CN116642961A - 一种生物反应器在线取样装置、检测系统及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分析的技术领域，公开了一种生物反应器在线取样装置、检测系统及其检测方法，在线取样装置包括横向过滤模块与进样模块；横向过滤模块设有原液入口、原液出口与滤液出口，原液入口与原液出口分别与生物反应器管路连通，形成循环通路；横向过滤模块内设有与循环通路流向平行设置的滤膜；滤液出口通过管路与进样模块连接。检测系统还包括生物反应器与测试装置。实时监控细胞培养基消耗和代谢废物毒物数据，蛋白产量和质量的同步分析，使优化有依据，缩短分析周期，满足细胞培养部门高通量、低成本的样品检测要求。本发明生物反应器在线取样装置，在不停止操作的状态下，完成滤液分离与测试，整个过程高效便利，且便于控制。
Description
技术领域
本发明属于生化分析的技术领域，特别涉及一种生物反应器在线取样装置、检测系统及其检测方法。
背景技术
生物药研发和生产各环节都离不开细胞培养，为提高目的蛋白的产量和质量而需要不断优化细胞培养工艺。传统优化方法仅是对细胞状态进行优化，如生长密度、活率、倍增时间等。往往忽略了细胞生长环境的变化和蛋白的质量。
细胞培养离不开培养基，培养基营养成分的消耗以及代谢废物毒物的积累，都会影响到细胞的生长和蛋白的表达，质量“好”的蛋白不是检测出来的，而是“做”出来的，需要在细胞培养的全流程对蛋白质量进行有效的监控。因此，对细胞培养基消耗以及蛋白质量的实时分析，于生物药研发和生产都非常重要。
现有技术中，在对培养基进行取样分析时，往往是采用离线操作的方式。离线操作是先暂停生物反应器的反应进程，然后取出培养液，再对取出样品进行检测。整个过程会影响到反应的进程，提取大量培养液后会影响到培养基的环境。另外，取样过程还有概率会带入杂菌，造成培养基的污染。
对于细胞培养基和蛋白质量分析，从生物反应器中进行取样是第一步，也是关键一步。取出的样品的稳定性、代表性以及取样过程对于细胞培养的影响，都是需要评估的。实现真正意义上的在线实时取样和分析，是细胞培养监控的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物反应器在线取样装置、检测系统及其检测方法，解决了对生物反应器内培养液在线实时取样、分析与监控的技术问题。
本发明提供的技术方案如下：
本发明的目的一为提供：一种生物反应器在线取样装置，包括横向过滤模块与进样模块；所述横向过滤模块设有原液入口、原液出口与滤液出口，所述原液入口与原液出口分别与生物反应器管路连通，并形成循环通路；
所述横向过滤模块内设有与循环通路流向平行设置的滤膜；所述滤液出口通过管路与进样模块连接。由滤膜分隔，滤液出口设于原液入口与原液出口的另一侧。
作为优选地，还包括设于滤液出口与进样模块之间，用于滤液储存的储液模块；所述储液模块包括储液器与动力单元；所述动力单元用于驱动滤液定向流动；
所述储液器内设有滤液容纳腔，外设有一个储液入口和两个储液出口；所述储液入口与滤液出口导通连接；两个所述储液出口，其一与进样模块导通连接，另一个与动力单元连接。
作为优选地，所述横向过滤模块包括第一卡壳与第二卡壳；所述第一卡壳与第二卡壳对应设置形成封闭腔室；所述原液入口与原液出口设于第一卡壳上；所述滤液出口设于第二卡壳上；所述滤膜至于封闭腔室内，将封闭腔室分为仅由滤膜相隔的腔室一与腔室二。腔室一内用于循环通路导通，腔室二与滤液出口导通。
作为优选地，所述进样模块包括注射泵、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶；所述注射泵包括六通选择阀与注射器；所述注射器、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶分别通过管路连接于六通选择阀的各对应阀口处。
