JP3270041B2 - シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定法 - Google Patents
シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結
合性蛋白質（Ｇ−蛋白質）および／または第２メッセン
ジャー、たとえばサイクリックアデノシン一リン酸（cA
MP）を用いる、シグナル形質導入経路に関与する蛋白質
に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る化学物質の同定法、ならびにＧ−蛋白質および／また
は第２メッセンジャー、たとえばcAMPを用いる、シグナ
ル形質導入経路を介して作用するＧ−蛋白質結合−細胞
表面レセプター（GPCレセプター）をコードする核酸ク
ローンの同定法に関するものである。
合性蛋白質（Ｇ−蛋白質）および／または第２メッセン
ジャー、たとえばサイクリックアデノシン一リン酸（cA
MP）を用いる、シグナル形質導入経路に関与する蛋白質
に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る化学物質の同定法、ならびにＧ−蛋白質および／また
は第２メッセンジャー、たとえばcAMPを用いる、シグナ
ル形質導入経路を介して作用するＧ−蛋白質結合−細胞
表面レセプター（GPCレセプター）をコードする核酸ク
ローンの同定法に関するものである。
背景情報 ここに述べる刊行物はすべて参考として引用される。
医学的に重要な生物学的プロセスの多くがＧ−蛋白質
および／または第２メッセンジャー、たとえばcAMPを伴
うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質により仲介さ
れることは十分に確認されている（レフコヴィッツ（Le
fkowitz）（1991）Nature 351:353−354）。ここでは
これらの蛋白質は、Ｇ−蛋白質を伴う経路に関与する蛋
白質、すなわちPPG蛋白質と呼ばれている。これらの蛋
白質の若干の例には下記のものが含まれる:GPCレセプタ
ー、たとえばアドレナリン作動薬およびドーパミンに対
するもの（コビルカ、ディキソン、フリーレ（Kobilka
B.K.,Dixon,R.A.,Frielle,T.）ら（1987）Pro Natl
Acad Sci USA 84:46−50;コビルカ、マツイ、コビ
ルカ（Kobilka B.K.,Matui,H.,Kobilka T.S.）ら（19
87）Science 238:650−656;ブンゾウ、ファン・トル、
グランディ、アルバート（Bunzow,J.R.,Van Tol,H.H.
M.,Grandy,D.K.,Albert,P.）ら（1988）Nature 336:78
3−787）、Ｇ−蛋白質自身、エフェクター蛋白質、たと
えばホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼおよびホス
ホジエステラーゼ、ならびにアクチュエーター蛋白質、
たとえばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナー
ゼＣ（シモン、ストラスマン、ガウタム（Simon,M.I.,S
trathmann,M.P.,Gautam,N.）（1991）Science 252:802
−８）。
および／または第２メッセンジャー、たとえばcAMPを伴
うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質により仲介さ
れることは十分に確認されている（レフコヴィッツ（Le
fkowitz）（1991）Nature 351:353−354）。ここでは
これらの蛋白質は、Ｇ−蛋白質を伴う経路に関与する蛋
白質、すなわちPPG蛋白質と呼ばれている。これらの蛋
白質の若干の例には下記のものが含まれる:GPCレセプタ
ー、たとえばアドレナリン作動薬およびドーパミンに対
するもの（コビルカ、ディキソン、フリーレ（Kobilka
B.K.,Dixon,R.A.,Frielle,T.）ら（1987）Pro Natl
Acad Sci USA 84:46−50;コビルカ、マツイ、コビ
ルカ（Kobilka B.K.,Matui,H.,Kobilka T.S.）ら（19
87）Science 238:650−656;ブンゾウ、ファン・トル、
グランディ、アルバート（Bunzow,J.R.,Van Tol,H.H.
M.,Grandy,D.K.,Albert,P.）ら（1988）Nature 336:78
3−787）、Ｇ−蛋白質自身、エフェクター蛋白質、たと
えばホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼおよびホス
ホジエステラーゼ、ならびにアクチュエーター蛋白質、
たとえばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナー
ゼＣ（シモン、ストラスマン、ガウタム（Simon,M.I.,S
trathmann,M.P.,Gautam,N.）（1991）Science 252:802
−８）。
色素細胞に内在する数種類のGPCレセプターを活性化
する化学物質のバイオアッセイ法が下記に記載されてい
る：ネギシ（Negishi）ら（1988）General and Compa
rative Endocrinology,70:127−132;メッセンジャーお
よびワーナー（Messenger,Warner）（1977）Br.J.Pharm
acology 61:607−614;モリおよびレルナー（Mori,Lern
er）（1960）Endocrinology,67:443−450;モラーおよび
レルナー（Moller,Lerner）（1966）Acta Endocrinolo
gica,51:149−160;カーターおよびシュスター（Carter,
Shuster）（1978）J.Inv.Dermatology,71:229−232;レ
ルナー（Lerner）ら（1988）P.N.A.S.USA,85:261−264;
ならびにエルウィン（Erwing）ら（1990）Biosensors
＆ Bioelectronics,5:449−459。
する化学物質のバイオアッセイ法が下記に記載されてい
る：ネギシ（Negishi）ら（1988）General and Compa
rative Endocrinology,70:127−132;メッセンジャーお
よびワーナー（Messenger,Warner）（1977）Br.J.Pharm
acology 61:607−614;モリおよびレルナー（Mori,Lern
er）（1960）Endocrinology,67:443−450;モラーおよび
レルナー（Moller,Lerner）（1966）Acta Endocrinolo
gica,51:149−160;カーターおよびシュスター（Carter,
Shuster）（1978）J.Inv.Dermatology,71:229−232;レ
ルナー（Lerner）ら（1988）P.N.A.S.USA,85:261−264;
ならびにエルウィン（Erwing）ら（1990）Biosensors
＆ Bioelectronics,5:449−459。
以上に挙げた刊行物に記載された方法すべてにおい
て、それらと本発明方法との間には下記６つの主要な相
異がある： （１）本発明方法は連続長期培養において増殖しうる色
素細胞に基づくものであるのに対し、上記刊行物に記載
されたバイオアッセイ法はいずれも培養において分裂し
続ける色素細胞を利用していない。本発明方法の利点
は、無制限な数の直系の細胞をアッセイに使用しうるこ
とである。これが可能でなければ、大規模の薬物スクリ
ーニングは不可能である。
て、それらと本発明方法との間には下記６つの主要な相
異がある： （１）本発明方法は連続長期培養において増殖しうる色
素細胞に基づくものであるのに対し、上記刊行物に記載
されたバイオアッセイ法はいずれも培養において分裂し
続ける色素細胞を利用していない。本発明方法の利点
は、無制限な数の直系の細胞をアッセイに使用しうるこ
とである。これが可能でなければ、大規模の薬物スクリ
ーニングは不可能である。
（２）本発明方法によってのみ、動物から新鮮な細胞を
採取することなく既存のものから形成された色素細胞の
継続的供給源を得ることができる。
採取することなく既存のものから形成された色素細胞の
継続的供給源を得ることができる。
（３）本発明方法のみが、組織培養容器内で高い密度に
まで増殖しうる色素細胞を使用する。これは多数の薬物
をスクリーニングしうるために重要であり、かつこれは
標準ミクロタイタープレート読取り装置を用いて信頼性
のある結果を得ることができるために重要である。
まで増殖しうる色素細胞を使用する。これは多数の薬物
をスクリーニングしうるために重要であり、かつこれは
標準ミクロタイタープレート読取り装置を用いて信頼性
のある結果を得ることができるために重要である。
（４）本発明方法は、色素細胞上の色素を分散させる内
在セロトニンレセプターに作用する薬物をスクリーニン
グするために利用しうる。これに対し上記に挙げた刊行
物の場合、セロトニンは色素を凝集させると述べられて
いる；たとえば メッセンジャーおよびワーナー（Messenger,Warner）
（1977）Br.J.Pharmacology 61:607−614。
在セロトニンレセプターに作用する薬物をスクリーニン
グするために利用しうる。これに対し上記に挙げた刊行
物の場合、セロトニンは色素を凝集させると述べられて
いる；たとえば メッセンジャーおよびワーナー（Messenger,Warner）
（1977）Br.J.Pharmacology 61:607−614。
（５）本発明方法は、色素細胞が天然に発現しないレセ
プターおよび他の蛋白質に対する薬物のアッセイの基礎
として色素細胞が用いられる、組換えDNA技術を採用す
る。しかし上記刊行物に記載される方法は色素細胞に内
在するレセプターに限定される。
プターおよび他の蛋白質に対する薬物のアッセイの基礎
として色素細胞が用いられる、組換えDNA技術を採用す
る。しかし上記刊行物に記載される方法は色素細胞に内
在するレセプターに限定される。
（６）上記刊行物と異なり、本発明方法のみをGPCレセ
プターのクローニングに利用しうる。本発明方法は色素
細胞の連続培養および組換えDNA技術を利用するからで
ある。
プターのクローニングに利用しうる。本発明方法は色素
細胞の連続培養および組換えDNA技術を利用するからで
ある。
現在、GPCレセプターに対する新規な、より良い薬物
を見出すには大きな制限がある。すなわち化学物質がGP
Cレセプターに作用する能力を試験するための簡単、迅
速かつ一般的な初期スクリーニング法が無い。たとえば
GsまたはGiを介して細胞内cAMPを増加または減少させる
作用をするGPCレセプターを評価するアッセイ法につい
て考えよう。cAMP蓄積についてのラジオイムノアッセイ
法（RIA）は経費がかかり、かつ緩徐であり、１人の技
術者が３重試験法で１日20個以上の化学物質をスクリー
ニングするのは困難であろう（スタイナー（Steiner）
ら（1972）J.Biol.Chem.,247:1106−1113）。一方で
は、現在のアデニレートシクラーゼ活性化アッセイ法は
RIAより迅速であり、１人で１日に最高150個の試料を処
理することができる（サロモン（Salomon）ら（1974）A
nalytical Biochemistry 58:541−548）。しかし現在
のアデニレートシクラーゼ活性化アッセイ法は数工程を
必要とし、従って煩雑である。また両方法とも実質的な
放射性物質、たとえば32Pまたは125Iの使用を伴う。
を見出すには大きな制限がある。すなわち化学物質がGP
Cレセプターに作用する能力を試験するための簡単、迅
速かつ一般的な初期スクリーニング法が無い。たとえば
GsまたはGiを介して細胞内cAMPを増加または減少させる
作用をするGPCレセプターを評価するアッセイ法につい
て考えよう。cAMP蓄積についてのラジオイムノアッセイ
法（RIA）は経費がかかり、かつ緩徐であり、１人の技
術者が３重試験法で１日20個以上の化学物質をスクリー
ニングするのは困難であろう（スタイナー（Steiner）
ら（1972）J.Biol.Chem.,247:1106−1113）。一方で
は、現在のアデニレートシクラーゼ活性化アッセイ法は
RIAより迅速であり、１人で１日に最高150個の試料を処
理することができる（サロモン（Salomon）ら（1974）A
nalytical Biochemistry 58:541−548）。しかし現在
のアデニレートシクラーゼ活性化アッセイ法は数工程を
必要とし、従って煩雑である。また両方法とも実質的な
放射性物質、たとえば32Pまたは125Iの使用を伴う。
定義 “化学物質”は、薬物、化合物または分子のいずれを
も包含するものであると定義される。
も包含するものであると定義される。
“Ｇ−蛋白質結合−細胞表面レセプター”（GPCレセ
プター）は、化学物質により活性化された場合、これが
ヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性蛋白質
（Ｇ−蛋白質）を活性化する、いずれかの細胞表面トラ
ンスメンブラン蛋白質であると定義される。
プター）は、化学物質により活性化された場合、これが
ヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性蛋白質
（Ｇ−蛋白質）を活性化する、いずれかの細胞表面トラ
ンスメンブラン蛋白質であると定義される。
“Ｇ−蛋白質および／または第２メッセンジャーを伴
うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質（PPG蛋白
質）”は、この経路に関与するいずれかの蛋白質である
と定義され、GPCレセプター、Ｇ−蛋白質、エフェクタ
ー蛋白質およびアクチュエーター蛋白質が含まれる。
うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質（PPG蛋白
質）”は、この経路に関与するいずれかの蛋白質である
と定義され、GPCレセプター、Ｇ−蛋白質、エフェクタ
ー蛋白質およびアクチュエーター蛋白質が含まれる。
“エフェクター蛋白質”は、Ｇ−蛋白質のαサブユニ
ットにより活性化または不活性化されるいずれかの蛋白
質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例
には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびホ
スホリパーゼA2が含まれる。ホスホジエステラーゼもエ
フェクター蛋白質であると考えられる。
ットにより活性化または不活性化されるいずれかの蛋白
質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例
には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびホ
スホリパーゼA2が含まれる。ホスホジエステラーゼもエ
フェクター蛋白質であると考えられる。
“第２メッセンジャー”は、細胞間または周囲の細胞
膜内におけるその濃度がエフェクター蛋白質の活性の結
果として上昇または低下する中間化合物であると定義さ
れる。第２メッセンジャーの若干の例には、サイクリッ
クアデノシン一リン酸（cAMP）、ホスファチジルイノシ
トール（PI）、たとえばイノシトール三リン酸（IP
3）、ジアシルグリセロール（DAG）、カルシウム（Ca＋
＋）およびアラキドン酸誘導体が含まれる。
膜内におけるその濃度がエフェクター蛋白質の活性の結
果として上昇または低下する中間化合物であると定義さ
れる。第２メッセンジャーの若干の例には、サイクリッ
クアデノシン一リン酸（cAMP）、ホスファチジルイノシ
トール（PI）、たとえばイノシトール三リン酸（IP
3）、ジアシルグリセロール（DAG）、カルシウム（Ca＋
＋）およびアラキドン酸誘導体が含まれる。
“アクチュエーター蛋白質”は、その活性化状態が第
２メッセンジャーの結合の結果として変化する蛋白質で
あると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例に
は、プテインキナーゼＡおよびプテインキナーゼＣが含
まれる。
２メッセンジャーの結合の結果として変化する蛋白質で
あると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例に
は、プテインキナーゼＡおよびプテインキナーゼＣが含
まれる。
Ｇ−蛋白質および第２メッセンジャーcAMPを用いる１
経路の例により、上記の定義の概要を提示する模式図を
図１に示す。
経路の例により、上記の定義の概要を提示する模式図を
図１に示す。
“色素細胞”とは、下記の条件を満たすいずれかの色
素含有細胞を意味する：（１）それらは、その色素細胞
が特異的刺激、たとえばメラニン細胞刺激ホルモン、メ
ラトニン、光などとの接触に応答してそれらの色素を凝
集または分散させうるいずれかの動物から誘導される。
（２）それらはインビトロで無限に増殖することがで
き、従って無限な量の細胞が得られる。（３）本発明に
用いられる色素細胞（“被験細胞”）にはたとえば下記
のクロマトフォア（色素胞）が含まれるが、これらは限
定ではない：黒色素胞またはメラニン細胞、黄色素胞、
赤色素胞、白色素胞および紅色素胞。色素細胞は進化樹
において人類および鳥類より低級の動物から採取され
る。本発明に用いられる色素細胞を採取しうる“より低
級の動物”の例には下記のものが含まれるが、これらは
限定ではない：爬虫類（Reptilia）、たとえばトカゲ
（Anolis sp）；両生類（Amphibia）、たとえばアフリ
カツメガエル（Xenopus laevis）；魚類（Pisces）、
たとえば（Zacco temmincki）；甲殻類、たとえばシオ
マネキ（Uca pugilator）；棘皮動物（Echinodermat
a）、たとえばガンガゼ（Diadema antillarum）および
（Cinidaria）、たとえば（Nanomsa cara）。本発明に
用いるために特に好ましい色素細胞は、アフリカツメガ
エルからの培養された黒色素胞である（Pigment Cell
（1985），バグナラ（Bagnara）ら編，東京大学出版会,
219−227頁およびレルナー（Lerner）ら（1988）P.N.A.
