JP3295421B2 - 生物物質破砕の方法と装置 - Google Patents
生物物質破砕の方法と装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 クロスリファレンス 本出願は、1990年10月11日出願の米国特許出願07/59
5,429号の一部継続出願である1991年２月25日出願の米
国特許出願第07/660,650号の一部継続出願である。
5,429号の一部継続出願である1991年２月25日出願の米
国特許出願第07/660,650号の一部継続出願である。
背景 本発明は、一般的には破砕可能な生物物質に関係し、
特異的には生物物質、例えばDNAのような核酸、細胞、
澱粉、その他のものを破砕し、そしてその成分を回収す
るために非常に効果的な方法と装置に関係する。本発明
は、バイオテクノロジー、ゲノム研究及び関連するDNA
塩基配列決定の試みに対して世界的に高まりつつある興
味にとって非常に重要である。
特異的には生物物質、例えばDNAのような核酸、細胞、
澱粉、その他のものを破砕し、そしてその成分を回収す
るために非常に効果的な方法と装置に関係する。本発明
は、バイオテクノロジー、ゲノム研究及び関連するDNA
塩基配列決定の試みに対して世界的に高まりつつある興
味にとって非常に重要である。
これまで、核酸、たとえばデオキシリボ核酸（DNA）
の塩基配列決定に関心が持たれて来た。この関心のもと
は学問的、また商業的な観点から、核酸の一般的な性質
を解明し、更に特異的にはヒトゲノムと商業的に重要な
植物又は動物のゲノムの性質を解明し、新薬、新治療
法、そしてある場合には遺伝子に基づく疾病の予防など
に寄与しうるDNAの性質に対する興味に由来する。効果
的なDNAの塩基配列決定は、高分子量のDNAからランダム
DNA断片を作り出す能力に高度に依存する。従って、DNA
をランダムに破砕する方法の開発に多くの関心と努力が
注がれて来た。
の塩基配列決定に関心が持たれて来た。この関心のもと
は学問的、また商業的な観点から、核酸の一般的な性質
を解明し、更に特異的にはヒトゲノムと商業的に重要な
植物又は動物のゲノムの性質を解明し、新薬、新治療
法、そしてある場合には遺伝子に基づく疾病の予防など
に寄与しうるDNAの性質に対する興味に由来する。効果
的なDNAの塩基配列決定は、高分子量のDNAからランダム
DNA断片を作り出す能力に高度に依存する。従って、DNA
をランダムに破砕する方法の開発に多くの関心と努力が
注がれて来た。
一般的には、DNAの塩基配列決定は三種類の作業を含
む。第一に、塩基配列決定の対象となる個々のDNA断片
が作り出される。第二に、塩基配列決定反応が前記断片
に作用する。第三に、電気泳動とデータの収集が完了さ
れる。現時点での大規模なDNA塩基配列決定の成否は多
分に塩基配列決定法においての技術的革新に掛かってい
る。特に、その成否は、DNA塩基配列決定における全過
程の自動化の開発と実現に左右される。（C.R.Cantor,O
rchestrating the Human Genome Project Science 248,
49（1990）．現在、第二と第三の作業は既に自動化され
るか、またはされつつある。たとえば、L.Smithなど.,F
luorescence Detection,an Automated DNA Sequence An
alysis,Nature 321,674（1986）;J.M.Proberなど.,A Sy
stem for Rapid DNA Sequencing with Fluorescent Cha
in−Terminating Dide oxynucleotides,Science 238,33
6（1987）;J.Zimmermanなど.,Automated Sanger Dideox
y Sequencing Reaction Protocol.,FEBSLetters 233,43
2（1988）を参照のこと。しかし、よく「塩基配列決定
の作戦」とも呼ばれる第一の作業は改良も難しく自動化
も困難であることがわかっている。
む。第一に、塩基配列決定の対象となる個々のDNA断片
が作り出される。第二に、塩基配列決定反応が前記断片
に作用する。第三に、電気泳動とデータの収集が完了さ
れる。現時点での大規模なDNA塩基配列決定の成否は多
分に塩基配列決定法においての技術的革新に掛かってい
る。特に、その成否は、DNA塩基配列決定における全過
程の自動化の開発と実現に左右される。（C.R.Cantor,O
rchestrating the Human Genome Project Science 248,
49（1990）．現在、第二と第三の作業は既に自動化され
るか、またはされつつある。たとえば、L.Smithなど.,F
luorescence Detection,an Automated DNA Sequence An
alysis,Nature 321,674（1986）;J.M.Proberなど.,A Sy
stem for Rapid DNA Sequencing with Fluorescent Cha
in−Terminating Dide oxynucleotides,Science 238,33
6（1987）;J.Zimmermanなど.,Automated Sanger Dideox
y Sequencing Reaction Protocol.,FEBSLetters 233,43
2（1988）を参照のこと。しかし、よく「塩基配列決定
の作戦」とも呼ばれる第一の作業は改良も難しく自動化
も困難であることがわかっている。
大規模、且つ迅速なDNA塩基配列決定において理想と
される塩基配列決定作戦は、ランダムまたは「ショット
ガン」作戦である。この作戦は大きなDNA断片のランダ
ムサブクローン化とランダム断片塩基配列決定ライブラ
リーの作成を含む。すでに述べた様に、この作戦の成否
は大部分、作り出された断片のランダム度と断片化作業
にどのくらい時間がかかるかに依存する。現在まで、塩
基配列決定ライブラリー構築のためのDNA断片の生産に
主として３種類の手法が使用されてきた。第一法は、制
限酵素による部分的分解である。第二法はMn++の存在下
でDNAse I酵素によるDNAの断片化である。第三法は超音
波処理に基づく物理的なDNAの破砕法である。現在まで
の以上の諸方法の有意な使用にもかかわらず、これらの
手法は幾つかの欠点がある。
される塩基配列決定作戦は、ランダムまたは「ショット
ガン」作戦である。この作戦は大きなDNA断片のランダ
ムサブクローン化とランダム断片塩基配列決定ライブラ
リーの作成を含む。すでに述べた様に、この作戦の成否
は大部分、作り出された断片のランダム度と断片化作業
にどのくらい時間がかかるかに依存する。現在まで、塩
基配列決定ライブラリー構築のためのDNA断片の生産に
主として３種類の手法が使用されてきた。第一法は、制
限酵素による部分的分解である。第二法はMn++の存在下
でDNAse I酵素によるDNAの断片化である。第三法は超音
波処理に基づく物理的なDNAの破砕法である。現在まで
の以上の諸方法の有意な使用にもかかわらず、これらの
手法は幾つかの欠点がある。
第一法、「制限酵素の使用」の大きな欠点は、DNA上
の制限酵素作用点がランダムに配分されていない為、作
り出されたクローバンクにも所望するランダム性がなく
なる事である。この問題に対応するには、塩基配列決定
バンクの調製にあたって多数の異なった制限酵素の使用
が必要であり、手間と時間がかかる。この手法は多くの
よく制限された制限酵素反応を必要とし、異なる酵素と
DNAの標本を用いての再現が困難である。
の制限酵素作用点がランダムに配分されていない為、作
り出されたクローバンクにも所望するランダム性がなく
なる事である。この問題に対応するには、塩基配列決定
バンクの調製にあたって多数の異なった制限酵素の使用
が必要であり、手間と時間がかかる。この手法は多くの
よく制限された制限酵素反応を必要とし、異なる酵素と
DNAの標本を用いての再現が困難である。
DNAse Iの使用に基づく第二法は、DNAse Iによる切断
にほとんどDNA配列特異性が存在しないために、第一法
の難点を部分的に克服している。しかしながら、ランダ
ム断片作成へのDNAse Iの適用は第一法よりも更に再現
が難しく、多数の試験反応を必要とする。これは無駄で
あり、そして多量の出発材料を必要とする。
にほとんどDNA配列特異性が存在しないために、第一法
の難点を部分的に克服している。しかしながら、ランダ
ム断片作成へのDNAse Iの適用は第一法よりも更に再現
が難しく、多数の試験反応を必要とする。これは無駄で
あり、そして多量の出発材料を必要とする。
第三法すなわち高波処理は、上記の二つの酵素法のい
ずれよりも再現と制御が容易な点で利点をもっている。
しかし、この方法の適用は、元のDNA分子の極小部分の
みが必要なサイズに断片化される為膨大な出発材料を必
要とする。音波処理法はまた、ソーニケーターの検度に
手間がかかり、以後の処理において厳密な時間の制御を
必要とする。更に音波処理はATに富む配列をより選別的
に剪断し、本当のランダム塩基配列決定ライブラリーを
作成しないことが既に示されている。P.L.Deininger,Ra
ndom Subcloning of Sonicated DNA:Application to Sh
otgun DNA Sequence Analysis,Analytical Biochemistr
y 129,216（1983）。この難点は、剪断されるDNAが長い
ATとGCに富んだ部分を含む時、顕著になる。
ずれよりも再現と制御が容易な点で利点をもっている。
しかし、この方法の適用は、元のDNA分子の極小部分の
みが必要なサイズに断片化される為膨大な出発材料を必
要とする。音波処理法はまた、ソーニケーターの検度に
手間がかかり、以後の処理において厳密な時間の制御を
必要とする。更に音波処理はATに富む配列をより選別的
に剪断し、本当のランダム塩基配列決定ライブラリーを
作成しないことが既に示されている。P.L.Deininger,Ra
ndom Subcloning of Sonicated DNA:Application to Sh
otgun DNA Sequence Analysis,Analytical Biochemistr
y 129,216（1983）。この難点は、剪断されるDNAが長い
ATとGCに富んだ部分を含む時、顕著になる。
その他の数えきれない分野においてバイオテクノロジ
ーに対する関心と研究が近年、劇的に増加している。こ
れらの研究の多くが細胞に内在する生物物質の分離と回
収を必要とする。したがって、これらの物質を入手する
為には、普通、細胞破砕による生物物質の放出を必要と
する。過去において、この破砕は音波処理、液体窒素使
用による極低温下での研摩材による摩砕、高速均質化、