作为优选地，所述六通选择阀设有分别用于连接储液器与测试装置的阀口。
作为优选地，还包括控制模块；所述动力单元为第一蠕动泵，所述第一蠕动泵末端出口设有废液收集装置；所述循环通路上设有第二蠕动泵；所述第一蠕动泵、第二蠕动泵、注射器与选择阀均分别与控制模块电性连接。
本发明的目的二为提供：一种生物反应器在线取样装置的检测系统，检测系统包括横向过滤模块、进样模块、储液模块、生物反应器与测试装置；所述生物反应器设有出口与入口，出口通过管路与横向过滤模块的原液入口导通连接，入口通过管路与横向过滤模块的原液出口导通连接；所述六通选择阀阀口通过管路与测试装置导通连接。
作为优选地，所述测试装置为液质联用仪，也即是HPLC-MS或LC-MS，高效液相与质谱联用或液相色谱与质谱联用。
本发明的目的三为提供：带有生物反应器在线取样装置检测系统的检测方法，包括以下步骤：
S1、根据测试需要配置待测样品目标物质的标准溶液，并绘制峰面积-浓度标准曲线；
S2、控制模块控制第二蠕动泵运作，带动生物反应器内培养液沿循环通路流动；经横向过滤模块过滤后，将待测滤液输送至六通选择阀处；
S3、经控制模块控制导通滤液入口与注射器、稀释液瓶与注射器之间通路，关闭其他通路；待稀释液与待测滤液于注射器内混合均匀后，切换六通选择阀，关闭以上通路，导通注射器与测试装置之间通路，并完成进样；
S4、测试装置测得待测滤液中目标物质的出峰面积，代入步骤S1绘制的标注曲线中，计算的到目标物质的浓度。
作为优选地，步骤S2控制模块控制第二蠕动泵运作时，同时控制第一蠕动泵运作；第一蠕动泵驱动滤液定向流动，使滤液流入废液收集装置，与之并联的另一出口管路流至六通选择阀。
作为优选地，步骤S3后，控制模块控制关闭注射器与测试装置之间通路，导通清洗液瓶与注射器之间通路，完成对注射器的清洗；以上步骤完成后，关闭以上通路，并导通注射器与废液瓶之间通路，完成废液的排出；完成以上步骤后，重置选择阀至初始状态，便于下一次测试。
有益效果：现有技术的检测方法对培养基进行取样分析时，往往是采用离线操作的方式，先暂停生物反应器的反应进程，然后取出培养液，再对取出样品进行检测。整个过程会影响到反应的进程，提取大量培养液后会影响到培养基的环境。取样过程会带入杂菌，造成培养基的污染。整个过程也就不够便利、安全与高效。
本发明的生物反应器在线取样装置，在不停止操作的状态下，完成滤液分离与测试，整个过程高效便利，且便于控制。
1)、本发明的生物反应器在线取样装置，生物反应器与横向过滤模块的腔室一之间形成循环通路，过滤后的滤液能直接通过六通选择阀注射入测试装置内，并完成相关数据的测试。实现了真正意义上的细胞培养液的在线取样和分析，大大简化细胞培养监控流程，缩短了分析检测时间，降低监控成本，避免了取样对于样品本身以及培养过程的影响和污染；
2)、横向过滤模块可更换，通过更换不同滤孔的滤膜，实现控制生物反应器中的培养液只有待检测成分透过过滤膜进入储液装置中，其他培养液成分不通过，而顺着循环通路全部回到生物反应器中。此过程不会带出不必要的成分，不会造成培养体积和培养环境的变化，不会对培养过程造成影响；
3)、横向过滤模块为一次性使用装置，在完成一次细胞培养取样后进行更换，避免了不同批次细胞培养之间的交叉污染；
4)、横向过滤模块采用的是切向力过滤技术，滤膜设置方向与液相流动方向平行，而不同于常用的垂直状态；与传统纵向垂直过滤相比，横向过滤速度快，不容易造成膜的堵塞；待滤液流动产生剪切力，使得滤饼不容易堆积，在一定程度上减慢了膜污染的速率；
5)、横向过滤模块和储液器内的待测组分都是连续流动的，实时变化的，实现了真正意义的实时在线取样和检测。
6)、生物反应器中的培养基环境为一个整体，通过培养基的在线取样和检测，可以得到实时的细胞培养基消耗和代谢废物毒物数据，使得培养优化有依据、有方向，优化效率大大提供；
