JP3318602B2

JP3318602B2 - 糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JP3318602B2
Application number: JP30772197A
Authority: JP
Inventors: 亨今村; 眞弘浅田; 修一岡; 理鈴木; 敦子米田; 恵子大田; 裕子織田; 和子宮川; 訓子折笠; 知栄浅田; 哲人小嶋
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1997-11-10
Filing date: 1997-11-10
Publication date: 2002-08-26
Anticipated expiration: 2017-11-10
Also published as: US20060079451A1; US7005415B1; US7282481B2; JPH11137255A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖を共有結合さ
せることにより高機能化されたヘパリン結合性タンパク
質、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ヘパリン結合性タンパク質、なか
でも繊維芽細胞増殖因子（fibroblastgrowth factor、
以下、「FGF」と記す。) ファミリーに分類されるタン
パク質及びその類似体（fibroblast growth factor hom
ologous factors)は、硫酸化多糖であるヘパリンとヘパ
ラン硫酸に非共有的な結合様式で強く結合することが知
られていた。そして繊維芽細胞増殖因子などのヘパリン
結合性タンパク質をヘパリンなど硫酸化多糖との混合物
とした場合、ヘパリン結合性タンパク質の生物活性や物
性が変化し、その機能が変化し、高機能化する場合のあ
ることが知られていた。しかしながら、硫酸化多糖を混
合しても、期待できる高機能化は限定的なものであっ
た。また、これらを医薬組成物として用いる場合には、
遊離状態の硫酸化多糖による好ましくない生理活性が問
題となっていた。ヘパリン結合性タンパク質の高機能化
を意図してヘパリン結合性タンパク質と硫酸化多糖を共
有結合によって一体化したタンパク質はこれまで存在し
なかった。

【０００３】また、従来、ヘパリン結合性タンパク質、
なかでもFGFファミリーに分類されるタンパク質及びそ
の類似体の機能に対し、アスパラギン結合型糖鎖 (以
下、「N-型糖鎖」という。) またはセリン・スレオニン
結合型糖鎖 (以下、「O-型糖鎖」という。) の人工的な
共有結合的一体化によってヘパリン結合性タンパク質の
機能が高機能化出来ることは一切知られていなかった。
さらにN-型糖鎖またはO-型糖鎖が与えうる一般的な影響
については知られていなかった。例外として、FGF-6 に
ついて、本来それが有するN-型糖鎖の役割が生体外翻訳
の系で示唆されたが、直接証明されてはいなかった。こ
れまでに、ヘパリン結合性タンパク質の高機能化を意図
してヘパリン結合性タンパク質とN-型糖鎖またはO-型糖
鎖を共有結合によって一体化した例は存在しなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ヘパ
リン結合性タンパク質の機能改質をめざし、糖鎖を共有
結合させたヘパリン結合性タンパク質とその製造方法を
確立し、これを含む医薬組成物を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、(1)硫酸化多糖、
(2)グリコサミノグリカン、(3)硫酸化多糖またはグリコ
サミノグリカンと組み合わされたＮ−型糖鎖、(4)硫酸
化多糖またはグリコサミノグリカンと組み合わされたＯ
−型糖鎖および(5)それらの組合せからなる群より選択
される糖鎖の各々が、動物生体中では糖タンパク質の糖
鎖として合成されることに着目し、これらの糖鎖のいず
れかの付加を受けることができるペプチドをコードする
cDNAとヘパリン結合性タンパク質のcDNAを連結し、この
連結cDNAの遺伝子産物を動物細胞に生産させることによ
り、共有結合によって結合している上記糖鎖を分子内に
有するヘパリン結合性タンパク質を製造できることを見
出し、さらに、これらの糖鎖が付加したヘパリン結合性
タンパク質の機能が向上していることを確認した。本発
明はこのような知見に基づいて完成されたものである。

【０００６】すなわち、本発明は、糖鎖を共有結合させ
ることにより高機能化されたヘパリン結合性タンパク質
を提供する。糖鎖は、(1)硫酸化多糖、(2)グリコサミノ
グリカン、(3)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカン
と組み合わされたＮ−型糖鎖、(4)硫酸化多糖またはグ
リコサミノグリカンと組み合わされたＯ−型糖鎖および
(5)それらの組合せからなる群より選択される。ヘパリ
ン結合性タンパク質はＦＧＦファミリーに属する因子ま
たはその近縁の因子であってもよい。ヘパリン結合性タ
ンパク質は、糖鎖の付加を受けることができるペプチド
を介して糖鎖を共有結合していてもよい。例えば、糖鎖
を共有結合させるヘパリン結合性タンパク質は、以下の
（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質であっても
よい。

【０００７】（ａ）配列番号１、３、５、１７、１９、
２１、２３、２５、２７または２９のいずれかのアミノ
酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１、３、５、１７、１９、２１、２３、
２５、２７または２９のいずれかのアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく
は修飾されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦ活性を有
し、かつ糖鎖の付加を受けることができるタンパク質。

【０００８】本発明のヘパリン結合性タンパク質におい
ては、ヘパリン結合性タンパク質の２次構造においてタ
ーンを形成している部位又は末端近傍に糖鎖が結合して
いるか、あるいは、糖鎖付加によって３次元構造が大き
く変化しない部位に糖鎖が結合しているとよい。

【０００９】また、本発明は、(1)硫酸化多糖、(2)グリ
コサミノグリカン、(3)硫酸化多糖またはグリコサミノ
グリカンと組み合わされたＮ−型糖鎖、(4)硫酸化多糖
またはグリコサミノグリカンと組み合わされたＯ−型糖
鎖および(5)それらの組合せからなる群より選択される
糖鎖を共有結合させることにより高機能化されたヘパリ
ン結合性タンパク質の製造方法であって、以下の工程：（ａ）糖鎖の付加を受けることができるペプチドをコー
ドするcDNAとヘパリン結合性タンパク質をコードするcD
NAとを連結する工程、（ｂ）当該連結cDNAを発現ベクターに組み込む工程、（ｃ）当該発現ベクターを糖鎖付加経路を有する宿主細
胞に導入する工程、および（ｄ）当該宿主細胞において、糖鎖の付加を受けること
ができるペプチドを介して糖鎖が共有結合しているヘパ
リン結合性タンパク質を発現させる工程を含むことを特
徴とする前記の方法を提供する。糖鎖が硫酸化多糖また
はグリコサミノグリカンである場合には、糖鎖の付加を
受けることができるペプチドはプロテオグリカンコアタ
ンパク質またはその一部分であるとよい。また、本発明
は、糖鎖を共有結合させることにより高機能化されたへ
パリン結合性タンパク質の製造方法であって、糖鎖を化
学的結合法によりへパリン結合性タンパク質に結合させ
る工程を含む前記の方法を提供する。糖鎖は、(1)硫酸
化多糖、(2)グリコサミノグリカン、(3)硫酸化多糖また
はグリコサミノグリカンと組み合わされたＮ−型糖鎖、
(4)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカンと組み合わ
されたＯ−型糖鎖および(5)それらの組合せからなる群
より選択され、ヘパリン結合性タンパク質はＦＧＦファ
ミリーに属する因子またはその近縁の因子であってもよ
い。さらに、本発明は、糖鎖を共有結合させることによ
り高機能化された前記のヘパリン結合性タンパク質を有
効成分として含有する医薬組成物を提供する。以下、本
発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明において、糖鎖を共有結合
させるべきヘパリン結合性タンパク質は、ヘパリン結合
性を有するタンパク質であり、具体例としては、FGFフ
ァミリーに属する因子または近縁の因子、またはヘパリ
ン結合性を有するが前者と構造的な類似性はない他のタ
ンパク質を挙げることができる。ここで述べる他のタン
パク質としては、具体的には、ヘパリン結合性上皮細胞
増殖因子様因子（HB-EGF）、血小板由来増殖因子（PDG
F）などが挙げられるが、これに限定されるものではな
い。FGFファミリーに属する因子または近縁の因子の具
体例としては、FGF-1〜10や、FHF(fibroblast growth f
actor homologous factor)-1 〜４などが知られてい
る。ヘパリン結合性タンパク質は、糖鎖の付加を受ける
ことができるペプチドを介して糖鎖を共有結合していて
もよい。例えば、糖鎖を共有結合させるヘパリン結合性
タンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの
タンパク質であってもよい。

