通孔ｃとｄ、通孔
ｅとｆが各々連通されてサンプルループ４に一定量の試
料液が導入されて保持される。試料液の量は上記ループ
４の長さによって調整することができる。測定時には、
このバルブＶ1の回転によって通孔ａとｆ、通孔ｃとｂ
が各々連通され、サンプルループ４から管路７に一定量
の試料液が導入される。その後は再びバルブＶ1の回転
によって測定前の状態に戻り、新たに試料液がループ４
に導入される。

【００１４】なお、図示するように、上記六方バルブＶ
1の通孔ｅを介して複数の試料液を選択して導入する選
択バルブＶ3を付設しても良い。該バルブＶ3には一例と
して四方バルブが用いられる。該四方バルブＶ3には通
孔ｍ,ｎ,ｏ,ｐが設けられており、各通孔ｍ〜ｐには異
なる試料液ア〜エの供給源に通じる管路24,25,26,27が
各々接続している。また、バルブ中央には上記六方バル
ブＶ1の孔ｅに通じる孔ｑが設けられている。四方バル
ブＶ3の各通孔ｍ〜ｐは該バルブの回転によってバルブ
中央の孔ｑと個々に連通され、これにより試料液ア〜エ
の供給源に通じる管路24,25,26,27の接続が切替られ
る。試料液ア〜エは、四方バルブＶ3の孔ｑに接続した
管路24〜27の何れかにより該孔ｑおよび六方バルブＶ1
の孔ｅを通じてポンプＰ3によって吸引され、六方バル
ブＶ1のサンプルループ４に一定量導入される。このよ
うに本手段によれば複数の試料液を適宜選択して測定系
に導入することができる。

【００１５】フィルター部Ｘは、試料液の導入手段Ａ2
と同様の六方バルブＶ4と、これに接続する洗浄用管路
を有する。このバルブＶ4には６個の通孔ｒ,ｓ,ｔ,ｕ,
ｖ,ｗが設けられており、相対向する通孔ｖ,ｗの間にタ
ンパク質を捕集するためのフィルター34が設けられてい
る。上記通孔ｒは試料導入部に通じる管路７に連通して
おり、通孔ｓは管路28および管路29を通じてカラム吸着
部Ｙに接続している。また通孔ｔは管路31を通じて洗浄
水の供給手段に連通し、通孔ｕは管路30および管路29を
通じてカラム吸着部Ｙに連通している。

【００１６】洗浄水供給手段として図示する例では送液
ポンプＰ6が用いられている。この送液ポンプＰ6はダブ
ルプランジャーポンプが好適に用いられ、該ポンプＰ6
には洗浄液および水が各々流れる管路32,33が配設され
ている。管路32,33は合流し管路31を経て上記バルブＶ4
の通孔ｔに通じている。

【００１７】フィルター34はその孔径に応じたタンパク
質を捕集するものであれば良い、従来のセルロースアセ
テートフィルターやＰＴＦＥフィルターなどを用いるこ
とができる。フィルターの孔径は分画するタンパク質の
分子サイズに応じて決定すればよい。因みに、電解液や
メッキ液中の膠ないしゼラチンを定量する場合には、
０.２μm程度の孔径を有するものを用い、これより大き
なサイズのものと小さなものとを分画して定量するのが
好ましい。

【００１８】上記フィルター部Ｘは、フィルター接続用
のバルブを並列させ、孔径の異なる複数のフィルターを
用い、上流側から順に孔径の大きなフィルターを配設す
ることにより、各フィルターの孔径に応じた分子サイズ
のタンパク質を段階的に分画するように形成してもよ
い。