7)、通过蛋白的在线取样和检测，可以实现蛋白产量和质量的同步分析，大大缩短了分析周期，减低了成本，满足了细胞培养部门高通量、低成本的样品检测要求。
如，采用离线取样，14天损失起始培养体积600ml的23％，每次取样细胞也有损失，最终蛋白的绝对产量也减低约25％。且培养体积减少，培养工艺参数，如补料量、溶氧和pH等也都会影响。本发明在线取样14天损失仅为培养体积0.5％，影响很小；而且取样不会造成细胞数量的减少，不影响细胞密度以及单批次蛋白的绝对产量，也不会影响补料量、溶氧、pH等工艺条件。采用同样的分析仪器和测试方法(蛋白分析实验条件)，由于离线取样造成蛋白的吸附或者降解，含量减低23％，SEC纯度降低5％，CEX主峰降低15％，含量和质量明显减低，不能真实反应蛋白的Titer含量和质量，影响质量分析和监控的准确度，监控蛋白含量和质量均由于取样问题由合格变为不合格。在线监控可以很好地解决这一问题。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种生物反应器在线取样装置、检测系统及其检测方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明带有生物反应器在线取样装置的检测系统；
图2、3为横向过滤模块不同视角的结构示意图；
图4为目的蛋白表达量Titer、分子量和糖型的HPLC和MS图谱；
图5为培养基营养成分消耗分析的各氨基酸的典型LC-MS色谱图(D0天数据)；
图6为培养基营养成分消耗分析的各维生素的典型LC-MS色谱图(D0天数据)。
附图标号说明
1-在线取样装置；11-横向过滤模块；111-滤膜；112-原液入口；113-原液出口；114-滤液出口；
12-储液器；13-六通选择阀；14-第一蠕动泵；15-第二蠕动泵；16-废液收集装置；17-注射器；18-废液瓶；
2-生物反应器。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。
实施例1
如图1所示，生物反应器在线取样装置，包括横向过滤模块11与进样模块；横向过滤模块11设有原液入口112、原液出口113与滤液出口114，原液入口112与原液出口113分别与生物反应器2管路连通，并形成循环通路；横向过滤模块11内设有与循环通路流向平行设置的滤膜111；滤液出口114通过管路与进样模块连接。
在实际使用中，生物反应器2是利用生物体所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统、细胞、组织器官等等。本发明使用培养液，用于细菌及细胞培养目标代谢产物。本发明的在线取样装置1于生物反应器2不停止工作，仍然能稳定取出待测样品。在线取样器包括横向过滤模块11，其用于提供不同孔径的滤膜111，膜孔从粗到细分为微滤膜(MF)，超滤膜(UF)，纳诺滤膜(NF)和反渗透膜(RO)。如需取样目的蛋白时，使用0.22微米孔径的PES微滤膜；然而对培养基中成分进行取样则使用超滤膜。
横向过滤模块11中滤膜111设置方向与液体流向平行，滤液流动产生剪切力，使得滤饼不容易堆积，在一定程度上减慢了膜污染的速率。平行流过的溶液与生物反应器2之间形成循环通路，此循环通路可保证经过滤膜111的溶液与生物反应器2内的容易组分相同，从而可保证检测的准确性与及时性。
在某一实施例中，生物反应器在线取样装置还包括设于滤液出口114与进样模块之间，用于滤液储存的储液模块；储液模块包括储液器12与动力单元；动力单元用于驱动滤液定向流动；
储液器12内设有滤液容纳腔，外设有一个储液入口和两个储液出口；储液入口与滤液出口114导通连接；两个储液出口，其一与进样模块导通连接，另一个与动力单元连接。