【００１１】（ａ）配列番号１、３、５、１７、１９、
２１、２３、２５、２７または２９のいずれかのアミノ
酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１、３、５、１７、１９、２１、２３、
２５、２７または２９のいずれかのアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく
は修飾されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦ活性を有
し、かつ糖鎖の付加を受けることができるタンパク質。

【００１２】配列番号１、３、５、１７、１９、２１、
２３、２５、２７および２９のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質は、例えば、配列番号２、４、６、１８、２
０、２２、２４、２６、２８および３０のＤＮＡ配列に
よりそれぞれコードされる。これらのタンパク質は、FG
Fファミリーに属する因子のペプチド配列の他、糖鎖の
付加を受けることができるペプチド配列とシグナルペプ
チドの配列を含んでいる。本明細書でいうヘパリン結合
性タンパク質は、配列表に記載されたｃＤＮＡが一次的
に規定するタンパク質に加えて、細胞から分泌される際
にそのアミノ末端に存するシグナルペプチドと呼ばれる
分泌の為のペプチド配列が切断された形のタンパク質を
含む。本発明の医薬組成物の有効成分として含有させる
ヘパリン結合性タンパク質は、初めからシグナルペプチ
ドを欠損する形で製造してもその有用性には変化がな
い。

【００１３】ヘパリン結合性タンパク質に共有結合させ
る(1)硫酸化多糖、(2)グリコサミノグリカン、(3)硫酸
化多糖またはグリコサミノグリカンと組み合わされたＮ
−型糖鎖、(4)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカン
と組み合わされたＯ−型糖鎖および(5)それらの組合せ
からなる群より選択される糖鎖は、共有結合させること
によりヘパリン結合性タンパク質が高機能化されるもの
であり、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸などの硫酸
化多糖およびグリコサミノグリカンを例示することがで
きる。本明細書において、「高機能化」とは、対象のタ
ンパク質の活性が、糖鎖を共有結合させていないタンパ
ク質に比べて上がることを意味し、糖鎖をタンパク質に
共有結合させることにより、熱、酸またはアルカリ等に
よる処理後の残存活性が、糖鎖を共有結合させていない
タンパク質の場合よりも高くなる。本明細書でいう硫酸
化多糖とは、タンパク質の一次構造に存するセリン残基
に結合したキシロースを起点として伸長する、もしくは
後述のN-型糖鎖やO-型糖鎖の非還元末端側に伸長する、
あるいは遊離状態で存在する多様な糖鎖構造を総称する
ものであり、その多くはアミノ糖とウロン酸（またはガ
ラクトース）の二糖単位の繰り返し構造をもち、いくつ
かの水酸基あるいはアミノ基が硫酸基で置換されている
ものをいう。また、グリコサミノグリカンとは、同様の
構造を有するものであるが、硫酸基での置換がないもの
も含む。本明細書では、これらを総称して、硫酸化多糖
等と記す。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運
命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィッ
ク）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図１に
示す。本明細書でいうN-型糖鎖とは、タンパク質の一次
構造に存するアスパラギン残基に結合したN-アセチルガ
ラクトサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総
称するものであるが、硫酸化多糖またはグリコサミノグ
リカンと組み合わされるものでなければならない。具体
的な構造は、「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守
・木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記載さ
れており、代表的な糖鎖配列を図２に示す。本明細書で
いうO-型糖鎖とは、タンパク質の一次構造に存するセリ
ン残基またはスレオニン残基に結合したN-アセチルガラ
クトサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称
するものであるが、硫酸化多糖またはグリコサミノグリ
カンと組み合わされるものでなければならない。具体的
な構造は、「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守・
木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記載され
ており、代表的な糖鎖配列を図３に示す。これらの硫酸
化多糖等は、その機能を発揮する限りにおいて、その糖
鎖配列の一部に、付加、欠失、置換または修飾があって
もよい。

【００１４】糖鎖をヘパリン結合性タンパク質に結合さ
せるにあたっては、糖鎖のみを直接ヘパリン結合性タン
パク質に共有結合させてもよいし、糖鎖を共有結合して
いる任意の長さのペプチド鎖をヘパリン結合性タンパク
質に共有結合させてもよい。本発明の糖鎖が共有結合し
ているヘパリン結合性タンパク質（以下、「糖鎖付加型
へパリン結合性タンパク質」と記す。）を製造するに
は、まず、糖鎖の付加を受けることができるペプチドを
コードするcDNAとヘパリン結合性タンパク質をコードす
るcDNAとを連結し、これを適切な発現ベクターに組み込
み、当該発現ベクターを糖鎖付加経路を有する宿主細胞
に導入して、糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質を発
現させればよい。

【００１５】各種ヘパリン結合性タンパク質のcDNAは、
DDBJ (日本DNAデータバンク）など遺伝子バンクに登録
された配列から適当なプライマーを設計し、当該動物の
当該組織のmRNAよりRT-PCR（逆転写PCR)を行うことによ
って、取得できる。硫酸化多糖等付加型ヘパリン結合性
タンパク質を製造するには、まず、ヘパリン結合性タン
パク質のcDNAを硫酸化多糖等の付加を受けることが知ら
れているペプチドをコードするcDNAと連結し、これを適
切な宿主細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターを
宿主細胞に導入して、硫酸化多糖等付加型ヘパリン結合
性タンパク質を発現させればよい。硫酸化多糖等の付加
を受けることが知られているペプチドとしては、各種プ
ロテオグリカン（例えば、シンデカン、グリピカン、パ
ールカンなど）のコアタンパク質またはその一部分が挙
げられる。プロテオグリカンのコアタンパク質の一部分
としては、プロテオグリカンの糖鎖付加部位と考えられ
るSer-Glyの繰り返し配列を含むペプチドが挙げられ
る。

【００１６】N-型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質
を製造するには、まず、ヘパリン結合性タンパク質のcD
NAをN-型糖鎖の付加を受けることが知られているペプチ
ドをコードするcDNAとライゲートし、これを適切な宿主
細胞発現ベクターに組み込む。さらに当該ベクターを宿
主細胞に導入し、N-型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパ
ク質を発現させればよい。N-型糖鎖の付加を受けること
が知られているペプチドの例として、Asn-X-Thr、Asn-X
-Ser（配列中、X はプロリン以外の任意のアミノ酸であ
る。) が挙げられる。

【００１７】O-型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質
を製造するには、まず、ヘパリン結合性タンパク質のcD
NAをO-型糖鎖の付加を受けることが既知であるペプチド
をコードするcDNAとライゲートし、これを適切な宿主細
胞発現ベクターに組み込む。さらに当該ベクターを宿主
細胞に導入し、O-型糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク
質を発現させる。O-型糖鎖の付加を受けることが知られ
ているペプチドの例として、Ala-Thr-Pro-Ala-Proが挙
げられる。本発明で糖鎖を結合させる部位としては、ヘ
パリン結合性タンパク質の２次構造においてターンを形
成している部位又は末端近傍や糖鎖付加によって３次元
構造が大きく変化しない部位がよい。本発明の糖鎖付加
型ヘパリン結合性タンパク質の製造方法の一例を以下に
説明する。

【００１８】まず、分泌シグナルおよび糖鎖の付加を受
けることが知られているペプチドをコードするオリゴヌ
クレオチドを合成し、あるいは PCR反応によって増幅
し、これをヘパリン結合性タンパク質をコードするプラ
スミドの5'端に組み込む。分泌シグナルおよび糖鎖の付
加を受けることが知られているペプチドとしては、例え
ば、典型的な分泌型糖タンパク質のアミノ末端を利用す
ることができ、具体的には、マウスFGF-6 のN末端より4
0残基のアミノ酸などが挙げられる。ヘパリン結合性タ
ンパク質をコードするプラスミドは、ヘパリン結合性タ
ンパク質をコードするDNAを適当なプラスミドに組み込
むことにより調製することができる。このヘパリン結合
性タンパク質をコードするDNAを組み込むプラスミドと
しては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれ
も使用することができるが、例えば大腸菌由来のpBR32
2、pUC18 、及びこれらを基に構築されたpET-3cなどを
挙げることができる。

【００１９】ヘパリン結合性タンパク質をコードするプ
ラスミドに上記のオリゴヌクレオチドを組み込む方法と
しては、例えばT.Maniatisら、Molecular Cloning, Col
d Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982) に記載の
方法などが挙げられる。上記のようにして作製したプラ
スミドから、分泌シグナル、糖鎖の付加を受けることが
知られているペプチドおよびヘパリン結合性タンパク質
をコードする塩基配列を含む領域（以下、「糖鎖付加型
ヘパリン結合性タンパク質をコードする塩基配列を含む
領域」と記す。) を切り出し、これを発現に適したベク
ター中のプロモーターの下流に連結することにより、発
現型ベクターを得ることができる。

