JPH09500874A

JPH09500874A - カルバゾール及びジベンゾフラン誘導体用のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体

Info

Publication number: JPH09500874A
Application number: JP7505102A
Authority: JP
Inventors: フイーノ，ジエームズ・アール
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1997-01-28
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: AU4685693A; WO1995003296A1; CA2166782A1; EP0708767B1; EP0708767A4; JP3292731B2; ATE199149T1; DE69329935T2; DE69329935D1; EP0708767A1; ES2156128T3

Abstract

(57)【要約】カルバゾール及び／又はジベンゾフランをベースとする新規な連結ハプテン中間体及び関連の結合体、並びに該結合体の製造及び使用方法。前記コア構造をベースとするハプテンは、芳香族環の任意の位置にて多様な置換基で置換され得る。連結中間体、免疫原、トレーサー、固相支持体及び標識オリゴヌクレオチドの使用、結合体製造のための中間体の使用法、並びにアッセイトレーサーとして及び核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける、抗体の産生及び精製のための結合体の使用法を全て記載する。ハプテン化オリゴヌクレオチド及び抗ハプテン結合体を含むキットも記載する。

Description

【発明の詳細な説明】カルバゾール及びジベンゾフラン誘導体用のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体本発明は、新規なカルバゾール及びジベンゾフランハプテン化合物、連結（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）中間体、抗体産生に有用な免疫原、ハプテンのアッセイに有用なトレーサー化合物、ハプテンで標識したオリゴヌクレオチド、並びにこれらの試薬を含むキットに関する。本発明は更に、上述の新規なハプテン及びその誘導体の種々の製造及び／又は使用方法に関する。Ｉ．発明の背景多くの小分子はそれ自体では抗体応答を誘発せず、適切な免疫原性付与キャリヤー分子と結合して（免疫原になると）、ハプテンに対する抗体を産生し得ることは一般に公知である。この技術は多くの文献で議論されている。Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．，ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０：８５− １０５（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８０）及びＨｕｒｎ，Ｂ．Ａ．Ｌ．等，ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０：１０５−（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドプローブにハプテンを付加する方法は多数文献で知られている。このような結合体の文献の概説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（３）：１６５−１８７（１９９０）に記載されている。ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ）は共に、ビオチン又は同様のハプテンでプローブを標識するための技術を含むプローブ標識技術を記載しかつ商品化している。更には、１９９０年１２月１１日出願の同時係属中の米国特許出願第６２５，５６６号、及び１９９０年１２月２０日出願の米国特許出願第６３０，９０８号はそれぞれ５’末端及び３’末端でプローブを標識する方法を教示している。前述の同時係属中の出願明細書の全内容は、参考として本明細書の一部を構成するものとする。ハプテンラベル、即ち“フック”を使用して、（ハプテン化オリゴヌクレオチドでハイブリダイズし、特異結合パートナーを用いてハプテンを回収することにより）所望の標的配列を単離するか、又は（例えば発蛍光団、化学発光団、コロイド粒子もしくは酵素のような検出可能シグナル生成化合物と抗ハプテンとの結合体を用いて、ハプテン化オリゴヌクレオチドで標的をプローブすることにより）検出可能シグナル化部分を標的配列に付着させることができる。ある公知のオリゴヌクレオチド標識方法によれば、ラベル−ホスホアミダイト試薬を調製し、これを使用して合成中にラベルをオリゴヌクレオチドに付加する。例えば、Ｔｈｕｏｎｇ，Ｎ．Ｔ．等，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）、又はＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．等，米国特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳＯＲＤＥＲＮｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ −７−２４６，６８８）（１９８９）を参照されたい。しかしながら、ＤＮＡ合成反応条件は極めて苛酷であり（例えばヨウ素酸化及び水酸化アンモニウム開裂）、多数のハプテン（例えばビオチン及びフルオレセイン）は修飾しなければこれらの条件に容易には耐えられない。不安定ハプテンに有用な他のアプローチでは、保護末端アミンを有するリンカーをオリゴヌクレオチドの所望の末端に結合させる。アミンを脱保護し、より温和な条件下でラベルと反応させることができる。オリゴヌクレオチド自動化合成（例えばＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２（２０）：１８５９ −１８６２（１９８１）及び米国特許第４，９７３，６７９号及び第４，４５８，０６６号を参照されたい）が最も効果的なプローブ製造方法である場合が多い。しかしながら、自動化合成中に課される不利な条件が、この方法による標識で使用できるラベルの選択を制限する。本発明は、ＤＮＡ合成のかなり苛酷な条件に耐える新規なハプテンを用いることにより、上記欠点を克服する。従って、本発明のハプテンを用いれば、単離又は二次標識反応の介在を受けることなしに、自動化合成中にオリゴヌクレオチドを直接標識することができる。本発明は、ハプテンの特異結合パートナー（例えば抗体）を用いて、親和性分離法により、うまく標識したオリゴヌクレオチドを非標識オリゴヌクレオチドから容易に単離することができるという更なる利点を有する。トレーサー分子の製造法も公知である。例えば、蛍光偏光アッセイは、蛍光分子に結合したハプテン−被分析物質（analyte）を含むトレーサーを必要とする。通常、被分析物質−ハプテンと既知量のトレーサーとを、限定された量のハプテン特異結合メンバーについて競合させて、標識トレーサーを結合形態と遊離形態とに分ける。結合形態由来のシグナルは遊離形態由来のシグナルと識別可能であるので、被分析物質−ハプテンの量を推定することができる。シグナルの識別方法のひとつは蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）であり、文献及び以下に記載されているように“ミリ偏光”、“スパン”又は“相対強度”を測定することができる。ＦＰＩＡ技術は例えば、Ｊｏｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ａｎａｌｙｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，５：２３６−２４０（１９８１）及びＢｌｅｃｋａ，Ｌ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．ｐｐ．１−６（１９８３年３月）に記載されている。これらの文献の全内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。毒性副産物の検出及び浄化に関連してポリハロゲン化ジベンゾフランに対する抗体を産生した（即ちポリハロゲン化ジベンゾフランの免疫原性を実証した）研究者もいる。例えば、Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ等は、（２個のベンゼン環の間に、５員の１個の酸素を有するフランの代わりに、６員の２個の酸素を有するスペーサー環を有する点でジベンゾフランと異なる）ポリハロゲン化ｐ−ジオキシン、及びポリハロゲン化ジベンゾフランを用いて研究を行った。例えば、米国特許第４，７９８，８０７号、ヨーロッパ特許出願公開第３３２８１９号、Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，１６（８−９）：１６３５−３９（１９８７）、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，４５（３）；２２９−４３（１９８７）を参照されたい。Ａｌｂｒｏ等の米国特許第４，２３８，４７２号は、類似ポリ塩素化化合物に対する抗体及びこの化合物から製造した免疫原を記載している。Ａｌｂｒｏ等は、ポリ塩素化ジオキシン及びジベンゾフランに対する抗血清が、非塩素化物質とはほとんど反応性を有さなかったことを示している。Ｐａｎｄｅｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９４（１−２）：２３７−４６（１９８６）は、３−アジド−Ｎ−エチルカルバゾールに対する抗体及びこの化合物から製造した免疫原を記載している。しかしながら、上記出願人らは、本発明のカルバゾール及びジベンゾフラン誘導体の抗原性又は免疫原性を実証する技術に気づいていない。 II．発明の要約：本発明は一態様において、以下の構造式：［式中、ａ及びａ’は単独で、独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₁₀ −アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルチオ、ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル）アミノ、アリール−Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される１〜４個の基であるか、あるいはａ及びａ’は隣接しかつこれらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、Ｇは、Ｓ、Ｏ及びＮＲ（Ｒは水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル，任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及びこれらの保護形態である）の中から選択され、Ａは、式−Ｌ−ｙ（式中、ｙは第２分子中の官能基と直接又は活性化後に反応し得る官能基であり、Ｌは１〜約５０個の原子からなるスペーサー基である）の結合部分である］で表されるカルバゾール及びジベンゾフラン誘導体をベースとする化合物種から誘導される。本発明は他の態様において、以下の構造式：（式中、ａ、ａ’、Ｇ及びＡは先に定義した通りであり、Ｑは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オリゴヌクレオチド又は固体支持体である）で表される結合体化合物に関する。本発明は他の態様において、前記化合物（Ｉ）又は（II）と反応性のポリクローナル又はモノクローナル抗体に関する。このような抗体は、免疫原（II）を動物に注射して、抗体を回収する方法により産生することができる。更には、本発明は、以下に示す前記化合物の使用方法に関する：１．免疫原、トレーサー、標識オリゴヌクレオチド及び親和性固体支持体を調製するための化合物（II）の使用；２．抗体産生のための化合物（III：Ｑ＝免疫原性付与キャリヤー）の使用；３．抗体の単離又は精製のための化合物（III：Ｑ＝固体支持体）の使用；４．オリゴヌクレオチドと相補的な核酸の検出のための化合物（III：Ｑ＝オリゴヌクレオチド）の使用；及び５．ハプテン−被分析物質類似体の検出のための化合物（III：Ｑ＝検出可能シグナル部分）の使用。最後に、本発明は更に、本発明の化合物（例えばII：ｙ＝ホスホアミダイト又はIII：Ｑ＝オリゴヌクレオチド）を該化合物に対し反応性の抗体と組み合わせて含んでいるキットに関し、該抗体は、固体支持体又は検出可能ラベルに結合するか又はこれらに結合するように改変（adapted）されている。第２の例では、オリゴヌクレオチドプローブを標的でハイブリダイズし、抗体を使用して標的を分離又は検出してもよい。