在实际使用中，储液模块的设置，可缓存少量滤液，管路中的液体通过蠕动泵的作用，缓慢定量的前移。从而使得通过六通选择阀13进入测试装置的待测液能稳定，不会因为长时间的等待而沉淀，也不会因为长时间不运作，测试得到的数据仍然是前一次测试时滞留在管路内的滤液，从而影响测试数据，使得测试具有滞后性。
储液器12内置容纳腔，还设有一个储液入口和两个储液出口；储液入口与滤液出口114管路连接；两个储液出口分接两个支路，其一连接六通选择阀13，用于向测试装置供液；另一支路连接第一蠕动泵14，用于提供动力。两支路并联，位于容纳腔处的压强一定，第一蠕动泵14工作时会形成低压，引导横向过滤模块11中的滤液随第一蠕动泵14工作频率恒定频率流动。
在某一实施例中，如图1、2、3所示，横向过滤模块11包括第一卡壳与第二卡壳；第一卡壳与第二卡壳对应设置形成封闭腔室；原液入口112与原液出口113设于第一卡壳上；滤液出口114设于第二卡壳上；滤膜111至于封闭腔室内，将封闭腔室分为仅由滤膜111相隔的腔室一与腔室二。腔室一用于循环通路导通，腔室二与滤液出口114导通。
在实际使用中，横向过滤模块11是由上下两卡壳与设于两卡壳之间的滤膜111组成。上下俩卡壳上设有对应的定位凸起和凹槽，对应扣合可形成密闭的腔室，滤膜111置于两者之间，紧紧扣压在两者之前，且连接处不会留有缝隙。封闭腔室被滤膜111分为腔室一与腔室二，腔室一通过管路与生物反应器2形成完美闭合回路。腔室二位于滤膜111另一侧，其腔室内液体均为经滤膜111过滤后的液体，此液体于第一蠕动泵14的作用下，定向移动。
在某一实施例中，进样模块包括注射泵、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶18；注射泵包括六通选择阀13与注射器17；注射器17、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶18分别通过管路连接于六通选择阀13的各对应阀口处。
在某一实施例中，六通选择阀13设有分别用于连接储液器12与测试装置的阀口。
在实际使用中，进样模块用于定量，稳定的向测试装置注入待测样。此处使用六通选择阀13，可根据实际需要，手动或是通过控制模块控制，通过切换阀门的各通路，以完成位于不同阀口连接管路提供的各项功能。六通选择阀13的一号位点连接滤液管路，二号位点连接稀释液瓶，三号位点连接清洗液瓶，四号位点连接测试装置的进样口，五号位点连接废液瓶18，中间位点连接注射器17。注射器17为主要部件，其用于定量注入待测滤液，稀释与向进液口注入样品。可由不同需求调换阀门位置，从而实现不同的作用。一号位与中间位导通时，滤液注入注射器17；二号位与中间位导通时，稀释液注入注射器17中；四号位与中间位导通时，完成样品上样。三号位与中间位连接时，清洗液注入注射器17中，完成对注射器17的清洗；六号位与中间位连接时，清洗或是进样时的废液可排出至废液瓶18内。整个流程都是围绕位于中间位的注射器17。各位点所处的实际位置，可根据实际需要和操作顺手程度按需排布。
在某一实施例中，生物反应器在线取样装置还包括控制模块；动力单元为第一蠕动泵14，第一蠕动泵14末端出口设有废液收集装置16；循环通路上设有第二蠕动泵15；第一蠕动泵14、第二蠕动泵15、注射器17与六通选择阀13均分别与控制模块电性连接。
在实际使用中，除手工控制外，可根据实际需要，通过控制模块对此在线取样装置1的工作流程进行控制。第二蠕动泵15的转动功率可调控与生物反应器2内溶液的混合程度，如在测试前一分钟，加快第二蠕动泵15的工作频率，将循环管路内的溶液都跟换为生物反应器2内的溶液。加快第一蠕动泵14的工作频率，也可以及时的将储液器12内的液体排空，换成新鲜的滤液，也能保证测试的时效性。
