CN113490738A - 用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续系统和生物工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自动化集成连续生物工艺系统和生物工艺，其能够以不间断的方式连续生产治疗性蛋白质并可从实验室规模扩展到生产规模。本发明提供了一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统和生物工艺，其中该系统和工艺由选自监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)、可编程逻辑电路(PLC)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)、信息中继系统和用于在线测试的自动化UPLC/HPLC采样的一个或多个控制系统控制，从而以运行所述系统和工艺，并以不间断的方式连续生产治疗性蛋白质。

Description

用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续系统和生物工艺

技术领域

本发明总体上涉及用于生产治疗性蛋白质的连续生物工艺的系统。具体地，本发明涉及能够连续生产治疗性蛋白质并且可从实验室规模扩展到生产规模的自动化集成连续生物工艺系统和生物工艺。

背景技术

背景描述包括可能有助于理解本发明的信息。不承认此处提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认任何特别或隐含引用的出版物是现有技术。

对治疗性蛋白质意义的鉴定已经导致了生物制药行业的新革命。然而，治疗性蛋白质的生产通常会观察到它们的带电异构体，这在很大程度上干扰了获得高产量和产品质量所需的分离和纯化过程。

传统上，生物制药公司使用批处理来制造治疗性蛋白质，其中在工艺流移动到下一步骤之前执行和完成单元操作。最近，生物制药公司正在采用连续生物工艺制造治疗性蛋白质。在连续生物工艺中，随着每个单元工艺的完成，加工过的产品被转移到下一步。连续生物处理因其稳态操作、小设备尺寸、高容量生产率、简化的工艺流程、低循环时间和降低资本成本等各种优点而引起了广泛的关注。

在现有技术中已经尝试使用连续生物工艺方法制造治疗性蛋白质的各种方法。然而，这种现有的连续生物工艺是包含独立单元的伪连续工艺，每个单元都执行其功能。在这样的系统中，每个单元操作在各个系统参数之间的通信有限，并且大多是孤立地运行的。此外，当前的连续工艺主要涉及离线层析分析，对正在进行的过程的反馈有限或没有反馈。随着生物制药公司的不断发展，提供可以从实验室规模扩展到生产规模的自动化集成生物工艺和系统来制造治疗性蛋白质的需求尚未得到满足。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统。

本发明的另一个目的是提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，该过程使用具有通信和可编程控制功能的控制系统，以使用主控制器调节整个工艺参数。

本发明的另一个目的是提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，该工艺可以以连续和不间断的方式进行。

发明内容

本发明的一些方面涉及一种用于以不间断方式生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统，其使用具有通信和可编程控制功能的控制系统，以使用主控制器调节整个工艺参数。

在本发明的一个方面提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统(100)，其包括：

生物反应器(103)，其用于在培养基中培养能够产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，该生物反应器(103)能够使用交替切向流(ATF)过滤器(109)以收集包含分泌到培养基中的蛋白质的收获物；

第一层析系统(119)，其连接到生物反应器(103)的ATF过滤系统(109)且没有任何中间保持容器，以纯化收获的重组治疗性蛋白质并提供蛋白A洗脱液；

病毒灭活系统(126)，其包括连接到第一层析系统(119)的病毒灭活容器(128)以收集蛋白A洗脱液并使可能存在于所述洗脱液中的病毒灭活，并且所述病毒灭活容器(128)配置为自动调节蛋白A洗脱液的pH值；

收集容器(136)，其通过一个或多个过滤器与所述病毒灭活容器(128)连接以接收病毒灭活、中和及过滤的蛋白A洗脱液，其中所述一个或多个过滤器(224)和(226)配置为从接收自所述病毒灭活容器的中和的蛋白A洗脱液中去除沉淀形式的杂质；

第二层析系统(137)，其与收集容器(136)连接以从所述收集容器(136)接收过滤的蛋白A洗脱液并提供进一步纯化的蛋白质。

在一个方面，本发明提供了自动化集成连续生物工艺系统，其任选地还包括连接到第二层析系统(137)的额外收集容器(140)，以接收和储存纯化的蛋白质，其可以任选地使用一个或多个过滤器(142)进行纯化并提供进一步纯化的治疗性蛋白质。

在一个方面，本发明提供一种自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括一个或多个控制系统，所述控制系统选自：监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)(未显示)、可编程逻辑电路(PLC)(112)、工业PC、分布式控制系统(DCS)(未显示)、与诸如层析系统1(119)在内的各个系统可操作地连接的输入-输出模块或IO盒(130)和(132)、病毒灭活系统(128)、收集容器(136)、层析系统2(137)和消息中继系统(未显示)。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括一个或多个电磁或气动夹管阀(114)，并且任选地包括流量计、气泡传感器、压力传感器和负载池(load cell)，以用于产生一个反馈回路，从而保持系统各个组件之间的流体流动，避免形成气泡并调节液体流量。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，该系统还包括通过阀门(114)与所述生物反应器连接的浪涌袋(surge bag)(116)。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其包括病毒灭活容器(128)，连接到用于测量蛋白A洗脱液pH值的pH值变送器的一个或多个pH探针，包括PLC和泵(122)依次连接到装有用于滴定的酸和碱的容器(124)的自动滴定器，用于检查容器中流体液位的液位传感器，以及用于测量实时比浊法浊度单位(NTU)的在线浊度测量传感器。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中在病毒灭活容器和收集容器之间的每个过滤器是0.2-0.45微米过滤器。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中所述病毒灭活容器和所述收集容器由玻璃或不锈钢制成。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中所述第一层析系统包括一个或多个亲和层析柱，所述第二层析系统包括一个或多个多模式阴离子交换柱和一个或多个阳离子交换柱。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括原位清洁(CIP)系统(120)，其用于定期清洁层析系统入口、病毒灭活容器、收集容器和液流管。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括来自用于细胞计数和营养分析的生物反应器的自动收获采样，以及用于连续生物工艺中的在线层析分析的在不同位置的自动采样。

在一些其他方面，本发明涉及用于以不间断的方式生产治疗性蛋白质的连续生物工艺，其可以从实验室规模扩大到生产规模。

在一个方面，本发明提供用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，其中该工艺由一个或多个控制系统控制，所述控制系统选自监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)、可编程逻辑电路(PLC)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)和消息中继系统，并且该工艺包括以下步骤：

(a)在能够使用交替切向流(ATF)过滤器(109)的生物反应器(103)中培养能够在液体培养基中产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，并收集包含分泌在培养基中的蛋白质的渗出收获物(bleeding harvest)；

(b)将来自生物反应器(103)的包含治疗性蛋白质的细胞培养收获物供给到第一层析系统(119)中以提供蛋白A洗脱液；

(c)将来自第一层析系统(119)的蛋白A洗脱液供给到病毒灭活容器(128)中，并使蛋白A洗脱液中的病毒灭活；

(d)使病毒灭活和中和的蛋白A洗脱液通过一个或多个过滤器以去除在病毒灭活和中和步骤期间形成的任何沉淀形式的杂质，并在收集容器(136)中收集过滤的蛋白A洗脱液；和

