JP3414287B2 - タンパク質の分析方法 - Google Patents
タンパク質の分析方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液中のタンパク質
を簡便に精度良く分析する方法に関し、特に電解液また
はメッキ液中に含まれる膠やゼラチンなどの微量タンパ
ク質の定量分析に適する方法に関する。
を簡便に精度良く分析する方法に関し、特に電解液また
はメッキ液中に含まれる膠やゼラチンなどの微量タンパ
ク質の定量分析に適する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】電解液またはメッキ液中には、電着にお
ける光沢化やメッキ層の硬化、面の平滑化などの種々の
目的に応じて添加剤が加えられる。添加剤としては、電
解製錬では膠が、メッキではゼラチンがしばしば用いら
れているが、その濃度を一定の範囲内に保つことが品質
管理上極めて重要である。例えば、膠は電着面の平滑化
するために用いられるが、濃度が過剰になると分極を著
しく高め、ビスマス等の不純物が析出しやすくなるなど
の問題がある。
ける光沢化やメッキ層の硬化、面の平滑化などの種々の
目的に応じて添加剤が加えられる。添加剤としては、電
解製錬では膠が、メッキではゼラチンがしばしば用いら
れているが、その濃度を一定の範囲内に保つことが品質
管理上極めて重要である。例えば、膠は電着面の平滑化
するために用いられるが、濃度が過剰になると分極を著
しく高め、ビスマス等の不純物が析出しやすくなるなど
の問題がある。
【０００３】しかし、一般に知られているタンパク質の
分析法は、弱酸性から弱アルカリ性の条件下で行われる
ものが多く、電解液やメッキ液などのｐＨが１以下であ
るような強酸性の試料溶液に適用できる例は少ない。従
来、電解液やメッキ液などに含まれる膠やゼラチンなど
のタンパク質は、電位差滴定法やケルダール蒸留法など
により測定されているが、いずれも特殊な装置が必要で
ある上、操作が煩雑であった。また、ケルダール蒸留法
は膠をアンモニア態窒素に分解してから測定を行なうも
のであるが、電解液中にはタンパク質以外の窒素化合物
が含まれる場合が多く、正確な測定を困難にしている。
分析法は、弱酸性から弱アルカリ性の条件下で行われる
ものが多く、電解液やメッキ液などのｐＨが１以下であ
るような強酸性の試料溶液に適用できる例は少ない。従
来、電解液やメッキ液などに含まれる膠やゼラチンなど
のタンパク質は、電位差滴定法やケルダール蒸留法など
により測定されているが、いずれも特殊な装置が必要で
ある上、操作が煩雑であった。また、ケルダール蒸留法
は膠をアンモニア態窒素に分解してから測定を行なうも
のであるが、電解液中にはタンパク質以外の窒素化合物
が含まれる場合が多く、正確な測定を困難にしている。
【０００４】この他に、強酸性溶液中のゼラチン・膠定
量法として、ゼラチンまたは膠をメンブランフィルター
に捕集して特定の試薬(アミドブラック１０Ｂ色素)と結
合させ、過剰の色素を洗浄した後、色素を溶出してゼラ
チン等を検出する方法（特開平2-69660号公報）、ある
いはゼラチン等を捕集したフィルターを乾燥させ反射率
を利用して検出する方法（特開平6-337247号公報）など
が報告されている。しかし、これらの方法は膠の捕集量
がフィルターの孔径に著しく左右されると云う問題があ
る。またフィルターの捕集に濾過装置を必要とし、操作
も煩雑であり、しかもフィルターが使い捨てであるため
分析コストが嵩む等の問題がある。
量法として、ゼラチンまたは膠をメンブランフィルター
に捕集して特定の試薬(アミドブラック１０Ｂ色素)と結
合させ、過剰の色素を洗浄した後、色素を溶出してゼラ
チン等を検出する方法（特開平2-69660号公報）、ある
いはゼラチン等を捕集したフィルターを乾燥させ反射率
を利用して検出する方法（特開平6-337247号公報）など
が報告されている。しかし、これらの方法は膠の捕集量
がフィルターの孔径に著しく左右されると云う問題があ
る。またフィルターの捕集に濾過装置を必要とし、操作
も煩雑であり、しかもフィルターが使い捨てであるため
分析コストが嵩む等の問題がある。
【０００５】
【発明の解決課題】本発明は、従来のタンパク質測定方
法における上記問題を解決したものであって、強酸性の
溶液でも、液中のゼラチンや膠などのタンパク質を容易
に定量することができる分析方法を提供するものであ
る。
法における上記問題を解決したものであって、強酸性の