六通选择阀13的使用，可以有效的完成注射器17液体的注入、稀释、注入样品和清洗。使用控制模块更能提高工作效率，增加测试的准确性和周期性。
实施例2
如图1所示，检测系统除带有生物反应器在线取样装置外，还包括生物反应器2与测试装置；生物反应器2设有出口和入口，分别通过管路与横向过滤模块11的原液入口112和原液出口113导通连接；六通选择阀13阀口通过管路与测试装置导通连接。
在某一实施例中，测试装置为液质联用仪，也即是HPLC-MS或是LC-MS，高效液相与质谱联用或是液相色谱与质谱联用。此仪器整合了高效液相对含量的测试，还可以通过质谱确定分子片段，从而验证推测此分子结构和分子量。
实际使用中，此检测系统除上述的在线取样装置1外，还包括用于生物反应器2与液质联用仪。从生物反应器2的反应进程观察其反应状态，再由液质联用仪确定待测物的含量和确定分子，整个过程高效而稳定。
实施例3
带有生物反应器在线取样装置检测系统的检测方法，包括以下步骤：
S1、根据测试需要配置待测样品目标物质的标准溶液，并绘制峰面积-浓度标准曲线；
S2、控制模块控制第二蠕动泵15运作，带动生物反应器2内培养液沿循环通路流动；经横向过滤模块11过滤后，将待测滤液输送至六通选择阀13处；
S3、经控制模块控制导通滤液入口与注射器17、稀释液瓶与注射器17之间通路，关闭其他通路；待稀释液与待测滤液于注射器17内混合均匀后，切换六通选择阀13，关闭以上通路，导通注射器17与测试装置(HPLC-MS或是LC-MS)之间通路，并完成进样；
S4、测试装置测得待测滤液中目标物质的出峰面积，代入步骤S1绘制的标注曲线中，计算的到目标物质的浓度；
S5、循环测样，重复S2-S4的步骤；更换新待测物，则重复S1-S4的步骤。
在实际使用中，需先根据需要测试的项目更换合适孔径的横向过滤模块11；横向过滤模块11可设计为一次性装置，其滤膜111孔径会有所不同。如取样目的蛋白时，使用0.22微米孔径的PES微滤膜；对培养基中成分进行取样则使用超滤膜。
因测试装置为液质联用仪，故而还需要现制备标准曲线，根据实际需要测试含量或是浓度曲线。
标准曲线制作完成后预存与存储单元，方便在后期数据计算时调出。根据测试需要，于合适时间段通过控制模块，控制第一蠕动泵14、第二蠕动泵15与注射器17。第二蠕动泵15的转动功率可调控与生物反应器2内溶液的混合程度，如在测试前一分钟，加快第二蠕动泵15的工作频率，将循环管路内的溶液都更换为生物反应器2内的溶液。加快第一蠕动泵14的工作频率，也可以及时的将储液器12内的液体排空，换成新鲜的滤液，也能保证测试的时效性。
六通选择阀13的使用，可以有效的完成注射器17液体的注入、稀释、注入样品和清洗。使用控制模块更能提高工作效率，增加测试的准确性和周期性。
在某一实施例中，控制模块控制第二蠕动泵15运作时，同时控制第一蠕动泵14运作；第一蠕动泵14驱动滤液定向流动，使滤液流入废液收集装置16，与之并联的另一出口管路流至六通选择阀13。
在某一实施例中，步骤S3后，控制模块控制关闭注射器17与测试装置之间通路，导通清洗液瓶与注射器17之间通路，完成对注射器17的清洗；以上步骤完成后，关闭以上通路，并导通注射器17与废液瓶18之间通路，完成废液的排出；完成以上步骤后，重置六通选择阀13至初始状态。
在实际使用中，六通选择阀13的一号位点连接滤液管路，二号位点连接稀释液瓶，三号位点连接清洗液瓶，四号位点连接测试装置的进样口，五号位点连接废液瓶18，中间位点连接注射器17。注射器17为主要部件，其用于定量注入待测滤液，稀释与向进液口注入样品。可由不同需求调换阀门位置，从而实现不同的作用。一号位与中间位导通时，滤液注入注射器17；二号位与中间位导通时，稀释液注入注射器17中；四号位与中间位导通时，完成样品上样。三号位与中间位连接时，清洗液注入注射器17中，完成对注射器17的清洗；六号位与中间位连接时，清洗或是进样时的废油可排出至废液瓶18内。整个流程都是围绕位于中间位的注射器17。各位点所处的实际位置，可根据实际需要和操作顺手程度按需排布。