(e)将经中和及过滤的蛋白A洗脱液供给至第二层析系统(137)以提供纯化的蛋白质。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其任选地还包括将从第二层析系统(137)接收的纯化的蛋白质储存在附加容器(140)中。在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其任选地还包括一个或多个使纯化的蛋白质通过一个或多个过滤器(142)以进一步纯化治疗性蛋白质的步骤。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中哺乳动物细胞在生物反应器(103)中培养，该生物反应器是能够使用交替切向流(ATF)技术的灌注生物反应器。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中使用第一层析系统泵将分级的细胞培养收获物从生物反应器(103)直接供给到第一层析系统(119)中。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中使用第一层析系统泵将澄清的细胞培养收获物直接从生物反应器(103)进料到第一层析系统(119)中。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中使用一个或多个亲和层析柱进行第一层析，以从生物反应器纯化包含治疗性蛋白质的细胞培养收获物并提供蛋白A洗脱液。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中病毒灭活步骤中蛋白A洗脱液的pH值通过比例积分微分(PID)控制器、可编程逻辑控制器(PLC)或工业个人计算机(IPC)控制器自动调节。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中在第二层析步骤中分别使用一个或多个多模式阴离子交换柱和一个或多个阳离子交换柱进行，以提供纯化的蛋白质。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，该工艺包括使用用于定期清洁层析系统、管和容器以保持不间断操作的(CIP)系统(120)进行在线测试和原位清洁的自动采样。

在一个方面，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、重组蛋白、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白质片段、肽、免疫球蛋白或其任何组合。

从以下优选实施方式的详细描述中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。

附图说明

包括附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图被并入并构成本说明书的一部分。附图示出了本公开的示例性实施方式并且与说明书一起用于解释本公开的原理。

图1示出了上游工艺的示例性工艺流程。

图2示出了下游工艺的示例性工艺流程。

图3是显示用于制造治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统的概览的示意图。

图4是显示用于制造治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统的病毒灭活系统的概览的示意图。

图5是显示用于制造治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统的层析1的CIP系统的概览的示意图。

图6是显示乳糖与葡萄糖在不同天数对细胞生长的影响的图。

图7是层析系统1的色谱图，显示了pH峰、洗脱峰和电导峰。

图8是层析系统2的色谱图，显示了洗脱峰、流过峰和电导峰。

具体实施方式

以下是对本公开的实施方式的详细描述。实施方式如此详细以清楚地传达本公开。然而，所提供的细节量并不旨在限制实施方式的预期变化；相反，其意图是覆盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等效和替代。

本文中的所有出版物均通过援引并入，就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示为通过援引并入一样。如果并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义，而参考文献中该术语的定义不适用。

在整个说明书中提及“一个实施方式”或“一种实施方式”意味着结合实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方式中。因此，在本说明书各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定都指代相同的实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表达组分的量、性质(例如浓度、反应条件等)的数字在一些情况下应理解为受到术语“约”的修饰。因此，在一些实施方式中，所述说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方式中，应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释数值参数。尽管说明本发明的一些实施方式的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施方式中阐述的数值尽可能准确地报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含由它们各自的测试测量中发现的标准偏差不可避免地引起的某些误差。

如在本文的描述和随后的权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数指代。此外，如本文的描述中所用，除非上下文另有明确规定，否则“在……中”的含义包括“在……之中”和“在……之上”。

除非上下文另有要求，在整个以下说明书中，词语“包括”及其变体，例如“含有”和“包含”应解释为开放和包括性的意义，即“包括但不限于”。

本文对数值范围的描述仅旨在作为一种简写方法，其单独指代落入该范围内的各个单独数值。除非本文另有说明，否则每个单独的数值都被并入到说明书中，如同在本文中单独叙述。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。本文针对某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不对所要求保护的发明的范围施加限制。说明书中的语言都不应被解释为指明任何未要求保护的要素对本发明的实施是至关重要的。

此处公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独地或与组的其他成员或本文中发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可以包含在一个组中或从一个组中删除。当发生任何此类包含或删除时，说明书在此被视为包含修改后的组从而满足书面要求。

下文的描述以及本文描述的实施方式是通过说明本发明原理和各方面的特定实施方式的一个或多个实例的方式提供的。提供这些实例是出于解释这些原理和本发明的目的，而非进行限制。

还应当理解，本公开可以以多种方式实现，包括作为系统、方法或设备。在本说明书中，这些实施方式或本发明可以采用的任何其他形式可以被称为工艺。通常，在本发明的范围内可以改变所公开工艺的步骤的顺序。

本文提供的本发明的标题和摘要仅为方便起见，并不对实施方式的范围或含义进行解释。

以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方式。尽管每个实施方式代表发明要素的单个组合，但认为本发明主题包括所公开的要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，而第二个实施方式包括要素B和D，则本发明的主题也被认为包括A、B、C或D的其余组合，即使没有明确披露。

如本文所用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语在下文未定义，则应给予相关领域技术人员给出的最广泛定义，如提交申请时的印刷出版物和已授权专利中所反映的那样。

如本文所用，术语“连续生物工艺”是指具有两个以上串联处理步骤的任何工艺，其中来自上游步骤(单元操作)的输出连续地转移到下游步骤(单元操作)直到最终的层析步骤，并且其中在开始下一个处理步骤之前，上游处理步骤不需要运行到完成。在连续过程中，目标产品的某些部分总是在处理系统中移动。理想地，连续工艺被调节以使得在最大可能的程度上，连续过程的每个步骤或单元操作同时并且以基本相同的生产率运行。通过这种方式，最大限度地压缩了循环时间，并实现了尽可能短的完成时间。

术语“连续转移”是指产品流从上游单元操作转移到下游单元操作，意味着两个单元操作之间的连接或链接使得上游单元操作将产品流(直接或通过其他组件)转移至第二(下游)单元操作，并且下游单元操作在上游单元操作运行完成之前开始(即，两个连续单元操作同时处理流入它们的产品流，以针对整个操作运行(两个单元操作构成其一部分)的至少一部分)。

如本文所用，术语“灌注细胞培养过程”是指灌注培养，其通过将新鲜培养基连续供给至生物反应器并不断去除无细胞的用过的培养基(同时将细胞保留在反应器中)来进行；因此，与连续培养相比，灌注培养可以获得更高的细胞密度，因为细胞通过细胞保留装置保留在反应器内。灌注速率取决于细胞系的需求、进料中营养物质的浓度和毒性水平。

术语“细胞培养基”是指在培养细胞的情况下使用的所有种类的培养基。通常，细胞培养基包含氨基酸、作为能源的至少一种碳水化合物、微量元素、维生素、盐和可能的附加成分(例如，以影响细胞生长和/或生产力和/或产品质量。

