JP3387745B2 - 肝成長因子受容体としてのｍｅｔプロトオンコジーン - Google Patents

肝成長因子受容体としてのｍｅｔプロトオンコジーン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肝細胞成長因子(h
epatocyte growth factor: HGF) とmet プロトオンコジ
ーンタンパク質からなる複合体に関する。本発明は、ま
た、HGF リガンドやmet プロトオンコジーン受容体の存
在を検出する方法、及びこれらのリガンドや受容体また
はその双方からなる複合体のいずれかを単離する方法に
関する。本発明は、さらに、肝炎、悪性肝癌、発癌のよ
うな増殖性疾患の診断方法と治療方法、あるいは傷の治
療方法に関する。特に、本発明の方法は、リガンドと受
容体の対の検出を含む。
【０００２】
【従来の技術】肝細胞成長因子(HGF) は、最初、ラット
肝細胞の有糸分裂誘発を刺激する能力を有することに着
目して、ヒトやうさぎの血漿、あるいはラット血小板か
ら精製された(E. Gohodaら, J. Clin.Invest. 81, 414
(1988); R. Zarnegar and G. Michalopoulos, Cancer R
es. 49, 3314(1989); T. Nakamura ら, FEBS Lett. 22
4, 311(1987))。HGF は、部分的肝切除または肝損傷の
後の肝再生を促進する体液中の因子として働くことがで
きる(G.K. Michalopoulos, FASEB J.4, 176(1990))。同
様の因子がヒト線維芽細胞培地から精製されており、メ
ラニン細胞やいろいろな上皮及び下皮細胞に対して作用
することが示されている(J.S.Rubinら, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 88, 415 (1990)) 。いくつかの器官に
おけるHGF 発現の証拠とともに(J.S. Rubin ら, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 415 (1991); K. Tashiro
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3200 (1991);
R. Zarnegarら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87, 1
252 (1990); T. Kinoshitaら,Biochem. Biophys. Res.
Comm. 165, 1229 (1989))、これらの知見は、HGF が、
広い範囲の細胞系に対して、分裂増殖のパラクリン媒介
物質としても働くことを示している。HGF の分子クロー
ニングによって、プラスミノーゲン及び関連するセリン
プロテアーゼに対して著しい構造上の相同性を示した
(J.S. Rubin ら, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88, 4
15 (1991); T. Nakamuraら, Nature 342, 440 (1989);
K. Miyazawa ら, Biophys. Res. Comm. 163, 967 (198
9))。手をつけていない目標細胞におけるタンパク質の
チロシンの迅速なリン酸化をHGF が誘発することが最近
証明されたが、このことは、チロシンキナーゼ受容体が
そのミトゲン(mitogen) の信号を媒介することを示唆し
ている(J.S.Rubin, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,415
(1991))。
【０００３】HGF は、構造的には、プラスミノーゲン、
プロトロンビン、ウロキナーゼ、及びプラスミノゲン活
性化因子を含むセリンプロテアーゼの群(family)と関係
がある(J.S.Rubinら, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88, 4
15 (1990); T.Nakamura ら,Nature 342, 440 (1989))。
本発明中で明らかにされているように、HGF は、プラス
ミノーゲン様成長因子(plasminogen like growth facto
r:PLGF) と呼ばれる広範囲のミトゲンとして従来特徴づ
けられていたHGF の変種を含む。セリンプロテアーゼの
群に属するものを含むいくつかのプロテアーゼは、おそ
らくインシュリン受容体のトリプシン活性化と同様なタ
ンパク質分解機構を通じてDNA 合成を刺激する(S.E.Sho
elson ら, J.Biol.Chem.263, 4852 (1988)) 。ウロキナ
ーゼのみが特定の細胞表面受容体と関連があることが見
い出されており、この細胞表面受容体自体は、どんな既
知のチロシンキナーゼ受容体とも相同性をもっていない
(A.L. Roldanら, EMBOJ. 9, 467 (1990)) 。