【００１９】フィルター部ＸのバルブＶ4は、その回転
によって試料液導入部Ａからフィルター34を経てカラム
吸着部Ｙに通じる管路と、洗浄液管路31からフィルター
34を経てカラム吸着部Ｙに通じる管路とが切替自在に形
成されている。具体的には、試料液がフィルター部Ｘを
流れる場合には、上記バルブＶ4の回転により通孔ｒと
ｖ、通孔ｗとｓがおのおの連通され、管路７を通じてフ
ィルター34に試料液が導入される。ここで、試料液に含
まれているタンパク質のうちフィルター34の孔径より分
子サイズの大きいものはフィルター34に捕集される。こ
の孔径より分子サイズの小さいタンパク質や試料液中に
含まれる金属イオン等はフィルター34を通過し、管路2
8,29を通じてカラム吸着部Ｙに送られる。

【００２０】上記フィルター34にタンパク質を捕集させ
た後、バルブＶ4を回動して通孔ｔとｗ、通孔ｕとｖを
各々連通させ、洗浄水をフィルター34に導く、該フィル
ター34に捕集されたタンパク質は洗浄水によって洗い出
され、管路29,30を通じてカラム吸着部Ｙに送られる。
その際、送液ポンプＰ5を一時的に停止させキャリアー
溶液の送液を停止させる。

【００２１】洗浄水としては水または希硫酸、緩衝液等
を用いることができる。なお、上記洗浄水はキャリアー
と同じ組成のものが適当である。なお、フィルター34に
試料液を導入する際には、必要に応じて、予め上記管路
を切り替えてフィルターを洗浄することができる。

【００２２】カラム吸着部Ｙは上記バルブＶ1,Ｖ4と同
様の六方バルブＶ2と、これに接続する溶離液の供給手
段を有する。このバルブＶ2には６個の通孔ｇ,ｈ,ｉ,
ｊ,ｋ,ｌが設けられており、相対向する通孔ｈ,ｋの間
に疎水性吸着樹脂を充填したカラム８が設けられてい
る。通孔ｉは上記フィルター部に通じる管路29に接続し
ており、通孔ｊは管路13を経て系外に通じている。ま
た、通孔ｌは溶離液の管路11に連通し、通孔ｇは試薬添
加部Ｂに通じている。

【００２３】カラム８に充填される疎水性吸着樹脂は、
強酸性の電解液やメッキ液に対しても使用できるよう
に、好ましくは、スチレン−ジビニルベンゼン系無極性
樹脂またはエステル系中間極性樹脂が用いられる。これ
らの無極性樹脂および中間極性樹脂はイオン交換樹脂よ
りも液中の微量タンパク質に対する吸着能が優れる。ま
た、酸に対する耐久性に優れる。

【００２４】溶離液の供給手段として、図示する例では
送液ポンプＰ3が用いられている。この送液ポンプＰ3は
ダブルプランジャーポンプが好適に用いられ、該ポンプ
Ｐ3に管路9,10が配設されている。管路9,10は合流し管
路11を経て上記バルブＶ2の通孔ｌに通じている。この
管路11を通じて溶離液ないし水が上記カラム８に導入さ
れる。

【００２５】上記バルブＶ2は、その回転によって試料
液の導入部Ａから樹脂充填カラム８を経て系外に通じる
管路と、該カラム８に溶離液を流して試薬添加部Ｂに導
く管路とが切替自在に形成されている。具体的には、上
記バルブＶ2は、予め通孔ｈとｇ、通孔ｋとｌが各々連
通されて樹脂充填カラム８に溶離液が供給されてカラム
が洗浄される。測定時には、バルブＶ2の回転によって
通孔ｈとｉ、通孔ｊとｋが各々連通され、管路29を通じ
て樹脂充填カラム８に試料液が導入される。試料液に含
まれている分子サイズの小さいタンパク質はカラム内の
樹脂に吸着される。上記カラム８を通過した試料液は管
路13を通じて系外に排出される。