术语“治疗性蛋白质”是指已经从液体培养基中存在的污染蛋白质、脂质和核酸或从宿主细胞(例如哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)和生物污染物(例如，病毒和细菌污染物)充分纯化或分离的重组蛋白质，并且可以配制成用于治疗或预防不同疾病或病症的药物产品。治疗性蛋白质的代表性实例包括但不限于抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白质片段和免疫球蛋白。

术语“抗体”是指血清的功能成分并且通常被称为分子的集合(抗体或免疫球蛋白、片段等)或分子。抗体分子能够与特定的抗原决定簇结合或反应，这继而可能导致特定的免疫效应或机制。

术语“单克隆抗体”是指由细胞或细胞系的单个克隆产生并由相同的抗体分子组成的抗体。

如本文所用，术语“保留时间”是指一半量的溶质从层析系统洗脱的时间。其由柱的长度和溶质的迁移速度决定；其可以为1-30分钟。

如本文所用，术语“洗脱液”是指从包含可检测量的重组治疗性蛋白质的层析柱或层析膜洗脱的流体。

本公开使用了各种缩写，其完整形式在下文提供：

ATF：交替切向流

CV：柱体积

CEX：阳离子交换(CEX)层析

CIP：就地清洁

DO：溶解氧

DCS：分布式控制系统

HPLC：高效液相层析

IPC：工业PC

min：分钟

mM：毫摩尔

mAU：毫吸光度单位

mL：毫升

mS/cm：毫西门子/厘米

mA：毫安培

NTU：比浊法浊度单位

NaOH：氢氧化钠

PLC：可编程逻辑电路

PCC：周期性逆流

PID：比例-积分-微分

RV：反应器体积

TTL：晶体管-晶体管逻辑

UV：紫外线

UPLC：超高效液相层析

VI：病毒灭活

V：伏特

VCC：活细胞计数

在一些实施方式中，本发明涉及用于以不间断方式连续生产治疗性蛋白质的自动化集成生物工艺系统，该系统由具有通信和可编程控制功能的控制系统控制，以使用主控制器调节整个工艺参数。

现在将参照用于连续制造治疗性蛋白质的集成自动化系统，通过以下实施方式更具体地描述本发明。

图3示出了根据本发明的一个实施方式的以不间断方式连续生产治疗性蛋白质的示例性自动化集成系统，如下文所述：

用于连续生产治疗性蛋白质的自动化集成系统(100)包括：

生物反应器(103)，其用于在培养基中培养能够产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，该生物反应器(103)安装有附带有叶片(105)和进料入口(104)的搅拌器(102)，并且能够利用交替切向流(ATF)过滤器(109)以收集包含分泌到反应器的培养基中的蛋白质的收获物；

第一层析系统(119)，其连接到生物反应器(103)的ATF过滤系统(109)且没有任何中间保持容器，以从由培养的哺乳动物细胞产生的培养基中纯化重组治疗性蛋白质，并提供蛋白A洗脱液；

病毒灭活系统(126)，其包括连接到第一层析系统(119)的病毒灭活容器(128)以收集蛋白A洗脱液并使可能存在于蛋白A洗脱液中的病毒灭活，并且所述病毒灭活容器(128)配置为自动调节蛋白A洗脱液的pH值；

收集容器(136)，其通过一个或多个过滤器与所述病毒灭活容器(128)连接以在中和的蛋白A洗脱液通过一个或多个过滤器时从病毒灭活容器(128)接收中和的蛋白A洗脱液，从而从蛋白A洗脱液中去除沉淀形式的杂质；

第二层析系统(137)，其与收集容器(136)连接以从所述收集容器(136)接收经中和及过滤的蛋白A洗脱液并提供进一步纯化的蛋白质。

在一个实施方式中，本发明提供了自动化集成连续生物工艺系统，其任选地还包括连接到第二层析系统(137)的额外收集容器(140)，以接收和储存纯化的蛋白质，其可以任选地使用一个或多个过滤器(142)并提供进一步纯化的治疗性蛋白质。

在一个实施方式中，本发明提供一种自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括一个或多个控制系统，所述控制系统选自：监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)(未显示)、可编程逻辑电路(PLC)(112)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)(未显示)、与包括层析系统1(119)的单独系统可操作地连接的输入-输出模块或IO盒(130)和(132)、病毒灭活系统(128)、收集容器(136)、层析系统2(137)和消息中继系统(未显示)。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括一个或多个电磁或气动夹管阀(114)，并且任选地包括流量计、气泡传感器、压力传感器和负载池，以用于产生一个反馈回路，从而保持系统各个组件之间的流体流动，避免形成气泡并调节液体流量。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，该系统还包括通过夹管阀(114)中的一个与所述生物反应器连接的浪涌袋(116)。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其包括病毒灭活容器(126)，一个或多个连接到用于测量蛋白A洗脱液pH值的pH值变送器的pH探针，以及包括依次连接到装有用于滴定的酸和碱的容器(124)的PLC和泵(122)的自动滴定器，并且任选地包括用于检查容器中流体液位的液位传感器，以及用于测量实时比浊法浊度单位(NTU)的在线浊度测量传感器。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中在病毒灭活容器和收集容器之间的每个过滤器是0.2-0.45微米过滤器。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中所述第一层析系统包括一个或多个亲和层析柱，所述第二层析系统包括一个或多个多模式阴离子交换柱和一个或多个阳离子交换柱。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中所述病毒灭活容器和所述收集容器由玻璃或不锈钢制成。

在一个实施方式中，本发明提供了自动化集成连续生物工艺系统，其中使用由合适的材料(例如硅树脂和生物戊二烯)制成的管来维持流体流动。在一个实施方式中，所使用的连接器是无菌连接器以减少系统生物负荷。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括原位清洁(CIP)系统(120)，其用于定期清洁层析系统、病毒灭活容器、收集容器和管。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺系统，其中该系统还包括来自用于细胞计数和营养分析的生物反应器的自动收获采样，以及用于连续生物工艺期间的在线层析分析的在不同位置的自动采样。

在一个实施方式中，自动化集成连续生物工艺系统任选地包括超高效液相层析(UPLC)系统(108)和(138)。在一些实施方式中，本发明中使用的第一层析系统和第二层析系统可以是高压液相层析(HPLC)。在另一个实施方式中，该系统提供了使用自动采样系统的集成/分析系统的条件。控制器使用合适的一个或多个数字接口触发HPLC系统来启动分析运行，所述一个或多个数字接口选自但不限于开放平台通信(OPC)、modbus TCP/IP、EtherCAT、Profibus、Profinet、profibus和工业以太网接口。

在一个实施方式中，控制器调节多端口电动旋转阀或流量选择阀以调节液流。控制器调节精密泵启动并打开生物反应器采样口阀门。收集程序化量的流体并供HPLC系统执行分析。HPLC系统根据设定的程序完成分析。HPLC系统将分析数据发送到SCADA系统。

在另一个实施方式中，由具有SCADA软件的IPC组成的主控制器控制数据的可视化、监控以及作为工艺参数的历史记录器。主控制器使用选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、profinet、profibus或工业以太网中的一个或多个数字接口与各个系统(例如生物反应器、第一层析系统、第二层析系统和病毒灭活系统)连接。