S.USA 85:261−264）。
素含有細胞を意味する：（１）それらは、その色素細胞
が特異的刺激、たとえばメラニン細胞刺激ホルモン、メ
ラトニン、光などとの接触に応答してそれらの色素を凝
集または分散させうるいずれかの動物から誘導される。
（２）それらはインビトロで無限に増殖することがで
き、従って無限な量の細胞が得られる。（３）本発明に
用いられる色素細胞（“被験細胞”）にはたとえば下記
のクロマトフォア（色素胞）が含まれるが、これらは限
定ではない：黒色素胞またはメラニン細胞、黄色素胞、
赤色素胞、白色素胞および紅色素胞。色素細胞は進化樹
において人類および鳥類より低級の動物から採取され
る。本発明に用いられる色素細胞を採取しうる“より低
級の動物”の例には下記のものが含まれるが、これらは
限定ではない：爬虫類（Reptilia）、たとえばトカゲ
（Anolis sp）；両生類（Amphibia）、たとえばアフリ
カツメガエル（Xenopus laevis）；魚類（Pisces）、
たとえば（Zacco temmincki）；甲殻類、たとえばシオ
マネキ（Uca pugilator）；棘皮動物（Echinodermat
a）、たとえばガンガゼ（Diadema antillarum）および
（Cinidaria）、たとえば（Nanomsa cara）。本発明に
用いるために特に好ましい色素細胞は、アフリカツメガ
エルからの培養された黒色素胞である（Pigment Cell
（1985），バグナラ（Bagnara）ら編，東京大学出版会,
219−227頁およびレルナー（Lerner）ら（1988）P.N.A.
S.USA 85:261−264）。
発明の概要 本発明の目的の１つは、PPG蛋白質、特にGPCレセプタ
ーに対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評
価するための迅速かつ高感度のバイオアッセイ法を開発
することである。
ーに対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評
価するための迅速かつ高感度のバイオアッセイ法を開発
することである。
本発明の他の目的は、GPCレセプターをコードするDNA
のクローニング法を開発することである。
のクローニング法を開発することである。
本発明の他の目的は、PPG蛋白質、特にGPCレセプター
に対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評価
するためのバイオアッセイ法の実施に用いるキットを提
供することである。
に対する新規なアゴニストおよびアンタゴニストを評価
するためのバイオアッセイ法の実施に用いるキットを提
供することである。
これらの目的および他の目的、意図ならびに利点が本
発明により達成される。
発明により達成される。
本発明によれば、外来GPCレセプターに対するアゴニ
ストとして作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が
提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの
色素を分散または凝集しうる、かつGPCレセプターをコ
ードする外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細
胞に、外来GPCレセプターの活性化が色素分散を誘発す
る場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態
を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導
入するか、または外来GPCレセプターの活性化が色素凝
集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色
素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もし
くは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験細
胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された
被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化
したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施す
ることもできる。対照は上記と同じであるが、ただし外
来GPCレセプターを発現しない色素細胞を用いる。外来G
PCレセプターを発現する被験細胞において色素装置の変
化が観察されるが、外来GPCレセプターを発現しない対
照細胞において色素配置の変化が観察されない場合、そ
の化学物質はその外来GPCレセプターに対するアゴニス
トである。
ストとして作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が
提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの
色素を分散または凝集しうる、かつGPCレセプターをコ
ードする外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細
胞に、外来GPCレセプターの活性化が色素分散を誘発す
る場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態
を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導
入するか、または外来GPCレセプターの活性化が色素凝
集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色
素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もし
くは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験細
胞を化学物質と接触させ；そして化学物質で処理された
被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化
したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施す
ることもできる。対照は上記と同じであるが、ただし外
来GPCレセプターを発現しない色素細胞を用いる。外来G
PCレセプターを発現する被験細胞において色素装置の変
化が観察されるが、外来GPCレセプターを発現しない対
照細胞において色素配置の変化が観察されない場合、そ
の化学物質はその外来GPCレセプターに対するアゴニス
トである。
本発明によれば、外来PPG蛋白質に対するアゴニスト
として作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が提供
される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素
を分散または凝集しうる、かつPPG蛋白質をコードする
外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外
来PPG蛋白質の活性化が色素分散を誘発する場合は被験
細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する刺
激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、ま
たは外来PPG蛋白質の活性化が色素凝集を誘発する場合
は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設定
する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；
初期色素配置状態に設定された被験細胞を化学物質と接
触させ；そして化学物質で処理された被験細胞において
色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判定
することよりなる。対照操作を実施することもできる。
対照は上記と同じであるが、ただし外来PPG蛋白質を発
現しない色素細胞を用いる。外来PPG蛋白質を発現する
被験細胞において色素配置の変化が観察されるが、外来
PPG蛋白質を発現しない対照細胞において色素配置の変
化が観察されない場合、その化学物質はその外来PPG蛋
白質に対するアゴニストである。
として作用する化学物質、たとえば薬物の同定法が提供
される。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素
を分散または凝集しうる、かつPPG蛋白質をコードする
外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外
来PPG蛋白質の活性化が色素分散を誘発する場合は被験
細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する刺
激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、ま
たは外来PPG蛋白質の活性化が色素凝集を誘発する場合
は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設定
する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；
初期色素配置状態に設定された被験細胞を化学物質と接
触させ；そして化学物質で処理された被験細胞において
色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判定
することよりなる。対照操作を実施することもできる。
対照は上記と同じであるが、ただし外来PPG蛋白質を発
現しない色素細胞を用いる。外来PPG蛋白質を発現する
被験細胞において色素配置の変化が観察されるが、外来
PPG蛋白質を発現しない対照細胞において色素配置の変
化が観察されない場合、その化学物質はその外来PPG蛋
白質に対するアゴニストである。
また本発明は、外来GPCレセプターに対するアンタゴ
ニストとして作用する化学物質の同定法に関するもので
ある。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素を
分散または凝集しうる、かつGPCレセプターをコードす
る外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、
外来GPCレセプターの活性化が色素分散を誘発する場合
は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定
する第１刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入
するか、または外来GPCレセプターの活性化が色素凝集
を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素
配置状態を設定する第１刺激物質、たとえば化学物質も
しくは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験
細胞を同定すべき化学物質と接触させ；細胞を観察して
それらの色素配置状態が変化していないことを判定し；
同定すべき化学物質と接触させた被験細胞に、外来GPC
レセプターの活性化が色素分散を誘発する場合は外来GP
Cレセプターの活性化により色素の分散を誘発する第２
刺激物質を添加し；外来GPCレセプターの活性化が色素
凝集を誘発する場合は外来GPCレセプターの活性化によ
り色素の凝集を誘発する第２刺激物質を添加し；そして
第２刺激物質を添加した被験細胞において色素配置が初
期色素配置状態から変化したか否かを判定することより
なる。対照操作を実施することもできる。対照操作の１
例は、外来GPCレセプターを活性化する第２刺激物質の
代わりに、その外来GPCレセプターの活性化が有するも
のと同じ作用を色素配置に対して有する、内在GPCレセ
プターを活性化する第２刺激物質を導入するものであ
る。被験細胞においては色素配置の変化が観察されない
が、対照細胞が実際に色素配置の変化を生じる場合、そ
の同定すべき化学物質はその外来GPCレセプターに対す
るアンタゴニストである。
ニストとして作用する化学物質の同定法に関するもので
ある。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの色素を
分散または凝集しうる、かつGPCレセプターをコードす
る外来クローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、
外来GPCレセプターの活性化が色素分散を誘発する場合
は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定
する第１刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入
するか、または外来GPCレセプターの活性化が色素凝集
を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素
配置状態を設定する第１刺激物質、たとえば化学物質も
しくは光を導入し；初期色素配置状態に設定された被験
細胞を同定すべき化学物質と接触させ；細胞を観察して
それらの色素配置状態が変化していないことを判定し；
同定すべき化学物質と接触させた被験細胞に、外来GPC
レセプターの活性化が色素分散を誘発する場合は外来GP
Cレセプターの活性化により色素の分散を誘発する第２
刺激物質を添加し；外来GPCレセプターの活性化が色素
凝集を誘発する場合は外来GPCレセプターの活性化によ
り色素の凝集を誘発する第２刺激物質を添加し；そして
第２刺激物質を添加した被験細胞において色素配置が初
期色素配置状態から変化したか否かを判定することより
なる。対照操作を実施することもできる。対照操作の１
例は、外来GPCレセプターを活性化する第２刺激物質の
代わりに、その外来GPCレセプターの活性化が有するも
のと同じ作用を色素配置に対して有する、内在GPCレセ
プターを活性化する第２刺激物質を導入するものであ
る。被験細胞においては色素配置の変化が観察されない
が、対照細胞が実際に色素配置の変化を生じる場合、そ
の同定すべき化学物質はその外来GPCレセプターに対す
るアンタゴニストである。
本発明は、更に、外因性PPGタンパク質に対するアン
タゴニストとして作用する化学物質を同定する方法に関
する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的
刺激に反応して分散または凝集させ且つPPGタンパク質
をコードする外因性クローンを発現することができる試
験細胞に対して、外因性PPGタンパク質の活性化が色素
分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している
色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、
化学物質または光を導入し、または外因性PPGタンパク
質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞
内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の
刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態
の色素配置にある試験細胞を、同定される化学物質と接
触させ；それらの色素配置の状態が未変化のままである
ことを確認させる細胞を観察し；同定される化学物質と
接触した試験細胞に対して、外因性PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合、外因性PPGタンパク質
を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺
激剤を加え、または外因性PPGタンパク質を活性化する
ことが色素凝集を誘導する場合、外因性PPGタンパク質
を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺
激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞
中の色素配置が初期状態の色素配置から変化しているか
どうかを確認することを含む。対照操作も行うことがで
きる。対照操作の一例は、外因性PPGタンパク質を活性
化する第二の刺激剤の代わりに、色素配置に対して外因
性PPGタンパク質の活性化が有すると考えられるのと同
一の効果を有する内因性PPGタンパク質を活性化する第
二の刺激剤を試験細胞に対して導入することである。試
験細胞において色素配置に変化が見られない場合、対照
細胞は色素配置が変化しないので、同定される化学物質
は外因性PPGタンパク質に対するアンタゴニストであ
る。
タゴニストとして作用する化学物質を同定する方法に関
する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的
刺激に反応して分散または凝集させ且つPPGタンパク質
をコードする外因性クローンを発現することができる試
験細胞に対して、外因性PPGタンパク質の活性化が色素
分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している
色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、
化学物質または光を導入し、または外因性PPGタンパク
質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞
内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の
刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態
の色素配置にある試験細胞を、同定される化学物質と接
触させ；それらの色素配置の状態が未変化のままである
ことを確認させる細胞を観察し；同定される化学物質と
接触した試験細胞に対して、外因性PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合、外因性PPGタンパク質
を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺
激剤を加え、または外因性PPGタンパク質を活性化する
ことが色素凝集を誘導する場合、外因性PPGタンパク質
を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺
激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞
中の色素配置が初期状態の色素配置から変化しているか
どうかを確認することを含む。対照操作も行うことがで
きる。対照操作の一例は、外因性PPGタンパク質を活性
化する第二の刺激剤の代わりに、色素配置に対して外因
性PPGタンパク質の活性化が有すると考えられるのと同
一の効果を有する内因性PPGタンパク質を活性化する第
二の刺激剤を試験細胞に対して導入することである。試
験細胞において色素配置に変化が見られない場合、対照
細胞は色素配置が変化しないので、同定される化学物質
は外因性PPGタンパク質に対するアンタゴニストであ
る。
更に、本発明は、内因性GPC受容体に対するアゴニス
トとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対して
内因性であるセロトニンに関するものを同定する方法に
関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異
的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セロト
ニン受容体を発現することができる試験細胞に対して、
刺激剤、例えばメラトニンを導入し；色素凝集の初期状
態にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物
質で処理された試験細胞中の色素が分散しているかどう
かを確認することを含む。
トとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対して
内因性であるセロトニンに関するものを同定する方法に
関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異
的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セロト
ニン受容体を発現することができる試験細胞に対して、
刺激剤、例えばメラトニンを導入し；色素凝集の初期状
態にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物
質で処理された試験細胞中の色素が分散しているかどう
かを確認することを含む。
更に、本発明は、内因性GPC受容体に対するアンタゴ
ニストとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対
して内因性であるセロトニンに関するものを同定する方
法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を
特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セ
ロトニン受容体を発現することができる試験細胞に対し
て、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状
態を決定する第一の刺激剤、例えばメラトニンを導入
し；色素凝集の初期状態にある試験細胞を、同定される
化学物質と接触させ；細胞を観察して、それらの色素配
置の状態が未変化のままであることを確認し；同定され
る化学物質と接触した試験細胞に対して、内因性セロト
ニン受容体を活性化することによって色素分散を誘導す
る第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられ
た試験細胞中の色素が分散しているかどうかを確認する
ことを含む。対照操作も行うことができる。対照操作の
一例は、内因性セロトニン受容体を活性化する第二の刺
激剤の代わりに、活性化した場合にセロトニン受容体と
同様に色素分散を誘導する別の内因性GPC受容体、例え
ば、MSH受容体を活性化する第二の刺激剤を試験細胞に
対して導入することである。試験細胞において色素分散
が見られない場合、対照細胞は色素分散を行わないの
で、同定される化学物質は内因性セロトニン受容体に対
するアンタゴニストであると考えられる。
ニストとして作用する化学物質、例えば、黒色素胞に対
して内因性であるセロトニンに関するものを同定する方
法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を
特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性セ
ロトニン受容体を発現することができる試験細胞に対し
て、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状
態を決定する第一の刺激剤、例えばメラトニンを導入
し；色素凝集の初期状態にある試験細胞を、同定される
化学物質と接触させ；細胞を観察して、それらの色素配
置の状態が未変化のままであることを確認し；同定され
る化学物質と接触した試験細胞に対して、内因性セロト
ニン受容体を活性化することによって色素分散を誘導す
る第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられ
た試験細胞中の色素が分散しているかどうかを確認する
ことを含む。対照操作も行うことができる。対照操作の
一例は、内因性セロトニン受容体を活性化する第二の刺
激剤の代わりに、活性化した場合にセロトニン受容体と
同様に色素分散を誘導する別の内因性GPC受容体、例え
ば、MSH受容体を活性化する第二の刺激剤を試験細胞に
対して導入することである。試験細胞において色素分散
が見られない場合、対照細胞は色素分散を行わないの
で、同定される化学物質は内因性セロトニン受容体に対
するアンタゴニストであると考えられる。
本発明により、更に、黒色素胞に対して内因性である
PPGタンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼ
Ａ、プロテインキナーゼＣ等に対するアゴニストとして
作用する化学物質を同定する方法を提供する。その方法
は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して
分散または凝集させ且つ内因性PPGタンパク質を発現す
ることができる試験細胞に対して、PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝
集している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例え
ば、化学物質または光を導入し、またはPPGタンパク質
の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内
で分散している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、
例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配
置にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物
質で処理された試験細胞中の色素が初期状態の色素配置
から変化しているかどうかを確認することを含む。
PPGタンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼ
Ａ、プロテインキナーゼＣ等に対するアゴニストとして
作用する化学物質を同定する方法を提供する。その方法
は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して
分散または凝集させ且つ内因性PPGタンパク質を発現す
ることができる試験細胞に対して、PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝
集している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例え
ば、化学物質または光を導入し、またはPPGタンパク質
の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内
で分散している色素配置の初期状態を決定する刺激剤、
例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配
置にある試験細胞を化学物質と接触させ；そして化学物
質で処理された試験細胞中の色素が初期状態の色素配置
から変化しているかどうかを確認することを含む。
本発明は、更に、黒色素胞に対して内因性であるPPC
タンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼＡ、プ
ロテインキナーゼＣ、ホスホジエステラーゼ等に対する
アンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法
に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特
異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性PPG
タンパク質を発現することができる試験細胞に対して、
PPGタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色
素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決
定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入
し、または内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を
誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配
置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物
質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細
胞を、同定される化学物質と接触させ；その細胞を観察
して、それらの色素配置の状態が未変化のままであるこ
とを確認し；同定される化学物質と接触した試験細胞に
対して、内因性PPGタンパク質の活性化が色素分散を誘
導する場合、内因性PPGタンパク質を活性化することに
よって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、または
内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場
合、内因性PPGタンパク質を活性化することによって色
素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え；そして第二の刺
激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色
素配置から変化しているかどうかを確認することを含
む。
タンパク質、例えば、内因性プロテインキナーゼＡ、プ
ロテインキナーゼＣ、ホスホジエステラーゼ等に対する
アンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法
に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特
異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性PPG
タンパク質を発現することができる試験細胞に対して、
PPGタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色
素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決
定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入
し、または内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を
誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配
置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物
質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細
胞を、同定される化学物質と接触させ；その細胞を観察
して、それらの色素配置の状態が未変化のままであるこ
とを確認し；同定される化学物質と接触した試験細胞に
対して、内因性PPGタンパク質の活性化が色素分散を誘
導する場合、内因性PPGタンパク質を活性化することに
よって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、または
内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場
合、内因性PPGタンパク質を活性化することによって色
素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え；そして第二の刺
激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色
素配置から変化しているかどうかを確認することを含
む。
更に、本発明は、GPC受容体をクローン化する方法を
提供する。その方法は、カエルなどの下等動物由来で且
つインビトロで増殖を続けることができる色素細胞に対
して、外因性核酸クローン、例えば、プラスミドベクタ
ーにおいて生じたcDNAライブリーを、任意の許容しうる
方法、例えば、エレクトロポレーションによって導入す
ることを含む。次に、その方法は、内因性GPC受容体を
活性化することによって細胞内の色素配置の初期状態を
決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を細胞に対
して導入し；初期状態の色素配置にある細胞を、外因性
受容体を活性化する化学物質と接触させ；そして色素配
置が初期状態の色素配置から変化していることによって
色素配置の変化が、受容体をコードする外因性クローン
を発現する細胞を示す、化学物質で処理された細胞を同
定することを含む。
提供する。その方法は、カエルなどの下等動物由来で且
つインビトロで増殖を続けることができる色素細胞に対
して、外因性核酸クローン、例えば、プラスミドベクタ
ーにおいて生じたcDNAライブリーを、任意の許容しうる
方法、例えば、エレクトロポレーションによって導入す
ることを含む。次に、その方法は、内因性GPC受容体を
活性化することによって細胞内の色素配置の初期状態を
決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を細胞に対
して導入し；初期状態の色素配置にある細胞を、外因性
受容体を活性化する化学物質と接触させ；そして色素配
置が初期状態の色素配置から変化していることによって
色素配置の変化が、受容体をコードする外因性クローン
を発現する細胞を示す、化学物質で処理された細胞を同
定することを含む。
本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が外因性GP
C受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを
確認するためのキットを提供する。そのキットは１個ま
たはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性ク
ローンを発現する下等動物色素試験細胞；並びに外因性
受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容
体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活
性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化
することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば、
光またはMSHを含む。
C受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを
確認するためのキットを提供する。そのキットは１個ま
たはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性ク
ローンを発現する下等動物色素試験細胞；並びに外因性
受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容
体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活
性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化
することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば、
光またはMSHを含む。
本発明により、更に、ある化学物質が外因性GPC受容
体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確
認するためのキットを提供する。そのキットは１個また
はそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クロ
ーンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性受容体の
活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性
化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、
例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活性化
が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化する
ことによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば
光；並びに外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する
場合に外因性受容体を活性化することによって色素分散
を誘導する第二の刺激剤および／または外因性受容体の
活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性受容体を活性
化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を
含む。
体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確
認するためのキットを提供する。そのキットは１個また
はそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クロ
ーンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性受容体の
活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性
化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、
例えばメラトニンおよび／または外因性受容体の活性化
が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化する
ことによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば
光；並びに外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する
場合に外因性受容体を活性化することによって色素分散
を誘導する第二の刺激剤および／または外因性受容体の
活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性受容体を活性
化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を
含む。
更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が外因性PP
Gタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどう
かを確認するためのキットを提供する。そのキットは１
個またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする
外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；並び
に外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合
に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘
導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性
タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性
受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺
激剤、例えば光を含む。
Gタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどう
かを確認するためのキットを提供する。そのキットは１
個またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする
外因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；並び
に外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合
に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘
導する刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性
タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性
受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺
激剤、例えば光を含む。
本発明により、更に、ある化学物質が外因性PPGタン
パク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうか
を確認するためのキットを提供する。そのキットは１個
またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外
因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性
タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性
受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第
一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性タ
ンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受
容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一
の刺激剤、例えば光；並びに外因性タンパク質の活性化
が色素分散を誘導する場合に外因性タンパク質を活性化
することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤およ
び／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導
する場合に外因性タンパク質を活性化することによって
色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
パク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうか
を確認するためのキットを提供する。そのキットは１個
またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外
因性クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外因性
タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性
受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第
一の刺激剤、例えばメラトニンおよび／または外因性タ
ンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性受
容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一
の刺激剤、例えば光；並びに外因性タンパク質の活性化
が色素分散を誘導する場合に外因性タンパク質を活性化
することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤およ
び／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導
する場合に外因性タンパク質を活性化することによって
色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が内因性GP
C受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを
確認するためのキットを提供する。そのキットは１個ま
たはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色
素試験細胞；並びにその化学物質が向けられている内因
性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受
容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けら
れている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場
合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を
誘導する刺激剤、例えば光を含む。
C受容体に対するアゴニストとして作用するかどうかを
確認するためのキットを提供する。そのキットは１個ま
たはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色
素試験細胞；並びにその化学物質が向けられている内因
性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受
容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けら
れている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場
合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を
誘導する刺激剤、例えば光を含む。
本発明により、更に、ある化学物質が内因性GPC受容
体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確
認するためのキットを提供する。そのキットは１個また
はそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素
試験細胞；その化学物質が向けられている内因性受容体
の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活
性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けら
れている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場
合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を
誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに化学物質が向
けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導す
る場合に、化学物質が向けられている内因性受容体を活
性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤
および／または化学物質が向けられている内因性受容体
の活性化が色素凝集を誘導する場合に、化学物質が向け
られている内因性受容体を活性化することによって色素
凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
体に対するアンタゴニストとして作用するかどうかを確
認するためのキットを提供する。そのキットは１個また
はそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素
試験細胞；その化学物質が向けられている内因性受容体
の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活
性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激
剤、例えばメラトニンおよび／または化学物質が向けら
れている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場
合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を
誘導する第一の刺激剤、例えば光；並びに化学物質が向
けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導す
る場合に、化学物質が向けられている内因性受容体を活
性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤
および／または化学物質が向けられている内因性受容体
の活性化が色素凝集を誘導する場合に、化学物質が向け
られている内因性受容体を活性化することによって色素
凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が内因性PP
Gタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどう
かを確認するためのキットを提供する。このキットは１
個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下
等動物色素試験細胞；並びに内因性PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化
することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメ
ラトニンおよび／または内因性PPGタンパク質の活性化
が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化する
ことによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含
む。
Gタンパク質に対するアゴニストとして作用するかどう
かを確認するためのキットを提供する。このキットは１
個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下
等動物色素試験細胞；並びに内因性PPGタンパク質の活
性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化
することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメ
ラトニンおよび／または内因性PPGタンパク質の活性化
が色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化する
ことによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含
む。
本発明により、更に、ある化学物質が内因性PPGタン
パク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうか
を確認するためのキットを提供する。そのキットは１個
またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等
動物色素試験細胞；内因性PPGタンパク質の活性化が色
素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化すること
によって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラ
トニンおよび／または内因性PPGタンパク質の活性化が
色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化するこ
とによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば
光；並びに内因性PPGタンパク質の活性化が色素分散を
誘導する場合に内因性PPGタンパク質を活性化すること
によって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／また
は内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する
場合に内因性PPGタンパク質を活性化することによって
色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
パク質に対するアンタゴニストとして作用するかどうか
を確認するためのキットを提供する。そのキットは１個
またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等
動物色素試験細胞；内因性PPGタンパク質の活性化が色
素分散を誘導する場合に内因性受容体を活性化すること
によって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラ
トニンおよび／または内因性PPGタンパク質の活性化が
色素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化するこ
とによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば
光；並びに内因性PPGタンパク質の活性化が色素分散を
誘導する場合に内因性PPGタンパク質を活性化すること
によって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／また
は内因性PPGタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する
場合に内因性PPGタンパク質を活性化することによって
色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。
本発明に関する上記論及において、色素配置の初期状
態を決定する基準は「化学物質または光」を用いて行わ
れることが多い。キセノプス・レヴィス（Xenopus lae
vis）由来の黒色素胞に関して研究した本発明者の経験
では、色素凝集の初期状態を決定する最も好都合な方法
はメラトニンを用いることであるが、色素分散の初期状
態を決定する最も好都合な方法は光を用いることであ
る。これらの選択の理由は、双方の場合において、それ
らの効果が、色素配置に対して反対の効果を有する刺激
によって速やかに且つ容易に克服されることによる。こ
のことは、全ての種類の色素胞の場合ではない。例え
ば、多数の魚類の黒色素胞は、それらの色素を分散させ
る代わりに凝集させることによって光に反応するが、メ
ラトニンには全く反応しない。このような黒色素胞を本
発明で用いるために開発したならば、別の初期刺激、例
えば、色素凝集に対する光および色素分散に対するエピ
ネフリンが用いられるであろう。しかしながら、検定に
関係する実際の化学物質または光および色素胞にかかわ
りなく、その概念は同様である。
態を決定する基準は「化学物質または光」を用いて行わ
れることが多い。キセノプス・レヴィス（Xenopus lae
vis）由来の黒色素胞に関して研究した本発明者の経験
では、色素凝集の初期状態を決定する最も好都合な方法
はメラトニンを用いることであるが、色素分散の初期状
態を決定する最も好都合な方法は光を用いることであ
る。これらの選択の理由は、双方の場合において、それ
らの効果が、色素配置に対して反対の効果を有する刺激
によって速やかに且つ容易に克服されることによる。こ
のことは、全ての種類の色素胞の場合ではない。例え
ば、多数の魚類の黒色素胞は、それらの色素を分散させ
る代わりに凝集させることによって光に反応するが、メ
ラトニンには全く反応しない。このような黒色素胞を本
発明で用いるために開発したならば、別の初期刺激、例
えば、色素凝集に対する光および色素分散に対するエピ
ネフリンが用いられるであろう。しかしながら、検定に
関係する実際の化学物質または光および色素胞にかかわ
りなく、その概念は同様である。
図面の簡単な説明 図１はＧ−蛋白質及び第二メッセンジャー（本ケース
