JP3292731B2 - カルバゾール及びジベンゾフラン誘導体用のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体 - Google Patents
カルバゾール及びジベンゾフラン誘導体用のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なカルバゾール及びジベンゾフランハ
プテン化合物、連結(tethered)中間体、抗体産生に有
用な免疫原、ハプテンのアッセイに有用なトレーサー化
合物、ハプテンで標識したオリゴヌクレオチド、並びに
これらの試薬を含むキットに関する。本発明は更に、上
述の新規なハプテン及びその誘導体の種々の製造及び/
又は使用方法に関する。
プテン化合物、連結(tethered)中間体、抗体産生に有
用な免疫原、ハプテンのアッセイに有用なトレーサー化
合物、ハプテンで標識したオリゴヌクレオチド、並びに
これらの試薬を含むキットに関する。本発明は更に、上
述の新規なハプテン及びその誘導体の種々の製造及び/
又は使用方法に関する。
I.発明の背景 多くの小分子はそれ自体では抗体応答を誘発せず、適
切な免疫原性付与キャリヤー分子と結合して(免疫原に
なると)、ハプテンに対する抗体を産生し得ることは一
般に公知である。この技術は多くの文献で議論されてい
る。Erlanger,B.F.,Methods of Enzymology,70:85−1
05(Academic Press 1980)及びHurn,B.A.L.等,Metho
ds of Enzymology,70:105−(Academic Press 198
0)を参照されたい。
切な免疫原性付与キャリヤー分子と結合して(免疫原に
なると)、ハプテンに対する抗体を産生し得ることは一
般に公知である。この技術は多くの文献で議論されてい
る。Erlanger,B.F.,Methods of Enzymology,70:85−1
05(Academic Press 1980)及びHurn,B.A.L.等,Metho
ds of Enzymology,70:105−(Academic Press 198
0)を参照されたい。
オリゴヌクレオチドプローブにハプテンを付加する方
法は多数文献で知られている。このような結合体の文献
の概説は、Goodchild,Bioconjugate Chemistry,1
(3):165−187(1990)に記載されている。Enzo Bio
chemical(New York)及びClontech(Palo Alto)は
共に、ビオチン又は同様のハプテンでプローブを標識す
るための技術を含むプローブ標識技術を記載しかつ商品
化している。更には、1990年12月11日出願の同時係属中
の米国特許出願第625,566号、及び1990年12月20日出願
の米国特許出願第630,908号はそれぞれ5'末端及び3'末
端でプローブを標識する方法を教示している。前述の同
時係属中の出願明細書の全内容は、参考として本明細書
の一部を構成するものとする。ハプテンラベル、即ち
“フック”を使用して、(ハプテン化オリゴヌクレオチ
ドでハイブリダイズし、特異結合パートナーを用いてハ
プテンを回収することにより)所望の標的配列を単離す
るか、又は(例えば発蛍光団、化学発光団、コロイド粒
子もしくは酵素のような検出可能シグナル生成化合物と
抗ハプテンとの結合体を用いて、ハプテン化オリゴヌク
レオチドで標的をプローブすることにより)検出可能シ
グナル化部分を標的配列に付着させることができる。
法は多数文献で知られている。このような結合体の文献
の概説は、Goodchild,Bioconjugate Chemistry,1
(3):165−187(1990)に記載されている。Enzo Bio
chemical(New York)及びClontech(Palo Alto)は
共に、ビオチン又は同様のハプテンでプローブを標識す
るための技術を含むプローブ標識技術を記載しかつ商品
化している。更には、1990年12月11日出願の同時係属中
の米国特許出願第625,566号、及び1990年12月20日出願
の米国特許出願第630,908号はそれぞれ5'末端及び3'末
端でプローブを標識する方法を教示している。前述の同
時係属中の出願明細書の全内容は、参考として本明細書
の一部を構成するものとする。ハプテンラベル、即ち
“フック”を使用して、(ハプテン化オリゴヌクレオチ
ドでハイブリダイズし、特異結合パートナーを用いてハ
プテンを回収することにより)所望の標的配列を単離す
るか、又は(例えば発蛍光団、化学発光団、コロイド粒
子もしくは酵素のような検出可能シグナル生成化合物と
抗ハプテンとの結合体を用いて、ハプテン化オリゴヌク
レオチドで標的をプローブすることにより)検出可能シ
グナル化部分を標的配列に付着させることができる。
ある公知のオリゴヌクレオチド標識方法によれば、ラ
ベル−ホスホアミダイト試薬を調製し、これを使用して
合成中にラベルをオリゴヌクレオチドに付加する。例え
ば、Thuong,N.T.等,Tet.Letters,29(46):5905−5908
(1988)、又はCohen,J.S.等,米国特許出願第07/246,6
88号(NTIS ORDER No.PAT−APPL−7−246,688)(19
89)を参照されたい。しかしながら、DNA合成反応条件
は極めて苛酷であり(例えばヨウ素酸化及び水酸化アン
モニウム開裂)、多数のハプテン(例えばビオチン及び
フルオレセイン)は修飾しなければこれらの条件に容易
には耐えられない。不安定ハプテンに有用な他のアプロ
ーチでは、保護末端アミンを有するリンカーをオリゴヌ
クレオチドの所望の末端に結合させる。アミンを脱保護
し、より温和な条件下でラベルと反応させることができ
る。
ベル−ホスホアミダイト試薬を調製し、これを使用して
合成中にラベルをオリゴヌクレオチドに付加する。例え
ば、Thuong,N.T.等,Tet.Letters,29(46):5905−5908
(1988)、又はCohen,J.S.等,米国特許出願第07/246,6
88号(NTIS ORDER No.PAT−APPL−7−246,688)(19
89)を参照されたい。しかしながら、DNA合成反応条件
は極めて苛酷であり(例えばヨウ素酸化及び水酸化アン
モニウム開裂)、多数のハプテン(例えばビオチン及び
フルオレセイン)は修飾しなければこれらの条件に容易
には耐えられない。不安定ハプテンに有用な他のアプロ
ーチでは、保護末端アミンを有するリンカーをオリゴヌ
クレオチドの所望の末端に結合させる。アミンを脱保護
し、より温和な条件下でラベルと反応させることができ
る。
オリゴヌクレオチド自動化合成(例えばBeaucage及び
Caruthers,Tet.Letters,22(20):1859−1862(1981)
及び米国特許第4,973,679号及び第4,458,066号を参照さ
れたい)が最も効果的なプローブ製造方法である場合が
多い。しかしながら、自動化合成中に課される不利な条
件が、この方法による標識で使用できるラベルの選択を
制限する。本発明は、DNA合成のかなり苛酷な条件に耐
える新規なハプテンを用いることにより、上記欠点を克
服する。従って、本発明のハプテンを用いれば、単離又
は二次標識反応の介在を受けることなしに、自動化合成
中にオリゴヌクレオチドを直接標識することができる。
Caruthers,Tet.Letters,22(20):1859−1862(1981)
及び米国特許第4,973,679号及び第4,458,066号を参照さ
れたい)が最も効果的なプローブ製造方法である場合が
多い。しかしながら、自動化合成中に課される不利な条
件が、この方法による標識で使用できるラベルの選択を
制限する。本発明は、DNA合成のかなり苛酷な条件に耐
える新規なハプテンを用いることにより、上記欠点を克
服する。従って、本発明のハプテンを用いれば、単離又
は二次標識反応の介在を受けることなしに、自動化合成
中にオリゴヌクレオチドを直接標識することができる。
本発明は、ハプテンの特異結合パートナー(例えば抗
体)を用いて、親和性分離法により、うまく標識したオ
リゴヌクレオチドを非標識オリゴヌクレオチドから容易
に単離することができるという更なる利点を有する。
体)を用いて、親和性分離法により、うまく標識したオ
リゴヌクレオチドを非標識オリゴヌクレオチドから容易
に単離することができるという更なる利点を有する。
トレーサー分子の製造法も公知である。例えば、蛍光
偏光アッセイは、蛍光分子に結合したハプテン−被分析
物質(analyte)を含むトレーサーを必要とする。通
常、被分析物質−ハプテンと既知量のトレーサーとを、
限定された量のハプテン特異結合メンバーについて競合
させて、標識トレーサーを結合形態と遊離形態とに分け
る。結合形態由来のシグナルは遊離形態由来のシグナル
と識別可能であるので、被分析物質−ハプテンの量を推
定することができる。シグナルの識別方法のひとつは蛍
光偏光イムノアッセイ(FPIA)であり、文献及び以下に
記載されているように“ミリ偏光”、“スパン”又は
“相対強度”を測定することができる。FPIA技術は例え
ば、Jolley,M.E.,J.Analyt.Toxicol.,5:236−240(198
1)及びBlecka,L.J.Amer.Assoc.Clin.Chem.pp.1−6(1
983年3月)に記載されている。これらの文献の全内容
は参考として本明細書の一部を構成するものとする。
偏光アッセイは、蛍光分子に結合したハプテン−被分析
物質(analyte)を含むトレーサーを必要とする。通
常、被分析物質−ハプテンと既知量のトレーサーとを、
限定された量のハプテン特異結合メンバーについて競合
させて、標識トレーサーを結合形態と遊離形態とに分け
る。結合形態由来のシグナルは遊離形態由来のシグナル
と識別可能であるので、被分析物質−ハプテンの量を推
定することができる。シグナルの識別方法のひとつは蛍
光偏光イムノアッセイ(FPIA)であり、文献及び以下に
記載されているように“ミリ偏光”、“スパン”又は
“相対強度”を測定することができる。FPIA技術は例え
ば、Jolley,M.E.,J.Analyt.Toxicol.,5:236−240(198
1)及びBlecka,L.J.Amer.Assoc.Clin.Chem.pp.1−6(1
983年3月)に記載されている。これらの文献の全内容
は参考として本明細書の一部を構成するものとする。
毒性副産物の検出及び浄化に関連してポリハロゲン化
ジベンゾフランに対する抗体を産生した(即ちポリハロ
ゲン化ジベンゾフランの免疫原性を実証した)研究者も
いる。例えば、Vanderlaan等は、(2個のベンゼン環の
間に、5員の1個の酸素を有するフランの代わりに、6
員の2個の酸素を有するスペーサー環を有する点でジベ
ンゾフランと異なる)ポリハロゲン化p−ジオキシン、
及びポリハロゲン化ジベンゾフランを用いて研究を行っ
た。例えば、米国特許第4,798,807号、ヨーロッパ特許
出願公開第332 819号、Chemosphere,16(8−9):163
5−39(1987)、Toxicology,45(3);229−43(1987)
を参照されたい。Albro等の米国特許第4,238,472号は、
類似ポリ塩素化化合物に対する抗体及びこの化合物から
製造した免疫原を記載している。Albro等は、ポリ塩素
化ジオキシン及びジベンゾフランに対する抗血清が、非
塩素化物質とはほとんど反応性を有さなかったことを示
している。
ジベンゾフランに対する抗体を産生した(即ちポリハロ
ゲン化ジベンゾフランの免疫原性を実証した)研究者も
いる。例えば、Vanderlaan等は、(2個のベンゼン環の
間に、5員の1個の酸素を有するフランの代わりに、6
員の2個の酸素を有するスペーサー環を有する点でジベ
ンゾフランと異なる)ポリハロゲン化p−ジオキシン、
及びポリハロゲン化ジベンゾフランを用いて研究を行っ
た。例えば、米国特許第4,798,807号、ヨーロッパ特許
出願公開第332 819号、Chemosphere,16(8−9):163
5−39(1987)、Toxicology,45(3);229−43(1987)
を参照されたい。Albro等の米国特許第4,238,472号は、
類似ポリ塩素化化合物に対する抗体及びこの化合物から
製造した免疫原を記載している。Albro等は、ポリ塩素
化ジオキシン及びジベンゾフランに対する抗血清が、非
塩素化物質とはほとんど反応性を有さなかったことを示
している。
Pandey等,J.Immunol.Methods,94(1−2):237−46
(1986)は、3−アジド−N−エチルカルバゾールに対
する抗体及びこの化合物から製造した免疫原を記載して
いる。
(1986)は、3−アジド−N−エチルカルバゾールに対
する抗体及びこの化合物から製造した免疫原を記載して
いる。
しかしながら、上記出願人らは、本発明のカルバゾー
ル及びジベンゾフラン誘導体の抗原性又は免疫原性を実
証する技術に気づいていない。
ル及びジベンゾフラン誘導体の抗原性又は免疫原性を実
証する技術に気づいていない。
II.発明の要約: 本発明は一態様において、以下の構造式: [式中、a及びa'は単独で、独立して水素、C1−C10−
アルキル、C1−C10−アルコキシ、C1−C10−アルキルチ
オ、ハロ−C1−C10−アルキル、C1−C10−アルキルアミ
ノ、ジ−(C1−C10−アルキル)アミノ、アリール−C1
−C10−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲ
ン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキ
シ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及
びこれらの保護形態からなる群の中から選択される1〜
4個の基であるか、あるいはa及びa'は隣接しかつこれ
らに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、
Gは、S、O及びNR(Rは水素、C1−C10−アルキル,
任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニ
ル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及び
これらの保護形態である)の中から選択され、 Aは、式−L−y(式中、yは第2分子中の官能基と直
接又は活性化後に反応し得る官能基であり、Lは1〜約
50個の原子からなるスペーサー基である)の結合部分で
ある]で表されるカルバゾール及びジベンゾフラン誘導
体をベースとする化合物種から誘導される。
アルキル、C1−C10−アルコキシ、C1−C10−アルキルチ
オ、ハロ−C1−C10−アルキル、C1−C10−アルキルアミ
ノ、ジ−(C1−C10−アルキル)アミノ、アリール−C1
−C10−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲ
ン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキ
シ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及
びこれらの保護形態からなる群の中から選択される1〜
4個の基であるか、あるいはa及びa'は隣接しかつこれ
らに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、
Gは、S、O及びNR(Rは水素、C1−C10−アルキル,
任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニ
ル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及び
これらの保護形態である)の中から選択され、 Aは、式−L−y(式中、yは第2分子中の官能基と直
接又は活性化後に反応し得る官能基であり、Lは1〜約
50個の原子からなるスペーサー基である)の結合部分で
ある]で表されるカルバゾール及びジベンゾフラン誘導
体をベースとする化合物種から誘導される。
本発明は他の態様において、以下の構造式: (式中、a、a'、G及びAは先に定義した通りであり、
Qは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オ
リゴヌクレオチド又は固体支持体である)で表される結
合体化合物に関する。
Qは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オ
リゴヌクレオチド又は固体支持体である)で表される結
合体化合物に関する。
本発明は他の態様において、前記化合物(I)又は
(II)と反応性のポリクローナル又はモノクローナル抗
体に関する。このような抗体は、免疫原(II)を動物に
注射して、抗体を回収する方法により産生することがで
きる。
(II)と反応性のポリクローナル又はモノクローナル抗
体に関する。このような抗体は、免疫原(II)を動物に
注射して、抗体を回収する方法により産生することがで
きる。
更には、本発明は、以下に示す前記化合物の使用方法
に関する: 1.免疫原、トレーサー、標識オリゴヌクレオチド及び親
和性固体支持体を調製するための化合物(II)の使用; 2.抗体産生のための化合物(III:Q=免疫原性付与キャ
リヤー)の使用; 3.抗体の単離又は精製のための化合物(III:Q=固体支
持体)の使用; 4.オリゴヌクレオチドと相補的な核酸の検出のための化
合物(III:Q=オリゴヌクレオチド)の使用;及び 5.ハプテン−被分析物質類似体の検出のための化合物
(III.Q=検出可能シグナル部分)の使用。
に関する: 1.免疫原、トレーサー、標識オリゴヌクレオチド及び親
和性固体支持体を調製するための化合物(II)の使用; 2.抗体産生のための化合物(III:Q=免疫原性付与キャ
リヤー)の使用; 3.抗体の単離又は精製のための化合物(III:Q=固体支
持体)の使用; 4.オリゴヌクレオチドと相補的な核酸の検出のための化
合物(III:Q=オリゴヌクレオチド)の使用;及び 5.ハプテン−被分析物質類似体の検出のための化合物
(III.Q=検出可能シグナル部分)の使用。
最後に、本発明は更に、本発明の化合物(例えばII:y
=ホスホアミダイト又はIII:Q=オリゴヌクレオチド)
を該化合物に対し反応性の抗体と組み合わせて含んでい
るキットに関し、該抗体は、固体支持体又は検出可能ラ
ベルに結合するか又はこれらに結合するように改変(ad
apted)されている。第2の例では、オリゴヌクレオチ
ドプローブを標的でハイブリダイズし、抗体を使用して
標的を分離又は検出してもよい。第1の例では、上記と
同様に抗体を使用しつつ、ホスホアミダイトを使用して
合成中に自身のオリゴヌクレオチドを標識することがで
きる。
=ホスホアミダイト又はIII:Q=オリゴヌクレオチド)
を該化合物に対し反応性の抗体と組み合わせて含んでい
るキットに関し、該抗体は、固体支持体又は検出可能ラ
ベルに結合するか又はこれらに結合するように改変(ad
apted)されている。第2の例では、オリゴヌクレオチ
ドプローブを標的でハイブリダイズし、抗体を使用して
標的を分離又は検出してもよい。第1の例では、上記と
同様に抗体を使用しつつ、ホスホアミダイトを使用して
合成中に自身のオリゴヌクレオチドを標識することがで
きる。
III.詳細な説明: 以下の定義を本発明に適用する: “抗原”は、その通常の意味で定義され、チャレンジ
された動物の免疫又は抗体応答を誘発し得る分子又は化
合物を指す。それ自体抗原性ではない化合物は、化合物
(“ハプテン”)を“免疫原性付与キャリヤー”分子と
結合させて“免疫原”を形成することにより、免疫応答
を誘発させる場合がある。そのようなハプテンは厳密な
意味では“抗原性”とは言えないが、該ハプテンは抗原
を模倣し得、且つ抗原と共通する多くの特性を有してい
る。従って、抗原という用語とハプテンという用語はし
ばしば互換可能に用いられる。例えば、ハプテンと抗原
とは共に、本明細書に用いられる場合、抗原又はハプテ
ンと抗体との特異的結合反応に係わる抗原又はハプテン
の領域を指す少なくとも1個の“決定基”を有する。あ
る種のハプテン及び抗原は2個以上の決定基領域又は部
位を有しており、従って“多価”である。本質的に、免
疫学的な特異性を基準として抗原、従って抗体を互いに
区別するのは決定基である。
された動物の免疫又は抗体応答を誘発し得る分子又は化
合物を指す。それ自体抗原性ではない化合物は、化合物
(“ハプテン”)を“免疫原性付与キャリヤー”分子と
結合させて“免疫原”を形成することにより、免疫応答
を誘発させる場合がある。そのようなハプテンは厳密な
意味では“抗原性”とは言えないが、該ハプテンは抗原
を模倣し得、且つ抗原と共通する多くの特性を有してい
る。従って、抗原という用語とハプテンという用語はし
ばしば互換可能に用いられる。例えば、ハプテンと抗原
とは共に、本明細書に用いられる場合、抗原又はハプテ
ンと抗体との特異的結合反応に係わる抗原又はハプテン
の領域を指す少なくとも1個の“決定基”を有する。あ
る種のハプテン及び抗原は2個以上の決定基領域又は部