ポターホモジナイザーによる剪断等の諸方法で行なわれ
て来た。これらの方法は広範囲の検度と制御、再現性が
低く難しい操作作業、その他の難点をもたらす。
ーに対する関心と研究が近年、劇的に増加している。こ
れらの研究の多くが細胞に内在する生物物質の分離と回
収を必要とする。したがって、これらの物質を入手する
為には、普通、細胞破砕による生物物質の放出を必要と
する。過去において、この破砕は音波処理、液体窒素使
用による極低温下での研摩材による摩砕、高速均質化、
ポターホモジナイザーによる剪断等の諸方法で行なわれ
て来た。これらの方法は広範囲の検度と制御、再現性が
低く難しい操作作業、その他の難点をもたらす。
以上の論点からみて、生物物質の処理と回収における
改良の必要性は明白である。例えば、DNAサンプルからD
NA断片を作り出し、そして、細胞内の物質を回収する為
に細胞を破砕するための改良された手法が必要とされて
いる。サブクローンを作り出すのに非常に望ましい手法
は、ランダムDNA断片化を作り出し、すなわち、剪断が
塩基配列に依存しない。更に、何時でも、どんなDNAを
使用してもそれは再現されるべきである。この目標達成
には、剪断は定常的に達成されるべきであり、すなわち
特定の大きさへの剪断は剪断要素が加えられる時間に依
存すべきではない。また、そのような手法は500から200
0塩基対の範囲のDNA断片の生成を可能とする。その手法
は効率良くなければならず、処理されたDNAの大部分が
望ましい大きさの断片に転換されるべきである。さら
に、その手法は大量及び小量のDNAのどちらにも適用で
き、特に時間がかからずに簡単に操作出来ることが大切
である。加えて、例えば、細胞内の生物物質を回収する
為に高能率で便利な細胞破砕方法が必要とされている。
そのような手法は破砕操作中に起きる生物物質への害を
最小限度に食い止めることが望ましい。本出願者等の発
明はこれらの必要性に対処している。
改良の必要性は明白である。例えば、DNAサンプルからD
NA断片を作り出し、そして、細胞内の物質を回収する為
に細胞を破砕するための改良された手法が必要とされて
いる。サブクローンを作り出すのに非常に望ましい手法
は、ランダムDNA断片化を作り出し、すなわち、剪断が
塩基配列に依存しない。更に、何時でも、どんなDNAを
使用してもそれは再現されるべきである。この目標達成
には、剪断は定常的に達成されるべきであり、すなわち
特定の大きさへの剪断は剪断要素が加えられる時間に依
存すべきではない。また、そのような手法は500から200
0塩基対の範囲のDNA断片の生成を可能とする。その手法
は効率良くなければならず、処理されたDNAの大部分が
望ましい大きさの断片に転換されるべきである。さら
に、その手法は大量及び小量のDNAのどちらにも適用で
き、特に時間がかからずに簡単に操作出来ることが大切
である。加えて、例えば、細胞内の生物物質を回収する
為に高能率で便利な細胞破砕方法が必要とされている。
そのような手法は破砕操作中に起きる生物物質への害を
最小限度に食い止めることが望ましい。本出願者等の発
明はこれらの必要性に対処している。
発明の要約 極く短くまとめれば、本発明の好ましい態様の一つ
は、生物物質を断片化してその成分を分離、回収する工
程に改良をもたらす。この工程で、好ましい方法は生物
物質を含んだ液体を霧状化することによって以上の様な
断片化を行なう段階を含んで成る。
は、生物物質を断片化してその成分を分離、回収する工
程に改良をもたらす。この工程で、好ましい方法は生物
物質を含んだ液体を霧状化することによって以上の様な
断片化を行なう段階を含んで成る。
本発明の他の好ましい態様は、分離されたDNAを断片
化する工程に関する。この工程は、DNAを含む溶液を霧
状化することによりDNA断片を生成する段階を含んで成
る。
化する工程に関する。この工程は、DNAを含む溶液を霧
状化することによりDNA断片を生成する段階を含んで成
る。
更に他の好ましい態様は、（ｉ）DNAを含む溶液を霧
状化してDNA断片を作り出し、そして（ii）DNA断片の分
析によりDNA鎖の塩基配列を決定する段階を含んで成るD
NAの鎖の塩基配列決定ための方法を包含する。
状化してDNA断片を作り出し、そして（ii）DNA断片の分
析によりDNA鎖の塩基配列を決定する段階を含んで成るD
NAの鎖の塩基配列決定ための方法を包含する。
更にこの発明の好ましい態様は、液体導入部と液体排
出部を備えた霧状化装置の改良に関する。本発明に応じ
て、この装置はまた液体を排出部から導入部に戻すため
の手段を含んで成る。
出部を備えた霧状化装置の改良に関する。本発明に応じ
て、この装置はまた液体を排出部から導入部に戻すため
の手段を含んで成る。
本発明を制限するものではないが、液滴発生の過程に
おいて、霧状化される液体に懸濁されるDNA又はその他
の生物物質は、液体表面と液滴との間に起こる瞬間的な
流れを通して形成されつつあるバブルの表面に強制的に
分配されると思われる。この流れはDNA分子又はその他
の生物物質を、機械的に小断片に分解するのに充分な剪
断力を前記懸濁されたDNA分子又は他の生物物質に付与
すると思われる。更に、DNA又その他の剪断可能な高分
子の霧状化は、繰り返されるバブル形成の過程において
個々の分子をほぼ半分の大きさに破壊し、やがて加えら
れた力が更にそれを分解するのに不十分な程、分子の大
きさが小さくなる時まで続くと思われる。以上の結果と
して、DNA又はその他の高分子は、定常状態で剪断さ
れ、破砕された分子の最終的なサイズは、加えられた力
の大きさのみ依存する。更に、分子の破砕に必要な最小
の剪断力は、DNAの分子量が増えると共に減少し、巨大
分子の迅速な剪断をもたらし、この手法を効果的なもの
とする。作り出された剪断力の大きさは、理論的に、細
管における液体の流れを示す公式により記載される圧力
低下に形式的に比例する。従って、この力は、加えられ
たガスの圧力と液体の粘度に正比例し、そして液滴の大
きさに反比例する。したがって、液滴がより小さいほ
ど、粘度がより高まり、そして加えられるガスの圧力が
より大きくなるほど、分子又はその他の生物物質に加え
られる剪断力が大きくなる。
おいて、霧状化される液体に懸濁されるDNA又はその他
の生物物質は、液体表面と液滴との間に起こる瞬間的な
流れを通して形成されつつあるバブルの表面に強制的に
分配されると思われる。この流れはDNA分子又はその他
の生物物質を、機械的に小断片に分解するのに充分な剪
断力を前記懸濁されたDNA分子又は他の生物物質に付与
すると思われる。更に、DNA又その他の剪断可能な高分
子の霧状化は、繰り返されるバブル形成の過程において
個々の分子をほぼ半分の大きさに破壊し、やがて加えら
れた力が更にそれを分解するのに不十分な程、分子の大
きさが小さくなる時まで続くと思われる。以上の結果と
して、DNA又はその他の高分子は、定常状態で剪断さ
れ、破砕された分子の最終的なサイズは、加えられた力
の大きさのみ依存する。更に、分子の破砕に必要な最小
の剪断力は、DNAの分子量が増えると共に減少し、巨大
分子の迅速な剪断をもたらし、この手法を効果的なもの
とする。作り出された剪断力の大きさは、理論的に、細
管における液体の流れを示す公式により記載される圧力
低下に形式的に比例する。従って、この力は、加えられ
たガスの圧力と液体の粘度に正比例し、そして液滴の大
きさに反比例する。したがって、液滴がより小さいほ
ど、粘度がより高まり、そして加えられるガスの圧力が
より大きくなるほど、分子又はその他の生物物質に加え
られる剪断力が大きくなる。
本発明の目的の一つは、生物物質を処理しそして回収
するための改良された方法を提供することにある。実例
はDNAの断片化と塩基配列決定の改良された方法、細胞
を剪断しそしてその中の生物物質を回収する改良された
方法、及び澱粉のような生物高分子を剪断する改良され
た法を包含する。
するための改良された方法を提供することにある。実例
はDNAの断片化と塩基配列決定の改良された方法、細胞
を剪断しそしてその中の生物物質を回収する改良された
方法、及び澱粉のような生物高分子を剪断する改良され
た法を包含する。
本発明の他の目的は、出願者達の好ましい方法におい
て有利に使用出来る、液体の霧状化を繰り返せる装置の
提供である。
て有利に使用出来る、液体の霧状化を繰り返せる装置の
提供である。
他の追加目的と本発明の利点は、以下に述べられる説
明と後記される請求の範囲を検討することによって明ら
かにされるであろう。
明と後記される請求の範囲を検討することによって明ら
かにされるであろう。
図面の簡単な説明 図１は、異なる圧力下における霧状化中のDNAのサイ
ズの平均値対時間のグラフである。
ズの平均値対時間のグラフである。
図２は、圧力とDNA使用量を変化させた霧状化中のDNA
のサイズの平均値対時間のグラフである。
のサイズの平均値対時間のグラフである。
図３は、霧状化中、グリセロール濃度を変化させた場
合のDNAのサイズの平均値対時間のグラフである。
合のDNAのサイズの平均値対時間のグラフである。
図４は、異なる圧力下における霧状化中、DNAのサイ
ズの平均値対グリセロールの割合（％）のグラフであ
る。
ズの平均値対グリセロールの割合（％）のグラフであ
る。
図５は、DNA試料（25/ug/ml DNA、25％Glycerol）を
異なる圧力下において霧状化した場合の、DNAのサイズ
の平均値対時間のグラフである。
異なる圧力下において霧状化した場合の、DNAのサイズ
の平均値対時間のグラフである。
図６は、25％グリセロールを用いての霧状化中のDNA
のサイズの平均値及び作業効率対時間のグラフである。
のサイズの平均値及び作業効率対時間のグラフである。
図7Aは、この発明に基づいて改良された霧状化装置の
スケッチである。
スケッチである。
図7Bは、この発明に基づいて改良された霧状化装置の
断面図である。
断面図である。
図7Cは、図7Bに図解した装置の中枢部の拡大断面図で
ある。
ある。
図８は、クラマイドモナス レインハードチ（Chlamy
domonas reinhardtiiを試料とした霧状化中、波長260,2
80,と652nmにおける上澄みの吸光度（OD単位を用いる）
対霧状化の時間のグラフである。
domonas reinhardtiiを試料とした霧状化中、波長260,2
80,と652nmにおける上澄みの吸光度（OD単位を用いる）
対霧状化の時間のグラフである。
図９は、アスパラガル細胞における破砕された細胞の
割合（％）対霧状化の時間のグラフである。
割合（％）対霧状化の時間のグラフである。
図10は、大豆の培養細胞をサンプルとしたポターホモ
ジナイザー処理（１ストロークと６ストローク）と霧状
化処理（１分間）した場合の、波長260,280,と652nmに
おける上澄みの吸光度（OD単位をもちいる）の比較のグ
ラフである。
ジナイザー処理（１ストロークと６ストローク）と霧状
化処理（１分間）した場合の、波長260,280,と652nmに
