DE69131962T2 - Verfahren und vorrichtung für die fragmentation von biomaterialien - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf fragmentierbare Biomaterialien und insbesondere auf ein äußerst wirksames Verfahren und eine äußerst wirksame Vorrichtung für die Fragmentation von derartigen Biomaterialien, wie beispielsweise von Nucleinsäuren wie DNA, Zellen, Stärken und dergleichen, und das Abtrennen von Komponenten derselben. Die Erfindung ist daher von großer Bedeutung, unter anderem wegen des steigenden weltweiten Interesses an der Biotechnologie, der Genomforschung und den damit verbundenen DNA-Sequenzierungsarbeiten.
- Seit einiger Zeit besteht schon Interesse am Sequenzieren von Nucleinsäuren, wie der Deoxyribonucleinsäure (DNA). Dieses Interesse ist auf den Wunsch von Wissenschaftlern und dem Gewerbe zurückzuführen, sowohl die allgemeine Natur der Nucleinsäuren und insbesondere die des menschlichen Genoms und der Genome handelsmäßig wichtiger Pflanzen oder Tiere näher zu erforschen, als auch potentielle DNA-Attribute zu identifizieren, die zur Entwicklung neuer Medikamente und Behandlungsverfahren und in manchen Fällen möglicherweise sogar zur Verhinderung genetisch verursachter Funktionsstörungen führen können. Ein erfolgreiches DNA- Sequenzieren hängt stark von der Fähigkeit ab, aus größeren DNA-Molekülen zufällige DNA-Fragmente zu bilden. Offensichtlich sind daher der Entwicklung von Wegen zum Fragmentieren von DNA auf zufallsbedingte Weise viel Interesse und Bemühungen gewidmet worden.
- Im allgemeinen beinhaltet das DNA-Sequenzieren drei grundlegende Aufgaben. Zuerst werden zu sequenzierende Einzelfragmente gebildet. Als zweiter Schritt werden an den Fragmenten Sequenzierreaktionen durchgeführt. Als dritter Schritt findet eine Elektrophorese und die Kompilation von Daten statt. Der Erfolg der gegenwärtig in großem Maßstab stattfindenden DNA-Sequenzierbemühungen hängt in starkem Grad von technologischen Innovationen beim Sequenzieren ab. Insbesondere hängt ein derartiger Erfolg weitgehend von der Entwicklung und Implementierung automatisierter Verfahren für alle Schritte der DNA-Sequenzierung ab, C.R. Cantor, Orchestrating the Human Genome Project, Science 248, 49 (1990). Inzwischen sind die zweite und dritte Aufgabe automatisiert worden oder werden es gegenwärtig. Man vergleiche beispielsweise L. Smith et al., Fluorescence Detection an Automated DNA Sequence Analysis, Nature 321, 674 (1986); J.M. Prober et al., A System for Rapid DNA Sequencing with Fluorescent Chain-Terminating Dideoxynucleotides, Science 238, 336 (1987); J. Zimmerman et al., Automated Sanger Dideoxy Seguencing Reaction Protocol, FEBS Letters 233. 432 (1988). Der erste Schritt, der häufig als die "Sequenzierstrategie" bezeichnet wird, hat sich jedoch als schwierig zu verbessern oder automatisieren erwiesen.
- Die Sequenzierstrategie, die bis jetzt für das schnelle DNA-Sequenzieren in großem Maßstab als ideal geeignet betrachtet worden ist, ist die zufallsbedingte oder "Schrotschuß-" Strategie. Diese Strategie beinhaltet das zufallsbedingte Subklonieren eines großen DNA-Fragments und die Erstellung einer Sequenzierbibliothek zufälliger Fragmente. Wie schon angegeben, hängt der Erfolg dieser Strategie weitgehend vom Grad der Zufälligkeit der gebildeten Fragmente und außerdem davon ab, wie zeitaufwendig der Fragmentiervorgang ist. Bis jetzt sind drei verschiedene Methoden in signifikantem Maße zur Bildung von DNA-Fragmenten für die Erstellung von Sequenzierbibliotheken angewendet worden. Die erste Methode bedient sich des Partialrestriktions-Enzymverdaus. Eine zweite beinhaltet die Fragmentation von DNA durch DNase I-Enzym in Gegenwart von Mn&spplus;&spplus; und eine dritte Methode beruht auf der Beschallung, um das DNA physisch aufzubrechen. Trotz ihrer bisher weitverbreiteten Anwendung bringt jede dieser Methoden eine Reihe von Nachteilen mit sich.
- Ein wesentlicher Nachteil der ersten Methode, nämlich der Anwendung von Restriktionsenzymen, ist der nicht zufälligen Verteilung von Restriktionsstellen der DNA entlang zuzuschreiben, was zu einer mangelhaften erwünschten Zufälligkeit in der Klonenbank führen kann. Um diesem Problem entgegenzuwirken, ist die Verwendung zahlreicher verschiedener Restriktionsenzyme zu Präparation von Sequenzierbanken erforderlich, was einen mühsamen und zeitraubenden Prozeß darstellt. Diese Methode erfordert außerdem die Durchführung einer Reihe sorgfältig gesteuerter Restriktionsenzymreaktionen, die mit verschiedenen Enzymen und DNA- Präparationen schwierig zu reproduzieren sind.
- Bei der zweiten Methode unter Zuhilfenahme der DNase I werden einige der Schwierigkeiten der ersten Methode deshalb überwunden, weil nur eine geringe DNA- Sequenzspezifizität bei der DNase I-Spaltung auftritt. Jedoch ist in noch größerem Maße als bei der ersten Methode die Anwendung von DNase I für die Bildung zufälliger Fragmente schwierig zu reproduzieren und erfordert zahlreiche Testreaktionen. Dies ist unwirtschaftlich und erfordert große Mengen an Ausgangsmaterial.
- Die dritte Methode, die Beschallung, hat den Vorteil, daß sie leichter zu reproduzieren und zu steuern ist, als die beiden oben besprochenen enzymatischen Methoden. Zu ihrer Anwendung sind jedoch große Mengen Ausgangsmaterial erforderlich, da nur ein geringer Teil der ursprünglichen DNA-Moleküle auf die erforderliche Größe abgeschert wird. Die Beschallungsmethode beinhaltet außerdem das mühsame Kalibrieren des Beschallers und die genaue Zeitregelung der nachfolgenden Behandlungen. Außerdem hat es sich gezeigt, daß durch Beschallen bevorzugt AT- reiche Sequenzen abgeschert werden, was zu keinen wirklich zufallsbedingten Sequenzierbibliotheken führt, P.L. Deininger, Random Subcloning of Sonicated DNA; Application to Shotgun DNA Sequence Analysis, Analytical Biochemistry 129, 216 (1983). Dies ist eventuell dort besonders offensichtlich, wo das abzuscherende DNA lange AT- und GC-reiche Strecken umfaßt.
- Im Zusammenhang mit zahlreichen anderen Aspekten haben das Interesse an und die Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Biotechnologie in den letzten Jahren ebenfalls dramatisch zugenommen. Bei einem Großteil dieser Forschungsarbeiten ist die Isolierung und Abtrennung von innerhalb der Zelle aufgefundenen Biomaterialien erforderlich. Will man diese Materialien erhalten, so ist als solches gewöhnlich das Aufbrechen der Zellen zur Freisetzung der Biomaterialien erforderlich. In der Vergangenheit wurde dieses Aufbrechen durch verschiedene Methoden, einschließlich der Beschallung, des Mahlens mit schleifenden Materialien bei durch flüssigen Stickstoff hervorgerufenen sehr niedrigen Temperaturen, Hochgeschwindigkeitshomogenisierung und Abscheren mit einem Potter- Homogenisator zustandegebracht. Diese Methoden weisen verschiedene Nachteile auf, einschließlich der Notwendigkeit einer umfassenden Kalibrierung und Steuerung, schwerfälliger und nicht gleichförmiger Arbeitsgänge sowie anderer.
- In der US-A-3 806 250 wird eine Vernebelungseinheit für die Bildung eines durch Flammenspektrometrie zu untersuchenden feinen Sprühnebels einer Lösung geoffenbart. Bei dem Vernebelungsgerät handelt es sich um ein Durchflußgerät, das eine Aufprallfläche enthält, die sich in einer Wolkenkammer des Vernebelungsgeräts vor der Vernebelungsdüse befindet, und die von außerhalb des Vernebelungsgeräts der Düsenachse entlang zum Zweck des Einstellens der Vernebelungswirkung während des Arbeitsvorgangs einstellbar ist.