位を有しており、従って“多価”である。本質的に、免
疫学的な特異性を基準として抗原、従って抗体を互いに
区別するのは決定基である。
本明細書では、“ハプテン”は、以下に示すコア構
造: [式中、a及びa'は単独で、独立して水素、C1−C10−
アルキル、C1−C10−アルコキシ、C1−C10−アルキルチ
オ、ハロ−C1−C10−アルキル、C1−C10−アルキルアミ
ノ、ジ−(C1−C10−アルキル)アミノ、アリール−C1
−C10−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲ
ン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキ
シ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及
びこれらの保護形態からなる群の中から選択される1〜
4個の基であるか、あるいはa及びa'は、隣接しかつこ
れらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成
し、Gは、S、O及びNR(Rは水素、C1−C10−アルキ
ル,任意に置換されたアリール、任意に置換されたスル
ホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド
及びこれらの保護形態である)の中から選択される]で
表される任意の化合物であると定義される。
造: [式中、a及びa'は単独で、独立して水素、C1−C10−
アルキル、C1−C10−アルコキシ、C1−C10−アルキルチ
オ、ハロ−C1−C10−アルキル、C1−C10−アルキルアミ
ノ、ジ−(C1−C10−アルキル)アミノ、アリール−C1
−C10−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲ
ン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキ
シ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及
びこれらの保護形態からなる群の中から選択される1〜
4個の基であるか、あるいはa及びa'は、隣接しかつこ
れらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成
し、Gは、S、O及びNR(Rは水素、C1−C10−アルキ
ル,任意に置換されたアリール、任意に置換されたスル
ホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド
及びこれらの保護形態である)の中から選択される]で
表される任意の化合物であると定義される。
前述したように、“免疫原”という用語は、ハプテン
又は抗原とキャリヤー分子との結合体を指す。キャリヤ
ーはタンパク質又はペプチドであることが多い。公知の
免疫原性付与キャリヤーには、例えば天然ポリ(アミノ
酸)、アルブミン及び血清タンパク質(例えばウシチロ
グロブリン(BTG)、グロブリン、リポタンパク質、眼
球レンズタンパク質、ウシ血清アルブミン(BSA)、キ
ーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、卵オボアル
ブミン、ウシガンマグロブリン(BGG)、チロキシン結
合グロブリン(TBG)等)が含まれる。あるいは、ポリ
リシン等のような合成ポリ(アミノ酸)を使用すること
ができる。しかしながら、ハプテンに抗原性を付与し得
るいずれの分子も“免疫原性付与キャリヤー”である。
又は抗原とキャリヤー分子との結合体を指す。キャリヤ
ーはタンパク質又はペプチドであることが多い。公知の
免疫原性付与キャリヤーには、例えば天然ポリ(アミノ
酸)、アルブミン及び血清タンパク質(例えばウシチロ
グロブリン(BTG)、グロブリン、リポタンパク質、眼
球レンズタンパク質、ウシ血清アルブミン(BSA)、キ
ーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、卵オボアル
ブミン、ウシガンマグロブリン(BGG)、チロキシン結
合グロブリン(TBG)等)が含まれる。あるいは、ポリ
リシン等のような合成ポリ(アミノ酸)を使用すること
ができる。しかしながら、ハプテンに抗原性を付与し得
るいずれの分子も“免疫原性付与キャリヤー”である。
本明細書に用いられている“ハプテン特異的結合メン
バー”という用語は、ハプテンに特異的に結合する抗体
又はレセプターのようなメンバーを指す。ハプテン上の
決定基は、ハプテンに対する結合メンバーの特異的結合
に関与する。最も一般的且つ通常の特異的結合メンバー
は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。
バー”という用語は、ハプテンに特異的に結合する抗体
又はレセプターのようなメンバーを指す。ハプテン上の
決定基は、ハプテンに対する結合メンバーの特異的結合
に関与する。最も一般的且つ通常の特異的結合メンバー
は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。
一般に、“アルキル”、“アルケニル”及び“アリー
ル”といった用語は、有機化学分野の当業者が通常該用
語に属すると考える意味を有する。例えば、アルキル
は、アルカンから水素1個を除去して誘導され得、一般
式CnH2n+1を有する一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指
す。アルキル置換基は、1〜約30個、より実際的には1
〜約20個の炭素を有していてよい。“低級アルキル”と
は、1〜約10個の炭素を有するアルキルを指す。低級ア
ルキルの例には、CH3−、CH3CH2−、CH3CH(CH3)−及
びCH3(CH2)4−が含まれる。
ル”といった用語は、有機化学分野の当業者が通常該用
語に属すると考える意味を有する。例えば、アルキル
は、アルカンから水素1個を除去して誘導され得、一般
式CnH2n+1を有する一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指
す。アルキル置換基は、1〜約30個、より実際的には1
〜約20個の炭素を有していてよい。“低級アルキル”と
は、1〜約10個の炭素を有するアルキルを指す。低級ア
ルキルの例には、CH3−、CH3CH2−、CH3CH(CH3)−及
びCH3(CH2)4−が含まれる。
“アルキレン”とは、直鎖又は分枝鎖飽和炭化水素か
ら水素原子2個を除去して誘導される二価の基を指す。
その例には、メチレン、1,2−エチレン、1,3−プロピレ
ン、2,2−ジメチルプロピレンなどが含まれる。
ら水素原子2個を除去して誘導される二価の基を指す。
その例には、メチレン、1,2−エチレン、1,3−プロピレ
ン、2,2−ジメチルプロピレンなどが含まれる。
“ハロ−C1−C10−アルキル”とは、以下に定義され
ているような、少なくとも1個のハロゲン置換基を有す
る低級アルキル基、例えば、クロロメチル、フルオロメ
チル、クロロエチル、トリフルオロメチルなどを指す。
ているような、少なくとも1個のハロゲン置換基を有す
る低級アルキル基、例えば、クロロメチル、フルオロメ
チル、クロロエチル、トリフルオロメチルなどを指す。
“C1−C10−アルコキシ”とは、酸素原子を介して結
合された上記に定義のようなアルキル基を指す。そのよ
うなアルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、t−
ブトキシなどが含まれる。
合された上記に定義のようなアルキル基を指す。そのよ
うなアルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、t−
ブトキシなどが含まれる。
“C1−C10−アルキルアミノ”とは、メチルアミノ、
エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、プロ
ピルアミノ及びエチルメチルアミノを含む、上記に定義
されているような1個又は2個の低級アルキル基で置換
されたアミノ基を指す。
エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、プロ
ピルアミノ及びエチルメチルアミノを含む、上記に定義
されているような1個又は2個の低級アルキル基で置換
されたアミノ基を指す。
“C1−C10−アルキルチオ”とは、メチルチオ、エチ
ルチオ、ジメチルチオ及びジエチルチオを含む、上記に
定義のような1個又は2個の低級アルキル基で置換され
たチオ基を指す。
ルチオ、ジメチルチオ及びジエチルチオを含む、上記に
定義のような1個又は2個の低級アルキル基で置換され
たチオ基を指す。
“アルケニル”とは、アルケンから水素原子1個を除
去することにより誘導され得、一般式CnH2n-1を有する
一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指す。アルケニル置換
基は、1〜約30個、より実際的には1〜約20個の炭素を
有していてよい。“低級アルケニル”とは、1〜約10個
の炭素を有するアルケニルを指す。“オレフィン性”と
いう用語はアルケニルと同義語である。
去することにより誘導され得、一般式CnH2n-1を有する
一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指す。アルケニル置換
基は、1〜約30個、より実際的には1〜約20個の炭素を
有していてよい。“低級アルケニル”とは、1〜約10個
の炭素を有するアルケニルを指す。“オレフィン性”と
いう用語はアルケニルと同義語である。
“アリール”とは、芳香族炭化水素又はヘテロ芳香族
化合物から水素1個を除去して誘導される一価の基を指
す。アリール置換基は、フェニル、ナフチル及び2−チ
エニルが有しているような環構造を有している。典型的
には、アリール置換基は平面の対向側部に残留する各炭
素のπ電子雲と同一平面内にある。アリール置換基はヒ
ュッケル(4n+2)π電子規則に適う。
化合物から水素1個を除去して誘導される一価の基を指
す。アリール置換基は、フェニル、ナフチル及び2−チ
エニルが有しているような環構造を有している。典型的
には、アリール置換基は平面の対向側部に残留する各炭
素のπ電子雲と同一平面内にある。アリール置換基はヒ
ュッケル(4n+2)π電子規則に適う。
“アリールアルキル”とは、上記に定義のような1〜
2個の低級アルキル基で置換された上記定義のアリール
基を指す。
2個の低級アルキル基で置換された上記定義のアリール
基を指す。
保護基は、特定条件下では除去できるが、他の条件下
では中間反応中に反応性原子又は官能基を一時的に保護
又は隠蔽する基と定義される。ヒドロキシル、アミノ及
びチオール官能基の保護基は当業界ではよく知られてい
る(T.W.Greene,Protective Groups in Organic Sy
nthesis,John Wiley and Sons,NY,1981)。ヒドロキ
シル官能基は通常、アルキル若しくはアリールエーテル
(アルキル、アリール、アルケニル)、シリルエーテル
(シリル)、エステル(アシル)、カーボネート(−C
(=O)−O−アルキル、−C(=O)−O−アリー
ル、−C(=O)−O−アルケニル)及びカルバメート
(−C(=O)−NH−アルキル、−C(=O)−NH−ア
リール、−C(=O)−NH−アルケニル)として保護さ
れる。アミノ官能基は通常、カルバメート(−C(=
O)−O−アルキル、−C(=O)−O−アリール、−
C(=O)−O−アルケニル)、アミド(−C(=O)
−アルキル、−C(=O)−アリール、−C(=O)−
アルケニル)、環式イミド(フタロイル)、N−ベンジ
ル誘導体〔−CH(n)アリール(3-n),n=1〜3〕、イミン
誘導体〔=CH(n)アルキル(2-n),=CH(n)アリール(2-n),
n=0〜2〕、シリル誘導体(シリル)、N−スルフェ
ニル誘導体〔S−アリール、−S−CH(n)アリー
ル(3-n),n=0〜3〕、及びN−スルホニル誘導体(−S
O2−アリール、−SO2−アルキル)として保護される。
チオール官能基は通常、チオエーテル〔−CH(n)アリー
ル(3-n),n=1−3,アルキル〕、チオエステル(アシ
ル)、チオカーボネート〔−C(=O)−O−アルキ
ル、−C(=O)−O−アリール、−C(=O)−O−
アルケニル〕、チオカルバメート〔−C(=O)−NH−
アルキル、−C(=O)−NH−アリール、−C(=O)
−NH−アルケニル〕、及びジスルフィド(−S−アルキ
ル、アリール)として保護される。2個以上の保護基が
必要な場合には、各基を種々の保護基から独立に選択し
てよいことが理解されよう。実際、当業者はどの保護基
がどの官能基に対して慣用的であるかわかっている筈で
ある。
では中間反応中に反応性原子又は官能基を一時的に保護
又は隠蔽する基と定義される。ヒドロキシル、アミノ及
びチオール官能基の保護基は当業界ではよく知られてい
る(T.W.Greene,Protective Groups in Organic Sy
nthesis,John Wiley and Sons,NY,1981)。ヒドロキ
シル官能基は通常、アルキル若しくはアリールエーテル
(アルキル、アリール、アルケニル)、シリルエーテル
(シリル)、エステル(アシル)、カーボネート(−C
(=O)−O−アルキル、−C(=O)−O−アリー
ル、−C(=O)−O−アルケニル)及びカルバメート
(−C(=O)−NH−アルキル、−C(=O)−NH−ア
リール、−C(=O)−NH−アルケニル)として保護さ
れる。アミノ官能基は通常、カルバメート(−C(=
O)−O−アルキル、−C(=O)−O−アリール、−
C(=O)−O−アルケニル)、アミド(−C(=O)
−アルキル、−C(=O)−アリール、−C(=O)−
アルケニル)、環式イミド(フタロイル)、N−ベンジ
ル誘導体〔−CH(n)アリール(3-n),n=1〜3〕、イミン
誘導体〔=CH(n)アルキル(2-n),=CH(n)アリール(2-n),
n=0〜2〕、シリル誘導体(シリル)、N−スルフェ
ニル誘導体〔S−アリール、−S−CH(n)アリー
ル(3-n),n=0〜3〕、及びN−スルホニル誘導体(−S
O2−アリール、−SO2−アルキル)として保護される。
チオール官能基は通常、チオエーテル〔−CH(n)アリー
ル(3-n),n=1−3,アルキル〕、チオエステル(アシ
ル)、チオカーボネート〔−C(=O)−O−アルキ
ル、−C(=O)−O−アリール、−C(=O)−O−
アルケニル〕、チオカルバメート〔−C(=O)−NH−
アルキル、−C(=O)−NH−アリール、−C(=O)
−NH−アルケニル〕、及びジスルフィド(−S−アルキ
ル、アリール)として保護される。2個以上の保護基が
必要な場合には、各基を種々の保護基から独立に選択し
てよいことが理解されよう。実際、当業者はどの保護基
がどの官能基に対して慣用的であるかわかっている筈で
ある。
本明細書中、“結合部分"Aは“連結部”(tether)と
も称される。これらの用語は、式: −L−y (式中、yは直接又は活性化後に第二分子、例えば結合
パートナーQ中の官能基と反応し得る反応性官能基であ
り、Lは1〜50個の炭素及びヘテロ原子からなるスペー
サー基である) で表されるスペーサー分子を指す。典型的には、Lは、
10個以下のヘテロ原子を含み、飽和又は不飽和の直鎖若
しくは分枝鎖又は環式部分として配置されるが、但し、
2個以下のヘテロ原子は配列−L−y中で直接結合し
得、配列−L−yは−O−O−結合を含み得ず、環式部
分は6個以下のメンバーを含み、且つ分枝は炭素原子上
でのみ生起され得る。Aが既にQに結合している式にお
いては、基yが該式から脱離して、A=−L−となって
いる。
も称される。これらの用語は、式: −L−y (式中、yは直接又は活性化後に第二分子、例えば結合
パートナーQ中の官能基と反応し得る反応性官能基であ
り、Lは1〜50個の炭素及びヘテロ原子からなるスペー
サー基である) で表されるスペーサー分子を指す。典型的には、Lは、
10個以下のヘテロ原子を含み、飽和又は不飽和の直鎖若
しくは分枝鎖又は環式部分として配置されるが、但し、
2個以下のヘテロ原子は配列−L−y中で直接結合し
得、配列−L−yは−O−O−結合を含み得ず、環式部
分は6個以下のメンバーを含み、且つ分枝は炭素原子上
でのみ生起され得る。Aが既にQに結合している式にお
いては、基yが該式から脱離して、A=−L−となって
いる。
典型的には、yは、ヒドロキシ(−OH)、チオール
(−SH)、カルボキシ(−C(=O)OH)、アミノ(−
NH2)、アルデヒド(−CH(=O))、離脱基、マイケ
ル受容体、ホスホアミダイト、ホスホネート及びこれら
の官能基の保護形態からなる群から選択される。合成の
際には、結合部分はしばしば、x−L−y〔ここで、x
もハプテン又は−R上の官能基と反応し得る官能基(y
と同じ群から選択される)である〕で示される二官能性
化合物からなる。多くの二官能性結合物質が当業者には
公知である。例えば、ヘテロ二官能性結合物質が、例え
ば米国特許第5,002,883号(Bieniarz)に記載されてい
る。これらの結合物質は、該物質の末端が異なる官能基
に対して特異性を有するために好ましい場合がある。
“マイケル受容体”は当業界では以下のように定義され
ている: “α,β−不飽和ケトン、アルデヒド、ニトリル又はカ
ルボン酸誘導体の炭素−炭素二重結合へのエノラート
(又は類似)アニオンの求核付加はマイケル反応として
知られているプロセスであり...しばしばマイケル受容
体と称されるこの反応における不飽和化合物は、カルバ
ニオン中間体を安定化し得る官能基を有する任意の不飽
和系を含み得る...マイケル受容体には更にアルコー
ル、チオール及びアミンのような種々の求核剤を付加し
得る。“H.O.House,Modern Synthetic Reactions,W.
A.Benjamin,Inc.,Menlo Park CA,1972,595−596ペー
ジ。この種の求核付加(それによってマイケル受容体が
形成される)に対して二重結合を活性化し得る一般官能
基には、−CH(=O)、−C(=O)R†、−C(=
O)NH2、−CN、−NO2、−S(=O)R†、−S(=
O)2R†(ここで、R†はアルキルであってもアリール
であってもよい)が含まれる。従って、マイケル受容体
の例としては、 〔ここで、d、e及びfは独立して、水素、アルキル又
はアリールであり得、Uは、−CH(=O)、C(=O)
R†、−C(=O)NH2、−CN、−NO2、−S(=O)R
†及び−S(=O)2R†の中から選択され、R†はこの
場合もアルキル又はアリールである〕 が挙げられる。特に好ましいマイケル受容体はマレイミ
ドである: 固体支持体は多岐にわたる支持体材料を指す。ポリマー
プラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン及
びポリテトラフルオロエチレン)がその例である。ガラ
スも有用な支持体である。支持体は、ビーズ、微粒子、
チューブ、ロッド、プレート、ウエル及びキュベットを
含む任意のサイズ又は形状のものであってよい。支持体
は、結合用の官能基を含んでいてもよいし、又は結合前
に誘導体化してもよい。あるいは、支持体をコーティン
グしたり又は吸着させてもよい場合がある。支持体は、
サイズ、重量、形状、電荷、磁気特性又は他の物理特性
に基づいて、試薬溶液から物理的に分離可能でなければ
ならない。本明細書には、固体支持体の2種の異なる使
用が記載されていることが理解されよう。第1に、抗体
は連結中間体に結合した支持体を用いて精製し得、第2
に、抗ハプテン抗体が付着した支持体は、ハプテン標識
したオリゴヌクレオチドの分離及び/又は検出、並びに
競合ハプテン−類似体アッセイに有用である。
(−SH)、カルボキシ(−C(=O)OH)、アミノ(−
NH2)、アルデヒド(−CH(=O))、離脱基、マイケ
ル受容体、ホスホアミダイト、ホスホネート及びこれら
の官能基の保護形態からなる群から選択される。合成の
際には、結合部分はしばしば、x−L−y〔ここで、x
もハプテン又は−R上の官能基と反応し得る官能基(y
と同じ群から選択される)である〕で示される二官能性
化合物からなる。多くの二官能性結合物質が当業者には
公知である。例えば、ヘテロ二官能性結合物質が、例え
ば米国特許第5,002,883号(Bieniarz)に記載されてい
る。これらの結合物質は、該物質の末端が異なる官能基
に対して特異性を有するために好ましい場合がある。
“マイケル受容体”は当業界では以下のように定義され
ている: “α,β−不飽和ケトン、アルデヒド、ニトリル又はカ
ルボン酸誘導体の炭素−炭素二重結合へのエノラート
(又は類似)アニオンの求核付加はマイケル反応として
知られているプロセスであり...しばしばマイケル受容
体と称されるこの反応における不飽和化合物は、カルバ
ニオン中間体を安定化し得る官能基を有する任意の不飽
和系を含み得る...マイケル受容体には更にアルコー
ル、チオール及びアミンのような種々の求核剤を付加し
得る。“H.O.House,Modern Synthetic Reactions,W.