生物反应器2培养液中目的蛋白的含量和鉴别分析：
采用本发明在线取样装置对目的蛋白进行取样，横向过滤模块11中的滤膜111使用0.22微米孔径的PES微滤膜。取样过程中，培养液中的目的蛋白通过横向过滤模块11中过滤膜，细胞等其他成分不能经过过滤膜。目的蛋白溶液经过储液器12和反复式注射器，不经过稀释，直接进入HPLC-MS进行检测。HPLC-MS对目的蛋白的产量(Titer)进行测定，并对蛋白的分子量和糖型进行鉴别，结果和图谱如图4所示。图4中采用已知浓度的目的蛋白(单克隆抗体)标准品，通过外标曲线法计算培养液中表达的目的蛋白的Titer，测得Titer为5.2g/L。通过目的蛋白的理论氨基酸序列计算各糖型的理论分子量，MS实测的分子量与理论分子量进行比对，从而对培养液中的蛋白糖型进行鉴定，并通过峰面积计算各糖型的相对比例，完成目的蛋白的鉴别分析，糖型、理论分子量、实际分子量与相对含量如下表1所示。
表1
| 糖型 | 理论分子量Da | 实际分子量Da | 差异Da | 相对含量％ |
| G0F/G0F | 148059 | 148058 | 1 | 52 |
| G0F/G1F | 1480221 | 1480220 | 1 | 48 |
培养液中培养基营养成分消耗分析：
采用本发明在线取样装置对培养基成分进行取样，横向过滤模块11中的滤膜111使用截止分子量为10K的超滤膜。取样过程中，培养液中的培养基成分通过横向过滤模块中超滤膜，细胞、蛋白等其他成分不能经过过滤膜。培养基营养成分溶液经过储液器和和反复式注射泵，经过稀释后进入HPLC-MS进行检测。HPLC-MS对培养液的氨基酸、维生素等营养成分的含量进行测定，细胞培养第0、3、5、7和9天氨基酸测试结果和消耗趋势如表2所示，维生素测试结果和消耗趋势如表3所示，图5为培养基营养成分消耗分析的各氨基酸的典型LC-MS色谱图(以D0天数据为例)，Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr与Valine分别对应各氨基酸的缩写，图6为培养基营养成分消耗分析的各维生素的典型LC-MS色谱图(以D0天数据为例)。
表2
表3
对比试验1(对生物反应器内环境的影响)
按实施例3所述步骤在线取样、测试，取1升的生物反应器，实际培养液体积约为600ml，14天细胞培养，每天取样两次测定培养基营养成分消耗和蛋白Titer和质量分析。
生物反应器2中的培养液只有待检测成分透过横向过滤模块11进入储液器12中，细胞和其他培养液成分不能通过滤膜111，则被隔挡后全部顺着循环通路返回到生物反应器2中。在线取样每次取样体积约0.1ml，经过14天培养和取样，总取样体积约为2.8ml(第一蠕动泵14带动的流向废液收集装置16排掉部分的量极少，可忽略不计)，占起始培养体积600ml的0.5％，影响很小；而且取样不会造成细胞数量的减少，不影响细胞密度以及单批次蛋白的绝对产量，也不会影响补料量、溶氧、pH等工艺条件。
对比例1为采用离线取样，14天细胞培养，每天取样两次，每次取样5毫升进行培养基消耗以及蛋白Titer和质量分析。经过14天培养和取样，共取样140毫升，占起始培养体积600ml的23％，培养结束只有460毫升培养液。一方面，每次取样细胞也有损失，最终蛋白的绝对产量也减低约25％。另一方面，培养体积减少，培养工艺参数，如补料量、溶氧和pH等也都会影响，需要做相应的调整，影响工艺条件的确认。
对比试验2(对蛋白含量和质量的影响)
蛋白分析实验条件：
1)、含量Titer实验条件：
离线样品处理