【０００４】HGF の受容体の正体を突き止める必要性の
あることは明らかである。本発明は、HGF とmet プロト
オンコジーンからなる複合体について述べ、met プロト
オンコジーンがHGF の受容体であることを示す。met プ
ロトオンコジーンタンパク質は、チロシンキナーゼ成長
因子受容体の群に属する。この受容体とリガンドの関係
に関する知識は、これらの分子の発現が重要な役割を演
ずる増殖性の疾患の研究を容易にすることであろう。加
えて、met プロトオンコジーン受容体とHGF の複合体を
同定することは、因子の結合によって影響を受けた肝組
織以外の組織を同定するための方法を提供する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、肝細
胞成長因子(HGF) リガンドとmet プロトオンコジーンタ
ンパク質受容体からなる複合体の検出方法、および該複
合体と結合する抗体を提供することにある。本発明の他
の様々な目的及び利点が、本発明に関する図面と以下の
記述から明らかになるであろう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】１つの実施態様として、
本発明は、HGF リガンドとmet プロトオンコジーン受容
体タンパク質の複合体であって、自然に会合または付随
するタンパク質をもたないものに関する。他の実施態様
として、本発明は、HGF リガンドとmet プロトオンコジ
ーン受容体タンパク質からなる複合体であって、その構
成部分の１つがしっかりした支持体に結合するものに関
する。さらに他の実施態様として、本発明は、サンプル
中のHGF とmet プロトオンコジーン受容体タンパク質の
複合体を検出する方法に関するものであり、その方法と
は、上記サンプルを、複合体のHGF またはmet プロトオ
ンコジーン受容体タンパク質と特異的に結合する抗体と
反応させることからなる。陽性の免疫反応は、サンプル
中の複合体の存在を示す。
【０００７】さらなる実施態様として、本発明は、患者
から採取した生物学的サンプルを、HGF とmet プロトオ
ンコジーン受容体タンパク質の複合体と結合する抗体と
反応させることからなる、増殖性疾患の疑いのある患者
の診断方法に関する。さらに他の実施態様として、本発
明は、患者から採取した生物学的サンプルを、HGF とme
t プロトオンコジーン受容体タンパク質の複合体と結合
する抗体と反応させることからなる、患者の再生中の組
織の診断方法に関する。
【０００８】さらなる実施態様として、本発明は、患者
から採取した生物学的サンプルを、HGF とmet プロトオ
ンコジーン受容体タンパク質の複合体と結合する抗体と
反応させることからなる、特定の疾患の疑いのある患者
の疾患の状態の診断方法に関する。他の実施態様とし
て、本発明は、サンプル中に存在するHGF とmet プロト
オンコジーン受容体との結合に影響を与えるような条件
下で、サンプルをmet プロトオンコジーン受容体タンパ
ク質と接触させ、結合したHGF の存在を検出することか
らなる、サンプル中のHGF を検出する方法に関する。
【０００９】さらなる実施態様として、本発明は、サン
プル中に存在するmet プロトオンコジーン受容体とHGF
との結合に影響を与えるような条件下で、サンプルをHG
F と接触させ、結合した該受容体の存在を検出すること
からなる、サンプル中のmetプロトオンコジーン受容体
タンパク質を検出する方法に関する。本発明の他の実施
態様は、傷の治療度合や増殖性疾患を測定する診断キッ
トに関する。１つ目の種類の診断用具は、生物学的サン
プル中のmet プロトオンコジーン受容体の存否の検出に
用いるのに適する、補助試薬と１つの容器に入った標識
されたHGF からなる。
【００１０】２つ目の種類の診断キットは、生物学的な
サンプル中のHGF の存否の検出に用いるのに適する、補
助試薬と１つの容器に入った標識されたmet プロトオン
コジーン受容体タンパク質からなる。ここに記載される
全ての刊行物の全内容は、引用することにより本明細書
の一部とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、肝細胞成長因子(HGF)
とmet プロトオンコジーンタンパク質からなる複合体に
関する。本発明は、さらに複合体の利用方法に関する。
本発明の１つの態様は、HGF とその受容体であるmet プ
ロトオンコジーンタンパク質の相互作用により形成され
る複合体に関する。その複合体には、自然に会合または
付随するタンパク質がない。HGF とその受容体であるme
t プロトオンコジーンタンパク質との結合により、受容
体のもつ固有のチロシンキナーゼ活性を制御できる。
【００１２】HGF とc-met 受容体チロシンキナーゼとの
直接的相互作用は、インシュリン、EGF(表皮成長因子)
、及び他のペプチド成長因子の場合と同様なミトゲン
の信号の導入の生化学的メカニズムがあることを示唆す
る。この相互作用は、HGF と構造的に関連のあるセリン
プロテアーゼ相同体群との重要な機能的相違を意味す
る。