【００２０】上記の糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク
質をコードする塩基配列を含む領域はその5'末端に翻訳
開始コドンとしてのATG を有し、また3'末端には翻訳終
始コドンとしてのTAA 、TGA またはTAG を有してもよ
い。さらに該コーディング領域にコードされているタン
パク質を発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝
子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターで
あればいかなるものでもよい。形質転換する宿主が枯草
菌である場合には、SP01プロモーター、SP02プロモータ
ー、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合に
は、PHO5プロモーター、PGK プロモーター、GAP プロモ
ーター、ADH プロモーターなどが挙げられる。また、宿
主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーターが挙げられる。

【００２１】このようにして構築された糖鎖付加型ヘパ
リン結合性タンパク質をコードする塩基配列を有する組
み換えＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、宿主細胞
内で発現されるものであれば、いずれも使用することが
できるが、例えば大腸菌由来のpBR322、pUC18 などを基
に構築されたベクターなどを挙げることができる。プラ
スミドに組み込む方法としては、例えばT.Maniatisら、
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。上記の
組み換えＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入するこ
とにより、該ベクターを保持する形質転換体を製造す
る。

【００２２】宿主細胞としては、糖鎖付加経路を有する
ものであれば、いかなるものであってもよく、枯草菌
(例えばBacillus subtilis DB105)、酵母 (例えばPichi
a pasto ris, Saccharomyces cerevisiae) 、動物細胞
（例えばCOS cell, CHO cell,BHK cell, NIH3T3 cell,
BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell) 、昆虫細胞
（例えば、Sf-9 cell 、Tn cell ）などを例示すること
ができるが、これらに限定されることはない。

【００２３】上記の形質転換は、それぞれの宿主につい
て一般的に行われている方法で行う。また、一般的でな
くとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が
酵母であればリチウム法その他の方法により作成したコ
ンピータント細胞に組み換えＤＮＡを含むベクターを温
度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により
導入する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に
組み換えＤＮＡを含むベクターをリン酸カルシウム法、
リポフェクション法あるいはエレクトロポレーション法
により導入する。

【００２４】このようにして得られた形質転換体を培地
にて培養することにより、糖鎖付加型ヘパリン結合性タ
ンパク質を産生させる。形質転換体を培養する場合、培
養に使用される培地としては、それぞれの宿主について
一般的に用いられているものを用いる。または一般的で
なくとも適用可能な培地ならば良い。例としては、宿主
が酵母であればＹＰＤ培地などを用いる。宿主が動物細
胞であれば、Dulbecco's MEMに動物血清を加えたものな
どを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に
用いられている条件で行う。また一般的でなくとも適用
可能な条件ならばよい。例としては、宿主が酵母であれ
ば約25〜37℃で、約12時間〜2 週間行い、必要により通
気や攪拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれ
ば約32〜37℃で、5% CO₂、100%湿度の条件で約24時間〜
2 週間行い、必要により気相の条件を変えたり攪拌を加
えることができる。

【００２５】上記のような形質転換体の培養物から糖鎖
付加型ヘパリン結合性タンパク質を得るには、培養液中
に放出されたものを、遠心分離後の上澄み液から直接回
収できる。また、培養菌体あるいは細胞から抽出する場
合には、培養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、
超音波、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌
体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目的のタ
ンパク質を溶出させ、可溶性の画分から該タンパク質を
得ることができる。また目的のタンパク質が不溶性画分
に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離
により不溶性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む
緩衝液などによって可溶性にして回収する方法も用いう
る。このほか塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を
含む緩衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌
体外に目的のタンパク質を溶出させる方法もある。

【００２６】上記上澄み液から糖鎖付加型ヘパリン結合
性タンパク質を精製するには、公知の分離・精製法を適
切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾
過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、
等電点電気泳動などが使用されうる。さらに、多くのヘ
パリン結合性タンパク質については、ヘパリンセファロ
ースを担体としたアフィニティークロマトグラフィー法
が適用できる。

【００２７】このようにして得られた標品は糖鎖付加型
ヘパリン結合性タンパク質の活性が損なわれない限りに
おいて透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもで
きる。さらに、担体として血清アルブミンなどを添加し
て保存することは、標品の容器への吸着を防ぐのに有効
である。また、精製過程、あるいは保存過程での微量の
還元剤の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。
還元剤としては、β−メルカプトエタノール、ジチオス
レイトール、グルタチンなどが挙げられる。

【００２８】本発明の糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパ
ク質は、化学的な方法で糖鎖をヘパリン結合性タンパク
質に結合させることにより、製造することもできる。そ
の具体的な方法としては以下のa)，b)いずれか、あるい
はこれらの組み合わせによる方法が考えられる。ａ）例えば、まず、これらの糖鎖を生物学的方法または
化学的合成法またはこれの適宜組み合わせた方法により
完成させる。その際、糖鎖末端に適当なタンパク質結合
用の残基を導入しておくこともできる。例えば、完成さ
れた糖鎖の還元末端を還元および部分酸化することによ
りアルデヒド基を形成し、これをタンパク質中のアミノ
基とアミノ結合させることにより、糖鎖とタンパク質の
結合が完成する。

【００２９】ｂ）例えば、まず、単糖の還元末端、ある
いは単糖に結合した適当なタンパク質結合用の残基を還
元および部分酸化することによりアルデヒド基を形成
し、これをタンパク質中のアミノ基とアミノ結合させる
ことにより、単糖とタンパク質の結合が完成する。この
単糖の水酸基などの官能基にさらなる単糖や糖鎖などを
結合させることにより、糖鎖を完成させる。この結合に
は生物学的方法または化学的合成法またはこれの適宜組
み合わせた方法などが考えられる。

【００３０】ヘパリン結合性タンパク質に糖鎖を共有結
合させることにより高機能化したタンパク質は医薬とし
て利用可能である。例えば、本発明の糖鎖付加型ヘパリ
ン結合性タンパク質は、 FGFの生理的機能を調節する作
用を有する。 FGFの生理的機能とは、具体的には、繊維
芽細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、骨芽細
胞、グリア細胞の増殖を促進または抑制するこという。
従って、本発明の糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質
は、細胞増殖や肝臓など組織再生の促進、創傷治癒や神
経機能調節、および繊維芽細胞等の増殖調節に有効であ
り、各種疾病、具体的には、繊維芽細胞腫、血管腫、骨
芽腫、神経細胞死、アルツハイマー病、パーキンソン
病、神経芽腫、健忘症、痴呆病、心筋梗塞の予防や治療
に有用であり、発毛剤、育毛剤などとしても利用可能で
ある。

【００３１】上記のようにして得られた糖鎖付加型ヘパ
リン結合性タンパク質は、医薬的に許容できる溶剤、賦
形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従
って液剤、ローション剤、エアゾール剤、注射剤、散
剤、顆粒剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤など
の医薬組成物としてもよい。医薬組成物中、有効成分で
ある糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質の含有量は、
0.0000000001〜1.0重量％程度とすればよい。

【００３２】該医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラ
ット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口
的にまたは経口的に安全に投与することができる。本医
薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により
適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与す
る場合、当該糖鎖付与型ヘパリン結合性タンパク質を、
0.0001〜100mgを患部に１日に数回適用することが例示
される。

【００３３】微生物の寄託本発明の糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質をコード
する遺伝子（配列番号２、４、１８、２０、２２、２
４、２６、２８および３０のＤＮＡ配列をそれぞれ有す
る）を組み込んだプラスミドを含む大腸菌 DH5α株は、
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-1
6412、FERM P-16408、FERM P-16411、FERMP-16415、FER
M P-16413、FERM P-16414、FERM P-16407、 FERM P-164
09 およびFERM P-16410にて、平成９年９月10日に寄託
されている。