おける上澄みの吸光度（OD単位をもちいる）の比較のグ
ラフである。
図11は、枝状高分子、スターチアズールを試料とした
場合の波長595nmにおける吸光度（OD単位を用いる）対
霧状化の時間のグラフである。
場合の波長595nmにおける吸光度（OD単位を用いる）対
霧状化の時間のグラフである。
図12は、窒素とヘリウムを用い、異なる圧力の下で酵
母細胞を処理した場合の、波長595nmにおける上澄みの
吸光度対霧状化の回数のグラフである。
母細胞を処理した場合の、波長595nmにおける上澄みの
吸光度対霧状化の回数のグラフである。
好ましい態様の説明 本発明の原理の理解を促進するために、いくつかの態
様に触れ、その解説の為に特定の用語を使用する。しか
し、発明に関連する当業者が普通考えるであろう発明原
理のより進んだ応用、改造や変更は、本発明の範囲を限
定するものではないことが理解されるであろう。
様に触れ、その解説の為に特定の用語を使用する。しか
し、発明に関連する当業者が普通考えるであろう発明原
理のより進んだ応用、改造や変更は、本発明の範囲を限
定するものではないことが理解されるであろう。
上記の様に、本発明の好ましい態様の一つは、生物物
質（すなわち、変性されている又は変性されていない生
物学的に存在する物質）の破砕とその成分の分離と回収
の工程の改良に関連する。この生物物質とは、細胞もし
くは細胞内画分、たとえば蛋白質、DNAやスターチポリ
マーの様な剪断可能な高分子、染色体、核、葉緑体、ミ
トコンドリア等のオルガネラを包含する。
質（すなわち、変性されている又は変性されていない生
物学的に存在する物質）の破砕とその成分の分離と回収
の工程の改良に関連する。この生物物質とは、細胞もし
くは細胞内画分、たとえば蛋白質、DNAやスターチポリ
マーの様な剪断可能な高分子、染色体、核、葉緑体、ミ
トコンドリア等のオルガネラを包含する。
断片化されるべき剪断可能な物質は、破砕の為に適切
な液体、典型的には水性媒体に導入され、そして生物物
質を剪断する為に、この液体が霧状化される。バッチで
回収して霧状化しなおすか、又は連続霧状化と再循環工
程で、前記液体が複数回霧状化されることが望ましい。
な液体、典型的には水性媒体に導入され、そして生物物
質を剪断する為に、この液体が霧状化される。バッチで
回収して霧状化しなおすか、又は連続霧状化と再循環工
程で、前記液体が複数回霧状化されることが望ましい。
既に述べられた様に、発明の好ましい形式及び態様
は、DNAを含む液体の霧状化段階を含んで成る、分離さ
れたDNAの断片化法に関する。本出願者達の研究は、霧
状化剪断法を用いたDNAの断片作成がこの分野において
現在までに強く望まれていた多くの重要な利点をもたら
すことを示した。例えば、この方法がDNAの高度のラン
ダム断片化をもたらすことが立証された。この方法は再
現が容易であり、定常的に剪断を達成する。実際に、現
時点までに、発明された方法を用いて、500塩基対（b
p）から2000bpの範囲の特定のサイズのDNA断片を、30％
以上（50％から出願者の実験では70％にも達する）の効
率で作り出すことが可能となった。更に、ガス圧を上
げ、液体の粘度を高め、更に下記の諸方法によって、こ
のサイズの範囲は500bp以下迄広げられる。更に、DNAの
断片化やその他の破砕と剪断工程において、霧状化法
は、音波処理法の様に大量の熱を発生させず、むしろ、
霧滴の蒸発による固有の又は“ビルトイン”冷却機能を
持つ。
は、DNAを含む液体の霧状化段階を含んで成る、分離さ
れたDNAの断片化法に関する。本出願者達の研究は、霧
状化剪断法を用いたDNAの断片作成がこの分野において
現在までに強く望まれていた多くの重要な利点をもたら
すことを示した。例えば、この方法がDNAの高度のラン
ダム断片化をもたらすことが立証された。この方法は再
現が容易であり、定常的に剪断を達成する。実際に、現
時点までに、発明された方法を用いて、500塩基対（b
p）から2000bpの範囲の特定のサイズのDNA断片を、30％
以上（50％から出願者の実験では70％にも達する）の効
率で作り出すことが可能となった。更に、ガス圧を上
げ、液体の粘度を高め、更に下記の諸方法によって、こ
のサイズの範囲は500bp以下迄広げられる。更に、DNAの
断片化やその他の破砕と剪断工程において、霧状化法
は、音波処理法の様に大量の熱を発生させず、むしろ、
霧滴の蒸発による固有の又は“ビルトイン”冷却機能を
持つ。
霧状化という用語が液体を細かい霧に変えるという意
味を含むことは、当業者において良く知られている。好
ましくは、そのような霧状化が大量の液体から均一のサ
イズの少液滴を良く制御して作り出すことである。この
霧状化は、現在よく知られ、市販されている多くのネビ
ュライザーを含む適当な方法で達成出来る。例えば、代
表的な実例は出願者等がInhalation Plastic,Inc.,Nile
s.Illinoisから入手出来るAEROMIST空気圧ネビュライザ
ーを使って行なわれた。AEROMISTネビュライザーの開放
口は円錐形の圧力弁で部分的に閉じられ、この弁の為に
発生した霧が再循環して溜めにもどり、液体の大量なロ
スを防げる。この方法における液体の回収率はほぼ80な
いし90％である。良く知られているように、霧状化にお
いては、幾つかの適当なガスを使って圧力を加えうる
が、現在迄好まれてきた霧状化用のガスは核酸に対して
化学的に不活性であって欲しい。この観点から見て、本
出願者達の現在迄の研究に基づけば、一番好ましいガス
は窒素であるが、ヘリウムがアルゴンなど他の不活性ガ
スも有効に利用出来る。窒素を用いた実験では、標準の
窒素タンクガス調整器でガスの圧力を調節した。
味を含むことは、当業者において良く知られている。好
ましくは、そのような霧状化が大量の液体から均一のサ
イズの少液滴を良く制御して作り出すことである。この
霧状化は、現在よく知られ、市販されている多くのネビ
ュライザーを含む適当な方法で達成出来る。例えば、代
表的な実例は出願者等がInhalation Plastic,Inc.,Nile
s.Illinoisから入手出来るAEROMIST空気圧ネビュライザ
ーを使って行なわれた。AEROMISTネビュライザーの開放
口は円錐形の圧力弁で部分的に閉じられ、この弁の為に
発生した霧が再循環して溜めにもどり、液体の大量なロ
スを防げる。この方法における液体の回収率はほぼ80な
いし90％である。良く知られているように、霧状化にお
いては、幾つかの適当なガスを使って圧力を加えうる
が、現在迄好まれてきた霧状化用のガスは核酸に対して
化学的に不活性であって欲しい。この観点から見て、本
出願者達の現在迄の研究に基づけば、一番好ましいガス
は窒素であるが、ヘリウムがアルゴンなど他の不活性ガ
スも有効に利用出来る。窒素を用いた実験では、標準の
窒素タンクガス調整器でガスの圧力を調節した。
出発材料となる単離DNAについて言えば、どんな原料
から得られたDNAでも本出願人達の発明で扱える。ここ
で使用される「単離DNA」の意味は、好ましい方法でのD
NAの回収に有意な問題を起こす。有意な量の他の物質を
含まないDNAを包含する。精製された形でのこのようなD
NAは商業的な供給者から普通に入手出来、または、当業
界において良く知られそして良く使用されている方法に
よって調製出来る。本出願者の研究における代表的なDN
Aは、lamdaとpuc 19DNA、クラマイドモナス レインハ
ードチ野生株137cから分離した葉緑体DNAを包含する。
さらに例示的なDNAは、大腸菌の高分子量染色体DNAであ
る。しかしながら、上記のごとく、当業者により認めら
れるであろうようにどんな原料からのDNAでも適切であ
る。
から得られたDNAでも本出願人達の発明で扱える。ここ
で使用される「単離DNA」の意味は、好ましい方法でのD
NAの回収に有意な問題を起こす。有意な量の他の物質を
含まないDNAを包含する。精製された形でのこのようなD
NAは商業的な供給者から普通に入手出来、または、当業
界において良く知られそして良く使用されている方法に
よって調製出来る。本出願者の研究における代表的なDN
Aは、lamdaとpuc 19DNA、クラマイドモナス レインハ
ードチ野生株137cから分離した葉緑体DNAを包含する。
さらに例示的なDNAは、大腸菌の高分子量染色体DNAであ
る。しかしながら、上記のごとく、当業者により認めら
れるであろうようにどんな原料からのDNAでも適切であ
る。
同様に、有意の分解を伴わないでDNAを懸濁できる適
切な液体は、本発明にとって好適である。しかしなが
ら、典型的に液体は、水が他の添加物を加えた水であ
る。
切な液体は、本発明にとって好適である。しかしなが
ら、典型的に液体は、水が他の添加物を加えた水であ
る。
本発明の他の観点では、制御されたDNAの剪断は、霧
状化段階におけるガス圧と媒体の粘度を変化させて達成
された。例えば、液体に適切な薬剤を混入することでそ
の粘度を高め、実施例６と７で示すように作り出された
DNA断片のサイズと剪断過程の効率に劇的な影響を与え
た。この点について言えば、水性媒体における望ましい
粘度上昇剤は適切なアルコール、たとえばグリセロール
及びエチレングライコル、並びに適当な糖分、例えばス
ークロースを包含する。更に、本発明の方法によって得
られたDNA断片のサイズはガス圧の制御によって、確実
に制御された。なぜならばDNA断片のサイズは霧状化段
階に用いられるガス圧に反比例するからである。
状化段階におけるガス圧と媒体の粘度を変化させて達成
された。例えば、液体に適切な薬剤を混入することでそ
の粘度を高め、実施例６と７で示すように作り出された
DNA断片のサイズと剪断過程の効率に劇的な影響を与え
た。この点について言えば、水性媒体における望ましい
粘度上昇剤は適切なアルコール、たとえばグリセロール
及びエチレングライコル、並びに適当な糖分、例えばス
ークロースを包含する。更に、本発明の方法によって得
られたDNA断片のサイズはガス圧の制御によって、確実
に制御された。なぜならばDNA断片のサイズは霧状化段
階に用いられるガス圧に反比例するからである。
もう１つの観点においては、50ug/ml以上の出発DNA濃
度を使用することによる自己保護現象を利用して、（実
施例４と図２を参照）、DNA断片のサイズは霧状化によ
ってより高められ得る。更に、他の適当な高分子、例え
ば澱粉を出発DNAに加えることによって、同様な成果を
あげ、DNAを保護してより大きいDNA断片を得ることが出
来る。
度を使用することによる自己保護現象を利用して、（実
施例４と図２を参照）、DNA断片のサイズは霧状化によ
ってより高められ得る。更に、他の適当な高分子、例え
ば澱粉を出発DNAに加えることによって、同様な成果を
あげ、DNAを保護してより大きいDNA断片を得ることが出
来る。
霧状化段階の後DNA断片は、エタノール沈殿の様な適
切な方法で回収される。更に下記の実施例８で説明され