溶液でも、液中のゼラチンや膠などのタンパク質を容易
に定量することができる分析方法を提供するものであ
る。
【０００６】
【課題の解決手段】本発明は、酸や有機溶媒に耐性を有
する疎水性吸着樹脂を用い、該樹脂を利用してタンパク
質の吸着・溶離を行うことにより、従来のフィルターを
用いる方法よりも信頼性が高く、しかも操作の容易な測
定方法を完成させたものである。
する疎水性吸着樹脂を用い、該樹脂を利用してタンパク
質の吸着・溶離を行うことにより、従来のフィルターを
用いる方法よりも信頼性が高く、しかも操作の容易な測
定方法を完成させたものである。
【０００７】すなわち、本発明は以下の構成を有するタ
ンパク質分析方法に関する。 （１）試料液が管路を流れる間に、試薬の添加と反応お
よび分析が連続して行われる流れ分析方法に基づいた電
解液ないしメッキ液のタンパク質定量方法であって、疎
水性吸着樹脂を充填したカラムに少量の酸、水または緩
衝液を通液してカラム内を洗浄した後に、試料液をカラ
ムに通液して液中に含まれるタンパク質を上記樹脂に吸
着させ、次いで、カラムに希硫酸を通液して残留金属イ
オンを除去し、カラム内のｐＨを調整した後に、該カラ
ムに溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶出液が
管路を流れる間に分析試薬を添加し反応させて検出部に
導き、タンパク質を定量分析することを特徴とするタン
パク質の分析方法。 （２）疎水性吸着樹脂が無極性樹脂または中間極性樹脂
である上記(1)に記載する分析方法。 （３）試料液がｐＨ１以下の強酸性であり、耐酸性の疎
水性吸着樹脂を用いる上記(1)または(2)に記載する分析
方法。 （４）試料液が膠ないしゼラチンを含む電解液またはメ
ッキ液である上記(1)、(2)または(3)に記載する分析方
法。 （５）上記(1)〜(4)の何れかに記載する流れ分析方法に
おいて、管路を切り替えることにより一定量の試料液と
溶離液とを交互に樹脂充填カラムに通液してタンパク質
の定量を連続的に行う分析方法。
ンパク質分析方法に関する。 （１）試料液が管路を流れる間に、試薬の添加と反応お
よび分析が連続して行われる流れ分析方法に基づいた電
解液ないしメッキ液のタンパク質定量方法であって、疎
水性吸着樹脂を充填したカラムに少量の酸、水または緩
衝液を通液してカラム内を洗浄した後に、試料液をカラ
ムに通液して液中に含まれるタンパク質を上記樹脂に吸
着させ、次いで、カラムに希硫酸を通液して残留金属イ
オンを除去し、カラム内のｐＨを調整した後に、該カラ
ムに溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶出液が
管路を流れる間に分析試薬を添加し反応させて検出部に
導き、タンパク質を定量分析することを特徴とするタン
パク質の分析方法。 （２）疎水性吸着樹脂が無極性樹脂または中間極性樹脂
である上記(1)に記載する分析方法。 （３）試料液がｐＨ１以下の強酸性であり、耐酸性の疎
水性吸着樹脂を用いる上記(1)または(2)に記載する分析
方法。 （４）試料液が膠ないしゼラチンを含む電解液またはメ
ッキ液である上記(1)、(2)または(3)に記載する分析方
法。 （５）上記(1)〜(4)の何れかに記載する流れ分析方法に
おいて、管路を切り替えることにより一定量の試料液と
溶離液とを交互に樹脂充填カラムに通液してタンパク質
の定量を連続的に行う分析方法。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明の分析方法は、疎水性吸着
樹脂を充填したカラムに、タンパク質を含む試料液を通
液して該樹脂にタンパク質を吸着させ、次いで該カラム
に溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶出液に分
析試薬を添加してタンパク質を定量分析することを特徴
とする方法である。
樹脂を充填したカラムに、タンパク質を含む試料液を通
液して該樹脂にタンパク質を吸着させ、次いで該カラム
に溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶出液に分
析試薬を添加してタンパク質を定量分析することを特徴
とする方法である。
【０００９】本発明において用いる疎水性吸着樹脂はタ
ンパク質に対して吸着性を有する樹脂であり、タンパク
質と樹脂の相互の疎水性作用によってタンパク質が樹脂
