CN116068093A - 一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于物质检测领域，涉及一种在线固相萃取‑高效液相色谱联用的检测系统及检测方法。所述在线固相萃取‑高效液相色谱联用的检测系统包括固相萃取单元和高效液相色谱单元；固相萃取单元包括SPE六通阀、SPE四元泵和固相萃取柱；高效液相色谱单元包括进样器、HPLC六通阀、HPLC四元泵、DAD检测器、C₁₈色谱柱和FLD检测器。本发明基于固相萃取原理，针对高效液相色谱仪设计在线富集系统，通过合理的设计，使之能更好地简化操作，实现进样、萃取、富集与检测为一体，提高痕量化合物的检测灵敏度，满足痕量化合物的分析需求。

Description

一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统及检测方法

技术领域

本发明属于物质检测领域，具体涉及一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统及检测方法。

背景技术

液相色谱仪是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异对混合物进行先分离、后分析鉴定的仪器。由于高效液相色谱仪具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用、流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、医药研究、环境分析、无机分析、食品分析等各种领域，是生化分析最常用的仪器之一。然而，高效液相色谱仪的高分辨率和高灵敏度是建立在恰当的样品预处理基础上的。实际研究表明，痕量化合物的色谱峰强度弱且不稳定，很难直接通过高效液相色谱仪分离检测浓度为ng/L级别的化合物。对于痕量化合物的分离鉴定，通常需要在进行高效液相色谱分析之前，对痕量化合物进行浓缩富集的预处理，以使样品的浓度达到进行稳定的液相色谱分析的要求。对于生物医药和环境分析等领域而言，很多实际样品的浓度范围是在ng/L-μg/L之间，痕量物质的检测需求巨大。

为了准确地进行痕量物质检测，目前常用的做法是在液相色谱进样前，采用固相萃取小柱对样品进行手动浓缩富集，以使样品浓度达到稳定检测的要求。其中，固相萃取的过程包括活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，样品富集流程比较复杂，操作繁琐，而且样品在多个容器之间转移，容易造成损耗和二次污染。此外，固相萃取小柱为耗材，价格在800-2000元/盒(50个)之间。实际环境样品每次的采样量通常在几十至几百个左右，累计所需的固相萃取小柱费用可观。

发明内容

本发明旨在提供一种新的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统及检测方法，旨在有效解决痕量化合物分析检测过程中的预处理难题，提高实际样品中痕量化合物的分离鉴定准确度，同时简化流程，减少耗材使用量。

具体地，本发明提供了一种在线固相萃取-高效液相色谱联用(SPE-HPLC)的检测系统，其包括固相萃取单元和高效液相色谱单元；所述固相萃取单元包括SPE六通阀、SPE四元泵和固相萃取柱；所述高效液相色谱单元包括自动进样器、HPLC六通阀、HPLC四元泵、DAD检测器、C₁₈色谱柱和FLD检测器；所述HPLC四元泵与HPLC六通阀的1号口连通，所述自动进样器的出口与HPLC六通阀的4号口连通，所述HPLC六通阀的6号口与SPE六通阀的1号口连通，所述固相萃取柱的一端与SPE六通阀的6号口连通而另一端与SPE六通阀的3号口连通，所述SPE六通阀的2号口接入DAD检测器且5号口依次连接C₁₈色谱柱和FLD检测器。

在一种优选实施方式中，所述固相萃取柱中装填的填料为C₁₈。

在一种优选实施方式中，所述在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统能够对痕量样品和/或普通样品进行分析检测。

本发明还提供了一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，该方法在上述在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统中进行；

当待测样品为痕量样品时，将HPLC六通阀设置为旁路位置，待测样品从HPLC六通阀的4号口引入完成进样，再将HPLC六通阀切换至主路位置且将SPE六通阀设置为旁路位置，HPLC四元泵将流动相从HPLC六通阀的1号口引入以使HPLC六通阀中的待测样品进入固相萃取单元的固相萃取柱中实现富集，待富集完成之后，将SPE六通阀切换至主路位置，同时SPE四元泵将洗脱相引入SPE六通阀中，以将固相萃取柱中的待测样品冲洗下来，并依次进入C₁₈色谱柱和FLD检测器中进行分析检测；