る様に、DNA断片は一般的な方法で処理されそしてクロ
ーン化され、塩基配列決定され、そしてデータがデータ
ベースに適当に導入される。このようにして得られたデ
ータの分析により、これらの断片の由来するDNA鎖の塩
基配列が求められる。
切な方法で回収される。更に下記の実施例８で説明され
る様に、DNA断片は一般的な方法で処理されそしてクロ
ーン化され、塩基配列決定され、そしてデータがデータ
ベースに適当に導入される。このようにして得られたデ
ータの分析により、これらの断片の由来するDNA鎖の塩
基配列が求められる。
既に述べられているように、生存細胞は、当業者が、
通常その成分を回収するために破砕する生物物質の一部
を代表する。この細胞とは、植物細胞と動物細胞、そし
て原核生物細胞を含む。本発明によれば、細胞は水性緩
衝液のような適切な媒体に懸濁される。この媒体が霧状
化されて細胞が剪断もしくは破砕されて、細胞内の成分
や画分、例えば、染色体、DNA、蛋白質や核、ミトコン
ドリア、葉緑体の様なオルガネラ等が放出される。例え
ば、本出願者は緑藻のクロレラ（Chlorella）やクラヌ
イドモナス レインハードチ、アスパラガス、大豆、酵
母等の細胞の破砕を立証し、通常の方法で分離回収出来
る蛋白質と核酸の画分の放出を確認した。もう一つの例
として、本出願者達はまた、E.コリ細胞を適当な（温和
な）条件下で霧状化してプラスミドDNAのみを媒体中に
放出させた。この方法はプラスミドDNAの迅速、かつ効
率的な分離を可能とする。本出願者達はクラマイドモナ
ス レインハードチ細胞を適当に霧状化して、細胞周辺
部分からのみ蛋白質（例えば酵素）を放出させた。こう
して放出された酵素は、活性を保っており、従ってこの
やり方は、生物工学により生態細胞の細胞周辺空間に到
着するようにされた蛋白質の効果的、かつ特異的な回収
を可能とする。更に、本出願者達は、クロマイドモナス
レインハードチの葉緑体のカルボニックアンヒドラー
ゼを、音波処理、Yeda Press処理、そしてこの発明の霧
状化法で処理により放出し、回収された酵素の活性を調
べたところ、活性は三つの方法の間でほとんど変わりが
なく、この方法で蛋白質を壊さずに回収出来ることがわ
かった。
通常その成分を回収するために破砕する生物物質の一部
を代表する。この細胞とは、植物細胞と動物細胞、そし
て原核生物細胞を含む。本発明によれば、細胞は水性緩
衝液のような適切な媒体に懸濁される。この媒体が霧状
化されて細胞が剪断もしくは破砕されて、細胞内の成分
や画分、例えば、染色体、DNA、蛋白質や核、ミトコン
ドリア、葉緑体の様なオルガネラ等が放出される。例え
ば、本出願者は緑藻のクロレラ（Chlorella）やクラヌ
イドモナス レインハードチ、アスパラガス、大豆、酵
母等の細胞の破砕を立証し、通常の方法で分離回収出来
る蛋白質と核酸の画分の放出を確認した。もう一つの例
として、本出願者達はまた、E.コリ細胞を適当な（温和
な）条件下で霧状化してプラスミドDNAのみを媒体中に
放出させた。この方法はプラスミドDNAの迅速、かつ効
率的な分離を可能とする。本出願者達はクラマイドモナ
ス レインハードチ細胞を適当に霧状化して、細胞周辺
部分からのみ蛋白質（例えば酵素）を放出させた。こう
して放出された酵素は、活性を保っており、従ってこの
やり方は、生物工学により生態細胞の細胞周辺空間に到
着するようにされた蛋白質の効果的、かつ特異的な回収
を可能とする。更に、本出願者達は、クロマイドモナス
レインハードチの葉緑体のカルボニックアンヒドラー
ゼを、音波処理、Yeda Press処理、そしてこの発明の霧
状化法で処理により放出し、回収された酵素の活性を調
べたところ、活性は三つの方法の間でほとんど変わりが
なく、この方法で蛋白質を壊さずに回収出来ることがわ
かった。
一般的には、細胞も剪断する場合、分離、回収される
構成成分や副画分に実質的な損傷を与えない為に、霧状
化は適当に制御される。この観点から、使用される霧状
化の圧力は、剪断される細胞の種類と支持液体媒体の粘
度によって変えられるであろう。
構成成分や副画分に実質的な損傷を与えない為に、霧状
化は適当に制御される。この観点から、使用される霧状
化の圧力は、剪断される細胞の種類と支持液体媒体の粘
度によって変えられるであろう。
上記で述べたごとく、本発明の他の好ましい態様は導
入部と排出部を備えた、液体を霧状化する装置の改良に
関する。本発明によれば、この装置は霧状化された液体
をネビュライザーの排出部から導入部まで戻すための手
段を含んで成る。
入部と排出部を備えた、液体を霧状化する装置の改良に
関する。本発明によれば、この装置は霧状化された液体
をネビュライザーの排出部から導入部まで戻すための手
段を含んで成る。
現在入手可能な市販のネビュライザーを使用した場
合、霧状化によるDNAの剪断の効率及び効果に対して有
意な制限がある。例えば、既存の装置にはそのような機
能が備わってないので、霧状化された液体を捕捉してネ
ビュライザーのなかへ再循環させることが難しい。更
に、DNA断片のサイズの分布と過程の効率は、液体の粘
度やガス圧を変えことによって変えられるのみならず、
霧状化によって得られる液滴のサイズを変えられる他の
手段によっても変えられる。とくに、既知の装置には霧
状化ゾーンに液体を供給する細管チヤンネルと、液体の
放出口から一定の距離に置かれ放出口から出てくる液滴
をさらに微細な液滴にかえる普通半球形の障壁部材が備
わっている。細管チヤンネルのサイズと障壁部材の形状
と相対的な位置とは、霧状化からの液滴のサイズに影響
する。しかしながら、既存の装置は、細管チヤンネルの
サイズを変え、１つの障壁部材を異なった形状の他の障
壁部材を相互交換し、又は放出口と障壁部材間の距離を
変化させることが出来ない。本出願者達の発明した装置
は、液滴のサイズを変化させ、そして従ってDNA剪断工
程の効果と効率を制御できるこれらの特徴を組み込んで
いる。
合、霧状化によるDNAの剪断の効率及び効果に対して有
意な制限がある。例えば、既存の装置にはそのような機
能が備わってないので、霧状化された液体を捕捉してネ
ビュライザーのなかへ再循環させることが難しい。更
に、DNA断片のサイズの分布と過程の効率は、液体の粘
度やガス圧を変えことによって変えられるのみならず、
霧状化によって得られる液滴のサイズを変えられる他の
手段によっても変えられる。とくに、既知の装置には霧
状化ゾーンに液体を供給する細管チヤンネルと、液体の
放出口から一定の距離に置かれ放出口から出てくる液滴
をさらに微細な液滴にかえる普通半球形の障壁部材が備
わっている。細管チヤンネルのサイズと障壁部材の形状
と相対的な位置とは、霧状化からの液滴のサイズに影響
する。しかしながら、既存の装置は、細管チヤンネルの
サイズを変え、１つの障壁部材を異なった形状の他の障
壁部材を相互交換し、又は放出口と障壁部材間の距離を
変化させることが出来ない。本出願者達の発明した装置
は、液滴のサイズを変化させ、そして従ってDNA剪断工
程の効果と効率を制御できるこれらの特徴を組み込んで
いる。
特に、剪断されたDNAのサイズと霧状化工程の効率を
改良するこれらの発明特徴が組み込まれている改良され
たネビュライザー11の略図が図7Aに示される。特に、霧
状化装置11は、次の特徴を除けば従来通りであってもよ
い。第一にネビュライザー11の溜め12の形は、極く小量
の液体13の霧状化を可能とする円錐形が望ましい。更
に、溜め12は、気密的に密封され、そして霧状化された
霧を再循環させるための戻り管14が備えられることが望
ましい。これは、DNAを含んだ液体13を長時間効率的に
霧状化することを可能とする。更に、本発明のネビュラ
イザー11は、共に調節できるガス圧調節弁15及びガス排
出弁16とを備える。これらは溜め12内のガス圧を一定に
保つことを可能とする。
改良するこれらの発明特徴が組み込まれている改良され
たネビュライザー11の略図が図7Aに示される。特に、霧
状化装置11は、次の特徴を除けば従来通りであってもよ
い。第一にネビュライザー11の溜め12の形は、極く小量
の液体13の霧状化を可能とする円錐形が望ましい。更
に、溜め12は、気密的に密封され、そして霧状化された
霧を再循環させるための戻り管14が備えられることが望
ましい。これは、DNAを含んだ液体13を長時間効率的に
霧状化することを可能とする。更に、本発明のネビュラ
イザー11は、共に調節できるガス圧調節弁15及びガス排
出弁16とを備える。これらは溜め12内のガス圧を一定に
保つことを可能とする。
好ましいネビュライザー装置11は障壁部材17と排出ノ
ズル18との間の距離を調節する手段を備えている。これ
は支持体19に障壁部材17に対応するねじ溝をつけ、障壁
部材17が反対面20に捩り込み捩戻し出来るようにして達
成した。勿論、この機能は他のいかなる適当な方法でも
達成出来る。加えて好ましい装置11は、障壁部材17をサ
イズや形の異なる他の障壁部材に交換できる手段を備え
ている。これは表面20から支持体19を捩取り去り、新し
い障壁部材の付いた支持体を捩込んで達成される。別法
では、支持体を恒久的に表面20に接続し、障壁部材の調
節と取り外しを可能とする。捩かその他適当な手段で支
持体の外の末端に接続出来る。これらの方法は、剪断法
の応用の各種に最適の距離と障壁部材の形の選択を可能
とする。更に好ましいネビュライザー装置11は、霧状化
ゾーンに液体を供給する細管チヤンネルの直径を調節す
る機能を備えている。例えば、これは装置11に垂直に調
節できるカップ21を加えることで達成される。ネビュラ
イザーによって作り出される液滴のサイズを更に制御す
ることが可能になる。以上述べたごとく、ここで述べら
れた好ましい特徴を除いては、ネビュライザーは通常の
構造を持っても良い。
ズル18との間の距離を調節する手段を備えている。これ
は支持体19に障壁部材17に対応するねじ溝をつけ、障壁
部材17が反対面20に捩り込み捩戻し出来るようにして達
成した。勿論、この機能は他のいかなる適当な方法でも
達成出来る。加えて好ましい装置11は、障壁部材17をサ
イズや形の異なる他の障壁部材に交換できる手段を備え
ている。これは表面20から支持体19を捩取り去り、新し
い障壁部材の付いた支持体を捩込んで達成される。別法
では、支持体を恒久的に表面20に接続し、障壁部材の調
節と取り外しを可能とする。捩かその他適当な手段で支
持体の外の末端に接続出来る。これらの方法は、剪断法
の応用の各種に最適の距離と障壁部材の形の選択を可能
とする。更に好ましいネビュライザー装置11は、霧状化
ゾーンに液体を供給する細管チヤンネルの直径を調節す
る機能を備えている。例えば、これは装置11に垂直に調
節できるカップ21を加えることで達成される。ネビュラ
イザーによって作り出される液滴のサイズを更に制御す
ることが可能になる。以上述べたごとく、ここで述べら
れた好ましい特徴を除いては、ネビュライザーは通常の
構造を持っても良い。