【００１３】本発明は、また、HGF(リガンド) 、met プ
ロトオンコジーン受容体、またはリガンド受容体複合体
を同定する診断に使用し得る、検出及び定量の方法に関
する。met プロトオンコジーン受容体は肝臓を含む多く
のタイプの細胞と組織において発現するため、ここに述
べる方法は、HGF の結合により影響を受けた肝臓以外の
組織を同定するための手段を提供する。本発明の方法
は、また、広い範囲の組織における生化学的及び生理学
的メカニズムの制御の中での受容体とリガンドの相互作
用の役割を理解する際の助けとなる。
【００１４】本発明は、さらに、プローブとして標識さ
れたHGF を用いて、生物学的サンプル中のHGF 受容体を
検出し、定量する方法に関する。適切な標識としては、
例えば、 125Ｉのような放射性標識や蛍光性色素が含ま
れる。当業界でよく知られた標準的方法を用いて、生物
学的サンプルは、標識されていないHGF の存在下または
非存在下で、非イオン性界面活性剤で抽出され、標識化
されたHGF を用いて培養され得る。結果的に生じる複合
体は、複合体化していない( または結合していない) 標
識された物質から分離され得る。例えば、metプロトオ
ンコジーン受容体タンパク質やHGF-met プロトオンコジ
ーン受容体複合体を認識する特定のポリクローナルまた
はモノクローナル抗体を用いて、複合体を免疫沈降させ
ることにより分離され得る。結果的に生じる複合体に会
合した標識の存在により生ずる全体信号は、にせの(moc
k)サンプルからの信号と比較される。にせのサンプル
は、生物学的サンプルと同様な方法で処理された既知の
量の精製済みmet-オンコジーンを用いて調製される。
【００１５】代わりに、複合体は、ポリエチレングリコ
ールを用いた沈澱によって、複合体化されていない物質
から分離され得る。いずれの方法であっても、免疫沈降
または沈澱した標識の量は、直接的に生物学的サンプル
中の複合体の量と関係付けられる。本発明は、また、プ
ローブとして標識されたHGF 受容体を用いる、生物学的
サンプル中のHGF を検出し、定量する方法に関する。そ
の方法は、HGF またはHGF-met プロトオンコジーン受容
体複合体を特異的に認識するものを抗体として置換する
ことを除いては、上述の方法に従って相互結合検定とし
て実施される。
【００１６】本発明は、また、さらに、サンプル中のHG
F-met プロトオンコジーン受容体複合体を検出し、定量
する方法に関する。１つの側面として、複合体は、抗体
を用いて検出され、定量される。この態様で利用され得
る抗体は、HGF 、met プロトオンコジーン受容体タンパ
ク質、またはHGF-受容体複合体に対して作用するもので
ある。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルの
いずれでもよい。サンプルを、非イオン性界面活性剤で
抽出し、標識されたHGF またはmet プロトオンコジーン
受容体タンパク質を用いて培養する。培養後、サンプル
を、ジスクシニミジルスベレート(disuccinimidil sube
rate(DSS))を例として挙げることのできる化学架橋剤の
ような二官能性の試薬で共有結合架橋する。反応終止剤
で反応を止めた後、サンプルを、特定の抗体を用いて免
疫沈降させるか、あるいははポリエチレングリコールを
用いて沈澱させる。定量には、例えばゲル電気泳動によ
るクロマトグラフィー分離が必要であり、分離後オート
ラジオグラフを行う。
【００１７】HGF-met プロトオンコジーン受容体複合体
を検出する他の方法においては、HGF とmet プロトオン
コジーン受容体mRNAの同時発現が測定される。HGF とme
t プロトオンコジーン受容体の同時発現は、mRNAを認識
するいずれかの遺伝子の配列から誘導されたオリゴまた
はcDNAを用いた、またはポリメラーゼ鎖反応(PCR) を用
いた、またはそれらの併用によるノーザン分析法(North
ern analysis) によって測定され得る。ノーザン分析法
とPCR 技術は、当業界でよく知られた方法である。
【００１８】本発明は、さらに、上記の方法を用いた診
断方法に関する。本発明の方法によって診断される疾患
には、例えば、通常met プロトオンコジーン受容体を発
現する肝癌や他の組織の癌のような増殖性疾患が含まれ
る。そのような組織は、皮膚、肺、胃、腎臓、または結
腸、肝臓、または血管の内層、骨髄、造血幹細胞(hemat
onic stem cells)に含まれているような内皮細胞から得
られるものである。本診断方法は、また、上記の細胞か
ら得た組織の中で、および血小板、線維芽細胞( 皮膚や
他の器官の基質組織) 、脾臓のようなHGF を通常発現す
る細胞の中で、傷の治癒度合を測定するのに用い得る。
【００１９】HGF/met ミトゲンの経路の不活性化は、正
常なまたは異常な細胞増殖を軽減し、または阻害するよ
うに企図された治療方法のための基礎を提供する。これ
らの方法は、損なわれたmet 結合ドメインを欠くかもし
くは保有するか、または、損なわれた活性ドメインを欠
くかもしくは保有するが、HGF の構造的または生化学的