ではcAMP）を用いたシグナル形質導入経路の一例を示す
模式図である。
ではcAMP）を用いたシグナル形質導入経路の一例を示す
模式図である。
図2aはメラトニンで処理した細胞を示す写真であり、
図2bはMSHで処理した図2aと同じ細胞を示す写真であ
る。
図2bはMSHで処理した図2aと同じ細胞を示す写真であ
る。
図３はXenopus laevisからの培養メラノフォア（メ
ラニン保有細胞）のスペクトル感受性を示す、光刺激の
波長と相対分散％とのプロットである。メラトニン凝集
メラノフォアを、PTI格子モノクロメータを用いて種々
の波長の光で10分間刺激した。種々の波長に対するメラ
ノフォアの相対感受性は、460nmに対して100％の値を与
えるように調節した。
ラニン保有細胞）のスペクトル感受性を示す、光刺激の
波長と相対分散％とのプロットである。メラトニン凝集
メラノフォアを、PTI格子モノクロメータを用いて種々
の波長の光で10分間刺激した。種々の波長に対するメラ
ノフォアの相対感受性は、460nmに対して100％の値を与
えるように調節した。
図4a及び4bは色素顆粒が凝集または分散されたコンフ
ルエント細胞により示される不透明性の相違を比較する
写真である。
ルエント細胞により示される不透明性の相違を比較する
写真である。
図５は最初にメラトニンで色素凝集状態にセットされ
次にMSHで処理されたコンフルエントのメラノフォアを
含む96ウェルプレートのウェルによる、吸光度と時間の
変化のプロットである。
次にMSHで処理されたコンフルエントのメラノフォアを
含む96ウェルプレートのウェルによる、吸光度と時間の
変化のプロットである。
図6aは各ウェルを異なる組合せのメラトニンとMSHで
処理した各ウェルを有する96ウェルプレートにおけるメ
ラノフォアに関してのドーズリスポンスカーブの写真表
示であり、図6bはマイクロタイタープレートリーダーに
より変換された図6aと同じ情報のグラフ表示である。
処理した各ウェルを有する96ウェルプレートにおけるメ
ラノフォアに関してのドーズリスポンスカーブの写真表
示であり、図6bはマイクロタイタープレートリーダーに
より変換された図6aと同じ情報のグラフ表示である。
図７はメラノフォアが（本ケースではβ−ガラクトシ
ダーゼをコードするcDNAの発現により）組換えDNAを発
現できることを示す写真である。
ダーゼをコードするcDNAの発現により）組換えDNAを発
現できることを示す写真である。
図8A、8B及び8Cは、メラノフォアが外来ヒトβ−２−
アドレナリン性リセプターを発現できること、及び該リ
セプターが刺激されたとき色素細胞がその色素を分散さ
せることを示す一連の写真である。
アドレナリン性リセプターを発現できること、及び該リ
セプターが刺激されたとき色素細胞がその色素を分散さ
せることを示す一連の写真である。
図９は色素細胞内で発現することが知られているＧ−
蛋白質の異なるサブユニットを示す模式図である。
蛋白質の異なるサブユニットを示す模式図である。
図10はβ−２−アドレナリン性リセプターアゴニスト
アッセイの模式図である。
アッセイの模式図である。
図11はβ−２−アドレナリン性リセプターアンタゴニ
ストアッセイの模式図である。
ストアッセイの模式図である。
図12はα−２−アドレナリン性リセプターアゴニスト
アッセイの模式図である。
アッセイの模式図である。
図13はα−２−アドレナリン性リセプターアンタゴニ
ストアッセイの模式図である。
ストアッセイの模式図である。
図14a及び14bは模式図である。図14aは細胞の仮想区
域における色素配置の初期状態を示す；図14bはそのリ
セプターをクローンすべき薬剤で処理した後の同区域で
の色素分散を示す。
域における色素配置の初期状態を示す；図14bはそのリ
セプターをクローンすべき薬剤で処理した後の同区域で
の色素分散を示す。
図15は、ボンベシンリセプターをコードする種々の組
合せのプラスミドでの形質転換に続いてのボンベシンに
対する応答性メラノフォアの割合対ベータガラクトシダ
ーゼ応答性メラノフォアの関係を示すグラフである。
合せのプラスミドでの形質転換に続いてのボンベシンに
対する応答性メラノフォアの割合対ベータガラクトシダ
ーゼ応答性メラノフォアの関係を示すグラフである。
発明の詳細な説明 概要 本発明は、in vitroで連続増殖可能で、そしてＧ−
蛋白質および／または第二メッセンジャー（例えばサイ
クリックアデノシンモノフォスフェート（cAMP））を用
いたシグナル形質導入経路に関与する蛋白質の刺激に応
答して外観を劇的に変化させることが可能な特殊の色素
細胞ライブラリーの開発を利用したものである。
蛋白質および／または第二メッセンジャー（例えばサイ
クリックアデノシンモノフォスフェート（cAMP））を用
いたシグナル形質導入経路に関与する蛋白質の刺激に応
答して外観を劇的に変化させることが可能な特殊の色素
細胞ライブラリーの開発を利用したものである。
出願人は、GPCリセプター及び他のPPG蛋白質を活性化
または阻害する能力について、文字通り１日に何千もの
化学物質をスクリーニングするために用いることが可能
な、正確で直接的バイオアッセイを設計した。試験可能
なGPCリセプターの例には、ベータ２−アドレナリン性
リセプター、ボンベシンリセプター及びセロトニンリセ
プターが含まれる。試験可能な他のPPG蛋白質の例に
は、アデニルサイクラーゼ及びプロテインキナーゼＣが
含まれる。
または阻害する能力について、文字通り１日に何千もの
化学物質をスクリーニングするために用いることが可能
な、正確で直接的バイオアッセイを設計した。試験可能
なGPCリセプターの例には、ベータ２−アドレナリン性
リセプター、ボンベシンリセプター及びセロトニンリセ
プターが含まれる。試験可能な他のPPG蛋白質の例に
は、アデニルサイクラーゼ及びプロテインキナーゼＣが
含まれる。
本発明の主な利点は、潜在的薬剤がGPCリセプターの
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を
評価する速度を、現在の方法にくらべで非常に高めるこ
とができる点である。その本質において、GPCリセプタ
ー、例えばベータ２−アドレナリン性リセプターをコー
ドするcDNAクローンを、数あるなかの任意の標準方法例
えばエレクトロポレーションにより、色素細胞に導入す
る。一時的もしくは永久的に該リセプターを発現しうる
基礎としてバイオアッセイを行い、化学物質の該細胞に
対する添加が該細胞内の色素の配置状態にいかに影響す
るかを観察することにより、該化学物質のベータβ２−
アドレナリン性リセプターに対するアゴニストまたはア
ンタゴニストとしての能力を評価する。同様にして、該
細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するGPCリセプ
ターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する
能力を評価するために用いることも可能である。最後
に、該細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するPPG
蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る能力を評価するために用いることも可能である。
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を
評価する速度を、現在の方法にくらべで非常に高めるこ
とができる点である。その本質において、GPCリセプタ
ー、例えばベータ２−アドレナリン性リセプターをコー
ドするcDNAクローンを、数あるなかの任意の標準方法例
えばエレクトロポレーションにより、色素細胞に導入す
る。一時的もしくは永久的に該リセプターを発現しうる
基礎としてバイオアッセイを行い、化学物質の該細胞に
対する添加が該細胞内の色素の配置状態にいかに影響す
るかを観察することにより、該化学物質のベータβ２−
アドレナリン性リセプターに対するアゴニストまたはア
ンタゴニストとしての能力を評価する。同様にして、該
細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するGPCリセプ
ターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する
能力を評価するために用いることも可能である。最後
に、該細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するPPG
蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る能力を評価するために用いることも可能である。
出願人はさらに、GPCリセプターをコードするcDNAの
クローニング方法も設計した。例えば、二つの公知タイ
プのグルカゴンリセプターが存在し、両者ともGPCリセ
プターである（Wakelam,M.J.O.,Murphy,G.J.,Hruby,V.
J.及びHouslay,M.D.（1986）Nature,323:68−71）。そ
れらの一方は、細胞内のcAMPレベルを調節するシグナル
形質導入経路を活性化し、他方はIP3のレベルを調節す
る。いずれのパスウェイも色素の分散を誘発するから、
これらリセプターの両者は新たな方法でクローニング可
能である。本発明は、色素含有細胞を、目的リセプター
（本ケースではグルカゴン）を発現する組織または細胞
ライン内に存在するmRNA由来のcDNAライブラリー（プラ
スミドもしくはウイルス性）で、色素含有細胞をトラン
スフェクトするために、分子生物学的方法を用いる。イ
メージ形成システム、例えばコンピューターガイドビデ
オシステムまたは写真もまた、グルカゴンに応答して色
素顆粒（メラノゾーム）を分散する色素細胞を同定する
ために、用いることができる。一旦反応性細胞が見つか
ったら、目的リセプターをクローニングするために、い
くつもの周知の方法を用いることができる。
クローニング方法も設計した。例えば、二つの公知タイ
プのグルカゴンリセプターが存在し、両者ともGPCリセ
プターである（Wakelam,M.J.O.,Murphy,G.J.,Hruby,V.
J.及びHouslay,M.D.（1986）Nature,323:68−71）。そ
れらの一方は、細胞内のcAMPレベルを調節するシグナル
形質導入経路を活性化し、他方はIP3のレベルを調節す
る。いずれのパスウェイも色素の分散を誘発するから、
これらリセプターの両者は新たな方法でクローニング可
能である。本発明は、色素含有細胞を、目的リセプター
（本ケースではグルカゴン）を発現する組織または細胞
ライン内に存在するmRNA由来のcDNAライブラリー（プラ
スミドもしくはウイルス性）で、色素含有細胞をトラン
スフェクトするために、分子生物学的方法を用いる。イ
メージ形成システム、例えばコンピューターガイドビデ
オシステムまたは写真もまた、グルカゴンに応答して色
素顆粒（メラノゾーム）を分散する色素細胞を同定する
ために、用いることができる。一旦反応性細胞が見つか
ったら、目的リセプターをクローニングするために、い
くつもの周知の方法を用いることができる。
細胞 黒色素胞の培養物を得た。黒色素胞の長期連続培養物
を確立した（Ide（1974）,Developmental Biology,41:
380−384）。本出願人の使用したXenopus laevisから
由来する培養物は100以上の細胞集団倍加数を経てお
り、およそ５日おきに安定に分裂し続けているものであ
る。本出願人はさらに、いくつかの精製クローンサブラ
インについて、その成長速度、色素形成の程度、および
光やメラトニンなどの刺激剤に対する色素配列の感受性
などの面を試験して性質を決定した。
を確立した（Ide（1974）,Developmental Biology,41:
380−384）。本出願人の使用したXenopus laevisから
由来する培養物は100以上の細胞集団倍加数を経てお
り、およそ５日おきに安定に分裂し続けているものであ
る。本出願人はさらに、いくつかの精製クローンサブラ
インについて、その成長速度、色素形成の程度、および
光やメラトニンなどの刺激剤に対する色素配列の感受性
などの面を試験して性質を決定した。
刺激剤 GPC受容体またはPPGタンパク質に影響を及ぼす薬剤は
黒色素胞に劇的変化をもたらす。生きている動物、皮膚
および培養細胞を用いる実験に基づいて、各種動物から
のいくつかの型の色素胞、および特に黒色素胞は、その
メラノソームを拡散するか、あるいは凝集することによ
って多数の薬剤に応答することが長年知られてきた（Le
rner and Case（1959）,Investigative Dermatolog
y,32:211−221;Butman et al.（1979）,J.Exp.Zool.,
208:17−34;Hogben and Slome（1931）Proc.Royal S
oc.B.,108:10−53）。色素拡散を誘導する化学物質の一
例はメラニン細胞刺激ホルモン（MSH）を含む。一方、
メラトニンは色素凝集を引き起こす。ノルエピネフリン
のようないくつかの薬剤はXenopus laevisのようなあ
る型のカエルからの黒色素胞では色素拡散を誘導する
が、Rana pipiensのような他の種からの黒色素胞では
凝集を誘導する。Xenopus laevisからの黒色素胞はベ
ータ−アドレナリン受容体を有するが、有意な数のアル
ファ−アドレナリン受容体を欠いており、一方Rana pi
piensからの黒色素胞はベータ−受容体もアルファ−受
容体ももっていることが明らかとなった。興味深いこと
に、我々の黒色素胞のような１つの源からの黒色素胞は
どの受容体が発現するかという点については一定である
けれども、１つの種の中においてもかなりの遺伝的差異
がありうる。例えば、いくつかのRana pipiensにおけ
る黒色素胞はアセチルコリンにさらすとその色素顆粒を
凝集するのに対して、その他のRana pipiensの黒色素
胞では該化学物質に応答しない（Moller and Lerner
（1996）,Acta Endocrinologica,51:149−160）。細胞
内cAMPの増加を引き起こす薬剤は全て色素拡散を引き起
こすことは知られていない（Rozdzail and Haimo（19
86）,Cell,47:1061−1070;Lynch et al.（1986）,J.B
iol.Chem.,261:4212−4216）。
黒色素胞に劇的変化をもたらす。生きている動物、皮膚
および培養細胞を用いる実験に基づいて、各種動物から
のいくつかの型の色素胞、および特に黒色素胞は、その
メラノソームを拡散するか、あるいは凝集することによ
って多数の薬剤に応答することが長年知られてきた（Le
rner and Case（1959）,Investigative Dermatolog
y,32:211−221;Butman et al.（1979）,J.Exp.Zool.,
208:17−34;Hogben and Slome（1931）Proc.Royal S
oc.B.,108:10−53）。色素拡散を誘導する化学物質の一
例はメラニン細胞刺激ホルモン（MSH）を含む。一方、
メラトニンは色素凝集を引き起こす。ノルエピネフリン
のようないくつかの薬剤はXenopus laevisのようなあ
る型のカエルからの黒色素胞では色素拡散を誘導する
が、Rana pipiensのような他の種からの黒色素胞では
凝集を誘導する。Xenopus laevisからの黒色素胞はベ
ータ−アドレナリン受容体を有するが、有意な数のアル
ファ−アドレナリン受容体を欠いており、一方Rana pi
piensからの黒色素胞はベータ−受容体もアルファ−受
容体ももっていることが明らかとなった。興味深いこと
に、我々の黒色素胞のような１つの源からの黒色素胞は
どの受容体が発現するかという点については一定である
けれども、１つの種の中においてもかなりの遺伝的差異
がありうる。例えば、いくつかのRana pipiensにおけ
る黒色素胞はアセチルコリンにさらすとその色素顆粒を
凝集するのに対して、その他のRana pipiensの黒色素
胞では該化学物質に応答しない（Moller and Lerner
（1996）,Acta Endocrinologica,51:149−160）。細胞
内cAMPの増加を引き起こす薬剤は全て色素拡散を引き起
こすことは知られていない（Rozdzail and Haimo（19
86）,Cell,47:1061−1070;Lynch et al.（1986）,J.B
iol.Chem.,261:4212−4216）。
本出願人はXenopus laevis黒色素胞のいくつかの化
学物質に応答する能力を試験し、図２は４つの細胞に対
するメラトニンおよびMSHの効果を示す。細胞を0.1nMメ
ラトニンで30分間処理した効果を図２の左側に示し、右
側には同じ細胞を次いで100nM MSHにさらに30分間さら
した（メラトニンは引き続き存在する）効果を示す。メ
ラトニンにもMSHにもさらさなかった細胞は色素凝集お
よび拡散の程度にバラツキがある（データ示さず）。MS
H、メラトニンおよびベータ１−アドレナリン受容体を
活性化する薬剤は黒色素胞に影響を及ぼすことが知られ
ているが、本出願人はXenopus laevisからの黒色素胞
がセロトニンに応答してその色素を拡散することをも発
見した。文献ではこの逆の効果を報告しているので、こ
の発見は重要である（Messenger and Warner（1977）
Br.J.Pharmacology 61:607−614）。一方、本出願人は
これらの細胞が、ベータ２−アドレナリン、ボンベシン
（bombesin）または物質Ｐ受容体選択的アゴニストのよ
うなGPCクラスに属する受容体に影響を及ぼす化学物質
の多くに対して、色素配置に何ら変化を伴う応答をしな
いことも発見した。本出願人の得た結果のいくつかを表
１にまとめた。
学物質に応答する能力を試験し、図２は４つの細胞に対
するメラトニンおよびMSHの効果を示す。細胞を0.1nMメ
ラトニンで30分間処理した効果を図２の左側に示し、右
側には同じ細胞を次いで100nM MSHにさらに30分間さら
した（メラトニンは引き続き存在する）効果を示す。メ
ラトニンにもMSHにもさらさなかった細胞は色素凝集お
よび拡散の程度にバラツキがある（データ示さず）。MS
H、メラトニンおよびベータ１−アドレナリン受容体を
活性化する薬剤は黒色素胞に影響を及ぼすことが知られ
ているが、本出願人はXenopus laevisからの黒色素胞
がセロトニンに応答してその色素を拡散することをも発
見した。文献ではこの逆の効果を報告しているので、こ
の発見は重要である（Messenger and Warner（1977）
Br.J.Pharmacology 61:607−614）。一方、本出願人は
これらの細胞が、ベータ２−アドレナリン、ボンベシン
（bombesin）または物質Ｐ受容体選択的アゴニストのよ
うなGPCクラスに属する受容体に影響を及ぼす化学物質
の多くに対して、色素配置に何ら変化を伴う応答をしな