- Angesichts der obigen Ausführungen ist es offensichtlich, daß immer noch ein Bedarf besteht nach Verbesserungen bei der Verarbeitung und der Abtrennung von Biomaterialien. Beispielsweise besteht ein Bedarf nach einem verbesserten Verfahren für die Bildung von DNA-Fragmenten aus DNA-Proben und das Abscheren von Zellen zur Abtrennung von darin enthaltenen Materialien. Eine äußerst erwünschte Methode für die Herstellung von Subklonen würde zur Bildung von zufälligen DNA-Fragmenten führen, d. h. das Abscheren wäre sequenzunabhängig. Des weiteren sollte sie zu jeder Zeit mit einer jeglichen DNA reproduzierbar sein. Um dies zu erzielen, sollte die Abscherung im stationären Zustand erreicht werden, d. h. die Abscherung auf eine bestimmte Größe sollte nicht vom Zeitpunkt der Anwendung des Abschermittels abhängen. Auch würde die Methode die Bildung von DNA-Fragmenten im Größenbereich von ca. 500 bis 2000 Basenpaaren erlauben. Die Methode sollte effizient sein und ein Großteil der behandelten DNA sollte in Fragmente der erwünschten Größe umgewandelt werden. Des weiteren sollte sich die Methode sowohl auf große als auch kleine Mengen DNA anwenden lassen und, was ebenfalls wichtig ist, sollte sie einfach auszuführen und dabei nicht zeitraubend sein. Außerdem besteht beispielsweise ein Bedarf nach einem äußerst effizienten und zweckmäßigen Verfahren für das Abscheren von Zellen zur Abtrennung der darin enthaltenen Biomaterialien. Ein solches Verfahren würde wünschenswerterweise jegliche an den Biomaterialien während der Abscherarbeit stattfindende Beschädigung auf ein Minimum reduzieren. Die Erfindung der Anmelder dient der Befriedigung dieser Erfordernisse.
- Einer ersten Abwandlung der vorliegenden Erfindung gemäß wird ein Verfahren bereitgestellt für die Fragmentation eines Biomaterials und das Abtrennen einer Komponente desselben, gekennzeichnet durch
- (i) die Durchführung der Fragmentation durch Vernebeln einer das Biomaterial enthaltenden Flüssigkeit, wobei das Vernebeln das Richten der das Biomaterial enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarriere einschließt, um zu verursachen, daß das Biomaterial unter Bildung einer Komponente des Biomaterials fragmentiert wird, und
- (ii) das Abtrennen der Komponente
- Die Erfindung stellt damit eine Verbesserung eines Verfahrens für die Fragmentation eines Biomaterials und das Isolieren und Abtrennen einer Komponente desselben bereit. Dabei umfaßt das Verfahren den Schritt der Durchführung der Fragmentation durch Vernebeln einer das Biomaterial enthaltenden Flüssigkeit.
- Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Fragmentation von isolierter DNA. Dabei umfaßt das Verfahren den Schritt des Vernebelns einer die DNA enthaltenden Flüssigkeit, durch den DNA-Fragmente gebildet werden.
- Eine andere bevorzugte Ausführungsform umfaßt ein Verfahren für das Bestimmen einer Sequenz eines DNA-Strangs, das folgende Schritte umfaßt: (i) Vernebeln einer den DNA-Strang enthaltenden Flüssigkeit unter gleichzeitiger Bildung von DNA- Fragmenten und (ii) Bestimmen der Fragmente, einer Sequenz des DNA-Strangs, durch Analyse.
- Einer zweiten Abwandlung der vorliegenden Erfindung gemäß wird ein Gerät für das Vernebeln einer Flüssigkeit bereitgestellt, das eine Flüssigkeitseingabe und eine Flüssigkeitsausgabe aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Gerät folgendes umfaßt: Vorrichtungen für das Zurückführen der Flüssigkeit von der Ausgabe zur Eingabe; und
- eine Vernebelungsbarriere, die von der Ausgabe im Abstand gehalten wird, zum Reduzieren der die Ausgabe verlassenden Flüssigkeitstropfen zu kleineren Tröpfchen.
- Ohne die Erfindung einzuschränken wird angenommen, daß beim Vorgang der Tröpfchenbildung in der zu vernebelnden Flüssigkeit suspendierte DNA bzw. anderes Biomaterial an die Oberfläche des sich bildenden Bläschens in einer Übergangsströmung zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und dem Tröpfchen energisch verteilt wird. Man nimmt an, daß diese Strömung genügend hohe Scherkräfte auf die suspendierten DNA-Moleküle oder anderes Biomaterial ausübt, um sie auf mechanischem Wege in kleine Fragmente aufzubrechen. Außerdem nimmt man an, daß das Vernebeln von DNA oder anderen scherfähigen Polymeren dazu führt, daß jedes Molekül bei dem wiederholten Bläschenbildungsvorgang ungefähr in die Hälfte zerbricht, bis das Molekül eine genügend kleine Dimension erreicht derart, daß die aufgebrachten Kräfte nicht mehr ausreichen, es noch weiter aufzuzerbrechen. Dadurch werden die DNA- oder anderen Polymermoleküle im stationären Zustand abgeschert und die schließliche Dimension der zerbrochenen Moleküle hängt nur vom Ausmaß der aufgebrachten Kraft ab. Des weiteren verringert sich die geringste Scherspannung, die Moleküle zu brechen in der Lage ist, mit steigender Molmasse der DNA, was zu einem sehr schnellen Abscheren eines großen Moleküls führt und zur Wirksamkeit des Verfahrens beiträgt. Das Ausmaß der gebildeten Scherkraft sollte theoretisch formell der Druckminderung proportional sein, die durch die Gleichung der Flüssigkeitskapillarströmung beschrieben wird. Dementsprechend ist diese Kraft dem aufgebrachten Gasdruck und der Viskosität der Flüssigkeit direkt proportional und der Größe der Tröpfchen umgekehrt proportional. Je kleiner die Tröpfchen, je höher die Viskosität und je stärker der aufgebrachte Gasdruck, desto höher sind daher die Scherkräfte, die auf die Moleküle oder andere Biomaterialien aufgebracht werden.
- Ein Gegenstand dieser Erfindung besteht darin, verbesserte Verfahren für das Aufbereiten und Abtrennen von Biomaterialien bereitzustellen, einschließlich beispielsweise verbesserter Verfahren für die Fragmentation und das Sequenzieren von DNA, verbesserter Verfahren für das Abscheren von Zellen und das Abtrennen von sich darin befindenden Biomaterialien und verbesserter Verfahren für das Abscheren von Biopolymeren wie beispielsweise Stärke.
- Ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein Gerät für das wiederholte Vernebeln von Flüssigkeit bereitzustellen, das sich vorteilhaft für die bevorzugten Verfahren der Anmelder verwenden läßt.
- Zusätzliche Gegenstände sowie Vorteile der Erfindung werden bei der Durchsicht durch die folgende Beschreibung und die beiliegenden Ansprüche offensichtlich.
- Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe in Abhängigkeit von der Zeit bei unterschiedlichem Druck während des Vernebelns.
- Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe in Abhängigkeit von der Zeit bei unterschiedlichem Druck und verschiedenen DNA- Konzentrationen während des Vernebelns.
- Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe in Abhängigkeit von der Zeit unter Anwendung verschiedener Glycerinkonzentrationen während des Vernebelns.
- Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe in Abhängigkeit vom Prozentsatz an Glycerin bei unterschiedlichem Druck während des Vernebelns.
- Fig. 5 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe in Abhängigkeit von der Zeit für DNA-Präparationen von 25 ug/ml und 25% Glycerin bei unterschiedlichem Druck während des Vernebelns.
- Fig. 6 zeigt eine graphische Darstellung der durchschnittlichen DNA-Größe und der Verfahrenseffizienz in Abhängigkeit von der Zeit bei Verwendung von 25% Glycerin während des Vernebelns.
- Fig. 7A zeigt eine schematische Darstellung eines verbesserten erfindungsgemäßen Vernebelungsgeräts.
- Fig. 7B zeigt eine Querschnittsansicht eines erfindungsgemäßen Vernebelungsgeräts.
- Fig. 7C zeigt eine auseinandergezogene Querschnittsansicht der mittleren Teile des in Fig. 7B veranschaulichten Geräts.
- Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung der Extinktion der überstehenden Flüssigkeit (in optischen Dichteeinheiten "OD") bei 260, 280 und 652 Nanometern in Abhängigkeit von der Vernebelungszeit für Proben von Chlamydomonas reinhardtii- Zellen.
- Fig. 9 zeigt eine graphische Darstellung des Prozentsatzes aufgebrochener Zellen in Abhängigkeit von der Vernebelungszeit für Spargel-Zellen.
- Fig. 10 zeigt eine graphische Darstellung eines Vergleichs der Extinktion der überstehenden Flüssigkeit (in OD-Einheiten) bei 260, 280 und 652 Nanometern für Behandlungen mit einem 1- und 6-Stoß-Potter-Homogenisator und eine einminütige Behandlung von Proben von Sojabohnenkulturzellen mit dem Vernebelungsgerät.