图4图示了根据本发明实施方式的病毒灭活系统的概览。病毒灭活系统(200)包括由玻璃或不锈钢制成的病毒灭活(VI)容器(201)以收集来自第一层析系统的蛋白A洗脱液。VI容器(201)包含带有多个端口的顶置式搅拌器/磁力搅拌器(216)，以用于添加和去除洗脱液。病毒灭活系统包括连接到变送器的pH探针(220)，以用于测量从第一层析系统接收的蛋白A洗脱液的pH。该系统还任选地包括用于容纳各种液体(例如酸、碱、NaOH、水和缓冲液)的负载池(202)、(206)、(208)、(210)、(212)和(214)。该系统还包括0.2-0.45微米过滤器(224)和(226)以去除在中和步骤期间可能形成的任何沉淀物。该系统可以任选地包括流量传感器(250-1)至(250-3)以监测各种液体到VI容器(201)和收集容器(230)的流量。该系统还可以包括用于检查VI容器中的流体液位的液位传感器，以及用于监测各个负载池中的液位的负载池传感器(248-1)至(248-6)。如果控制系统中的一个过滤器在连续操作期间被堵塞，则可以在两个过滤器之间自动切换流体路径，该系统可以是基于(256-1)和(256-2)的压力传感器或使用拨动开关。该系统可在过滤器堵塞和切换时发出警报以供操作员干预。该系统还可以任选地包括在灭活容器之后的浊度传感器(254)以测量比浊法浊度单位(NTU)。在超出阈值时，系统将触发警报以供操作员干预。连接在病毒灭活容器之后的流体路径中的可选气泡传感器(252)可以触发流体路径的切换以防止气泡进入层析系统。气泡捕集器(未显示)可防止气泡进入层析系统。病毒灭活(VI)容器经过专门设计以允许温和地添加水、洗脱液、酸、碱和缓冲液，从而避免液体起泡和飞溅。该系统由收集容器(230)组成，该收集容器是用于收集病毒灭活后的洗脱液的容器。收集容器(230)包含带有多个端口的顶置式搅拌器/磁力搅拌器(236)，以用于添加和去除各种液体和洗脱液。

在一个实施方式中，病毒灭活系统包括各种传感器从而不间断地以连续和自动模式监测和调节病毒灭活系统。

在一个实施方式中，病毒灭活系统任选地包括液位或负载池传感器，所述传感器选自但不限于用于监测酸的液位的(248-1)、用于监测碱的液位的(248-2)、用于监测NaOH的液位的(248-3)、用于监测水的液位的(248-4)、用于监测缓冲液的液位的(248-5)和(248-6)。

在一个实施方式中，病毒灭活系统任选地包括流量传感器以监测各种液体到VI容器(201)和收集容器(230)的流量，流量传感器选自但不限于用于监测酸的流量的(250-1)、用于监测碱的流量的(250-2)以及用于监测NaOH、水和缓冲剂的流量的(250-3)。

在一个实施方式中，病毒灭活系统可操作地连接到主控制器，例如PID、PLC或IPC，以用于pH的实时测量和控制。控制单元可针对多个参数进行编程，例如pH设置点、保持时间、搅拌器rpm、酸和碱泵速率控制、CIP循环控制。病毒灭活系统由选自但不限于用于各种设置(238)、用于主电源(240)、用于自动或手动模式选择(242)、用于警报(244)、用于校准(258)以及用于关闭系统(246)的各种装置控制。控制器向系统中的各种执行器例如(阀门(222-1)至(222-10)和泵(204-1)至(204-5))发出信号，以调节液体流量并控制酸碱添加到蛋白A洗脱液，从而用于pH调节。

在一个实施方式中，控制器接收和发送来自层析系统的信号，例如模拟信号(例如0-10V或4-20mA)或来自TTL逻辑或更高级的一个或多个接口的数字信号，所述一个或多个接口选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、Profibus、Profinet、profibus和工业以太网。来自第一层析系统的信号触发病毒灭活程序。变送器测量pH探针(220)产生的信号，并将值传递到主控制器。系统根据控制器中的设定点自动调节洗脱液的pH值，这会激活酸(202)或碱(206)添加，然后是病毒灭活步骤的保持时间。在病毒灭活保持时间完成并调节设定点2的pH值后，系统将病毒灭活后的洗脱液从病毒灭活容器(201)泵入收集容器(230)。流体路径通过使用常闭电磁阀/气动夹管阀(222-1)至(222-3)进行数字控制，其可根据需要阻止和转移流体流动。

在一个实施方式中，在将蛋白A洗脱液从病毒灭活容器转移到收集容器后，控制器向第二层析系统发送信号例如模拟信号(例如0-10V或4-20mA)或来自TTL逻辑的数字信号或更高级的一种或多种数字接口，其选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、Profibus、Profinet、profibus和工业以太网。触发器启动将洗脱液从收集容器加载到第二层层析系统中，以进一步纯化蛋白A洗脱液并提供纯化的蛋白质。

在一个实施方式中，控制器启动病毒灭活容器中的CIP循环。在CIP循环期间的VI容器中，控制器向泵(204-4)发出信号启动并打开阀门(222-5)，以使NaOH从负载池(208)流出。NaOH流向VI容器的流量通过流量传感器(250-3)监测并由泵(204-4)控制。在用保持时间设定装置(218)调整以将NaOH保持在VI容器中的设定时间已经过去后，控制器向废液泵(204-3)发出信号以从VI容器中移除NaOH并触发用于废液出口(228)的废液阀(222-4)的打开。排空NaOH的VI容器触发气泡传感器(252)，它向控制器发送信号并停止废液泵(204-3)及其阀门(222-4)，或者，如果气泡传感器不可用，则控制器也可以通过编程来运行泵以设定时间，直到容器排空为止。然后控制器向泵(204-4)发出信号以启动并打开阀门(222-6)，以允许水从负载池(210)流出并调节通过阀门(222-6)的水流，由水传感器(250-3)监测并由泵(204-4)控制到VI容器(201)。在VI容器中保持水的设定时间过去后，控制器向废液泵(204-3)发出信号以从VI容器中排出水并触发废液阀(222-4)的打开。排空VI容器中的水将触发气泡传感器(252)，该传感器向控制器发送信号并停止废水泵(204-3)及其阀门(222-4)，或者，如果气泡传感器不可用，控制器也可以通过编程来运行泵持续设置的时间，直到容器排空。然后控制器向泵发出信号以启动并打开阀(222-7)，以启动来自负载池(212)的缓冲液流动。该信号用于从VI容器中排空缓冲液，并且一旦蛋白A洗脱液准备好加载到VI容器中，就会由第一层析系统触发。控制器接收该信号并触发废液泵以从VI容器中去除缓冲液并触发废液阀(222-4)的打开。排空缓冲液的VI容器触发气泡传感器(252)，该传感器向控制器发送信号并停止废液泵(204-3)及其阀门(222-4)，或者，如果气泡传感器不可用，则控制器也可以通过编程来运行泵持续设定的时间，直到容器排空。