第１の例では、上記と同様に抗体を使用しつつ、ホスホアミダイトを使用して合成中に自身のオリゴヌクレオチドを標識することができる。 III．詳細な説明：以下の定義を本発明に適用する： “抗原”は、その通常の意味で定義され、チャレンジされた動物の免疫又は抗体応答を誘発し得る分子又は化合物を指す。それ自体抗原性ではない化合物は、化合物（“ハプテン”）を“免疫原性付与キャリヤー”分子と結合させて“免疫原”を形成することにより、免疫応答を誘発させる場合がある。そのようなハプテンは厳密な意味では“抗原性”とは言えないが、該ハプテンは抗原を模倣し得、且つ抗原と共通する多くの特性を有している。従って、抗原という用語とハプテンという用語はしばしば互換可能に用いられる。例えば、ハプテンと抗原とは共に、本明細書に用いられる場合、抗原又はハプテンと抗体との特異的結合反応に係わる抗原又はハプテンの領域を指す少なくとも１個の“決定基”を有する。ある種のハプテン及び抗原は２個以上の決定基領域又は部位を有しており、従って“多価”である。本質的に、免疫学的な特異性を基準として抗原、従って抗体を互いに区別するのは決定基である。本明細書では、“ハプテン”は、以下に示すコア構造：［式中、ａ及びａ’は単独で、独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₁₀ −アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルチオ、ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル）アミノ、アリール−Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される１〜４個の基であるか、あるいはａ及びａ’は、隣接しかつこれらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、Ｇは、Ｓ、Ｏ及びＮＲ（Ｒは水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル，任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及びこれらの保護形態である）の中から選択される］で表される任意の化合物であると定義される。前述したように、“免疫原”という用語は、ハプテン又は抗原とキャリヤー分子との結合体を指す。キャリヤーはタンパク質又はペプチドであることが多い。公知の免疫原性付与キャリヤーには、例えば天然ポリ（アミノ酸）、アルブミン及び血清タンパク質（例えばウシチログロブリン（ＢＴＧ）、グロブリン、リポタンパク質、眼球レンズタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）等）が含まれる。あるいは、ポリリシン等のような合成ポリ（アミノ酸）を使用することができる。しかしながら、ハプテンに抗原性を付与し得るいずれの分子も“免疫原性付与キャリヤー”である。本明細書に用いられている“ハプテン特異的結合メンバー”という用語は、ハプテンに特異的に結合する抗体又はレセプターのようなメンバーを指す。ハプテン上の決定基は、ハプテンに対する結合メンバーの特異的結合に関与する。最も一般的且つ通常の特異的結合メンバーは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。一般に、“アルキル”、“アルケニル”及び“アリール”といった用語は、有機化学分野の当業者が通常該用語に属すると考える意味を有する。例えば、アルキルは、アルカンから水素１個を除去して誘導され得、一般式Ｃ_nＨ_2n+1を有する一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指す。アルキル置換基は、１〜約３０個、より実際的には１〜約２０個の炭素を有していてよい。“低級アルキル”とは、１〜約１０個の炭素を有するアルキルを指す。低級アルキルの例には、ＣＨ₃−、ＣＨ₃ＣＨ₂−、ＣＨ₃ＣＨ（ＣＨ₃）−及びＣＨ₃（ＣＨ₂）₄−が含まれる。 “アルキレン”とは、直鎖又は分枝鎖飽和炭化水素から水素原子２個を除去して誘導される二価の基を指す。その例には、メチレン、１，２−エチレン、１，３−プロピレン、２，２−ジメチルプロピレンなどが含まれる。 “ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル”とは、以下に定義されているような、少なくとも１個のハロゲン置換基を有する低級アルキル基、例えば、クロロメチル、フルオロメチル、クロロエチル、トリフルオロメチルなどを指す。 “Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルコキシ”とは、酸素原子を介して結合された上記に定義のようなアルキル基を指す。そのようなアルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどが含まれる。 “Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルアミノ”とは、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ及びエチルメチルアミノを含む、上記に定義されているような１個又は２個の低級アルキル基で置換されたアミノ基を指す。 “Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルチオ”とは、メチルチオ、エチルチオ、ジメチルチオ及びジエチルチオを含む、上記に定義のような１個又は２個の低級アルキル基で置換されたチオ基を指す。 “アルケニル”とは、アルケンから水素原子１個を除去することにより誘導され得、一般式Ｃ_nＨ_2n-1を有する一価の直鎖又は分枝鎖脂肪族基を指す。アルケニル置換基は、１〜約３０個、より実際的には１〜約２０個の炭素を有していてよい。“低級アルケニル”とは、１〜約１０個の炭素を有するアルケニルを指す。“オレフィン性”という用語はアルケニルと同義語である。 “アリール”とは、芳香族炭化水素又はヘテロ芳香族化合物から水素１個を除去して誘導される一価の基を指す。アリール置換基は、フェニル、ナフチル及び２−チエニルが有しているような環構造を有している。典型的には、アリール置換基は平面の対向側部に残留する各炭素のπ電子雲と同一平面内にある。アリール置換基はヒュッケル（４ｎ＋２）π電子規則に適う。 “アリールアルキル”とは、上記に定義のような１〜２個の低級アルキル基で置換された上記定義のアリール基を指す。保護基は、特定条件下では除去できるが、他の条件下では中間反応中に反応性原子又は官能基を一時的に保護又は隠蔽する基と定義される。ヒドロキシル、アミノ及びチオール官能基の保護基は当業界ではよく知られている（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮＹ，１９８１）。ヒドロキシル官能基は通常、アルキル若しくはアリールエーテル（アルキル、アリール、アルケニル）、シリルエーテル（シリル）、エステル（アシル）、カーボネート（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ− アリール、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アルケニル）及びカルバメート（−Ｃ（＝Ｏ）− ＮＨ−アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アリール、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アルケニル）として保護される。アミノ官能基は通常、カルバメート（−Ｃ（＝Ｏ）− Ｏ−アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アリール、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アルケニル）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−アリール、−Ｃ（＝Ｏ）− アルケニル）、環式イミド（フタロイル）、Ｎ−ベンジル誘導体〔−ＣＨ_(n)アリール_(3-n)，ｎ＝１〜３〕、イミン誘導体〔＝ＣＨ_(n)アルキル_(2-n)，＝ＣＨ₍ _n) アリール_(2-n)，ｎ＝０〜２〕、シリル誘導体（シリル）、Ｎ−スルフェニル誘導体〔Ｓ−アリール、−Ｓ−ＣＨ_(n)アリール_(3-n)，ｎ＝０〜３〕、及びＮ− スルホニル誘導体（−ＳＯ₂−アリール、−ＳＯ₂−アルキル）として保護される。チオール官能基は通常、チオエーテル〔−ＣＨ_(n)アリール_(3-n)，ｎ＝１−３，アルキル〕、チオエステル（アシル）、チオカーボネート〔−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ −アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アリール、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アルケニル〕、チオカルバメート〔−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アリール、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−アルケニル〕、及びジスルフィド（−Ｓ−アルキル、アリール）として保護される。２個以上の保護基が必要な場合には、各基を種々の保護基から独立に選択してよいことが理解されよう。実際、当業者はどの保護基がどの官能基に対して慣用的であるかわかっている筈である。本明細書中、“結合部分”Ａは“連結部”（ｔｅｔｈｅｒ）とも称される。これらの用語は、式： −Ｌ−ｙ（式中、ｙは直接又は活性化後に第二分子、例えば結合パートナーＱ中の官能基と反応し得る反応性官能基であり、Ｌは１〜５０個の炭素及びヘテロ原子からなるスペーサー基である）で表されるスペーサー分子を指す。典型的には、Ｌは、１０個以下のヘテロ原子を含み、飽和又は不飽和の直鎖若しくは分枝鎖又は環式部分として配置されるが、但し、２個以下のヘテロ原子は配列−Ｌ−ｙ中で直接結合し得、配列−Ｌ−ｙは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、環式部分は６個以下のメンバーを含み、且つ分枝は炭素原子上でのみ生起され得る。Ａが既にＱに結合している式においては、基ｙが該式から脱離して、Ａ＝−Ｌ−となっている。典型的には、ｙは、ヒドロキシ（−ＯＨ）、チオール（−ＳＨ）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ₂）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、離脱基、マイケル受容体、ホスホアミダイト、ホスホネート及びこれらの官能基の保護形態からなる群から選択される。合成の際には、結合部分はしばしば、ｘ −Ｌ−ｙ〔ここで、Ｘもハプテン又は−Ｒ上の官能基と反応し得る官能基（ｙと同じ群から選択される）である〕で示される二官能性化合物からなる。多くの二官能性結合物質が当業者には公知である。例えば、ヘテロ二官能性結合物質が、例えば米国特許第５，００２，８８３号（Ｂｉｅｎｉａｒｚ）に記載されている。これらの結合物質は、該物質の末端が異なる官能基に対して特異性を有するために好ましい場合がある。“マイケル受容体”は当業界では以下のように定義されている： “α，β−不飽和ケトン、アルデヒド、ニトリル又はカルボン酸誘導体の炭素- 炭素二重結合へのエノラート（又は類似）アニオンの求核付加はマイケル反応として知られているプロセスであり...しばしばマイケル受容体と称されるこの反応における不飽和化合物は、カルバニオン中間体を安定化し得る官能基を有する任意の不飽和系を含み得る...マイケル受容体には更にアルコール、チオール及びアミンのような種々の求核剤を付加し得る。” Ｈ．Ｏ．Ｈｏｕｓｅ，ＭｏｄｅｒｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃＲｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，ＭｅｎｌｏＰａｒｋＣＡ，１９７２，５９５−５９６ページ。この種の求核付加（それによってマイケル受容体が形成される）に対して二重結合を活性化し得る一般官能基には、−ＣＨ（＝Ｏ）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ₂、−ＣＮ、−ＮＯ₂、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ †、−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ†（ここで、Ｒ†はアルキルであってもアリールであってもよい）が含まれる。