図7Bに示されているのは、本発明の特徴の幾つかを組
み込んだネビュライザー装置30の断面図である。詳細に
は、ネビュライザー装置30は一般的に円柱形であり、普
通、三つのチャンバー、つまりサンプルチャンバー31と
ガス圧チャンバー32と霧状化チャンバー33から成る。チ
ャンバー31−33は、たとえば協同性ねじ山及び圧縮可能
ワッシャー（図7Bで黒点によって示される）もしくはそ
れらの間でのそれに相当するものを用いてお互い適切に
接続、密封される。
み込んだネビュライザー装置30の断面図である。詳細に
は、ネビュライザー装置30は一般的に円柱形であり、普
通、三つのチャンバー、つまりサンプルチャンバー31と
ガス圧チャンバー32と霧状化チャンバー33から成る。チ
ャンバー31−33は、たとえば協同性ねじ山及び圧縮可能
ワッシャー（図7Bで黒点によって示される）もしくはそ
れらの間でのそれに相当するものを用いてお互い適切に
接続、密封される。
図7Bを続けると、サンプルチャンバー31は霧状化され
るサンプルの容器の役を果たす。更にサンプルチャンバ
ー31は、適切なプラスチックが金属で作られた本体34が
あり、その中にサンプルを受け入れるチャンバー、叉は
溜め35が作られている。さらに、ネビュライザー装置30
を分解する必要なしに霧状化処理した材料、または無処
理の材料のサンプルを適切な器具を使って採りだせるサ
ンプリング口36が備えられることが望ましい。
るサンプルの容器の役を果たす。更にサンプルチャンバ
ー31は、適切なプラスチックが金属で作られた本体34が
あり、その中にサンプルを受け入れるチャンバー、叉は
溜め35が作られている。さらに、ネビュライザー装置30
を分解する必要なしに霧状化処理した材料、または無処
理の材料のサンプルを適切な器具を使って採りだせるサ
ンプリング口36が備えられることが望ましい。
図7Bと図7Cに関して、ガス圧チャンバー32には適当な
プラスチックか金属、例えば真鍮、などで作られた本体
34がある。ガスノズル38はチャンバー本体37に組み入れ
られる。チャンバー本体37には、ガス吸入口39がある。
ガス吸入口39はチャンバー本体37の内壁41（図7C）とノ
ズル38の外壁42の間に出来た円柱状チャンバー40にむか
って開かれる。チャネル43は、円柱状チャンバー40とノ
ズル38の真上にあるガス口44の間に広がりこれらを接続
する。
プラスチックか金属、例えば真鍮、などで作られた本体
34がある。ガスノズル38はチャンバー本体37に組み入れ
られる。チャンバー本体37には、ガス吸入口39がある。
ガス吸入口39はチャンバー本体37の内壁41（図7C）とノ
ズル38の外壁42の間に出来た円柱状チャンバー40にむか
って開かれる。チャネル43は、円柱状チャンバー40とノ
ズル38の真上にあるガス口44の間に広がりこれらを接続
する。
ノズル38は、また霧状化されるサンプル中に届く柔軟
なホース又は他の導管46（点線で示す）がつなげられる
チャネル45を備えている。チャネル45は霧状化されるサ
ンプルをノズル38の上面にあるサンプル口47へ導く。ノ
ズル38は小さな口49を持つノズルキャップ48によってキ
ャップされている。ノズルキャップ48は、例えば協同性
ねじ山によって、ノズル38の上部に固定される。
なホース又は他の導管46（点線で示す）がつなげられる
チャネル45を備えている。チャネル45は霧状化されるサ
ンプルをノズル38の上面にあるサンプル口47へ導く。ノ
ズル38は小さな口49を持つノズルキャップ48によってキ
ャップされている。ノズルキャップ48は、例えば協同性
ねじ山によって、ノズル38の上部に固定される。
霧状化チャンバー33はねじ込み部材51が受け入れられ
るねじ込み穴の有る本体50をその一部とする。例えば金
属、望ましくはステンレス鋼で出来た球状部材52は、ね
じ込み部材51の端に付いている。霧状化チャンバー33
は、一般的に円錐形の転向装置53をも含む。ねじ込み部
材51の最上部にダイヤル54が付けられ、その回転によっ
て、球状部材52とノズルキャップ48の開口部49の間の距
離を調整する。
るねじ込み穴の有る本体50をその一部とする。例えば金
属、望ましくはステンレス鋼で出来た球状部材52は、ね
じ込み部材51の端に付いている。霧状化チャンバー33
は、一般的に円錐形の転向装置53をも含む。ねじ込み部
材51の最上部にダイヤル54が付けられ、その回転によっ
て、球状部材52とノズルキャップ48の開口部49の間の距
離を調整する。
図7Bと図7Cに関して、霧状化装置30の操作について更
に説明する。霧状化される物質のサンプルがチャンバー
35に入れられ、ホース46がサンプルの中まで延びてい
る。圧縮ガス源とガス吸入口39をつなげる。それから圧
縮ガスは開口部39を通して導入され、チャンバー40に入
り、チャネル43を通して昇り、一般的に整合されている
開口部44と開口部49を通って排出される。ガスの流れが
真空を作り出し、この真空がホース46とチャネル45を通
してサンプルを吸い上げサンプル口47から出て、ノズル
38の上面とノズルキャップ48の下面との中間に出来た狭
い空間を通り、開口部49に至りそこで開口部49から出る
ガスによって霧化される。一次霧と呼ばれるこの霧は非
平面的接触をもたらす部材52へ導かれ衝突し、二次霧と
呼ばれるより小さな液滴になり、より細かい霧がそこで
作り出される。転向装置53の働きによって、この二次霧
は大部分、チャンバー本体37の凹上面で形成されるチャ
ンネル55に集められる。霧状化過程を通ったガスはガス
口56を通して外界にでる。望ましく、あるいは必要な場
合には、ガス口56にエーロゾル障壁部材フィルターか、
その他のガス以外の物質の流失を防ぐ装置を固定するこ
とができる。
に説明する。霧状化される物質のサンプルがチャンバー
35に入れられ、ホース46がサンプルの中まで延びてい
る。圧縮ガス源とガス吸入口39をつなげる。それから圧
縮ガスは開口部39を通して導入され、チャンバー40に入
り、チャネル43を通して昇り、一般的に整合されている
開口部44と開口部49を通って排出される。ガスの流れが
真空を作り出し、この真空がホース46とチャネル45を通
してサンプルを吸い上げサンプル口47から出て、ノズル
38の上面とノズルキャップ48の下面との中間に出来た狭
い空間を通り、開口部49に至りそこで開口部49から出る
ガスによって霧化される。一次霧と呼ばれるこの霧は非
平面的接触をもたらす部材52へ導かれ衝突し、二次霧と
呼ばれるより小さな液滴になり、より細かい霧がそこで
作り出される。転向装置53の働きによって、この二次霧
は大部分、チャンバー本体37の凹上面で形成されるチャ
ンネル55に集められる。霧状化過程を通ったガスはガス
口56を通して外界にでる。望ましく、あるいは必要な場
合には、ガス口56にエーロゾル障壁部材フィルターか、
その他のガス以外の物質の流失を防ぐ装置を固定するこ
とができる。
チャンバー本体37はバルブ部材58を備えたチャネル57
を持つ。バルブ部材58霧状化処理したサンプルを溜めか
チャンバー35に戻す為に、選択的、かつ可逆的に（部材
58を本体37に捩込んだり捩出したりすることによって）
チャネル57とチャネル59の連絡を可能とする。このよう
にして、チャネル55に集められたサンプルはバルブ部材
58の操作によって、任意、かつ選択的にチャンバー35に
再循環できる。故に、装置30によって三種類の霧状化作
業が行なえる。第一にサンプルは、一度だけ霧状化され
て、以後の処理の為に装置30から取り去られる。第二に
バルブ部材58を閉鎖の位置に置いてサンプルを霧状化し
て、バッチ再循環を行なえる。霧状化処理されたサンプ
ルは霧状化工程が完了するまでチャネル55に集められ
る。その後、バルズ部材58を開いて霧状化処理されたサ
ンプルをチャンバー35に戻し、以後バルブ部材58は再閉
鎖される。そしてサンプルを再度霧状化出来、これを繰
り返して装置30のバッチ作業を行なえる。第三に、装置
30は、例えば霧状化作業中、バルブ部材58を開いておく
ことで、連続的に操作することが出来る。霧状化された
サンプルを再度の霧状化の為にチャンバー35に再循環す
るか、別の回収容器に導いて装置30を一過性連続モード
でも操作出来る。
を持つ。バルブ部材58霧状化処理したサンプルを溜めか
チャンバー35に戻す為に、選択的、かつ可逆的に（部材
58を本体37に捩込んだり捩出したりすることによって）
チャネル57とチャネル59の連絡を可能とする。このよう
にして、チャネル55に集められたサンプルはバルブ部材
58の操作によって、任意、かつ選択的にチャンバー35に
再循環できる。故に、装置30によって三種類の霧状化作
業が行なえる。第一にサンプルは、一度だけ霧状化され
て、以後の処理の為に装置30から取り去られる。第二に
バルブ部材58を閉鎖の位置に置いてサンプルを霧状化し
て、バッチ再循環を行なえる。霧状化処理されたサンプ
ルは霧状化工程が完了するまでチャネル55に集められ
る。その後、バルズ部材58を開いて霧状化処理されたサ
ンプルをチャンバー35に戻し、以後バルブ部材58は再閉
鎖される。そしてサンプルを再度霧状化出来、これを繰
り返して装置30のバッチ作業を行なえる。第三に、装置
30は、例えば霧状化作業中、バルブ部材58を開いておく
ことで、連続的に操作することが出来る。霧状化された
サンプルを再度の霧状化の為にチャンバー35に再循環す
るか、別の回収容器に導いて装置30を一過性連続モード
でも操作出来る。
本発明の原理と利点の理解と真価を更に促進する為に
以下に例示的な実施例を示す。実施中に使用されたlamb
daとpuc 19のDNAはU.S.Biochemicals Company,Clevelan
d,Ohioから購入した。Chlamydomonas reinhardtii DNA
は、Wt137C strainから精製した。葉緑体DNAは、核DNA
から２回連続してCsCl2グラジエントを通しての遠心分
離で分けた。E.コリの高分子量染色体DNAは、C600株か
ら本体T.Manniatisなど.,Molecular Cloning Laborator
y Manual,Cold Sping Harbor Laboratory（1982）に記
載されている方法で精製した。T4DNAリガーゼ，クレノ
ウフラグメントびT4DNAポリメラーゼは、Boehringer−M
annheim Co.から購入した。1Kb DNAレーダー分子サイズ
標準は、BRLから購入した。
以下に例示的な実施例を示す。実施中に使用されたlamb
daとpuc 19のDNAはU.S.Biochemicals Company,Clevelan
d,Ohioから購入した。Chlamydomonas reinhardtii DNA
は、Wt137C strainから精製した。葉緑体DNAは、核DNA
から２回連続してCsCl2グラジエントを通しての遠心分
離で分けた。E.コリの高分子量染色体DNAは、C600株か