に吸着される。一般に、この疎水性吸着樹脂は酸や有機
溶媒に対して耐久性があり、比較的高い酸性の試料液に
ついても使用できる。この疎水性吸着樹脂を充填したカ
ラムを用いることにより、タンパク質の吸着・溶出手段
を簡便に形成することができ、また、その再生も容易で
ある。
ンパク質に対して吸着性を有する樹脂であり、タンパク
質と樹脂の相互の疎水性作用によってタンパク質が樹脂
に吸着される。一般に、この疎水性吸着樹脂は酸や有機
溶媒に対して耐久性があり、比較的高い酸性の試料液に
ついても使用できる。この疎水性吸着樹脂を充填したカ
ラムを用いることにより、タンパク質の吸着・溶出手段
を簡便に形成することができ、また、その再生も容易で
ある。
【００１０】この疎水性吸着樹脂は無極性樹脂あるいは
中間極性樹脂が好ましい。無極性樹脂の例としてはスチ
レン−ジビニルベンゼン系樹脂などが挙げられ、中間極
性樹脂の例としてはアシル化エステル系樹脂などのエス
テル系樹脂が挙げられる。後述の実施例に示すように、
これらの無極性樹脂および中間極性樹脂はイオン交換樹
脂よりもタンパク質の回収率が高い。
中間極性樹脂が好ましい。無極性樹脂の例としてはスチ
レン−ジビニルベンゼン系樹脂などが挙げられ、中間極
性樹脂の例としてはアシル化エステル系樹脂などのエス
テル系樹脂が挙げられる。後述の実施例に示すように、
これらの無極性樹脂および中間極性樹脂はイオン交換樹
脂よりもタンパク質の回収率が高い。
【００１１】本発明の分析方法は、タンパク質を含有す
る試料液を上記疎水性吸着樹脂を充填したカラムに通液
してタンパク質を上記樹脂に吸着させる。ここで、上記
樹脂に試料液を通液する前に、カラムのコンディショニ
ングを行なうと良い。コンディショニングにより、タン
パク質の吸着や不要な親水性物質の溶離を安定して行な
うことができる。コンディショニングは、例えばカラム
に少量の酸や水、あるいは緩衝液などを通液して行う。
る試料液を上記疎水性吸着樹脂を充填したカラムに通液
してタンパク質を上記樹脂に吸着させる。ここで、上記
樹脂に試料液を通液する前に、カラムのコンディショニ
ングを行なうと良い。コンディショニングにより、タン
パク質の吸着や不要な親水性物質の溶離を安定して行な
うことができる。コンディショニングは、例えばカラム
に少量の酸や水、あるいは緩衝液などを通液して行う。
【００１２】具体的には、カラム内の樹脂に多量の金属
イオン等が残留している場合には、試料液を通液する前
に、カラムに希硫酸等を通液し、金属イオン等を希硫酸
等によって溶出除去する。また、カラム中に強酸性溶液
が残留している場合には、試料液を通液する前に、カラ
ムに水などを通液してカラムを洗浄し、内部の酸を除去
してｐＨを整える。なお、カラム内部がアルカリ性のと
きにはこれを緩和ないし中和する緩衝液や水を通液して
カラム内部を洗浄すれば良い。
イオン等が残留している場合には、試料液を通液する前
に、カラムに希硫酸等を通液し、金属イオン等を希硫酸
等によって溶出除去する。また、カラム中に強酸性溶液
が残留している場合には、試料液を通液する前に、カラ
ムに水などを通液してカラムを洗浄し、内部の酸を除去
してｐＨを整える。なお、カラム内部がアルカリ性のと
きにはこれを緩和ないし中和する緩衝液や水を通液して
カラム内部を洗浄すれば良い。
【００１３】また、試料液を通液してタンパク質を樹脂
に吸着させた後、このタンパク質を樹脂から溶出させる
際、必要に応じて洗浄を行う。例えば、タンパク質と共
に多量の金属イオンを含有する試料液をカラムに通液し
た後は、タンパク質の溶離に先立ち、カラムに希硫酸等
を通液して残留する金属イオンを除去し、さらにｐＨが
低すぎる場合は、水を流してカラム内の酸を除去し、ｐ
Ｈを整える。その後、溶離液をカラムに通液して上記樹
脂に吸着したタンパク質を溶出させる。
に吸着させた後、このタンパク質を樹脂から溶出させる
際、必要に応じて洗浄を行う。例えば、タンパク質と共
に多量の金属イオンを含有する試料液をカラムに通液し
た後は、タンパク質の溶離に先立ち、カラムに希硫酸等
を通液して残留する金属イオンを除去し、さらにｐＨが
低すぎる場合は、水を流してカラム内の酸を除去し、ｐ
Ｈを整える。その後、溶離液をカラムに通液して上記樹
脂に吸着したタンパク質を溶出させる。
【００１４】溶離液としては有機溶媒の水溶液を用いる
ことができる。具体的には、メタノール、エタノールな
どの低級アルコール、アセトニトリルなどの水溶液を使
用できる。有機溶媒の濃度は２０〜５０wt％が好まし