【００２６】上記カラム８に試料液を通じた後、バルブ
Ｖ2はその回転により通孔ｇとｈ、通孔ｋとｌが連通さ
れ、管路11を通じて溶離液が上記カラム８に導入され
る。溶離液としては有機溶媒の水溶液を用いることがで
きる。具体的には、メタノールやエタノール等の低級ア
ルコール、アセトニトリルなどの水溶液を使用でき、こ
のうちアセトニトリルの溶離効果が高い。溶離液の濃度
は２０〜５０wt％が好ましい。濃度が低すぎるとタンパ
ク質の溶出が不十分であり、一方、濃度が高すぎるとカ
ラム内のあるいは溶出したタンパク質が沈殿して、試薬
との反応に支障をきたす。

【００２７】なお、樹脂充填カラム８に試料液ないし溶
離液を導入する際には、必要に応じて、予め上記管路を
切り替えてカラム内部のコンディショニングを行うこと
ができる。例えば、希硫酸液をカラム８に流してタンパ
ク質が吸着しやすいよう、あるいは試料中の金属が析出
しないようにカラム内を希硫酸で置換する。

【００２８】フィルター部Ｘを通過した分子サイズの小
さいタンパク質を含有する試料液は管路28を通じてカラ
ム吸着部Ｙに導き、液中のタンパク質をカラム８の樹脂
に吸着させて一時的に保持させる。カラム８を通過した
試料液は管路13を通じて系外に排出する。次いで、バル
ブＶ2を回転し管路を切り替え、溶離液管路11をカラム
８に連通し、溶離液をカラム８に導いて吸着されている
分子サイズの小さいタンパク質を溶離させ、溶離液と共
に管路12を通じて試料添加部Ｂに導く。その後、フィル
ター部ＸのバルブＶ3を回転して洗浄液管路31をフィル
ター34に連通させ、洗浄液をフィルター34に導いて捕集
されている分子ザイズの大きいタンパク質を洗い出し、
該タンパク質を含む洗浄液を管路30,29を通じてカラム
吸着部Ｙに導き、液中のタンパク質をカラム８の樹脂に
吸着させて保持させる。カラムを通過した液は管路13を
通じて系外に排出する。次いで上記と同様に、バルブＶ
2を回転し管路を切り替え、溶離液管路11をカラム８に
連通し、溶離液をカラム８に導いて吸着されている分子
サイズの大きいタンパク質を溶離させ、溶離液と共に管
路12を通じて試料添加部Ｂに導く。なお、洗浄液供給用
のポンプＰ6はフィルター34を洗浄する時のみ作動させ
る。分析するタンパク質濃度が低い場合は、フィルター
による分画樹脂への吸着を数回繰り返してタンパク質濃
度を濃縮させる。

【００２９】試薬添加部Ｂは試薬の供給手段を有し、図
示する例ではこの供給手段として送液ポンプＰ4が用い
られている。この送液ポンプＰ4にはダブルプランジャ
ーポンプが好適に用いられ、管路14,15が配設されてい
る。管路14,15は合流し管路16を経て管路12に通じてい
る。この管路16を通じて試薬が管路12を流れる溶出液に
供給される。試薬を添加された溶出液は管路12を通じて
反応部Ｃに導かれる。

【００３０】なお図示する例では、試薬の供給手段とし
てダブルプランジャーポンプを使用しているが、これは
試薬としてビシンコニン酸を用いる場合に特に有用であ
る。すなわち、ビシンコニン酸試薬はビシンコニン酸を
含む溶液(Ａ液)と銅を含む溶液(Ｂ液)とを混合してなる
ものであるが、その混合液の保存安定性が数時間と短
い。ダブルプランジャーポンプを用いればＡ液とＢ液を
各々の管路14,15を通じて送液し、管路16で混合させて
供給できるので好ましい。

【００３１】反応部Ｃは管路17がコイル状に形成された
部分であり、これにより反応時間が確保される。この部
分を上記溶出液が流れる間にタンパク質と試薬との反応
が進む。また、好ましくは、コイル状の管路17は反応槽
に収納され、槽内の温度が温度調整手段により４０〜８
０℃の温度に設定される。これより温度が低すぎると反
応が不十分になり、また温度が高すぎると試薬やタンパ
ク質の分解や銅の析出を生じるので好ましくない。反応
部Ｃを経た溶出液は検出部Ｄに導かれる。