【００３４】

〔実施例１〕

【００３５】１）S/FGF-1a-II プラスミドの構築 1.ヒトリュウドカン cDNA 断片の作成 phR7A8は、ヒトリュウドカンの cDNA (PCR産物) を pBl
uescript II (KS+) クローニングベクターの EcoR V 部
位に挿入したプラスミドである。アセッション番号 D13
292 に示される mRNA 配列のうち、7 番目から 2610 番
目までを含む（B.B.R.C. Vol. 190, No. 3, p.814-822,
1993 を参照のこと) 。これを Pvu II で消化し、得ら
れた 2,232塩基対の DNA断片を鋳型として PCR(Polymer
ase Chain Reaction:ポリメレース連鎖反応) を行っ
た。プライマーとして # 109 (5'-TTG TCG ACC CAC CAT
GGC CCC CGC CCG TCT-3' ) （配列番号７）および、#
111 (5'-TTG ATA TCT AGA GGC ACC AAG GGA TG-3' )
（配列番号８）を用いた。特異的に増幅された 276塩基
対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、 E
coR V および Sal Iで二重切断した。得られた、268 塩
基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用い
た。

【００３６】2. FGF-1a/pBluescript II (KS+) ヒト FGF-1 cDNA を鋳型とし、# 967 (5'-GCG TCG ACA
GCG CTA ATT ACA AGAAGC CCA AAC TC-3')（配列番号
９）および # 630 (5'-CCG AAT TCG AAT TCT TTAATC AG
A AGA GAC TGG-3')（配列番号１０）をプライマーとし
て PCR反応を行った。特異的に増幅された 434塩基対の
バンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、 EcoR
I および Sal Iで二重切断した。得られた、422 塩基対
のバンドを分離抽出し、これを、EcoR I, Sal I で二重
切断した pBluescript II (KS+) クローニングベクター
( 2934 塩基対) に挿入して、FGF-1a/pBluescript II
(KS+) を得た。FGF-1a/pBluescript II (KS+) を Aor51
H I および Sal Iで順次消化し、得られた2626塩基対の
バンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。

【００３７】3. S/FGF-1a-II キメラ遺伝子の作成ヒトリュウドカンの PCR産物の EcoR V/Sal I 断片、及
び FGF-1a/pBluescript II (KS+)の Aor51H I/Sal I 断
片を DNA連結反応に供し、S/FGF-1a-II/pBluescript II
(KS+)ベクターを得た。さらにこれを、EcoR Iおよび S
al Iで二重切断し、得られた、678 塩基対のバンドを分
離抽出した。これを、EcoR I, Sal I で二重切断した p
MEXneo発現ベクター (5916塩基対) に挿入して、S/FGF-
1a-II/pMEXneo を得た。この発現型ベクターは、配列番
号２の塩基配列を含む。

【００３８】２）S/FGF-1a-II の発現得られた S/FGF-1a-II/pMEXneoをリポフェクション法に
よって CHO-K1 細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞
K1 亜株）に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培
養することによって遺伝子導入細胞を選択した。得られ
た細胞を培養皿ほぼいっぱいになるまで増やし、培地を
無血清培地に交換することによって物質生産量を増大さ
せた。２日毎に培地を交換し、得られた馴化培地は低速
遠心分離した後、その上清を４℃で保存した。

【００３９】３）N-FGF-6/1a-IV プラスミドの構築 1.マウス FGF-6 cDNA 断片の作成マウス FGF-6 cDNA を鋳型とし、# 1048 (5'-GCG TCG A
CC CAC CAT GTC CCG GGG AGC AGG ACG TGT TCA GGG CAC
GCT GCA GGC TCT CGT CTT C-3')（配列番号１１）およ
び # 968 (5'-GCG ATA TCC AGT AGC GTG CCG TTG GCG C
G-3') （配列番号１２）をプライマーとして PCR反応を
行った。特異的に増幅された 138塩基対のバンドを電気
泳動により分離し、これを抽出後、EcoR Vおよび Sal I
で二重切断した。得られた、130 塩基対のバンドを分離
抽出し、以下に示す連結反応に用いた。

【００４０】2. N-FGF-6/1a-IVキメラ遺伝子の作成マウス FGF-6の PCR産物の EcoR V/Sal I 断片、及び F
GF-1a/pBluescript II(KS+)の Aor51H I/Sal I 断片を
DNA連結反応に供し、N-FGF-6/1a-IV/pBluescript II (K
S+)ベクターを得た。さらにこれを、EcoR Iおよび Sal
Iで二重切断し、得られた、540 塩基対のバンドを分離
抽出した。これを、EcoR I, Sal I で二重切断した pME
Xneo発現ベクター (5916塩基対) に挿入して、N-FGF-6/
1a-IV/pMEXneo を得た。この発現型ベクターは、配列番
号４の塩基配列を含む。

【００４１】４）N-FGF-6/1a-IV の発現上述、S/FGF-6/1a-IIと同様に N-FGF-6/1a-IV/pMEXneo
を CHO-K1 細胞に遺伝子導入し、N-FGF-6/1a-IV を培養
上清中に分泌させた。

【００４２】５）O-FGF-6/1aプラスミドの構築 1. N-FGF-6/1a<NQ> キメラ遺伝子の作成 N-FGF-6/1a/pBluescript II (KS+) ベクターを鋳型と
し、# 105 (5'-GCG TCGACC CAC CAT GTC-3') （配列番
号１３）および # 124 (5'-GCG ATA TCC AGT AGCGTG CC
T TGG GCG CG-3') （配列番号１４）をプライマーとし
て PCR反応を行った。特異的に増幅された 138塩基対の
バンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、 EcoR
V および Sal Iで二重切断した。得られた、130 塩基対
のバンドを、FGF-1a/pBluescript II (KS+) の Aor51H
I/Sal I断片と共に DNA連結反応に供し、N-FGF-6/1a<NQ
>/pBluescript II (KS+) ベクターを得た。

【００４３】2. O-FGF-6/1a キメラ遺伝子の作成 N-FGF-6/1a<NQ>/pBluescript II (KS+) を鋳型とし、#
098 (5'-GCT GGA GGAGGC TGC TAC TCC AGC TCC AAA CCA
TTA CA-3')（配列番号１５）および、# 116(5'-GCC GC
T CTA GAA CTA GTG GAT-3') （配列番号１６）をプライ
マーとして一次 PCR反応を行い、特異的に増幅された 2
10塩基対のバンドを精製し、この PCR産物と # 115 (5'
-AAC AAA AGC TGG GTA CCG GG-3')をプライマーとして
二次 PCR反応を行った。特異的に増幅された 631塩基対
のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出、精製
後、 EcoR I および Sal Iで二重切断した。得られた、
558 塩基対のバンドを、分離抽出した。これを、EcoR
I, Sal I で二重切断した pMEXneo発現ベクター (5916
塩基対) に挿入して、O-FGF-6/1a/pMEXneoを得た。この
発現型ベクターは、配列番号６の塩基配列を含む。

【００４４】６）O-FGF-6/1aの発現上述のS/FGF-1a-II と同様に O-FGF-6/1a/pMEXneo を C
HO-K1 細胞に遺伝子導入し、O-FGF-6/1aを培養上清中に
分泌させた。

【００４５】７）大腸菌でのFGF-1aの発現上述のとおり得られたヒトFGF-1a cDNA のEcoR I、Sal
I 二重切断断片を、大腸菌用発現ベクターであるpET3c
に組み込んだ。得られたベクターで大腸菌BL21(DE3)pLy
sSを形質転換した後、対数増殖期にある菌体をIPTG (イ
ソプロピルチオ−β−ガラクトシド）で刺激することに
よって、導入遺伝子の発現を誘導した。この菌体を集
め、超音波破砕することによってFGF-1aを遊離させ、遠
心上清中にこれを回収した。

【００４６】８）ペプチドN-グリコシダーゼ F処理によ
るN-型糖鎖の除去後述のとおり（試験例１参照）ヘパリンセファロースビ
ーズで濃縮したN-FGF-6/1a-II を電気泳動用緩衝液で煮
沸、溶出した。その一部に、NP-40(終濃度1%)、トリス
塩酸緩衝液(pH 7.5)、ペプチドN-グリコシダーゼ F(0.3
U) を加え、37℃で一晩保温した後、100 ℃で３分間加
熱して酵素反応を止めた。これを後述のとおりSDS変性
電気泳動によって解析した。

【００４７】上記、実施例のうち、「1.ヒトリュウドカ
ンｃＤＮＡ断片の作成」や「1.マウスFGF-6cDNA断片の
作成」で述べたＰＣＲプライマー（♯111，♯968）を適
当な配列に変更し、さらに酵素処理に用いるEcoR Vを平
滑末端を生じる適当な制限酵素に変更することによっ
て、様々のS/FGF-la、N-FGF-6/la を作成することがで
きる。このようなｃＤＮＡ配列の例を配列番号８，２
０，２２，２４，２６，２８に示す。また、上記、実施
例のうち、「2.O-FGF-6/laキメラ遺伝子の作成」で述べ
たＰＣＲに用いる鋳型をS/FGF-1a-II/pBluescript II(K
S+) やN-FGF-6/la-IV/pBluescript II(KS+) などを用い
ることによって、あるいはＰＣＲプライマー（♯098，
♯116，♯115）を適当な配列に変更することによって、
あるいはその両方を組み合わせることによって、様々の
O-FGF-6/laを作成することができる。このようなｃＤＮ
Ａ配列の例を配列番号３０に示す。