従って、マイケル受容体の例としては、〔ここで、ｄ、ｅ及びｆは独立して、水素、アルキル又はアリールであり得、Ｕは、−ＣＨ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ₂、−ＣＮ、−ＮＯ₂、 −Ｓ（＝Ｏ）Ｒ†及び−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ†の中から選択され、Ｒ†はこの場合もアルキル又はアリールである〕が挙げられる。特に好ましいマイケル受容体はマレイミドである：固体支持体は多岐にわたる支持体材料を指す。ポリマープラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン及びポリテトラフルオロエチレン）がその例である。ガラスも有用な支持体である。支持体は、ビーズ、微粒子、チューブ、ロッド、プレート、ウエル及びキュベットを含む任意のサイズ又は形状のものであってよい。支持体は、結合用の官能基を含んでいてもよいし、又は結合前に誘導体化してもよい。あるいは、支持体をコーティングしたり又は吸着させてもよい場合がある。支持体は、サイズ、重量、形状、電荷、磁気特性又は他の物理特性に基づいて、試薬溶液から物理的に分離可能でなければならない。本明細書には、固体支持体の２種の異なる使用が記載されていることが理解されよう。第１に、抗体は連結中間体に結合した支持体を用いて精製し得、第２に、抗ハプテン抗体が付着した支持体は、ハプテン標識したオリゴヌクレオチドの分離及び／又は検出、並びに競合ハプテン−類似体アッセイに有用である。動物に、以下に記載の免疫原に対する免疫応答を生起させて抗体を産生させる。当業界で一般に公知の技術に従って、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ又はウシのような動物に免疫原を一連の注射により投与する。本発明により、上記のハプテンから誘導された本発明の免疫原に応答して抗体を産生させる。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も免疫原上の特異的なエピトープを認識し、本発明では一般にポリクローナル抗体を用いたが、どちらも適当な抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、それぞれが特異的なエピトープを認識し、キャリヤー分子上に存在し得るものもある多数の抗体の混合物からなる。ポリクローナル抗体の産生技術は一般に当業界ではよく知られている。免疫原のハプテン部分に対して特異的な抗体の単離は当業者が容易になし得る技術である。アフィニティークロマトグラフィーが一つの方法である。ただ一つの決定基又はエピトープに特異的なモノクローナル抗体は、上記のような免疫応答を誘発させることにより産生し得る。適切なインキュベーション及び追加免疫注射の後、標準法により動物の脾臓からＢ−リンパ球細胞を取り出し、次いで、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，“ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＣｕｌｔｕｒｅｏｆＦｕｓｅｄＣｅｌｌｓＳｅｃｒｅｔｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙｏｆＰｒｅｄｅｆｉｎｅｄＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）に記載のもののような標準的な方法によりＢ−リンパ球細胞を骨髄腫融合パートナーと融合させる。本明細書に用いられている“ラベル”とは、直接検出可能なシグナルを生成し得るラベル、及び間接的に検出され得るハプテンのような分子を指す。この意味で、“ラベル”は“リポーター”又は“フック”と互換可能である。しかし、“ ラベル”と、通常は電磁線シグナルである測定し得る検出可能シグナルを生成し得る部分とを区別する必要がある場合もある。ハプテンタイプのラベル又は“フック”と区別する必要がある場合には、“検出可能ラベル”若しくは“シグナル化（signaling）”ラベル又は部分という用語を用いる。 “トレーサー”という用語は、ハプテンと検出可能シグナル化ラベルとの結合体を指す。トレーサーにより、未知溶液中に存在するハプテンの量の測定又はアッセイが可能となる。トレーサーのシグナル化ラベルは以下に記載の蛍光分子であることが好ましいが、該ラベルは、例えば、放射性同位体、化学発光団及びコロイド粒子を含むがそれらには限定されない他の検出可能なラベルを包含し得る。ＦＰＩＡにおいて、トレーサーを形成するための蛍光分子の選択はフレキシブルであることが有利であり、多分に専門家の選択による。蛍光ラベルはそれらのサイズに応じて選択されることが理想的であり、即ち、分子が小さければ小さい程分子の回転速度が高くなり得、従ってＦＰＩＡトレーサー成分としてより有効になることが容易に理解されよう。本発明において好ましい蛍光ラベルはフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体である。これらの化合物は、適切な波長の偏光により励起されると蛍光応答を生成し、それによって蛍光偏光測定が可能になる。例えば、以下のフルオレセイン誘導体のいずれを用いてもよい：フルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、ａ−ヨードアセトアミドフルオレセイン、４′−アミノメチルフルオレセイン、４′−Ｎ−アルキルアミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン −２−イル−アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），４−クロロ−６−メトキシ− １，３，５−トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート。特に好ましい誘導体は、アミノメチルフルオレセイン及び５ −カルボキシフルオレセインである。特に他の検出技術に関連した他のトレーサーの検出可能ラベルも当該文献において公知である。 “オリゴヌクレオチド”（しばしば“オリゴ”と略記される）という用語は、最低で約５個のヌクレオチド、最大で数百個のヌクレオチドを有する核酸の短セグメントを指す。約３０個より長いヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドはしばしばポリヌクレオチドと称されるが、本明細書においてオリゴヌクレオチドという用語は、そのような長鎖のものも包含するように用いられている。核酸はＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、一般にＤＮＡが好ましい。ＤＮＡは天然のものでも合成のものでもよいが、本発明はＤＮＡの自動化合成において優れている。Ａ．試薬１．ハプテンａ．ハプテンの構造構造的にカルバゾール又はジベンゾフランに類似しているハプテンは、以下の一般構造式：（式中、ＧはＯ（ジベンゾフラン）又はＮＲ（カルバゾール）であり、ａ、ａ’ 及びＡは先に定義した通りである）で表される。ｂ．ハプテンの合成慣用的な化学的手法により、市販のカルバゾール及びジベンゾフランコア構造を用いてハプテン誘導体を製造することができる。合成の詳細は実施例で説明する。更に、置換基ａ及びａ′が隣接し且つ一緒になって縮合環を形成している場合には該置換基には制限があることは当業者が理解するところであろう。フェニルに縮合した環は通常４〜１０個の原子、好ましくは６〜８個の原子を有している。ｃ．連結中間体リンカー分子ｘ−Ｌ−ｙ（別の分子又は高分子上の相補的反応性基に結合し得る反応性官能基ｘ及びｙを含む）を用い、当業者には公知の方法によりハプテンを変換させて、連結部又は側鎖−Ｌ−ｙを有するハプテン中間体化合物を生成させる。勿論、ハプテン分子の残留部分は所望の決定基の構造と実質的に類似した構造を保有している。ハプテンを別の分子に結合させる多くの方法が当業界では公知である。好ましい方法は、ハプテン又はリンカー上の官能基を活性化させ、活性化された基を介してリンカー又は連結部をハプテンに結合させることを含む。連結部の自由末端ｙは、所望の結合体分子Ｑとの結合に利用可能である。当業界では公知のように、Ｑ上の官能基を活性化させることが望ましい場合があり、第２のリンカーを用いる場合もある。所望のｙ基に応じて、（合成を容易にするために）連結部をハプテンに結合させた後にｙを別のｙと（例えばホスホアミダイト又はホスホネートをヒドロキシルと）交換することが好ましい場合もある。１つの可能な一般的活性化／結合スキームを以下に示す。特定例は所望生成物を製造するための種々の手段に応じる。ヒドロキシル基を有するハプテン（Ｉ）を活性化リンカー又は連結部分子ｘ− Ｌ−ｙ（式中、ｘは脱離基であり、Ｌは先に定義したスペーサー基であり、ｙはヒドロキシ、カルボキシ及びアミノからなる群の中から選択される）と反応させて、連結中間体（II）を生成する。例えば、ハプテンヒドロキシルを塩基中で４ −ブロモ酪酸エチル（ここで、ｘはＢｒ、Ｌは−（ＣＨ₂）₃−、ｙはＣＯ₂Ｃ₂Ｈ₅ である）と反応させてもよい。従って、連結部−Ｌ−ｙは−Ｏ（ＣＨ₂）₃−ＣＯ₂Ｃ₂Ｈ₅になる。エチルエステルを鹸化により脱保護し、カルボン酸にしてもよい。カルボン酸は、結合体パートナーＱの官能基と反応し得る反応性基である。これらの各反応工程の反応条件は、実施例の項の特定例又は当該文献から得ることができる。２免疫原ａ．免疫原の構造免疫原は、多岐にわたる連結中間体から産生することができる。本発明の免疫原は、以下の一般構造式：（式中、ａ、ａ’、Ｇ及びＡは先に定義した通りであり、Ｑは免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オリゴヌクレオチド又は固体支持体である）で表される。典型的なキャリヤーは前述した。免疫原は主に抗体の産生に使用される。ｂ．免疫原の合成本発明の免疫原において、連結中間体（II）の連結部官能基ｙは当業者には公知の数種の方法のいずれかでタンパク質キャリヤー上のアミノ基と反応し得る。カルボキシル反応性基では、一般的に極めて安定なアミド結合を形成することが好ましい場合が多い。アミド結合は、先ず連結中間体のカルボキシル部分ｙを１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドのような活性化試薬及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような添加剤と反応させて活性化することにより形成される。次いで活性化形態のハプテンを免疫原性付与キャリヤーを含む緩衝溶液と反応させる。あるいはカルボン酸ハプテンを、所要により単離して、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド又は混合カーボネートに変換し、次いで免疫原性付与キャリヤーと結合させることができる。アミド結合の形成には上記に列挙された以外の多くの試薬が使用され得ることは当業者が理解するところであろう。末端アミン官能基を含む連結中間体〔II、ｙ＝−ＮＨ₂〕は、適当な溶媒（例えばアセトニトリル又はジメチルホルムアミド）中のＮ，Ｎ′−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させることにより高反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換し得る。次いで、得られたウレタンを緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーと反応させて免疫原を得る。末端アルデヒド官能基を含む連結中間体〔［II］、ｙ＝−ＣＨ（＝Ｏ）〕は、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下に、当業者には公知の方法で還元アミノ化することにより、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーに結合し得る。あるいは、アルコール基を含む連結中間体〔［II］、ｙ＝−ＯＨ〕は、先ず該中間体をホスゲン又はホスゲン等価物（例えばジホスゲン、トリホスゲン又はカルボニルジイミダゾール）と反応させて、高反応性クロロホルメート又はイミダゾロホルメート誘導体を形成する（通常単離せず）ことにより免疫原性付与キャリヤーに結合し得る。次いで、得られた活性ギ酸エステルを、緩衝水溶液中の免疫原性付与キャリヤーと反応させて免疫原を得る。免疫原の場合と類似の方法で、連結中間体を、該中間体のリンカー上の反応性基ｙと相補的に反応し得るアミノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基のような官能基を有する固体支持体に結合させることができる。それによって、ハプテンに対する抗体の分離又は精製に用いることができる固相が得られる。２．抗体抗体の産生法は一般に知られており、先に要約した通りである。本発明のハプテン及び免疫原を用いた特定例を後述の実施例に示す。３．トレーサーａ．トレーサーの構造本発明のトレーサーは上記の免疫原と非常に似通っているが、但しＱはシグナル化部分である。トレーサーは上述の一般構造式で表される。上記のように、均質な系中に検出され得る検出可能ラベルが好ましい。