特質は保有する遺伝子工学により得られたHGF 種の産生
を含む。同様に、これらの方法は、損なわれたHGF 結合
ドメインを欠くかもしくは保有するか、または、損なわ
れたチロシンキナーゼドメインを欠くかもしくは保有す
るが、met タンパク質の構造的または生化学的特質は保
有する遺伝子工学により得られたmet 種の産生を含む。
これらの方法は、また、HGF による正常なmet タンパク
質活性の拮抗物質として作用し得る細胞外HGF 結合ドメ
インからなる水溶性のmet タンパク質の産生を含む。上
記の遺伝子工学により得られたHGF またはmet タンパク
質種の選択された作用部位への伝達は、薬剤伝達、遺伝
子伝達、またはそれらの組み合わせの通常の方法を用い
て達成し得る。
【００２０】HGF/met ミトゲンの経路の人為的活性化
は、自然に起こる傷の修復機構を回復し、置換し、また
は増強するように企図された治療方法のための基礎を提
供する。これらの方法には、met とHGF の結合相互作用
を高め、それゆえに人為的に支持されたHGF とmet との
相互作用を生じさせる、遺伝子工学で得られたHGF また
はmet 種の傷の部位への応用を含む。たとえば、met の
HGF 結合ドメインやHGFのmet 結合ドメイン( またはそ
の双方) の部位特異的突然変異誘発は、HGF/met対の１
つの構成部分に対してより高い結合親和性をもったHGF/
met 対の他方の構成部分を作り出し、傷ついた組織の促
進的成長や再生に影響を与えるのに使用され得る。同様
に、通常の組み替えDNA 技術を用いて、構造的に活性化
されたチロシンキナーゼを有するmet 突然変異体を含
む、HGF 結合によって正常に制御されるmet タンパク質
のキナーゼ活性を高め、または維持することができる。
上記の遺伝子工学により得られたHGF またはmet タンパ
ク質種の選択された活性部位への伝達は、薬剤伝達、遺
伝子伝達、またはそれらの組み合わせの通常の方法を用
いて達成され得る。外因的に与えられるHGF と組み合わ
される組み替えDNA 技術によりmet の自然発現を増補す
ることによるHGF/met ミトゲン経路の活性化も、また含
められる。
【００２１】
【実施例】
実施例1. HGF に反応するB5/589ヒト乳房上皮細胞中の
p145のチロシンリン酸化 ヒト乳房上皮細胞系B5/589は、HGF のミトゲンの影響に
特に敏感である(J.S.Rubinら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 88, 415 (1990)) 。手をつけていない血清欠乏
B5/589細胞をHGF(約100ng/mL) を用いて10分間37℃で処
理し、氷上で可溶化した。ホスホチロシルタンパク質を
ホスホチロシンに対する抗体( 抗pTyr)で免疫沈降させ
ることにより細胞ライゼートから単離した。これらのタ
ンパク質は、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
-PAGE)によって分解され、同じ抗体を用いて免疫ブロッ
トした。いくつかのホスホチロシルタンパク質がこの方
法によって未処理の細胞中で検出された( 図１のA)。手
をつけていない細胞のHGFによる処理は、145kD のタン
パク質(p145)のリン酸化を誘導した( 図１のA,中央のラ
イン) 。表皮成長因子(EFG) に曝されたB5/589細胞は、
EGF 受容体のチロシンリン酸化を示したが、p145では示
さなかった( 図１のA,右のライン) 。32Ｐオルトリン酸
で標識された対照細胞およびHGF 処理細胞からのライゼ
ートが抗pTyr特異抗体による免疫沈降のために使用され
たとき、p145のリン酸化は、HGF 処理細胞の中で特異的
に検出された( 図１のB)。32Ｐで標識化されたp145のホ
スホアミノ酸分析は、ホスホチロシンの存在を確認し、
ホスホセリンの存在を同様に突き止めた( 図１のC)。HG
F により刺激された、p145のチロシン・リン酸化と、そ
の見かけの分子量は、p145が、受容体であるチロシンキ
ナーゼをHGF に対して表している可能性と矛盾のないも
のであった。
【００２２】実施例2.p145とc-met プロトオンコジーン
生産物のβサブユニットとの同一性 それに対するリガンドの知られていないいくつかの受容
体のような分子が、これまで論じられてきている。その
１つにc-met プロトオンコジーン生産物があり、それ
は、50kD( α) と145kD(β) の二硫化物架橋サブユニッ
トからなる受容体様のチロシンキナーゼからなる(P.R.
Tempest ら, Br.J. Cancer 58, 3 (1988);S. Giordano
ら, Oncogene 4, 1383 (1989))。全過程を経たc-met 生
産物の内訳について述べると、αサブユニットは細胞外
にあり、βサブユニットは細胞外、膜内外にあり、チロ
シンキナーゼドメインもまた、チロシンリン酸化部位に
ある(S. Giordanoら, Oncogene 4, 1383 (1989); A.A.