【００４８】〔試験例１〕 SDS 変性電気泳動各種 FGF-1a 類似蛋白質の分泌細胞の馴化培地に加えた
ヘパリンセファロースビーズを洗浄後、直接、電気泳動
用緩衝液（SDS, 2-メルカプトエタノール含有）と共に
煮沸し、溶出された蛋白質を試料とした。12.5 %アクリ
ルアミドゲルを用い、SDS、 2-メルカプトエタノール存
在下で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に電気的に
転写後、抗 FGF-1単クローナル抗体、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識抗マウス IgG抗体を用いて染色し、化学
発光法で検出した（図４）。図中、左の矢は分子量既知
の標準タンパク質の泳動位置とその分子量（単位：ダル
トン）を示す。図中、A)はS/FGF-1a-II のSDS変性電気
泳動図を、B)は、大腸菌で生産したFGF-1a (レーンa)、
N-FGF-6/1a-IV をペプチドN-グリコシダーゼ Fで処理す
ることによりN-型糖鎖を除去したN-FGF-1a-IV (レーン
b)、N-FGF-6/1a-IV (レーンc)およびO-FGF-6/1a (レー
ンd)のSDS変性電気泳動図を示す。

【００４９】〔試験例２〕 DNA 合成促進活性 HUVEC （ヒト臍帯由来血管内皮細胞）は 15 % 血清存在
下でもＦＧＦなどの増殖因子が欠乏すると細胞周期が停
止する。このような状態においた HUVECに S/FGF-1a-I
I, N-FGF-6/1a-IV, O-FGF-6/1a あるいは大腸菌で生産
させた FGF-1a を添加し、18時間後、放射標識されたチ
ミジンを６時間取り込ませてこの間にDNA中に取り込ま
れた放射能によって新たに合成された DNA量とした。

【００５０】1. S/FGF-1a-IIのヒト血管内皮細胞へのDN
A合成促進効果（ヘパリン非依存性） S/FGF-1a-II 遺伝子導入細胞の無血清培地での馴化培地
を PBSに対して透析後、ヘパリン共存下（5 μg/ml) 、
あるいはヘパリン非共存下で、HUVEC の DNA合成促進活
性を調べた。その結果、S/FGF-1a-II は、大腸菌で生産
した FGF-1a とは異なり、ヘパリン非依存的に HUVECの
DNA合成を促進した（図５）。

【００５１】2. N-FGF-6/1a-IVのヒト血管内皮細胞への
DNA合成促進効果 N-FGF-6/1a-IV 遺伝子導入細胞の無血清培地での馴化培
地を PBSに対して透析後、ヘパリン共存下（5 μg/ml)
、あるいはヘパリン非共存下で、HUVEC の DNA合成促
進活性を調べた（図８）。その結果、N-FGF-6/1a-IV
は、大腸菌で生産した FGF-1a と同様に HUVECの DNA合
成を促進するものの、そのヘパリン依存性は弱く、ヘパ
リン非共存下では大腸菌由来FGF-1aよりも強いDNA 合成
促進活性を示した（図８）。

【００５２】〔試験例３〕ヘパリン親和性アフィニテ
イークロマトグラフィー前述２）で得られたS/FGF-1a-II について、ヘパリン親
和性を調べた。S/FGF-1a-II の分泌細胞の馴化培地にヘ
パリンセファロースビーズを加え、４℃で２時間以上撹
拌した。低速遠心によって沈降するビーズを回収し、生
理的リン酸緩衝液（ PBS : phosphate buffered salin
e, pH 7.4）で十分に洗浄後、2.5 M NaClを含む PBSに
よってヘパリン固定化ビーズに結合した蛋白質を溶出し
た。さらにこの溶出液に蒸留水を加え塩濃度を低下させ
た後、再び、ヘパリン親和性アフィニテイービーズを充
填した高速液体クロマトグラフィーに供し、NaClの濃度
勾配によってS/FGF-1a-II を溶出した。大腸菌由来FGF-
1aは約1.0 M NaCl付近に溶出されるのに対し、S/FGF-1a
-II は約0.4 M NaClで溶出され、固定化ヘパリンへの親
和性が低下しているものと考えられた（図９）。図９で
見られる1.0 M NaCl付近の小さなピークについては、SD
S変性電気泳動の結果、S/FGF-1a-II の分解産物と考え
られる。

【００５３】〔試験例４〕 FGF-1a 類似蛋白質の耐熱
安定性各種 FGF-1a 類似蛋白質の分泌細胞の馴化培地を PBSに
対して十分に透析し、その一部を 56 ℃または 70 ℃に
保温した PBS中に 30 分間保持、あるいは、室温で12時
間保持した後、再び 4℃の PBSに対して透析し、試料と
した。S/FGF-1a-II の安定性は、各種処理の後、HUVEC
のDNA 合成促進活性試験に供し、4 ℃のPBS で12時間透
析した試料との比較によって、安定性の指標とした。室
温、12時間では、大腸菌由来 FGF-1a でもヘパリンによ
ってその活性は保護されるが、S/FGF-1a-II はヘパリン
の有無に関わらず活性は保持された。また、56℃、30分
の熱処理では大腸菌由来 FGF-1a はほとんど失活するに
も関わらず、S/FGF-1a-II は約 50 % の活性が残存し、
耐熱安定性が向上しているものと考えられた（図６）。

【００５４】〔試験例５〕 FGF-1a 類似蛋白質の耐
酸、耐アルカリ安定性各種 FGF-1a 類似蛋白質の分泌細胞の馴化培地を PBSに
対して十分に透析し、その一部を pH 4.0 のクエン酸緩
衝液または pH 10.0の炭酸ナトリウム緩衝液中で12時間
透析し、再び 4℃の PBSに対して透析した後、試料とし
た。S/FGF-1a-II の安定性は、各種処理の後、HUVEC の
DNA 合成促進活性試験に供し、4 ℃のPBS で12時間透析
した試料との比較によって、安定性の指標とした。S/FG
F-1a-II はヘパリンの存在の有無に関わらず pH 4.0 の
酸処理によってもほとんど活性の低下がみられず、耐酸
安定性の向上が認められた（図６）。また、pH 10.0 の
アルカリ処理によって、大腸菌由来 FGF-1a がほとんど
活性を消失するにも関わらず、S/FGF-1a-II は約50%の
活性を保持しており、耐アルカリ安定性についても向上
が認められた（図６）。

【００５５】〔試験例６〕 FGF-1a 類似蛋白質の抗蛋
白質分解酵素安定性各種 FGF-1a 類似蛋白質の分泌細胞の馴化培地をPBSに
対して十分に透析し、その一部に各種濃度のトリプシン
液 (0.0001〜0.1%) を加え、37℃で１時間保温した。こ
れを前述のSDS変性電気泳動に供し、残存するバンドの
強度を処理前の試料と比較することで安定性の指標とし
た。その結果、図７に示すとおり、S/FGF-1a-II は0.00
1%のトリプシン処理で88%、0.01%で35%の染色強度が残
存するのに対し、大腸菌由来FGF-1aは0.001%で58%、0.0
1%で6%にまでバンドの強度が減少しており、S/FGF-1a-I
I は蛋白質分解酵素に対する抵抗性が増大しているもの
と考えられた（図７）。

【００５６】

【発明の効果】本発明の新規な糖鎖付加型ヘパリン結合
性タンパク質は、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、蛋白
質分解酵素抵抗性などの安定性に優れている。従って、
本発明の糖鎖付加型ヘパリン結合性タンパク質を医薬品
に利用することにより、生体内での安定性、特に、耐酸
性、耐アルカリ性といった安定性に優れ、経口投与への
適用が可能な医薬品を設計することができる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 1 5 10 15 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Asp Leu Asp Asp Leu Glu Asp Ser Met Ile Gly Pro Glu Val Val His 65 70 75 80 Pro Leu Val Pro Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr 85 90 95 Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val 100 105 110 Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser 115 120 125 Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln 130 135 140 Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro 145 150 155 160 Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn 165 170 175 Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu 180 185 190 Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 210 215 220