ら本体T.Manniatisなど.,Molecular Cloning Laborator
y Manual,Cold Sping Harbor Laboratory（1982）に記
載されている方法で精製した。T4DNAリガーゼ，クレノ
ウフラグメントびT4DNAポリメラーゼは、Boehringer−M
annheim Co.から購入した。1Kb DNAレーダー分子サイズ
標準は、BRLから購入した。
普通、DNAは2mlのTE緩衝液に懸濁し、実施中に説明さ
れた各種の条件下でガス圧を加えて霧状化処理する。la
mbda DNAを実験に用した場合、霧状化の前に60℃で10分
間加熱した。霧状化の後、DNAはTAE電気泳動緩衝液を使
って普通の1.2％アガロースゲルで電気泳動分離を行な
った。ゲルは臭化エチジウムで染色して写真にとった。
写真のネガは、面積インテグレターを備えたQuickScan
Density Scannerでスキャンした。DNA断片の平均サイズ
は主要なDNAピークの位置を、同じゲル内のDNA対照の移
動距離と比較するコンピュータープログラムを使って推
定した。DNAの主要ピークの位置から＋/200bp以内のゲ
ルにあるDNAの％はこの限界以内でスキャンされた面積
をDNA全体の面積で割り:100を掛けて計算した。DNA断片
の末端は、T4DNAポリメラーゼをクレノウフラグメント
と共に用いて、ブラント末端を作り出すように修復され
た（F.M.Auzibelなど.,Current Protocols In Molecula
r Biology,John Wiley and Sons（1989）に記載されて
いる通りに。）。断片はT4リガーゼにより、製造元の指
示するブラント末端連結の条件のもとで連結した。この
連結の範囲はリガーゼの製造元が説明するようにアガロ
ースゲル電気泳動で決定した。
れた各種の条件下でガス圧を加えて霧状化処理する。la
mbda DNAを実験に用した場合、霧状化の前に60℃で10分
間加熱した。霧状化の後、DNAはTAE電気泳動緩衝液を使
って普通の1.2％アガロースゲルで電気泳動分離を行な
った。ゲルは臭化エチジウムで染色して写真にとった。
写真のネガは、面積インテグレターを備えたQuickScan
Density Scannerでスキャンした。DNA断片の平均サイズ
は主要なDNAピークの位置を、同じゲル内のDNA対照の移
動距離と比較するコンピュータープログラムを使って推
定した。DNAの主要ピークの位置から＋/200bp以内のゲ
ルにあるDNAの％はこの限界以内でスキャンされた面積
をDNA全体の面積で割り:100を掛けて計算した。DNA断片
の末端は、T4DNAポリメラーゼをクレノウフラグメント
と共に用いて、ブラント末端を作り出すように修復され
た（F.M.Auzibelなど.,Current Protocols In Molecula
r Biology,John Wiley and Sons（1989）に記載されて
いる通りに。）。断片はT4リガーゼにより、製造元の指
示するブラント末端連結の条件のもとで連結した。この
連結の範囲はリガーゼの製造元が説明するようにアガロ
ースゲル電気泳動で決定した。
実施例１ lambdaファージDNAか、E.コリDNAを上記の装置と方法
を用いて霧状化した。図１はE.コリDNAを用いた同様の
実験の結果を示す。DNAは三つの異なったガス圧を使っ
て示された時間の間霧状化された。サンプルが採取さ
れ、アガロースゲル電気泳動を用いてDNAはサイズによ
って分離された。作り出されたDNA断片の平均サイズは
上記の方法で計られた。結果は次ぎに示す。ａ）霧状化
工程は、大きなDNA分子を効率良く破砕し、非常に低い
ガス圧下でも30秒以内に、DNA分子の大部分が少なくと
も6000bpの断片に剪断される。ｂ）DNAの霧状化は定常
状態の工程で、使用されるガス圧にかかわらず、90秒間
の霧状化の後はそれ以上の剪断は起こらない。ｃ）定常
状態におけるDNA断片の平均サイズは加えられたガス圧
に依存する。
を用いて霧状化した。図１はE.コリDNAを用いた同様の
実験の結果を示す。DNAは三つの異なったガス圧を使っ
て示された時間の間霧状化された。サンプルが採取さ
れ、アガロースゲル電気泳動を用いてDNAはサイズによ
って分離された。作り出されたDNA断片の平均サイズは
上記の方法で計られた。結果は次ぎに示す。ａ）霧状化
工程は、大きなDNA分子を効率良く破砕し、非常に低い
ガス圧下でも30秒以内に、DNA分子の大部分が少なくと
も6000bpの断片に剪断される。ｂ）DNAの霧状化は定常
状態の工程で、使用されるガス圧にかかわらず、90秒間
の霧状化の後はそれ以上の剪断は起こらない。ｃ）定常
状態におけるDNA断片の平均サイズは加えられたガス圧
に依存する。
実施例２ 実施例１の繰り返しで、E.コリDNAの替わりにlambda
DNAが使われている。定量的に同じ結果が得られた。元
のDNAサイズが非常に違うので、この結果は定常状態で
得られたDNA断片の平均サイズは始めのDNAサイズに依存
しないことを示す。
DNAが使われている。定量的に同じ結果が得られた。元
のDNAサイズが非常に違うので、この結果は定常状態で
得られたDNA断片の平均サイズは始めのDNAサイズに依存
しないことを示す。
実施例３ スーパーコイルDNAに対する霧状化の効果 スーパーコイルDNAに対する霧状化の効果を調べるた
めに、少量のスーパーコイルPuc 19 DNAをE.コリの高分
子DNAを含んだ霧状化溶液に加えた。これらのスーパー
コイル分子の形とサイズの為、スーパーコイルプラスミ
ドDNAは、霧状化工程に対して耐性であるべきである。
予期された様に、スーパーコイルモノマーとスーパーコ
イルダイマーDNAのいずれも剪断されないことが電気泳
同によってあきらかになった。
めに、少量のスーパーコイルPuc 19 DNAをE.コリの高分
子DNAを含んだ霧状化溶液に加えた。これらのスーパー
コイル分子の形とサイズの為、スーパーコイルプラスミ
ドDNAは、霧状化工程に対して耐性であるべきである。
予期された様に、スーパーコイルモノマーとスーパーコ
イルダイマーDNAのいずれも剪断されないことが電気泳
同によってあきらかになった。
実施例４ DNA破砕に対しての種々のDNA濃度の効果 DNA濃度のDNA破砕に対する効果を、2ug/ml〜50ug/ml
のDNA濃度範囲において調べた。結果は最初のDNA濃度は
DNA剪断の速度にも程度にも影響を与えないことを示し
た。図２は、クラマイドモナス レインハードチの葉緑
素体DNAを用いたこのタイプの実験の典型的な結果を示
す。この実験のDNAは、二つのDNA濃度（25ug/mlか50ug/
ml）を使い10psiもしくは30psiのガス圧下で霧状化され
た。定常状態における断片の平均サイズは高いガス圧の
下での両方の濃度のDNA、また低いガス圧の下での低濃
度のDNAの場合ほとんど同一だった。定常状態における
断片の平均サイズは高濃度のDNAと低圧が使われた場
合、より高い（図２白丸）。この理由は、高濃度のDNA
のもとでは“自己保護”の現象によってDNAの剪断に対
する耐性が増加するからである。また、この実験の傾向
は「自己保護」現象はDNA濃度が25ug/ml以下の場合には
霧状化工程にとって問題にならないことを示す。
のDNA濃度範囲において調べた。結果は最初のDNA濃度は
DNA剪断の速度にも程度にも影響を与えないことを示し
た。図２は、クラマイドモナス レインハードチの葉緑
素体DNAを用いたこのタイプの実験の典型的な結果を示
す。この実験のDNAは、二つのDNA濃度（25ug/mlか50ug/
ml）を使い10psiもしくは30psiのガス圧下で霧状化され
た。定常状態における断片の平均サイズは高いガス圧の
下での両方の濃度のDNA、また低いガス圧の下での低濃
度のDNAの場合ほとんど同一だった。定常状態における
断片の平均サイズは高濃度のDNAと低圧が使われた場
合、より高い（図２白丸）。この理由は、高濃度のDNA
のもとでは“自己保護”の現象によってDNAの剪断に対
する耐性が増加するからである。また、この実験の傾向
は「自己保護」現象はDNA濃度が25ug/ml以下の場合には
霧状化工程にとって問題にならないことを示す。
実施例５ DNA剪断の効率 DNA剪断工程における重要な指標は、この効率、つま
り平均サイズの範囲にあるDNA断片の％として定義され
る。もし剪断工程が効率良ければ、DNA断片のサイズの
分布が狭く、大部分のDNAは近似したサイズとなる。図
３は使用濃度20ug/ml、圧力30psiの下で剪断されたlamb
da DNAのサイズ分布の分析を示す。サイズ分布は平均断
片サイズから＋／−200bp以内にあるDNAの％として計ら
れた。霧状化時間が増えるにつれて、平均断片サイズは
2200bp（30秒）から150秒の時点で1250bp（図３の白四
角）まで縮小する。同時に、DNAの剪断効率は、30秒の
時点での８％から約100秒後に到達した定常状態では25
％に増加した。この働きは液体霧状化工程におけるDNA
剪断の定常状態性を示すと共に、液体の粘度が低い場
合、この条件下で作りだされた剪断力はDNA分子を1250b
p以下に剪断するには不十分であることを示す。剪断力
を増加させることによって、定常状態におけるDNA断片
のサイズを縮小することが出来、DNA破砕の効率を改良
出来るかもしれない。
り平均サイズの範囲にあるDNA断片の％として定義され
る。もし剪断工程が効率良ければ、DNA断片のサイズの
分布が狭く、大部分のDNAは近似したサイズとなる。図
３は使用濃度20ug/ml、圧力30psiの下で剪断されたlamb
da DNAのサイズ分布の分析を示す。サイズ分布は平均断
片サイズから＋／−200bp以内にあるDNAの％として計ら
れた。霧状化時間が増えるにつれて、平均断片サイズは
2200bp（30秒）から150秒の時点で1250bp（図３の白四
角）まで縮小する。同時に、DNAの剪断効率は、30秒の
時点での８％から約100秒後に到達した定常状態では25
％に増加した。この働きは液体霧状化工程におけるDNA
剪断の定常状態性を示すと共に、液体の粘度が低い場
合、この条件下で作りだされた剪断力はDNA分子を1250b
p以下に剪断するには不十分であることを示す。剪断力
を増加させることによって、定常状態におけるDNA断片
のサイズを縮小することが出来、DNA破砕の効率を改良
出来るかもしれない。
実施例６ DNA破砕に対する種々の程度の効果 霧状化工程においてDNA分子に加えられる剪断力の増
加は、ガス圧を変えるだけでなく、液体粘度を増加させ
ることによっても達成される。実験的には、グリセロー
ルのような水溶性で粘度の高い物質を、種々の量、霧状
化溶液に加えることによって達成される。一連の実験で
グリセロール濃度は０％から25％迄変えられ、使用され
たガス圧は10psiから30psiにわたった。この実験にもE.