当待测样品为普通样品时，将SPE六通阀的5号接头与6号接头互换位置，同时将HPLC六通阀和SPE六通阀均设置为旁路位置，待测样品从HPLC六通阀的4号口引入完成进样，再将HPLC六通阀切换至主路位置，HPLC四元泵将流动相引入HPLC六通阀中，并依次进入C₁₈色谱柱和FLD检测器中进行分析检测；

所述HPLC六通阀以及SPE六通阀的主路位置是指阀门的连通位置为端口1-2、3-4、5-6连通；所述HPLC六通阀以及SPE六通阀的旁路位置是阀门的连通位置为端口1-6、2-3、4-5连通。

在一种优选实施方式中，所述SPE六通阀进样器从旁路位置切换至主路位置的时间t按照以下方法确定：从SPE六通阀的主路位置和旁路位置分别引入相同的待测样品，将从DAD检测器检测到的出峰时间分别记为t1和t2，则t＝t2-t1。

在一种优选实施方式中，所述痕量样品中目标物质的浓度＜0.01％；所述普通样品中目标物质的浓度≥0.01％。

在一种优选实施方式中，当待测样品为痕量萘样品时，所述HPLC四元泵和SPE四元泵的流量各自独立地设置为0.1-1mL/min。

在一种优选实施方式中，当待测样品为痕量萘样品时，以乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱，0-1min使用100％的水相，1-5min乙腈比例逐渐上升，第5min时乙腈的体积占比控制在50％。

在一种优选实施方式中，当待测样品为痕量萘样品时，以乙腈和水作为洗脱相进行梯度洗脱，0-5min时乙腈的体积占比为30％，5-15min乙腈体积占比从30％缓慢升至100％。

在一种优选实施方式中，当待测样品为痕量萘样品时，所述DAD检测器的波长设为230nm，峰宽设为10Hz；所述FLD检测器的激发波长设为275nm，发射波长设为340nm，峰宽设为18.52Hz。

本发明的有益效果：本发明基于固相萃取原理，针对高效液相色谱仪设计在线富集系统，通过合理的设计，使之能更好地简化操作，实现进样、萃取、富集与检测为一体，提高痕量化合物的检测灵敏度，满足痕量化合物的分析需求。

附图说明

图1为SPE-HPLC检测系统的结构示意图；

图2为常规的高效液相色谱的旁路位置(进样位置)示意图；

图3为常规的高效液相色谱的主路位置(分析位置)示意图；

图4为采用SPE-HPLC检测系统分析痕量样品时的进样位置示意图；

图5为采用SPE-HPLC检测系统分析痕量样品时的富集位置示意图；

图6为采用SPE-HPLC检测系统分析痕量样品时的分析位置示意图；

图7为采用SPE-HPLC检测系统分析普通样品时的进样位置示意图；

图8为采用SPE-HPLC检测系统分析普通样品时的分析位置示意图。

具体实施方式

本发明提供的SPE-HPLC检测系统由固相萃取单元和高效液相色谱单元串联而成，其在原有的HPLC系统基础上新增了固相萃取单元。其中，固相萃取单元包括六通阀、四元泵和固相萃取柱。如图1所示，高效液相色谱单元保持现有仪器配置不变，改动自动进样器到液相色谱柱的进样流路，增加流经在线固相萃取预处理单元的旁路，通过阀门控制进样，对样品进行选择性的在线富集预处理，达到富集、净化的目的。具体地，将原来连接HPLC色谱柱入口的接头断开，移至SPE六通阀的1号口，SPE六通阀的6号口连接新的固相萃取柱，固相萃取柱另一端接入SPE六通阀的3号口，可以进行样品的固相萃取。SPE六通阀的2号口接入DAD检测器再进废液，SPE六通阀的5号口依次接入C₁₈色谱柱和FLD检测器，最后进废液。此时形成一个完整的流路。

常规的高效液相色谱(HPLC)包括自动进样器、六通阀、四元泵、DAD检测器、C₁₈色谱柱和FLD检测器，一般还包括柱温箱和中央控制单元。在自动进样器进样时将六通阀设置在旁路位置(图2)，此时阀门上1-6、2-3、4-5位置连通，会从阀门4号口自动抽取定量样品于六通阀的定量环中；完成进样之后进入样品分析阶段，将六通阀调整为主路位置(图3)，此时阀门上1-2、3-4、5-6位置连通，来自四元泵的流动相会从阀门1号口流入，经2号口、5号口、6号口，将六通阀的定量环中的样品带入色谱柱分离后进入检测器检测。