【００５８】配列番号：２配列の長さ：６６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列ＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ
ＴＴＣＴＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＧ６０ＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣ
ＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡ１２０ＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＣＣＣ
ＧＧＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧ１８０ＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＣ
ＴＣＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴ２４０ＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＧ
ＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＧＴＡＧＣＡＡＣＧＧＧ３００ＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡ
ＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣ３６０ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＣ
ＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＧＡＧＴＡＣＣ４２０ＧＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＣ
ＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡ４８０ＡＡＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧ
ＧＡＧＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＴＣＣ５４０ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＧＣ
ＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣ６００ＧＧＴＣＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣ
ＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴ６６０ＧＡＴ
６６３

【００５９】配列番号：３配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 115 120 125 Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 130 135 140 Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 165 170 175

【００６０】配列番号：４配列の長さ：５２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TGTTCAGGGC ACGCTGCAGG CTCTCGTCTT CTTAGGCGTC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCACCTGCC GGCGCCCGCG CCAACGGCAC GCTACTGGAC 120 GCTAATTACA AGAAGCCCAA ACTCCTCTAC TGTAGCAACG GGGGCCACTT CCTGAGGATC 180 CTTCCGGATG GCACAGTGGA TGGGACAAGG GACAGGAGCG ACCAGCACAT TCAGCTGCAG 240 CTCAGTGCGG AAAGCGTGGG GGAGGTGTAT ATAAAGAGTA CCGAGACTGG CCAGTACTTG 300 GCCATGGACA CCGACGGGCT TTTATACGGC TCACAGACAC CAAATGAGGA ATGTTTGTTC 360 CTGGAAAGGC TGGAGGAGAA CCATTACAAC ACCTATATAT CCAAGAAGCA TGCAGAGAAG 420 AATTGGTTTG TTGGCCTCAA GAAGAATGGG AGCTGCAAAC GCGGTCCTCG GACTCACTAT 480 GGCCAGAAAG CAATCTTGTT TCTCCCCCTG CCAGTCTCTT CTGAT 525

【００６１】配列番号：５配列の長さ：１８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Ala Ala 115 120 125 Thr Pro Ala Pro Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala 130 135 140 Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg 145 150 155 160 Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu 165 170 175 Pro Val Ser Ser Asp 180

【００６２】配列番号：６配列の長さ：５４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TGTTCAGGGC ACGCTGCAGG CTCTCGTCTT CTTAGGCGTC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCACCTGCC GGCGCCCGCG CCCAAGGCAC GCTACTGGAC 120 GCTAATTACA AGAAGCCCAA ACTCCTCTAC TGTAGCAACG GGGGCCACTT CCTGAGGATC 180 CTTCCGGATG GCACAGTGGA TGGGACAAGG GACAGGAGCG ACCAGCACAT TCAGCTGCAG 240 CTCAGTGCGG AAAGCGTGGG GGAGGTGTAT ATAAAGAGTA CCGAGACTGG CCAGTACTTG 300 GCCATGGACA CCGACGGGCT TTTATACGGC TCACAGACAC CAAATGAGGA ATGTTTGTTC 360 CTGGAAAGGC TGGAGGAGGC TGCTACTCCA GCTCCAAACC ATTACAACAC CTATATATCC 420 AAGAAGCATG CAGAGAAGAA TTGGTTTGTT GGCCTCAAGA AGAATGGGAG CTGCAAACGC 480 GGTCCTCGGA CTCACTATGG CCAGAAAGCA ATCTTGTTTC TCCCCCTGCC AGTCTCTTCT 540 GAT 543

【００６３】配列番号：７配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTGTCGACCC ACCATGGCCC CCGCCCGTCT 30

【００６４】配列番号：８配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状１列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTGATATCTA GAGGCACCAA GGGATG 26

【００６５】配列番号：９配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGTCGACAG CGCTAATTAC AAGAAGCCCA AACTC 35

【００６６】配列番号：１０配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧ
３３

【００６７】配列番号：１１配列の長さ：６４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGTCGACCC ACCATGTCCC GGGGAGCAGG ACGTGTTCAG GGCACGCTGC AGGCTCTCGT 60 CTTC 64

【００６８】配列番号：１２配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGATATCCA GTAGCGTGCC GTTGGCGCG 29

【００６９】配列番号：１３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣ
１８

【００７０】配列番号：１４配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGATATCCA GTAGCGTGCC TTGGGCGCG 29

【００７１】配列番号：１５配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTGGAGGAG GCTGCTACTC CAGCTCCAAA CCATTACA 38

【００７２】配列番号：１６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCGCTCTAG AACTAGTGGA T 21

【００７３】配列番号：１７配列の長さ：２００配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 1 5 10 15 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly 65 70 75 80 His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp 85 90 95 Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly 100 105 110 Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp 115 120 125 Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu 130 135 140 Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys 145 150 155 160 Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser 165 170 175 Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe 180 185 190 Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 195 200

【００７４】配列番号：１８配列の長さ：６００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGCCCCCG CCCGTCTGTT CGCGCTGCTG CTGTTCTTCG TAGGCGGAGT CGCCGAGTCG 60 ATCCGAGAGA CTGAGGTCAT CGACCCCCAG GACCTCCTAG AAGGCCGATA CTTCTCCGGA 120 GCCCTACCAG ACGATGAGGA TGTAGTGGGG CCCGGGCAGG AATCTGATGA CTTTGAGCTG 180 TCTGGCTCTG GAGATGCTAA TTACAAGAAG CCCAAACTCC TCTACTGTAG CAACGGGGGC 240 CACTTCCTGA GGATCCTTCC GGATGGCACA GTGGATGGGA CAAGGGACAG GAGCGACCAG 300 CACATTCAGC TGCAGCTCAG TGCGGAAAGC GTGGGGGAGG TGTATATAAA GAGTACCGAG 360 ACTGGCCAGT ACTTGGCCAT GGACACCGAC GGGCTTTTAT ACGGCTCACA GACACCAAAT 420 GAGGAATGTT TGTTCCTGGA AAGGCTGGAG GAGAACCATT ACAACACCTA TATATCCAAG 480 AAGCATGCAG AGAAGAATTG GTTTGTTGGC CTCAAGAAGA ATGGGAGCTG CAAACGCGGT 540 CCTCGGACTC ACTATGGCCA GAAAGCAATC TTGTTTCTCC CCCTGCCAGT CTCTTCTGAT 600

【００７５】配列番号：１９配列の長さ：２００配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 5 10 15 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Ser Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly 65 70 75 80 His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp 85 90 95 Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly 100 105 110 Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp 115 120 125 Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu 130 135 140 Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys 145 150 155 160 Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser 165 170 175 Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe 180 185 190 Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 195 200

【００７６】配列番号：２０配列の長さ：６００配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGCCCCCG CCCGTCTGTT CGCGCTGCTG CTGTTCTTCG TAGGCGGAGT CGCCGAGTCG 60 ATCCGAGAGA CTGAGGTCAT CGACCCCCAG GACCTCCTAG AAGGCCGATA CTTCTCCGGA 120 GCCCTATCAG ACGATGAGGA TGTAGTGGGG CCCGGGCAGG AATCTGATGA CTTTGAGCTG 180 TCTGGCTCTG GAGATGCTAA TTACAAGAAG CCCAAACTCC TCTACTGTAG CAACGGGGGC 240 CACTTCCTGA GGATCCTTCC GGATGGCACA GTGGATGGGA CAAGGGACAG GAGCGACCAG 300 CACATTCAGC TGCAGCTCAG TGCGGAAAGC GTGGGGGAGG TGTATATAAA GAGTACCGAG 360 ACTGGCCAGT ACTTGGCCAT GGACACCGAC GGGCTTTTAT ACGGCTCACA GACACCAAAT 420 GAGGAATGTT TGTTCCTGGA AAGGCTGGAG GAGAACCATT ACAACACCTA TATATCCAAG 480 AAGCATGCAG AGAAGAATTG GTTTGTTGGC CTCAAGAAGA ATGGGAGCTG CAAACGCGGT 540 CCTCGGACTC ACTATGGCCA GAAAGCAATC TTGTTTCTCC CCCTGCCAGT CTCTTCTGAT 600