- Fig. 11 zeigt eine graphische Darstellung der Extinktion (in OD-Einheiten) bei 595 Nanometern in Abhängigkeit von der Vernebelungszeit Ihr Proben von verzweigtem Polymerstärkeazur.
- Fig. 12 zeigt eine graphische Darstellung der Extinktion der überstehenden Flüssigkeiten von Hefezellen bei 595 Nanometern in Abhängigkeit von der Anzahl der Vernebelungszyklen bei unterschiedlichem Druck mit Stickstoff und Heliumgasen.
- Zum Zwecke des besseren Verständnisses der Prinzipien der Erfindung wird nun Bezug genommen auf gewisse Ausführungsformen und es werden spezifische Ausdrücke zur Beschreibung derselben verwendet. Man sollte sich jedoch im Klaren darüber sein, daß damit keine Begrenzung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt wird und daß solche Änderungen, Modifikationen und weitere Anwendungen der Prinzipien der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie normalerweise einem Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, in den Sinn kommen könnten.
- Wie oben angegeben, bezieht sich eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung auf eine Verbesserung eines Verfahrens für die Fragmentation eines Biomaterials (d. h. eines modifizierten oder unmodifizierten biologisch auftretenden Materials) und das Isolieren und Abtrennen einer Komponente desselben. Derartige Biomaterialien umfassen beispielsweise Zellen oder Zellsubfraktionen, z. B. Proteine, scherfähige lange Polymere wie DNA und Stärkepolymere, Chromosomen, Organellen wie Zellkerne, Chloroplaste, Mitochondrien und dergleichen.
- Das scherfähige zu fragmentierende Material wird in eine geeignete Flüssigkeit, typischerweise ein wäßriges Medium, eingeführt und diese Flüssigkeit wird daraufhin vernebelt, um das Biomaterial abzuscheren. Bevorzugt wird die Flüssigkeit mehrere Male entweder durch chargenweises Einsammeln und Wiedervernebeln oder durch ein kontinuierliches Vernebelungs- und Rückführverfahren vernebelt.
- Wie oben angegeben, bezieht sich eine bevorzugte Art und Weise und Ausführungsform der Erfindung auf ein Verfahren für die Fragmentation von isolierter DNA, das den Schritt des Vernebelns einer die DNA enthaltenden Flüssigkeit umfaßt, wobei das Vernebeln das Richten der das Biomaterial enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarriere einschließt. Die Arbeiten der Anwender haben gezeigt, daß die Bildung von DNA-Fragmenten unter Verwendung eines Vernebelungsscherverfahrens Viele der bis jetzt auf diesem Gebiet in starkem Maße erwünschten wichtigen Vorteile liefert. Beispielsweise hat es sich erwiesen, daß dieses Verfahren eine äußerst zufallsbedingte Fragmentation von DNA ergibt. Das Verfahren ist leicht reproduzierbar und läßt sich zur Erzielung eines Abscherens im stationären Zustand verwenden. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bei den bis jetzt stattgefundenen Arbeiten der Anmelder in der Tat möglich gewesen, DNA- Fragmente einer ausgewählten Größe im Bereich von ca. 500 Basenpaaren ("bp") bis ca. 2000 bp mit einer Effizienz von mehr als 30% und im Bereich von bis zu 50% und sogar 70% und mehr zu erzielen. Des weiteren läßt sich dieser Größenbereich durch Erhöhung des Gasdrucks, durch Erhöhung der Viskosität der Flüssigkeit und/oder andere Mittel noch unter eine Größe von 500 bp erweitern, wie im folgenden noch besprochen wird. Außerdem wird durch das Vernebelungsverfahren beim Fragmentieren von DNA und anderen Abscher- oder Aufbrechverfahren keine signifikante Wärme gebildet, im Gegenteil zur Beschallung, sondern das Verfahren weist einen inhärenten oder "eingebauten" Kühlungsmechanismus aufgrund des Verdampfens von Nebeltröpfchen auf.
- Der Begriff "Vernebelung" ist im Stand der Technik allgemein dafür bekannt, daß er das Reduzieren einer Flüssigkeit zu einem feinen Sprühnebel beinhaltet. Durch ein derartiges Vernebeln werden bevorzugt kleine Flüssigkeitströpfchen einheitlicher Größe aus einem größeren Flüssigkeitskörper auf gesteuerte Weise gebildet. Diese Vernebelung kann durch irgendeine dafür geeignete Vorrichtung, einschließlich der Verwendung vieler bekannter und heute im Handel erhältlicher Vernebelungsgeräte, erzielt werden. Typische Verfahren wurden durch den Anmelder beispielsweise unter Verwendung eines von Inhalation Plastic, Inc., Niles, Illinois, erhältlichen pneumatischen AEROMIST-Vernebelungsgerät durchgeführt. Die Öffnung des AEROMIST-Vernebelungsgeräts wurde durch ein kegelförmiges Druckventil teilweise verschlossen und der dadurch erhaltene Nebel wurde durch dieses Ventil zur Vermeidung eines großen Flüssigkeitsverlusts wieder in den Speicherbehälter zurückgeführt. Bei diesem Verfahren wurden ca. 80-90% der Flüssigkeit wiedergewonnen. Wie allgemein bekannt ist, kann ein jegliches geeignetes Gas zum Aufbringen von Druck während des Vernebelns verwendet werden, wobei bisher die bevorzugten Gase diejenigen waren, die der Nucleinsäure gegenüber chemisch inert sind. In dieser Beziehung ist bei den Arbeiten der Anmelder bisher der Stickstoff ein bevorzugtes Gas gewesen, obwohl andere inerte Gase wie Argon oder Helium äußerst vorteilhaft verwendet werden können. Bei den Arbeiten unter Anwendung von Stickstoffgas wurde ein Standardstickstoffgas-Tankregler zum Regeln des Gasdrucks verwendet.
- Was das isolierte DNA-Ausgangsmaterial anbetrifft, so ist eine solche DNA aus jeglicher Quelle für die Erfindung der Anmelder akzeptabel. Es wird dabei beabsichtigt, daß der Begriff "isolierte DNA", wie er hier verwendet wird, DNA umfassen soll, die frei ist von jeglichen signifikanten Mengen anderer Materialien, die die Abtrennung der DNA-Fragmente in den bevorzugten Verfahren signifikant erschweren würden. Eine derartige DNA in gereinigter Form ist allgemein aus handelsmäßigen Quellen erhältlich oder kann unter Zuhilfenahme von Verfahren, die gut bekannt sind und im Stand der Technik verwendet werden, hergestellt werden. Bei den Arbeiten der Anmelder verwendete typische DNA waren unter anderem Lambda- und puc 19-DNA, aus dem WT 137C-Stamm gereinigtes Chlamydomonas reinhardtii-Chloroplast-DNA. Weitere veranschaulichende DNA-Affen waren hochmolekulare Chromosomen-DNA von Ecoli. Wie oben angegeben, ist eine solche DNA aus jeglicher Quelle geeignet, wie sich diejenigen, die auf diesem Gebiet Erfahrung haben, bewußt sein werden.
- Desgleichen ist eine jegliche geeignete Flüssigkeit, in der die DNA sich auf unbedenkliche Weise ohne wesentlichen Abbau suspendieren läßt, für die Erfindung geeignet. Typischerweise handelt es sich bei der Flüssigkeit jedoch um Wasser mit oder ohne andere Zusatzmittel.
- In anderen Abwandlungen der vorliegenden Erfindung ist ein gezielt gesteuertes DNA-Abscheren durch Variieren des Gasdrucks und der Viskosität der Medien im Vernebelungsschritt erzielt worden. Beispielsweise sind geeignete Mittel der Flüssigkeit zur Erhöhung ihrer Viskosität zugesetzt worden, was - wie im Folgenden in den Beispielen 6 und 7 in noch weiteren Einzelheiten besprochen wird - eine dramatische Wirkung auf die Größe der erhaltenen DNA-Fragmente sowie auf die Effizienz des Abschervorgangs ausübt. In dieser Beziehung umfaßten die viskositätserhöhenden Mittel für wäßrige Medien unter anderem geeignete Alkohole wie Ethylenglykol und Glycerin und geeignete Zucker wie Saccharose. Außerdem ist die Größe der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente auf verläßliche Weise durch Regeln des Drucks gesteuert worden, da die Größe des DNA- Fragments dem im Vernebelungsschritt angewendeten Gasdruck umgekehrt proportional ist.
- Einer anderen Abwandlung gemäß kann die Größe des DNA-Fragments durch Vernebelungen erhöht werden, bei denen man sich das Selbstschutzphänomen zu Nutze macht unter Verwendung von DNA-Anfangskonzentrationen, die über ca. 50 ug/ml DNA liegen (vergleiche Beispiel 4 und Fig. 2).