いことも発見した。本出願人の得た結果のいくつかを表
１にまとめた。
表１は、本出願人の黒色素胞において色素移動を誘導
する化学物質と光のリストの一部分を示す。
する化学物質と光のリストの一部分を示す。
光導入メラノソーム分散はＧ−蛋白に基づくシグナル
形質導入経路によって仲介される。アフリカツメガエル
由来のメラニン保有細胞の場合では、経路には第２のメ
ッセンジャーとしてcAMPが用いられる。この発見は、メ
ラニン保有細胞中への光形質導入は脊椎動物の視覚系に
おいて使用されたcGMPに基づく系と異なる第２のメッセ
ンジャー系によって仲介されるという観点からみて、驚
くべきものである（Stryer,L.（1986）Ann.Rve.Neurosc
i.,9:87−119）。しかしながら、ここでの重要な点は、
色素の細胞感光性によって、非常に簡単なやり方で細胞
を色素分散状態に固定でき、そして色素の凝集を起こす
化学物質をスクリーニングするのに有用なことである。
図３はアフリカツメガエル由来の培養されたメラニン保
有細胞の分光感光性を示している。メラトニンへの露光
の結果である凝集した色素を持つメラニン保有細胞は、
PTIグレーティングモノクロメーターを用いて、様々な
波長の光によって10分間刺激された。異なる波長に対す
るメラニン保有細胞の比感光性は460nMについて100％の
値を与えるように調節された。図３に示されるように、
細胞が一定の強さである範囲の波長の光に露光される場
合、細胞は460nmの光に対して最高の感光性であり、550
nm以上の光に対しては感光しなかった。550nmは可視領
域であるから、光応答性を刺激することなく、メラニン
保有細胞を取り扱うことは困難なことではない。
形質導入経路によって仲介される。アフリカツメガエル
由来のメラニン保有細胞の場合では、経路には第２のメ
ッセンジャーとしてcAMPが用いられる。この発見は、メ
ラニン保有細胞中への光形質導入は脊椎動物の視覚系に
おいて使用されたcGMPに基づく系と異なる第２のメッセ
ンジャー系によって仲介されるという観点からみて、驚
くべきものである（Stryer,L.（1986）Ann.Rve.Neurosc
i.,9:87−119）。しかしながら、ここでの重要な点は、
色素の細胞感光性によって、非常に簡単なやり方で細胞
を色素分散状態に固定でき、そして色素の凝集を起こす
化学物質をスクリーニングするのに有用なことである。
図３はアフリカツメガエル由来の培養されたメラニン保
有細胞の分光感光性を示している。メラトニンへの露光
の結果である凝集した色素を持つメラニン保有細胞は、
PTIグレーティングモノクロメーターを用いて、様々な
波長の光によって10分間刺激された。異なる波長に対す
るメラニン保有細胞の比感光性は460nMについて100％の
値を与えるように調節された。図３に示されるように、
細胞が一定の強さである範囲の波長の光に露光される場
合、細胞は460nmの光に対して最高の感光性であり、550
nm以上の光に対しては感光しなかった。550nmは可視領
域であるから、光応答性を刺激することなく、メラニン
保有細胞を取り扱うことは困難なことではない。
色素配置の定量化 図4a及び図4bは、色素粒子が凝集又は分散している融
合性細胞によって示される不透明度の違いを比較したも
のである。図4aは0.1nMのメラトニンで30分間処理した
融合性メラニン保有細胞をもつ100mmの組織培養皿を示
す。図4bは、同数のメラニン保有細胞を含有する別の培
養皿を示すが、メラトニンで処理した後100nMのMSHで30
分間処理したものである。
合性細胞によって示される不透明度の違いを比較したも
のである。図4aは0.1nMのメラトニンで30分間処理した
融合性メラニン保有細胞をもつ100mmの組織培養皿を示
す。図4bは、同数のメラニン保有細胞を含有する別の培
養皿を示すが、メラトニンで処理した後100nMのMSHで30
分間処理したものである。
本発明によるメラトニン保有細胞検定は標準96ウェル
プレートリーダーで読み取ることが出来る。化学物質
が、メラトニン保有細胞内での色素の分散又は凝集を誘
因する能力は、目によって容易に認識できるが、迅速な
医薬スクリーニングの為には、例えば標準96ウェルプレ
ートの使用による色素分散の程度定量化が有用である。
図５は96ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェ
ル内で化学的刺激に応答したメラニン保有細胞内の色素
分散の結果をグラフ化して示すものである。この曲線を
得る為に、メラトニン保有細胞の融合層を有するウェル
は最初メラトニンで１時間処理された。620nm（細胞の
内因性光レセプターでは検知されない波長）の光の吸光
度が決定された。次に、MSHを10nMで添加し、そしてウ
ェルによる620nm光の吸光度が５分間隔で１時間測定さ
れた。
プレートリーダーで読み取ることが出来る。化学物質
が、メラトニン保有細胞内での色素の分散又は凝集を誘
因する能力は、目によって容易に認識できるが、迅速な
医薬スクリーニングの為には、例えば標準96ウェルプレ
ートの使用による色素分散の程度定量化が有用である。
図５は96ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェ
ル内で化学的刺激に応答したメラニン保有細胞内の色素
分散の結果をグラフ化して示すものである。この曲線を
得る為に、メラトニン保有細胞の融合層を有するウェル
は最初メラトニンで１時間処理された。620nm（細胞の
内因性光レセプターでは検知されない波長）の光の吸光
度が決定された。次に、MSHを10nMで添加し、そしてウ
ェルによる620nm光の吸光度が５分間隔で１時間測定さ
れた。
本発明によるメラトニン検定はGPCレセプター及び別
のPPG蛋白に作用する化学物質対して応答する投与量を
迅速に決定するために使用できる。図６は、色素細胞に
たいして内因性であるMSHレセプターにより、この点を
示している。図6aでは、各ウェルが異なるメラトニンと
MSHとの組み合わせで処理されたマイクロタイタープレ
ートを示す。最初の８つの異なるメラトニン投与量は、
最終濃度が0.1−320nMの範囲になるように、列毎に添加
された。60分後、ウェルは、0.5−1024nMの範囲のMSHの
12の異なる投与量のうちの１つがカラムにより与えられ
た。30分後、プレートはマイクロプレートリーダーで読
み取られ、次いで固定された。固定されたプレートは図
6aの写真に示す。一方、マイクロプレートリーダーによ
って決定された最下部から上部への列を表す投与量応答
曲線は図6bに示される。プレートリーダーは異なる濃度
の化学物質を受け入れているウェルを容易に区別でき
る。
のPPG蛋白に作用する化学物質対して応答する投与量を
迅速に決定するために使用できる。図６は、色素細胞に
たいして内因性であるMSHレセプターにより、この点を
示している。図6aでは、各ウェルが異なるメラトニンと
MSHとの組み合わせで処理されたマイクロタイタープレ
ートを示す。最初の８つの異なるメラトニン投与量は、
最終濃度が0.1−320nMの範囲になるように、列毎に添加
された。60分後、ウェルは、0.5−1024nMの範囲のMSHの
12の異なる投与量のうちの１つがカラムにより与えられ
た。30分後、プレートはマイクロプレートリーダーで読
み取られ、次いで固定された。固定されたプレートは図
6aの写真に示す。一方、マイクロプレートリーダーによ
って決定された最下部から上部への列を表す投与量応答
曲線は図6bに示される。プレートリーダーは異なる濃度
の化学物質を受け入れているウェルを容易に区別でき
る。
メラニン保有細胞における外因性GPCレセプターの発現 GPCレセプターにおける化学物質の影響を研究するた
めの、メラニン保有細胞をベースとする方法論を開発す
る最初の工程は、細胞内で外来DNAをどのように発現す
るかを決定することである。幾つかのプロモーター及び
DNAのトランスフェクションのための幾つかの方法が、
外来cDNA類を発現する為にカエルのメラニン保有細胞に
おいて使用されるそれらの能力について、試験された。
試験されたプロモーターは、CMV（サイトメガロウイル
ス）、RSV（ラウス肉腫ウイルス）、カエル熱ショッ
ク、SV−40アーリー及びカエルベータアクチンである。
一方、予め評価された細胞にDNAを導入する試験方法は
リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラン、リポフェ
クション及びエレクトロポレーション（電気穿孔法）で
ある。
めの、メラニン保有細胞をベースとする方法論を開発す
る最初の工程は、細胞内で外来DNAをどのように発現す
るかを決定することである。幾つかのプロモーター及び
DNAのトランスフェクションのための幾つかの方法が、
外来cDNA類を発現する為にカエルのメラニン保有細胞に
おいて使用されるそれらの能力について、試験された。
試験されたプロモーターは、CMV（サイトメガロウイル
ス）、RSV（ラウス肉腫ウイルス）、カエル熱ショッ
ク、SV−40アーリー及びカエルベータアクチンである。
一方、予め評価された細胞にDNAを導入する試験方法は
リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラン、リポフェ
クション及びエレクトロポレーション（電気穿孔法）で
ある。
（Hall,C.V.,Jacob,P.E.,Ringold,G.M.およびLee,F.（1
983）,J.Mol.Appl.Genet.,2:101−109;Harland,R.およ
びMisher,L.（1988）Development,102:837−852;Gorma
n,C.M.,Merlino,G.T.,Willinghan,M.C.,et al.（198
2）,Proc.Natl.Acad.Sci.22:6777−6781;Spaete,R.R.お
よびMocarski,E.S.（1985）,Journal of Virology,5
6:135−143;Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,
T.（1989）Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory Press 2nd.ed.1610−1612;McCutchan,
J.H.およびPagano,J.S.（1968）,J.Natl.Cancer Ins
t.,41:351−357;Warden,D.およびThorne,H.V.（1968）,
J.Gen.Viro..3:371−377;Felgner,P.L.,Gadek,T.R.,Hol
m.,M.,et al.（1987）,Proc.Natl.Acad.Sci.84:7413−
7414;Boggs,S.S,Gregg,R.G.,Borenstein,N.およびSmith
ies,O.（1986）,Exp.Hematol.,14:988−994） 最良の組み合わせは、初期のcDNAの発現をもたらすCM
Vプロモーターをエレクトロポレーションによって使用
することであると思われる。図７には、CMVプロモータ
ーの後ろにベータガラクトシダーゼをコードするlacZ遺
伝子を含むプラスミドを色素細胞に導入するためにエレ
クトロポレーションを用いる例が示されている。サイト
プラズム内でＸ−gal染色によるベータガラクトシダー
ゼの可視化を助けるために、細胞は予めメラトニンで処
理される。この具体的試験でのトランスフェクションの
有効率は63％であった。試験の平均では、有効率は37％
であった。
983）,J.Mol.Appl.Genet.,2:101−109;Harland,R.およ
びMisher,L.（1988）Development,102:837−852;Gorma
n,C.M.,Merlino,G.T.,Willinghan,M.C.,et al.（198
2）,Proc.Natl.Acad.Sci.22:6777−6781;Spaete,R.R.お
よびMocarski,E.S.（1985）,Journal of Virology,5
6:135−143;Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,
T.（1989）Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory Press 2nd.ed.1610−1612;McCutchan,
J.H.およびPagano,J.S.（1968）,J.Natl.Cancer Ins
t.,41:351−357;Warden,D.およびThorne,H.V.（1968）,
J.Gen.Viro..3:371−377;Felgner,P.L.,Gadek,T.R.,Hol
m.,M.,et al.（1987）,Proc.Natl.Acad.Sci.84:7413−
7414;Boggs,S.S,Gregg,R.G.,Borenstein,N.およびSmith
ies,O.（1986）,Exp.Hematol.,14:988−994） 最良の組み合わせは、初期のcDNAの発現をもたらすCM
Vプロモーターをエレクトロポレーションによって使用
することであると思われる。図７には、CMVプロモータ
ーの後ろにベータガラクトシダーゼをコードするlacZ遺
伝子を含むプラスミドを色素細胞に導入するためにエレ
クトロポレーションを用いる例が示されている。サイト
プラズム内でＸ−gal染色によるベータガラクトシダー
ゼの可視化を助けるために、細胞は予めメラトニンで処
理される。この具体的試験でのトランスフェクションの
有効率は63％であった。試験の平均では、有効率は37％
であった。
薬剤のスクリーニングに用いる色素細胞cDNA表示シス
テムを明らかにする際の次の工程は、Ｇ−タンパク質に
基づく信号形質導入経路を活性化しかつ一般にヒトによ
って発現される特徴のある７つのトランスメンブランド
メインレセプターが、カエルの黒色素胞で適切に発現で
きることを証明するものであった。本出願人等は、カエ
ルの色素細胞が、ベータ２−レセプター特異的薬剤であ
るメタプロテレノールに反応しないことを知っていたの
で（表１参照）、この重要なポイントを評価するため
に、ヒトベータ２−アドレナリン性レセプターを選ん
だ。２つの基準を満たさなければならなかった。第１
に、レセプターは、有意な数の細胞によって発現されな
ければならなかった。第２に、トランスフェクトされた
細胞によって発現されるレセプターは、内在性のＧに結
合することができなければならなかった。
テムを明らかにする際の次の工程は、Ｇ−タンパク質に
基づく信号形質導入経路を活性化しかつ一般にヒトによ
って発現される特徴のある７つのトランスメンブランド
メインレセプターが、カエルの黒色素胞で適切に発現で
きることを証明するものであった。本出願人等は、カエ
ルの色素細胞が、ベータ２−レセプター特異的薬剤であ
るメタプロテレノールに反応しないことを知っていたの
で（表１参照）、この重要なポイントを評価するため
に、ヒトベータ２−アドレナリン性レセプターを選ん
だ。２つの基準を満たさなければならなかった。第１
に、レセプターは、有意な数の細胞によって発現されな
ければならなかった。第２に、トランスフェクトされた
細胞によって発現されるレセプターは、内在性のＧに結
合することができなければならなかった。
図８は、前記の基準１及び２を満たしたことを証明し
ている。第１のパネルでは、CMVプロモーターの後ろに
配置されたヒトベータ２−レセプターに40μｇのプラス
ミドコードを用いる、エレクトロポーレイション実験に
おいて、２日早くトランスフェクトされた色素細胞が示
されている。ここで、細胞は10nMメラトニで60分間処理
して色素を凝集させた。第２のパネルは、以下のように
して何回も露光して得た同一範囲の細胞を示す。
ている。第１のパネルでは、CMVプロモーターの後ろに
配置されたヒトベータ２−レセプターに40μｇのプラス
ミドコードを用いる、エレクトロポーレイション実験に
おいて、２日早くトランスフェクトされた色素細胞が示
されている。ここで、細胞は10nMメラトニで60分間処理
して色素を凝集させた。第２のパネルは、以下のように
して何回も露光して得た同一範囲の細胞を示す。
第１に、細胞を赤色光にさらすが、カメラ内のフィル
ムは前進させなかった。第２に、細胞を１μＭのメタプ
ロテレノールで30分間処理した。第３に、細胞を白色光
にさらした。
ムは前進させなかった。第２に、細胞を１μＭのメタプ
ロテレノールで30分間処理した。第３に、細胞を白色光
にさらした。
メタプロテノールに反応して色素を分散させたどの細
胞も、白色光がフィルムに当たるのを妨げるが、赤色光
は通過させた。この結果、メタプロテレノールに反応し
て色素を分散させた細胞は、中心が黒ずんだ赤色となっ
た。
胞も、白色光がフィルムに当たるのを妨げるが、赤色光
は通過させた。この結果、メタプロテレノールに反応し
て色素を分散させた細胞は、中心が黒ずんだ赤色となっ
た。
一方、ベータ２−レセプタープラスミドを受け入れな
かったどの細胞も、メタプロテレノールに反応して色素
を分散させることはなく、従って、これらの細胞は、赤
色及び白色の光にさらしたフィルムのどの領域も白色と
なったので、小さな黒っぽいスポットとなっただけであ
る。最後のパネルは、同じ細胞を示すが、メタプロテレ
ノールで処理した後、１回露光したものである。この実
験では、メタプロテレノールに反応する能力を得た細胞
の割合は、出願人等の平均トランスフェクション効率と
同じであった。このことは、人間から本来誘導されたレ
セプターが、カエルの色素細胞内のＧ−タンパク質仲介
信号形質導入経路に機能的に結合することができること
を証明している。
かったどの細胞も、メタプロテレノールに反応して色素
を分散させることはなく、従って、これらの細胞は、赤
色及び白色の光にさらしたフィルムのどの領域も白色と
なったので、小さな黒っぽいスポットとなっただけであ
る。最後のパネルは、同じ細胞を示すが、メタプロテレ
ノールで処理した後、１回露光したものである。この実
験では、メタプロテレノールに反応する能力を得た細胞
の割合は、出願人等の平均トランスフェクション効率と
同じであった。このことは、人間から本来誘導されたレ
セプターが、カエルの色素細胞内のＧ−タンパク質仲介
信号形質導入経路に機能的に結合することができること
を証明している。
出願人等はまた、他のＧ−タンパク質仲介信号形質導
入経路が、いくつかの基準に基づいてカエルの黒色素胞
内の色素のトランスロケーションを制御しうることも証
明した。第１に、細胞は図９に示すように、多数の異な
るＧ−タンパク質を有する。実際、色素細胞は各種類か
らの多数のＧ−タンパク質を有する。第２に、３つの他
の外来性のGPCレセプターが、カエルの黒色素胞内で示
された（データは示さない）。これらには、セロトニ
ン、ボンベシン及びサブスタンスＰに対するレセプター
が含まれる。いずれの場合も、適当なアゴニストを添加
すると色素の分散を引き起こした。これらの研究の重要
なことは、ボンベシン及びサブスタンスＰレセプターの