【００３２】検出部Ｄは試薬と反応した液中のタンパク
質を検出する部分であり、例えば、フローセルを備えた
光検出器などが設けられている。具体的には、ビシンコ
ニン酸試薬を用いる場合には波長５６２nmの吸光度を測
定するもの、ビウレット試薬を用いる場合には波長６２
０nmの吸光度を測定するもの、フルオレサミン試薬を用
いる場合には励起波長３９０nm、蛍光波長４７５nmの蛍
光度を測定する検出器が用いられる。

【００３３】これらの吸光度ないし蛍光度はタンパク質
の濃度に比例しているので、測定した吸光度ないし蛍光
度に基づき、予め作成された検量線などからタンパク質
濃度が求められる。光検出器を通過した液は管路18を通
じて系外に排出される。

【００３４】本発明の分析装置は、好ましくは自動制御
手段を有する。すなわち、試料液の導入部に設けた各送
液ポンプおよび各バルブの回転手段、タンパク質分離手
段に設けた各バルブの回転手段および溶離液供給ポン
プ、試薬添加部に設けた試薬供給ポンプなどの各部分の
操作部、および反応部の温度調整手段、検出部の光検出
器の各動作を統一的に制御する自動制御手段が設けられ
ており、試料液の導入からタンパク質の定量に至る操作
が自動的に行われる。

【００３５】

【発明の効果】(イ)本発明の分析装置は、試料液が管路
を流れる間にタンパク質の分画と試薬の添加・反応およ
び定量分析が連続して行われる流れ分析装置であり、従
来、個々に手作業で行われていたタンパク質の分画と定
量分析をその分子サイズ毎に機械的にかつ連続的に行う
ことができ、手作業による測定誤差がなく測定精度が高
い。しかも分析時間を大幅に短縮できる。 (ロ)さらに、本発明の分析装置は自動化に適する。自動
化により分析時間を一層短縮でき、誤差要因もさらに少
なくなるので測定精度が向上する。 (ハ)特に、本発明の分析装置は、電解液やメッキ液など
の強酸性溶液に含まれる微量タンパク質の定量に適す
る。強酸性溶液に存在するタンパク質は分解ないし変質
しやすいので分析時間が長いと測定精度が大幅に低下す
る。本発明の分析装置はサンプリング後、直ちにリアル
タイムで分析することができるため、これらの液中のタ
ンパク質を高精度で定量することができる。 (ニ)また本発明の装置は、試料液中のタンパク質を分子
サイズに応じ分画してそれぞれ定量することができるの
で、電解液やメッキ液に添加するタンパク質の量をその
分子サイズに応じて把握することができ、添加すべきタ
ンパク質の最適な大きさと量を迅速に決定することがで
きる。また、フィルター部で捕集した分子サイズの大き
いタンパク質をカラム吸着部に導いて一時的に保持した
後に試薬添加部に導くので、試料液を複数回導入してカ
ラムへの吸着を繰り返すことにより、タンパク質濃度を
濃縮させた後に定量することができる。 (ホ)また、本発明の分析装置に用いられているフィルタ
ーや吸着樹脂は洗浄水の導入により洗浄して再生し、繰
り返し使用することができるので分析コストも低減でき
る。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、本発明はこれらの例に限定されない。

【００３７】実施例１ 図１に示す装置を用い、銅電解液(硫酸:1.5M、銅:40g/
l、ニッケル:20g/l)のゼラチンの定量分析を行なった。フィ
ルター部には孔径０.２μmのＰＴＦＥフィルターを用
い、樹脂充填カラムはチューブ(2mmφ×200mm:容量6.28
ml)に疎水性の無極性吸着樹脂(SM-2)を充填して形成し
た。また、試料液は1ml用い、キャリヤー液としては０.
０５Ｍ希硫酸、フィルターの洗浄水としては０.０５Ｍ
希硫酸を用い、タンパク質の溶離液として５０％アセト
ニトリル水溶液を使用した。試薬はビシンコニン酸試薬
を用い、波長562nmにおける吸光度を測定した。