本发明提供的在线SPE-HPLC检测系统的基本工作原理为：样品通过自动进样器取样，定量环定量后首先被引入固相萃取单元新增的六通阀，需要进行富集预处理的痕量样品进入固相萃取单元，通过HPLC四元泵将待测样品导入固相萃取柱中，经过浓缩富集后，再进入高效液相色谱单元进行分离检测，可以同时达到富集、净化的作用；不需要进行浓缩富集处理的普通样品通过固相萃取单元的阀门后则不经过固相萃取柱直接进入高效液相色谱单元进行后续的分离鉴定。

在本发明中，为了将固相萃取单元和高效液相色谱单元中相同的组件进行区别以便于描述，将固相萃取单元中的六通阀称为“SPE六通阀”，将高效液相色谱单元中的六通阀称为“HPLC六通阀”，将固相萃取单元中的四元泵称为“SPE四元泵”，将高效液相色谱单元中的四元泵称为“HPLC四元泵”。

在本发明中，HPLC六通阀以及SPE六通阀的主路位置，阀门的连通位置为端口1-2、3-4、5-6连通；HPLC六通阀以及SPE六通阀的旁路位置，阀门的连通位置为端口1-6、2-3、4-5连通。

当对待测样品进行分析检测时，痕量样品(浓度＜0.01％)和普通样品(浓度≥0.01％)所经过的不同检测流路可通过改变固相萃取单元新增的六通阀的接口和阀门切换实现，具体实现路径详述如下：

对于痕量样品，先富集再分析，具体操作如下：HPLC的六通阀进行常规运转，自动进样器完成样品抽取、进样后，HPLC的六通阀由进样位置(如图4所示)切换为富集位置(如图5所示)，而SPE单元新增的六通阀则设置为旁路位置，即阀门上端口1-6、2-3、4-5位置连通。原本从HPLC六通阀进入C₁₈色谱柱的样品不再进入C₁₈色谱柱，而是进入固相萃取单元中SPE六通阀的1号口，再从6号口出进入固相萃取柱，待测样品富集在固相萃取柱上，而杂质随流动相流出进入3号口经2号口流入废液，在2号口的出口位置加入一个DAD检测器，可以直观地观察到有无待测样品在富集期间流出，以确保检测的准确性。与此同时，SPE四元泵(分析泵)将洗脱相输送进入4号口，经5号口出流入高效液相色谱单元的C₁₈色谱柱、FLD检测器，最后进废液，可以观察到色谱柱是否有残余污染。此时DAD检测器和FLD检测器均应无待测样品峰出现。在DAD检测出样品前，将SPE六通阀切换至如图6所示的主路位置，此时阀门上端口1-2、3-4、5-6位置连通。分析泵将洗脱相输送进入4号口，由3号出进入固相萃取柱，将富集在固相萃取柱上的待测样品冲洗下来，随洗脱相经6号口、5号口进入C₁₈色谱柱再进入FLD检测器进行分析。

SPE六通阀的切阀时间需要在实验前期进行摸索，具体方法如下：先不切阀，在SPE六通阀的主路位置(如图6中SPE六通阀所示)和SPE六通阀的旁路位置(如图4和图5中SPE六通阀所示)分别进一次相同的标样。在SPE六通阀的主路位置，样品不会流经固相萃取柱，而是直接进入DAD检测器后排出，此时得出待测样品的出峰时间t1。在SPE六通阀的旁路位置，样品先进入固相萃取柱富集以后再进入DAD检测器，得到待测样品先富集后洗脱出峰的出峰时间t2。t2-t1即为阀门切换时间t。在后续检测过程中使用该方法时，需要在t时间之内完成切阀，否则样品将会在富集之后被持续的流动相洗脱流出固相萃取柱，造成样品损失，影响检测结果。不同待测样品因其性能不同会有不同的切阀时间，同一待测样品也因富集洗脱方法设置不同会有不同的切阀时间，因此检测前需要采用此方法摸索特定物质的切阀时间。