在完成病毒灭活保持时间和调节设定点2的pH值后，系统将病毒灭活后的洗脱液从病毒灭活容器(201)泵入收集容器(230)。流体路径通过使用常闭电磁阀/气动夹管阀(222-1)至(222-3)进行数字控制，所述夹管阀可根据需要阻止和转移流体流动。

在一个实施方式中，病毒灭活后，来自VI容器(201)的蛋白A洗脱液通过数控电磁阀/气动夹管阀(222-1)，然后通过另一数控电磁阀/气动夹管阀(222-2)和/或(222-3)，并使其通过0.2-0.45微米过滤器(224)和/或(226)以去除在病毒灭活步骤期间可能形成的任何沉淀物。任选地，可以在流体路径中提供用于压力传感器(256-1)和(256-2)的装置，如果在连续操作期间过滤器之一被堵塞时则允许在两个过滤器之间自动切换。该系统在过滤器堵塞和切换时发出警报以供操作员干预。任选地，可以在灭活后的容器中提供用于浊度传感器(254)的装置，以测量NTU，在超出阈值时，系统将触发警报以供操作员干预。任选地，可以在病毒灭活容器后提供气泡传感器(252)，其触发关闭流体路径以防止气泡进入层析系统，并且气泡捕集器防止气泡进入层析系统。在通过过滤器(224)和(226)澄清后，来自VI容器(201)的病毒灭活和中和蛋白质洗脱液转移到收集容器(230)中，之后，控制器向第二层析系统发送信号，例如模拟信号(例如0-10V或4-20mA)或来自TTL逻辑的数字信号或更高级的一个或多个数字接口，所述数字接口选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、Profibus、Profinet、profibus或工业以太网。触发器开始将来自收集容器的蛋白质洗脱液通过端口(232)加载到第二层析系统中。

图5示出了根据本发明的实施方式的用于第一层析系统的原位清洁(CIP)系统的概览。用于层析系统的CIP系统(300)可操作地连接到控制器，该控制器向系统中的各种致动器(例如阀门和泵)发出信号以调节流体的流动。控制器接收和发送来自层析系统的信号，例如模拟信号(例如0-10V或4-20mA)或来自TTL逻辑的数字信号或更高级的一个或多个数字接口，所述数字接口选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、Profibus、Profinet、profibus和工业以太网。来自第一层析系统(314)的信号触发样品入口CIP程序。控制器打开排放阀(306-2)以将流体/收获物引导至浪涌袋(308)并启动排放泵(310)。控制器打开CIP NaOH阀(306-3)，启动泵(312)并同时关闭阀(306-1)。在NaOH流过第一层析系统的设定时间过去后，控制器向NaOH阀(306-3)发出信号以将其关闭并同时打开水阀(306-4)。在水流过第一层析系统的设定时间过去后，控制器向水阀(306-4)发出信号以将其关闭并同时打开缓冲阀(306-5)。在缓冲液流过第一层析系统的设定时间过去后，控制器向缓冲液阀(306-5)发出信号以将其关闭，同时打开排放阀(306-2)、泵(310)和阀(306-1)，从而实现在工艺期间第一层析系统的原位清洁。

本公开的进一步实施方式涉及能够连续生产治疗性蛋白质的自动化集成生物制造工艺，其中该工艺由一个或多个选自监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)、可编程逻辑电路(PLC)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)和消息中继系统的控制系统控制，从而以不间断的方式运行该工艺。

在一个实施方式中，本发明涉及用于以不间断的方式生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，其可从实验室规模扩展到生产规模，该工艺包括以下步骤：

(a)在能够使用交替切向流(ATF)过滤器(109)的生物反应器(103)中培养能够在液体培养基中产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，并收集包含分泌在培养基中的蛋白质的渗出收获物；

(b)将来自生物反应器(103)的包含治疗性蛋白质的细胞培养收获物供给到第一层析系统(119)中以提供蛋白A洗脱液；

(c)将来自第一层析系统(119)的蛋白A洗脱液供给到病毒灭活容器(128)中，并使可以存在于蛋白A洗脱液中的病毒灭活；

(d)使病毒灭活和中和的蛋白A洗脱液通过一个或多个过滤器以去除在病毒灭活和中和步骤期间形成的任何沉淀形式的杂质，并在收集容器(136)中收集过滤的蛋白A洗脱液；和

(e)将经中和及过滤的蛋白A洗脱液供给至第二层析系统(137)以提供进一步纯化的蛋白质。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中哺乳动物细胞在生物反应器(103)中培养，该生物反应器是能够使用交替切向流(ATF)技术的灌注生物反应器。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中使用第一层析系统泵将液体培养基从生物反应器(103)直接供给到第一层析系统(119)中。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中第一层析步骤使用一个或多个亲和层析柱进行，以用于纯化包含来自生物反应器的治疗性蛋白质的细胞培养收获物，以及提供蛋白A洗脱液。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中病毒灭活步骤中蛋白A洗脱液的pH值使用比例积分微分(PID)控制器、可编程逻辑控制器(PLC)或工业个人计算机(IPC)控制器自动调节。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其中在第二层析步骤中使用一个或多个多模式阴离子交换柱和一个或多个阳离子交换柱进行以提供纯化的蛋白质。

在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其任选地进一步包括将纯化的蛋白质储存在从第二层析系统(137)接收的额外收集容器(140)中。在一个实施方式中，本发明提供自动化集成连续生物工艺，其任选地还包括一个或多个使纯化的蛋白质通过一个或多个过滤器(142)的步骤，以进一步纯化治疗性蛋白质。过滤器可以选自纳滤器、超滤器和渗滤器。

在一个实施方式中，本发明提供了自动化集成连续生物工艺，其中该工艺包括用于在线测试和使用(CIP)系统(120)进行原位清洁的自动采样，以用于定期清洁层析系统和其组件(包括层析柱、管和容器)，以保持不间断运行。

在一个实施方式中，生物工艺任选地包括自动HPLC采样，以用于使用监督控制和数据采集(SCADA)控制系统、原位清洁(CIP)系统和液体流动路径的切换来保持不间断系统操作的在线测试工艺参数。在一个实施方式中，生物工艺任选地进一步包括自动UPLC采样，以用于使用监督控制和数据采集(SCADA)控制系统、原位清洁(CIP)系统和液体流动路径的切换来保持不间断系统操作的在线测试工艺参数。

在一个实施方式中，本发明的集成连续生物工艺可以由主控制器控制，该主控制器由带有SCADA软件的IPC组成，用于控制数据的可视化、监测和作为过程参数的历史记录器。主控制器能够使用选自但不限于OPC、modbus TCP/IP、EtherCAT、profinet、profibus或工业以太网中的一个或多个数字接口控制各个系统(例如生物反应器、第一层析系统、第二层析系统和病毒灭活系统)。