特に好ましいのは、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体である。本発明のトレーサーは、このハプテンで誘導体化されたオリゴヌクレオチドを含むカルバゾール及びジベンゾフラン誘導体についてのアッセイに用いられる。本発明のトレーサーの場合、リンカーが１〜１２個の炭素及びヘテロ原子からなることが好ましい。より長鎖のものは、その偏光特性を調節する高分子からラベルを遠ざけることにより示差偏光作用を低減させる。ｂ．トレーサーの合成連結部中にアミノ基、カルボキシル基又はアルコール基を含む連結中間体（II ）を、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体に結合して本発明のトレーサーを製造することができる。末端アミン官能基を含む連結中間体は、適当な溶媒（例えばアセトニトリル又はジメチルホルムアミド）中のＮ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させて、高反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換することができる。あるいは、アミン-末端基を含む連結中間体はイソシアネートに対して活性化することができる。次いで、得られた生成物をアミノフルオレセイン誘導体と反応させて尿素トレーサーを形成する。アミノ基含有ハプテンも、適当な溶媒中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したカルボキシフルオレセイン誘導体に結合し得る。リンカー上の末端カルボキシル基を含む連結中間体は、先ず、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドのような活性化試薬及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような添加剤と反応させて、連結部のカルボン酸部分を活性化することによりアミノ-末端フルオレセイン誘導体に結合し得る。次いで、活性化中間体をフルオレセイン誘導体溶液と反応させてトレーサーを形成する。あるいは、カルボン酸ハプテンを、所要により単離して、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド又は混合カーボネートに変換し、次いでフルオレセイン誘導体と結合させてもよい。あるいは、アルコール基を含む連結中間体は、先ず、該中間体をホスゲン又はホスゲン等価物（例えばジホスゲン、トリホスゲン又はカルボニルジイミダゾール）と反応させて、高反応性クロロホルメート又はイミダゾロホルメート誘導体を形成（通常単離せず）することによりフルオレセインに結合し得る。次いで、得られた活性ギ酸エステルをアミノ末端フルオレセイン誘導体と反応させてトレーサーを形成する。４．オリゴヌクレオチドａ．オリゴヌクレオチドの構造オリゴヌクレオチドは多岐にわたる連結中間体から生成され得る。以下に記載のように、ハプテンで標識したオリゴヌクレオチドは、増幅アッセイを含む核酸ハイブリダイゼーションアッセイに用いられる。ハプテン化オリゴヌクレオチドプローブはＰＣＲ産物（例えばヨーロッパ特許出願公開第３５７０１１号参照）及び／又はＬＣＲ産物（例えばヨーロッパ特許出願公開第４３９１８２号参照）の分離及び／又は検出に十分適合する。他のハプテン（例えば、ビオチン、フルオレセイン、ダンシル、アセチルアミノフルオレン及びヨード -アセチルアミノフルオレンなど）と組み合わせた本発明ハプテンで標識したプローブは、多種多様なＰＣＲ及びＬＣＲに特に有用である。ｂ．連結オリゴヌクレオチドの合成本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、連結部官能基ｙはトレーサー及び免疫原の場合と同義であってよい。オリゴヌクレオチドは、官能基ｙをオリゴヌクレオチドのアミノ又はヒドロキシル官能基と反応させるか、又はＨ−ホスホネート試薬の酸化的アミノ化を介してリンと直接反応させて標識させることができる。アミノ官能基はプリン及びピリミジン塩基中に存在するが、これらの部位は、ハイブリダイゼーションにおける該部位の重要性のために標識にはあまり好ましくない。アミノ官能基は、Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ）のような試薬を用いてオリゴヌクレオチドの５′ 及び／又は３′末端に導入することができる。ヒドロキシル官能基は一般に自動化合成中に形成される。オリゴヌクレオチドの３′末端にハプテンを付加するための好ましい方法は、本出願人が１９９０年１２月２０日付けで出願した同時係属中の米国特許出願第６３０，９０８号に開示されており、該明細書の内容は既に本明細書に組み込まれている。５’末端にハプテンを付加するための好ましい方法は、上記「発明の背景」の項に引用したＴｈｕｏｎｇら又はＣｏｈｅｎらにより記載されたホスホアミダイト試薬を用いたものである。例えば、ホスホアミダイトｙが：である連結ハプテン中間体（II、ｙ＝ホスホアミダイト）は、連結ハプテン（II 、ｙ＝−ＯＨ）を、以下の図式Ｉに記載のようにＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ− （２−シアノエチル）クロロホスホアミダイトと反応させることにより製造される。図式Ｉの出発化合物は一般式１〔ここで、Ｗは、飽和又は不飽和の直鎖若しくは分枝鎖又は環式部分として配置された１〜約５０個の原子からなるスペーサー基であり、但し、（ａ）２個以下のヘテロ原子は直接結合しており、（ｂ）環式部分は６個以下のメンバーを含み、（ｃ）分枝は炭素原子上でのみ生起するものとし、Ｒ¹及びＲ¹⁰は独立して、水素、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、アミノ保護基又はアリールであるか、あるいはＲ¹又はＲ¹⁰は、それらが結合している窒素原子及びＷと一緒になって環式アミンを形成し得る］のエステルである。化合物１を、グリム（glyme）の存在下で塩基加水分解し（工程１）、次いでメルドラム（Ｍｅｌｄｒｕｍ）酸（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２）及びＲ²ＯＨ（Ｒ²は１〜６個の炭素原子を有するアルキルである）と反応させて、β−ケトエステル３を生成する。次いで、これをホウ水素化物により低温（例えば１５〜３０℃）で２３〜２４時間還元し（工程４）、ゆっくり中和してジオール４を得る。気体の急な放出という危険な状態を避けるために、中和は非常にゆっくり実施しなければならない。次いで、ジメトキシトリチル化（工程５）によりジオールの第一級ヒドロキシルを保護して、連結ハプテン５を生成する。次いで、連結ハプテンを第二アルコール部分でホスホアミダイト化（工程６）してホスホアミダイト結合ハプテン６を得る。次いで、ホスホアミダイト結合ハプテンを使用して、合成オリゴヌクレオチドの任意の位置にハプテンを導入することができる。あるいは、連結ハプテン（II，ｙ＝−ＯＨ）を三塩化リンと反応させ、次いで加水分解して、ｙがホスホネートである連結ハプテン中間体（II，ｙ＝ホスホネート）を製造する。ホスホアミダイト及びホスホネート誘導体は共に、標準プロトコルを用いて、合成中にオリゴヌクレオチド内に容易に組み込まれる。あるいは、連結ハプテン（II，ｙ＝−ＮＨ₂）を、四塩化炭素の存在下、酸化的アミド化により、既にオリゴヌクレオチドに組み込まれたホスホネート基と反応させる。オリゴヌクレオチドの固相合成手順の詳細な説明は、例えば、参考として本明細書の一部を構成するものとする米国特許第４，４０１，７９６号及び第４，４５８，０６６号に詳しく記載されている。本発明の一実施態様では、ハプテン標識したオリゴヌクレオチドの合成は、ハプテンホスホアミダイトを、成長するオリゴヌクレオチド鎖に結合したヌクレオチドの５’ヒドロキシルと反応させることにより達成される。標識したオリゴヌクレオチドを標準的な手順（例えばＧａｉｔ，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：１９８４））により精製する。勿論、市販の自動化合成機（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３８０Ｂ）での合成法によりオリゴヌクレオチドを産生することがかなり一般的な方法である。Ｂ．ＦＰＩＡアッセイ法トレーサー及び本発明の免疫原に対して産生された抗体により、ハプテン誘導体を半定量測定するための本発明の蛍光偏光アッセイにおいて優秀な結果が得られる。該アッセイは実施例２７の一般的手順に従って行われる。好ましい手順は、ＴＤｘ（登録商標）ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＳｙｓｔｅｍ又はＡＤｘ^TMＡｂｕｓｅｄＤｒｕｇＳｙｓｔｅｍ，ＩＭｘ（登録商標）ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＭｉｃｏｒｏｐａｒｔｉｃｌｅＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＥＩＡ）Ａｎａｌｙｚｅｒ（これらのシステムは全てＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能である）上で行うように設計されている。ＴＤｘ、ＡＤｘ又はＩＭｘシステムを用いる場合、アッセイは、一旦試験試料が準備されたら、前処理から最終読み取りまで完全に自動化されている。しかし、手動アッセイを行うことも可能である。本発明の原理は手動アッセイにも適用できるが、ＴＤｘ、ＡＤｘ及びＩＭｘシステムの自動化特性により、技術者がアッセイの実施及びデータの解釈に要する時間が確実に最短になる。結果は、“ミリ偏光単位”、（ミリ偏光単位での）“スパン”及び“相対強度”で定量化することができる。ミリ偏光単位の測定により、試験試料中、ＰＣＢの不在下で最大量のトレーサーが抗体に結合したときに最大の偏光が得られることが示される。正味ミリ偏光単位が高くなるにつれ、トレーサーと抗体との結合率が高くなる。スパンは、正味ミリ偏光と抗体に結合した最小量のトレーサーとの差を示すものである。スパンが大きい程データの数量分析が良好に行われる。本発明のためには、ミリ偏光単位が少なくとも１５のスパンが好ましい。強度は、バックグラウンド蛍光を上回る蛍光シグナル強度の測定値である。従って、該強度が高いほど測定精度が増す。強度は、垂直偏光強度と水平偏光強度の二倍との和として測定される。該強度は、トレーサーの濃度及びアッセイの他の変数に応じて、バックグラウンドノイズの約３倍〜約３０倍のシグナルの範囲であり得る。本発明のためには、バックグラウンドノイズの約３倍〜約２０倍の強度が好ましいが、それぞれの特定のシステムについてシグナルを最適化するのは専門家の裁量に任され得る。フルオレセイントレーサーの場合、本発明の方法を実施するｐＨは、フルオレセイン部分をその開いた形（open form）で存在させるのに十分でなければならない。ｐＨは、約４〜９、好ましくは約６〜８、最も好ましくは約７〜７．５の範囲であり得る。アッセイ手順の間のｐＨの調整及び維持には種々の緩衝液を使用することができる。代表的な緩衝液には、ボレート、ホスフェート、カーボネート、トリス、バルビタールなどが含まれる。どの緩衝液を用いるかは本発明では重要ではないが、トリス及びホスフェート緩衝液が好ましい。好ましいＦＰＩＡ手順は、特にＡｂｂｏｔｔＴＤｘ（登録商標）ＣｌｉｎｉｃａｌＡｎａｌｙｚｅｒ、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘＦＬｘ^TM又はＡｂｕｓｅＳｙｓｔｅｍのＡｂｂｏｔｔＡＤｘ（登録商標）Ｄｒｕｇｓ（これら３種は全てＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能である）と組み合わせて用いるように設計されている。検定試薬、対照又は未知試料をＴＤｘ（登録商標）試料カートリッジの試料ウエルに直接ピペット装入する。この手順の利点の一つは、試料を特別に調製する必要が全くないことである。この時点以降のアッセイ手順は完全に自動化されている。手動アッセイを実施する場合には、試料を希釈緩衝溶液中で前処理溶液と混合し、バックグラウンドの読み取りを行う。次いで蛍光トレーサーをアッセイと混合する。最後に抗体を試験溶液に混合する。インキュベーション後、蛍光偏光の読み取りを行う。各検定試薬、対照又は試料の蛍光偏光値を測定し、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＤｘＦＬｘ^TM又はＡＤｘ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍのような装置の出力テープ上にプリントする。非線形回帰分析を用いて、各検定試薬の偏光に対するその濃度をプロットして装置で標準曲線を作成する。保存されている検定曲線から各対照又は試料の濃度を読み取り、出力テープ上にプリントする。