A.Benjamin,Inc.,Menlo Park CA,1972,595−596ペー
ジ。この種の求核付加(それによってマイケル受容体が
形成される)に対して二重結合を活性化し得る一般官能
基には、−CH(=O)、−C(=O)R†、−C(=
O)NH2、−CN、−NO2、−S(=O)R†、−S(=
O)2R†(ここで、R†はアルキルであってもアリール
であってもよい)が含まれる。従って、マイケル受容体
の例としては、 〔ここで、d、e及びfは独立して、水素、アルキル又
はアリールであり得、Uは、−CH(=O)、C(=O)
R†、−C(=O)NH2、−CN、−NO2、−S(=O)R
†及び−S(=O)2R†の中から選択され、R†はこの
場合もアルキル又はアリールである〕 が挙げられる。特に好ましいマイケル受容体はマレイミ
ドである: 固体支持体は多岐にわたる支持体材料を指す。ポリマー
プラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン及
びポリテトラフルオロエチレン)がその例である。ガラ
スも有用な支持体である。支持体は、ビーズ、微粒子、
チューブ、ロッド、プレート、ウエル及びキュベットを
含む任意のサイズ又は形状のものであってよい。支持体
は、結合用の官能基を含んでいてもよいし、又は結合前
に誘導体化してもよい。あるいは、支持体をコーティン
グしたり又は吸着させてもよい場合がある。支持体は、
サイズ、重量、形状、電荷、磁気特性又は他の物理特性
に基づいて、試薬溶液から物理的に分離可能でなければ
ならない。本明細書には、固体支持体の2種の異なる使
用が記載されていることが理解されよう。第1に、抗体
は連結中間体に結合した支持体を用いて精製し得、第2
に、抗ハプテン抗体が付着した支持体は、ハプテン標識
したオリゴヌクレオチドの分離及び/又は検出、並びに
競合ハプテン−類似体アッセイに有用である。
動物に、以下に記載の免疫原に対する免疫応答を生起
させて抗体を産生させる。当業界で一般に公知の技術に
従って、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ又はウシのよ
うな動物に免疫原を一連の注射により投与する。本発明
により、上記のハプテンから誘導された本発明の免疫原
に応答して抗体を産生させる。ポリクローナル抗体もモ
ノクローナル抗体も免疫原上の特異的なエピトープを認
識し、本発明では一般にポリクローナル抗体を用いた
が、どちらも適当な抗体であり得る。ポリクローナル抗
体は、それぞれが特異的なエピトープを認識し、キャリ
ヤー分子上に存在し得るものもある多数の抗体の混合物
からなる。ポリクローナル抗体の産生技術は一般に当業
界ではよく知られている。免疫原のハプテン部分に対し
て特異的な抗体の単離は当業者が容易になし得る技術で
ある。アフィニティークロマトグラフィーが一つの方法
である。
させて抗体を産生させる。当業界で一般に公知の技術に
従って、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ又はウシのよ
うな動物に免疫原を一連の注射により投与する。本発明
により、上記のハプテンから誘導された本発明の免疫原
に応答して抗体を産生させる。ポリクローナル抗体もモ
ノクローナル抗体も免疫原上の特異的なエピトープを認
識し、本発明では一般にポリクローナル抗体を用いた
が、どちらも適当な抗体であり得る。ポリクローナル抗
体は、それぞれが特異的なエピトープを認識し、キャリ
ヤー分子上に存在し得るものもある多数の抗体の混合物
からなる。ポリクローナル抗体の産生技術は一般に当業
界ではよく知られている。免疫原のハプテン部分に対し
て特異的な抗体の単離は当業者が容易になし得る技術で
ある。アフィニティークロマトグラフィーが一つの方法
である。
ただ一つの決定基又はエピトープに特異的なモノクロ
ーナル抗体は、上記のような免疫応答を誘発させること
により産生し得る。適切なインキュベーション及び追加
免疫注射の後、標準法により動物の脾臓からB−リンパ
球細胞を取り出し、次いで、Kohler及びMilstein,“Con
tinuous Culture of Fused Cells Secreting Ant
ibody of Predefined Specificity,"Nature,256,495
(1975)に記載のもののような標準的な方法によりB−
リンパ球細胞を骨髄腫融合パートナーと融合させる。
ーナル抗体は、上記のような免疫応答を誘発させること
により産生し得る。適切なインキュベーション及び追加
免疫注射の後、標準法により動物の脾臓からB−リンパ
球細胞を取り出し、次いで、Kohler及びMilstein,“Con
tinuous Culture of Fused Cells Secreting Ant
ibody of Predefined Specificity,"Nature,256,495
(1975)に記載のもののような標準的な方法によりB−
リンパ球細胞を骨髄腫融合パートナーと融合させる。
本明細書に用いられている“ラベル”とは、直接検出
可能なシグナルを生成し得るラベル、及び間接的に検出
され得るハプテンのような分子を指す。この意味で、
“ラベル”は“リポーター”又は“フック”と互換可能
である。しかし、“ラベル”と、通常は電磁線シグナル
である測定し得る検出可能シグナルを生成し得る部分と
を区別する必要がある場合もある。ハプテンタイプのラ
ベル又は“フック”と区別する必要がある場合には、
“検出可能ラベル”若しくは“シグナル化(signalin
g)”ラベル又は部分という用語を用いる。
可能なシグナルを生成し得るラベル、及び間接的に検出
され得るハプテンのような分子を指す。この意味で、
“ラベル”は“リポーター”又は“フック”と互換可能
である。しかし、“ラベル”と、通常は電磁線シグナル
である測定し得る検出可能シグナルを生成し得る部分と
を区別する必要がある場合もある。ハプテンタイプのラ
ベル又は“フック”と区別する必要がある場合には、
“検出可能ラベル”若しくは“シグナル化(signalin
g)”ラベル又は部分という用語を用いる。
“トレーサー”という用語は、ハプテンと検出可能シ
グナル化ラベルとの結合体を指す。トレーサーにより、
未知溶液中に存在するハプテンの量の測定又はアッセイ
が可能となる。トレーサーのシグナル化ラベルは以下に
記載の蛍光分子であることが好ましいが、該ラベルは、
例えば、放射性同位体、化学発光団及びコロイド粒子を
含むがそれらには限定されない他の検出可能なラベルを
包含し得る。FPIAにおいて、トレーサーを形成するため
の蛍光分子の選択はフレキシブルであることが有利であ
り、多分に専門家の選択による。蛍光ラベルはそれらの
サイズに応じて選択されることが理想的であり、即ち、
分子が小さければ小さい程分子の回転速度が高くなり
得、従ってFPIAトレーサー成分としてより有効になるこ
とが容易に理解されよう。本発明において好ましい蛍光
ラベルはフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体であ
る。これらの化合物は、適切な波長の偏光により励起さ
れると蛍光応答を生成し、それによって蛍光偏光測定が
可能になる。例えば、以下のフルオレセイン誘導体のい
ずれを用いてもよい:フルオレセインアミン、カルボキ
シフルオレセイン、a−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン、4′−アミノメチルフルオレセイン、4′−N−
アルキルアミノメチルフルオレセイン、5−アミノメチ
ルフルオレセイン、2,4−ジクロロ−1,3,5−トリアジン
−2−イル−アミノフルオレセイン(DTAF),4−クロロ
−6−メトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル−アミ
ノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト。特に好ましい誘導体は、アミノメチルフルオレセイ
ン及び5−カルボキシフルオレセインである。特に他の
検出技術に関連した他のトレーサーの検出可能ラベルも
当該文献において公知である。
グナル化ラベルとの結合体を指す。トレーサーにより、
未知溶液中に存在するハプテンの量の測定又はアッセイ
が可能となる。トレーサーのシグナル化ラベルは以下に
記載の蛍光分子であることが好ましいが、該ラベルは、
例えば、放射性同位体、化学発光団及びコロイド粒子を
含むがそれらには限定されない他の検出可能なラベルを
包含し得る。FPIAにおいて、トレーサーを形成するため
の蛍光分子の選択はフレキシブルであることが有利であ
り、多分に専門家の選択による。蛍光ラベルはそれらの
サイズに応じて選択されることが理想的であり、即ち、
分子が小さければ小さい程分子の回転速度が高くなり
得、従ってFPIAトレーサー成分としてより有効になるこ
とが容易に理解されよう。本発明において好ましい蛍光
ラベルはフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体であ
る。これらの化合物は、適切な波長の偏光により励起さ
れると蛍光応答を生成し、それによって蛍光偏光測定が
可能になる。例えば、以下のフルオレセイン誘導体のい
ずれを用いてもよい:フルオレセインアミン、カルボキ
シフルオレセイン、a−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン、4′−アミノメチルフルオレセイン、4′−N−
アルキルアミノメチルフルオレセイン、5−アミノメチ
ルフルオレセイン、2,4−ジクロロ−1,3,5−トリアジン
−2−イル−アミノフルオレセイン(DTAF),4−クロロ
−6−メトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル−アミ
ノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト。特に好ましい誘導体は、アミノメチルフルオレセイ
ン及び5−カルボキシフルオレセインである。特に他の
検出技術に関連した他のトレーサーの検出可能ラベルも
当該文献において公知である。
“オリゴヌクレオチド”(しばしば“オリゴ”と略記
される)という用語は、最低で約5個のヌクレオチド、
最大で数百個のヌクレオチドを有する核酸の短セグメン
トを指す。約30個より長いヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドはしばしばポリヌクレオチドと称される
が、本明細書においてオリゴヌクレオチドという用語
は、そのような長鎖のものも包含するように用いられて
いる。核酸はRNAでもDNAでもよいが、一般にDNAが好ま
しい。DNAは天然のものでも合成のものでもよいが、本
発明はDNAの自動化合成において優れている。
される)という用語は、最低で約5個のヌクレオチド、
最大で数百個のヌクレオチドを有する核酸の短セグメン
トを指す。約30個より長いヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドはしばしばポリヌクレオチドと称される
が、本明細書においてオリゴヌクレオチドという用語
は、そのような長鎖のものも包含するように用いられて
いる。核酸はRNAでもDNAでもよいが、一般にDNAが好ま
しい。DNAは天然のものでも合成のものでもよいが、本
発明はDNAの自動化合成において優れている。
A.試薬 1.ハプテン a.ハプテンの構造 構造的にカルバゾール又はジベンゾフランに類似して
いるハプテンは、以下の一般構造式: (式中、GはO(ジベンゾフラン)又はNR(カルバゾー
ル)であり、a、a'及びAは先に定義した通りである)
で表される。
いるハプテンは、以下の一般構造式: (式中、GはO(ジベンゾフラン)又はNR(カルバゾー
ル)であり、a、a'及びAは先に定義した通りである)
で表される。
b.ハプテンの合成 慣用的な化学的手法により、市販のカルバゾール及び
ジベンゾフランコア構造を用いてハプテン誘導体を製造
することができる。合成の詳細は実施例で説明する。
ジベンゾフランコア構造を用いてハプテン誘導体を製造
することができる。合成の詳細は実施例で説明する。
更に、置換基a及びa′が隣接し且つ一緒になって縮
合環を形成している場合には該置換基には制限があるこ
とは当業者が理解するところであろう。フェニルに縮合
した環は通常4〜10個の原子、好ましくは6〜8個の原
子を有している。
合環を形成している場合には該置換基には制限があるこ
とは当業者が理解するところであろう。フェニルに縮合
した環は通常4〜10個の原子、好ましくは6〜8個の原
子を有している。
c.連結中間体 リンカー分子x−L−y(別の分子又は高分子上の相
補的反応性基に結合し得る反応性官能基x及びyを含
む)を用い、当業者には公知の方法によりハプテンを変
換させて、連結部又は側鎖−L−yを有するハプテン中
間体化合物を生成させる。勿論、ハプテン分子の残留部
分は所望の決定基の構造と実質的に類似した構造を保有
している。ハプテンを別の分子に結合させる多くの方法
が当業界では公知である。好ましい方法は、ハプテン又
はリンカー上の官能基を活性化させ、活性化された基を
介してリンカー又は連結部をハプテンに結合させること
を含む。連結部の自由末端yは、所望の結合体分子Qと
の結合に利用可能である。当業界では公知のように、Q
上の官能基を活性化させることが望ましい場合があり、
第2のリンカーを用いる場合もある。所望のy基に応じ
て、(合成を容易にするために)連結部をハプテンに結
合させた後にyを別のyと(例えばホスホアミダイト又
はホスホネートをヒドロキシルと)交換することが好ま
しい場合もある。
補的反応性基に結合し得る反応性官能基x及びyを含
む)を用い、当業者には公知の方法によりハプテンを変
換させて、連結部又は側鎖−L−yを有するハプテン中
間体化合物を生成させる。勿論、ハプテン分子の残留部
分は所望の決定基の構造と実質的に類似した構造を保有
している。ハプテンを別の分子に結合させる多くの方法
が当業界では公知である。好ましい方法は、ハプテン又
はリンカー上の官能基を活性化させ、活性化された基を
介してリンカー又は連結部をハプテンに結合させること
を含む。連結部の自由末端yは、所望の結合体分子Qと
の結合に利用可能である。当業界では公知のように、Q
上の官能基を活性化させることが望ましい場合があり、
第2のリンカーを用いる場合もある。所望のy基に応じ
て、(合成を容易にするために)連結部をハプテンに結
合させた後にyを別のyと(例えばホスホアミダイト又
はホスホネートをヒドロキシルと)交換することが好ま
しい場合もある。
1つの可能な一般的活性化/結合スキームを以下に示
す。特定例は所望生成物を製造するための種々の手段に
応じる。
す。特定例は所望生成物を製造するための種々の手段に
応じる。
ヒドロキシル基を有するハプテン(I)を活性化リン
カー又は連結部分子x−L−y(式中、xは脱離基であ
り、Lは先に定義したスペーサー基であり、yはヒドロ
キシ、カルボキシ及びアミノからなる群の中から選択さ
れる)と反応させて、連結中間体(II)を生成する。例
えば、ハプテンヒドロキシルを塩基中で4−ブロモ酪酸
エチル(ここで、xはBr、Lは−(CH2)3−、yはCO2
C2H5である)と反応させてもよい。従って、連結部−L
−yは−O(CH2)3−CO2C2H5になる。エチルエステル
を鹸化により脱保護し、カルボン酸にしてもよい。カル
ボン酸は、結合体パートナーQの官能基と反応し得る反
応性基である。これらの各反応工程の反応条件は、実施
例の項の特定例又は当該文献から得ることができる。
カー又は連結部分子x−L−y(式中、xは脱離基であ
り、Lは先に定義したスペーサー基であり、yはヒドロ
キシ、カルボキシ及びアミノからなる群の中から選択さ
れる)と反応させて、連結中間体(II)を生成する。例
えば、ハプテンヒドロキシルを塩基中で4−ブロモ酪酸
エチル(ここで、xはBr、Lは−(CH2)3−、yはCO2
C2H5である)と反応させてもよい。従って、連結部−L
−yは−O(CH2)3−CO2C2H5になる。エチルエステル
を鹸化により脱保護し、カルボン酸にしてもよい。カル
ボン酸は、結合体パートナーQの官能基と反応し得る反
応性基である。これらの各反応工程の反応条件は、実施
例の項の特定例又は当該文献から得ることができる。
2 免疫原 a.免疫原の構造 免疫原は、多岐にわたる連結中間体から産生すること
ができる。本発明の免疫原は、以下の一般構造式: (式中、a、a'、G及びAは先に定義した通りであり、
Qは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オ
リゴヌクレオチド又は固体支持体である)で表される。
ができる。本発明の免疫原は、以下の一般構造式: (式中、a、a'、G及びAは先に定義した通りであり、
Qは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オ
リゴヌクレオチド又は固体支持体である)で表される。
典型的なキャリヤーは前述した。免疫原は主に抗体の
産生に使用される。
産生に使用される。
b.免疫原の合成 本発明の免疫原において、連結中間体(II)の連結部
官能基yは当業者には公知の数種の方法のいずれかでタ
ンパク質キャリヤー上のアミノ基と反応し得る。カルボ
キシル反応性基では、一般的に極めて安定なアミド結合
を形成することが好ましい場合が多い。アミド結合は、
先ず連結中間体のカルボキシル部分yを1,3−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドのような活性化試薬及びN−ヒ
ドロキシスクシンイミドのような添加剤と反応させて活
性化することにより形成される。次いで活性化形態のハ
プテンを免疫原性付与キャリヤーを含む緩衝溶液と反応
させる。あるいはカルボン酸ハプテンを、所要により単
離して、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシ
ルイミダゾリド又は混合カーボネートに変換し、次いで
免疫原性付与キャリヤーと結合させることができる。ア
ミド結合の形成には上記に列挙された以外の多くの試薬
が使用され得ることは当業者が理解するところであろ
う。
官能基yは当業者には公知の数種の方法のいずれかでタ
ンパク質キャリヤー上のアミノ基と反応し得る。カルボ
キシル反応性基では、一般的に極めて安定なアミド結合
を形成することが好ましい場合が多い。アミド結合は、
先ず連結中間体のカルボキシル部分yを1,3−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドのような活性化試薬及びN−ヒ
ドロキシスクシンイミドのような添加剤と反応させて活
性化することにより形成される。次いで活性化形態のハ
プテンを免疫原性付与キャリヤーを含む緩衝溶液と反応
させる。あるいはカルボン酸ハプテンを、所要により単
離して、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシ
ルイミダゾリド又は混合カーボネートに変換し、次いで
免疫原性付与キャリヤーと結合させることができる。ア
ミド結合の形成には上記に列挙された以外の多くの試薬
が使用され得ることは当業者が理解するところであろ
う。
末端アミン官能基を含む連結中間体〔II、y=−N
H2〕は、適当な溶媒(例えばアセトニトリル又はジメチ
ルホルムアミド)中のN,N′−ジスクシンイミジルカー
ボネートと反応させることにより高反応性N−ヒドロキ