- Außerdem lassen sich durch Zusetzen eines anderen geeigneten Polymers wie Stärke zu dem Anfangs-DNA zur Erzielung eines DNA-Schutzes ähnliche Ergebnisse erreichen unter Erzielung größerer DNA-Fragmente.
- Auf den Vernebelungsschritt hin werden die DNA-Fragmente durch eine geeignete Methode, wie Ausfällen mit Ethanol, abgetrennt. Wie im Folgenden in Beispiel 8 besprochen, können die Fragmente außerdem auf herkömmlichem Wege behandelt, kloniert und sequenziert und die Daten entsprechend in eine Datenbank eingegeben werden. Durch Analyse der dadurch erhaltenen Daten kann man eine Sequenz größerer DNA-Stränge erhalten, aus denen die Fragmente deriviert werden.
- Wie schon angegeben, stellen lebende Zellen ein weiteres Biomaterial dar, das diejenigen, die auf diesem Gebiet erfahren sind, allgemeinen zur Abtrennung der Komponenten desselben aufbrechen. Diese Zellen umfassen sowohl pflanzliche als auch tierische Zellen sowie Prokaryontenzellen. Erfindungsgemäß werden die Zellen in einem geeigneten Medium, wie gepuffertem Wasser, suspendiert. Dieses Medium wird daraufhin vernebelt, um die Zellen aufzubrechen oder abzuscheren und dadurch die sich darin befindlichen Komponenten oder Zellsubfraktionen, z. B. Chromosomen, DNA, Proteine, Organellen wie Zellkerne, Mitochondrien, Chloroplaste usw. freizusetzen. Beispielsweise haben die Anmelder das Aufbrechen von Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella (Grünalgen), Spargel, Sojabohnenzellen und Hefezellen aufgezeigt und das Freisetzen von Nucleinsäure und Proteinsubfraktionen identifiziert, die daraufhin durch Standardverfahren isoliert und abgetrennt werden können. Als weiteres Beispiel haben die Anmelder außerdem E. coli-Zellen unter geeigneten (milden) Bedingungen vernebelt, um so ausschließlich Plasmid-DNA in dem Medium freizusetzen. Dies ermöglicht ein schnelles und effizientes Isolieren der Plasmid-DNA. Die Anmelder haben auch C. reinhardtii-Zellen auf geeignete Weise vernebelt, um ausschließlich Protein (z. B. Enzyme) aus den Periplasma-Kompartimenten der Zellen freizusetzen. Es hat sich erwiesen, daß auf diese Weise freigesetztes Enzym seine Enzymaktivität beibehält und dieses Verfahren bietet daher eine effektive und selektive Abtrennung von Proteinen, die durch die Bioingenieurtechnik an den periplasmatischen Leerstellen der Zellen abgesetzt werden sollen. Des weiteren haben die Anmelder durch Beschallung, Yeda-Press- und ihr eigenes erfindungsgemäßes Vernebelungsverfahren Chloroplast-Carboanhydrase aus C. reinhardtii freigesetzt und die Aktivität der abgetrennten Enzyme verglichen. Die Enzymaktivität war bei den drei Methoden fast identisch, was wiederum die Möglichkeit der Abtrennung von intakten Proteinen beweist.
- Beim Abscheren von Zellen wird die Vernebelung im allgemeinen auf geeignete Weise gesteuert, um jegliche wesentliche Beschädigung der zu isolierenden und abzutrennenden Subfraktion oder Komponente zu vermeiden. In dieser Hinsicht ist der angewandte Vernebelungsdruck je nach dem speziellen Typ der abzuscherenden Zellen und der Viskosität des flüssigen Trägermediums unterschiedlich.
- Wie oben angegeben, bezieht sich eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung auf ein verbessertes Gerät für das Vernebeln einer Flüssigkeit, welches - Gerät eine Eingabe und eine Ausgabe aufweist. Erfindungsgemäß umfaßt das Gerät außerdem Vorrichtungen für das Zurückführen der vernebelten Flüssigkeit von der Ausgabe des Vernebelungsgeräts zurück zur Eingabe des Vernebelungsgeräts und eine Vernebelungsbarriere, die von der Ausgabe im Abstand gehalten wird, zum Reduzieren der die Ausgabe verlassenden Flüssigkeitstropfen zu kleineren Tröpfen.
- Bei Verwendung der gegenwärtig im Handel erhältlichen Vernebelungsgeräte sind der Wirksamkeit und Effizienz des Vernebelungsscheren von DNA signifikante Grenzen gesetzt. Diese umfassen beispielsweise Schwierigkeit beim Auffangen und erneuertem Zurückführen der vernebelten Flüssigkeit durch das Vernebelungsgerät, da die bekannten Geräte keine Vorrichtungen zu diesem Zweck aufweisen. Außerdem können die DNA-Fragmentgrößenverteilung und Verfahrenseffizienz nicht nur durch Ändern der Viskosität der Flüssigkeit oder des Gasdrucks variiert werden, sondern auch durch andere Mittel, durch die die Größe der durch Vernebeln erhaltenen Tröpfchen verändert wird. Insbesondere weisen bekannte Geräte auch einen Kapillarkanal auf, durch den die Flüssigkeit zur Vernebelungszone gespeist wird, sowie eine Barriere, die gewöhnlich die Form einer Halbkugel aufweist und im Abstand von der Flüssigkeitsausgabe angebracht ist und die die Ausgabe verlassenden Flüssigkeitstropfen noch zu kleineren Tröpfchen aufbricht. Die Größe des Kapillarkanals und die Form und relative Positionierung der Barriere wirken sich ebenfalls auf die Größe der durch Vernebelung erhaltenen Tröpfchen aus. Keines der bekannten Geräte weist jedoch eine Vorrichtung zur Veränderung der Größe des Kapiallarkanals, für das Ersetzen einer Barriere durch eine andere von anderer Form oder für das Variieren des Abstands der Barriere von der Ausgabe auf. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Geräte der Anmelder enthalten diese weiteren Merkmale, durch die die Größe der Tröpfchen variiert und die Wirksamkeit und Effizienz des DNA-Scherverfahrens entsprechend gesteuert werden kann.
- Insbesondere wird in Fig. 7A eine schematische Darstellung eines verbesserten Vernebelungsgeräts 11 gezeigt, das diese erfindungsgemäßen Merkmale umfaßt und durch das die Größe der abgescherten DNA und die Effizienz der Vernebelungsvorgänge verbessert werden können. Insbesondere kann das Vernebelungsgerät 11 herkömmlicher Art sein, mit Ausnahme der folgenden Merkmale. Erstens ist der Behälter 12 des Vernebelungsgeräts 11 bevorzugt von konischer Form, die das Vernebeln sehr geringer Volumen von Flüssigkeit 13 erlaubt. Des weiteren ist der Behälter 12 bevorzugt hermetisch verschlossen und mit einer Rückflußröhre 14 für das Zurückführen des vernebelten Nebels ausgestattet. Dies ermöglicht das effiziente Vernebeln der die DNA enthaltenden Flüssigkeit 13 über längere Zeitspannen. Außerdem weist das bevorzugte erfindungsgemäße Vernebelungsgerät 11 ein Gasdruckventil 15 und ein Überdruckventil 16 auf, die gleichzeitig einstellbar sind. Diese Vorkehrungen ermöglichen es, den Gasdruck im Behälter 12 konstant zu halten.
- Das bevorzugte Vernebelungsgerät 11 umfaßt außerdem eine Vorrichtung zum Einstellen des Abstands zwischen der Barriere 17 und der Ausgabedüse 18, welche Vorrichtung dadurch bereitgestellt wird, daß die Halterung 19 der Barriere 17 mit einem Gewinde versehen wird, so daß sie in die gegenüberliegende Fläche 20 geschraubt und aus dieser herausgeschraubt werden kann. Diese Funktion kann jedoch auch durch jegliche andere geeignete Vorrichtung erreicht werden. Außerdem weist das bevorzugte Gerät 11 eine Vorrichtung auf für das Ersetzen der Barriere 17 durch eine andere Barriere, wie beispielsweise eine Barriere anderer Größe oder Form. Im bevorzugten Gerät läßt sich dies durch vollständiges Herausschrauben der Halterung 19 aus der Fläche 20 und Einschrauben einer neuen Halterung und damit verbundenen Barriere erzielen. Als Alternative kann die Halterung auf Dauer an der Fläche 20 befestigt werden, und die Barriere kann einstell- und entfernbar an das nach Außen gerichtete Ende der Halterung, beispielsweise durch ein Gewinde oder eine andere geeignete Vorrichtung, befestigt werden. Diese Aspekte ermöglichen die Auswahl eines optimalen Abstands und einer optimalen Form der Barriere für verschiedene Abscheranwendungen. Des weiteren weist das bevorzugte Vernebelungsgerät 11 eine Vorrichtung auf für das Einstellen des Durchmessers des Kapillarkanals, der Flüssigkeit in die Vernebelungszone einspeist. Dies läßt sich beispielsweise durch Einsetzen einer senkrecht einstellbaren Schale 21 in das Gerät 11 erzielen. Dadurch läßt sich eine zusätzliche Regelung der Größe der durch das Vernebelungsgerät erzielbaren Tröpfchen erreichen. Wie oben angegeben, kann das Vernebelungsgerät eine herkömmliche Struktur aufweisen, mit Ausnahme der hier erwähnten bevorzugten Merkmale.