コリとlambdaのDNAが25ug/mlの濃度で使用された。二つ
のDNAを使用した結果は定量的にほぼ同じだった。
加は、ガス圧を変えるだけでなく、液体粘度を増加させ
ることによっても達成される。実験的には、グリセロー
ルのような水溶性で粘度の高い物質を、種々の量、霧状
化溶液に加えることによって達成される。一連の実験で
グリセロール濃度は０％から25％迄変えられ、使用され
たガス圧は10psiから30psiにわたった。この実験にもE.
コリとlambdaのDNAが25ug/mlの濃度で使用された。二つ
のDNAを使用した結果は定量的にほぼ同じだった。
図４は10,20または30psiのガス圧を用いた120秒間の
霧状化後のDNA（25ug/ml）断片サイズに対するグリセロ
ール濃度の影響を示す。ガス圧30psiの場合、DNA断片の
サイズはグリセロールぬきの場合の1000bpからグリセロ
ール濃度25％の場合の600bpに変わる。DNA断片の平均サ
イズは30％以上のグリセロール濃度においてほとんど縮
小しなかった（データは示されていない）。故に、使用
された圧力とグリセロール存在下で作り出せるDNA断片
の最小サイズはおおよそ600bpである。DNA断片のサイズ
をより小さくするためにはガス圧を更に上げればよい。
霧状化後のDNA（25ug/ml）断片サイズに対するグリセロ
ール濃度の影響を示す。ガス圧30psiの場合、DNA断片の
サイズはグリセロールぬきの場合の1000bpからグリセロ
ール濃度25％の場合の600bpに変わる。DNA断片の平均サ
イズは30％以上のグリセロール濃度においてほとんど縮
小しなかった（データは示されていない）。故に、使用
された圧力とグリセロール存在下で作り出せるDNA断片
の最小サイズはおおよそ600bpである。DNA断片のサイズ
をより小さくするためにはガス圧を更に上げればよい。
図５が示するはE.コリDNAを使って図４に示されたも
のと同じデータを求める実験の一例である。図５は、比
較の為、グリセロールぬきでE.コリDNAを10psiのガス圧
下で霧状化した以前のデータを含んでいる。結果は粘度
の増加がDNA剪断の程度に劇的な影響を与えることを示
した。例えば10psi下で30秒間霧状化したDNAの平均サイ
ズは、グリセロールぬきでは5500bpでグリセロール濃度
25％の場合は1650bpとなった。（図５を参照）さらに定
常状態（例えば、処理時間100秒後）におけるDNA断片の
平均サイズはグリセロールぬきの場合よりもはるかに小
さかった。例えばグリセロールぬきで30秒間霧状化され
たDNAの断片の平均サイズは1250bp（図１）で有り、一
方濃度25％のグリセロール存在下でのDNA断片の平均サ
イズは600bpである。
のと同じデータを求める実験の一例である。図５は、比
較の為、グリセロールぬきでE.コリDNAを10psiのガス圧
下で霧状化した以前のデータを含んでいる。結果は粘度
の増加がDNA剪断の程度に劇的な影響を与えることを示
した。例えば10psi下で30秒間霧状化したDNAの平均サイ
ズは、グリセロールぬきでは5500bpでグリセロール濃度
25％の場合は1650bpとなった。（図５を参照）さらに定
常状態（例えば、処理時間100秒後）におけるDNA断片の
平均サイズはグリセロールぬきの場合よりもはるかに小
さかった。例えばグリセロールぬきで30秒間霧状化され
たDNAの断片の平均サイズは1250bp（図１）で有り、一
方濃度25％のグリセロール存在下でのDNA断片の平均サ
イズは600bpである。
粘度の増加は定常状態に到達する時間にも影響した。
DNA断片の平均サイズは80秒間の霧状化以後、ほとんど
変わらなかった。（図５を参照） 実施例７ 効率に対する種々の粘度の効果 粘度の変化はDNA剪断の効率に劇的な影響を与える。
図６はグリセロール濃度25％、30psi下でのDNA剪断効率
の解析を示す。データが示すところによれば、定常状態
において、霧状化溶液が25％のグリセロールを含む場合
には殆ど70％の分子は600bp＋／−200bpのサイズの範囲
内にあり、グリセロールぬきの場合の20％と対比される
図３を参照）。
DNA断片の平均サイズは80秒間の霧状化以後、ほとんど
変わらなかった。（図５を参照） 実施例７ 効率に対する種々の粘度の効果 粘度の変化はDNA剪断の効率に劇的な影響を与える。
図６はグリセロール濃度25％、30psi下でのDNA剪断効率
の解析を示す。データが示すところによれば、定常状態
において、霧状化溶液が25％のグリセロールを含む場合
には殆ど70％の分子は600bp＋／−200bpのサイズの範囲
内にあり、グリセロールぬきの場合の20％と対比される
図３を参照）。
更に、図６の詳細な点検は、この実験では定常状態レ
ベルのDNAサイズ分布に到達していないことを示唆す
る。理由は過程の効率が30秒時点から160秒時点まで殆
ど直線的に増加していることである。この現象は、DNA
断片の平均サイズがこの時点で既に定常状態に達してい
るにもかかわらず起きている。これは、160秒の霧状化
処理後にも、未だ全部のDNA分子が霧状化チャネルの中
を再循環していないことを示唆する。従って、霧状化剪
断時間の増加は、DNAの平均サイズを減小することなく
この方法の効率をあげるべきである。時間が充分に長け
れば、100％に迫る効率を達成することも可能である。
ベルのDNAサイズ分布に到達していないことを示唆す
る。理由は過程の効率が30秒時点から160秒時点まで殆
ど直線的に増加していることである。この現象は、DNA
断片の平均サイズがこの時点で既に定常状態に達してい
るにもかかわらず起きている。これは、160秒の霧状化
処理後にも、未だ全部のDNA分子が霧状化チャネルの中
を再循環していないことを示唆する。従って、霧状化剪
断時間の増加は、DNAの平均サイズを減小することなく
この方法の効率をあげるべきである。時間が充分に長け
れば、100％に迫る効率を達成することも可能である。
実施例８ DNA断片の連結 霧状化によって得られた断片はお互いにブラント末端
連結するか、ブラント末端化されたPuc 19プラスミド末
端連結する。連結の程度はDNA断片の平均サイズより大
きなサイズへの転換で決定される。凡そ20％の断片がお
互いか、Puc 19に直接ブラント末端連結する。これは凡
そ20％の分子が、少なくとも分子の一端にブラント末端
をもつことを意味する。ブラント末端化されたPuc 19ベ
クターにクローンして決められたクローニング可能の断
片の％は約10％である。これは、小数のDNA断片の両端
がブラントであることを示唆する。
連結するか、ブラント末端化されたPuc 19プラスミド末
端連結する。連結の程度はDNA断片の平均サイズより大
きなサイズへの転換で決定される。凡そ20％の断片がお
互いか、Puc 19に直接ブラント末端連結する。これは凡
そ20％の分子が、少なくとも分子の一端にブラント末端
をもつことを意味する。ブラント末端化されたPuc 19ベ
クターにクローンして決められたクローニング可能の断
片の％は約10％である。これは、小数のDNA断片の両端
がブラントであることを示唆する。
同様の実験が連結反応以前にT4ポリメラーゼとクレノ
ウフラグメントによって修復されたDNA断片を用いて行
なわれた。その結果、修復されたDNA断片の80％がブラ
ント末端連結できる。これらの断片を用いたクローニン
グの効率も80％がそれ以上と推定される。末端（分子
の）は通常の末端修復方法を用いてかなりな程度修復可
能であると思える。故に、霧状化工程で機械的剪断で作
り出された断片はランダム配列決定ライブラリィーの構
築に有用である。
ウフラグメントによって修復されたDNA断片を用いて行
なわれた。その結果、修復されたDNA断片の80％がブラ
ント末端連結できる。これらの断片を用いたクローニン
グの効率も80％がそれ以上と推定される。末端（分子
の）は通常の末端修復方法を用いてかなりな程度修復可
能であると思える。故に、霧状化工程で機械的剪断で作
り出された断片はランダム配列決定ライブラリィーの構
築に有用である。
実施例９ クラマイドモナス レインバードチ細胞の破砕 この実験では霧状化処理でクラマイドモナス細胞を剪
断した。2mlのこの細胞（液体培地＝水性緩衝液1x108の
細胞濃度）は遠心分離で細胞を沈殿させ、上澄みの吸光
度を260nm（核酸による吸光）、280nm（蛋白質による吸
光）、と652nm（葉緑素による吸光）において測った。
これらの測定値は末破損細胞の値となる。以後、同様な
細胞を含む溶液が前述の改善されたAERMISTレビュライ
ザー（10psi）を用いて10,30,60,90秒間霧状化された。
その後、溶液は遠心分離され、260,280,と652における
上みの吸光度が計られた。吸光度のレベルは吸光物質の
溶液中への放出のレベルを示す。この検討の結果は図８
に示される。それによれば、細胞の数、もしくは吸光度
による推定では、98％の細胞が破砕された。上澄みから
核酸と蛋白質が通常の方法で回収された。他の一連の実
験で酵母細胞が同様の方法で破砕された。
断した。2mlのこの細胞（液体培地＝水性緩衝液1x108の
細胞濃度）は遠心分離で細胞を沈殿させ、上澄みの吸光
度を260nm（核酸による吸光）、280nm（蛋白質による吸
光）、と652nm（葉緑素による吸光）において測った。
これらの測定値は末破損細胞の値となる。以後、同様な
細胞を含む溶液が前述の改善されたAERMISTレビュライ
ザー（10psi）を用いて10,30,60,90秒間霧状化された。
その後、溶液は遠心分離され、260,280,と652における
上みの吸光度が計られた。吸光度のレベルは吸光物質の
溶液中への放出のレベルを示す。この検討の結果は図８
に示される。それによれば、細胞の数、もしくは吸光度
による推定では、98％の細胞が破砕された。上澄みから
核酸と蛋白質が通常の方法で回収された。他の一連の実
験で酵母細胞が同様の方法で破砕された。
実施例10 アスパラガスの葉細胞の破砕 細胞濃度が6x105のアスパラガスの葉細胞のサンプル
の2ml（溶液＝水性緩衝液）を前述の改善されたAERMIST
レビュライザー（ガス圧20psi）で1.5,3,4.5,と５分
間、それぞれ霧状化した。破砕された細胞の％はClay−
Adams計数チャンバーを使用して決定した。結果は図９
に示され、５分間の霧状化後には80％以上の細胞が破砕
されていることがわかった。
の2ml（溶液＝水性緩衝液）を前述の改善されたAERMIST
レビュライザー（ガス圧20psi）で1.5,3,4.5,と５分
間、それぞれ霧状化した。破砕された細胞の％はClay−
Adams計数チャンバーを使用して決定した。結果は図９
に示され、５分間の霧状化後には80％以上の細胞が破砕
されていることがわかった。
実施例11 ネビュライザーとポターホモジナイザー使用の細胞破砕
の比較 この例ではこの発明の方法とポターホモジナイザーに