い。濃度が低すぎるとタンパク質の溶出が不十分であ
り、一方、濃度が高すぎるとカラム内のあるいは溶出し
たタンパク質が沈殿して、試薬との反応に支障をきた
す。
ことができる。具体的には、メタノール、エタノールな
どの低級アルコール、アセトニトリルなどの水溶液を使
用できる。有機溶媒の濃度は２０〜５０wt％が好まし
い。濃度が低すぎるとタンパク質の溶出が不十分であ
り、一方、濃度が高すぎるとカラム内のあるいは溶出し
たタンパク質が沈殿して、試薬との反応に支障をきた
す。
【００１５】溶離したタンパク質を含有する溶出液に試
薬を添加して液中のタンパク質を定量分析する。分析法
としては、色素結合法、ビウレット法、蛍光光度法など
を利用することができる。ビウレット法はビウレット試
薬を添加してタンパク質と反応させ、その反応液の吸光
度に基づいてタンパク質を定量する方法である。蛍光光
度法はフルオレサミン試薬等を添加してタンパク質と反
応させ、その反応液の蛍光度からタンパク質を定量する
方法である。
薬を添加して液中のタンパク質を定量分析する。分析法
としては、色素結合法、ビウレット法、蛍光光度法など
を利用することができる。ビウレット法はビウレット試
薬を添加してタンパク質と反応させ、その反応液の吸光
度に基づいてタンパク質を定量する方法である。蛍光光
度法はフルオレサミン試薬等を添加してタンパク質と反
応させ、その反応液の蛍光度からタンパク質を定量する
方法である。
【００１６】このうち、ビシンコニン酸(ＢＣＡ)を用い
た方法が微量のタンパク質を検出する場合に適してい
る。これはタンパク質による銅の還元・発色を利用した
方法であり、ビシンコニン酸を含む溶液(Ａ液)と銅を含
む溶液(Ｂ液)を混合してなるビシンコニン酸試薬を用
い、タンパク質と反応させた後、その反応液の吸光度に
基づいてタンパク質の濃度を定量する方法である。この
方法は他の分析方法よりも高感度であるので、電解液や
メッキ液などに含まれる微量のタンパク質の定量に適す
る。また、試料液の反応と、その吸光度の測定により分
析を行うので連続流れ分析にも適する。
た方法が微量のタンパク質を検出する場合に適してい
る。これはタンパク質による銅の還元・発色を利用した
方法であり、ビシンコニン酸を含む溶液(Ａ液)と銅を含
む溶液(Ｂ液)を混合してなるビシンコニン酸試薬を用
い、タンパク質と反応させた後、その反応液の吸光度に
基づいてタンパク質の濃度を定量する方法である。この
方法は他の分析方法よりも高感度であるので、電解液や
メッキ液などに含まれる微量のタンパク質の定量に適す
る。また、試料液の反応と、その吸光度の測定により分
析を行うので連続流れ分析にも適する。
【００１７】なお、上記疎水性樹脂によるタンパク質の
吸着は、タンパク質と樹脂の相互の疎水性作用による
が、タンパク質と共に疎水性部位を有する高分子化合物
が液中に存在すると、これがタンパク質と共に疎水性樹
脂に吸着されて溶出され、これがタンパク質を検出する
際の妨害要素になる虞があるので、このような場合には
タンパク質に特異的な検出法を選択し、あるいは溶離液
組成(種類・濃度)を選択すること等によって、この妨害
を排除することができる。
吸着は、タンパク質と樹脂の相互の疎水性作用による
が、タンパク質と共に疎水性部位を有する高分子化合物
が液中に存在すると、これがタンパク質と共に疎水性樹
脂に吸着されて溶出され、これがタンパク質を検出する
際の妨害要素になる虞があるので、このような場合には
タンパク質に特異的な検出法を選択し、あるいは溶離液
組成(種類・濃度)を選択すること等によって、この妨害
を排除することができる。
【００１８】本発明の上記分析方法は連続流れ分析(FI
分析)に適し、連続流れ分析に基づいて電解液ないしメ
ッキ液に含まれるタンパク質を定量することができる。
すなわち、試料液が管路を流れる間に、試薬の添加と反
応および分析が連続して行われる流れ分析方法におい
て、電解液ないしメッキ液を試料液として用い、この試
料液を疎水性吸着樹脂を充填したカラムに通液して液中
に含まれるタンパク質を上記樹脂に吸着させ、次いで、
該カラムに溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶
出液が管路を流れる間に分析試薬を添加し反応させて検
出部に導き、タンパク質を定量分析する。
分析)に適し、連続流れ分析に基づいて電解液ないしメ
ッキ液に含まれるタンパク質を定量することができる。