对于一般浓度的普通样品，可不经富集直接检测分析。如图7和图8所示，此时，需要改变固相萃取单元中SPE六通阀的接口位置，只需将SPE六通阀的6号接头与5号接头互换位置即可(也即，互换位置之后，5号接头与固相萃取柱连通，而6号接头依次接入C₁₈色谱柱和FLD检测器)，同时将SPE六通阀设置为旁路位置，即阀门上端口1-6、2-3、4-5位置连通。HPLC六通阀进行常规运转，自动进样器完成样品抽取、进样后，HPLC六通阀由进样位置(如图7所示)切换为分析位置(如图8所示)，HPLC四元泵(富集泵)将样品送入固相萃取单元中SPE六通阀的1号口，经6号口出进入C₁₈色谱柱和FLD检测器进行后续分析。而此时分析泵不参与物质检测，分析泵带来的洗脱相进入4号口经5号口出，进入固相萃取柱，再进入3号口经2号口出流入废液，完全不影响常规HPLC分析。样品检测分析过程和常规HPLC一致，此过程SPE六通阀无需切阀，保持SPE六通阀处于旁路位置即可。

在一种具体实施方式中，所述在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法包括以下步骤：

(1)准备流动相：根据待测样品准备对应的流动相和洗脱相，其中，水相置于棕色瓶中并每日进行更换以避免系统污染，有机相可每周进行更换与补充，确保流动相和洗脱相干净且足量。

(2)创建固相萃取、液相色谱分析方法：按照不同样品需求设置合适的流动相和洗脱相比例。泵流量一般可设置为0.1-1mL/min，停止时间根据具体样品的实际洗脱时间确定，并且加上一定时间的后运行使管路达到下次进样的环境条件，压力低于泵的最高压力，梯度洗脱模式。闲置泵可以设置低流速如0.1mL/min，亦可将其流速设为0mL/min。进样量1-100μL，洗针模式3s，进样器停止时间与泵一致。柱温箱温度设置为25-40℃。检测波长设在化合物的最大吸收波长处，且大于溶剂的截止波长20nm以上，峰宽10-20Hz，全波段扫描。

(3)仪器平衡：HPLC六通阀处于主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，SPE六通阀处于旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)，流动相和洗脱相通过整体流路以获得富集、检测需要的稳定基线，流速为0.3mL/min。压力上下浮动不超过2bar。

(4)富集、检测：样品用0.45μm玻璃纤维滤头进行过滤。运行采集序列，HPLC六通阀设置为旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)，吸取定量样品，而后HPLC六通阀自动切换至主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，此前SPE六通阀一直处于旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)，样品直接进入固相萃取柱，停留时间和预先摸索的切阀时间一致；根据预先摸索确定的切阀时间，采用切阀功能切换SPE六通阀到主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，样品进入FLD检测器进行检测，运行结束将阀切换到运行开始位置。

(5)仪器清理：运行结束进行系统冲洗。先以水相:有机相(V:V)＝8:2的配比进行冲洗，再逐渐过渡到水相:有机相(V:V)＝2:8冲洗，冲洗量不少于20倍柱体积。清理完毕，关闭仪器。

(6)数据处理：调用数据，新建3D/UV定量数据处理方法，保存、选择存储路径并命名。选中结果集关联方法，对样品峰进行积分。于色谱图界面，采用积分功能独立样品峰，点击重新处理全部。将峰作为化合物添加到方法。于处理方法模块设置浓度单位、标准样品浓度、识别区间。于进样序列模块将样品类型改为标准样品，录入相应的样品级别，将样品需清除所有校正，重新处理全部，即可得到标准曲线。选中数据再次关联方法即可利用标准曲线求出样品的浓度。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例

(1)摸索萘的切阀时间：

SPE六通阀的切阀时间需要在实验前期进行摸索，具体方法如下：先不切阀，在SPE六通阀的主路位置(如图6中SPE六通阀所示)和SPE六通阀的旁路位置(如图4和图5中SPE六通阀所示)分别进一次相同的标样。在SPE六通阀的主路位置，样品不会流经固相萃取柱，而是直接进入DAD检测器后排出，此时得出待测样品的出峰时间t1＝0.1min。在SPE六通阀的旁路位置，样品先进入固相萃取柱富集以后再进入DAD检测器，得到待测样品先富集后洗脱出峰的出峰时间t2＝5.8min。t2-t1即为阀门切换时间t＝5.7min。在后续检测过程中使用该方法时，需要在t时间之内完成切阀，否则样品将会在富集之后被持续的流动相洗脱流出固相萃取柱，造成样品损失，影响检测结果。因此本实施例选取5min作为切阀时间。