- Was Fig. 7B anbetrifft, so veranschaulicht sie eine Querschnittsansicht eines Vernebelungsgeräts 30, das einige der erfindungsgemäßen Merkmale umfaßt. Insbesondere weist das Vernebelungsgerät 30 allgemein eine zylindrische Form auf und umfaßt allgemein drei Kammern, nämlich die Probenkammer 31, die Gasdruckkammer 32 und die Vernebelungskammer 33. Kammern 31-33 sind auf geeignete Weise miteinander verbunden und gegeneinander abgedichtet, beispielsweise durch kooperierende Gewinde und das Einfügen von komprimierbaren Dichtungsscheiben (die in Fig. 7B punktförmig angedeutet sind) oder dergleichen zwischen diesen.
- Immer noch mit Bezug auf Fig. 7B dient die Probenkammer 31 als Aufnahmebehälter für die zu vernebelnde Probe. Probenkammer 31 weist einen Körper 34 auf, der bevorzugt aus einem geeigneten Kunststoff oder Metall gefertigt ist, in den eine Kammer oder ein Behälter 35 für die Aufnahme der Probe eingebaut ist. Außerdem wird bevorzugt eine Probenahmeöffnung 36 bereitgestellt, durch die Proben von vernebelten oder nichtvernebelten Materialien mit einem geeigneten Instrument herausgenommen werden können, ohne daß das Vernebelungsgerät 30 auseinandergenommen zu werden braucht.
- Was Fig. 7B und 7C zusammengenommen anbetrifft, so weist die Gasdruckkammer 32 einen Körper 37 auf, der bevorzugt aus einem geeigneten Metall oder Kunststoff gefertigt ist; beispielsweise ist Messing dazu geeignet. Eine Gasdüse 38 ist in dem Kammerkörper 37 befestigt, und zwar bevorzugt durch ein Gewinde. Der Kammerkörper 37 weist eine Gaseingabeöflhung 39 auf. Die Gaseingabeöffnung 39 führt in die zylindrische Kammer 40, die zwischen einer Innenwand 41 (Fig. 7C) des Kammerkörpers 37 und einer Außenwand 42 der Düse 38 gebildet wird. Der Kanal 43 erstreckt sich zwischen der zylindrischen Kammer 40 und der Gasöffnung 44 oben an der Düse 38 und verbindet diese beiden miteinander.
- Die Düse 38 weist ebenfalls einen Kanal 45 auf, an den ein Schlauch oder eine andere Leitung 46 (gestrichelt gezeigt) angeschlossen werden kann, so daß der Schlauch 46 sich bis in die zu vernebelnde Probe hinunter erstreckt. Durch den Kanal 45 wird die zu vernebelnde Probe zur Probenöffnung 47 oben an der Düse 38 geleitet. Die Düse 38 ist mit einer Düsenkappe 48 verschlossen, in der sich eine kleine Öffnung 49 befindet. Die Düsenkappe 48 ist beispielsweise durch kooperierende Gewinde oben an der Düse 38 befestigt.
- Die Vernebelungskammer 33 umfaßt einen Körper 50, in dem sich eine Gewindebohrung befindet, der ein Gewindeelement 51 aufnimmt. Ein kugelförmiges Element 52, das bevorzugt aus einem geeigneten Metall, beispielsweise Edelstahl, gefertigt ist, wird am Ende des Gewindeelements 51 bereitgestellt. Die Vernebelungskammer 33 umfaßt außerdem einen allgemein kegelförmigen Ablenker 53. Oben am Gewindeelement 51 ist eine Skalenscheibe 54 befestigt, die zum Einstellen des Abstands zwischen dem kugelförmigen Element 52 und der Öffnung 49 der Düsenkappe 48 gedreht werden kann.
- Immer noch mit Bezug auf Fig. 7B und 7C wird nun die Funktion des Vernebelungsgeräts 30 näher beschrieben. Eine Probe des zu vernebelnden Materials wird in die Kammer 35 eingegeben, wobei der Schlauch 46 in die Probe reicht. An die Gaseingabeöflhung 39 wird eine Druckgasquelle angeschlossen. Wenn daraufhin Druckgas durch die Öffnung 39 geleitet wird, so strömt es in die Kammer 40, nach oben durch Kanal 43 und durch die Öffnungen 44 und 49, die im allgemeinen aufeinander ausgerichtet sind, hinaus. Durch die Gasströmung wird ein Vakuum gebildet, durch das die Probe durch den Schlauch 46 und den Kanal 45 nach oben gezogen wird, durch die Probenöffnung 47 hinaus, durch den engen Raum, der an der Grenzfläche zwischen dem Oberteil der Düse 38 und dem Unterteil der Düsenkappe 48 gebildet wird zur Öffnung 49, wo sie durch das aus der Öffnung 49 austretende Gas in einen Nebel umgewandelt wird. Dieser Nebel, der als "Primärnebel" bezeichnet wird, wird auf ein kugelförmiges Element 52, das eine nichtplane Kontaktfläche bietet, gerichtet und trifft auf diese auf. Dadurch wird ein noch feinerer Nebel von noch kleineren Tröpfchen, der als "Sekundärnebel" bezeichnet wird, gebildet. Mit Hilfe des Ablenkers 53 wird dieser Sekundärnebel im großen ganzen in Kanal 55 eingesammelt, der durch die obere konkave Oberfläche des Kammerkörpers 37 gebildet wird. Nach Teilnahme am Vernebelungsvorgang entweicht Gas durch die Gasöffnung 56 nach Außen. Falls erwünscht oder notwendig, kann die Gasöffnung 56 mit einem Aerosolbarrierefilter oder einem anderen geeigneten Gerät zum Verhindern des Entweichens von Materialien, bei denen es sich nicht um Gas handelt, versehen werden.
- Der Kammerkörper 37 weist ebenfalls einen Kanal 57 auf, der mit einem Ventilelement 58 ausgestattet ist. Das Ventilelement 58 kann so betrieben werden, daß es wahlweise und reversibel (z. B. durch Ein- oder Ausschrauben des Elements 58 in oder aus dem Körper 37) eine Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Kanal 57 und dem Kanal 59 bildet, um die vernebelte Probe wieder zurück in den Behälter oder die Kammer 35 zu entleeren. Auf diese Weise kann eine im Kanal 55 eingesammelte Probe wahlweise und selektiv in die Kammer 35 zurückgeführt werden, indem das Ventilelement 58 betätigt wird. Auf diese Weise lassen sich drei Arten von Vernebelungsvorgänge mit dem Gerät 30 durchführen. Erstens kann eine Probe nur einmal vernebelt und daraufhin zur weiteren Verarbeitung aus dem Gerät 30 entfernt werden. Zweitens kann eine Chargenrückführung stattfinden, durch Vernebeln einer Probe während sich das Ventilelement 58 in geschlossener Stellung befindet. Die vernebelte Probe kann sich auf diese Weise im Kanal 55 ansammeln, bis der Vernebelungsvorgang abgeschlossen ist. Daraufhin kann die vernebelte Probe in die Probenkammer 35 dadurch zurückgeführt werden, daß man das Ventilelement 58 öffnet, woraufhin das Ventil 58 wieder geschlossen werden kann. Die Probe kann dann wieder vernebelt und der Vorgang wiederholt werden, um eine chargenweise Bedienung des Geräts 30 zu erzielen. Drittens kann das Gerät 30 im Dauerbetrieb betrieben werden, indem man beispielsweise das Ventilelement 58 während eines Vernebelungsvorgangs offen läßt. Das vernebelte Material kann dann zum erneuten Vernebeln in die Kammer 35 zurückgeführt oder in ein anderes Sammelgefäß umgeleitet werden, um das Gerät 30 auf kontinuierliche Einmaldurchlaufarbeitsweise zu betreiben.