すなわち、試料液が管路を流れる間に、試薬の添加と反
応および分析が連続して行われる流れ分析方法におい
て、電解液ないしメッキ液を試料液として用い、この試
料液を疎水性吸着樹脂を充填したカラムに通液して液中
に含まれるタンパク質を上記樹脂に吸着させ、次いで、
該カラムに溶離液を流してタンパク質を溶出させ、該溶
出液が管路を流れる間に分析試薬を添加し反応させて検
出部に導き、タンパク質を定量分析する。
【００１９】上記流れ分析方法において、試料液を樹脂
充填カラムに導いて系外に通じる管路と、溶離液をこの
樹脂充填カラムに導いて試薬の添加部に通じる管路とを
交互に切り替えることにより、一定量の試料液と溶離液
とを交互に樹脂充填カラムに通液し、タンパク質の定量
を連続して行うことができる。
充填カラムに導いて系外に通じる管路と、溶離液をこの
樹脂充填カラムに導いて試薬の添加部に通じる管路とを
交互に切り替えることにより、一定量の試料液と溶離液
とを交互に樹脂充填カラムに通液し、タンパク質の定量
を連続して行うことができる。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に示
す。なお、本発明はこれらの例に限定されない。
す。なお、本発明はこれらの例に限定されない。
【００２１】実施例１
樹脂として表１に示す４種（疎水性分配吸着樹脂２種：
イオン交換樹脂２種）を用い、これら２ｇを各々内径８
mmのカラムに充填した。各カラムを予め０.１Ｍの硫酸
溶液で洗浄してコンディショニングを行なった後、ゼラ
チン２００μｇを含む疑似電解液（硫酸:1.5M、銅:40g/
l、ニッケル:20g/l）５mlを各カラムに付加した。試料液の
通液後、０.１Ｍの硫酸液１０mlをカラムに流して残留
している金属イオンを除去し、さらに水２０mlをカラム
に流して内部を洗浄し残留する酸を除去した。次いで、
５０％のアセトニトリル水溶液２０mlをカラムに通液
し、樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。得られた
溶出液２０mlに水を加えて５０mlとした。これを１ml分
取してビシンコニン酸試薬１mlを添加し、室温で２時間
放置して充分に反応を行なわせた。この反応液の吸光度
(波長562nm)を測定し、予め作成した検量線からゼラチ
ン濃度を求め、回収率を算出した。この結果を表１に示
した。表１から明らかなように、ゼラチンの回収率はイ
オン交換樹脂よりも無極性樹脂および中間極性樹脂が格
段に高い。このことから、液中の微量なタンパク質に対
して無極性樹脂および中間極性樹脂の吸着性能が特に優
れていることがわかる。
イオン交換樹脂２種）を用い、これら２ｇを各々内径８
mmのカラムに充填した。各カラムを予め０.１Ｍの硫酸
溶液で洗浄してコンディショニングを行なった後、ゼラ
チン２００μｇを含む疑似電解液（硫酸:1.5M、銅:40g/
l、ニッケル:20g/l）５mlを各カラムに付加した。試料液の
通液後、０.１Ｍの硫酸液１０mlをカラムに流して残留
している金属イオンを除去し、さらに水２０mlをカラム
に流して内部を洗浄し残留する酸を除去した。次いで、
５０％のアセトニトリル水溶液２０mlをカラムに通液
し、樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。得られた
溶出液２０mlに水を加えて５０mlとした。これを１ml分
取してビシンコニン酸試薬１mlを添加し、室温で２時間
放置して充分に反応を行なわせた。この反応液の吸光度
(波長562nm)を測定し、予め作成した検量線からゼラチ
ン濃度を求め、回収率を算出した。この結果を表１に示
した。表１から明らかなように、ゼラチンの回収率はイ
オン交換樹脂よりも無極性樹脂および中間極性樹脂が格
段に高い。このことから、液中の微量なタンパク質に対
して無極性樹脂および中間極性樹脂の吸着性能が特に優
れていることがわかる。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例２
実施例１の疎水性樹脂２種を各々充填したカラムを用
い、これにゼラチン５mgを含む１.５Ｍ硫酸液１mlを付
加してゼラチンを吸着させた。次いで、溶離液として５
０％メタノール、５０％エタノール、５０％アセトニト
リル、１００％メタノールの４種を用い、実施例１と同
様の操作によりゼラチンを溶出させ、その回収率を求め
た。この結果を表２に示した。表２に示すように、無極
性樹脂(SM-2)および中間極性樹脂(XAD-7)を用いた場合