(2)萘富集检测方法：

以500ng/L萘作为待测物质，进样量为100μL，柱温箱为30℃，HPLC六通阀的初始位置为主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，SPE六通阀的初始位置为旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)，如图5所示。开始运行后，HPLC六通阀自动切换至旁路位置开始取样、进样，流路如图4所示。进完样后，HPLC六通阀自动切换至主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，HPLC系统自动切阀的同时开始计时，此时泵开始按照设置的梯度洗脱工作，SPE六通阀的位置保持不变，流路如图5所示。SPE四元泵(富集泵)和HPLC四元泵(分析泵)均采用乙腈和纯水作为流动相进行梯度洗脱。富集泵流量设为0.6mL/min，梯度设置如下：0-1min使用100％的水相将萘富集在固相萃取柱上，1-5min时乙腈比例逐渐上升，到第5min时乙腈体积占比为50％，有机相比例逐渐升高以便之后更好地洗脱萘，但是不能超过5min，根据之前的切阀说明，在此方法下如果继续洗脱，萘将会被洗脱下来。此时，分析泵对检测没有影响，但为了之后与洗脱萘有较好的衔接，需要确保流路和色谱柱里有一定的有机相且需要和洗脱萘初始的有机相比例一致。因此，分析泵流量设为0.4mL/min，在0-5min时乙腈体积占比为30％。5min时切阀，将SPE六通阀切换至主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，流路如图6所示，分析泵洗脱相的梯度在5-15min的时间内将乙腈的体积占比从30％缓慢升至100％。此时的富集泵对萘分析没有影响，可以在5.1min时将水相设为100％，使管路达到下次进样的环境并且减少了有机相的使用。DAD检测器的波长设为230nm，峰宽设为10Hz；FLD检测器的激发波长设为275nm，发射波长设为340nm，峰宽设为18.52Hz。在12.669min时可以用FLD检测到萘出峰，全过程中DAD检测器均应检测不到萘出峰，否则则检测结果有误。15min检测完成后SPE六通阀根据设置的程序切回初始位置。最后根据程序设置需进行5min后运行，使SPE-HPLC整体流路达到下次测相同样品的环境。

(3)萘不富集检测方法：

此过程中，SPE六通阀一直保持旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)，分析泵不参与萘的检测工作，因此可以将其以低流速0.1mL/min流入30％的乙腈或者将流速直接设为0mL/min。以500ng/L萘作为待测物质，进样量为10μL，柱温箱、检测器参数设置与上述萘富集检测方法一致，HPLC六通阀的初始位置为主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，如图8所示。开始运行后，HPLC六通阀自动切换至旁路位置(端口1-6、2-3、4-5位置连通)开始取样、进样，流路如图7所示。进完样后，HPLC六通阀自动切换至主路位置(端口1-2、3-4、5-6位置连通)，HPLC系统自动切阀的同时开始计时，泵按照设置的梯度洗脱开始工作，流路如图8所示。富集泵的流动相用15min从30％的乙腈缓慢上升到100％的乙腈，直接将样品环内的待测样品萘经过SPE六通阀的1-6通道带至C₁₈色谱柱再进入FLD检测器检测。在8.487min时可以用FLD检测到萘出峰。最后根据程序设置需进行5min后运行，使SPE-HPLC整体流路达到下次测相同样品的环境。

当天试验结束后，需用一定量的有机相冲洗管路，管路中留有一定的有机相，起到保护设备的作用。

(4)结果对比：

在测样品之前，先测一组不同浓度的萘样品，根据浓度不同导致的不同峰高，确定萘的出峰时间，本实施例以实验室配置的萘样品(1、10、20、40、80μg/L)进样100μL，经富集测得了对应的曲线，确定了在本实施例条件下的萘出峰时间为12.669min。再用500ng/L待测样品萘进样100μL，经上述方法测得待测样品萘的出峰时间12.671min、峰面积18.187、信噪比847.36240。