Gonzatti-Hacesら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
5, 21 (1988))。
【００２３】p145がc-met タンパク質βサブユニットに
相当するとの仮説を立証するために、対照細胞とHGF 処
理されたB5/589細胞から抗pTyrによって免疫沈降したタ
ンパク質をc-met 生産物の細胞質ドメインに対して作用
するモノクローナル抗体で免疫ブロットした。特別に、
組み替えヒトc-met タンパク質細胞質ドメインに対して
用いられるマウスモノクローナルIgG が使用された。免
疫沈降または免疫ブロットによるヒトc-met タンパク質
の認識は、組み替えタンパク質フラグメントの存在下で
培養することによって特別に阻害される。
【００２４】HGF 処理細胞( 図２のA)中で特別に観察さ
れる顕著な145kD タンパク質は、このミトゲンがチロシ
ン残基のc-met タンパク質のリン酸化を誘導することの
直接的証拠を提供する。同一に処理された細胞から調製
された全ライゼートがc-met抗体を用いて直接的にブロ
ットされたとき、HGF に応じてチロシンにおいてリン酸
化されるc-met タンパク質の割合は、定量され得る( 図
２のA)。細胞c-met タンパク質の全量の少なくとも10％
がHGF による刺激の後、抗pTyr抗体により免疫沈降した
と見積もられる。HGF の作用の時間経過の分析は、c-me
t タンパク質が抗pTyr抗体による免疫沈降で処理後１分
以内に回復し、この効果が少なくとも３時間持続するこ
とを示した。還元条件下と非還元条件下におけるp145の
電気泳動移動度の比較は、それがc-met タンパク質のβ
サブユニットであることを確認した( 図２のB)。還元な
しでは、c-met タンパク質の50kDのαサブユニットがβ
サブユニットと二硫化結合を維持し、SDS-PAGE中の移動
を実質的に妨害する(P.R.Tempest ら, Br.J. Cancer 5
8, 3 (1988); S. Giordanoら, Oncogene 4, 1383 (198
9); P.R. Tempest ら, FEBS Lett. 209, 357 (1986);
M.Parkら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 6379
(1987); A. Gonzatti-Hacesら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 85, 21 (1988))。同様に、HGF で処理された
32Ｐで標識化されたB5/589細胞から免疫沈降したp145
は、還元または非還元電気泳動状態に曝されたとき、c-
met プロトオンコジーン生産物の移動度特性の変化を示
した( 図２のB)。これらの結果は、p145がc-met タンパ
ク質βサブユニットと同一であることを示し、また、HG
F がチロシン残基のリン酸化を刺激することを立証し
た。
【００２５】実施例3. 125Ｉ- HGFp28は、物理的にc-me
t タンパク質チロシンキナーゼと組み合わされる。 HGF に応じたc-met タンパク質チロシンのリン酸化の速
度と程度は、c-met タンパク質がHGF に対する細胞表面
の受容体である可能性を支持するものであった。しか
し、受容体キナーゼが他の受容体をリン酸化し得る証拠
がある(D.F.Sternand M.P.Kamps, EMBO J. 7, 995 (198
8); C.R.King ら, EMBO J. 7, 1647 (1988)) 。c-met
生産物とHGF 受容体の決定的な同一性を示すためには、
それらの直接的相互作用の証明を必要とする。 125Ｉで
標識化されたHGF は、共有結合親和性架橋には適さな
い。なぜならば、該HGF は、単鎖とヘテロダイマーの標
識化された種の混合物からなるからである。HGFp28と呼
ばれる同様の結合性をもつ、より小さな形のHGF は、一
個の存在として 125Ｉで標識され、HGF 受容体を特徴づ
けるのに用いられた。
【００２６】HGFp28は、以下のようにクロラミンT 法に
より〔 125Ｉ〕Naで標識された。HGFp28(1.0MNaCl を含
む20mMリン酸緩衝液50μL 中に3 μg, pH7.4) をクロラ
ミンT(4 μL のリン酸緩衝液中1.2 μg)及び〔 125Ｉ〕
Na(1μCi) と24℃で1 分間反応させた。反応は、ナトリ
ウムメタ重亜硫酸塩(8μL のリン酸緩衝液中10μg)を加
えることにより止めた。混合液を0.1 ％のウシの血清ア
ルブミン(200μL)を含むリン酸緩衝液で希釈し、リン酸
で緩衝液とされた0.1 ％のBSA(PBS/BSA)を含む塩類溶液
中で平衡化したヘパリン- セファローズCL-6B(heparin-
Sepharose CL-6B)のカラム(300μL 詰め容量) に入れ
た。そのカラムを30mLのPBS/BSA で洗浄し、1.0MのNaCl
を含むPBS/BSA(200 μL/フラクション）で希釈し、トリクロロ
酢酸で沈澱可能な放射能をもつ物質の98％をカラムから
除去した。ピークのフラクション(比活性：150 〜250
μCi/ μg)は、99％がトリクロロ酢酸で沈澱可能なもの
であり、SDS-PAGE上で単一バンドとして移動した。
【００２７】比較上の架橋の研究が、HGF に反応せず、
検出できる量のc-met タンパク質をもたない細胞系であ
る、B5/589細胞とM426ヒト線維芽細胞上の 125Ｉで標識
化されたHGFp28を用いてなされた( 図３のA)。 125Ｉで