在另一个实施方式中，本发明的自动化生物工艺提供了从上游工艺到下游工艺的产品流的连续转移。

在一个实施方式中，上游工艺在具有适合于哺乳动物细胞培养的控制系统的自动化集成连续生物工艺系统的生物反应器中进行。在一个实施方式中，上游工艺在能够使用ATF技术的生物反应器中进行，其中使用HPLC系统泵从ATF收集包含产生的治疗性蛋白质的收获物。上游工艺的示例性工艺流程如图1所示。

在一个实施方式中，在生物反应器中培养哺乳动物细胞的上游工艺采用灌注细胞培养工艺，培养哺乳动物细胞的批次持续时间为3至16天。此外，上游工艺可以通过在本领域技术人员已知的用于促进哺乳动物细胞在生物反应器中生长的不同细胞培养基中培养细胞来进行。

在一个实施方式中，下游工艺包括在连续自动化集成生物工艺系统中的上游工艺期间产生的治疗性蛋白质的纯化步骤，其中将澄清的细胞培养液供应到包括一个或多个亲和柱的第一层析系统中以提供蛋白A洗脱液，在病毒灭活系统中灭活和中和蛋白A洗脱液，并供应到包括一个或多个多模式阴离子交换层析柱和一个或多个阳离子交换层析柱的第二层析系统中，以提供纯化的蛋白质。下游工艺的示例性工艺流程如图2所示。

在本公开的用于产生目的蛋白质的系统的上游和下游工艺和操作期间的不同实施方式，可以使用选自能够产生所需目的蛋白质的天然、野生、突变或基因工程化细胞的细胞；适合所用细胞的营养或培养基；各种化学品；试剂；在层析步骤中使用的树脂；以及任何合适的材料。在一些实施方式中，采用的不同缓冲液或缓冲系统包括适合作为洗涤缓冲液、追踪缓冲液、平衡缓冲液、洗脱缓冲液等的化学品。

自动化集成连续系统和生物工艺能够产生选自治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、工程化蛋白质、免疫原性蛋白质、蛋白质片段、免疫球蛋白或其任何组合。

通过根据本发明的自动化集成连续生物工艺制备的治疗性蛋白质选自由以下组成的组：帕尼单抗、奥马珠单抗、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿克托舒单抗、阿达木单抗、阿德卡木单抗、阿非莫单抗、阿夫妥珠单抗、阿拉珠单抗、阿拉珠单抗、阿仑单抗、阿利库单抗、阿妥莫单抗、阿麦妥单抗、阿麦妥单抗、安那莫单抗、安芦珠单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿替奴单抗、托珠单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、贝索单抗、bezlotoxumab、比西单抗、博纳吐单抗(blinatumomab)、卡那单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗(cetixumab)、西妥木单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依库丽单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗、依帕珠单抗、厄妥索单抗、埃达珠单抗、芬妥木单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、伊马曲单抗、英夫利西单抗、伊诺莫单抗、inotuzumab、拉贝珠单抗、来瑞珠单抗、moxetumomab、那他珠单抗、纳武单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲罗芦单抗、西莫白介素单抗(tucotuzumab)、曲妥珠单抗、优特克单抗、维多珠单抗、维妥珠单抗、扎鲁木单抗、扎昔单抗(zatuximab)、酶、蛋白质、免疫原性或抗原性蛋白质或蛋白质片段、阿糖苷酶α、拉罗尼酶、阿巴西普、加硫酶、促黄体素α、抗血友病因子、阿加糖酶-β、干扰素β-la、达贝泊汀α、替奈普酶、依那西普、凝血因子IX、促卵泡激素、干扰素β-la、伊米苷酶、链道酶α、依泊汀α、胰岛素或胰岛素类似物、美卡舍明(mecasermin)、因子VIII、因子VIIa、抗凝血酶III、蛋白C、人白蛋白、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-11、拉罗尼酶(laronidase)、idursuphase、galsulphase、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原激活剂、促甲状腺激素α、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、己糖胺酶A和己糖胺酶B。

虽然前面描述了本公开的各种实施方式，但是在不脱离其基本范围的情况下可以设计本公开的其他和进一步的实施方式。本发明的范围由随后的权利要求确定。本发明不限于所描述的实施方式、版本或实施例，当结合本领域普通技术人员可获得的信息和知识时，包括这些实施方式、版本或实施例以使得本领域普通技术人员能够制造和使用本发明。

实施例

以下列实施例的形式进一步解释本发明。然而，应理解以下实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。

实施例1

使用自动化集成连续系统和生物工艺生产和纯化西妥昔单抗

上游工艺-蛋白质的生产

为了生产目的蛋白质，在自动化连续工艺中使用的细胞系是从美国INVITROGEN采购的目录号为11619012的CHO-S细胞系。

在接种CHO哺乳动物细胞之前，通过喷洒0.5LPM的空气进行溶解氧(DO)校准。一旦DO值稳定，则DO探针校准到100％。

对于连续工艺使用ATF，其是过滤和灌注系统，其中使用通过滤芯的交替切向流以建立高效过滤。这使得细胞的生长密度高达每毫升8000万-1亿个细胞，存活率超过90％，从而产生极高的蛋白质产量。

用培养基例如ActiPro将生物反应器填充至其工作体积，然后用哺乳动物细胞(即CHO细胞)以0.3-0.5×10⁶个活哺乳动物细胞/mL接种。培养3天。然后启动交替切向流(ATF)系统，并在5-10分钟内反应器和ATF处于快速平衡。使用通过滤芯的交替切向流以建立高效过滤。这使得细胞的生长密度达到每毫升8000万-1亿亿个细胞，存活率超过90％，从而产生极高的蛋白质产量。根据细胞浓度，细胞以1.5-6L/min的再循环速率从中空纤维泵入和泵出反应器。然后启动与AKTA^TM定期逆流层析(PCC)相连的滤液泵。从第3-16天起用于灌注的培养基是PM-基础培养基+cell Boost7a(1g/L)和cell Boost(1g/L)+8g/L葡萄糖和8mM谷氨酰胺。

开始的滤过率在第3天为0.25反应器体积(RV)，第4天为0.5RV，第5-7天为1RV，第8-9天为1.25RV，第10-16天为1.5RV。确保泵进行足够紧密的密封以确保保持滤液侧的真空(其为跨膜压力)。这是因为ATF在每个循环中施加反冲洗，其将少量液体从滤液中拉回穿过过滤器进入反应器。由于ATF系统不控制泵流速-它由用户通过控制HPLC系统泵的流速手动控制。

在整个培养过程中每天监测细胞生长和细胞活力。表1中提供了细胞生长曲线

表1:

培养时间(天)	VCC(mill/mL)	活力(％)
			0.0	0.58	99.0
1.0	0.89	99.2
			2.0	1.8	99.7
3.0	2.7	98.5
			4.0	4.8	98.1
5.0	11.4	99.2
			6.0	29.6	99.0
7.0	47.8	98.8
			8.0	59.5	98.2
9.0	68.0	98.2
			10.0	78.0	97.5
11.0	85.0	98.1
			12.0	88.0	96.8
13.0	92.0	95.2
			14.0	100.0	95.0
15.0	94.3	93.2
			16.0	92.3	90.0