には、５０％アセトニトリルの溶出効果が最も良く、次
いで５０％メタノールおよび５０％エタノールの溶出効
果が高い。一方、１００％メタノールでは沈殿が生じて
測定できなかった。以上の結果から、溶離液としては５
０％アセトニトリルが好ましい。
い、これにゼラチン５mgを含む１.５Ｍ硫酸液１mlを付
加してゼラチンを吸着させた。次いで、溶離液として５
０％メタノール、５０％エタノール、５０％アセトニト
リル、１００％メタノールの４種を用い、実施例１と同
様の操作によりゼラチンを溶出させ、その回収率を求め
た。この結果を表２に示した。表２に示すように、無極
性樹脂(SM-2)および中間極性樹脂(XAD-7)を用いた場合
には、５０％アセトニトリルの溶出効果が最も良く、次
いで５０％メタノールおよび５０％エタノールの溶出効
果が高い。一方、１００％メタノールでは沈殿が生じて
測定できなかった。以上の結果から、溶離液としては５
０％アセトニトリルが好ましい。
【００２４】
【表２】
【００２５】実施例３
実施例１で用いた無極性樹脂(SM-2)充填カラムを、予め
０.１Ｍの硫酸液でコンディショニングした後、ゼラチ
ンを各々０mg、１２.５mg、２５mg含む疑似銅電解液
（硫酸:1.5M、銅:40g/l、ニッケル:20g/l）１０mlをカラム
に付加した。次いで、実施例１と同様にして樹脂に吸着
したゼラチンを溶出させ、得られた溶出液をメスフラス
コに回収し、ビウレット試薬１５mlを添加した後、水で
５０ml定容とした。これを室温(25℃)で３０分放置した
後、吸光度(波長540nm)を測定し、予め作成した検量線
からゼラチン濃度を求めて回収率を算出した。結果を表
３に示した。表３から明らかなように、ゼラチンの回収
率はいずれの濃度においても１００％に近く、検量線の
相関係数は０.９９９２であり、信頼性が高い。
０.１Ｍの硫酸液でコンディショニングした後、ゼラチ
ンを各々０mg、１２.５mg、２５mg含む疑似銅電解液
（硫酸:1.5M、銅:40g/l、ニッケル:20g/l）１０mlをカラム
に付加した。次いで、実施例１と同様にして樹脂に吸着
したゼラチンを溶出させ、得られた溶出液をメスフラス
コに回収し、ビウレット試薬１５mlを添加した後、水で
５０ml定容とした。これを室温(25℃)で３０分放置した
後、吸光度(波長540nm)を測定し、予め作成した検量線
からゼラチン濃度を求めて回収率を算出した。結果を表
３に示した。表３から明らかなように、ゼラチンの回収
率はいずれの濃度においても１００％に近く、検量線の
相関係数は０.９９９２であり、信頼性が高い。
【００２６】
【表３】
【００２７】実施例４
無極性樹脂(SM-2)を充填したカラム(内径8mm)を用い、
予め０.１Ｍの硫酸液でコンディショニングした後、所
定量のゼラチンを含む銅電解液（硫酸:1.5M、銅:40g/
l、ニッケル:20g/l）５０mlを各カラムに付加した。試料液
の通液後、０.１Ｍの硫酸液１０mlを通液して残留して
いる金属イオンを除去し、次いで水２０mlを流して残留
する酸を洗浄した。これに５０％のアセトニトリル水溶
液２０mlを通液し、この溶出液に水を加えて５０mlと
し、１mlを分取してビシンコニン酸試薬１mlを添加し、
室温で２時間放置して充分に反応を行なわせた。この反
応液の吸光度(波長562nm)を測定し、予め作成した検量
線からゼラチン濃度を求めた。一方、上記電解液に５０
０μgの膠を添加したものについて同様に操作を行い、
タンパク質を吸着・溶出させて、その回収率を求めた。
ゼラチンおよび膠について測定を各々２回行い、これら
の結果を表４に示した。表４に示すように、電解液のゼ
ラチン濃度は３８ppm前後であり、この電解液にさらに
膠を５００μg添加したものについて、検出したタンパ
ク質濃度はゼラチンと膠の合計量に見合い、そのゼラチ
ン回収率は９０％程度であり、ゼラチンと膠を含むもの
についても精度よい定量ができた。なお、本例のゼラチ
ンの定量下限は試料濃度換算で１０ppm程度であった。
予め０.１Ｍの硫酸液でコンディショニングした後、所
定量のゼラチンを含む銅電解液（硫酸:1.5M、銅:40g/
l、ニッケル:20g/l）５０mlを各カラムに付加した。試料液
の通液後、０.１Ｍの硫酸液１０mlを通液して残留して
いる金属イオンを除去し、次いで水２０mlを流して残留
する酸を洗浄した。これに５０％のアセトニトリル水溶
液２０mlを通液し、この溶出液に水を加えて５０mlと