標識化されたHGFp28は、非還元条件下で、210kD のタン
パク質複合体として移動したB5/589細胞上の受容体に架
橋した( 図３のB)。還元条件下では、大きな170kD の複
合体が観察された( 図３のB)。これらの明らかな分子の
大きさは、標識されたHGFp28とc-met タンパク質の145k
D のβサブユニットとの直接的相互作用と矛盾のないも
のであった。還元条件下では、190kD と約300kD の２つ
の小さなバンドがまた検出された( 図３のB)。還元条件
下で観察された、 125Ｉで標識されたHGFp28のその種へ
の架橋は、標識されていないHGFp28またはHGF で中性化
する抗血清のいずれかの添加により阻害された。同様な
条件下で、 125Ｉで標識されたHGFp28は、M426細胞中の
どの大きなタンパク質とも架橋しなかった( 図３のB)。
【００２８】125Ｉで標識されたHGFp28が物理的にc-met
タンパク質と会合することを立証するために、 125Ｉ
で標識化されたHGFp28架橋複合体を、c-met タンパク質
のβサブユニットのカルボキシル末端の28のアミノ酸に
特異性をもつポリクローナル抗血清(A.Gonzatti-Hace
s.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85,21 (1988))で免疫沈
降させた。還元条件下で検出された、共有結合架橋され
たメジャーな170kD 種とマイナーな300kD 種を、この抗
体により免疫沈降させた。それらの検出は競合するペプ
チドにより特異的に阻害された( 図３のC)。これらの結
果は、 125Ｉで標識されたHGFp28とc-met βサブユニッ
トの間の直接的分子相互作用を示している。マイナーな
300kD 架橋種の構成物は、測定のために残された。これ
らの知見の全てが、c-met 生産物がHGF のための細胞表
面受容体であることを立証する。
【００２９】前述の発明は明瞭と理解のためにある程度
詳細に述べられたが、ここに開示された内容を読むこと
により、形態と細部においていろいろな変更が発明の真
の範囲から離れることなくなされ得ることが、当業者に
より認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、HGF に反応するB5/589ヒト乳房上皮細
胞中のp145のチロシン・リン酸化を示す。図１のA は、
処理されない対照細胞(C) 、HGF で処理された細胞、EG
F(表皮成長因子(Collaborative Research 社))で処理さ
れた細胞の各々のホスホチロシルタンパク質の免疫ブロ
ットを示す。HGF は、文献に記載された方法で精製され
た(J.S.Rubinら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 88, 415
(1990))。血清が欠乏している細胞を、指示されている
ように37℃で10分間、成長因子(100 ng/mL) に曝し、氷
上で界面活性剤により溶解させ、モノクローナル抗pTyr
(Upstate Biotechnology社) を用いて免疫沈降させた。
免疫沈降したタンパク質を7.5 ％のSDS ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分解し(U.K.Laemmli
Nature 227, 680 (1970))、文献に既述されているもの
と同様な抗体で免疫ブロットした(D.P.Bottaroら, J.Bi
o.Chem.265, 12767 (1990)) 。図１のB は、対照細胞
(C) とHGF で処理された細胞の各々の32Ｐで標識したリ
ンタンパク質のオートラジオグラムである。血清の欠乏
した細胞は、文献に記載されているように32Ｐ-オルト
リン酸塩(1.0mCi/mL) を用いて新陳代謝によって標識さ
れた(M.F. Whiteand C.R. Kahn, in Insulin Receptor
s, Part A: Methods for the Study of Structure and
Function, C.R. Kahn and L. Harrison 編(Liss, New Y
ork, 1988)pp.125-147)。この細胞を、指示されている
ように10分間37℃で、HGF(100 ng/mL)を用いて処理し、
氷上で界面活性剤により可溶化した。ホスホチロシルプ
ロティンを、抗pTyr特異抗体(anti pTyr) を用いて免疫
沈降させ、7.5 ％SDS-PAGEにより分解した。図１のC
は、図１のB のレーン２からのp145のホスホアミノアシ
ド分析を文献に記載されている方法で行った結果を示す
(M.F. White and C.R. Kahn, in Insulin Receptors, P
art A: Methods for the Study of Structure and Func
tion, C.R. Kahn and L. Harrison 編, Liss, New Yor
k, 1988, pp.125-147) 。小点でつくられた円は、標識
されていないホスホセリン(pS)、ホスホスレオニン(p
T)、及びホスホチロシン(pY)の移動を示す。
【図２】図２は、p145がc-met プロトオンコジーン生産
物のβサブユニットであることを示す。図２のA は、対
照細胞(C) およびHGF で処理されたB5/589細胞からの抗
pTyr特異抗体による免疫沈降物のc-met 免疫ブロットを
示す。免疫沈降物のサンプル(2mgのタンパク質) が、図