- Zum besseren Verständnis der Prinzipien und Vorteile der Erfindung werden noch die folgenden veranschaulichenden Beispiele vorgelegt. Die in den Beispielen verwendete Lambda- und puc 19-DNA wurde von der Firma U.S. Biochemicals Company, Cleveland, Ohio, erworben. Chlamydomonas reinhardtii-DNA wurde aus dem WT 137C-Stamm durch Reinigen desselben erhalten. Chloroplast-DNA wurde durch Zentrifugieren über zwei aufeinanderfolgende CsCl&sub2;-Gradienten von Zellkern-DNA abgetrennt. Hochmolekulare Chromosomen-DNA von E. coli wurde aus Stamm C600 mi wesentlichen auf die von T. Manniatis et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebene Weise zubereitet. T4-DNA- Ligase, Klenow-Fragment und T4-DNA-Polymerase wurden von der Firma Boehringer-Mannheim Co. erworben. Der 1 kb-DNA-Leiter-Molekülgrößenstandard wurde von BRL erworben.
- Im Allgemeinen wurde die DNA in 2 ml TE-Puffer suspendiert und durch Aufbringen eines Gasdrucks unter Anwendung verschiedener Bedingungen, wie in den Beispielen beschrieben, einem Vernebelungsvorgang unterzogen. Bei Verwendung der Lambda- DNA für die Versuche wurde sie vor dem Vernebeln 10 Minuten bei 60ºC erhitzt. Nach dem Vernebeln wurden Proben der DNA auf einem 1,2%igen Standard-Agarose- Gel mit Hilfe eines TAE-Elektrophoresepuffers einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Die Negative wurden daraufhin mit Hilfe eines QuickScan-Dichteabtasters mit Bereichsintegrator abgetastet. Die durchschnittliche Größe des DNA-Fragments wurde mit Hilfe eines Computerprogramms schätzungsweise bestimmt, durch das die Position des Haupt- DNA-Peaks mit der Entfernung verglichen wird, die ein DNA-Standard im gleichen Gel überquert. Der Prozentsatz an DNA wurde berechnet, die sich im Gelbereich in einer Entfernung von +/- 200 bp von der Position des Hauptpeaks befindet, indem der sich innerhalb dieser Grenzen befindende Abtastbereich durch den gesamten DNA- Bereich geteilt und durch 100 multipliziert wurde. Die Enden der DNA-Fragmente wurden unter Zuhilfenahme von T4-DNA-Polymerase in Verbindung mit Klenow- Fragment unter Bildung stumpfer Enden einer Reparation unterzogen (wie von F.M. Auzibel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (1989) beschrieben). Die Fragmente wurden daraufhin mit T4-Ligase unter den vom Hersteller für die Stumpendverknüpfung vorgeschlagenen Bedingungen verknüpft. Der Verknüpfungsgrad wurde mittels Agarose-Gel-Elektrophorese, wie vom Hersteller der Ligase beschrieben, bestimmt.
- Mit Hilfe des oben beschriebenen Geräts und Verfahrens wurden Lambda-Phagen- DNA oder E. coli-DNA vernebelt. In Fig. 1 sind die Ergebnisse eines solchen Versuchs mit E. coli-DNA veranschaulicht. Die DNA wurde für die angegebene Zeit unter Anwendung drei verschiedener Gasdruckwerte vernebelt. Es wurden Proben gezogen und DNA-Fragmente der Größe nach unter Anwendung von Agarose-Gel- Elektrophorese abgetrennt. Die durchschnittliche Größe der dadurch erhaltenen DNA- Fragmente wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß (a) durch den Vernebelungsvorgang große DNA-Moleküle wirksam aufgebrochen werden können - innerhalb von 30 Sekunden wurden die meisten DNA-Moleküle selbst bei sehr niedrigem Gasdruck zu Fragmenten von mindestens 6000 bp abgeschert: (b) das Vernebeln von DNA ein Stationaritätsvorgang ist - nur eine sehr geringe zusätzliche Abscherung fand nach einer 90 Sekunden langen Vernebelung statt, gleichgültig, welcher Gasdruck aufgebracht wurde; und (c) die durchschnittliche Größe der DNA- Fragmente im stationären Zustand vom aufgebrachten Gasdruck abhängt.
- Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Lambda-DNA anstatt E. coli verwendet. Quantitativ wurden die gleichen Ergebnisse erhalten. Da die anfängliche Größe dieser DNA sehr unterschiedlich ist, deutet diese Ergebnis daraufhin, daß die durchschnittliche Fragmentgröße der DNA, die im stationären Zustand erhalten wird, nicht von der anfänglichen DNA-Größe abhängt.
- Um die Auswirkung des Vernebelns auf die überspiralisierte DNA zu untersuchen wurde eine geringe Menge von überspiralisierter Puc 19-DNA der die hochmolekulare DNA von E. coli enthaltenden Vernebelungsmischung zugegeben. Wegen der Form und Größe dieser überspiralisierten Moleküle sollte das überspiralisierte Plasmid-DNA dem Vernebelungsvorgang gegenüber resistent sein. Wie erwartet, zeigte die Elektrophorese, daß weder überspiralisierte Monomer- noch überspiralisierte Dimer- DNA beim Vernebelungsvorgang abgeschert wurde.
- Die Auswirkung der Konzentration der DNA auf das Aufbrechen derselben wurde bei DNA-Konzentrationen im Bereich von 2 ug/ml bis 50 ug/ml untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die anfängliche DNA-Konzentration den Grad und die Kinetik des DNA-Abscherens nur wenig beeinflußt. Fig. 2 zeigt typische Ergebnisse derartiger Versuche mit Chloroplast-DNA von Chlamydomonas reinhardtii. Die DNA wurde bei diesem Versuch mittels Gasdruck von 10 bzw. 30 psi vernebelt, und zwar wurden zwei DNA-Konzentrationen - 25 ug/ml bzw. 50 ug/ml - dieser Behandlung unterzogen. Die durchschnittliche Größe der Fragmente im stationären Zustand war bei beiden DNA-Konzentrationen bei hohem Gasdruck und bei niedrigem Gasdruck und niedriger DNA-Konzentration fast identisch. Die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente im stationären Zustand war dann höher, wenn eine hohe DNA- Konzentration und ein geringer Druck angewendet wurde (Fig. 2, Kreise). Der Grund dafür liegt darin, daß die Resistenz der DNA gegen Abscheren bei sehr hohen DNA- Konzentrationen auf Grund des Phänomens des "Selbstschutzes" steigt. Der Versuch weist im allgemeinen auch darauf hin, daß das Selbstschutzphänomen im Vernebelungsvorgang dann keine Rolle spielt, wenn die DNA-Konzentration unter ca. 25 ug/ml liegt.
- Ein wichtiger Parameter des DNA-Abschervorgangs ist seine Effizienz, die als der Prozentsatz der in einer Klasse durchschnittlicher Größe anwesenden DNA-Fragmente definiert wird. Ist der Abschervorgang effizient, so ist die Größenverteilung der DNA- Fragmente eng und die meisten DNA-Moleküle sind von ähnlicher Größe. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Größenverteilungsanalyse von bei einem Druck von 30 psi und einer Konzentration von 20 ug/ml gescherter Lambda-DNA. Die Größenverteilung Wurde als Prozentsatz der DNA-Fragmente gemessen, die im Größenbereich von +/- 200 bp, auf die durchschnittliche Fragmentgröße bezogen, vorliegen. Bei steigender Vernebelungszeitspanne nimmt die durchschnittliche Fragmentgröße von 2200 bp (30 Sekunden) auf ca. 1250 bp beim 150 Sekundenzeitpunkt (Fig. 3, Quadrate) ab.
- Gleichzeitig stieg die Effizienz der DNA-Abscherung von ca. 8% nach 30 Sekunden auf 25% im stationären Zustand, der nach ca. 100 Sekunden erreicht wurde. Dieses Verhalten veranschaulicht die Stationarität der DNA-Fragmentation während der Flüssigkeitsvernebelung, zeigt aber auch, daß die Scherkräfte, die unter den Bedingungen des Versuchs erzeugt werden, unter denen die Viskosität der Flüssigkeit gering ist, nicht ausreichen, um DNA-Moleküle auf unter ca. 1250 bp abzuscheren. Durch Erhöhen der Scherkraft kann die Größe der DNA-Fragmente im stationären Zustand reduziert und die Effizienz der DNA-Fragmentation verbessert werden.
- Die auf die DNA-Moleküle während des Vernebelns aufgebrachte Scherkraft kann nicht nur durch Ändern des Gasdrucks, sondern auch durch Erhöhen der Viskosität der Flüssigkeit erhöht werden. Experimentell kann dies durch Zusatz unterschiedlicher Mengen einer viskosen, wasserlöslichen Flüssigkeit wie Glycerin zur Vernebelungsmischung erreicht werden. In Versuchen wurde die Glycerinkonzentration von 0% auf 25% verändert, während Gasdruckwerte im Bereich von 10 psi bis 30 psi angewendet wurden. E. coli- und Lambda-DNA wurden in diesen Versuchen wiederum in einer Konzentration von 25 ug/ml verwendet. Die Ergebnisse, die mit beiden DNA erzielt wurden, waren quantitativ im wesentlichen die gleichen.