シスクシンイミドウレタンに変換し得る。次いで、得ら
れたウレタンを緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤー
と反応させて免疫原を得る。
H2〕は、適当な溶媒(例えばアセトニトリル又はジメチ
ルホルムアミド)中のN,N′−ジスクシンイミジルカー
ボネートと反応させることにより高反応性N−ヒドロキ
シスクシンイミドウレタンに変換し得る。次いで、得ら
れたウレタンを緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤー
と反応させて免疫原を得る。
末端アルデヒド官能基を含む連結中間体〔[II]、y
=−CH(=O)〕は、シアノホウ水素化ナトリウムの存
在下に、当業者には公知の方法で還元アミノ化すること
により、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーに結合
し得る。あるいは、アルコール基を含む連結中間体
〔[II]、y=−OH〕は、先ず該中間体をホスゲン又は
ホスゲン等価物(例えばジホスゲン、トリホスゲン又は
カルボニルジイミダゾール)と反応させて、高反応性ク
ロロホルメート又はイミダゾロホルメート誘導体を形成
する(通常単離せず)ことにより免疫原性付与キャリヤ
ーに結合し得る。次いで、得られた活性ギ酸エステル
を、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーと反応させ
て免疫原を得る。
=−CH(=O)〕は、シアノホウ水素化ナトリウムの存
在下に、当業者には公知の方法で還元アミノ化すること
により、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーに結合
し得る。あるいは、アルコール基を含む連結中間体
〔[II]、y=−OH〕は、先ず該中間体をホスゲン又は
ホスゲン等価物(例えばジホスゲン、トリホスゲン又は
カルボニルジイミダゾール)と反応させて、高反応性ク
ロロホルメート又はイミダゾロホルメート誘導体を形成
する(通常単離せず)ことにより免疫原性付与キャリヤ
ーに結合し得る。次いで、得られた活性ギ酸エステル
を、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーと反応させ
て免疫原を得る。
免疫原の場合と類似の方法で、連結中間体を、該中間
体のリンカー上の反応性基yと相補的に反応し得るアミ
ノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基のような官能基を
有する固体支持体に結合させることができる。それによ
って、ハプテンに対する抗体の分離又は精製に用いるこ
とができる固相が得られる。
体のリンカー上の反応性基yと相補的に反応し得るアミ
ノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基のような官能基を
有する固体支持体に結合させることができる。それによ
って、ハプテンに対する抗体の分離又は精製に用いるこ
とができる固相が得られる。
2.抗体 抗体の産生法は一般に知られており、先に要約した通
りである。本発明のハプテン及び免疫原を用いた特定例
を後述の実施例に示す。
りである。本発明のハプテン及び免疫原を用いた特定例
を後述の実施例に示す。
3.トレーサー a.トレーサーの構造 本発明のトレーサーは上記の免疫原と非常に似通って
いるが、但しQはシグナル化部分である。トレーサーは
上述の一般構造式で表される。
いるが、但しQはシグナル化部分である。トレーサーは
上述の一般構造式で表される。
上記のように、均質な系中に検出され得る検出可能ラ
ベルが好ましい。特に好ましいのは、フルオレセイン及
びフルオレセイン誘導体である。
ベルが好ましい。特に好ましいのは、フルオレセイン及
びフルオレセイン誘導体である。
本発明のトレーサーは、このハプテンで誘導体化され
たオリゴヌクレオチドを含むカルバゾール及びジベンゾ
フラン誘導体についてのアッセイに用いられる。本発明
のトレーサーの場合、リンカーが1〜12個の炭素及びヘ
テロ原子からなることが好ましい。より長鎖のものは、
その偏光特性を調節する高分子からラベルを遠ざけるこ
とにより示差偏光作用を低減させる。
たオリゴヌクレオチドを含むカルバゾール及びジベンゾ
フラン誘導体についてのアッセイに用いられる。本発明
のトレーサーの場合、リンカーが1〜12個の炭素及びヘ
テロ原子からなることが好ましい。より長鎖のものは、
その偏光特性を調節する高分子からラベルを遠ざけるこ
とにより示差偏光作用を低減させる。
b.トレーサーの合成 連結部中にアミノ基、カルボキシル基又はアルコール
基を含む連結中間体(II)を、フルオレセイン又はフル
オレセイン誘導体に結合して本発明のトレーサーを製造
することができる。末端アミノ官能基を含む連結中間体
は、適当な溶媒(例えばアセトニトリル又はジメチルホ
ルムアミド)中のN,N′−ジスクシンイミジルカーボネ
ートと反応させて、高反応性N−ヒドロキシスクシンイ
ミドウレタンに変換することができる。あるいは、アミ
ン−末端基を含む連結中間体はイソシアネートに対して
活性化することができる。次いで、得られた生成物をア
ミノフルオレセイン誘導体と反応させて尿素トレーサー
を形成する。アミノ基含有ハプテンも、適当な溶媒中の
N−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したカルボキシ
フルオレセイン誘導体に結合し得る。
基を含む連結中間体(II)を、フルオレセイン又はフル
オレセイン誘導体に結合して本発明のトレーサーを製造
することができる。末端アミノ官能基を含む連結中間体
は、適当な溶媒(例えばアセトニトリル又はジメチルホ
ルムアミド)中のN,N′−ジスクシンイミジルカーボネ
ートと反応させて、高反応性N−ヒドロキシスクシンイ
ミドウレタンに変換することができる。あるいは、アミ
ン−末端基を含む連結中間体はイソシアネートに対して
活性化することができる。次いで、得られた生成物をア
ミノフルオレセイン誘導体と反応させて尿素トレーサー
を形成する。アミノ基含有ハプテンも、適当な溶媒中の
N−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したカルボキシ
フルオレセイン誘導体に結合し得る。
リンカー上の末端カルボキシル基を含む連結中間体
は、先ず、1,3−ジシクロヘキシルカルボイミドのよう
な活性化試薬及びN−ヒドロキシスクシンイミドのよう
な添加剤と反応させて、連結部のカルボン酸部分を活性
化することによりアミノ−末端フルオレセイン誘導体に
結合し得る。次いで、活性化中間体をフルオレセイン誘
導体溶液と反応させてトレーサーを形成する。あるい
は、カルボン酸ハプテンを、所要により単離して、高反
応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリ
ド又は混合カーボネートに変換し、次いでフルオレセイ
ン誘導体と結合させてもよい。
は、先ず、1,3−ジシクロヘキシルカルボイミドのよう
な活性化試薬及びN−ヒドロキシスクシンイミドのよう
な添加剤と反応させて、連結部のカルボン酸部分を活性
化することによりアミノ−末端フルオレセイン誘導体に
結合し得る。次いで、活性化中間体をフルオレセイン誘
導体溶液と反応させてトレーサーを形成する。あるい
は、カルボン酸ハプテンを、所要により単離して、高反
応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリ
ド又は混合カーボネートに変換し、次いでフルオレセイ
ン誘導体と結合させてもよい。
あるいは、アルコール基を含む連結中間体は、先ず、
該中間体をホスゲン又はホスゲン等価物(例えばジホス
ゲン、トリホスゲン又はカルボニルジイミダゾール)と
反応させて、高反応性クロロホルメート又はイミダゾロ
ホルメート誘導体を形成(通常単離せず)することによ
りフルオレセインに結合し得る。次いで、得られた活性
ギ酸エステルをアミノ末端フルオレセイン誘導体と反応
させてトレーサーを形成する。
該中間体をホスゲン又はホスゲン等価物(例えばジホス
ゲン、トリホスゲン又はカルボニルジイミダゾール)と
反応させて、高反応性クロロホルメート又はイミダゾロ
ホルメート誘導体を形成(通常単離せず)することによ
りフルオレセインに結合し得る。次いで、得られた活性
ギ酸エステルをアミノ末端フルオレセイン誘導体と反応
させてトレーサーを形成する。
4.オリゴヌクレオチド a.オリゴヌクレオチドの構造 オリゴヌクレオチドは多岐にわたる連結中間体から生
成され得る。
成され得る。
以下に記載のように、ハプテンで標識したオリゴヌク
レオチドは、増幅アッセイを含む核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイに用いられる。ハプテン化オリゴヌクレ
オチドプローブはPCR産物(例えばヨーロッパ特許出願
公開第357 011号参照)及び/又はLCR産物(例えばヨ
ーロッパ特許出願公開第439 182号参照)の分離及び/
又は検出に十分適合する。他のハプテン(例えば、ビオ
チン、フルオレセイン、ダンシル、アセチルアミノフル
オレン及びヨード−アセチルアミノフルオレンなど)と
組み合わせた本発明ハプテンで標識したプローブは、多
種多様なPCR及びLCRに特に有用である。
レオチドは、増幅アッセイを含む核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイに用いられる。ハプテン化オリゴヌクレ
オチドプローブはPCR産物(例えばヨーロッパ特許出願
公開第357 011号参照)及び/又はLCR産物(例えばヨ
ーロッパ特許出願公開第439 182号参照)の分離及び/
又は検出に十分適合する。他のハプテン(例えば、ビオ
チン、フルオレセイン、ダンシル、アセチルアミノフル
オレン及びヨード−アセチルアミノフルオレンなど)と
組み合わせた本発明ハプテンで標識したプローブは、多
種多様なPCR及びLCRに特に有用である。
b.連結オリゴヌクレオチドの合成 本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、連結部官能基
yはトレーサー及び免疫原の場合と同義であってよい。
オリゴヌクレオチドは、官能基yをオリゴヌクレオチド
のアミノ又はヒドロキシル官能基と反応させるか、又は
H−ホスホネート試薬の酸化的アミノ化を介してリンと
直接反応させて標識させることができる。アミノ官能基
はプリン及びピリミジン塩基中に存在するが、これらの
部位は、ハイブリダイゼーションにおける該部位の重要
性のために標識にはあまり好ましくない。アミノ官能基
は、Aminomodifier(登録商標)(Clontech,Palo Alt
o)のような試薬を用いてオリゴヌクレオチドの5′及
び/又は3′末端に導入することができる。ヒドロキシ
ル官能基は一般に自動化合成中に形成される。
yはトレーサー及び免疫原の場合と同義であってよい。
オリゴヌクレオチドは、官能基yをオリゴヌクレオチド
のアミノ又はヒドロキシル官能基と反応させるか、又は
H−ホスホネート試薬の酸化的アミノ化を介してリンと
直接反応させて標識させることができる。アミノ官能基
はプリン及びピリミジン塩基中に存在するが、これらの
部位は、ハイブリダイゼーションにおける該部位の重要
性のために標識にはあまり好ましくない。アミノ官能基
は、Aminomodifier(登録商標)(Clontech,Palo Alt
o)のような試薬を用いてオリゴヌクレオチドの5′及
び/又は3′末端に導入することができる。ヒドロキシ
ル官能基は一般に自動化合成中に形成される。
オリゴヌクレオチドの3′末端にハプテンを付加する
ための好ましい方法は、本出願人が1990年12月20日付け
で出願した同時係属中の米国特許出願第630,908号に開
示されており、該明細書の内容は既に本明細書に組み込
まれている。5'末端にハプテンを付加するための好まし
い方法は、上記「発明の背景」の項に引用したThuongら
又はCohenらにより記載されたホスホアミダイト試薬を
用いたものである。
ための好ましい方法は、本出願人が1990年12月20日付け
で出願した同時係属中の米国特許出願第630,908号に開
示されており、該明細書の内容は既に本明細書に組み込
まれている。5'末端にハプテンを付加するための好まし
い方法は、上記「発明の背景」の項に引用したThuongら
又はCohenらにより記載されたホスホアミダイト試薬を
用いたものである。
例えば、ホスホアミダイトyが: である連結ハプテン中間体(II、y=ホスホアミダイ
ト)は、連結ハプテン(II、y=−OH)を、以下の図式
Iに記載のようにN,N−ジイソプロピル−O−(2−シ
アノエチル)クロロホスホアミダイトと反応させること
により製造される。
ト)は、連結ハプテン(II、y=−OH)を、以下の図式
Iに記載のようにN,N−ジイソプロピル−O−(2−シ
アノエチル)クロロホスホアミダイトと反応させること
により製造される。
図式Iの出発化合物は一般式1〔ここで、Wは、飽和
又は不飽和の直鎖若しくは分枝鎖又は環式部分として配
置された1〜約50個の原子からなるスペーサー基であ
り、但し(a)2個以下のヘテロ原子は直接結合してお
り、(b)環式部分は6個以下のメンバーを含み、
(c)分枝は炭素原子上でのみ生起するものとし、R1及
びR10は独立して、水素、1〜10個の炭素原子を有する
アルキル、アミノ保護基又はアリールであるか、あるい
はR1又はR10は、それらが結合している窒素原子及びW
と一緒になって環式アミンを形成し得る]のエステルで
ある。化合物1を、グリム(glyme)の存在下で塩基加
水分解し(工程1)、次いでメルドラム(Meldrum)酸
(2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン、
2)及びR2OH(R2は1〜6個の炭素原子を有するアルキ
ルである)と反応させて、β−ケトエステル3を生成す
る。次いで、これをホウ水素化物により低温(例えば15
〜30℃)で23〜24時間還元し(工程4)、ゆっくり中和
してジオール4を得る。気体の急な放出という危険な状
態を避けるために、中和は非常にゆっくり実施しなけれ
ばならない。次いで、ジメトキシトリチル化(工程5)
によりジオールの第一級ヒドロキシルを保護して、連結
ハプテン5を生成する。次いで、連結ハプテンを第二ア
ルコール部分でホスホアミダイト化(工程6)してホス
ホアミダイト結合ハプテン6を得る。次いで、ホスホア
ミダイト結合ハプテンを使用して、合成オリゴヌクレオ
チドの任意の位置にハプテンを導入することができる。
又は不飽和の直鎖若しくは分枝鎖又は環式部分として配
置された1〜約50個の原子からなるスペーサー基であ
り、但し(a)2個以下のヘテロ原子は直接結合してお
り、(b)環式部分は6個以下のメンバーを含み、
(c)分枝は炭素原子上でのみ生起するものとし、R1及
びR10は独立して、水素、1〜10個の炭素原子を有する
アルキル、アミノ保護基又はアリールであるか、あるい
はR1又はR10は、それらが結合している窒素原子及びW
と一緒になって環式アミンを形成し得る]のエステルで
ある。化合物1を、グリム(glyme)の存在下で塩基加
水分解し(工程1)、次いでメルドラム(Meldrum)酸
(2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン、
2)及びR2OH(R2は1〜6個の炭素原子を有するアルキ
ルである)と反応させて、β−ケトエステル3を生成す
る。次いで、これをホウ水素化物により低温(例えば15
〜30℃)で23〜24時間還元し(工程4)、ゆっくり中和
してジオール4を得る。気体の急な放出という危険な状
態を避けるために、中和は非常にゆっくり実施しなけれ
ばならない。次いで、ジメトキシトリチル化(工程5)
によりジオールの第一級ヒドロキシルを保護して、連結
ハプテン5を生成する。次いで、連結ハプテンを第二ア
ルコール部分でホスホアミダイト化(工程6)してホス
ホアミダイト結合ハプテン6を得る。次いで、ホスホア
ミダイト結合ハプテンを使用して、合成オリゴヌクレオ
チドの任意の位置にハプテンを導入することができる。
あるいは、連結ハプテン(II,y=−OH)を三塩化リン
と反応させ、次いで加水分解して、yがホスホネートで
ある連結ハプテン中間体(II,y=ホスホネート)を製造
する。ホスホアミダイト及びホスホネート誘導体は共
に、標準プロトコルを用いて、合成中にオリゴヌクレオ
チド内に容易に組み込まれる。あるいは、連結ハプテン
(II,y=−NH2)を、四塩化炭素の存在下、酸化的アミ
ド化により、既にオリゴヌクレオチドに組み込まれたホ
スホネート基と反応させる。
と反応させ、次いで加水分解して、yがホスホネートで
ある連結ハプテン中間体(II,y=ホスホネート)を製造
する。ホスホアミダイト及びホスホネート誘導体は共
に、標準プロトコルを用いて、合成中にオリゴヌクレオ
チド内に容易に組み込まれる。あるいは、連結ハプテン
(II,y=−NH2)を、四塩化炭素の存在下、酸化的アミ
ド化により、既にオリゴヌクレオチドに組み込まれたホ
スホネート基と反応させる。
オリゴヌクレオチドの固相合成手順の詳細な説明は、
例えば、参考として本明細書の一部を構成するものとす
る米国特許第4,401,796号及び第4,458,066号に詳しく記
載されている。本発明の一実施態様では、ハプテン標識
したオリゴヌクレオチドの合成は、ハプテンホスホアミ
ダイトを、成長するオリゴヌクレオチド鎖に結合したヌ
クレオチドの5'ヒドロキシルと反応させることにより達
成される。標識したオリゴヌクレオチドを標準的な手順
(例えばGait,Oligonucleotide Synthesis:A Practio
cal Approach(IRL Press,Washington,D.C.:1984)に
より精製する。
例えば、参考として本明細書の一部を構成するものとす
る米国特許第4,401,796号及び第4,458,066号に詳しく記
載されている。本発明の一実施態様では、ハプテン標識
したオリゴヌクレオチドの合成は、ハプテンホスホアミ
ダイトを、成長するオリゴヌクレオチド鎖に結合したヌ
クレオチドの5'ヒドロキシルと反応させることにより達
成される。標識したオリゴヌクレオチドを標準的な手順
(例えばGait,Oligonucleotide Synthesis:A Practio
cal Approach(IRL Press,Washington,D.C.:1984)に
より精製する。
勿論、市販の自動化合成機(例えばApplied Biosyst
emのDNA Synthesizer 380B)での合成法によりオリゴ
ヌクレオチドを産生することがかなり一般的な方法であ
る。
emのDNA Synthesizer 380B)での合成法によりオリゴ
ヌクレオチドを産生することがかなり一般的な方法であ
る。
B.FPIAアッセイ法 トレーサー及び本発明の免疫原に対して産生された抗
体により、ハプテン誘導体を半定量測定するための本発
明の蛍光偏光アッセイにおいて優秀な結果が得られる。
該アッセイは実施例27の一般的手順に従って行われる。
体により、ハプテン誘導体を半定量測定するための本発
明の蛍光偏光アッセイにおいて優秀な結果が得られる。
該アッセイは実施例27の一般的手順に従って行われる。
好ましい手順は、TDx(登録商標)Therapeutic Drug
Monitoring System又はADxTMAbused Drug System.