１のA で述べられたように調製され、7.5 ％SDS-PAGEに
より分解され、イモビロン( ミリポア社)(Immobilon (M
illipore))膜に伝達され、そして、モノクローナル抗c-
met 特異抗体(monoclonal anti c-met) と〔 125Ｉ〕タ
ンパク質A で検出された。抗pTyr特異抗体で免疫沈降さ
れ得るc-met タンパク質の割合を測定するため、200 μ
g のB5/589細胞ライゼート(LYSATE)がSDS-PAGEにより分
解され、c-met に対するモノクローナル抗体を用いて直
接に免疫ブロットされた。図２のB は、還元条件下(R)
及び非還元条件下(NR)で7.5％SDS-PAGEにより分解され
た、対照細胞(C) 及びHGF で処理されたB5/589細胞から
の32Ｐで標識化されたリンタンパク質のオートラジオグ
ラムを示す。血清欠乏細胞を、32Ｐオルトリン酸を用い
て新陳代謝により標識し、HGF で処理するかもしくは処
理せずに置き、図１のB で述べたように抗pTyr特異抗体
で免疫沈降させた。サンプルを、指示されているよう
に、電気泳動の前に100mM のβ- メルカプトエタノール
で還元した。
【図３】図３は、 125Ｉで標識されたHGFp28とc-met タ
ンパク質- チロシンキナーゼとの共有結合親和性架橋を
表す。図３のA は、c-met タンパク質の細胞質ドメイン
に対するモノクローナル抗体を使用し、M426ヒト肺線維
芽細胞から調製されたライゼート(200μg のタンパク
質) の免疫ブロットを表す。図３のB は、還元条件下(N
R)及び非還元条件下(R) で6.5 ％のSDS-PAGEにより分解
された、 125Ｉで標識されたHGFp28と、M426及びB5/589
細胞との架橋を表す。HGFp28を、文献に記載されている
ようにして精製し、クロラミンT 法により〔 125Ｉ〕-N
a で放射能標識した(W.M.Hunter and F.C.Greenwood, N
ature 194, 495 (1962))。細胞を、45分間25℃で、 125
Ｉで標識されたHGFp28(5×105 ｃｐｍ）を含むHEPES 結
合緩衝液(D.P.Bottaro, J.Biol.Chem. 265, 12767 (199
0)) で培養した。そして、冷たいHEPES 緩衝塩類溶液(p
H7.4) で洗浄し、ジスクシニミジルスベレート(disucci
nimidyl suberate) で処理した(D.P.Bottaroら, J.Bio
l.Chem. 265, 12767 (1990)) 。その細胞を、その後、S
DS で可溶化し、指示されているように100mM のβメル
カプトエタノールの存在下で３分間煮沸した。 125Ｉで
標識されたタンパク質は、6.5%のSDS-PAGEと-70 ℃での
オートラジオグラフ法により分解した。図３のC は、c-
met ペプチド抗血清によるB5/589細胞からの〔 125Ｉ〕
-HGFp28 架橋複合体の免疫沈降を示す(A. Gonzatti-Hac
esら, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 85, 21 (198
8))。図３のB の説明で述べたようにして行なった、免
疫沈降前のサンプル調製と架橋化により、還元条件下で
左のレーン(LYSATE)に示された電気泳動パターンが生じ
た。隣りのレーンは、競合ペプチド(10 μg/mL) の非存
在下( α-MET) または存在下(+COMP) における、c-met
ペプチド抗血清(1:100) と架橋したサンプルの免疫沈降
を示す。免疫沈降したタンパク質は、図３のBの説明で
述べたような電気泳動とオートラジオグラフをする前
に、固定化したタンパク質G(Genex)に吸着され、SDS に
より溶出させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 33/576 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ラビン，ジェフリー・エス アメリカ合衆国、20853 メリーランド、 ロックヴィル、シャープ・ケイ44、ボル ティモア・ロード 2020 (72)発明者 ファレット，ドンナ アメリカ合衆国、21771 メリーランド、 マウント・エアリー、タルボット・コー ト 5551 (72)発明者 チャン，アンドリュー・エム‐エル アメリカ合衆国、20852 メリーランド、 ロックヴィル、シャープ107、タルボッ ト・ストリート 180 (72)発明者 ヴァンデ・ワウデ，ジョージ・エフ アメリカ合衆国、22611 ヴァージニア、 ベリーヴィル、ルート １、ボックス 2905 (72)発明者 アーロンソン，スチュアート・エイ アメリカ合衆国、22066 ヴァージニア、 グレイト・フォールズ、ハリマン・スト リート 1006 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 85（1988）ｐ21〜25

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 その中で複合体の存在が検出されること
    となる試料を、HGFと特異的に結合する抗体、及び／又
    は、metプロトオンコジーン受容体タンパク質と結合す
    る抗体と反応させ、陽性の免疫反応が該試料中の該複合
    体の存在を示し、抗体により結合された複合体を同定す
    ることを含む、試料中のHGFとmetプロトオンコジーン受
    容体タンパク質の複合体を検出する方法。
  2. 【請求項２】 試料中に存在する受容体とHGFとの結合