上記の好ましい手順に関して、トレーサー、抗体、前処理溶液、洗液、検定試薬及び対照は、約２℃〜約８℃の範囲で貯蔵する必要があるが、希釈緩衝液は室温で貯蔵しなければならないことに留意されたい。標準曲線及び対照は２週間毎にランさせる必要があり、各検定試薬及び対照は２回ランさせる。試料は全て２回ランさせることができる。本発明の好ましい蛍光偏光イムノアッセイ用の好ましい試薬、検定試薬及び対照は以下の実施例の項に見ることができる。Ｃ．使用法新規なハプテン、連結中間体、免疫原、固体支持体及びトレーサーの使用法はそれぞれ上記に説明した。標識オリゴヌクレオチドの使用法には、当業界で公知のサンドイッチハイブリダイゼーションのような特定のハイブリダイゼーションの実施が含まれる。例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Ｒａｎｋｉ）及び英国特許第２，１６９，４０３号（Ｏｒｉｏｎ）を参照されたい。ハプテン化オリゴヌクレオチドはＰＣＲ及びＬＣＲのような増幅技術で使用してもよい。ＰＣＲにおけるハプテン化プライマーの使用例はヨーロッパ特許出願公開第３５７０１１号（Ａｂｂｏｔｔ）に記載されている。ＬＣＲにおけるハプテン化プローブの使用は、ヨーロッパ特許出願公開第３２０３０８号及びヨーロッパ特許出願公開第０４３９１８２号に記載されている。上記特許はそれぞれ参考として本明細書の一部を構成するものとする。本発明を実施例により説明するが、該実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。 IV．実施例ここで使用する％は、特に指摘がない限り、いずれも重量／容量である。下記の略号は、特に指摘がない限り、下記の意味を表し、総ての化学的試薬はＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手したものである。ＡＣＡ：アミノカプロン酸ＡＭＦ又はＡＭＦ：発蛍光団であるアミノメチルフルオレセイン（Ａｂｂｏｔｔ）ＢＡＥ：３カルボキシプロピルオキシ基酪酸エステルＢＳＡ：免疫原性付与キャリヤーであるウシ血清アルブミン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）セライト（登録商標）：ＭａｎｖｉｌｌｅＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのケイ藻土の商標ＣＤＩ：カップリング試薬である１，１’カルボニルジイミダゾールＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＥＡＤ又はＤＥＡＤＣ：ジエチルアゾジカルボキシレートＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミンＤＭＡＰ：４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジンＤＭＥＭ：細胞培養培地であるダルベッコの最少必須培地ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＥＢＢ：エチル４−ブロモブチレートＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリングリム：１，２−ジメトキシエタンＨＮＱ：８−ヒドロキシ−５−ニトロキノリンＨＯＳｕ又はＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＫＬＨ：免疫原性付与キャリヤーであるキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノンＰＥＧ：ポリエチレングリコールＴＢＡＦ：フッ化テトラブチルアンモニウムＴＥＡ：トリエチルアミンＴＨＦ：テトラヒドロフランＡ．中間体、連結部及び連結ハプテンの合成実施例１：連結ハプテンである２−［３−カルボキシプロピルオキシ］−カルバゾールエチルエステル（Ｇ３３）２−ヒドロキシカルバゾール（５．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）、エチルブロモブチレート（ＥＢＢ、５．９ｍｌ、４１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５．７ｇ、４１ｍｍｏｌ）をメチルエチルケトン（５０ｍｌ）中で１８時間還流させた。該反応混合物にテトラヒドロフラン（６０ｍｌ）を加え、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、固体物質をヘキサンで細かくすり砕いて過剰ＥＢＢを除去した。減圧下での乾燥後、８．１ｇの淡褐色固体物質が得られた。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺＠ｍ／ｚ２９８，（ｍ＋ＮＨ₄）⁺＠ｍ／ｚ３１５。実施例２：連結ハプテンである２−［３−カルボキシプロピルオキシ］−カルバゾール（カルバゾール−ＢＡＥ、Ｇ４０）前述のように製造したカルバゾールエステル（１．０ｇ）をグリム（３０ｍｌ）及び水酸化リチウム水溶液（７ｍｌ、０．５Ｎ）に溶解した。室温で２４時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、水（１０ｍｌ）を加えた。該溶液をＨＣｌ水溶液（１Ｎ）でｐＨ２．０に酸性化し、次いで酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を乾燥し、溶媒を減圧下で除去すると、有色固体物質が得られた（０．８２ｇ）。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺＠ｍ／ｚ２７０，（ｍ＋ＮＨ₄）⁺＠ｍ／ｚ２８７。実施例３：連結ハプテンであるカルバゾール誘導体活性エステル（Ｇ５７）前述のように製造したカルバゾール−ＢＡＥ（Ｇ４０）（０．１ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０５１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解し、次いでＤＣＣ（０．０８４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いでセライトで濾過し、ＮＭＰで２ｍｌに希釈した。この活性化エステル溶液を下記の実施例で使用した。実施例４：連結ハプテンである２−［３−カルボキシプロピルオキシ］−Ｎ−［２−チオフェニルスルホニル］−カルバゾール（ＣＴ、Ｈ３９）前述のように製造したカルバゾールエステル（Ｇ３３）（２．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を氷浴で冷却した。冷却溶液に、Ｎ₂雰囲気下で水素化ナトリウム（０．２２５ｇ、８０％、７４ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を室温にし、次いで４０℃で６時間加熱した。該反応混合物を氷浴で冷却し、ＴＨＦ（２０ｍｌ）中の塩化チオフェンスルホニル（１．２２ｇ、６．７ｍｍｏｌ）溶液を５分間で滴下した。反応混合物を室温にし、次いで光を遮断してＮ₂下で、４０℃で１８時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をグリム（６０ｍｌ）及び水酸化リチウム水溶液（１５ｍｌ、０．５Ｎ）に加えた。室温で１８時間後、溶媒を減圧下で除去し、水（２０ｍｌ）を加えた。該溶液をＨＣｌ水溶液（１Ｎ）でｐＨ２．０に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。該有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去すると、生成物が有色固体物質として得られた。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋ＮＨ₄）⁺ ＠ｍ／ｚ４３３，（ｍ＋ＮＨ₄−Ｈ₂Ｏ）⁺＠ｍ／ｚ４１５。実施例５：連結ハプテンであるカルバゾール−チオフェン誘導体活性エステル（Ｇ５８）前述のように製造したＣＴ（Ｈ３９）（０．２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及びＮ −ヒドロキシスクシンイミド（０．０６６ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解し、次いでＤＣＣ（０．１１ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を窒素雰囲気下で１８時間撹拌し、セライトで濾過した。該溶液をＮＭＰで２．５ｍｌに希釈した。該活性エステル溶液を下記の実施例で使用した。実施例６：連結ハプテンである２−［３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロピルオキシ］−ジベンゾフラン（Ｄｂｆ−シリルエーテル、Ｆ１４１）２−ヒドロキシジベンゾフラン（３．０ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルジメチルシリル−プロパンジオール（３．１ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（５．１ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解した。該溶液をＮ₂雰囲気下で氷浴で冷却し、次いでジエチルアゾジカルボキシレート（３．８ｍｌ、１９．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。該反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：９酢酸エチル／ヘキサン）で精製した。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺＠ｍ／ｚ３５７，（ｍ＋ＮＨ₄ ）⁺＠ｍ／ｚ３７４。実施例７：連結ハプテンである２−［３−ヒドロキシプロピルオキシ］−ジベンゾフラン（Ｄｂｆ−アルコール、Ｆ１４５）前述のように製造したＤｂｆ−シリルエーテル（Ｆ１４１）（１．０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（２ｍｌ）及びＴＢＡＦ（５．６ｍｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ、５．６ｍｍｏｌ）に加えた。該反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶解し、水（３×１２ｍｌ）及び飽和ブライン（１２ｍｌ）で洗浄した。該溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去すると、極めて純粋な生成物が得られた。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺ ＠ｍ／ｚ２４３，（ｍ＋ＮＨ₄）⁺＠ｍ／ｚ２６０，（ｍ＋ＮＨ₄・ＮＨ₃）⁺＠ｍ／ｚ２７７。実施例８：連結ハプテンである２−［３−カルボキシプロピルオキシ］−ジベンゾフラン（Ｄｂｆ−ＢＡＥ、Ｆ２４６）２−ヒドロキシジベンゾフラン（０．５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、エチルブロモブチレート（０．７８ｍｌ、５．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．１ｇ、８．１ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（１０ｍｇ）を２−ブタノン（１５ｍｌ）中で混合した。該反応混合物を反応が完了するまで還流させ、次いで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を６ＭＫＯＨ水溶液／メタノール、１：１に加えた。加水分解が終了した後、反応混合物をｐＨ３に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン／酢酸、１０：３０：６０：０．５）で精製した。０．５２ｇの生成物が得られた。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺＠ｍ／ｚ２７１，（ｍ＋ＮＨ₄ ）⁺＠ｍ／ｚ２８８、（ｍ＋ＮＨ₄・ＮＨ₃）⁺＠ｍ／ｚ３０５。実施例９：連結ハプテンであるジベンゾフランイミジゾリド誘導体（Ｆ１４６ａ）前述のように製造したＤｂｆ−アルコール（Ｆ１４５）（０．２７５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１．５ｍｌ）に溶解し、次いでＣＤＩ（０．２０２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。その結果、Ｄｂｆ−アルコールイミジゾリド（後述）が得られた。これをそのまま下記の実施例で使用した。実施例１０：連結ハプテンである１２原子連結カルバゾール中間体Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｏ−（２−アミノエチル）−２−アミノエタノール塩酸塩（０．