IMx(登録商標)Fluorescence Polarization and Mi
coroparticle Enzyme Immunoassay(MEIA)Analyzer
(これらのシステムは全てAbbott Laboratories,Abbot
t Park,Illinoisから入手可能である)上で行うように
設計されている。TDx、ADx又はIMxシステムを用いる場
合、アッセイは、一旦試験試料が準備されたら、前処理
から最終読み取りまで完全に自動化されている。しか
し、手動アッセイを行うことも可能である。本発明の原
理は手動アッセイにも適用できるが、TDx、ADx及びIMx
システムの自動化特性により、技術者がアッセイの実施
及びデータの解釈に要する時間が確実に最短になる。結
果は、“ミリ偏光単位”、(ミリ偏光単位での)“スパ
ン”及び“相対強度”で定量化することができる。ミリ
偏光単位の測定により、試験試料中、PCBの不在下で最
大量のトレーサーが抗体に結合したときに最大の偏光が
得られることが示される。正味ミリ偏光単位が高くなる
につれ、トレーサーと抗体との結合率が高くなる。
Monitoring System又はADxTMAbused Drug System.
IMx(登録商標)Fluorescence Polarization and Mi
coroparticle Enzyme Immunoassay(MEIA)Analyzer
(これらのシステムは全てAbbott Laboratories,Abbot
t Park,Illinoisから入手可能である)上で行うように
設計されている。TDx、ADx又はIMxシステムを用いる場
合、アッセイは、一旦試験試料が準備されたら、前処理
から最終読み取りまで完全に自動化されている。しか
し、手動アッセイを行うことも可能である。本発明の原
理は手動アッセイにも適用できるが、TDx、ADx及びIMx
システムの自動化特性により、技術者がアッセイの実施
及びデータの解釈に要する時間が確実に最短になる。結
果は、“ミリ偏光単位”、(ミリ偏光単位での)“スパ
ン”及び“相対強度”で定量化することができる。ミリ
偏光単位の測定により、試験試料中、PCBの不在下で最
大量のトレーサーが抗体に結合したときに最大の偏光が
得られることが示される。正味ミリ偏光単位が高くなる
につれ、トレーサーと抗体との結合率が高くなる。
スパンは、正味ミリ偏光と抗体に結合した最小量のト
レーサーとの差を示すものである。スパンが大きい程デ
ータの数量分析が良好に行われる。本発明のためには、
ミリ偏光単位が少なくとも15のスパンが好ましい。
レーサーとの差を示すものである。スパンが大きい程デ
ータの数量分析が良好に行われる。本発明のためには、
ミリ偏光単位が少なくとも15のスパンが好ましい。
強度は、バックグラウンド蛍光を上回る蛍光シグナル
強度の測定値である。従って、該強度が高いほど測定精
度が増す。強度は、垂直偏光強度と水平偏光強度の二倍
との和として測定される。該強度は、トレーサーの濃度
及びアッセイの他の変数に応じて、バックグラウンドノ
イズの約3倍〜約30倍のシグナルの範囲であり得る。本
発明のためには、バックグラウンドノイズの約3倍〜約
20倍の強度が好ましいが、それぞれの特定のシステムに
ついてシグナルを最適化するのは専門家の裁量に任され
得る。
強度の測定値である。従って、該強度が高いほど測定精
度が増す。強度は、垂直偏光強度と水平偏光強度の二倍
との和として測定される。該強度は、トレーサーの濃度
及びアッセイの他の変数に応じて、バックグラウンドノ
イズの約3倍〜約30倍のシグナルの範囲であり得る。本
発明のためには、バックグラウンドノイズの約3倍〜約
20倍の強度が好ましいが、それぞれの特定のシステムに
ついてシグナルを最適化するのは専門家の裁量に任され
得る。
フルオレセイントレーサーの場合、本発明の方法を実
施するpHは、フルオレセイン部分をその開いた形(open
form)で存在させるのに十分でなければならない。pH
は、約4〜9、好ましくは約6〜8、最も好ましくは約
7〜7.5の範囲であり得る。アッセイ手順の間のpHの調
整及び維持には種々の緩衝液を使用することができる。
代表的な緩衝液には、ボレート、ホスフェート、カーボ
ネート、トリス、バルビタールなどが含まれる。どの緩
衝液を用いるかは本発明では重要ではないが、トリス及
びホスフェート緩衝液が好ましい。
施するpHは、フルオレセイン部分をその開いた形(open
form)で存在させるのに十分でなければならない。pH
は、約4〜9、好ましくは約6〜8、最も好ましくは約
7〜7.5の範囲であり得る。アッセイ手順の間のpHの調
整及び維持には種々の緩衝液を使用することができる。
代表的な緩衝液には、ボレート、ホスフェート、カーボ
ネート、トリス、バルビタールなどが含まれる。どの緩
衝液を用いるかは本発明では重要ではないが、トリス及
びホスフェート緩衝液が好ましい。
好ましいFPIA手順は、特にAbbott TDx(登録商標)C
linical Analyzer、Abbott TDxFLxTM又はAbuse Syst
emのAbbott ADx(登録商標)Drugs(これら3種は全て
Abbott Laboratories,Abbott Park,Illinoisから入手
可能である)と組み合わせて用いるように設計されてい
る。検定試薬、対照又は未知試料をTDx(登録商標)試
料カートリッジの試料ウエルに直接ピペット装入する。
この手順の利点の一つは、試料を特別に調製する必要が
全くないことである。この時点以降のアッセイ手順は完
全に自動化されている。
linical Analyzer、Abbott TDxFLxTM又はAbuse Syst
emのAbbott ADx(登録商標)Drugs(これら3種は全て
Abbott Laboratories,Abbott Park,Illinoisから入手
可能である)と組み合わせて用いるように設計されてい
る。検定試薬、対照又は未知試料をTDx(登録商標)試
料カートリッジの試料ウエルに直接ピペット装入する。
この手順の利点の一つは、試料を特別に調製する必要が
全くないことである。この時点以降のアッセイ手順は完
全に自動化されている。
手動アッセイを実施する場合には、試料を希釈緩衝溶
液中で前処理溶液と混合し、バックグラウンドの読み取
りを行う。次いで蛍光トレーサーをアッセイと混合す
る。最後に抗体を試験溶液に混合する。インキュベーシ
ョン後、蛍光偏光の読み取りを行う。
液中で前処理溶液と混合し、バックグラウンドの読み取
りを行う。次いで蛍光トレーサーをアッセイと混合す
る。最後に抗体を試験溶液に混合する。インキュベーシ
ョン後、蛍光偏光の読み取りを行う。
各検定試薬、対照又は試料の蛍光偏光値を測定し、Ab
bott TDx(登録商標)Analyzer、TDxFLxTM又はADx(登
録商標)Systemのような装置の出力テープ上にプリント
する。非線形回帰分析を用いて、各検定試薬の偏光に対
するその濃度をプロットして装置で標準曲線を作成す
る。保存されている検定曲線から各対照又は試料の濃度
を読み取り、出力テープ上にプリントする。
bott TDx(登録商標)Analyzer、TDxFLxTM又はADx(登
録商標)Systemのような装置の出力テープ上にプリント
する。非線形回帰分析を用いて、各検定試薬の偏光に対
するその濃度をプロットして装置で標準曲線を作成す
る。保存されている検定曲線から各対照又は試料の濃度
を読み取り、出力テープ上にプリントする。
上記の好ましい手順に関して、トレーサー、抗体、前
処理溶液、洗液、検定試薬及び対照は、約2℃〜約8℃
の範囲で貯蔵する必要があるが、希釈緩衝液は室温で貯
蔵しなければならないことに留意されたい。標準曲線及
び対照は2週間毎にランさせる必要があり、各検定試薬
及び対照は2回ランさせる。試料は全て2回ランさせる
ことができる。本発明の好ましい蛍光偏光イムノアッセ
イ用の好ましい試薬、検定試薬及び対照は以下の実施例
の項に見ることができる。
処理溶液、洗液、検定試薬及び対照は、約2℃〜約8℃
の範囲で貯蔵する必要があるが、希釈緩衝液は室温で貯
蔵しなければならないことに留意されたい。標準曲線及
び対照は2週間毎にランさせる必要があり、各検定試薬
及び対照は2回ランさせる。試料は全て2回ランさせる
ことができる。本発明の好ましい蛍光偏光イムノアッセ
イ用の好ましい試薬、検定試薬及び対照は以下の実施例
の項に見ることができる。
C.使用法 新規なハプテン、連結中間体、免疫原、固体支持体及
びトレーサーの使用法はそれぞれ上記に説明した。標識
オリゴヌクレオチドの使用法には、当業界で公知のサン
ドイッチハイブリダイゼーションのような特定のハイブ
リダイゼーションの実施が含まれる。例えば、米国特許
第4,486,539号(Ranki)及び英国特許第2,169,403号(O
rion)を参照されたい。ハプテン化オリゴヌクレオチド
はPCR及びLCRのような増幅技術で使用してもよい。PCR
におけるハプテン化プライマーの使用例はヨーロッパ特
許出願公開第357 011号(Abbott)に記載されている。
LCRにおけるハプテン化プローブの使用は、ヨーロッパ
特許出願公開第320 308号及びヨーロッパ特許出願公開
第0 439 182号に記載されている。上記特許はそれぞ
れ参考として本明細書の一部を構成するものとする。
びトレーサーの使用法はそれぞれ上記に説明した。標識
オリゴヌクレオチドの使用法には、当業界で公知のサン
ドイッチハイブリダイゼーションのような特定のハイブ
リダイゼーションの実施が含まれる。例えば、米国特許
第4,486,539号(Ranki)及び英国特許第2,169,403号(O
rion)を参照されたい。ハプテン化オリゴヌクレオチド
はPCR及びLCRのような増幅技術で使用してもよい。PCR
におけるハプテン化プライマーの使用例はヨーロッパ特
許出願公開第357 011号(Abbott)に記載されている。
LCRにおけるハプテン化プローブの使用は、ヨーロッパ
特許出願公開第320 308号及びヨーロッパ特許出願公開
第0 439 182号に記載されている。上記特許はそれぞ
れ参考として本明細書の一部を構成するものとする。
本発明を実施例により説明するが、該実施例は本発明
を例示するものであって、限定するものではない。
を例示するものであって、限定するものではない。
IV.実施例 ここで使用する%は、特に指摘がない限り、いずれも
重量/容量である。下記の略号は、特に指摘がない限
り、下記の意味を表し、総ての化学的試薬はAldrich C
hemical社(Milwaukee,WI)から入手したものである。
重量/容量である。下記の略号は、特に指摘がない限
り、下記の意味を表し、総ての化学的試薬はAldrich C
hemical社(Milwaukee,WI)から入手したものである。
ACA:アミノカプロン酸 AMF又はAMF:発蛍光団であるアミノメチルフルオレセイ
ン(Abbott) BAE:3カルボキシプロピルオキシ基酪酸エステル BSA:免疫原性付与キャリヤーであるウシ血清アルブミン
(Sigma Chemical) セライト(登録商標):Manville Products Corporati
onのケイ藻土の商標 CDI:カップリング試薬である1,1'カルボニルジイミダゾ
ール DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド DEAD又はDEADC:ジエチルアゾジカルボキシレート DIEA:ジイソプロピルエチルアミン DMAP:4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン DMEM:細胞培養培地であるダルベッコの最少必須培地 DMF:N,N−ジメチルホルムアミド EBB:エチル4−ブロモブチレート EEDQ:2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジ
ヒドロキノリン グリム:1,2−ジメトキシエタン HNQ:8−ヒドロキシ−5−ニトロキノリン HOSu又はNHS:N−ヒドロキシスクシンイミド KLH:免疫原性付与キャリヤーであるキーホールリンペッ
トヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)(Cal
BioChem) NMP:N−メチルピロリジノン PEG:ポリエチレングリコール TBAF:フッ化テトラブチルアンモニウム TEA:トリエチルアミン THF:テトラヒドロフラン A.中間体、連結部及び連結ハプテンの合成 実施例1:連結ハプテンである2−[3−カルボキシプロ
ピルオキシ]−カルバゾールエチルエステル(G33) 2−ヒドロキシカルバゾール(5.0g、27mmol)、エチ
ルブロモブチレート(EBB、5.9ml、41mmol)及び炭酸カ
リウム(5.7g、41mmol)をメチルエチルケトン(50ml)
中で18時間還流させた。該反応混合物にテトラヒドロフ
ラン(60ml)を加え、濾過した。溶媒を減圧下で除去
し、固体物質をヘキサンで細かくする砕いて過剰EBBを
除去した。減圧下での乾燥後、8.1gの淡褐色固体物質が
得られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z
298,(m+NH4)+@m/z315。
ン(Abbott) BAE:3カルボキシプロピルオキシ基酪酸エステル BSA:免疫原性付与キャリヤーであるウシ血清アルブミン
(Sigma Chemical) セライト(登録商標):Manville Products Corporati
onのケイ藻土の商標 CDI:カップリング試薬である1,1'カルボニルジイミダゾ
ール DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド DEAD又はDEADC:ジエチルアゾジカルボキシレート DIEA:ジイソプロピルエチルアミン DMAP:4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン DMEM:細胞培養培地であるダルベッコの最少必須培地 DMF:N,N−ジメチルホルムアミド EBB:エチル4−ブロモブチレート EEDQ:2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジ
ヒドロキノリン グリム:1,2−ジメトキシエタン HNQ:8−ヒドロキシ−5−ニトロキノリン HOSu又はNHS:N−ヒドロキシスクシンイミド KLH:免疫原性付与キャリヤーであるキーホールリンペッ
トヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)(Cal
BioChem) NMP:N−メチルピロリジノン PEG:ポリエチレングリコール TBAF:フッ化テトラブチルアンモニウム TEA:トリエチルアミン THF:テトラヒドロフラン A.中間体、連結部及び連結ハプテンの合成 実施例1:連結ハプテンである2−[3−カルボキシプロ
ピルオキシ]−カルバゾールエチルエステル(G33) 2−ヒドロキシカルバゾール(5.0g、27mmol)、エチ
ルブロモブチレート(EBB、5.9ml、41mmol)及び炭酸カ
リウム(5.7g、41mmol)をメチルエチルケトン(50ml)
中で18時間還流させた。該反応混合物にテトラヒドロフ
ラン(60ml)を加え、濾過した。溶媒を減圧下で除去
し、固体物質をヘキサンで細かくする砕いて過剰EBBを
除去した。減圧下での乾燥後、8.1gの淡褐色固体物質が
得られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z
298,(m+NH4)+@m/z315。
実施例2:連結ハプテンである2−[3−カルボキシプロ
ピルオキシ]−カルバゾール(カルバゾール−BAE、G4
0) 前述のように製造したカルバゾールエステル(1.0g)
をグリム(30ml)及び水酸化リチウム水溶液(7ml、0.5
N)に溶解した。室温で24時間撹拌した後、溶媒を減圧
下で除去し、水(10ml)を加えた。該溶液をHCl水溶液
(1N)でpH2.0に酸性化し、次いで酢酸エチルで抽出し
た。有機抽出物を乾燥し、溶媒を減圧下で除去すると、
有色固体物質が得られた(0.82g)。質量スペクトル:DC
I/NH3,(m+H)+@m/z270,(m+NH4)+@m/z287。
ピルオキシ]−カルバゾール(カルバゾール−BAE、G4
0) 前述のように製造したカルバゾールエステル(1.0g)
をグリム(30ml)及び水酸化リチウム水溶液(7ml、0.5
N)に溶解した。室温で24時間撹拌した後、溶媒を減圧
下で除去し、水(10ml)を加えた。該溶液をHCl水溶液
(1N)でpH2.0に酸性化し、次いで酢酸エチルで抽出し
た。有機抽出物を乾燥し、溶媒を減圧下で除去すると、
有色固体物質が得られた(0.82g)。質量スペクトル:DC
I/NH3,(m+H)+@m/z270,(m+NH4)+@m/z287。
実施例3:連結ハプテンであるカルバゾール誘導体活性エ
ステル(G57) 前述のように製造したカルバゾール−BAE(G40)(0.
1g、0.37mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.
051g、0.45mmol)をNMP(1ml)に溶解し、次いでDCC
(0.084g、0.41mmol)を加えた。該反応混合物を室温で
18時間撹拌し、次いでセライトで濾過し、NMPで2mlに希
釈した。この活性化エステル溶液を下記の実施例で使用
した。
ステル(G57) 前述のように製造したカルバゾール−BAE(G40)(0.
1g、0.37mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.