移取200μl待测样品置于1.5ml离心管中，13000rpm离心10分钟，移取100μl上清液于样品瓶中。
样品分析
色谱柱：POROS A20 Column，2.1×30mm或相当产品
流动相A：20mM磷酸缓冲液
流动相B：100mM甘氨酸溶液，pH 3.0
流动相流速：1ml/min
色谱柱温度：25℃
检测波长：280nm
进样量：30μl
流动相梯度设置如下表4所示：
表4
| 时间(min) | 流速(ml/min) | 流动相A比例(％) | 流动相B比例(％) |
| 0.00 | 1 | 100 | 0 |
| 0.50 | 1 | 100 | 0 |
| 0.51 | 1 | 0 | 100 |
| 1.50 | 1 | 0 | 100 |
| 1.51 | 1 | 100 | 0 |
| 4.00 | 1 | 100 | 0 |
2)、SEC实验条件：
离线样品处理
待测样品13000rpm离心10分钟，移取上清液进样分析。进样体积(μl)＝200(μg)/待测样品浓度(μg/μl)。
样品分析
色谱柱：Tosoh G3000SWXL，7.8×300mm或相当产品
流动相：200mM KH2PO4，250mM KCl，pH 6.2
流动相流速：0.5mL/min
色谱柱温度：25℃
检测波长：280nm
3)、EX实验条件：
离线样品处理
待测样品13000rpm离心10分钟，移取上清液进样分析。进样体积(μl)＝200(μg)/待测样品浓度(μg/μl)。
样品分析
色谱柱：MABPac SCX-10或相当产品
流动相A：125mM NaH2PO4溶液
流动相B：125mM Na2HPO4溶液
流动相C：1M NaCl溶液
流动相D：去离子水
色谱柱温度：30℃
检测波长：280nm
流动相梯度如下表5所示：
表5
| 时间(min) | 流速(ml/min) | pH | NaCl(mM) |
| 0.00 | 0.85 | 5.6 | 0 |
| 3.00 | 0.85 | 5.6 | 0 |
| 20.00 | 0.85 | 7.2 | 30 |
| 25.00 | 0.85 | 7.2 | 100 |
| 25.10 | 0.85 | 5.6 | 0 |
| 35.00 | 0.85 | 5.6 | 0 |
按实施例3所述步骤在线取样、测试，按以上蛋白分析实验条件在线取样实时分析目的蛋白(该实施例采用的是单克隆抗体)的Titer含量和质量(SEC纯度和CEX电荷异构体纯度)。
对比例2为采用离线取样，离线取样后，蛋白容易吸附和降解，按以上蛋白分析实验条件分析造成蛋白含量和质量的变化。
在线与离线两个平行批次细胞培养过程在线和取样的蛋白含量和质量的比如下表6所示。
表6
| 项目 | 监控合格标准 | 在线 | 离线 |
| 含量Titer | 不低于4g/l | 4.8g/l | 3.7g/l |
| SEC纯度 | 不低于95％ | 95％ | 90％ |
| CEX电荷异构体 | 主峰不低于60％ | 主峰70％ | 主峰55％ |
表6数据表明，同样的样品，采用同样的分析仪器和测试方法(蛋白分析实验条件)，由于离线取样造成蛋白的吸附或者降解，含量减低23％，SEC纯度降低5％，CEX主峰降低15％，含量和质量明显减低，不能真实反应蛋白的Titer含量和质量，影响质量分析和监控的准确度，监控蛋白含量和质量均由于取样问题由合格变为不合格。在线监控可以很好地解决这一问题。
综上，可以看出由本发明生物反应器在线取样装置能得到实时的细胞培养基消耗和代谢废物毒物数据，使得培养优化有依据、有方向，优化效率大大提供；通过蛋白的在线取样和检测，可以实现蛋白产量和质量的同步分析，大大缩短了分析周期，减低了成本，满足了细胞培养部门高通量、低成本的样品检测要求。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物反应器在线取样装置，其特征在于：包括横向过滤模块与进样模块；所述横向过滤模块设有原液入口、原液出口与滤液出口，所述原液入口与原液出口分别与生物反应器管路连通，并形成循环通路；