効果はＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路を経て働く
ものであるが、これらは、ベータ２−アドレナリン性レ
セプターが用るものとは異なるものを用いていることで
ある。第３に、カルシウムイオノフォアA23187（プレス
マン,B.C.（1976）、Ann.Rev.Biochem.、45:501−530）
も色素分散を引き起こす（データは示さない）。第４
に、タンパク質キナーゼＣを刺激することが知られてい
る薬剤TPAが色素分散を引き起こす（データは示さな
い）。
入経路が、いくつかの基準に基づいてカエルの黒色素胞
内の色素のトランスロケーションを制御しうることも証
明した。第１に、細胞は図９に示すように、多数の異な
るＧ−タンパク質を有する。実際、色素細胞は各種類か
らの多数のＧ−タンパク質を有する。第２に、３つの他
の外来性のGPCレセプターが、カエルの黒色素胞内で示
された（データは示さない）。これらには、セロトニ
ン、ボンベシン及びサブスタンスＰに対するレセプター
が含まれる。いずれの場合も、適当なアゴニストを添加
すると色素の分散を引き起こした。これらの研究の重要
なことは、ボンベシン及びサブスタンスＰレセプターの
効果はＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路を経て働く
ものであるが、これらは、ベータ２−アドレナリン性レ
セプターが用るものとは異なるものを用いていることで
ある。第３に、カルシウムイオノフォアA23187（プレス
マン,B.C.（1976）、Ann.Rev.Biochem.、45:501−530）
も色素分散を引き起こす（データは示さない）。第４
に、タンパク質キナーゼＣを刺激することが知られてい
る薬剤TPAが色素分散を引き起こす（データは示さな
い）。
トランスフェクションによって色素細胞内で示される
どのGPCレセプターも、色素分散を引き起こすことが可
能であるはずである。上述のように、色素細胞は多くの
外来性Ｇタンパク質を有する。それらの全てが、GPCレ
セプターを細胞内の色素トランスロケーションメカニズ
ムに結び付けるものではないが、それらの多くはそうで
あるにちがいない。また、黒色素胞内のGPCレセプター
を示すのに用いられる組み換えDNA法の種類で外来性の
ものを示すことによって、さらに別のものも加えること
ができる。最後に、色素のトランスロケーションに導く
Ｇ−タンパク質に基づく経路に対して、色素のトランス
ロケーションに導かないＧ−タンパク質に基づく経路に
一般につながるGPCレセプターにすることができる架空
のＧ−タンパク質を、試験官内でつくり、そして黒色素
胞内で示すことが可能である。これらの点の重要なこと
は、色素トランスロケーションを調節する信号形質導入
システムに細胞をつなぐことができるＧ−タンパク質を
発現するように細胞がつくられているとき、どのGPCレ
セプターも、刺激を加えたときに色素のトランスロケー
ションを引き起こすことができることである。
どのGPCレセプターも、色素分散を引き起こすことが可
能であるはずである。上述のように、色素細胞は多くの
外来性Ｇタンパク質を有する。それらの全てが、GPCレ
セプターを細胞内の色素トランスロケーションメカニズ
ムに結び付けるものではないが、それらの多くはそうで
あるにちがいない。また、黒色素胞内のGPCレセプター
を示すのに用いられる組み換えDNA法の種類で外来性の
ものを示すことによって、さらに別のものも加えること
ができる。最後に、色素のトランスロケーションに導く
Ｇ−タンパク質に基づく経路に対して、色素のトランス
ロケーションに導かないＧ−タンパク質に基づく経路に
一般につながるGPCレセプターにすることができる架空
のＧ−タンパク質を、試験官内でつくり、そして黒色素
胞内で示すことが可能である。これらの点の重要なこと
は、色素トランスロケーションを調節する信号形質導入
システムに細胞をつなぐことができるＧ−タンパク質を
発現するように細胞がつくられているとき、どのGPCレ
セプターも、刺激を加えたときに色素のトランスロケー
ションを引き起こすことができることである。
外来性GPCレセプターに対する潜在的なアゴニスト及び
アンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ 本発明のバイオアッセイ法の予備工程は、アフリカツ
メガエル（Xenopus laevis）からの黒色素胞内で外来
性cDNAを発現させることである。明確にするために、ヒ
トベータ２−アドレナリン性レセプターを例として用い
る。しかしながら、この記載は、甲状腺刺激ホルモン、
黄体形成ホルモン−絨毛性コナドトロピン、ドパミン及
びヒスタミンレセプター等のような、コードDNAをクロ
ーン化した多くのGPCレセプターに、等しく十分に適用
される。同様に、グルカゴンの場合のように、クローン
が他のGPCレセプターに利用できれば、アッセイは以下
のように説明される。
アンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ 本発明のバイオアッセイ法の予備工程は、アフリカツ
メガエル（Xenopus laevis）からの黒色素胞内で外来
性cDNAを発現させることである。明確にするために、ヒ
トベータ２−アドレナリン性レセプターを例として用い
る。しかしながら、この記載は、甲状腺刺激ホルモン、
黄体形成ホルモン−絨毛性コナドトロピン、ドパミン及
びヒスタミンレセプター等のような、コードDNAをクロ
ーン化した多くのGPCレセプターに、等しく十分に適用
される。同様に、グルカゴンの場合のように、クローン
が他のGPCレセプターに利用できれば、アッセイは以下
のように説明される。
薬剤計画及び発見プロセスの重要性 GPCレセプター及び他のPPGタンパク質に作用する薬剤
を見いだすための、及びGPCレセプターをクローン化す
るための技術は、薬学及び生物学いずれにとっても重要
なことである。本発明の方法は以下のものを提供する：
（１）GPCレセプター及び他のPPGタンパク質に作用する
新しい薬剤を素早くかつ注意深くスクリーニングする有
効な方法、及び（２）新しいGPCレセプターをクローン
化するための、及びレセプターがどのように作用するか
を厳密に調べるための有効な方法。追加のGPCレセプタ
ー遺伝子を特徴づけそして特定部位の突然変異誘発を用
いてそれらを分析するので、これらのレセプターに働く
基本的なメカニズムについての詳細な知識が得られる。
これらのレセプターに働く基本的なメカニズムについて
の根本的な知識は、有望な新薬をいかに開発するかを理
解する際に、大いに用いられる。
を見いだすための、及びGPCレセプターをクローン化す
るための技術は、薬学及び生物学いずれにとっても重要
なことである。本発明の方法は以下のものを提供する：
（１）GPCレセプター及び他のPPGタンパク質に作用する
新しい薬剤を素早くかつ注意深くスクリーニングする有
効な方法、及び（２）新しいGPCレセプターをクローン
化するための、及びレセプターがどのように作用するか
を厳密に調べるための有効な方法。追加のGPCレセプタ
ー遺伝子を特徴づけそして特定部位の突然変異誘発を用
いてそれらを分析するので、これらのレセプターに働く
基本的なメカニズムについての詳細な知識が得られる。
これらのレセプターに働く基本的なメカニズムについて
の根本的な知識は、有望な新薬をいかに開発するかを理
解する際に、大いに用いられる。
本発明また、食品又は血液もしくは尿のような体液中
の麻酔薬、例えばコカイン、ヘロイン、モルフィン又は
アヘン誘導体のような薬剤の試験に用いることもでき
る。
の麻酔薬、例えばコカイン、ヘロイン、モルフィン又は
アヘン誘導体のような薬剤の試験に用いることもでき
る。
実施例1:第１バイオアッセイ 活性化が色素分散を招くヒトベータ２−アドレナリン性
レセプター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴ
ニストを評価するためのバイオアッセイ β２−アドレナリン性レセプターを刺激する新薬をス
クリーンするために、レセプターを発現する組み換えメ
ラニン含有細胞及びレセプターを発現しない非組み換え
メラニン含有細胞を、図10に示す何組かの組織培養穴に
セットする。全ての穴を0.1−1nMメラトニンで処理し
て、細胞内色素凝集を生じさせる。メラトニンの濃度
は、イソプロテレノール（メラニン含有細胞外来性ベー
タ１−アドレナリン性レセプターを刺激する）又はMSH
の少量の投与で、容易に低下させることができる。
レセプター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴ
ニストを評価するためのバイオアッセイ β２−アドレナリン性レセプターを刺激する新薬をス
クリーンするために、レセプターを発現する組み換えメ
ラニン含有細胞及びレセプターを発現しない非組み換え
メラニン含有細胞を、図10に示す何組かの組織培養穴に
セットする。全ての穴を0.1−1nMメラトニンで処理し
て、細胞内色素凝集を生じさせる。メラトニンの濃度
は、イソプロテレノール（メラニン含有細胞外来性ベー
タ１−アドレナリン性レセプターを刺激する）又はMSH
の少量の投与で、容易に低下させることができる。
図10の欄１にあるように、メタプロテレノールのよう
な選択的ベータ２−レセプターアゴニストを、正のコン
トロール物質として用いる。この場合、ベータ２−レセ
プターを含む細胞を含有する穴は、色素の拡散により黒
っぽく変化する。試験を行う薬剤を同時に、図10の欄２
及び３に示すように、他の組の穴に入れる。これらの穴
にはそれぞれ、ベータ２−レセプターを発現するメラニ
ン含有細胞及び非組み換え親細胞が含まれている。
な選択的ベータ２−レセプターアゴニストを、正のコン
トロール物質として用いる。この場合、ベータ２−レセ
プターを含む細胞を含有する穴は、色素の拡散により黒
っぽく変化する。試験を行う薬剤を同時に、図10の欄２
及び３に示すように、他の組の穴に入れる。これらの穴
にはそれぞれ、ベータ２−レセプターを発現するメラニ
ン含有細胞及び非組み換え親細胞が含まれている。
潜在的に関心のある薬剤は、メタプロテレノールのよ
うに、組み換え細胞内に色素の拡散を引き起こすが、標
準的なものには作用しない。
うに、組み換え細胞内に色素の拡散を引き起こすが、標
準的なものには作用しない。
有望な薬剤を識別したら、これをさらに少なくとも２
つの方法で特徴づける。第１に、色素の分散を引き起こ
す様々な濃度での速度を、メタプロテレノールのような
確立された薬剤の場合の用量反応と比較することができ
る。そして第２に、他のGPCレセプターを表すメラニン
含有細胞が得られたら、これらのレセプターについての
特異性度対交差反応性を確かめることができる。
つの方法で特徴づける。第１に、色素の分散を引き起こ
す様々な濃度での速度を、メタプロテレノールのような
確立された薬剤の場合の用量反応と比較することができ
る。そして第２に、他のGPCレセプターを表すメラニン
含有細胞が得られたら、これらのレセプターについての
特異性度対交差反応性を確かめることができる。
実施例2:第２バイオアッセイ 活性化が色素分散を招くヒトベータ２−アドレナリン性
レセプター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴ
ニストを評価するためのバイオアッセイ ベータ２−アドレナリン性レセプターを拮抗する新薬
をスクリーンするために、レセプターを発現するメラニ
ン含有細胞及びレセプターを、図11に示す並列の何組か
の組織培養穴にセットする。ベータ２−アドレナリン性
レセプターアゴニストを識別する戦略を用いるので、全
ての穴に、0.1−1nMメラトニンを加えて、細胞内色素凝
集を生じさせる。プロプラノロールのようなベータ−ア
ドレナリン性レセプターを、正のコントロール物質とし
て用いる（欄１）。ベータレセプター遮断薬は、ベータ
２−アドレナリン性レセプター選択性刺激物のメタプロ
テレノールの添加後、細胞が色素を分散するのを妨げ
る。試験を行う新薬は他の組みの穴に用いる。
レセプター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴ
ニストを評価するためのバイオアッセイ ベータ２−アドレナリン性レセプターを拮抗する新薬
をスクリーンするために、レセプターを発現するメラニ
ン含有細胞及びレセプターを、図11に示す並列の何組か
の組織培養穴にセットする。ベータ２−アドレナリン性
レセプターアゴニストを識別する戦略を用いるので、全
ての穴に、0.1−1nMメラトニンを加えて、細胞内色素凝
集を生じさせる。プロプラノロールのようなベータ−ア
ドレナリン性レセプターを、正のコントロール物質とし
て用いる（欄１）。ベータレセプター遮断薬は、ベータ
２−アドレナリン性レセプター選択性刺激物のメタプロ
テレノールの添加後、細胞が色素を分散するのを妨げ
る。試験を行う新薬は他の組みの穴に用いる。
有望な薬剤は、プロプラノロールのように、メタプロ
テレノールに反応して色素が分散するのを妨げるが、欄
２及び３に見られるように細胞上の別のGPCレセプター
を刺激するMSHのような薬剤によって引き起こされる色
素の黒ずみを妨げないものである。負のコントロール物
質は、問題の薬剤が単に細胞に損傷によって色素の分散
を妨げているのではないことを確認するために、そして
またメタプロテレノールによって引き起こされる色素の
分散の遮断が、ベータ２−アドレナリン性レセプターを
越えたcAMPカスケードでのいくらかより基本的なレベル
で生じているのではないことを確かめるために用いる。
後者の例は、アデニレートシクラーゼを直接阻害する薬
剤である。興味のある薬剤を見いだしたら、新しいベー
タ２−アドレナリン性レセプターアゴニストを評価する
場合に説明したように、さらに、レセプター特異性及び
効能について特徴づける。
テレノールに反応して色素が分散するのを妨げるが、欄
２及び３に見られるように細胞上の別のGPCレセプター
を刺激するMSHのような薬剤によって引き起こされる色
素の黒ずみを妨げないものである。負のコントロール物
質は、問題の薬剤が単に細胞に損傷によって色素の分散
を妨げているのではないことを確認するために、そして
またメタプロテレノールによって引き起こされる色素の
分散の遮断が、ベータ２−アドレナリン性レセプターを
越えたcAMPカスケードでのいくらかより基本的なレベル
で生じているのではないことを確かめるために用いる。
後者の例は、アデニレートシクラーゼを直接阻害する薬
剤である。興味のある薬剤を見いだしたら、新しいベー
タ２−アドレナリン性レセプターアゴニストを評価する
場合に説明したように、さらに、レセプター特異性及び
効能について特徴づける。
実施例3:第３バイオアッセイ 活性化が色素凝集を招くヒトα２−アドレナリン性レセ
プター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴニス
トを評価するためのバイオアッセイ（ジャコブス（197
9）、Molecula and Cellular Endocrinology 16:14
7−156） アルファ２−アドレナリン受容体を刺激する新しい薬
剤をスクリーニングするために、アッセイは明るいウェ
ルの代わりに暗いウェルで始める点を除いてベーター２
−アドレナリン受容体アゴニストの記載とほとんど同一
である。受容体を発現する組み換え、および受容体を欠
く非組み換えメラニン保有細胞は、図12に概略されるよ
うに平行な組織培養ウェルの組にて準備された。すべて
のウェルは光に暴露されるかまたは少量のMSHのような
薬剤を与えられて細胞内色素分散を誘導する。ｐ−アミ
ノクロニジンのようなアルファ２−アドレナリン受容体
選択的アゴニストは陽性対照として役立つ。
プター又は別のGPCレセプターに対する潜在的アゴニス
トを評価するためのバイオアッセイ（ジャコブス（197
9）、Molecula and Cellular Endocrinology 16:14
7−156） アルファ２−アドレナリン受容体を刺激する新しい薬
剤をスクリーニングするために、アッセイは明るいウェ
ルの代わりに暗いウェルで始める点を除いてベーター２
−アドレナリン受容体アゴニストの記載とほとんど同一
である。受容体を発現する組み換え、および受容体を欠
く非組み換えメラニン保有細胞は、図12に概略されるよ
うに平行な組織培養ウェルの組にて準備された。すべて
のウェルは光に暴露されるかまたは少量のMSHのような
薬剤を与えられて細胞内色素分散を誘導する。ｐ−アミ
ノクロニジンのようなアルファ２−アドレナリン受容体
選択的アゴニストは陽性対照として役立つ。
メラトニンの効果のように、ｐ−アミノクロニジンは
組み換え細胞を誘導してそれらのcAMPの細胞内濃度を低
め、それらのメラノソームを凝集させるべきである。試
験される薬剤をその他のウェルの組に適用し、その中の
幾つかは組み換えメラニン保有細胞を含有し、およびそ
の中の幾つかはカラム２および３に表される標準物質を
含むであろう。
組み換え細胞を誘導してそれらのcAMPの細胞内濃度を低
め、それらのメラノソームを凝集させるべきである。試
験される薬剤をその他のウェルの組に適用し、その中の
幾つかは組み換えメラニン保有細胞を含有し、およびそ
の中の幾つかはカラム２および３に表される標準物質を
含むであろう。
興味深い薬剤はアルファ２−アドレナリン受容体陽性
細胞中で色素凝集を誘導するが、親細胞に影響を及ぼさ
ないものである。ベーター２−受容体アゴニストを評価
するための章に記載にされるように、潜在的に有用な薬
剤はその受容体特異性および効力に関してさらに特性決
定され得る。
細胞中で色素凝集を誘導するが、親細胞に影響を及ぼさ
ないものである。ベーター２−受容体アゴニストを評価
するための章に記載にされるように、潜在的に有用な薬
剤はその受容体特異性および効力に関してさらに特性決
定され得る。
実施例4:第４バイオアッセイ ヒトアルファ２−アドレナリン受容体またはその活性化
が色素凝集を引き起こすもうひとつのGPC受容体につい
ての強力アンタゴニストを評価するためのバイオアッセ
イ アルファ２−受容体に拮抗する新しい薬剤に関するア
ッセイは図13に概略されたアルファ２−受容体を発現す
る組み換えメラニン保有細胞を含有するウェルで（光を
暗くされた）かまたはMSHのような薬剤を含有するウェ
ルで始まる。ラウウォルシン（rauwolscine）のような
アルファ２−受容体アンタゴニストは、色素凝集を誘導
することからアゴニストｐ−アミノクロニジンを保護す
るので陽性対照として役立つであろう。新しい物質を平
列ウェルに供し、有力な目的薬剤はラウウォルシンのよ
うにｐ−アミノクロニジンを遮断するが色素凝集を誘導
したメラトニンではない。以前のように、有望分子の選
択性および効力はベーター２−アドレナリン受容体アゴ
ニストの評価の場合において記載されたようにさらに特
徴つけられる。
が色素凝集を引き起こすもうひとつのGPC受容体につい
ての強力アンタゴニストを評価するためのバイオアッセ
イ アルファ２−受容体に拮抗する新しい薬剤に関するア