051g、0.45mmol)をNMP(1ml)に溶解し、次いでDCC
(0.084g、0.41mmol)を加えた。該反応混合物を室温で
18時間撹拌し、次いでセライトで濾過し、NMPで2mlに希
釈した。この活性化エステル溶液を下記の実施例で使用
した。
実施例4:連結ハプテンである2−[3−カルボキシプロ
ピルオキシ]−N−[2−チオフェニルスルホニル]−
カルバゾール(CT、H39) 前述のように製造したカルバゾールエステル(G33)
(2.0g、6.7mmol)をテトラヒドロフラン(THF、20ml)
に溶解し、得られた溶液を氷浴で冷却した。冷却溶液
に、N2雰囲気下で水素化ナトリウム(0.225g、80%、74
mmol)を加え、該反応混合物を室温にし、次いで40℃で
6時間加熱した。該反応混合物を氷浴で冷却し、THF(2
0ml)中の塩化チオフェンスルホニル(1.22g、6.7mmo
l)溶液を5分間で滴下した。反応混合物を室温にし、
次いで光を遮断してN2下で、40℃で18時間加熱した。溶
媒を減圧下で除去し、残渣をグリム(60ml)及び水酸化
リチウム水溶液(15ml、0.5N)に加えた。室温で18時間
後、溶媒を減圧下で除去し、水(20ml)を加えた。該溶
液をHCl水溶液(1N)でpH2.0に酸性化し、酢酸エチルで
抽出した。該有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を減圧下で除去すると、生成物が有色固体物質として得
られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+NH4)+@m/z4
33,(m+NH4−H2O)+@m/z415。
ピルオキシ]−N−[2−チオフェニルスルホニル]−
カルバゾール(CT、H39) 前述のように製造したカルバゾールエステル(G33)
(2.0g、6.7mmol)をテトラヒドロフラン(THF、20ml)
に溶解し、得られた溶液を氷浴で冷却した。冷却溶液
に、N2雰囲気下で水素化ナトリウム(0.225g、80%、74
mmol)を加え、該反応混合物を室温にし、次いで40℃で
6時間加熱した。該反応混合物を氷浴で冷却し、THF(2
0ml)中の塩化チオフェンスルホニル(1.22g、6.7mmo
l)溶液を5分間で滴下した。反応混合物を室温にし、
次いで光を遮断してN2下で、40℃で18時間加熱した。溶
媒を減圧下で除去し、残渣をグリム(60ml)及び水酸化
リチウム水溶液(15ml、0.5N)に加えた。室温で18時間
後、溶媒を減圧下で除去し、水(20ml)を加えた。該溶
液をHCl水溶液(1N)でpH2.0に酸性化し、酢酸エチルで
抽出した。該有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を減圧下で除去すると、生成物が有色固体物質として得
られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+NH4)+@m/z4
33,(m+NH4−H2O)+@m/z415。
実施例5:連結ハプテンであるカルバゾール−チオフェン
誘導体活性エステル(G58) 前述のように製造したCT(H39)(0.2g、0.48mmol)
及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.066g、0.58mmo
l)をNMP(1ml)に溶解し、次いでDCC(0.11g、0.53mmo
l)を加えた。該反応混合物を窒素雰囲気下で18時間撹
拌し、セライトで濾過した。該溶液をNMPで2.5mlに希釈
した。該活性エステル溶液を下記の実施例で使用した。
誘導体活性エステル(G58) 前述のように製造したCT(H39)(0.2g、0.48mmol)
及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.066g、0.58mmo
l)をNMP(1ml)に溶解し、次いでDCC(0.11g、0.53mmo
l)を加えた。該反応混合物を窒素雰囲気下で18時間撹
拌し、セライトで濾過した。該溶液をNMPで2.5mlに希釈
した。該活性エステル溶液を下記の実施例で使用した。
実施例6:連結ハプテンである2−[3−t−ブチルジメ
チルシリルオキシプロピルオキシ]−ジベンゾフラン
(Dbf−シリルエーテル、F141) 2−ヒドロキシジベンゾフラン(3.0g、16.3mmol)、
t−ブチルジメチルシリル−プロパンジオール(3.1g、
16.3mmol)及びトリフェニルホスフィン(5.1g、19.5mm
ol)をテトラヒドロフラン(30ml)に溶解した。該溶液
をN2雰囲気下で氷浴で冷却し、次いでジエチルアゾジカ
ルボキシレート(3.8ml、19.5mmol)をゆっくり加え
た。該反応混合物を室温で18時間撹拌し、次いで溶媒を
減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー
(シリカゲル、1:9酢酸エチル/ヘキサン)で精製し
た。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z357,
(m+NH4)+@m/z374。
チルシリルオキシプロピルオキシ]−ジベンゾフラン
(Dbf−シリルエーテル、F141) 2−ヒドロキシジベンゾフラン(3.0g、16.3mmol)、
t−ブチルジメチルシリル−プロパンジオール(3.1g、
16.3mmol)及びトリフェニルホスフィン(5.1g、19.5mm
ol)をテトラヒドロフラン(30ml)に溶解した。該溶液
をN2雰囲気下で氷浴で冷却し、次いでジエチルアゾジカ
ルボキシレート(3.8ml、19.5mmol)をゆっくり加え
た。該反応混合物を室温で18時間撹拌し、次いで溶媒を
減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー
(シリカゲル、1:9酢酸エチル/ヘキサン)で精製し
た。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z357,
(m+NH4)+@m/z374。
実施例7:連結ハプテンである2−[3−ヒドロキシプロ
ピルオキシ]−ジベンゾフラン(Dbf−アルコール、F14
5) 前述のように製造したDbf−シリルエーテル(F141)
(1.0g、2.8mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(2ml)及
びTBAF(5.6ml、THF中1.0M、5.6mmol)に加えた。該反
応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で
除去した。残渣を酢酸エチル(40ml)に溶解し、水(3
×12ml)及び飽和ブライン(12ml)で洗浄した。該溶液
を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去す
ると、極めて純粋な生成物が得られた。質量スペクト
ル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z243,(m+NH4)+@m/z
260,(m+NH4・NH3)+@m/z277。
ピルオキシ]−ジベンゾフラン(Dbf−アルコール、F14
5) 前述のように製造したDbf−シリルエーテル(F141)
(1.0g、2.8mmol)を乾燥テトラヒドロフラン(2ml)及
びTBAF(5.6ml、THF中1.0M、5.6mmol)に加えた。該反
応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で
除去した。残渣を酢酸エチル(40ml)に溶解し、水(3
×12ml)及び飽和ブライン(12ml)で洗浄した。該溶液
を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去す
ると、極めて純粋な生成物が得られた。質量スペクト
ル:DCI/NH3,(m+H)+@m/z243,(m+NH4)+@m/z
260,(m+NH4・NH3)+@m/z277。
実施例8:連結ハプテンである2−[3−カルボキシプロ
ピルオキシ]−ジベンゾフラン(Dbf−BAE、F246) 2−ヒドロキシジベンゾフラン(0.5g、2.7mmol)、
エチルブロモブチレート(0.78ml、5.4mmol)、炭酸カ
リウム(1.1g、8.1mmol)及びヨウ化ナトリウム(10m
g)を2−ブタノン(15ml)中で混合した。該反応混合
物を反応が完了するまで還流させ、次いで濾過し、溶媒
を減圧下で除去した。残渣を6M KOH水溶液/メタノー
ル、1:1に加えた。加水分解が終了した後、反応混合物
をpH3に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。残
渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチ
ル/ヘキサン/酢酸、10:30:60:0.5)で精製した。0.52
gの生成物が得られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+
H)+@m/z271,(m+NH4)+@m/z288、(m+NH4・N
H3)+@m/z305。
ピルオキシ]−ジベンゾフラン(Dbf−BAE、F246) 2−ヒドロキシジベンゾフラン(0.5g、2.7mmol)、
エチルブロモブチレート(0.78ml、5.4mmol)、炭酸カ
リウム(1.1g、8.1mmol)及びヨウ化ナトリウム(10m
g)を2−ブタノン(15ml)中で混合した。該反応混合
物を反応が完了するまで還流させ、次いで濾過し、溶媒
を減圧下で除去した。残渣を6M KOH水溶液/メタノー
ル、1:1に加えた。加水分解が終了した後、反応混合物
をpH3に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。残
渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチ
ル/ヘキサン/酢酸、10:30:60:0.5)で精製した。0.52
gの生成物が得られた。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+
H)+@m/z271,(m+NH4)+@m/z288、(m+NH4・N
H3)+@m/z305。
実施例9:連結ハプテンであるジベンゾフランイミジゾリ
ド誘導体(F146a) 前述のように製造したDbf−アルコール(F145)(0.2
75g、1.1mmol)をNMP(1.5ml)に溶解し、次いでCDI
(0.202g、1.2mmol)を加えた。その結果、Dbf−アルコ
ールイミジゾリド(後述)が得られた。これをそのまま
下記の実施例で使用した。
ド誘導体(F146a) 前述のように製造したDbf−アルコール(F145)(0.2
75g、1.1mmol)をNMP(1.5ml)に溶解し、次いでCDI
(0.202g、1.2mmol)を加えた。その結果、Dbf−アルコ
ールイミジゾリド(後述)が得られた。これをそのまま
下記の実施例で使用した。
実施例10:連結ハプテンである12原子連結カルバゾール
中間体 N−t−BOC−O−(2−アミノエチル)−2−アミ
ノエタノール塩酸塩(0.30g、1.25mmol、Mattingly,P.
G.,Synthesis(4):366−68(1990)の方法で2−(2
−アミノエトキシ)エタノールから製造)、カルバゾー
ル−BAE(0.335g、1.25mmol)及びBOP試薬(0.551g、1.
25mmol)を、トリエチルアミン(0.521ml、3.74mmo
l)、テトラヒドロフラン(3ml)及びN−メチルピロリ
ジノン(2ml)と共にアセトニトリル(5ml)に溶解し
た。該反応混合物を不活性雰囲気下で18時間室温に維持
した。溶媒を真空下で除去し、残渣を、酢酸エチル/ヘ
キサンを溶離剤として使用してカラムクロマトグラフィ
ーで精製した。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+
@m/z456。BOC保護基をトリフルオロ酢酸/ジクロロメ
タン(5ml、1:1)で除去すると、アミンのトリフルオロ
酢酸塩が得られた。
中間体 N−t−BOC−O−(2−アミノエチル)−2−アミ
ノエタノール塩酸塩(0.30g、1.25mmol、Mattingly,P.
G.,Synthesis(4):366−68(1990)の方法で2−(2
−アミノエトキシ)エタノールから製造)、カルバゾー
ル−BAE(0.335g、1.25mmol)及びBOP試薬(0.551g、1.
25mmol)を、トリエチルアミン(0.521ml、3.74mmo
l)、テトラヒドロフラン(3ml)及びN−メチルピロリ
ジノン(2ml)と共にアセトニトリル(5ml)に溶解し
た。該反応混合物を不活性雰囲気下で18時間室温に維持
した。溶媒を真空下で除去し、残渣を、酢酸エチル/ヘ
キサンを溶離剤として使用してカラムクロマトグラフィ
ーで精製した。質量スペクトル:DCI/NH3,(m+H)+
@m/z456。BOC保護基をトリフルオロ酢酸/ジクロロメ
タン(5ml、1:1)で除去すると、アミンのトリフルオロ
酢酸塩が得られた。
実施例11:連結ハプテンであるカルバゾールベータケト
エステル 前述の図式1、ステップ1〜3に従って表題の化合物
を製造する。下線を引いた化合物番号は、当該図式の化
合物を示す。2−ヒドロキシカルバゾール(25g、136mm
ol)、エチル4−ブロモブチレート(29.3ml、205mmo
l)、炭酸カリウム(28.3g、205mmol)及びヨウ化ナト
リウム(1g)を激しく撹拌しながら48時間にわたり2−
ブタノン(250ml)中で還流させた。反応混合物が温か
いうちに、塩化メチレン(750ml)を加えた。該溶液を
濾過し、溶媒を真空下で除去した。残渣を撹拌下で30分
間ヘキサン(1)で洗浄し、次いで濾過した。固体物
質を真空乾燥すると38gの固体物質が得られた。水酸化
リチウム水溶液(0.5N、2〜4当量)を用いて、新しい
グリム(35ml/g)中で加水分解を行う。該塩基性溶液を
真空下で減量させ、水を加え、HCl水溶液(1〜6N)でp
H2にする。生成物(1)を固体の濾過又は酢酸エチルで
の抽出により分離する。
エステル 前述の図式1、ステップ1〜3に従って表題の化合物
を製造する。下線を引いた化合物番号は、当該図式の化
合物を示す。2−ヒドロキシカルバゾール(25g、136mm
ol)、エチル4−ブロモブチレート(29.3ml、205mmo
l)、炭酸カリウム(28.3g、205mmol)及びヨウ化ナト
リウム(1g)を激しく撹拌しながら48時間にわたり2−
ブタノン(250ml)中で還流させた。反応混合物が温か
いうちに、塩化メチレン(750ml)を加えた。該溶液を
濾過し、溶媒を真空下で除去した。残渣を撹拌下で30分
間ヘキサン(1)で洗浄し、次いで濾過した。固体物
質を真空乾燥すると38gの固体物質が得られた。水酸化
リチウム水溶液(0.5N、2〜4当量)を用いて、新しい
グリム(35ml/g)中で加水分解を行う。該塩基性溶液を
真空下で減量させ、水を加え、HCl水溶液(1〜6N)でp
H2にする。生成物(1)を固体の濾過又は酢酸エチルで
の抽出により分離する。
2丸底フラスコ内で、2−カルボキシプロピルオキ
シ−カルバゾール(1、50.0g、186mmol)を乾燥ジクロ
ロメタン(700ml)に懸濁し、次いでメルドラム(Meldr
um)の酸(28g、195mmol)、シアノホスホン酸ジエチル
(30ml、195mmol)及びトリエチルアミン(52ml、371mm
ol)を更に別の分のジクロロメタン(300ml)と共に加
えた。該反応混合物を乾燥窒素雰囲気下で室温で25時間
撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸エチル
(1300ml)に溶解した。該溶液に500mlの1.0Mリン酸を
加えた。30分間激しく撹拌した後、沈殿物を分離し、水
(7×200ml)で洗浄した。固体物質をメタノール(1.4
)に溶解し、溶液を加熱して5時間還流させた。溶媒
を真空下で除去し、固体物質をt−ブチルメチルエーテ
ルの存在下で細かくすり砕いた。固体物質を分離し、t
−ブチルメチルエーテル(200ml)で洗浄し、次いで真
空乾燥すると、淡褐色固体物質が得られた(48g、3) 実施例12:連結ハプテンであるカルバゾール−ジオール 前記図式1、ステップ4に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
シ−カルバゾール(1、50.0g、186mmol)を乾燥ジクロ
ロメタン(700ml)に懸濁し、次いでメルドラム(Meldr
um)の酸(28g、195mmol)、シアノホスホン酸ジエチル
(30ml、195mmol)及びトリエチルアミン(52ml、371mm
ol)を更に別の分のジクロロメタン(300ml)と共に加
えた。該反応混合物を乾燥窒素雰囲気下で室温で25時間
撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸エチル
(1300ml)に溶解した。該溶液に500mlの1.0Mリン酸を
加えた。30分間激しく撹拌した後、沈殿物を分離し、水
(7×200ml)で洗浄した。固体物質をメタノール(1.4
)に溶解し、溶液を加熱して5時間還流させた。溶媒
を真空下で除去し、固体物質をt−ブチルメチルエーテ
ルの存在下で細かくすり砕いた。固体物質を分離し、t
−ブチルメチルエーテル(200ml)で洗浄し、次いで真
空乾燥すると、淡褐色固体物質が得られた(48g、3) 実施例12:連結ハプテンであるカルバゾール−ジオール 前記図式1、ステップ4に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
カルバゾールベータケトエステル(前述の方法で製造
した3、47g、144mmol)をテトラヒドロフラン(500m
l)に溶解し、次いで水素化ホウ素リチウム(テトラヒ
ドロフラン中2M、238ml、477mmol)を、乾燥不活性雰囲
気下で撹拌しながらカニューレを用いてゆっくり加え
た。24時間後、10%クエン酸(500ml)を極めてゆっく
りと加えた。得られた溶液を酢酸エチル(3×400ml)
で抽出し、有機抽出物をまとめて5%重炭酸ナトリウム
(400ml)及び濃ブライン(400ml)で順次洗浄した。該
溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真
空下で除去すると、白色固体物質(29g)が得られた。
ジオールを精製するためには、大量(2)のメタノー
ルに溶解し、次いで溶媒を真空下で除去し得る。これを
4〜6回繰り返し、次いで固体物質(4)を真空乾燥す
る。
した3、47g、144mmol)をテトラヒドロフラン(500m
l)に溶解し、次いで水素化ホウ素リチウム(テトラヒ
ドロフラン中2M、238ml、477mmol)を、乾燥不活性雰囲
気下で撹拌しながらカニューレを用いてゆっくり加え
た。24時間後、10%クエン酸(500ml)を極めてゆっく
りと加えた。得られた溶液を酢酸エチル(3×400ml)
で抽出し、有機抽出物をまとめて5%重炭酸ナトリウム
(400ml)及び濃ブライン(400ml)で順次洗浄した。該
溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真
空下で除去すると、白色固体物質(29g)が得られた。
ジオールを精製するためには、大量(2)のメタノー
ルに溶解し、次いで溶媒を真空下で除去し得る。これを
4〜6回繰り返し、次いで固体物質(4)を真空乾燥す
る。
実施例13:連結ハプテンであるカルバゾール−ジオール
−DMT 前記図式1、ステップ5に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
−DMT 前記図式1、ステップ5に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
カルバゾール−ジオール(前述の方法で製造した4、
7.75g、25.9mmol)を乾燥ピリジン(70ml)に溶解し、
次いで塩化ジメトキシトリチル(8.8g、25.9mmol)、ジ
イソプロピルエチルアミン(4.5ml、33.7mmol)及びN,N
−ジメチルアミノピリジン(0.16g、1.3mmol)を加え
た。該反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下、室温
で18時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をフラ
ッシュクロマトグラフィー(6×22cmシリカゲル床、酢
酸エチル/ヘキサン/TEA、0:100:1、500ml;20:80:1、1
;40:60:1、最終まで)で精製した。溶媒を除去した
後、残留TEAをトルエン、次いで塩化メチレンと同時蒸
発することにより除去すると、表題の化合物(5)が1
2.2g(>78%)得られた。
7.75g、25.9mmol)を乾燥ピリジン(70ml)に溶解し、
次いで塩化ジメトキシトリチル(8.8g、25.9mmol)、ジ
イソプロピルエチルアミン(4.5ml、33.7mmol)及びN,N
−ジメチルアミノピリジン(0.16g、1.3mmol)を加え
た。該反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下、室温
で18時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をフラ
ッシュクロマトグラフィー(6×22cmシリカゲル床、酢
酸エチル/ヘキサン/TEA、0:100:1、500ml;20:80:1、1
;40:60:1、最終まで)で精製した。溶媒を除去した
後、残留TEAをトルエン、次いで塩化メチレンと同時蒸
発することにより除去すると、表題の化合物(5)が1
2.2g(>78%)得られた。
実施例14:連結ハプテンであるカルバゾールホスホアミ
ダイト 前記図式1、ステップ6に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
ダイト 前記図式1、ステップ6に従い表題の化合物を製造す
る。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示
す。
乾燥カルバゾール−ジオール−DMT(5、6.0g、10mmo
l)を乾燥塩化メチレン(80ml)に溶解し、次いでジイ
ソプロピルエチルアミン(7ml、40mmol、CaHから蒸留し
たもの)及び2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルク
ロロホスホアミダイト(3.1ml、14mmol)を加えた。該
反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下で2時間室温
に維持した。乾燥メタノール(0.6ml)を加え、次いで2
0分後に酢酸エチル(200ml)及びTEA(50ml)を加え
た。該反応混合物を10%炭酸ナトリウム(2×200ml)
及び飽和ブライン(2×200ml)で抽出し、硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣をフラッ
シュクロマトグラフィー(3.2×50cmシリカゲル床、酢
酸エチル/ヘキサン/TEA、0:100:1、試料添加前にカラ
ムをならすために250ml;0:100:1、250ml;20:80:1、500m
lで溶離、30:70:1、最終まで)で精製した。残留TEAを
トルエン、次いで酢酸エチル/塩化メチレン(1:1)と
同時蒸発すると、白色固体物質(6)が6.05g(76%)
得られた。
l)を乾燥塩化メチレン(80ml)に溶解し、次いでジイ
ソプロピルエチルアミン(7ml、40mmol、CaHから蒸留し
たもの)及び2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルク
ロロホスホアミダイト(3.1ml、14mmol)を加えた。該
反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下で2時間室温
に維持した。乾燥メタノール(0.6ml)を加え、次いで2
0分後に酢酸エチル(200ml)及びTEA(50ml)を加え
た。該反応混合物を10%炭酸ナトリウム(2×200ml)
及び飽和ブライン(2×200ml)で抽出し、硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣をフラッ
シュクロマトグラフィー(3.2×50cmシリカゲル床、酢
酸エチル/ヘキサン/TEA、0:100:1、試料添加前にカラ
ムをならすために250ml;0:100:1、250ml;20:80:1、500m
lで溶離、30:70:1、最終まで)で精製した。残留TEAを
トルエン、次いで酢酸エチル/塩化メチレン(1:1)と
同時蒸発すると、白色固体物質(6)が6.05g(76%)
得られた。
B. 免疫原の合成 実施例15:カルバゾール/BSA免疫原(G59): BSA(0.5g)をリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0、0.05
M、10ml)に溶解し、次いでNMP(5ml)を加えた。前記
実施例で得たカルバゾール活性エステル溶液(G57)
(1.7ml)を加え、該反応体を室温で4時間回転により
混合した。pHをトリエチルアミン(TEA、0.5ml)+HCl
水溶液(2ml、1.0N)で調整した。混合操作を合計18時
間続け、次いで溶液をリン酸ナトリウム緩衝液中10%エ
タノール(pH8.0、0.1M、3×6.6)に対して透析し、
次いで蒸留水(3×6)に対して透析した。該溶液を
凍結乾燥すると、免疫原が白色綿毛状物質として得られ
た(0.51g)。
M、10ml)に溶解し、次いでNMP(5ml)を加えた。前記
実施例で得たカルバゾール活性エステル溶液(G57)
(1.7ml)を加え、該反応体を室温で4時間回転により
混合した。pHをトリエチルアミン(TEA、0.5ml)+HCl
水溶液(2ml、1.0N)で調整した。混合操作を合計18時
間続け、次いで溶液をリン酸ナトリウム緩衝液中10%エ
タノール(pH8.0、0.1M、3×6.6)に対して透析し、
次いで蒸留水(3×6)に対して透析した。該溶液を
凍結乾燥すると、免疫原が白色綿毛状物質として得られ
た(0.51g)。
実施例16:カルバゾール−チオフェン/BSA免疫原(G6
0): BSA(0.5g)をリン酸ナトリウム緩衝液(10ml、pH8.