よる細胞破砕の比較の為に一連の実験が行なわれた。大
豆の培養細胞がこれらの実験に使われた。実例９と同様
に対照の値を出すために未破損細胞溶液の上澄みの吸光
度が260,280,652nmにおいて測定された。次ぎに、細胞
溶液はポターホモジナイザーで二度（１ストロークと６
ストローク）、改善されたAERMISTレビュライザー（20p
si,2分）で一度処理された。図10に示された結果は、１
分間の霧状化処理はポターホモジナイザーでの６ストロ
ークと同様な細胞破砕を行なうことを示す。
の比較 この例ではこの発明の方法とポターホモジナイザーに
よる細胞破砕の比較の為に一連の実験が行なわれた。大
豆の培養細胞がこれらの実験に使われた。実例９と同様
に対照の値を出すために未破損細胞溶液の上澄みの吸光
度が260,280,652nmにおいて測定された。次ぎに、細胞
溶液はポターホモジナイザーで二度（１ストロークと６
ストローク）、改善されたAERMISTレビュライザー（20p
si,2分）で一度処理された。図10に示された結果は、１
分間の霧状化処理はポターホモジナイザーでの６ストロ
ークと同様な細胞破砕を行なうことを示す。
実施例12 スターチアズールの破砕 この実例は、発明されたネビュライザー法がDNA以外
の剪断可能な長い高分子を破砕出来ることを示す。従っ
て、枝のある高分子、スターチアズール（Sigma Chemic
al Co.,St.Louis,Missouri（カタログ＃Ｓ−7629）（液
体溶媒＝水、濃度＝1mg/ml）のサンプルが作られた。こ
れらのサンプルは改善されたAERMISTネビュライザーで
それぞれ1,5,7と８分間、20psi下で霧状化された。霧状
化された溶媒の吸光度を595nmにおいて測定し、破砕の
程度の指標とした。図11に表された結果は、この方法が
DNAのような直線高分子のみならず、枝のある澱粉のよ
うな高分子、また、他の枝のある高分子の破砕において
も高い効果を持っていることを示す。
の剪断可能な長い高分子を破砕出来ることを示す。従っ
て、枝のある高分子、スターチアズール（Sigma Chemic
al Co.,St.Louis,Missouri（カタログ＃Ｓ−7629）（液
体溶媒＝水、濃度＝1mg/ml）のサンプルが作られた。こ
れらのサンプルは改善されたAERMISTネビュライザーで
それぞれ1,5,7と８分間、20psi下で霧状化された。霧状
化された溶媒の吸光度を595nmにおいて測定し、破砕の
程度の指標とした。図11に表された結果は、この方法が
DNAのような直線高分子のみならず、枝のある澱粉のよ
うな高分子、また、他の枝のある高分子の破砕において
も高い効果を持っていることを示す。
実施例13 酵母細胞の破砕 酵母細胞は1mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で３回
洗浄した後、同じ緩衝液に懸濁して最終の細胞濃度を2x
109細胞/mlとした。各実験において、10mlの細胞懸濁液
が図7Bと図7Cのネビュライザー装置30によって霧状化さ
れた。N2もしくはHeを用いて、３つの異なる圧力が使用
された（100,200,及び300psi）。霧状化処理後、上部の
容器内の液体は下部の容器に戻され、1mlのサンプルが
採取された。霧状化工程は３回繰り返された。サンプル
は遠心分離され、上澄みに放出された蛋白質がBradford
法（OD595）で測定された。結果の示すところによれ
ば、高圧力の下ではHeはN2よりもより効果的に細胞を破
砕する。
洗浄した後、同じ緩衝液に懸濁して最終の細胞濃度を2x
109細胞/mlとした。各実験において、10mlの細胞懸濁液
が図7Bと図7Cのネビュライザー装置30によって霧状化さ
れた。N2もしくはHeを用いて、３つの異なる圧力が使用
された（100,200,及び300psi）。霧状化処理後、上部の
容器内の液体は下部の容器に戻され、1mlのサンプルが
採取された。霧状化工程は３回繰り返された。サンプル
は遠心分離され、上澄みに放出された蛋白質がBradford
法（OD595）で測定された。結果の示すところによれ
ば、高圧力の下ではHeはN2よりもより効果的に細胞を破
砕する。
本発明が諸図と前述の説明文によって、細部に渡って
図解され、説明されているが、これはあくまでも解説図
であり、限定的なものではないと考えられるべきであ
る。好ましい態様のみが示され、かつ説明されたので有
って、本発明の範囲内の改善と変化も保護されることが
望まれていると理解する。
図解され、説明されているが、これはあくまでも解説図
であり、限定的なものではないと考えられるべきであ
る。好ましい態様のみが示され、かつ説明されたので有
って、本発明の範囲内の改善と変化も保護されることが
望まれていると理解する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キタヤマ，マサヒコ アメリカ合衆国，インディアナ 47406, ブルーミントン，＃608，キャンパス ビュー アパートメント (72)発明者 トウガサキ，ロバート ケー. アメリカ合衆国，インディアナ 47401, ブルーミントン，カーナビィ ドライブ 3126 (56)参考文献 特開 昭64−86982（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 - 1/33 A61M 11/06 C12Q 1/68 B02C 19/00
Claims (30)
- 【請求項１】生物物質の破砕とその成分の分離と回収の
ための方法であって、前記生物物質を含む液体の霧状化
によって前記破砕を行ない、前記霧状化が、生物物質の
破砕が起きるように生物物質を含む液体を霧状化用障壁
部材に向けることを包含することを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記霧状化が前記液体を繰り返し霧状化す
ることを包含する請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記成分を実質的に純粋な形態で回収する
こともまた包含する請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】前記生物物質とはDNA、スターチポリマ
ー、若しくは細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】前記生物物質が細胞であり、そして前記成
分が細胞内画分である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】前記細胞内画分がDNA、蛋白質、と細胞内
オルガネラである請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】前記細胞内画分が蛋白質である請求の範囲
第６項記載の方法。 - 【請求項８】前記細胞内画分がDNAである請求の範囲第
６項記載の方法。 - 【請求項９】前記細胞内面が細胞内オルガネラである請
求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項１０】前記細胞内オルガネラが核、ミトコンド
リア、または葉緑体である請求の範囲第９項記載の方
法。 - 【請求項１１】分離されたDNAを含む液体を霧状化する
段階を含んで成る、前記DNAを断片化する方法。 - 【請求項１２】前記DNAを、前記霧状化後に回収する段
階を含んで成る請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１３】前記DNAが実質的に純粋である請求の範
囲第11項記載の方法。 - 【請求項１４】前記霧状化が前記液体を繰り返し霧状化
することを含む請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】前記液体のその粘度を高める物質を加え
る段階をまた含んで成る請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１６】前記液体が水を含む請求の範囲第11項記
載の方法。 - 【請求項１７】前記粘度を高める物質が糖又はアルコー
ルである請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１８】前記粘度を高める物質がグリセロール、
エチレングリコール、またはスークロースである請求の
範囲第17項記載の方法。 - 【請求項１９】前記DNAが、十分な量で含まれ、それに
よって自己保護がより大きい最終のDNA断片を供給する
請求の範囲第18項記載の方法。 - 【請求項２０】前記DNAが、保護され、より大きな断片
が得られるのに充分な量の適当な高分子を前記液体に含
む請求の範囲第18項記載の方法。 - 【請求項２１】また、前記の回収の後、前記DNAの末端
の修復の段階を包含する請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項２２】（ｉ）DNA断片を作り出す為に複数のコ
ピーのDNA鎖を含む液体を霧状化し、その霧状化とは、
前記コピーの断片化を起こすように前記コピーを含む液
体を霧状化用障壁部材に向けることであり、そして（i
i）前記断片の分析により前記DNA鎖の塩基配列を決定す
る段階を含んで成るDNA鎖の塩基配列決定法。 - 【請求項２３】DNAを含む液体を繰り返し霧状化して＋
／−200bp塩基対のDNA断片を少なくとも約30％の効率で
作り出すことを含んで成る、DNA断片の生成方法。 - 【請求項２４】前記効率が少なくとも約50％である請求
の範囲第23項記載の方法。 - 【請求項２５】液体導入口及び排出口並びに霧状化用障
壁部材を備えた霧状化装置であって、その装置が排出口
から導入口迄、液体をもどす手段を含んで成る装置。 - 【請求項２６】排出口から出る液滴を、より小さい液滴
に縮小させる為に、排出口から距離をおいて設置された
障壁部材及び排出口から障壁部材迄の距離を調節するた
めの手段をさらに含んで成る請求の範囲第25項記載の装
置。 - 【請求項２７】排出口に向かって液体を供給する細管チ
ャンネル及び細管チャンネルの直径を調節するための手
段をさらに含んで成る請求の範囲第26項記載の装置。 - 【請求項２８】前記障壁部材を他の障壁部材と交換する
ための手段を包含する請求の範囲第27項記載の装置。 - 【請求項２９】気密的に密封され、そしてガス圧安全弁
を備える請求の範囲第28項記載の装置。 - 【請求項３０】霧状化装置であって、液体の導入、導入
した液体を霧状化用障壁部材に向けるチャンネル排出
口、及び導入した液体を霧状化する為の霧状化用障壁部
材を包含し、前記装置がチャンネル排出口と霧状化用障
壁部材との間の距離を調節する手段をさらに包含するこ
とを特徴とする装置。
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