- Die Auswirkung der Glycerinkonzentration auf die durchschnittliche Fragmentgröße der DNA (25 p.g/ml) nach 120 Sekunden Vernebelung mit einem Gasdruck von 10, 20 bzw. 30 psi ist in Fig. 4 ersichtlich. Bei einem Gasdruck von 30 psi änderte sich die Größe der DNA-Fragmente von ca. 1000 bp in Abwesenheit von Glycerin auf ca. 600 bp bei einer Glycerinkonzentration von 25%. Die durchschnittliche Fragmentgröße der DNA nahm bei Glycerinkonzentrationen von über 30% (Daten nicht gezeigt) nicht wesentlich ab. Die Mindestgröße der DNA-Fragmente, die man in Gegenwart von Glycerin bei den angewendeten Druckwerten erhält, beträgt daher ca. 600 bp. Um die Größe der DNA-Fragmente noch weiter zu reduzieren, kann der Gasdruck erhöht werden.
- Fig. 5 zeigt ein Beispiel der Ergebnisse von Versuchen, die mit E. coli-DNA durchgeführt wurden, um die in Fig. 4 aufgezeigten Daten zu erhalten. Zum Vergleich enthält Fig. 5 Daten, die vorher erhalten worden waren, als E. coli-DNA in Abwesenheit von Glycerin durch einen Gasdruck von 10 psi vernebelt worden war. Die Ergebnisse zeigen, daß das Erhöhen der Viskosität eine dramatische Wirkung auf den Grad der DNA-Abscherung ausübt. Beispielsweise betrug die durchschnittliche Fragmentgröße der DNA, die bei 10 psi 30 Sekunden vernebelt wurde, 5500 bp in Abwesenheit von Glycerin und 1650 bp in Gegenwart von 25% Glycerin (vergleiche Fig. 5). Außerdem war die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße im stationären Zustand (d. h. nach einer Behandlung von I00 Sekunden) viel kleiner als diejenige, die man ohne Glycerin erhielt. Beispielsweise betrug die durchschnittliche Fragmentgröße der DNA, die bei 30 psi ohne Glycerin vernebelt wurde, 1250 bp (Fig. 1), während die durchschnittliche Größe des DNA-Fragments 600 bp betrug, wenn Glycerin in einer Konzentration von 25% vorlag.
- Eine erhöhte Viskosität der Lösung wirkte sich auch auf die Zeit aus, zu der der stationäre Zustand erreicht wurde. Die durchschnittliche Größe des DNA-Fragments änderte sich nach 80 Sekunden langem Vernebeln kaum noch (vergleiche Fig. 5).
- Änderungen der Viskosität haben eine dramatische Wirkung auf die Effizienz der DNA-Abscherung. In Fig. 6 wird das Ergebnis der Analyse der Effizienz des DNA- Abscherens bei 30 psi und mit 25% Glycerin veranschaulicht. Die Daten zeigen, daß im stationären Zustand der durchschnittlichen Größe fast 70% der Moleküle im Größenbereich von 600 bp +/- 200 bp liegen, wenn die Vernebelungsmischung 25% Glycerin enthält, im Vergleich mit nur 20%, wenn kein Glycerin vorliegt (vergleiche Fig. 3).
- Des weiteren legt eine sorgfältige Untersuchung der Fig. 6 nahe, daß die Stationarität der DNA-Größenverteilung in diesem Versuch noch nicht erreicht worden war, da die Effizienz des Vorgangs während der Vernebelungsabscherung von 30 Sekunden bis 160 Sekunden fast linear anstieg, und zwar war dies der Fall, obgleich die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente zu diesem Zeitpunkt schon die Stationarität erreicht hatte. Dies legt nahe, daß selbst nach einer Behandlung von 160 Sekunden nicht jedes DNA- Molekül wieder durch den Vernebelungskanal "zurückgeführt" worden ist. Durch Verlängern der Vernebelungsabscherzeitspanne sollte daher die Effizienz des Vorgang sich ohne Reduzierung der durchschnittlichen DNA-Größe noch weiter erhöhen lassen. Bei genügend langer Zeitdauer ist es möglich, Effizienzleistungen in der Nähe von 100% zu erreichen.
- Die durch Vernebeln gebildeten Fragmente wurden stumpfendig mit einander verknüpft oder an stumpfendiges puc 19-Plasmid angeknüpft und auf dem Gel einer Elektrophorese unterzogen. Der Verknüpfungsgrad wurde durch eine Verschiebung der durchschnittlichen Größe des DNA-Fragments auf eine größere Dimension bestimmt. Ca. 20% der Fragmente konnten stumpfendig direkt miteinander verknüpft oder an puc 19 angeknüpft werden. Dies zeigt an, daß ca. 20% der Moleküle stumpfe Enden enthalten, zumindest an einem Ende des Moleküls. Der Prozentsatz an klonierbaren Fragmenten, wie er durch Klonieren derselben in einen puc 19-Vektor mit stumpfem Ende bestimmt wurde, betrug ca. 10%. Dies zeigt an, daß nur wenige DNA-Fragmente auftreten, bei denen beide Enden stumpf sind.
- Ein ähnlicher Versuch wurde mit DNA-Fragmenten durchgeführt, bei denen die Enden vor der Verknüpfungsreaktion einer Reparation mit T4-Polymerase und Klenow- Fragment unterzogen wurden. Folglich waren 80% der reparierten Fragmente einer Stumpfendenverknüpfung fähig. Auch wurde die Klonierungseffizienz bei diesen Fragmenten auf eine Größenordnung von 80% oder mehr geschätzt. Die Enden scheinen daher in starkem Maße mit Hilfe von Standard-Endreparationsverfahren reparierbar zu sein. Durch mechanisches Abscheren während des Vernebelns gebildete Fragmente sind daher für die Erstellung zufallsbedingter Sequenzierbibliotheken gut geeignet.
- Bei diesem Versuch wurden Chlamydomonas-Zellen mit Hilfe des Vernebelungsverfahrens abgeschert. Dementsprechend wurden zwei Milliliter dieser Zellen (flüssiges Medium = gepuffertes Wasser) in einer Konzentration von 1 · 10&sup8; zentrifugiert, um die Zellen zu granulieren, woraufhin die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit bei 260 Nanometern (Nucleinsäureextinktion), 280 Nanometern (Proteinextinktion) und 652 Nanometern (Chlorophyllpigmentextinktion) bestimmt wurde. Diese Meßwerte stellten die Werte der intakten Zellen dar. Dann wurden ähnliche Zellen enthaltenden Medien jeweils 10, 30, 60 bzw. 90 Sekunden lang in dem oben beschriebenen modifizierten AEROMIST-Vernebelungsgerät (10 psi) vernebelt. Daraufhin wurden die Medien zentrifugiert und die Extinktion der überstehenden Flüssigkeiten wurde bei 260, 280 und 652 bestimmt. Der Extinktionsgrad zeigte den Grad des Freisetzens der absorbierenden Substanz in das Medium an. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 8 veranschaulicht. Sie zeigen, daß 98% der Zellen durch dieses Verfahren aufgebrochen wurden, wie durch Zellausbeute und/oder Extinktion bestimmt wurde. Die Nucleinsäuren und Proteine werden mit Hilfe von Standardverfahren von den überstehenden Flüssigkeiten abgetrennt. Bei einer anderen Versuchsreihe wurden Hefezellen durch ähnliche Verfahren aufgebrochen.
- 2 ml-Proben von Spargelblattzellen in einer Konzentration von 6 · 10&sup5; Zellen/ml (Medium = gepuffertes Wasser) wurden im modifizierten AEROMIST- Vernebelungsgerät (Gasdruck 20 psi) jeweils 1,5, 3, 4, 5 bzw. 5 Minuten zentrifugiert. Der Prozentsatz an aufgebrochenen Zellen wurde durch Zellausbeute in einer Clay- Adams-Zählkammer bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 aufgezeigt und beweisen, daß mehr als 80% der Zellen nach 5 Minuten Vernebelung aufgebrochen worden waren.
- Im Falle dieses Beispiels wurden eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um das Aufbrechen von Zellen durch das erfindungsgemäße Verfahren und durch einen Potter- Homogenisator zu vergleichen. Es wurden jeweils Sojabohnenzellkulturen für diese Versuche verwendet. Ähnlich Beispiel 9 wurden für die Extinktion der überstehenden Flüssigkeiten des aus intakten Zellen bestehenden Mediums die Kontrollwerte bei 260, 280 bzw. 652 Nanometern bestimmt. Daraufhin wurden drei Zellmedienproben einer Behandlung unterzogen, und zwar zwei mit einem Potter-Homogenisator (1 bzw. 6 Stöße) und eine mit dem modifizierten AEROMIST-Vernebelungsgerät (20 psi, 1 Minute). Die Ergebnisse sind in Fig. 10 aufgezeigt und beweisen, daß die Zellen durch 1 Minute langes Behandeln im Vernebelungsgerät auf ähnliche Weise aufbrechen, wie im Potter-Homogenisator nach 6 Stößen.