し、１mlを分取してビシンコニン酸試薬１mlを添加し、
室温で２時間放置して充分に反応を行なわせた。この反
応液の吸光度(波長562nm)を測定し、予め作成した検量
線からゼラチン濃度を求めた。一方、上記電解液に５０
０μgの膠を添加したものについて同様に操作を行い、
タンパク質を吸着・溶出させて、その回収率を求めた。
ゼラチンおよび膠について測定を各々２回行い、これら
の結果を表４に示した。表４に示すように、電解液のゼ
ラチン濃度は３８ppm前後であり、この電解液にさらに
膠を５００μg添加したものについて、検出したタンパ
ク質濃度はゼラチンと膠の合計量に見合い、そのゼラチ
ン回収率は９０％程度であり、ゼラチンと膠を含むもの
についても精度よい定量ができた。なお、本例のゼラチ
ンの定量下限は試料濃度換算で１０ppm程度であった。
【００２８】
【表４】
【００２９】実施例５
試料液を流す管路に、無極性樹脂(SM-2)を充填したカラ
ムと試薬の添加部を設け、さらに該管路をコイル状に形
成した反応部を経て吸光光度計に通じる測定系を形成し
た流れ分析において、希硫酸(0.05M)をキャリアー液と
し、ゼラチン２５μg/ml相当を添加した銅電解液（硫
酸:1.5M、銅:40g/l、ニッケル:20g/l）１mlを管路に流して
上記カラムに通液した。次いで、キャリアー液を約４ml
流した後に、該カラムに４０％アセトニトリル水溶液を
通液し、この溶出液が管路を流れる間に該溶出液にビシ
ンコシン酸試薬０.５ml/minの流速で混合させて、該管
路を通じて吸光光度計に導き、反応液の吸光度(波長562
nm)を測定した。この吸光度に基づくゼラチンの濃度は
２４μg/mlであり添加量とほぼ一致し、１００％に近い
測定精度であった。
ムと試薬の添加部を設け、さらに該管路をコイル状に形
成した反応部を経て吸光光度計に通じる測定系を形成し
た流れ分析において、希硫酸(0.05M)をキャリアー液と
し、ゼラチン２５μg/ml相当を添加した銅電解液（硫
酸:1.5M、銅:40g/l、ニッケル:20g/l）１mlを管路に流して
上記カラムに通液した。次いで、キャリアー液を約４ml
流した後に、該カラムに４０％アセトニトリル水溶液を
通液し、この溶出液が管路を流れる間に該溶出液にビシ
ンコシン酸試薬０.５ml/minの流速で混合させて、該管
路を通じて吸光光度計に導き、反応液の吸光度(波長562
nm)を測定した。この吸光度に基づくゼラチンの濃度は
２４μg/mlであり添加量とほぼ一致し、１００％に近い
測定精度であった。
【００３０】
【表５】
【００３１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、電解液やメッキ
液などの強酸性溶液中に含まれるゼラチンや膠などのタ
ンパク質濃度を容易にかつ精度良く定量することができ
る。また、本発明の分析方法は連続流れ分析に適し、電
解液やメッキ液に含まれるタンパク質濃度を流れ分析に
より連続的に定量することができる。
液などの強酸性溶液中に含まれるゼラチンや膠などのタ
ンパク質濃度を容易にかつ精度良く定量することができ
る。また、本発明の分析方法は連続流れ分析に適し、電
解液やメッキ液に含まれるタンパク質濃度を流れ分析に
より連続的に定量することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 35/08 Ｇ０１Ｎ 35/08 Ｃ
(56)参考文献 特開 平２−69660（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−199944（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−134561（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−23281（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−49299（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−211041（ＪＰ，Ａ)
特開 平９−243626（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−23968（ＪＰ，Ａ)
特開 昭58−120607（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−68671（ＪＰ，Ａ)