【００７７】配列番号：２１配列の長さ：２５４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 5 10 15 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Asp Leu Asp Asp Leu Glu Asp Ser Met Ile Gly Pro Glu Val Val His 65 70 75 80 Pro Leu Val Pro Leu Asp Asn His Ile Pro Glu Arg Ala Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Gln Val Pro Thr Glu Pro Lys Lys Leu Glu Glu Asn Glu Val Ile 100 105 110 Pro Lys Arg Ile Ser Pro Val Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu 115 120 125 Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr 130 135 140 Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu 145 150 155 160 Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly 165 170 175 Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr 180 185 190 Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr 195 200 205 Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly 210 215 220 Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly 225 230 235 240 Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 245 250

【００７８】配列番号：２２配列の長さ：７６２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGCCCCCG CCCGTCTGTT CGCGCTGCTG CTGTTCTTCG TAGGCGGAGT CGCCGAGTCG 60 ATCCGAGAGA CTGAGGTCAT CGACCCCCAG GACCTCCTAG AAGGCCGATA CTTCTCCGGA 120 GCCCTACCAG ACGATGAGGA TGTAGTGGGG CCCGGGCAGG AATCTGATGA CTTTGAGCTG 180 TCTGGCTCTG GAGATCTGGA TGACTTGGAA GACTCCATGA TCGGCCCTGA AGTTGTCCAT 240 CCCTTGGTGC CTCTAGATAA CCATATCCCT GAGAGGGCAG GGTCTGGGAG CCAAGTCCCC 300 ACCGAACCCA AGAAACTAGA GGAGAATGAG GTTATCCCCA AGAGAATCTC ACCCGTTGCT 360 AATTACAAGA AGCCCAAACT CCTCTACTGT AGCAACGGGG GCCACTTCCT GAGGATCCTT 420 CCGGATGGCA CAGTGGATGG GACAAGGGAC AGGAGCGACC AGCACATTCA GCTGCAGCTC 480 AGTGCGGAAA GCGTGGGGGA GGTGTATATA AAGAGTACCG AGACTGGCCA GTACTTGGCC 540 ATGGACACCG ACGGGCTTTT ATACGGCTCA CAGACACCAA ATGAGGAATG TTTGTTCCTG 600 GAAAGGCTGG AGGAGAACCA TTACAACACC TATATATCCA AGAAGCATGC AGAGAAGAAT 660 TGGTTTGTTG GCCTCAAGAA GAATGGGAGC TGCAAACGCG GTCCTCGGAC TCACTATGGC 720 CAGAAAGCAA TCTTGTTTCT CCCCCTGCCA GTCTCTTCTG AT 762

【００７９】配列番号：２３配列の長さ：２８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 5 10 15 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Asp Leu Asp Asp Leu Glu Asp Ser Met Ile Gly Pro Glu Val Val His 65 70 75 80 Pro Leu Val Pro Leu Asp Asn His Ile Pro Glu Arg Ala Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Gln Val Pro Thr Glu Pro Lys Lys Leu Glu Glu Asn Glu Val Ile 100 105 110 Pro Lys Arg Ile Ser Pro Val Glu Glu Ser Glu Asp Val Ser Asn Lys 115 120 125 Val Ser Met Ser Ser Thr Val Gln Gly Ser Asn Ile Phe Glu Arg Thr 130 135 140 Glu Val Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg 165 170 175 Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val 180 185 190 Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met 195 200 205 Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys 210 215 220 Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser 225 230 235 ２４０ＬｙｓＬｙｓＨｉｓＡｌａＧｌｕＬｙｓＡｓｎＴｒｐＰｈｅ
ＶａｌＧｌｙＬｅｕＬｙｓＬｙｓＡｓｎＧｌｙ２４５
２５０２５５ＳｅｒＣｙｓＬｙｓＡｒｇＧｌｙＰｒｏＡｒｇＴｈｒＨｉｓ
ＴｙｒＧｌｙＧｌｎＬｙｓＡｌａＩｌｅＬｅｕ２６０２６５
２７０ＰｈｅＬｅｕＰｒｏＬｅｕＰｒｏＶａｌＳｅｒＳｅｒＡｓｐ２７５２８０

【００８０】配列番号：２４配列の長さ：８４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATGGCCCCCG CCCGTCTGTT CGCGCTGCTG CTGTTCTTCG TAGGCGGAGT CGCCGAGTCG 60 ATCCGAGAGA CTGAGGTCAT CGACCCCCAG GACCTCCTAG AAGGCCGATA CTTCTCCGGA 120 GCCCTACCAG ACGATGAGGA TGTAGTGGGG CCCGGGCAGG AATCTGATGA CTTTGAGCTG 180 TCTGGCTCTG GAGATCTGGA TGACTTGGAA GACTCCATGA TCGGCCCTGA AGTTGTCCAT 240 CCCTTGGTGC CTCTAGATAA CCATATCCCT GAGAGGGCAG GGTCTGGGAG CCAAGTCCCC 300 ACCGAACCCA AGAAACTAGA GGAGAATGAG GTTATCCCCA AGAGAATCTC ACCCGTTGAA 360 GAGAGTGAGG ATGTGTCCAA CAAGGTGTCA ATGTCCAGCA CTGTGCAGGG CAGCAACATC 420 TTTGAGAGAA CGGAGGTCGC TAATTACAAG AAGCCCAAAC TCCTCTACTG TAGCAACGGG 480 GGCCACTTCC TGAGGATCCT TCCGGATGGC ACAGTGGATG GGACAAGGGA CAGGAGCGAC 540 CAGCACATTC AGCTGCAGCT CAGTGCGGAA AGCGTGGGGG AGGTGTATAT AAAGAGTACC 600 GAGACTGGCC AGTACTTGGC CATGGACACC GACGGGCTTT TATACGGCTC ACAGACACCA 660 AATGAGGAAT GTTTGTTCCT GGAAAGGCTG GAGGAGAACC ATTACAACAC CTATATATCC 720 AAGAAGCATG CAGAGAAGAA TTGGTTTGTT GGCCTCAAGA AGAATGGGAG CTGCAAACGC 780 GGTCCTCGGA CTCACTATGG CCAGAAAGCA ATCTTGTTTC TCCCCCTGCC AGTCTCTTCT 840 GAT 843

【００８１】配列番号：２５配列の長さ：１７２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 35 40 45 Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 50 55 60 Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala 65 70 75 80 Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr 85 90 95 Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn 100 105 110 Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 115 120 125 Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys 130 135 140 Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys 145 150 155 160 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 165 170

【００８２】配列番号：２６配列の長さ：５１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TGTTCAGGGC ACGCTGCAGG CTCTCGTCTT CTTAGGCGTC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCACCTGCC GGCGCCCGCG CCAACGGCTC GGCTAATTAC 120 AAGAAGCCCA AACTCCTCTA CTGTAGCAAC GGGGGCCACT TCCTGAGGAT CCTTCCGGAT 180 GGCACAGTGG ATGGGACAAG GGACAGGAGC GACCAGCACA TTCAGCTGCA GCTCAGTGCG 240 GAAAGCGTGG GGGAGGTGTA TATAAAGAGT ACCGAGACTG GCCAGTACTT GGCCATGGAC 300 ACCGACGGGC TTTTATACGG CTCACAGACA CCAAATGAGG AATGTTTGTT CCTGGAAAGG 360 CTGGAGGAGA ACCATTACAA CACCTATATA TCCAAGAAGC ATGCAGAGAA GAATTGGTTT 420 GTTGGCCTCA AGAAGAATGG GAGCTGCAAA CGCGGTCCTC GGACTCACTA TGGCCAGAAA 480 GCAATCTTGT TTCTCCCCCT GCCAGTCTCT TCTGAT 516

【００８３】配列番号：２７配列の長さ：２１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly Glu Ile Ser Gly Val Asn Trp 50 55 60 Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Ala Asn Tyr Lys Lys 65 70 75 80 Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu 85 90 95 Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile 100 105 110 Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser 115 120 125 Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr 130 135 140 Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu 145 150 155 160 Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn 165 170 175 Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg 180 185 190 Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser 195 200 205 Ser Asp 210