【００３８】測定は次の手順で行った。先ず希硫酸液お
よび水を樹脂充填カラムに流して洗浄した後に、試料液
をサンプルループに導入して一定量(1ml)保持させ、次
に、希硫酸液をサンプルループに導いて上記試料液をフ
ィルターに送り込んだ。フィルターを通過した液はカラ
ム吸着部に導き、フィルターを通過したゼラチンをカラ
ムの樹脂に吸着させると共にカラムを通過した液を系外
に排出した。これを４回繰り返して合計４mlの試料液を
フィルター部に導入し、フィルターに捕集されるゼラチ
ン濃度を濃縮した。該フィルターおよびカラムを通過し
た液は系外に排出した。次いで、カラム吸着部のバルブ
を回転して管路を切り替え、カラムに溶離液を流し、溶
離したゼラチンを含む液を試薬添加部に導き、反応部を
経て分析部に導き、フィルター部を通過してカラムに吸
着された分子サイズの小さいゼラチンを定量した。引き
続き、フィルター部のバルブを回転して管路を切り替
え、フィルターに洗浄液を流して捕集されている分子サ
イズの大きいゼラチンを洗い出し、これをカラム吸着部
に導いてカラムの樹脂に吸着させた。この時、送液ポン
プＰ5を停止させ、キャリアーの流れを停止させる。次
に、カラム吸着部のバルブを回転して管路を切り替え、
カラムに溶離液を流して吸着されているゼラチンを溶出
させ、このゼラチンを含む液を試薬添加部に導き、反応
部を経て分析部に導入して、カラムに吸着された分子サ
イズの大きいゼラチンを定量した。なお、分子サイズの
大きいゼラチン、小さいゼラチンの濃縮回数はそれぞれ
の濃度に合わせて決定した。

【００３９】ゼラチンの定量は、上記電解液１mlに、ゼ
ラチンをおのおの０μg、２５μg、５０μg添加した試
料について、そのゼラチン濃度を測定して分画吸着率に
よる検出精度を求め、装置の信頼性を検証した。この結
果を表１に示した。表１に示すように、上記銅電解液中
のゼラチン濃度は４９μgであった。この電解液に上記
添加量のゼラチンを加えた試料のゼラチン検出濃度は、
追加したゼラチンを加えた合計量に見合うものであり、
従って、ゼラチンの分画と定量の精度は１００％に近
く、本装置の信頼性が高いことが実証された。

【００４０】

【表１】

【００４１】実施例２ 図１に示す装置を用い、実施例１と同様にして、２種類
の銅電解液について含まれる膠の分子サイズに応じた定
量分析を行なった。測定は各試料について３回行い、そ
の誤差を調べた。この結果を表２に示した。表２の結果
から明らかなように、膠の測定回数ごとの濃度は近似し
ており、本装置の信頼性が高いことが確認された。

【００４２】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の装置例を示す模式図。

【符号の説明】

Ａ−試料液導入部、Ａ1−送液手段、Ａ2−試料液導入手
段、Ｂ−試薬添加部、Ｃ−反応部、Ｄ−検出部、Ｅ−タ
ンパク質分離手段、Ｘ−フィルター部、Ｙ−カラム吸着
部、４−サンプルループ、８−樹脂充填カラム、フィル
ター−３４、Ｐ1〜Ｐ6−送液ポンプ、Ｖ1〜Ｖ4−バル
ブ、ａ〜ｗ−通孔

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/84 Ｇ０１Ｎ 30/84 Ａ 35/08 35/08 Ｃ (56)参考文献 特開 平２−69660（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−199944（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−134561（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−49299（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−211041（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−243626（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−23968（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−120607（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−68671（ＪＰ，Ａ) 特開2000−171452（ＪＰ，Ａ) 特開2000−171451（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/88 G01N 30/08 G01N 30/14 G01N 30/48 G01N 30/84 G01N 35/08