    に影響を与えるような条件下で上記試料をHGFと接触さ
    せる段階と、結合した受容体の存在を検出する段階とを
    含む、試料中のmetプロトオンコジーン受容体タンパク
    質を検出する方法。
  3. 【請求項３】 生物学的試料中のmetプロトオンコジー
    ン受容体タンパク質の存否の検出に用いるのに適する、
    1つの容器中の標識されたHGFを含んでなる傷の治療度合
    を測定するための診断キット。
  4. 【請求項４】 生物学的試料中のHGFの存否の検出に用
    いるのに適する、1つの容器中の標識されたmetプロトオ
    ンコジーン受容体タンパク質を含んでなる傷の治療度合
    を測定するための診断キット。
  5. 【請求項５】 HGF、またはmetプロトオンコジーン受容
    体タンパク質に対して常態のHGFと等しいかまたはより
    大きな結合効率を有するHGF作動物質を活性部位に伝達
    することを含む、生体細胞中のHGFとmetプロトオンコジ
    ーン受容体タンパク質の経路をin vitroで活性化する方
    法。
  6. 【請求項６】 metプロトオンコジーン受容体タンパク
    質の結合について常態のHGFと競合するが、生物学的反
    応を誘発することのないHGF拮抗物質を活性部位に伝達
    することを含む、生体細胞中のHGFとmetプロトオンコジ
    ーン受容体タンパク質の経路をin vitroで不活性化する
    方法。
  7. 【請求項７】 HGF結合に対して常態のmetプロトオンコ
    ジーン受容体タンパク質と競合するが、生物学的反応を
    誘発することのないmetプロトオンコジーン受容体タン
    パク質についての拮抗物質を不活性部位に伝達すること
    を含む、HGFとmetプロトオンコジーン受容体タンパク質
    によるミトゲン経路をin vitroで不活性化する方法。
  8. 【請求項８】 (a)常態のHGFとmetプロトオンコジーン
    受容体タンパク質の相互作用を増補するHGF作動物質で
    あるか、又は、常態のHGFとmetプロトオンコジーン受容
    体タンパク質の相互作用を阻害する拮抗物質であるHGF
    代替物質を産生する段階と、(b)metプロトオンコジーン
    受容体タンパク質と該HGF代替物質を接触させる段階
    と、(c)該HGF代替物質がHGF作動物質とHGF拮抗物質のい
    ずれであるかを決定する段階とを含み、該HGF代替物質
    の産生が、常態のHGFとmetプロトオンコジーン受容体タ
    ンパク質の相互作用の分子モデルによって、および/ま
    たはHGFとmetプロトオンコジーン受容体タンパク質の相
    互作用の分析を開発するスクリーニング技術によって導
    かれる、HGFとmetプロトオンコジーン受容体タンパク質
    の経路の制御のためにin vitroにおいて薬剤を開発する
    方法。
  9. 【請求項９】 (a) 常態のHGFとmet プロトオンコジー
    ン受容体タンパク質の相互作用を増補する作動物質であ
    るか、又は、常態のHGFとmetプロトオンコジーン受容体
    タンパク質の相互作用を阻害する拮抗物質であるmetプ
    ロトオンコジーン受容体タンパク質の代替物質を産生す
    る段階と、(b)HGFを該metプロトオンコジーン受容体タ
    ンパク質の代替物質と接触させる段階と、(c)該metプロ
    トオンコジーン受容体タンパク質の代替物質が、metプ
    ロトオンコジーン受容体タンパク質の作動物質とmetプ
    ロトオンコジーン受容体タンパク質の拮抗物質のいずれ
    であるかを決定する段階とを含み、該metプロトオンコ
    ジーン受容体タンパク質の代替物質の産生が、常態のHG
    Fとmetプロトオンコジーン受容体タンパク質の相互作用
    の分子モデルによって、および/またはHGFとmetプロト
    オンコジーン受容体タンパク質の相互作用の分析を開発
    するスクリーニング技術によって導かれる、HGFとmetプ
    ロトオンコジーン受容体タンパク質の経路の制御のため
    にin vitroにおいて薬剤を開発する方法。
  10. 【請求項１０】 HGF、またはmetプロトオンコジーン受
    容体タンパク質に対して常態のHGFと等しいかまたはよ
    り大きな結合効率を有するHGF代替物質を活性部位に伝
    達することを含む、HGFとmetプロトオンコジーン受容体
    タンパク質によるミトゲン経路をin vivoで活性化する
    方法。
  11. 【請求項１１】 metプロトオンコジーン受容体タンパ
    ク質の結合に対して常態のHGFと競合するが、生物学的
    反応を誘発することのないHGF代替物質を不活性部位に
    伝達することを含む、HGFとmetプロトオンコジーン受容
    体タンパク質によるミトゲン経路をin vivoで不活性化
    する方法。
  12. 【請求項１２】 HGFの結合に対して常態のmetプロトオ
    ンコジーン受容体タンパク質と競合するが、生物学的反
    応を誘発することのないmetプロトオンコジーン受容体
    タンパク質の代替物質を不活性部位に伝達することを含
    む、HGFとmetプロトオンコジーン受容体タンパク質によ
    るミトゲン経路をin vivoで不活性化する方法。
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