所述横向过滤模块内设有与循环通路流向平行设置的滤膜；所述滤液出口通过管路与进样模块连接。
2.根据权利要求1所述的生物反应器在线取样装置，其特征在于：还包括设于滤液出口与进样模块之间，用于滤液储存的储液模块；所述储液模块包括储液器与动力单元；所述动力单元用于驱动滤液定向流动；所述储液器内设有滤液容纳腔，外设有一个储液入口和两个储液出口；所述储液入口与滤液出口导通连接；两个所述储液出口，其一与进样模块导通连接，另一个与动力单元连接。
3.根据权利要求1所述的生物反应器在线取样装置，其特征在于：所述横向过滤模块包括第一卡壳与第二卡壳；所述第一卡壳与第二卡壳对应设置形成封闭腔室；所述原液入口与原液出口设于第一卡壳上；所述滤液出口设于第二卡壳上；所述滤膜至于封闭腔室内，将封闭腔室分为仅由滤膜相隔的腔室一与腔室二。
4.根据权利要求2所述的生物反应器在线取样装置，其特征在于：所述进样模块包括注射泵、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶；所述注射泵包括六通选择阀与注射器；所述注射器、清洗液瓶、稀释液瓶与废液瓶分别通过管路连接于六通选择阀的各对应阀口处。
5.根据权利要求4所述的生物反应器在线取样装置，其特征在于：还包括控制模块；所述动力单元为第一蠕动泵，所述第一蠕动泵末端出口设有废液收集装置；所述循环通路上设有第二蠕动泵；所述第一蠕动泵、第二蠕动泵、注射器与六通选择阀均分别与控制模块电性连接；所述六通选择阀设有分别用于连接储液器与测试装置的阀口。
6.带有如权利要求1-5任意项所述生物反应器在线取样装置的检测系统，其特征在于：还包括生物反应器与测试装置；所述生物反应器设有出入口，分别通过管路与横向过滤模块的原液入口和原液出口导通连接；所述六通选择阀阀口通过管路与测试装置导通连接。
7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于：所述测试装置为液质联用仪。
8.如权利要求6或7所述检测系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据测试需要配置待测样品目标物质的标准溶液，并绘制峰面积-浓度标准曲线；
S2、控制模块控制第二蠕动泵运作，带动生物反应器内培养液沿循环通路流动；经横向过滤模块过滤后，将待测滤液输送至六通选择阀处；
S3、经控制模块控制导通滤液入口与注射器、稀释液瓶与注射器之间通路，关闭其他通路；待稀释液与待测滤液于注射器内混合均匀后，切换六通选择阀，关闭以上通路，导通注射器与测试装置之间通路，并完成进样；
S4、测试装置测得待测滤液中目标物质的出峰面积，代入步骤S1绘制的标注曲线中，计算的到目标物质的浓度。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤S2控制模块控制第二蠕动泵运作时，同时控制第一蠕动泵运作；第一蠕动泵驱动滤液定向流动，使滤液流入废液收集装置，与之并联的另一出口管路流至六通选择阀。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤S3后，控制模块控制关闭注射器与测试装置之间通路，导通清洗液瓶与注射器之间通路，完成对注射器的清洗；以上步骤完成后，关闭以上通路，并导通注射器与废液瓶之间通路，完成废液的排出；完成以上步骤后，重置六通选择阀至初始状态。
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