３０ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４）：３６６−６８（１９９０）の方法で２−（２−アミノエトキシ）エタノールから製造）、カルバゾール−ＢＡＥ（０．３３５ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）及びＢＯＰ試薬（０．５５１ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を、トリエチルアミン（０．５２１ｍｌ、３．７４ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３ｍｌ）及びＮ−メチルピロリジノン（２ｍｌ）と共にアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解した。該反応混合物を不活性雰囲気下で１８時間室温に維持した。溶媒を真空下で除去し、残渣を、酢酸エチル／ヘキサンを溶離剤として使用してカラムクロマトグラフィーで精製した。質量スペクトル：ＤＣＩ／ＮＨ₃，（ｍ＋Ｈ）⁺＠ｍ／ｚ４５６。ＢＯＣ保護基をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（５ｍｌ、１：１）で除去すると、アミンのトリフルオロ酢酸塩が得られた。実施例１１：連結ハプテンであるカルバゾールベータケトエステル前述の図式１、ステップ１〜３に従って表題の化合物を製造する。下線を引いた化合物番号は、当該図式の化合物を示す。２−ヒドロキシカルバゾール（２５ｇ、１３６ｍｍｏｌ）、エチル４−ブロモブチレート（２９．３ｍｌ、２０５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２８．３ｇ、２０５ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（１ｇ）を激しく撹拌しながら４８時間にわたり２−ブタノン（２５０ｍｌ）中で還流させた。反応混合物が温かいうちに、塩化メチレン（７５０ｍｌ）を加えた。該溶液を濾過し、溶媒を真空下で除去した。残渣を撹拌下で３０分間ヘキサン（１ｌ）で洗浄し、次いで濾過した。固体物質を真空乾燥すると３８ｇの固体物質が得られた。水酸化リチウム水溶液（０．５Ｎ、２〜４当量）を用いて、新しいグリム（３５ｍｌ／ｇ）中で加水分解を行う。該塩基性溶液を真空下で減量させ、水を加え、ＨＣｌ水溶液（１〜６Ｎ）でｐＨ２にする。生成物（１）を固体の濾過又は酢酸エチルでの抽出により分離する。２ｌ丸底フラスコ内で、２−カルボキシプロピルオキシ−カルバゾール（１、５０．０ｇ、１８６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（７００ｍｌ）に懸濁し、次いでメルドラム（Ｍｅｌｄｒｕｍ）の酸（２８ｇ、１９５ｍｍｏｌ）、シアノホスホン酸ジエチル（３０ｍｌ、１９５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５２ｍｌ、３７１ｍｍｏｌ）を更に別の分のジクロロメタン（３００ｍｌ）と共に加えた。該反応混合物を乾燥窒素雰囲気下で室温で２５時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸エチル（１３００ｍｌ）に溶解した。該溶液に５００ｍｌの１．０Ｍリン酸を加えた。３０分間激しく撹拌した後、沈殿物を分離し、水（７× ２００ｍｌ）で洗浄した。固体物質をメタノール（１．４ｌ）に溶解し、溶液を加熱して５時間還流させた。溶媒を真空下で除去し、固体物質をｔ−ブチルメチルエーテルの存在下で細かくすり砕いた。固体物質を分離し、ｔ−ブチルメチルエーテル（２００ｍｌ）で洗浄し、次いで真空乾燥すると、淡褐色固体物質が得られた（４８ｇ、３）実施例１２：連結ハプテンであるカルバゾール−ジオール前記図式１、ステップ４に従い表題の化合物を製造する。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示す。カルバゾールベータケトエステル（前述の方法で製造した３、４７ｇ、１４４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５００ｍｌ）に溶解し、次いで水素化ホウ素リチウム（テトラヒドロフラン中２Ｍ、２３８ｍｌ、４７７ｍｍｏｌ）を、乾燥不活性雰囲気下で撹拌しながらカニューレを用いてゆっくり加えた。２４時間後、１０％クエン酸（５００ｍｌ）を極めてゆっくりと加えた。得られた溶液を酢酸エチル（３×４００ｍｌ）で抽出し、有機抽出物をまとめて５％重炭酸ナトリウム（４００ｍｌ）及び濃ブライン（４００ｍｌ）で順次洗浄した。該溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空下で除去すると、白色固体物質（２９ｇ）が得られた。ジオールを精製するためには、大量（２ｌ）のメタノールに溶解し、次いで溶媒を真空下で除去し得る。これを４〜６回繰り返し、次いで固体物質（４）を真空乾燥する。実施例１３：連結ハプテンであるカルバゾール−ジオール−ＤＭＴ前記図式１、ステップ５に従い表題の化合物を製造する。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示す。カルバゾール−ジオール（前述の方法で製造した４、７．７５ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（７０ｍｌ）に溶解し、次いで塩化ジメトキシトリチル（８．８ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍｌ、３３．７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．１６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（６×２２ｃｍシリカゲル床、酢酸エチル／ヘキサン／ＴＥＡ、０：１００：１、５００ｍｌ；２０：８０：１、１ｌ；４０：６０：１、最終まで）で精製した。溶媒を除去した後、残留ＴＥＡをトルエン、次いで塩化メチレンと同時蒸発することにより除去すると、表題の化合物（５）が１２．２ｇ（＞７８％）得られた。実施例１４：連結ハプテンであるカルバゾールホスホアミダイト前記図式１、ステップ６に従い表題の化合物を製造する。下線を引いた化合物番号は当該図式の化合物を示す。乾燥カルバゾール−ジオール−ＤＭＴ（５、６．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン（８０ｍｌ）に溶解し、次いでジイソプロピルエチルアミン（７ｍｌ、４０ｍｍｏｌ、ＣａＨから蒸留したもの）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイト（３．１ｍｌ、１４ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を、光を遮断して窒素雰囲気下で２時間室温に維持した。乾燥メタノール（０．６ｍｌ）を加え、次いで２０分後に酢酸エチル（２００ｍｌ）及びＴＥＡ（５０ｍｌ）を加えた。該反応混合物を１０％炭酸ナトリウム（２×２００ｍｌ）及び飽和ブライン（２×２００ｍｌ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３．２×５０ｃｍシリカゲル床、酢酸エチル／ヘキサン／ＴＥＡ、０：１００：１、試料添加前にカラムをならすために２５０ｍｌ；０：１００：１、２５０ｍｌ；２０：８０：１、５００ｍｌで溶離、３０：７０：１、最終まで）で精製した。残留ＴＥＡをトルエン、次いで酢酸エチル／塩化メチレン（１：１）と同時蒸発すると、白色固体物質（６）が６．０５ｇ（７６％）得られた。Ｂ．免疫原の合成実施例１５：カルバゾール／ＢＳＡ免疫原（Ｇ５９）：ＢＳＡ（０．５ｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．０５Ｍ、１０ｍｌ）に溶解し、次いでＮＭＰ（５ｍｌ）を加えた。前記実施例で得たカルバゾール活性エステル溶液（Ｇ５７）（１．７ｍｌ）を加え、該反応体を室温で４時間回転により混合した。ｐＨをトリエチルアミン（ＴＥＡ、０．５ｍｌ）＋ＨＣｌ水溶液（２ｍｌ、１．０Ｎ）で調整した。混合操作を合計１８時間続け、次いで溶液をリン酸ナトリウム緩衝液中１０％エタノール（ｐＨ８．０、０．１Ｍ、３×６．６ｌ）に対して透析し、次いで蒸留水（３×６ｌ）に対して透析した。該溶液を凍結乾燥すると、免疫原が白色綿毛状物質として得られた（０．５１ｇ）。実施例１６：カルバゾール−チオフェン／ＢＳＡ免疫原（Ｇ６０）：ＢＳＡ（０．５ｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍ１、ｐＨ８．０、０．０５Ｍ）に溶解し、次いでＮＭＰ（５ｍｌ）を加えた。該溶液に、実施例５（Ｇ５８）のＣＴ−ＢＡＥ活性エステル溶液（１．６ｍｌ）を加えた。該反応体を回転によって混合し、次いで２時間後にＴＥＡ（０．５ｍｌ）及びＨＣｌ（２ｍｌ、１Ｎ）を順次加えた。室温で１８時間後、該溶液をリン酸ナトリウム緩衝液中１０％エタノール（ｐＨ８．０、０．１Ｍ、３×６．６ｌ）及び蒸留水（３×６ｌ）に対して透析した。該溶液を凍結乾燥すると白色綿毛状生成物が得られた（０．５２ｇ）。実施例１７：ジベンゾフラン／ＢＳＡ免疫原（Ｇ４９）：前述のように製造したＤｂｆ−ＢＡＥ（Ｆ２４６）（０．０８５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（０．０５４ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍｌ）に溶解した。該溶液にＤＣＣ（０．０８４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物をＮ₂雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。ＢＳＡ（０．５ｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．０５Ｍ）に溶解し、次いでＮＭＰ（２．３ｍｌ）を加えた。該活性エステル溶液を濾過し、タンパク質溶液に加えた。該反応体を回転により室温で１８時間混合した。濁った溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．１Ｍ）中の１０％エタノール（３×６．６ｌ）に対して室温で透析し、次いで蒸留水（３×６ｌ）に対して２〜８℃で透析した。凍結乾燥後、免疫原が白色粉末として得られた（０．４７ｇ）。実施例１８：ジベンゾフラン／ＫＬＨ免疫原（Ｆ１４７）：ＫＬＨ（０．２５ｇ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０、１０ｍｌ）に溶解し、次いでＮＭＰ（４ｍｌ）を加えた。該溶液に、１アリコートの前述のように製造したイミダゾリド（Ｆ１４６ａ）（０．４５ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、更に別の分のイミダゾリド（０．３０ｍｌ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いでエタノール／ｐＨ８．０リン酸塩緩衝液（１：３、４ｌ、×４）に対して３回透析した。該溶液を部分的に凍結乾燥し、次いで解凍した。固体を水で洗浄し、凍結乾燥すると、灰色がかった固体物質が得られた。Ｃ．トレーサーの合成実施例１９：一般的トレーサー合成方法Ａ．一般的方法Ｉ：ハプテン（例えば２５ｍｇ）を、テトラヒドロフラン（５ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新しく蒸留したもの）又はジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０７ｍｍｏｌ）及びＮ− ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．２ｍｍｏｌ）で、窒素雰囲気下、０℃ で２時間、且つ室温で約１２時間活性化する。１アリコート（１ｍｌ）の活性化ハプテンにアミノ担持フルオレセイン誘導体（例えば４ｍｇ）を２滴のトリエチルアミンと共に加える。該反応混合物を１２時間撹拌し、蒸発させ、クロマトグラフィーにかける［例えばＷｈａｔｍａｎＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０ｃｍ逆相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液、６０：４０、又はＭＥＲＣＫシリカゲル６０Ｆ−２５４、２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、クロロホルム／メタノール、８５：１５］。Ｂ．一般的方法II：ハプテン（例えば２５ｍｇ）を塩化チオニル（１ｍｌ）に溶解し、１２時間６０℃に加熱する。その後過剰塩化チオニルを真空下で除去すると、ハプテンの酸塩化物が残る。