- Durch dieses Beispiel wird bewiesen, daß das erfindungsgemäße Vernebelungsverfahren in der Lage ist, abscherbare lange Polymere - bei denen es sich nicht um DNA handelt - aufzubrechen. Dementsprechend wurden 2 ml-Proben von verzweigtem Polymerstärkeazur, das von der Firma Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri erworben worden war (Katalog #S-7629) (flüssiges Medium = Wasser, Konzentration = 1 mg/ml) zubereitet. Diese Proben wurden im modifizierten AEROMIST-Vernebelungsgerät jeweils 1, 5, 7 bzw. 8 Minuten lang vernebelt, und zwar alle bei 20 psi. Die Extinktion der vernebelten Medien bei 595 Nanometern wurde zur Angabe des Ausmaßes des Aufbrechens bestimmt. Die Ergebnisse, die in Fig. 11 dargestellt sind, zeigen, daß dieses Verfahren zum Aufbrechen nicht nur eines linearen Polymers wie DNA sondern auch von verzweigten Polymeren wie Stärke und anderen verzweigten Polymeren äußerst wirksam ist.
- Hefezellen wurden dreimal mit 1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und im gleichen Puffer wieder suspendiert, wobei die Endkonzentration 2 · 10&supmin;&sup9; Zellen/ml betrug. 10 ml dieser Zellsuspension wurden bei jedem Versuch mit dem Vernebelungsgerät 30 der Abb. 7B und 7C vernebelt. Es wurde mit drei verschiedenen Druckwerten (100, 200 bzw. 300 psi) und entweder mit N&sub2; oder He gearbeitet. Nach dem Vernebeln wurde die Flüssigkeit in der oberen Kammer in die untere Kammer zurückgeführt und eine Probe von 1 ml gezogen. Der Vernebelungsvorgang wurde in Form von drei Zyklen wiederholt. Die Proben wurden zentrifugiert und die Menge an in die überstehende Flüssigkeit freigesetztem Protein durch den Bradford-Assay (OD&sub5;&sub9;&sub5;) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß He beim Aufbrechen von Zellen bei hohem Druck wirksamer ist als N&sub2;.
Claims (31)
1. Verfahren für die Fragmentation eines Biomaterials und Isolieren einer
Komponente desselben, gekennzeichnet durch
(i) die Durchführung der Fragmentation durch Vernebeln einer das Biomaterial
enthaltenden Flüssigkeit, wobei das Vernebeln das Richten der das Biomaterial
enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarnere (17) einschließt, um zu
verursachen, daß das Biomaterial unter Bildung einer Komponente des Biomaterials
fragmentiert wird, und
(ii) das Abtrennen der Komponente.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Vernebeln das wiederholte Vernebeln
der Flüssigkeit umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Komponente in im wesentlichen reiner
Form abgetrennt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Biomaterial DNA, ein Stärkepolymer
oder eine Zelle ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Biomaterial eine Zelle und die
Komponente eine Zellsubfraktion ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Zellsubfraktion DNA, ein Protein oder
eine Zellorganelle ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Zellsubfraktion ein Protein ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Zellsubfraktion DNA ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Zellsubfraktion eine Zellorganelle ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Zellorganelle ein Zellkern, ein
Mitochondrium oder ein Chloroplast ist.
11. Verfahren für die Fragmentation von isolierter DNA, das den Schritt des
Vernebelns einer die DNA enthaltenden Flüssigkeit umfaßt, wobei das Vernebeln das
Richten der die DNA enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarriere
einschließt, um zu verursachen, daß die DNA fragmentiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, das außerdem den Schritt des Abtrennens der
DNA nach dem Vernebeln umfaßt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die DNA im wesentlichen rein ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Vernebeln das wiederholte
Vernebeln der Flüssigkeit einschließt.
15. Verfahren nach Anspruch 11, das auch den Schritt des Zusetzens eines Mittels
zur Flüssigkeit zur Erhöhung ihrer Viskosität umfaßt.
16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Flüssigkeit Wasser enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das viskositätserhöhende Mittel ein
Zucker oder ein Alkohol ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das viskositätserhöhende Mittel
Glycerin, Ethylenglykol oder Saccharose ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die DNA in genügenden Mengen
zugesetzt wird, durch die durch Selbstschutz größere DNA-Endfragmente
bereitgestellt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem ein geeignetes Polymer der Flüssigkeit
zugesetzt wird in einer Menge, durch die die DNA geschützt wird und man größere
Fragmente erhält.
21. Verfahren nach Anspruch 12, das auch den Schritt des Reparierens der Enden
der DNA nach der Abtrennung umfaßt.
22. Verfahren für das Bestimmen einer Sequenz eines DNA-strings, das folgende
Schritte umfaßt: (i) Vernebeln einer Mehrfachkopien des DNA-Strangs enthaltenden
Flüssigkeit unter Bildung von DNA-Fragmenten, wobei das Vernebeln das Richten der
die Kopien enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarnere (17) einschließt, um
zu verursachen, daß die Kopien fragmentiert werden, und (ii) Bestimmen der
Fragmente, einer Sequenz des DNA-Strangs, durch Analyse.
23. Verfahren für die Bildung von DNA-Fragmenten, das das wiederholte
Vernebeln einer DNA enthaltenden Flüssigkeit umfaßt, wobei das Vernebeln das
Richten der die DNA enthaltenden Flüssigkeit auf eine Vernebelungsbarriere
einschließt, um zu verursachen, daß die DNA fragmentiert wird unter Bildung von
DNA-Fragmenten von +/-200-Basenpaaren mit einer Effizienz von mindestens ca.
30%.
24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Effizienz mindestens ca. 50%
beträgt.
25. Gerät (11; 30) für das Vernebeln einer Flüssigkeit, das eine Flüssigkeitseingabe
(12; 35) und eine Flüssigkeitsausgabe (18; 49) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß
das Gerät folgendes umfaßt:
Vorrichtungen (14; 57, 58, 59) für das Zurückführen der Flüssigkeit von der
Ausgabe (18; 49) zur Eingabe (12; 35) und
eine Vernebelungsbarnere (17; 52), die von der Ausgabe (18; 49) im Abstand
gehalten wird, zum Reduzieren der die Ausgabe (18; 49) verlassenden
Flüssigkeitstropfen zu kleineren Tröpfchen.
26. Gerät (11; 30) nach Anspruch 25, das des weiteren Vorrichtungen (19; 51, 54)
zum Einstellen des Abstands der Barriere (17; 52) von der Ausgabe (18; 49) umfaßt.
27. Gerät (11) nach Anspruch 26, das des weiteren einen Kapillarkanal zum
Speisen der Flüssigkeit zur Ausgabe (18) und eine Vorrichtung (21) zum Einstellen des
Durchmessers des Kapillarkanals umfaßt.
28. Gerät (11) nach Anspruch 27, das des weiteren eine Vorrichtung (19) zum
Auswechseln der Barriere (17) gegen eine andere Barriere (17) umfaßt.
29. Gerät nach Anspruch 28, das hermetisch versiegelt ist und außerdem ein
Gasdruckbegrenzungsventil aufweist.
30. Gerät (30) nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Gerät
folgendes umfaßt:
ein Trägerelement (31, 32) mit Innenkanälen (45, 46) die so eingepaßt sind,
daß sie eine Flüssigkeitsnebelprobe aus einer Öffnung (49) im Trägerelement abgeben;
ein oberes Element (33), das abnehmbar mit dem Trägerelement (31, 32)
verbunden ist und eine Innenkammer bildet, in die der Nebel eingeführt wird, wobei die
Vernebelungsbarriere (52) beweglich an das obere Element (33) befestigt ist, so daß
sie an ausgewählte Stellen innerhalb der Kammer gebracht werden kann derart, daß sie
mit der Flüssigkeitsnebelprobe in verschiedenen Abständen von der Öffnung (49) in
Kontakt gebracht werden kann; und
eine Stellvorrichtung (54), die sich außerhalb der oberen Kammer (33)
befindet, zum Anbringen der Vernebelungsbarriere (52) an ausgewählte Stellen.
31. Gerät nach Anspruch 30, bei dem das obere Element (33) folgendes
umfaßt:
(i) ein zylindrischer Teil, der abnehmbar mit dem Trägerelement
verbunden ist; und
(ii) ein oberes Element (54), das die beweglich mit dem zylindrischen Teil
verbundene Stellvorrichtung bildet.
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