0、0.05M)に溶解し、次いでNMP(5ml)を加えた。該溶
液に、実施例5(G58)のCT−BAE活性エステル溶液(1.
6ml)を加えた。該反応体を回転によって混合し、次い
で2時間後にTEA(0.5ml)及びHCl(2ml、1N)を順次加
えた。室温で18時間後、該溶液をリン酸ナトリウム緩衝
液中10%エタノール(pH8.0、0.1M、3×6.6)及び蒸
留水(3×6)に対して透析した。該溶液を凍結乾燥
すると白色綿毛状生成物が得られた(0.52g)。
0): BSA(0.5g)をリン酸ナトリウム緩衝液(10ml、pH8.
0、0.05M)に溶解し、次いでNMP(5ml)を加えた。該溶
液に、実施例5(G58)のCT−BAE活性エステル溶液(1.
6ml)を加えた。該反応体を回転によって混合し、次い
で2時間後にTEA(0.5ml)及びHCl(2ml、1N)を順次加
えた。室温で18時間後、該溶液をリン酸ナトリウム緩衝
液中10%エタノール(pH8.0、0.1M、3×6.6)及び蒸
留水(3×6)に対して透析した。該溶液を凍結乾燥
すると白色綿毛状生成物が得られた(0.52g)。
実施例17:ジベンゾフラン/BSA免疫原(G49): 前述のように製造したDbf−BAE(F246)(0.085g、0.
3mmol)及びHOSu(0.054g、0.47mmol)をNMP(2ml)に
溶解した。該溶液にDCC(0.084g、0.41mmol)を加え、
該反応混合物をN2雰囲気下、室温で18時間撹拌した。BS
A(0.5g)をリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0、0.05M)
に溶解し、次いでNMP(2.3ml)を加えた。該活性エステ
ル溶液を濾過し、タンパク質溶液に加えた。該反応体を
回転により室温で18時間混合した。濁った溶液をリン酸
ナトリウム緩衝液(pH8.0、0.1M)中の10%エタノール
(3×6.6)に対して室温で透析し、次いで蒸留水
(3×6)に対して2〜8℃で透析した。凍結乾燥
後、免疫原が白色粉末として得られた(0.47g)。
3mmol)及びHOSu(0.054g、0.47mmol)をNMP(2ml)に
溶解した。該溶液にDCC(0.084g、0.41mmol)を加え、
該反応混合物をN2雰囲気下、室温で18時間撹拌した。BS
A(0.5g)をリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0、0.05M)
に溶解し、次いでNMP(2.3ml)を加えた。該活性エステ
ル溶液を濾過し、タンパク質溶液に加えた。該反応体を
回転により室温で18時間混合した。濁った溶液をリン酸
ナトリウム緩衝液(pH8.0、0.1M)中の10%エタノール
(3×6.6)に対して室温で透析し、次いで蒸留水
(3×6)に対して2〜8℃で透析した。凍結乾燥
後、免疫原が白色粉末として得られた(0.47g)。
実施例18:ジベンゾフラン/KLH免疫原(F147): KLH(0.25g)をリン酸塩緩衝液(pH8.0、10ml)に溶
解し、次いでNMP(4ml)を加えた。該溶液に、1アリコ
ートの前述のように製造したイミダゾリド(F146a)
(0.45ml、0.19mmol)を加えた。1時間後、更に別の分
のイミダゾリド(0.30ml、0.13mmol)を加えた。該反応
混合物を室温で18時間撹拌し、次いでエタノール/pH8.0
リン酸塩緩衝液(1:3、4、×4)に対して3回透析
した。該溶液を部分的に凍結乾燥し、次いで解凍した。
固体を水で洗浄し、凍結乾燥すると、灰色がかった固体
物質が得られた。
解し、次いでNMP(4ml)を加えた。該溶液に、1アリコ
ートの前述のように製造したイミダゾリド(F146a)
(0.45ml、0.19mmol)を加えた。1時間後、更に別の分
のイミダゾリド(0.30ml、0.13mmol)を加えた。該反応
混合物を室温で18時間撹拌し、次いでエタノール/pH8.0
リン酸塩緩衝液(1:3、4、×4)に対して3回透析
した。該溶液を部分的に凍結乾燥し、次いで解凍した。
固体を水で洗浄し、凍結乾燥すると、灰色がかった固体
物質が得られた。
C. トレーサーの合成 実施例19:一般的トレーサー合成方法 A.一般的方法I:ハプテン(例えば25mg)を、テトラヒド
ロフラン(5ml、ベンゾフェノンケチルから新しく蒸留
したもの)又はジメチルホルムアミド(5ml)中のジシ
クロヘキシルカルボジイミド(0.07mmol)及びN−ヒド
ロキシスクシンイミド(NHS、0.2mmol)で、窒素雰囲気
下、0℃で2時間、且つ室温で約12時間活性化する。1
アリコート(1ml)の活性化ハプテンにアミノ担持フル
オレセイン誘導体(例えば4mg)を2滴のトリエチルア
ミンと共に加える。該反応混合物を12時間撹拌し、蒸発
させ、クロマトグラフィーにかける[例えばWhatman P
LKC18F、1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%
酢酸水溶液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2m
m、20×20cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
ロフラン(5ml、ベンゾフェノンケチルから新しく蒸留
したもの)又はジメチルホルムアミド(5ml)中のジシ
クロヘキシルカルボジイミド(0.07mmol)及びN−ヒド
ロキシスクシンイミド(NHS、0.2mmol)で、窒素雰囲気
下、0℃で2時間、且つ室温で約12時間活性化する。1
アリコート(1ml)の活性化ハプテンにアミノ担持フル
オレセイン誘導体(例えば4mg)を2滴のトリエチルア
ミンと共に加える。該反応混合物を12時間撹拌し、蒸発
させ、クロマトグラフィーにかける[例えばWhatman P
LKC18F、1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%
酢酸水溶液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2m
m、20×20cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
B.一般的方法II:ハプテン(例えば25mg)を塩化チオニ
ル(1ml)に溶解し、12時間60℃に加熱する。その後過
剰塩化チオニルを真空下で除去すると、ハプテンの酸塩
化物が残る。該酸塩化物をTHF(5ml、ベンゾフェノンケ
チルから新しく蒸留したもの)に溶解する。1アリコー
ト(1ml)の活性化ハプテンにアミノ担持フルオレセイ
ン誘導体(例えば4mg)を2滴のトリエチルアミンと共
に加える。該反応混合物を12時間撹拌し、蒸発させ、ク
ロマトグラフィーにかける[例えばWhatman PLKC18F、
1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%酢酸水溶
液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2mm、20×2
0cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
ル(1ml)に溶解し、12時間60℃に加熱する。その後過
剰塩化チオニルを真空下で除去すると、ハプテンの酸塩
化物が残る。該酸塩化物をTHF(5ml、ベンゾフェノンケ
チルから新しく蒸留したもの)に溶解する。1アリコー
ト(1ml)の活性化ハプテンにアミノ担持フルオレセイ
ン誘導体(例えば4mg)を2滴のトリエチルアミンと共
に加える。該反応混合物を12時間撹拌し、蒸発させ、ク
ロマトグラフィーにかける[例えばWhatman PLKC18F、
1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%酢酸水溶
液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2mm、20×2
0cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
C.一般的方法III:アミノ担持ハプテンをエーテル性塩化
水素で処理して塩酸塩に変換する。該塩酸ハプテン(例
えば50mg)をTHF(10ml、ベンゾフェノンケチルから新
しく蒸留したもの)に溶解し、窒素雰囲気下で、クロロ
ギ酸トリクロロメチル(100ml)で30分間処理する。そ
の後、揮発性物質を真空除去し、残渣をDMFに取り上
げ、複数のアリコートに分割し、アミノ担持フルオレセ
イン誘導体(例えば4mg)及び1滴のトリエチルアミン
で処理する。12時間撹拌した後、反応混合物を蒸発さ
せ、クロマトグラフィーにかける[例えばWhatman PLK
C18F、1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%酢
酸水溶液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2m
m、20×20cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
水素で処理して塩酸塩に変換する。該塩酸ハプテン(例
えば50mg)をTHF(10ml、ベンゾフェノンケチルから新
しく蒸留したもの)に溶解し、窒素雰囲気下で、クロロ
ギ酸トリクロロメチル(100ml)で30分間処理する。そ
の後、揮発性物質を真空除去し、残渣をDMFに取り上
げ、複数のアリコートに分割し、アミノ担持フルオレセ
イン誘導体(例えば4mg)及び1滴のトリエチルアミン
で処理する。12時間撹拌した後、反応混合物を蒸発さ
せ、クロマトグラフィーにかける[例えばWhatman PLK
C18F、1mm、20×20cm逆相プレート、メタノール/1%酢
酸水溶液、60:40、又はMERCKシリカゲル60F−254、2m
m、20×20cm、クロロホルム/メタノール、85:15]。
実施例20:カルバゾール/アミノメチルフルオレセイン
トレーサー(G61): 前述の方法で製造した活性エステル溶液(G57)の残
りを二分し、一方のアリコートに少量の5−AMF及び1
滴のDIEAを加えた。光を遮断して室温で72時間後、反応
混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレート、メ
タノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、下記の構
造のトレーサーが得られた。
トレーサー(G61): 前述の方法で製造した活性エステル溶液(G57)の残
りを二分し、一方のアリコートに少量の5−AMF及び1
滴のDIEAを加えた。光を遮断して室温で72時間後、反応
混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレート、メ
タノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、下記の構
造のトレーサーが得られた。
質量スペクトル:FAB,mH+@613 実施例21:カルバゾール/N−グリシルフルオレセインア
ミントレーサー 類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液
(G57)に少量のN−グリシルフルオレセインアミン及
び1滴のDIEAを加える。光を遮断して室温で約72時間
後、反応混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレ
ート、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、
下記の構造のトレーサーが得られた。
ミントレーサー 類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液
(G57)に少量のN−グリシルフルオレセインアミン及
び1滴のDIEAを加える。光を遮断して室温で約72時間
後、反応混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレ
ート、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、
下記の構造のトレーサーが得られた。
実施例22:カルバゾール−チオフェン/アミノメチルフ
ルオレセイントレーサー(G62): 活性エステル溶液(G58)の残りを二分し、一方のア
リコートに少量の5−AMF及び1滴のDIEAを加えた。光
を遮断して室温で72時間後、反応混合物を分離用TLC
(逆相、C18、1000μmプレート、メタノール/500mM N
aCl、6:4)で精製すると、下記の構造のトレーサーが得
られた。
ルオレセイントレーサー(G62): 活性エステル溶液(G58)の残りを二分し、一方のア
リコートに少量の5−AMF及び1滴のDIEAを加えた。光
を遮断して室温で72時間後、反応混合物を分離用TLC
(逆相、C18、1000μmプレート、メタノール/500mM N
aCl、6:4)で精製すると、下記の構造のトレーサーが得
られた。
質量スペクトル:FAB,mH+@759 実施例23:カルバゾール−チオフェン/N−グリシルフル
オレセインアミントレーサー: 類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液
(G58)に少量のN−グリシルフルオレセインアミン及
び1滴のDIEAを加える。光を遮断して室温で約72時間
後、反応混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレ
ート、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、
下記の構造のトレーサーが得られる。
オレセインアミントレーサー: 類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液
(G58)に少量のN−グリシルフルオレセインアミン及
び1滴のDIEAを加える。光を遮断して室温で約72時間
後、反応混合物を分離用TLC(逆相、C18、1000μmプレ
ート、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精製すると、
下記の構造のトレーサーが得られる。
実施例24:ジベンゾフラン/アミノメチルフルオレセイ
ントレーサー(F146b): 前述のように製造したイミジゾリド(F146a)1アリ
コート(0.6ml、0.25mmol)をAMF.HCl(0.05g、0.13mmo
l)と混合した。室温で18時間後、残渣を分離用TLC(シ
リカゲル、2×2mmプレート、メタノール/塩化メチレ
ン、1:9)で精製すると、下記の構造のトレーサーが得
られた。
ントレーサー(F146b): 前述のように製造したイミジゾリド(F146a)1アリ
コート(0.6ml、0.25mmol)をAMF.HCl(0.05g、0.13mmo
l)と混合した。室温で18時間後、残渣を分離用TLC(シ
リカゲル、2×2mmプレート、メタノール/塩化メチレ
ン、1:9)で精製すると、下記の構造のトレーサーが得
られた。
質量スペクトル:FAB,mH+@m/z630 実施例25:ジベンゾフラン/N−グリシルフルオレセイン
アミントレーサー 前述のように製造したDbf−BAE(F246)(0.022mmo
l)及びEEDQ(0.024mmol)をNMP(0.3ml)に溶解する。
室温で2時間撹拌した後、実施例17及び19のようにN−
グリシルフルオレセインアミン(0.022mmol)及びDIEA
(0.012ml、0.067mmol)を加える。光を遮断して室温で
18時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を分離用TLC
(逆相C18、1mm、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精
製すると、下記の構造のトレーサーが得られる。
アミントレーサー 前述のように製造したDbf−BAE(F246)(0.022mmo
l)及びEEDQ(0.024mmol)をNMP(0.3ml)に溶解する。
室温で2時間撹拌した後、実施例17及び19のようにN−
グリシルフルオレセインアミン(0.022mmol)及びDIEA
(0.012ml、0.067mmol)を加える。光を遮断して室温で
18時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を分離用TLC
(逆相C18、1mm、メタノール/500mM NaCl、6:4)で精
製すると、下記の構造のトレーサーが得られる。
D. 抗血清の製造 実施例26: 月齢約4〜5ケ月の雌ニュージーランドシロウサギ
に、皮下注射及び筋肉注射で、フロイント完全アジュバ
ント中0.2mgの免疫原を最初に接種し、次いで14日目に
0.1mgの免疫原をブースター注射し、その後毎月、フロ
イント不完全アジュバント中0.05mgでブースター注射を
行った。各ブースター注射の2週間後に採血を行い、血
清をトレーサーへの結合についてTDx計器で検査した。
最初の接種から6週間後、採血試料の一部に適当な明白
なミリ偏光(millipolarization)及びスパンを有する
抗体が観察された。
に、皮下注射及び筋肉注射で、フロイント完全アジュバ
ント中0.2mgの免疫原を最初に接種し、次いで14日目に
0.1mgの免疫原をブースター注射し、その後毎月、フロ
イント不完全アジュバント中0.05mgでブースター注射を
行った。各ブースター注射の2週間後に採血を行い、血
清をトレーサーへの結合についてTDx計器で検査した。
最初の接種から6週間後、採血試料の一部に適当な明白
なミリ偏光(millipolarization)及びスパンを有する
抗体が観察された。
E. ハイブリドーマの製造 実施例27: 週齢4〜6週間の雌BALB/cマウスに、生理食塩水1.88
ml中の前述のように製造したいずれかの免疫原(例えば
5mg/ml;0.06mlの免疫原)0.2mlを、100mgのモノホスホ
リル脂質A及びトレハロースジミクロエート(trehalos
e dimycloate)アジュバント(Ribi Immunochem Rese
arch,Inc.)と共に、4週間間隔で皮下注射する。最初
の接種から3ケ月後、抗体活性検査が陽性となった時点
で、最後の免疫感作から3日後にドナーマウスを殺し、
脾臓を無菌条件下で摘出し、5mlの冷却ダルベッコ最少
必須培地(DMEM)及び2.0mMのL−グルタミン(培地
A)を入れたプラスチックペトリ皿に入れる。脾臓を単
一細胞懸濁状になるように解離する。細胞を遠心分離し
てペレット化し、赤血球を10mMトリス緩衝液中0.83%塩
化アンモニウム2mlに再懸濁することによって溶解す
る。2分間静置した後、20〜30mlの新しい培地Aを加え
る。細胞を遠心分離によって洗浄し、10mlの新しい培地
Aに再懸濁する。
ml中の前述のように製造したいずれかの免疫原(例えば
5mg/ml;0.06mlの免疫原)0.2mlを、100mgのモノホスホ
リル脂質A及びトレハロースジミクロエート(trehalos
e dimycloate)アジュバント(Ribi Immunochem Rese
arch,Inc.)と共に、4週間間隔で皮下注射する。最初
の接種から3ケ月後、抗体活性検査が陽性となった時点
で、最後の免疫感作から3日後にドナーマウスを殺し、
脾臓を無菌条件下で摘出し、5mlの冷却ダルベッコ最少
必須培地(DMEM)及び2.0mMのL−グルタミン(培地
A)を入れたプラスチックペトリ皿に入れる。脾臓を単
一細胞懸濁状になるように解離する。細胞を遠心分離し
てペレット化し、赤血球を10mMトリス緩衝液中0.83%塩
化アンモニウム2mlに再懸濁することによって溶解す
る。2分間静置した後、20〜30mlの新しい培地Aを加え
る。細胞を遠心分離によって洗浄し、10mlの新しい培地
Aに再懸濁する。
本明細書に参考として包含されるKearney,Journal o
f Immunology,1979,123,1548に開示されているよう
に、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(HGPRT−,EC2.4.2.8)を欠失している
免疫グロブリン非分泌マウス骨髄腫細胞系(SP 2/0)
を融合相手として使用する。該骨髄腫細胞系を、20%の
ウシ胎児血清を加えた培地A中に維持する。融合前の3
日間、HGPRT+復帰細胞を殺すために、骨髄腫細胞に0.1
mM 8−アザグアニンを加える。融合当日、骨髄腫細胞
を回収し、培地Aで一回洗浄し、5mlの培地Aに再懸濁
する。骨髄腫細胞及び予め回収した脾臓細胞を血球計で
計数し、生存力をエリトロシンB染色排除によって評価