上表中的数据清楚地表明，在建立的培养条件下的整个培养过程中，细胞活力保持在可接受的值(>90％)。

还研究了细胞培养基对细胞生长的影响。使用葡萄糖和乳酸作为细胞培养基的细胞生长结果如图6所示。

下游工艺：生产的蛋白质的纯化

A.层析第一步是使用具有4个柱的亲和层析系统进行的，下游处理的以下工艺参数如表2(a)中提供。

表2(a):

第一层析系统与四个柱连接到AKTA PCC系统的四个不同柱位置并且使～3CV的Milli Q水通过柱以去除储存溶液。

柱平衡：将第一层析系统平衡缓冲液容器连接到系统并给出“平衡”的设置标记。所有层析柱均通过3个CV的缓冲液进行平衡。

加载：第一层层析系统的S1线，AKTAPCC连接到ATF出口并通过它开始加载。对其给出“加载”和“自动归零UV”命令的设置标记。第一柱上的第一循环加载进行了219分钟。

加载后平衡缓冲液洗涤：加载219分钟(1个循环)后，通过AKTA PCC系统的不同泵将液体转移到层析-1缓冲液，而将工艺从加载步骤切换到洗涤步骤。给出“加载后平衡缓冲液洗涤”的设置标记，并且3CV的缓冲液通过柱。

在此循环中，当工艺步骤从加载步骤切换到洗涤步骤时，加载步骤同时在另一个柱上开始，作为不同的循环。

中间洗涤2：加载洗涤后，使2个CV的洗涤2缓冲液通过层析柱。

洗涤3：洗涤2缓冲液洗涤后，使2个CV的洗涤2缓冲液通过所述柱。

洗脱：所需蛋白质通过层析-1洗脱缓冲液洗脱。从↑50mAU到3CV收集洗脱峰作为总洗脱体积。

再生：洗脱后，柱经由通过3个CV的再生缓冲液进行再生。

MilliQ水洗：通过3个CV的MilliQ水以去除消毒溶液。

平衡缓冲液：通过3个CV的EQB以在再生后重新平衡所述柱。

层析柱储存：通过2个CV的层析-1储存溶液以用于层析柱储存(所有循环结束后)。

B.在一个替代性工艺中，使用带有两个柱的亲和层析系统进行下游处理，以降低每个批次的树脂的利用。遵循的工艺参数如表2(b)所示：

表2(b):

因此，作为使用Mab Select Sure LX树脂捕获目的蛋白的亲和层析进行的层析第一步骤的结果，目的蛋白与树脂结合并且杂质在流过时被去除。在此步骤中获得的色谱图如图7所示，该图显示了对应于使用低pH缓冲液(pH–2.8)洗脱的所含目的蛋白的洗脱峰，所有循环的洗脱峰均与预期一致。

低pH病毒灭活处理和中和

根据表3使用以下参数进行病毒灭活和中和：

表3:

混合后每个循环的蛋白A洗脱液的pH保持在3.5±0.2的预期范围内(控制系统通过反馈机制确保该范围)。在考虑pH值后，在室温(23±2℃)下将蛋白质溶液完全混合45±5分钟，并记下温育开始时间、结束时间、温育持续时间和温度。

温育45±5分钟后，基于反馈机制通过控制系统用2M Tris碱溶液将蛋白质溶液的pH调节至5.5±0.2。中和后的电导率预计为约6mS/cm。中和后，蛋白质溶液通过控制系统驱动的蠕动泵通过

胶囊0.2μm过滤器，滤液收集在第二收集容器中，以用于进一步处理多模式和阳离子交换层析步骤。

多模式阴离子交换层析和阳离子交换层析

使用多模式阴离子交换层析和阳离子交换层析使用第二层析系统纯化蛋白质，参数如下表4：

表4:

作为第二层析系统的阴离子交换柱的第一柱连接到AKTA pure系统的2&4的通用阀位，作为第二层析系统的阳离子交换柱的第二柱连接到柱位置1。将3个CV的MilliQ水通过层析柱以去除储存溶液。

高盐洗涤缓冲液：2个CV的高盐洗涤缓冲液通过第二层层析系统的阴离子交换和阳离子交换柱，并且确保层析柱的pH值和电导率在高盐洗涤缓冲液的范围内。

层析柱平衡：两个层析柱均通过5个CV的平衡缓冲液进行平衡。

加载和缓冲液追踪：收集容器中收集的经中和及过滤的蛋白A洗脱液样品通过串联的柱加载，其中目的蛋白质不与第二层析系统的阴离子交换柱结合，并作为流体通过，其与第二层析系统的阳离子交换柱结合。加载结束后，将100mL平衡缓冲液分配到加载容器中，使其通过层析柱以确保中和的蛋白洗脱液样品完全加载。

加载后平衡缓冲液洗涤：在平衡缓冲液追踪后，当第二层析系统的阴离子交换柱的峰稳步地流动稳定化时，使另外2个CV的平衡缓冲液通过，以去除第二层析系统的阳离子交换柱上松散结合和未结合的蛋白质。然后使用阳离子交换层析洗脱缓冲液洗脱结合到第二层析系统的阳离子交换柱上的目标蛋白质。对于流动池的2mm光程，在UV 280nm处收集从↑50mAU峰到↓50mAU峰的洗脱峰。每个循环的洗脱部分在2至8℃下储存，直到进一步处理。

再生：使2个CV的阴离子交换和阳离子交换层析再生缓冲液通过两个层析柱。

MilliQ水洗：使2个CV的MilliQ水通过以去除再生溶液。

柱用储存：使2个CV的阴离子交换和阳离子交换储存溶液通过以便柱用储存(在所有循环结束时)。

因此，层析步骤2由两个阶段组成：使用Capto Adhere Impres树脂的多模式阴离子交换层析的第一阶段和使用SP sepharose FF树脂的阳离子交换层析的第二阶段。在多模式阴离子交换层析之后，杂质与柱结合，目的蛋白作为流过物通过。阳离子交换层析柱与阴离子交换层析柱串联连接，目的蛋白在此与其结合。然后使用高盐缓冲液从阳离子交换层析柱上洗脱蛋白质。在此步骤中获得的色谱图如图8所示，其中在所有循环中都可以如所预期地一致观察到洗脱峰。

切向流过滤(超滤和渗滤)

来自阳离子交换层析的洗脱液被合并并进一步处理以用于切向流过滤，从而浓缩西妥昔单抗蛋白，将其缓冲液交换到没有最终赋形剂的制剂缓冲液中，其按照以下表5中所示的参数：

表5:

TFF系统	Cogentμscale
		处理盒	Pellicon Biomax 30
盒区域	0.1m<sup>2</sup>
		盒MOC	PES
层析3洗脱液的浓度	至多50mg/mL
		缓冲液交换	8个渗滤体积
压力	≤1巴
		截止尺寸/MWCO	30kDa