为了与常规HPLC仪器进行对比，本实施例以实验室配置的萘样品(250、500μg/L)进样10μL，寻找常规HPLC在本实施例条件下的萘出峰时间，常规HPLC仪器在此方法下的萘出峰时间为8.487min。采用500ng/L的相同浓度待测样品萘进样100μL。测得进样100μL时出峰时间8.532min、峰面积1.514、信噪比28.76630。

由此可见，本发明提供的SPE-HPLC系统能够检测出ng/L级别的萘样品，检出限远高于常规HPLC仪器，灵敏度是HPLC的29倍，达到开发本仪器设备固相萃取单元的目的。对于其他物质，本发明也可以采取相同的方法操作，以提高其检测灵敏度。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统，其特征在于，包括固相萃取单元和高效液相色谱单元；

所述固相萃取单元包括SPE六通阀、SPE四元泵和固相萃取柱；

所述高效液相色谱单元包括自动进样器、HPLC六通阀、HPLC四元泵、DAD检测器、C₁₈色谱柱和FLD检测器；

所述HPLC四元泵与HPLC六通阀的1号口连通，所述自动进样器的出口与HPLC六通阀的4号口连通，所述HPLC六通阀的6号口与SPE六通阀的1号口连通，所述固相萃取柱的一端与SPE六通阀的6号口连通而另一端与SPE六通阀的3号口连通，所述SPE六通阀的2号口接入DAD检测器且5号口依次连接C₁₈色谱柱和FLD检测器。

2.根据权利要求1所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统，其特征在于，所述固相萃取柱中装填的填料为C₁₈。

3.根据权利要求1所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统，其特征在于，所述在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统能够对痕量样品和/或普通样品进行分析检测。

4.一种在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，该方法在权利要求1所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测系统中进行；

当待测样品为痕量样品时，将HPLC六通阀设置为旁路位置，待测样品从HPLC六通阀的4号口引入完成进样，再将HPLC六通阀切换至主路位置且将SPE六通阀设置为旁路位置，HPLC四元泵将流动相从HPLC六通阀的1号口引入以使HPLC六通阀中的待测样品进入固相萃取单元的固相萃取柱中实现富集，待富集完成之后，将SPE六通阀切换至主路位置，同时SPE四元泵将洗脱相引入SPE六通阀中，以将固相萃取柱中的待测样品冲洗下来，并依次进入C₁₈色谱柱和FLD检测器中进行分析检测；

当待测样品为普通样品时，将SPE六通阀的5号接头与6号接头互换位置，同时将HPLC六通阀和SPE六通阀均设置为旁路位置，待测样品从HPLC六通阀的4号口引入完成进样，再将HPLC六通阀切换至主路位置，HPLC四元泵将流动相引入HPLC六通阀中，并依次进入C₁₈色谱柱和FLD检测器中进行分析检测；

所述HPLC六通阀以及SPE六通阀的主路位置是指阀门的连通位置为端口1-2、3-4、5-6连通；所述HPLC六通阀以及SPE六通阀的旁路位置是阀门的连通位置为端口1-6、2-3、4-5连通。

5.根据权利要求4所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，所述SPE六通阀进样器从旁路位置切换至主路位置的时间t按照以下方法确定：从SPE六通阀的主路位置和旁路位置分别引入相同的待测样品，将从DAD检测器检测到的出峰时间分别记为t1和t2，则t＝t2-t1。

6.根据权利要求4所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，所述痕量样品中目标物质的浓度＜0.01％；所述普通样品中目标物质的浓度≥0.01％。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，当待测样品为痕量萘样品时，所述HPLC四元泵和SPE四元泵的流量各自独立地设置为0.1-1mL/min。

8.根据权利要求4-6中任意一项所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，当待测样品为痕量萘样品时，以乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱，0-1min使用100％的水相，1-5min乙腈比例逐渐上升，第5min时乙腈的体积占比控制在50％。

9.根据权利要求4-6中任意一项所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，当待测样品为痕量萘样品时，以乙腈和水作为洗脱相进行梯度洗脱，0-5min时乙腈的体积占比为30％，5-15min乙腈体积占比从30％缓慢升至100％。

10.根据权利要求4-6中任意一项所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，其特征在于，当待测样品为痕量萘样品时，所述DAD检测器的波长设为230nm，峰宽设为10Hz；所述FLD检测器的激发波长设为275nm，发射波长设为340nm，峰宽设为18.52Hz。

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