【００８４】配列番号：２８配列の長さ：６３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TGTTCAGGGC ACGCTGCAGG CTCTCGTCTT CTTAGGCGTC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCACCTGCC GGCGCCCGCG CCAACGGCAC GCTACTGGAC 120 TCCAGAGGCT GGGGCACCCT CTTGTCCAGG TCTCGAGCTG GGCTAGCTGG AGAGATTTCG 180 GGTGTGAATT GGGAAAGCGG CTATTTGGTG GGCATTAAGC GACAGGCTAA TTACAAGAAG 240 CCCAAACTCC TCTACTGTAG CAACGGGGGC CACTTCCTGA GGATCCTTCC GGATGGCACA 300 GTGGATGGGA CAAGGGACAG GAGCGACCAG CACATTCAGC TGCAGCTCAG TGCGGAAAGC 360 GTGGGGGAGG TGTATATAAA GAGTACCGAG ACTGGCCAGT ACTTGGCCAT GGACACCGAC 420 GGGCTTTTAT ACGGCTCACA GACACCAAAT GAGGAATGTT TGTTCCTGGA AAGGCTGGAG 480 GAGAACCATT ACAACACCTA TATATCCAAG AAGCATGCAG AGAAGAATTG GTTTGTTGGC 540 CTCAAGAAGA ATGGGAGCTG CAAACGCGGT CCTCGGACTC ACTATGGCCA GAAAGCAATC 600 TTGTTTCTCC CCCTGCCAGT CTCTTCTGAT 630

【００８５】配列番号：２９配列の長さ：１８０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Ala 115 120 125 Thr Pro Ala Pro His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu 130 135 140 Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly 145 150 155 160 Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro 165 170 175 Val Ser Ser Asp 180

【００８６】配列番号：３０配列の長さ：５４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TGTTCAGGGC ACGCTGCAGG CTCTCGTCTT CTTAGGCGTC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCACCTGCC GGCGCCCGCG CCAACGGCAC GCTACTGGAC 120 GCTAATTACA AGAAGCCCAA ACTCCTCTAC TGTAGCAACG GGGGCCACTT CCTGAGGATC 180 CTTCCGGATG GCACAGTGGA TGGGACAAGG GACAGGAGCG ACCAGCACAT TCAGCTGCAG 240 CTCAGTGCGG AAAGCGTGGG GGAGGTGTAT ATAAAGAGTA CCGAGACTGG CCAGTACTTG 300 GCCATGGACA CCGACGGGCT TTTATACGGC TCACAGACAC CAAATGAGGA ATGTTTGTTC 360 CTGGAAAGGC TGGAGGAGAA CGCTACTCCA GCTCCACATT ACAACACCTA TATATCCAAG 420 AAGCATGCAG AGAAGAATTG GTTTGTTGGC CTCAAGAAGA ATGGGAGCTG CAAACGCGGT 480 CCTCGGACTC ACTATGGCCA GAAAGCAATC TTGTTTCTCC CCCTGCCAGT CTCTTCTGAT 540

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、代表的な硫酸化多糖およびグリコサミ
ノグリカン糖鎖の例を示す。

【図２】図２は、代表的なN-型糖鎖の例を示す。

【図３】図３は、代表的なO-型糖鎖の例を示す。

【図４】図４は、各種FGF-1a類似タンパク質のSDS変性
電気泳動図を示す。

【図５】図５は、S/FGF-1a-II および大腸菌由来FGF-1a
のHUVEC に対するDNA合成促進活性を示す。

【図６】図６は、S/FGF-1a-II および大腸菌由来FGF-1a
の耐熱安定性、耐酸安定性および耐アルカリ安定性を示
す。

【図７】図７は、S/FGF-1a-II および大腸菌由来FGF-1a
のトリプシンに対する抵抗性を示す。

【図８】図８は、 N-FGF-6/1a-IVおよび大腸菌由来FGF-
1aのHUVEC に対するDNA 合成促進活性を示す。

【図９】図９は、S/FGF-1a-II のヘパリン親和性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｐ 25/28 25/28 35/00 35/00 43/00 １０７ 43/00 １０７Ｃ１２Ｐ 21/02 ＨＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者大田恵子茨城県つくば市梅園２−18−33 紫峰レジデンスＭ２−３ (72)発明者織田裕子茨城県つくば市二の宮１−12−17−203 (72)発明者宮川和子茨城県つくば市稲荷前17−12 沼尻アパート202 (72)発明者折笠訓子茨城県つくば市東新井22−10 大山ハイツ205 (72)発明者浅田知栄茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者小嶋哲人愛知県名古屋市昭和区折戸町５−16 審査官上條肇 (56)参考文献特開平２−227075（ＪＰ，Ａ) 米国特許4478746（ＵＳ，Ａ) 米国特許4280953（ＵＳ，Ａ) 国際公開91／16335（ＷＯ，Ａ１) 国際公開88／1647（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 C12N 15/11 - 15/61 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＰＣＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】糖鎖を共有結合させることにより高機能
化されたヘパリン結合性タンパク質であって、糖鎖が、
(1)硫酸化多糖、(2)グリコサミノグリカン、(3)硫酸化
多糖またはグリコサミノグリカンと組み合わされたＮ−
型糖鎖、(4)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカンと
組み合わされたＯ−型糖鎖および(5)それらの組合せか
らなる群より選択される、前記のヘパリン結合性タンパ
ク質。
【請求項２】糖鎖がヘパラン硫酸である、請求項１に
記載のヘパリン結合性タンパク質。
【請求項３】ヘパリン結合性タンパク質がＦＧＦファ
ミリーに属する因子またはその近縁の因子である、請求
項１または２に記載のヘパリン結合性タンパク質。
【請求項４】糖鎖の付加を受けることができるペプチ
ドを介して糖鎖が共有結合している、請求項１に記載の
ヘパリン結合性タンパク質。
【請求項５】糖鎖を共有結合させるヘパリン結合性タ
ンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタ
ンパク質である、請求項４に記載のヘパリン結合性タン
パク質。（ａ）配列番号１、３、５、１７、１９、２１、２３、
２５、２７または２９のいずれかのアミノ酸配列からな
るタンパク質。（ｂ）配列番号１、３、５、１７、１９、２１、２３、
２５、２７または２９のいずれかのアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく
は修飾されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦ活性を有
し、かつ糖鎖の付加を受けることができるタンパク質。
【請求項６】ヘパリン結合性タンパク質の２次構造に
おいてターンを形成している部位又は末端近傍に糖鎖が
結合しているか、あるいは、糖鎖付加によって３次元構
造が大きく変化しない部位に糖鎖が結合している、請求
項１に記載のヘパリン結合性タンパク質。
【請求項７】 (1)硫酸化多糖、(2)グリコサミノグリカ
ン、(3)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカンと組み
合わされたＮ−型糖鎖、(4)硫酸化多糖またはグリコサ
ミノグリカンと組み合わされたＯ−型糖鎖および(5)そ
れらの組合せからなる群より選択される糖鎖を共有結合
させることにより高機能化されたへパリン結合性タンパ
ク質の製造方法であって、以下の工程：（ａ）糖鎖の付加を受けることができるペプチドをコー
ドするcDNAとヘパリン結合性タンパク質をコードするcD
NAとを連結する工程、（ｂ）当該連結cDNAを発現ベクターに組み込む工程、（ｃ）当該発現ベクターを糖鎖付加経路を有する宿主細
胞に導入する工程、および（ｄ）当該宿主細胞において、糖鎖の付加を受けること
ができるペプチドを介して糖鎖が共有結合しているヘパ
リン結合性タンパク質を発現させる工程を含む、前記の方法。
【請求項８】糖鎖が硫酸化多糖またはグリコサミノグ
リカンであり、糖鎖の付加を受けることができるペプチ
ドがプロテオグリカンコアタンパク質またはその一部分
である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】糖鎖がヘパラン硫酸である、請求項７に
記載の方法。
【請求項１０】ヘパリン結合性タンパク質がＦＧＦフ
ァミリーに属する因子またはその近縁の因子である、請
求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】 (1)硫酸化多糖、(2)グリコサミノグリ
カン、(3)硫酸化多糖またはグリコサミノグリカンと組
み合わされたＮ−型糖鎖、(4)硫酸化多糖またはグリコ
サミノグリカンと組み合わされたＯ−型糖鎖および(5)
それらの組合せからなる群より選択される糖鎖を共有結
合させることにより高機能化されたへパリン結合性タン
パク質の製造方法であって、糖鎖を化学的結合法により
へパリン結合性タンパク質に結合させる工程を含む、前
記の方法。
【請求項１２】糖鎖がヘパラン硫酸である、請求項１
１に記載の方法。
【請求項１３】ヘパリン結合性タンパク質がＦＧＦフ
ァミリーに属する因子またはその近縁の因子である、請
求項１１に記載の方法。
【請求項１４】請求項１〜６のいずれかに記載のヘパ
リン結合性タンパク質を有効成分として含有する、医薬
組成物。