使用含有最终赋形剂溶液的制剂缓冲液，将从TFF系统回收的蛋白质溶液稀释至5mg/mL。

将所得溶液通过0.2μm过滤器(MOC-聚醚砜)无菌过滤到PETG瓶中。如此获得的滤液是适合用作药物物质的最终蛋白质产品西妥昔单抗。

根据表6观察示例性代表性批次的回收率数据如下：

表6:

上述实施方式仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。对所公开的实施方式的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以在不脱离本发明的范围的情况下进行这样的改变和修改。

本发明的优点

本发明提供一种自动化生物工艺，其用于连续多天工艺的持续操作，而在工艺期间无需重复更换容器/袋。

本发明提供一种自动化集成连续生物工艺系统，其使用控制器来利用SCADA或DCS调节和监测整个上游和下游工艺。

本发明提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统，该系统包括用于病毒灭活的可扩展且准确的实时自动pH调节系统

本发明提供一种自动化生物工艺和系统，其中用于HPLC分析的自动化在线采样允许深入的工艺分析以及工艺参数的反馈。

本发明提供一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，该系统包括夹管阀，其用于在每次连续批次完成后无故障更换管道，从而易于操作。

Claims (18)

1.一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺系统(100)，其包括：

生物反应器(103)，其用于在培养基中培养能够产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，所述生物反应器(103)能够使用交替切向流(ATF)过滤器(109)以收集包含分泌到所述培养基中的蛋白质的收获物；

第一层析系统(119)，其连接到生物反应器(103)的ATF过滤系统(109)且没有任何中间保持容器，以纯化收获的重组治疗性蛋白质并提供蛋白A洗脱液；

病毒灭活系统(126)，其包括连接到第一层析系统(119)的病毒灭活容器(128)以收集蛋白A洗脱液并使可能存在于所述洗脱液中的病毒灭活，并且所述病毒灭活容器(128)配置为自动调节蛋白A洗脱液的pH值；

收集容器(136)，其通过一个或多个过滤器与所述病毒灭活容器(128)连接以接收经病毒灭活、中和及过滤的蛋白A洗脱液，其中所述一个或多个过滤器(224)和(226)配置为从接收自所述病毒灭活容器的中和的蛋白A洗脱液中去除沉淀形式的杂质；

第二层析系统(137)，其与收集容器(136)连接以从所述收集容器(136)接收过滤的蛋白A洗脱液并提供进一步纯化的蛋白质。

2.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述系统还包括通过阀门(114)与所述生物反应器连接的浪涌袋(116)。

3.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述系统还包括一个或多个控制系统，所述控制系统选自：监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)、可编程逻辑电路(PLC)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)、与包括层析系统1(119)在内的各个系统可操作地连接的输入-输出模块或IO盒(130)和(132)、病毒灭活系统(126)、收集容器(136)、层析系统2(137)和消息中继系统。

4.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述系统还包括一个或多个电磁或气动夹管阀(114)，并且任选地包括流量计、气泡传感器、压力传感器和负载池，以用于产生一个反馈回路，从而保持所述系统的各个组件之间的流体流动，避免形成气泡并调节液体流量。

5.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述病毒灭活系统(200)包括病毒灭活(VI)容器(201)、连接到用于测量蛋白A洗脱液的pH的变送器的pH探针(220)和自动滴定器(122)、用于监测各个负载池中的液位的负载池传感器(248-1)至(248-6)、用于监测VI容器中的液位的液位传感器、用于当一个过滤器在连续操作期间被堵塞时在两个过滤器之间自动切换的流体路径中的压力传感器(256-1)和(256-2)、用于测量实时比浊法浊度单位(NTU)的在线浊度测量传感器(254)和用于防止气泡进入层析系统的气泡传感器(252)。

6.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中在病毒灭活容器和收集容器之间的每个过滤器是0.2-0.45微米过滤器。

7.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述第一层析系统包括一个或多个亲和层析柱，所述第二层析系统包括一个或多个多模式阴离子交换柱和一个或多个阳离子交换柱。

8.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述病毒灭活容器和所述收集容器由玻璃或不锈钢制成。

9.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述系统还包括原位清洁(CIP)系统(120)，其用于定期清洁层析系统及其组件，所述组件包括层析柱、入口、管和容器。

10.如权利要求1所述的自动化集成连续生物工艺系统，其中所述系统还包括来自用于细胞计数和营养分析的生物反应器的自动收获采样，以及用于连续生物工艺中的在线层析分析的在不同位置的自动采样。

11.一种用于生产治疗性蛋白质的自动化集成连续生物工艺，其中所述工艺由一个或多个控制系统控制，所述控制系统选自：监督控制和数据采集(SCADA)控制系统(110)、比例积分微分(PID)、可编程逻辑电路(PLC)、工业PC(IPC)、分布式控制系统(DCS)和消息中继系统，并且所述工艺包括以下步骤：

(a)在能够使用交替切向流(ATF)过滤器(109)的生物反应器(103)中培养能够在液体培养基中产生治疗性蛋白质的哺乳动物细胞，并收集包含分泌在培养基中的蛋白质的渗出收获物；

(b)将来自生物反应器(103)的包含治疗性蛋白质的细胞培养收获物供给到第一层析系统(119)中以提供蛋白A洗脱液；

(c)将来自第一层析系统(119)的蛋白A洗脱液供给到病毒灭活容器(128)中，并使蛋白A洗脱液中的病毒灭活；

(d)使经病毒灭活和中和的蛋白A洗脱液通过一个或多个过滤器以去除在病毒灭活和中和步骤期间形成的任何沉淀形式的杂质，并在收集容器(136)中收集过滤的蛋白A洗脱液；和

(e)将经中和及过滤的蛋白A洗脱液供给至第二层析系统(137)以提供纯化的蛋白质。

12.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中哺乳动物细胞在生物反应器(103)中培养，所述生物反应器是能够使用交替切向流(ATF)技术的灌注生物反应器。

13.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中使用第一层析系统泵将液体培养基从生物反应器(103)直接供给到第一层析系统(119)中。

14.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中所述第一层析系统是包括一个或多个亲和层析柱的亲和层析。

15.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中病毒灭活步骤中蛋白A洗脱液的pH值使用比例积分微分(PID)控制器、可编程逻辑控制器(PLC)或工业个人计算机(IPC)控制器自动调节。

16.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中所述第二层析系统包括一个或多个多模式阴离子交换层析柱和一个或多个阳离子交换层析柱。

17.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中所述工艺包括使用用于定期清洁层析系统入口以保持不间断操作的(CIP)系统(120)进行在线测试和原位清洁的自动采样。

18.如权利要求10所述的自动化集成连续生物工艺，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、单克隆抗体、酶、重组蛋白、工程化蛋白、免疫原性蛋白、蛋白质片段、肽、免疫球蛋白或其任何组合。

Images