特開2000−171453（ＪＰ，Ａ)
特開2000−171452（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 30/88
G01N 30/08
G01N 30/14
G01N 30/48
G01N 30/84
G01N 35/08
Claims (5)
- 【請求項１】 試料液が管路を流れる間に、試薬の添加
と反応および分析が連続して行われる流れ分析方法に基
づいた電解液ないしメッキ液のタンパク質定量方法であ
って、疎水性吸着樹脂を充填したカラムに少量の酸、水
または緩衝液を通液してカラム内を洗浄した後に、試料
液をカラムに通液して液中に含まれるタンパク質を上記
樹脂に吸着させ、次いで、カラムに希硫酸を通液して残
留金属イオンを除去し、カラム内のｐＨを調整した後
に、該カラムに溶離液を流してタンパク質を溶出させ、
該溶出液が管路を流れる間に分析試薬を添加し反応させ
て検出部に導き、タンパク質を定量分析することを特徴
とするタンパク質の分析方法。 - 【請求項２】 疎水性吸着樹脂が無極性樹脂または中間
極性樹脂である請求項１に記載する分析方法。 - 【請求項３】 試料液がｐＨ１以下の強酸性であり、耐
酸性の疎水性吸着樹脂を用いる請求項１または２に記載
する分析方法。 - 【請求項４】 試料液が膠ないしゼラチンを含む電解液
またはメッキ液である請求項１、２または３に記載する
分析方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４の何れかに記載する流れ分
析方法において、管路を切り替えることにより一定量の
試料液と溶離液とを交互に樹脂充填カラムに通液してタ
ンパク質の定量を連続的に行う分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34834998A JP3414287B2 (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | タンパク質の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34834998A JP3414287B2 (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | タンパク質の分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000171451A JP2000171451A (ja) | 2000-06-23 |
| JP3414287B2 true JP3414287B2 (ja) | 2003-06-09 |
Family
ID=18396434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34834998A Expired - Lifetime JP3414287B2 (ja) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | タンパク質の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3414287B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6668623B2 (en) * | 2000-03-03 | 2003-12-30 | Mitsubishi Materials Corporation | Method and apparatus for analyzing organic macromolecular component and application thereof |
| WO2021100474A1 (ja) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | 株式会社島津製作所 | ポンプユニットおよびクロマトグラフ |
-
1998
- 1998-12-08 JP JP34834998A patent/JP3414287B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000171451A (ja) | 2000-06-23 |
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