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料液の導入部、試薬添加部、反応部お
   よび検出部が測定管路によって順次一体に連通され、試
   料液が測定管路を流れる間に試薬との反応および分析が
   連続的に行なわれる流れ分析装置であって、試料液導入
   部にタンパク質を含有する試料液を一定量導入する手段
   を有し、さらに試料液導入部と試薬添加部との間に、タ
   ンパク質を分画して捕集する手段を有し、該分画捕集手
   段はタンパク質を分画するフィルター部と、分画された
   タンパク質を捕集するカラム吸着部および該フィルター
   部とカラム吸着部を通じる管路を有し、上記カラム吸着
   部はタンパク質を吸着する疎水性の無極性ないし中間極
   性の吸着樹脂を充填したカラムと、該カラムにタンパク
   質の溶離液を流して試薬添加部に導く管路と、タンパク
   質を分離した試料液を系外に導く管路とを有し、この溶
   離液用管路は該カラムのコンデショニング用管路を兼用
   し、かつ試料液の導入部から樹脂充填カラムを経て系外
   に通じる管路と、該カラムに溶離液を流して試薬添加部
   に導く管路とが切替自在に形成されており、試料液が上
   記フィルター部と上記カラム吸着部に導かれてタンパク
   質が分離された後に、該カラムに導入された溶離液によ
   って分離されたタンパク質が上記試薬添加部および上記
   反応部を経て検出部に導かれ、定量分析されることを特
   徴とするタンパク質の分析装置。
2. 【請求項２】上記フィルター部が切替バルブによって形
   成されており、該バルブは流路切替用の複数の通孔を有
   し、該通孔の一部の間にタンパク質を分画するフィルタ
   ーが設けられていると共に他の通孔の一部に洗浄用管路
   が接続されており、さらに該バルブは試料液導入部に通
   じる管路とカラム吸着部に通じる管路および洗浄用管路
   の各管路に対する上記通孔との接続部分が回動自在であ
   り、該バルブの回動により各通孔とこれらの管路との接
   続が切り替え自在に形成されている請求項１に記載する
   分析装置。
3. 【請求項３】上記フィルター部に孔径の異なる複数のフ
   ィルターが設けられており、各フィルターは管路の上流
   側から順にフィルター孔径の大きな順に配設されてお
   り、試料液がフィルター部を通過する間に段階的にタン
   パク質が分画される請求項１または２に記載する析装
   置。
4. 【請求項４】上記カラム吸着部が切替バルブによって形
   成されており、該バルブは流路切替用の複数の通孔を有
   し、該通孔の一部の間に分画されたタンパク質を吸着す
   る樹脂を充填したカラムが設けられていると共に他の通
   孔の一部に溶離液用管路が接続されており、さらに該バ
   ルブはフィルター部に通じる管路と試薬添加部に通じる
   管路および溶離液用管路の各管路に対する上記通孔との
   接続部分が回動自在であり、該バルブの回動により各通
   孔とこれらの管路との接続が切り替え自在に形成されて
   いる請求項１、２または３に記載する分析装置。
5. 【請求項５】ｐＨ１以下の強酸性の電解液またはメッキ
   液の微量タンパク質を定量する装置であり、疎水性吸着
   樹脂として耐酸性のスチレン−ジビニルベンゼン系無極
   性樹脂またはエステル系中間極性樹脂が用いられる請求
   項１〜４のいずれかに記載する分析装置。
6. 【請求項６】試料液の導入部、フィルター部、カラム吸
   着部、試薬添加部および反応部に設けられている送液手
   段と管路切替手段、検出部の操作手段を統一的に制御す
   る自動制御手段が設けられており、試料液の導入からタ
   ンパク質の分画定量に至る一連の操作が自動的に行われ
   る請求項１〜５のいずれかに記載する分析装置。