する。
f Immunology,1979,123,1548に開示されているよう
に、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(HGPRT−,EC2.4.2.8)を欠失している
免疫グロブリン非分泌マウス骨髄腫細胞系(SP 2/0)
を融合相手として使用する。該骨髄腫細胞系を、20%の
ウシ胎児血清を加えた培地A中に維持する。融合前の3
日間、HGPRT+復帰細胞を殺すために、骨髄腫細胞に0.1
mM 8−アザグアニンを加える。融合当日、骨髄腫細胞
を回収し、培地Aで一回洗浄し、5mlの培地Aに再懸濁
する。骨髄腫細胞及び予め回収した脾臓細胞を血球計で
計数し、生存力をエリトロシンB染色排除によって評価
する。
使用する融合方法は、本明細書に参考として包含され
るGefterら、Somatic Cell Genetics,1977,3,231に記
載の方法を改変したものである。無菌50ml円錐形遠心分
離管に1〜1.5×108個の脾臓細胞を同数のSP 2/0骨髄
腫細胞と共に導入する。骨髄腫−脾臓細胞懸濁液を1400
rpmで5分間遠心分離して細胞を一緒にペレット化す
る。上清を吸引除去し、管を軽くたたいて細胞ペレット
をほぐし、血清を含まないDMEM中50%ポリエチレングリ
コール(PEG、分子量1000、Sigma)1mlを細胞ペレット
に加える。1mlピペットでゆっくり吸い上げ放出を繰り
返すことにより、細胞を1分間で静かにPEG溶液に再懸
濁する。管を更に1分間手で保持し、次いで1mlの培地
Aをゆっくり加えてPEGを希釈する。撹拌又は混合を行
わずに、細胞を更に1分間静置する。更に20mlの培地A
を3〜5分間で加え、細胞を1400rpm、5分間でペレッ
ト化する。上清を吸引除去し、20%ウシ胎児血清、1×
10-4Mヒポキサンチン、4×10-7Mアミノプテリン及び3
×10-6Mチミジンを加えた20mlの培地A(培地C又はHAT
選択性培地)に細胞を再懸濁する。アミノプテリンは酵
素HGPRTを欠失した細胞に毒性を示し、従って非融合骨
髄腫細胞を総て殺す。融合細胞(ハイブリドーマ)はB
リンパ球(脾臓細胞)融合相手からHGPRTを得るため、H
AT中で生き残る。
るGefterら、Somatic Cell Genetics,1977,3,231に記
載の方法を改変したものである。無菌50ml円錐形遠心分
離管に1〜1.5×108個の脾臓細胞を同数のSP 2/0骨髄
腫細胞と共に導入する。骨髄腫−脾臓細胞懸濁液を1400
rpmで5分間遠心分離して細胞を一緒にペレット化す
る。上清を吸引除去し、管を軽くたたいて細胞ペレット
をほぐし、血清を含まないDMEM中50%ポリエチレングリ
コール(PEG、分子量1000、Sigma)1mlを細胞ペレット
に加える。1mlピペットでゆっくり吸い上げ放出を繰り
返すことにより、細胞を1分間で静かにPEG溶液に再懸
濁する。管を更に1分間手で保持し、次いで1mlの培地
Aをゆっくり加えてPEGを希釈する。撹拌又は混合を行
わずに、細胞を更に1分間静置する。更に20mlの培地A
を3〜5分間で加え、細胞を1400rpm、5分間でペレッ
ト化する。上清を吸引除去し、20%ウシ胎児血清、1×
10-4Mヒポキサンチン、4×10-7Mアミノプテリン及び3
×10-6Mチミジンを加えた20mlの培地A(培地C又はHAT
選択性培地)に細胞を再懸濁する。アミノプテリンは酵
素HGPRTを欠失した細胞に毒性を示し、従って非融合骨
髄腫細胞を総て殺す。融合細胞(ハイブリドーマ)はB
リンパ球(脾臓細胞)融合相手からHGPRTを得るため、H
AT中で生き残る。
実施例28:モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの選択 前述のように製造した各免疫原毎の細胞懸濁を75cm2T
フラスコに移し入れ、5%CO2インキュベーターで1〜
3時間、37℃でインキュベートする。該細胞懸濁液を培
地Cで1×106脾臓細胞/mlに希釈し、24ウェルCostarプ
レートの各ウェルに前記細胞懸濁液を1mlずつ加える。
これらのプレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベ
ートする。インキュベーション終了後、培地Cに2〜3
×105細胞/mlで懸濁した支持細胞(feeder cell)(非
免疫BALB/cマウス脾臓細胞)の懸濁液をCostarプレート
の24個のウェルの各々に1mlずつ加え、37℃、5%CO2で
14〜17日間インキュベートする。この期間に、一日置き
に、各ウェルから吸引によって培地を1mlずつ除去し、
代わりに新しい培地Cを1ml加える。10日目に、ハイブ
リドーマを含むウェルに由来する上清を抗体活性につい
て検査する。バックグラウンドより大きい抗体結合を示
す上清を選んで更にクローニングするために、数種のハ
イブリドーマ懸濁液を選択する。結合は例えば、実施例
16〜21に記載のトレーサーを用いてTDx分析器(Abbott
Laboratories)で評価し得る。抗体活性を有するとい
う理由で選択したウェルの細胞を、サンプリングから24
時間以内に限界希釈によりクローニングする。
マの選択 前述のように製造した各免疫原毎の細胞懸濁を75cm2T
フラスコに移し入れ、5%CO2インキュベーターで1〜
3時間、37℃でインキュベートする。該細胞懸濁液を培
地Cで1×106脾臓細胞/mlに希釈し、24ウェルCostarプ
レートの各ウェルに前記細胞懸濁液を1mlずつ加える。
これらのプレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベ
ートする。インキュベーション終了後、培地Cに2〜3
×105細胞/mlで懸濁した支持細胞(feeder cell)(非
免疫BALB/cマウス脾臓細胞)の懸濁液をCostarプレート
の24個のウェルの各々に1mlずつ加え、37℃、5%CO2で
14〜17日間インキュベートする。この期間に、一日置き
に、各ウェルから吸引によって培地を1mlずつ除去し、
代わりに新しい培地Cを1ml加える。10日目に、ハイブ
リドーマを含むウェルに由来する上清を抗体活性につい
て検査する。バックグラウンドより大きい抗体結合を示
す上清を選んで更にクローニングするために、数種のハ
イブリドーマ懸濁液を選択する。結合は例えば、実施例
16〜21に記載のトレーサーを用いてTDx分析器(Abbott
Laboratories)で評価し得る。抗体活性を有するとい
う理由で選択したウェルの細胞を、サンプリングから24
時間以内に限界希釈によりクローニングする。
実施例29:モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ培養物のクローニング 前述のように製造した抗体分泌ウェル内の細胞を、適
量の培地A+15%ウシ胎児血清(培地B)で10細胞/ml
の濃度に希釈し、各希釈細胞懸濁液100mlを、96ウェル
のCostarプレート3個のウェルに等分して加える。5×
105細胞/mlの培地B中支持細胞を各ウェルに100mlずつ
加え、プレートを37℃、5%CO2で14日間インキュベー
トする。上清を、前記実施例に記載のアッセイプロトコ
ルを使用して、抗体活性について再検査する。次いで、
抗体産生クローンを24ウェルCostarプレート内で支持細
胞なしに増殖させ、最後に25cm2 Tフラスコ内で増殖
させる。32×106細胞/mlのクローン試料を、液体窒素中
で、10%グリセロールを加えた培地B中に貯蔵する。次
いで、1〜2mlの試料をTDx計器プロトコルでディスプレ
イスメント(displacement)について更に評価し、1個
のクローンを無菌産生用に選択する。
マ培養物のクローニング 前述のように製造した抗体分泌ウェル内の細胞を、適
量の培地A+15%ウシ胎児血清(培地B)で10細胞/ml
の濃度に希釈し、各希釈細胞懸濁液100mlを、96ウェル
のCostarプレート3個のウェルに等分して加える。5×
105細胞/mlの培地B中支持細胞を各ウェルに100mlずつ
加え、プレートを37℃、5%CO2で14日間インキュベー
トする。上清を、前記実施例に記載のアッセイプロトコ
ルを使用して、抗体活性について再検査する。次いで、
抗体産生クローンを24ウェルCostarプレート内で支持細
胞なしに増殖させ、最後に25cm2 Tフラスコ内で増殖
させる。32×106細胞/mlのクローン試料を、液体窒素中
で、10%グリセロールを加えた培地B中に貯蔵する。次
いで、1〜2mlの試料をTDx計器プロトコルでディスプレ
イスメント(displacement)について更に評価し、1個
のクローンを無菌産生用に選択する。
実施例30:モノクローナル抗体のin vivo産生 大量のモノクローナル抗体を得るためのin vivo産生
方法は、前述の方法を「腹水」腫瘍としての増殖に適合
させることからなる。雌BALB/cマウスを、0.5mlのプリ
スタン(2,6,10,14−テトラ−メチルペンタデカン)の
腹腔内投与によって「初期免疫感作(prime)」する。
プリスタンは、増殖培地として機能するマウスの腹膜腔
内の漿液分泌(腹水)を誘起する無菌刺激原である。プ
リスタン投与から約4〜5週間後、実施例24に記載のよ
うなin vivo培養物から回収した1.5×104個の活発に増
殖するハイブリドーマ細胞を含むアリコートを、感作し
たマウスの腹膜腔に接種する。ハイブリドーマ細胞を投
与してから7日後、5〜10mlの腹水を各マウスから採取
する。硫酸アンモニウム沈降で精製すると、腹水1ml当
たり約24.6mgの抗体が得られる。
方法は、前述の方法を「腹水」腫瘍としての増殖に適合
させることからなる。雌BALB/cマウスを、0.5mlのプリ
スタン(2,6,10,14−テトラ−メチルペンタデカン)の
腹腔内投与によって「初期免疫感作(prime)」する。
プリスタンは、増殖培地として機能するマウスの腹膜腔
内の漿液分泌(腹水)を誘起する無菌刺激原である。プ
リスタン投与から約4〜5週間後、実施例24に記載のよ
うなin vivo培養物から回収した1.5×104個の活発に増
殖するハイブリドーマ細胞を含むアリコートを、感作し
たマウスの腹膜腔に接種する。ハイブリドーマ細胞を投
与してから7日後、5〜10mlの腹水を各マウスから採取
する。硫酸アンモニウム沈降で精製すると、腹水1ml当
たり約24.6mgの抗体が得られる。
実施例31:蛍光偏光イムノアッセイ 前述のように、本発明のEPIA用の試薬は、連結中間体
に特異的な本発明の免疫原に対するトレーサー及び抗体
を含む。更に、希釈緩衝液を含む一般的に使用されてい
るアッセイ溶液、並びにハプテン誘導体カリブレーター
及び対照も製造する。
に特異的な本発明の免疫原に対するトレーサー及び抗体
を含む。更に、希釈緩衝液を含む一般的に使用されてい
るアッセイ溶液、並びにハプテン誘導体カリブレーター
及び対照も製造する。
好ましい方法は、自動化TDx、ADx又はIMxシステムと
協働して使用するように設計されるが、手動アッセイも
実施できる。どちらの方法でも、検査試料は、バックグ
ラウンド読取りの実施前に、予備処理溶液及び希釈緩衝
液中抗体と混合し得る。次いで、検査溶液にトレーサー
を加える。インキュベーション後、蛍光偏光の読取りを
行う。
協働して使用するように設計されるが、手動アッセイも
実施できる。どちらの方法でも、検査試料は、バックグ
ラウンド読取りの実施前に、予備処理溶液及び希釈緩衝
液中抗体と混合し得る。次いで、検査溶液にトレーサー
を加える。インキュベーション後、蛍光偏光の読取りを
行う。
自動化アッセイでは、各カリブレーター、対照又は検
査試料の蛍光偏光値が測定され、TDx、ADx又はIMx計器
の出力テープに印字される。この計器は、非直線回帰分
析を用いて、各カリブレーターの偏光を濃度に対してプ
ロットすることにより、標準曲線も作成する。各対照又
は試料の濃度は記憶された曲線から読取られ、出力テー
プに印字される。
査試料の蛍光偏光値が測定され、TDx、ADx又はIMx計器
の出力テープに印字される。この計器は、非直線回帰分
析を用いて、各カリブレーターの偏光を濃度に対してプ
ロットすることにより、標準曲線も作成する。各対照又
は試料の濃度は記憶された曲線から読取られ、出力テー
プに印字される。
好ましい自動化ハプテン誘導体アッセイでは下記の試
薬を使用する。
薬を使用する。
1)前処理溶液。
2)リン酸カリウム緩衝液(0.15Mリン酸塩緩衝液、pH
7.5)中50%メタノールに希釈したトレーサー。
7.5)中50%メタノールに希釈したトレーサー。
3)ハプテン誘導体免疫原に対する抗体含有ウサギ抗血
清又はマウスモノクローナル抗体を、30%グリセロール
を加えたTDx緩衝液(0.01%ウシγ−グロブリン及び0.1
%アジ化ナトリウムを含むpH7.5の0.1Mリン酸塩緩衝
液)に希釈したもの。
清又はマウスモノクローナル抗体を、30%グリセロール
を加えたTDx緩衝液(0.01%ウシγ−グロブリン及び0.1
%アジ化ナトリウムを含むpH7.5の0.1Mリン酸塩緩衝
液)に希釈したもの。
4)TDx緩衝液を含む希釈緩衝液。
5)一組のカリブレーター 6)5mg/mlのハプテン誘導体を含む対照。
総ての偏光蛍光測定は、下記のプロトコルに従ってア
ッセイを実施したTDx計器を用いて行う。
ッセイを実施したTDx計器を用いて行う。
1)22.5mlの標準又は未知の検査試料、並びに各々12.5
mlの抗体試薬及び前処理試薬をキュベット内に導入し、
容量を1mlにするのに十分な量の希釈緩衝液を加え、バ
ックグラウンド強度の読取りを行う。
mlの抗体試薬及び前処理試薬をキュベット内に導入し、
容量を1mlにするのに十分な量の希釈緩衝液を加え、バ
ックグラウンド強度の読取りを行う。
2)各々12.5mlの前処理試薬及び抗体、25mlのトレーサ
ー、並びに第二の22.5mlの試料をキュベットに加え、容
量を2.0mlにするのに十分な量の希釈緩衝液を加える。
ー、並びに第二の22.5mlの試料をキュベットに加え、容
量を2.0mlにするのに十分な量の希釈緩衝液を加える。
3)該反応混合物をインキュベートする。
4)抗体へのトレーサー結合に起因する蛍光偏光を、前
記混合物の最終的偏光蛍光強度からバックグラウンドの
偏光蛍光強度を引き算することによって得る。
記混合物の最終的偏光蛍光強度からバックグラウンドの
偏光蛍光強度を引き算することによって得る。
5)未知の検査試料の偏光値を、ハプテン誘導体含量が
わかっているカリブレーターを用いて作成した標準曲線
と比較する。
わかっているカリブレーターを用いて作成した標準曲線
と比較する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C07D 409/14 C07D 409/14 C07F 9/572 C07F 9/572 A 9/655 9/655 9/6553 9/6553 C07H 21/04 C07H 21/04 Z C07K 16/44 C07K 16/44 G01N 33/53 G01N 33/53 J 33/532 33/532 Z (56)参考文献 特開 昭49−56973(JP,A) 特開 平5−16526(JP,A) 特開 平3−91504(JP,A) 特開 昭50−13412(JP,A) 特開 平6−228095(JP,A) 特開 平6−172307(JP,A) 特表 昭63−502511(JP,A) 特表 平7−505293(JP,A) 国際公開92/11388(WO,A1) 西独国特許出願公開3612831(DE, A1) Nat.Acad.Sci.Let t.,(1988),11(7),p.211− 2 Justus Liebigs An n.Chem.,(1974),(4), p.539−60 J.Med.Chem.,(1984), 27(8),p.967−78 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07D 209/88 C07D 307/91 C07D 333/76 C07D 407/12 C07D 409/14 CA(STN) REGISTRY(STN)
Claims (5)
- 【請求項1】以下の構造式: [式中、a及びa'は単独で、独立して水素、C1−C10−
アルキル、C1−C10−アルコキシ、C1−C10−アルキルチ
オ、ハロ−C1−C10−アルキル、C1−C10−アルキルアミ
ノ、ジ−(C1−C10−アルキル)アミノ、アリール−C1
−C10−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲ
ン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキ
シ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及
びこれらの保護形態からなる群の中から選択される1〜
4個の基であるか、あるいはa及びa'は隣接しかつこれ
らに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、
GはNR(Rは水素、C1−C10−アルキル,任意に置換さ
れたアリール、任意に置換されたスルホニル、チオフェ
ニル、カルボキシ、カルボキシアミド及びこれらの保護
形態である)であり、Aは、式−L−y(式中、yはホ
スホアミダイト、ホスホネート及びこれらの保護形態か
ら選択される基であり、Lは1〜50個の原子からなるス
ペーサー基である)の結合部分である]で表される化合
物。 - 【請求項2】aが水素であり、a'がアミノ、ハロゲン、
ヒドロキシ、ニトロ、又はそれらの保護形態である、請
求項1に記載の化合物。 - 【請求項3】LがC1−C10−アルキルである請求項1に
記載の化合物。 - 【請求項4】aが水素であり、a'が水素、アミノ、ハロ
ゲン、ヒドロキシ、ニトロ及びそれらの保護形態よりな
る群から選ばれる、請求項3に記載の化合物。 - 【請求項5】GがNであり、Rが水素、任意に置換され
たスルホニル及びチオフェニルから選ばれる、請求項1
に記載の化合物。
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ITBO20040697A1 (it) * | 2004-11-11 | 2005-02-11 | Consiglio Nazionale Ricerche | Sonde oligonucleotidiche |
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AU2015252024B2 (en) * | 2006-11-01 | 2018-02-22 | Ventana Medical Systems, Inc. | Haptens, hapten conjugates, compositions thereof and method for their preparation and use |
ES2383857B1 (es) * | 2010-11-23 | 2013-05-13 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Haptenos e inmunoreactivos y su uso en la obtención de anticuerpos de familia e inmunoensayos para quinolonas |
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GB8807275D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Synphar Lab Inc | Chemical compounds |
GB9008108D0 (en) * | 1990-04-10 | 1990-06-06 | Bayer Ag | Cycloalkano(b)dihydroindoles and-indolesulphonamides substituted by heterocycles |
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JPH06228095A (ja) * | 1993-02-04 | 1994-08-16 | Kirin Brewery Co Ltd | カルバゾール誘導体 |
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Justus Liebigs Ann.Chem.,(1974),(4),p.539−60 |
Nat.Acad.Sci.Lett.,(1988),11(7),p.211−2 |
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