該酸塩化物をＴＨＦ（５ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新しく蒸留したもの）に溶解する。１アリコート（１ｍｌ）の活性化ハプテンにアミノ担持フルオレセイン誘導体（例えば４ｍｇ）を２滴のトリエチルアミンと共に加える。該反応混合物を１２時間撹拌し、蒸発させ、クロマトグラフィーにかける［例えばＷｈａｔｍａｎＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０ｃｍ逆相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液、６０：４０、又はＭＥＲＣＫシリカゲル６０Ｆ−２５４、２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、クロロホルム／メタノール、８５：１５］。Ｃ．一般的方法III：アミノ担持ハプテンをエーテル性塩化水素で処理して塩酸塩に変換する。該塩酸ハプテン（例えば５０ｍｇ）をＴＨＦ（１０ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新しく蒸留したもの）に溶解し、窒素雰囲気下で、クロロギ酸トリクロロメチル（１００ｍｌ）で３０分間処理する。その後、揮発性物質を真空除去し、残渣をＤＭＦに取り上げ、複数のアリコートに分割し、アミノ担持フルオレセイン誘導体（例えば４ｍｇ）及び１滴のトリエチルアミンで処理する。１２時間撹拌した後、反応混合物を蒸発させ、クロマトグラフィーにかける［例えばＷｈａｔｍａｎＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０ｃｍ逆相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液、６０：４０、又はＭＥＲＣＫシリカゲル６０Ｆ−２５４、２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、クロロホルム／メタノール、８５：１５］。実施例２０：カルバゾール／アミノメチルフルオレセイントレーサー（Ｇ６１）前述の方法で製造した活性エステル溶液（Ｇ５７）の残りを二分し、一方のアリコートに少量の５−ＡＭＦ及び１滴のＤＩＥＡを加えた。光を遮断して室温で７２時間後、反応混合物を分離用ＴＬＣ（逆相、Ｃ１８、１０００μｍプレート、メタノール／５００ｍＭＮａＣｌ、６：４）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られた。質量スペクトル：ＦＡＢ，ｍＨ⁺＠６１３実施例２１：カルバゾール／Ｎ−グリシルフルオレセインアミントレーサー類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液（Ｇ５７）に少量のＮ− グリシルフルオレセインアミン及び１滴のＤＩＥＡを加える。光を遮断して室温で約７２時間後、反応混合物を分離用ＴＬＣ（逆相、Ｃ１８、１０００μｍプレート、メタノール／５００ｍＭＮａＣｌ、６：４）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られた。実施例２２：カルバゾール−チオフェン／アミノメチルフルオレセイントレーサー（Ｇ６２）：活性エステル溶液（Ｇ５８）の残りを二分し、一方のアリコートに少量の５− ＡＭＦ及び１滴のＤＩＥＡを加えた。光を遮断して室温で７２時間後、反応混合物を分離用ＴＬＣ（逆相、Ｃ１８、１０００μｍプレート、メタノール／５００ｍＭＮａＣｌ、６：４）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られた。質量スペクトル：ＦＡＢ，ｍＨ⁺＠７５９実施例２３：カルバゾール−チオフェン／Ｎ−グリシルフルオレセインアミントレーサー：類似の分量の前述のように製造した活性エステル溶液（Ｇ５８）に少量のＮ− グリシルフルオレセインアミン及び１滴のＤＩＥＡを加える。光を遮断して室温で約７２時間後、反応混合物を分離用ＴＬＣ（逆相、Ｃ１８、１０００μｍプレート、メタノール／５００ｍＭＮａＣｌ、６：４）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られる。実施例２４：ジベンゾフラン／アミノメチルフルオレセイントレーサー（Ｆ１４６ｂ）前述のように製造したイミジゾリド（Ｆ１４６ａ）１アリコート（０．６ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）をＡＭＦ．ＨＣｌ（０．０５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と混合した。室温で１８時間後、残渣を分離用ＴＬＣ（シリカゲル、２×２ｍｍプレート、メタノール／塩化メチレン、１：９）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られた。質量スペクトル：ＦＡＢ，ｍＨ⁺＠ｍ／ｚ６３０実施例２５：ジベンゾフラン／Ｎ−グリシルフルオレセインアミントレーサー前述のように製造したＤｂｆ−ＢＡＥ（Ｆ２４６）（０．０２２ｍｍｏｌ）及びＥＥＤＱ（０．０２４ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（０．３ｍｌ）に溶解する。室温で２時間撹拌した後、実施例１７及び１９のようにＮ−グリシルフルオレセインアミン（０．０２２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．０１２ｍｌ、０．０６７ｍｍｏｌ）を加える。光を遮断して室温で１８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を分離用ＴＬＣ（逆相Ｃ１８、１ｍｍ、メタノール／５００ｍＭＮａＣｌ、６：４）で精製すると、下記の構造のトレーサーが得られる。Ｄ．抗血清の製造実施例２６：月齢約４〜５ケ月の雌ニュージーランドシロウサギに、皮下注射及び筋内注射で、フロイント完全アジュバント中０．２ｍｇの免疫原を最初に接種し、次いで１４日目に０．１ｍｇの免疫原をブースター注射し、その後毎月、フロイント不完全アジュバント中０．０５ｍｇでブースター注射を行った。各ブースター注射の２週間後に採血を行い、血清をトレーサーへの結合についてＴＤｘ計器で検査した。最初の接種から６週間後、採血試料の一部に適当な明白なミリ偏光（ｍｉｌｌｉｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）及びスパンを有する抗体が観察された。Ｅ．ハイブリドーマの製造実施例２７：週齢４〜６週間の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、生理食塩水１．８８ｍｌ中の前述のように製造したいずれかの免疫原（例えば５ｍｇ／ｍｌ；０．０６ｍｌの免疫原）０．２ｍｌを、１００ｍｇのモノホスホリル脂質Ａ及びトレハロースジミクロエート（trehalose dimycloate）アジュバント（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）と共に、４週間間隔で皮下注射する。最初の接種から３ケ月後、抗体活性検査が陽性となった時点で、最後の免疫感作から３日後にドナーマウスを殺し、脾臓を無菌条件下で摘出し、５ｍｌの冷却ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）及び２．０ｍＭのＬ−グルタミン（培地Ａ）を入れたプラスチックペトリ皿に入れる。脾臓を単一細胞懸濁状になるように解離する。細胞を遠心分離してペレット化し、赤血球を１０ｍＭトリス緩衝液中０．８３％塩化アンモニウム２ｍｌに再懸濁することによって溶解する。２分間静置した後、２０〜３０ｍｌの新しい培地Ａを加える。細胞を遠心分離によって洗浄し、１０ｍｌの新しい培地Ａに再懸濁する。本明細書に参考として包含されるＫｅａｒｎｅｙ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７９，１２３，１５４８に開示されているように、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ− ，ＥＣ２．４．２．８）を欠失している免疫グロブリン非分泌マウス骨髄腫細胞系（ＳＰ２／０）を融合相手として使用する。該骨髄腫細胞系を、２０％のウシ胎児血清を加えた培地Ａ中に維持する。融合前の３日間、ＨＧＰＲＴ＋復帰細胞を殺すために、骨髄腫細胞に０．１ｍＭ８−アザグアニンを加える。融合当日、骨髄腫細胞を回収し、培地Ａで一回洗浄し、５ｍｌの培地Ａに再懸濁する。骨髄腫細胞及び予め回収した脾臓細胞を血球計で計数し、生存力をエリトロシンＢ染色排除によって評価する。使用する融合方法は、本明細書に参考として包含されるＧｅｆｔｅｒら、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９７７，３，２３１に記載の方法を改変したものである。無菌５０ｍｌ円錐形遠心分離管に１〜１．５×１０⁸個の脾臓細胞を同数のＳＰ２／０骨髄腫細胞と共に導入する。骨髄腫−脾臓細胞懸濁液を１４００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を一緒にペレット化する。上清を吸引除去し、管を軽くたたいて細胞ペレットをほぐし、血清を含まないＤＭＥＭ中５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１０００、Ｓｉｇｍａ）１ｍｌを細胞ペレットに加える。１ｍｌピペットでゆっくり吸い上げ放出を繰り返すことにより、細胞を１分間で静かにＰＥＧ溶液に再懸濁する。管を更に１分間手で保持し、次いで１ｍｌの培地Ａをゆっくり加えてＰＥＧを希釈する。撹拌又は混合を行わずに、細胞を更に１分間静置する。更に２０ｍｌの培地Ａを３〜５分間で加え、細胞を１４００ｒｐｍ、５分間でペレット化する。上清を吸引除去し、２０％ウシ胎児血清、１×１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン及び３×１０^-6Ｍチミジンを加えた２０ｍｌの培地Ａ（培地Ｃ又はＨＡＴ選択性培地）に細胞を再懸濁する。アミノプテリンは酵素ＨＧＰＲＴを欠失した細胞に毒性を示し、従って非融合骨髄腫細胞を総て殺す。融合細胞（ハイブリドーマ）はＢリンパ球（脾臓細胞）融合相手からＨＧＰＲＴを得るため、ＨＡＴ中で生き残る。実施例２８：モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択前述のように製造した各免疫原毎の細胞懸濁を７５ｃｍ²Ｔフラスコに移し入れ、５％ＣＯ₂インキュベーターで１〜３時間、３７℃でインキュベートする。該細胞懸濁液を培地Ｃで１×１０⁶脾臓細胞／ｍｌに希釈し、２４ウェルＣｏｓｔａｒプレートの各ウェルに前記細胞懸濁液を１ｍｌずつ加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。インキュベーション終了後、培地Ｃに２〜３×１０⁵細胞／ｍｌで懸濁した支持細胞（feeder cell）（非免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞）の懸濁液をＣｏｓｔａｒプレートの２４個のウェルの各々に１ｍｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ₂で１４〜１７日間インキュベートする。この期間に、一日置きに、各ウェルから吸引によって培地を１ｍｌずつ除去し、代わりに新しい培地Ｃを１ｍｌ加える。１０日目に、ハイブリドーマを含むウェルに由来する上清を抗体活性について検査する。バックグラウンドより大きい抗体結合を示す上清を選んで更にクローニングするために、数種のハイブリドーマ懸濁液を選択する。結合は例えば、実施例１６〜２１に記載のトレーサーを用いてＴＤｘ分析器（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で評価し得る。抗体活性を有するという理由で選択したウェルの細胞を、サンプリングから２４時間以内に限界希釈によりクローニングする。実施例２９：モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ培養物のクローニング前述のように製造した抗体分泌ウェル内の細胞を、適量の培地Ａ＋１５％ウシ胎児血清（培地Ｂ）で１０細胞／ｍｌの濃度に希釈し、各希釈細胞懸濁液１００ｍｌを、９６ウェルのＣｏｓｔａｒプレート３個のウェルに等分して加える。５ ×１０⁵細胞／ｍｌの培地Ｂ中支持細胞を各ウェルに１００ｍｌずつ加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ₂ で１４日間インキュベートする。上清を、前記実施例に記載のアッセイプロトコルを使用して、抗体活性について再検査する。次いで、抗体産生クローンを２４ウェルＣｏｓｔａｒプレート内で支持細胞なしに増殖させ、最後に２５ｃｍ² Ｔフラスコ内で増殖させる。３２×１０⁶細胞／ｍｌのクローン試料を、液体窒素中で、１０％グリセロールを加えた培地Ｂ中に貯蔵する。次いで、１〜２ｍｌの試料をＴＤｘ計器プロトコルでディスプレイスメント（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）について更に評価し、１個のクローンを無菌産生用に選択する。実施例３０：モノクローナル抗体のｉｎｖｉｖｏ産生大量のモノクローナル抗体を得るためのｉｎｖｉｖｏ産生方法は、前述の方法を「腹水」腫瘍としての増殖に適合させることからなる。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．５ｍｌのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラ−メチルペンタデカン）の腹腔内投与によって「初期免疫感作（ｐｒｉｍｅ）」する。プリスタンは、増殖培地として機能するマウスの腹膜腔内の漿液分泌（腹水）を誘起する無菌刺激原である。プリスタン投与から約４〜５週間後、実施例２４に記載のようなｉｎｖｉｖｏ培養物から回収した１．５×１０⁶個の活発に増殖するハイブリドーマ細胞を含むアリコートを、感作したマウスの腹膜腔に接種する。ハイブリドーマ細胞を投与してから７日後、５〜１０ｍｌの腹水を各マウスから採取する。硫酸アンモニウム沈降で精製すると、腹水１ｍｌ当たり約２４．６ｍｇの抗体が得られる。実施例３１：蛍光偏光イムノアッセイ前述のように、本発明のＥＰＩＡ用の試薬は、連結中間体に特異的な本発明の免疫原に対するトレーサー及び抗体を含む。更に、希釈緩衝液を含む一般的に使用されているアッセイ溶液、並びにハプテン誘導体カリブレーター及び対照も製造する。好ましい方法は、自動化ＴＤｘ、ＡＤｘ又はＩＭｘシステムと協働して使用するように設計されるが、手動アッセイも実施できる。どちらの方法でも、検査試料は、バックグラウンド読取りの実施前に、予備処理溶液及び希釈緩衝液中抗体と混合し得る。次いで、検査溶液にトレーサーを加える。インキュベーション後、蛍光偏光の読取りを行う。自動化アッセイでは、各カリブレーター、対照又は検査試料の蛍光偏光値が測定され、ＴＤｘ、ＡＤｘ又はＩＭｘ計器の出力テープに印字される。この計器は、非直線回帰分析を用いて、各カリブレーターの偏光を濃度に対してプロットすることにより、標準曲線も作成する。各対照又は試料の濃度は記憶された曲線から読取られ、出力テープに印字される。好ましい自動化ハプテン誘導体アッセイでは下記の試薬を使用する。１）前処理溶液。２）リン酸カリウム緩衝液（０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５）中５０％メタノールに希釈したトレーサー。３）ハプテン誘導体免疫原に対する抗体含有ウサギ抗血清又はマウスモノクローナル抗体を、３０％グリセロールを加えたＴＤｘ緩衝液（０．０１％ウシγ− グロブリン及び０．１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液）に希釈したもの。４）ＴＤｘ緩衝液を含む希釈緩衝液。５）一組のカリブレーター６）５ｍｇ／ｍｌのハプテン誘導体を含む対照。総ての偏光蛍光測定は、下記のプロトコルに従ってアッセイを実施したＴＤｘ計器を用いて行う。１）２２．５ｍｌの標準又は未知の検査試料、並びに各々１２．５ｍｌの抗体試薬及び前処理試薬をキュベット内に導入し、容量を１ｍｌにするのに十分な量の希釈緩衝液を加え、バックグラウンド強度の読取りを行う。２）各々１２．５ｍｌの前処理試薬及び抗体、２５ｍｌのトレーサー、並びに第二の２２．５ｍｌの試料をキュベットに加え、容量を２．０ｍｌにするのに十分な量の希釈緩衝液を加える。３）該反応混合物をインキュベートする。４）抗体へのトレーサー結合に起因する蛍光偏光を、前記混合物の最終的偏光蛍光強度からバックグラウンドの偏光蛍光強度を引き算することによって得る。５）未知の検査試料の偏光値を、ハプテン誘導体含量がわかっているカリブレーターを用いて作成した標準曲線と比較する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｆ 9/572 9450−4ＨＣ０７Ｆ 9/572 Ａ 9/655 9450−4Ｈ 9/655 9/6553 9450−4Ｈ 9/6553 Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＺＣ０７Ｋ 16/44 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/44 Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｊ 33/532 0276−2Ｊ 33/532 Ｚ // Ａ６１Ｋ 39/385 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/385

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の構造式：［式中、ａ及びａ’は単独で、独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₁₀ −アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルチオ、ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル）アミノ、アリール−Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される１〜４個の基であるか、あるいはａ及びａ’は隣接しかつこれらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、Ｇは、Ｓ、Ｏ及びＮＲ（Ｒは水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル，任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及びこれらの保護形態である）の中から選択され、Ａは、式−Ｌ−ｙ（式中、ｙは第２分子中の官能基と直接又は活性化後に反応し得る官能基であり、Ｌは１〜約５０個の原子からなるスペーサー基である）の結合部分である］で表される化合物。２．ａが水素であり、ａ’がアミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ及びこれらの保護形態である請求項１に記載の化合物。３．ＬがＣ₁−Ｃ₁₀−アルキルであり、ｙが、ヒドロキシル（−ＯＨ）、チオール（−ＳＨ）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ₂）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、脱離基、マイケル受容体、ホスホアミダイト、ホスホネート及びこれらの官能基の保護形態からなる群の中から選択される請求項１に記載の化合物。４．ｙがホスホアミダイト又はホスホネートである請求項３に記載の化合物。５．ａが水素であり、ａ’が水素、アミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される請求項４に記載の化合物。６．ＧがＮであり、Ｒが水素、任意に置換されたスルホニル、及びチオフェニルの中から選択される請求項１に記載の化合物。７．ＧがＯであり、Ｒが存在しない請求項１に記載の化合物。８．以下の構造式：［式中、ａ及びａ’は単独で、独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₁₀ −アルコキシ、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキルチオ、ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル、Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル）アミノ、アリール−Ｃ₁− Ｃ₁₀−アルキル、任意に置換されたアリール、ハロゲン、アミノ、カルボキシ、カルボキシアミド、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホ、ホスホ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される１〜４個の基であるか、あるいはａ及びａ’は隣接しかつこれらに結合している炭素と一緒になって縮合環を形成し、Ｇは、Ｓ、Ｏ及びＮＲ（Ｒは水素、Ｃ₁−Ｃ₁₀−アルキル，任意に置換されたアリール、任意に置換されたスルホニル、チオフェニル、カルボキシ、カルボキシアミド及びこれらの保護形態である）の中から選択され、Ａは、式−Ｌ−ｙ（式中、ｙは第２分子中の官能基と直接又は活性化後に反応し得る官能基であり、Ｌは１〜約５０個の原子からなるスペーサー基である）の結合部分であり、Ｑは、免疫原性付与キャリヤー分子、検出可能ラベル、オリゴヌクレオチド又は固体支持体である］で表される結合体化合物。９．ａが水素であり、ａ’がアミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ及びこれらの保護形態である請求項８に記載の化合物。１０．ＬがＣ₁−Ｃ₁₀−アルキルであり、ｙが、ヒドロキシル（−ＯＨ）、チオール（−ＳＨ）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ₂）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、脱離基、マイケル受容体、ホスホアミダイト、ホスホネート及びこれらの官能基の保護形態からなる群の中から選択される請求項８に記載の化合物。１１．ｙがホスホアミダイト又はホスホネートである請求項１０に記載の化合物。１２．ａが水素であり、ａ’が水素、アミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ及びこれらの保護形態からなる群の中から選択される請求項１１に記載の化合物。１３．ＧがＮであり、Ｒが水素、任意に置換されたスルホニル、及びチオフェニルの中から選択される請求項８に記載の化合物。１４．ＧがＯであり、Ｒが存在しない請求項８に記載の化合物。１５．ＱがＢＳＡ、ＫＬＨ、チログロブリン及びオボアルブミンからなる群の中から選択される請求項８に記載の結合体。１６．Ｑが検出可能ラベルである請求項８に記載の結合体。１７．前記検出可能ラベルが蛍光分子である請求項８に記載の結合体。１８．前記蛍光分子が、フルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、ａ −ヨードアセトアミドフルオレセイン、４’−アミノメチルフルオレセイン、４ ’−Ｎ−アルキルアミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、４−クロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン−２− イル −アミノフルオレセイン及びフルオレセインイソチオシアネートからなる群の中から選択されるフルオレセイン誘導体である請求項１７に記載の結合体。１９．Ｑが固体支持体である請求項８に記載の結合体。２０．前記固体支持体が、ビーズ、チューブ、ロッド、マイクロタイタープレート及びカラムからなる群の中から選択される請求項１９に記載の結合体。２１．Ｑがオリゴヌクレオチドである請求項８に記載の結合体。２２．前記オリゴヌクレオチドが、約１０〜約１００塩基長のデオキシリボヌクレオチドである請求項２１に記載の結合体。２３．ａ．標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチド成分Ｑを有する請求項２１に記載のハプテン：オリゴヌクレオチド結合体を、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で標的核酸と混合し、ｂ．ハイブリダイズした結合体からハイブリダイズしていない結合体を分離し、ｃ．ハイブリダイズしたハプテン：オリゴヌクレオチド結合体の量を検出することを含み、前記分離及び検出段階の少なくとも一方が前記ハプテンに対する特異結合メンバーを用いて実施される、標的核酸の検出方法。２４．分離が、前記ハプテンに対する前記特異結合メンバーが固定化されている固相を用いて実施される請求項２３に記載の方法。２５．検出が、前記ハプテンに対する前記特異結合メンバーと検出可能ラベルとの結合体を用いて実施される請求項２３に記載の方法。２６．前記分離段階の前に標的核酸を増幅する請求項２３に記載の方法。２７．ａ．生物高分子の標識に有用な請求項１に記載の少なくとも１種の連結中間体化合物と、ｂ．固体支持体もしくは検出可能ラベルに結合しているか又は固相支持体もしくは検出可能ラベルに結合するように改変されている、前記ハプテンと反応性の抗体とを含んでなるキット。２８．前記連結中間体化合物が、ホスホアミダイト及びホスホネートからなる群の中から選択されるｙ部分を含んでいる請求項２７に記載のキット。２９．請求項１に記載の化合物と反応性の抗体。３０．抗体がモノクローナル抗体である請求項２９に記載の抗体。