ッセイは図13に概略されたアルファ２−受容体を発現す
る組み換えメラニン保有細胞を含有するウェルで（光を
暗くされた）かまたはMSHのような薬剤を含有するウェ
ルで始まる。ラウウォルシン（rauwolscine）のような
アルファ２−受容体アンタゴニストは、色素凝集を誘導
することからアゴニストｐ−アミノクロニジンを保護す
るので陽性対照として役立つであろう。新しい物質を平
列ウェルに供し、有力な目的薬剤はラウウォルシンのよ
うにｐ−アミノクロニジンを遮断するが色素凝集を誘導
したメラトニンではない。以前のように、有望分子の選
択性および効力はベーター２−アドレナリン受容体アゴ
ニストの評価の場合において記載されたようにさらに特
徴つけられる。
実施例5:第５バイオアッセイ 内因性セロトニン受容体の有力アゴニストを評価するた
めのバイオアッセイ 内因性セロトニン受容体を刺激する新しい薬剤に関し
てスクリーンするためにメラニン保有細胞を組織培養ウ
ェルの組上に準備する。すべてのウェルは0.1−1nMのメ
ラトニンで処理し、細胞内色素凝集を誘導する。メラト
ニンのこの濃度はイソプロテレノール（メラニン保有細
胞内因性ベータ−１アドレナリン受容体を刺激する）ま
たはMSHのような少量の薬剤投与で容易に克服される。
セロトニンはウェルを色素凝集により暗くすることによ
り陽性対照として役立つ。試験された薬剤は、同時に他
のウェルの組にも適用された。効果の面で興味深い薬剤
は、セロトニンのように細胞中で色素分散を誘導するも
のである。有望な薬剤が同定されると、セロトニンのよ
うに確立された薬剤に関する投与反応と比較して、色素
分散を誘導する種々の濃度での早さによりさらに特徴つ
けられ得る。
めのバイオアッセイ 内因性セロトニン受容体を刺激する新しい薬剤に関し
てスクリーンするためにメラニン保有細胞を組織培養ウ
ェルの組上に準備する。すべてのウェルは0.1−1nMのメ
ラトニンで処理し、細胞内色素凝集を誘導する。メラト
ニンのこの濃度はイソプロテレノール（メラニン保有細
胞内因性ベータ−１アドレナリン受容体を刺激する）ま
たはMSHのような少量の薬剤投与で容易に克服される。
セロトニンはウェルを色素凝集により暗くすることによ
り陽性対照として役立つ。試験された薬剤は、同時に他
のウェルの組にも適用された。効果の面で興味深い薬剤
は、セロトニンのように細胞中で色素分散を誘導するも
のである。有望な薬剤が同定されると、セロトニンのよ
うに確立された薬剤に関する投与反応と比較して、色素
分散を誘導する種々の濃度での早さによりさらに特徴つ
けられ得る。
有望化合物に関する特異性の対照として、セロトニン
受容体アンタゴニストを有望化合物の添加に先立ち加え
る事ができる。この時有望化合物の添加に引き続き色素
凝集が避けられたら、新しい化合物はセロトニン受容体
に対する特異的アゴニストであろう。
受容体アンタゴニストを有望化合物の添加に先立ち加え
る事ができる。この時有望化合物の添加に引き続き色素
凝集が避けられたら、新しい化合物はセロトニン受容体
に対する特異的アゴニストであろう。
これまでに記載されたすべてのアッセイについて、内
因性GPC受容体を一時的または永久に発現するメラニン
保有細胞および他のPPGタンパク質を使用できることが
明らかである。
因性GPC受容体を一時的または永久に発現するメラニン
保有細胞および他のPPGタンパク質を使用できることが
明らかである。
実施例6:GPCタンパク質をコードするcDNAクローンの単
離 カエルメラニン保有細胞はcDNAライブラリーの迅速な
スクリーニングによりGPC受容体に関するクローニング
方法の基礎を形成できる。GPC受容体をクロニーニング
するための鍵は、目的受容体をコードするものを見いだ
すためにライブラリーから任意のcDNAクローンを迅速に
スクリーニングすることができるようになることであ
る。ここで、マウスボンベジン受容体を使用して、いか
に１回の実験で少なくとも10,000クローンをスクリーニ
ングできるか、ならび例えばにこの系を使用していかに
して新しいGPC受容体をクローン化するかを提供する。
離 カエルメラニン保有細胞はcDNAライブラリーの迅速な
スクリーニングによりGPC受容体に関するクローニング
方法の基礎を形成できる。GPC受容体をクロニーニング
するための鍵は、目的受容体をコードするものを見いだ
すためにライブラリーから任意のcDNAクローンを迅速に
スクリーニングすることができるようになることであ
る。ここで、マウスボンベジン受容体を使用して、いか
に１回の実験で少なくとも10,000クローンをスクリーニ
ングできるか、ならび例えばにこの系を使用していかに
して新しいGPC受容体をクローン化するかを提供する。
ボンベジン受容体を使用するこの実施例において、二
つの組のプラスミドを利用する。第一のプラスミドはCM
Vプロモーターの後ろにボンベジン受容体をコードするc
DNAを含み、一方第二のプラスミドはボンベジン受容体
のひとつに位置するマーカー遺伝子ベーターガラクトシ
ダーゼをコードするcDNAを含有する。プラスミドは種々
の相対濃度で一緒に混合されて、各組全40μｇのプラス
ミドを産するが、各含有は異なる。ひとつの極端な場合
において、ボンベジン受容体をコードするプラスミドの
みが存在する。他の混合物はボンベジン対ベーターガラ
クトシダーゼに関するプラスミドを1:99および1:9999で
含む。
つの組のプラスミドを利用する。第一のプラスミドはCM
Vプロモーターの後ろにボンベジン受容体をコードするc
DNAを含み、一方第二のプラスミドはボンベジン受容体
のひとつに位置するマーカー遺伝子ベーターガラクトシ
ダーゼをコードするcDNAを含有する。プラスミドは種々
の相対濃度で一緒に混合されて、各組全40μｇのプラス
ミドを産するが、各含有は異なる。ひとつの極端な場合
において、ボンベジン受容体をコードするプラスミドの
みが存在する。他の混合物はボンベジン対ベーターガラ
クトシダーゼに関するプラスミドを1:99および1:9999で
含む。
種々のプラスミド混合物を別個のメラニン保有細胞の
組に電気的に流入させ、次に別個の組織培養プレートに
撒く。各皿は、一度10nMメラトニンで30分インキュベー
ションして処理され、次に写真的または例えばサイエン
ティフィックイメージングシステム（Scientific Imagi
ng System:Knoxville Tennessee）のようなコンピュー
タ制御画像システムを使用して自動的に走査される。
組に電気的に流入させ、次に別個の組織培養プレートに
撒く。各皿は、一度10nMメラトニンで30分インキュベー
ションして処理され、次に写真的または例えばサイエン
ティフィックイメージングシステム（Scientific Imagi
ng System:Knoxville Tennessee）のようなコンピュー
タ制御画像システムを使用して自動的に走査される。
次にボンベジンを加えてさらに30分後に、第二写真を
第一の物について二倍露光して取るか、または第二の別
個ビデオ画像を得る。
第一の物について二倍露光して取るか、または第二の別
個ビデオ画像を得る。
写真的方法を使用する場合は、結果は図８に見られる
もののようになり、ここで試験リガンドに反応する細胞
は赤く現れる。ビデオシステムを使用する場合には、第
一画像は第二から引かれる。この研究の図式的例は図14
により提供される。
もののようになり、ここで試験リガンドに反応する細胞
は赤く現れる。ビデオシステムを使用する場合には、第
一画像は第二から引かれる。この研究の図式的例は図14
により提供される。
図14aは、殆ど全てのベーターガラクトシダーゼに関
するプラスミドを含有するプラスミド混合物でトランス
フェクトし、次に数日後にメラトニンで処理した細胞の
仮説領域を示す。小さな点は凝集した色素をもつメラニ
ン保有細胞であり、一方大きいものはメラトニンには何
らかの理由で反応しない分散したメラノソームを持つ擬
似細胞によりつくられたバックグラウンドノイズを表
す。
するプラスミドを含有するプラスミド混合物でトランス
フェクトし、次に数日後にメラトニンで処理した細胞の
仮説領域を示す。小さな点は凝集した色素をもつメラニ
ン保有細胞であり、一方大きいものはメラトニンには何
らかの理由で反応しない分散したメラノソームを持つ擬
似細胞によりつくられたバックグラウンドノイズを表
す。
図14bはボンベジン添加後の細胞の同じ領域を表す。
画像は元の画像のネガティブである。図式14aおよび14b
の斜線の箱は、絵を整列させる目的で提供される。同様
なマーカーは現実の組織培養プレートの表面に置かれ、
コンピューターが領域を一致させることができるようよ
うにする。二つの絵を並べることによって、図14bには
裸眼またはコンピューターによってさらに一つの大きな
点を観察することが容易にできる。ボンベジン反応細胞
が同定された時、加えた薬剤を洗い流し、メラトニンお
よびボンベジン処理を繰り返し、そして写真およびビデ
オ法が再び同じ細胞を見いだすことにより再確認するこ
とができる。
画像は元の画像のネガティブである。図式14aおよび14b
の斜線の箱は、絵を整列させる目的で提供される。同様
なマーカーは現実の組織培養プレートの表面に置かれ、
コンピューターが領域を一致させることができるようよ
うにする。二つの絵を並べることによって、図14bには
裸眼またはコンピューターによってさらに一つの大きな
点を観察することが容易にできる。ボンベジン反応細胞
が同定された時、加えた薬剤を洗い流し、メラトニンお
よびボンベジン処理を繰り返し、そして写真およびビデ
オ法が再び同じ細胞を見いだすことにより再確認するこ
とができる。
上記のように設計された実験の実際の組からのデータ
は図15に表わされる。グラフから３つの点を作ることが
できる。第一且つ最も重要にはボンベジン受容体をコー
ドするプラスミドを少なくとも10,000倍に希釈して、な
おボンベジンに反応する色素細胞を見いだすことが可能
である。特に、ここで討論された具体的実施例では、ボ
ンベジン受容体をコードするプラスミドが10,000個のう
ち１個存在する時、ボンベジン受容体細胞の頻度は500
個のうちの１個であった。第二に、バックグラウンドノ
イズ、即ち、任意に与えられた30分の実験中に自発的に
色素を分散する細胞の分画は10,000個に１個であり真の
信号より20倍低い。第三に、実験を実施する時間中その
自然な色素分散をする10,000個のうち１個の細胞のバッ
クグラウンドノイズ上に見ることができる10,000倍に希
釈したプラスミドからの信号の理由は高希釈プラスミド
での曲線の形から理解できる。これは外来DNAを発現で
きる細胞は約100の異なるプラスミドを発現し、ただ１
つでは無いということを示している。これはGPCレセプ
ターをコードするプラスミドである時最高10,000個のcD
NAクローンが一回の実験操作でスクリーンできることを
意味すると思われる。
は図15に表わされる。グラフから３つの点を作ることが
できる。第一且つ最も重要にはボンベジン受容体をコー
ドするプラスミドを少なくとも10,000倍に希釈して、な
おボンベジンに反応する色素細胞を見いだすことが可能
である。特に、ここで討論された具体的実施例では、ボ
ンベジン受容体をコードするプラスミドが10,000個のう
ち１個存在する時、ボンベジン受容体細胞の頻度は500
個のうちの１個であった。第二に、バックグラウンドノ
イズ、即ち、任意に与えられた30分の実験中に自発的に
色素を分散する細胞の分画は10,000個に１個であり真の
信号より20倍低い。第三に、実験を実施する時間中その
自然な色素分散をする10,000個のうち１個の細胞のバッ
クグラウンドノイズ上に見ることができる10,000倍に希
釈したプラスミドからの信号の理由は高希釈プラスミド
での曲線の形から理解できる。これは外来DNAを発現で
きる細胞は約100の異なるプラスミドを発現し、ただ１
つでは無いということを示している。これはGPCレセプ
ターをコードするプラスミドである時最高10,000個のcD
NAクローンが一回の実験操作でスクリーンできることを
意味すると思われる。
GPC受容体をクローニングするためのアッセイ用色素
細胞を使用するために、幾つかの基本的考察が関連す
る。第一にcDNAライブラリーを、たとえばインビトロゲ
ン（Invitrogen）からのpcDNA1のような多くの任意の標
準真核発現プラスミド中に構築できる。第二に、ライブ
ラリーを作成するための組織または細胞の選択は目的の
GPC受容体を発現する任意のもので有り得る。第三に、c
DNAライブラリーからのクローンの種々の組でトランス
フェクトした細胞のさらなる組から集めた単純なデータ
により10,000クローン以上の多くをスクリーンできる。
細胞を使用するために、幾つかの基本的考察が関連す
る。第一にcDNAライブラリーを、たとえばインビトロゲ
ン（Invitrogen）からのpcDNA1のような多くの任意の標
準真核発現プラスミド中に構築できる。第二に、ライブ
ラリーを作成するための組織または細胞の選択は目的の
GPC受容体を発現する任意のもので有り得る。第三に、c
DNAライブラリーからのクローンの種々の組でトランス
フェクトした細胞のさらなる組から集めた単純なデータ
により10,000クローン以上の多くをスクリーンできる。
GPC受容体のクローンを単離するために、いくつかの
可能な方法を採用できる。ひとつの例は分画法である。
陽性信号が観察されたら、はじめに10,000クローンのプ
ールを生じた細菌性コロニーを例えば各1,000クローン
のようなより小さなプールに副分割する。これらを増殖
させ、プラスミドが単離されならびに各々の組が再試験
される。プールが陽性信号を与えた時、それを再び副分
割し、単一クローンが同定されるまでこの工程を繰り返
す。Ｇ−タンパク質に結合する受容体をクローンするた
めにプールスクリーニング法が使用できることはよく実
証されている（Julius,D.,MacDermott,A.B.,Axel,R.and
Jessell,T.M.（1988）；セロトニン1c受容体をコード
する機能性cDNAの分子特性決定;"Molecular Characteri
zation of a Functional cDNA encoding the Serotonin
1c Receptor;Science 241:5458−564）。
可能な方法を採用できる。ひとつの例は分画法である。
陽性信号が観察されたら、はじめに10,000クローンのプ
ールを生じた細菌性コロニーを例えば各1,000クローン
のようなより小さなプールに副分割する。これらを増殖
させ、プラスミドが単離されならびに各々の組が再試験
される。プールが陽性信号を与えた時、それを再び副分
割し、単一クローンが同定されるまでこの工程を繰り返
す。Ｇ−タンパク質に結合する受容体をクローンするた
めにプールスクリーニング法が使用できることはよく実
証されている（Julius,D.,MacDermott,A.B.,Axel,R.and
Jessell,T.M.（1988）；セロトニン1c受容体をコード
する機能性cDNAの分子特性決定;"Molecular Characteri
zation of a Functional cDNA encoding the Serotonin
1c Receptor;Science 241:5458−564）。
本明細書は説明のための実例により説明され限定では
なく、種々の改良および変更は本発明の精神を逸脱する
ことなくなされ得ることが理解されるであろう。
なく、種々の改良および変更は本発明の精神を逸脱する
ことなくなされ得ることが理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＧＥＮＥＲＡＬ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡ ＲＡＴＩＶＥ ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯ ＧＹ，Ｖｏｌ．70，ｐ．127−132 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．262，Ｎｏ．32，ｐ．15796 −15802 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．33，ｐ．133−139 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．41，ｐ．380−384 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/48 C12N 15/00 - 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】（ａ）PPGタンパク質をコードする外来性
の遺伝子を発現する、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類お
よび棘皮動物からなる群から選択される動物の色素被験
細胞を、PPGタンパク質を活性化させるかまたは阻害す
る化学物質と接触させ、結果として細胞内で色素を分散
させるかまたは凝集させること；そして （ｂ）細胞内での色素の局在にいずれかの変化をもたら
すことにより、化学物質がアゴニストかまたはアンタゴ
ニストかを決定すること、 を含む、PPGタンパク質に対するアゴニストまたはアン
タゴニストである化学物質を同定する方法。 - 【請求項２】工程（ａ）の前に、外来性PPGタンパク質
の活性化により色素の分散が誘導される場合には、被験
細胞中で色素の凝集を引き起こすために、または外来性
PPGタンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される
場合には、細胞中で色素の分散を引き起こすために、第
一の刺激物質を適用する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】工程（ｂ）において、アゴニストの存在を
示すような色素性状の変化を引き起こすかどうかを決定
することにより、化学物質がアゴニストかどうかを決定
する、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】外来性のクローンを発現せず、そして特定
の刺激物質に反応してその色素を分散しまたは凝集する
ことができるが、第一の刺激物質に対しては色素を分散
しまたは凝集することができない、対照細胞を用いるこ
とによる対照をさらに含み、そして色素性状における変
化が第一の刺激物質と接触するときに対照細胞中で引き
起こされることがない、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】化学物質との接触の後に細胞を観察して、
細胞の色素性状の状態が変化しないことを決定するこ
と、 外来性PPGタンパク質の活性化により色素の分散が誘導
される場合には、化学物質と接触させた被験細胞に対し
て、外来性PPGタンパク質の活性化による色素分散を誘
導することができる第二の刺激物質を添加するか、また
は外来性PPGタンパク質の活性化により色素の凝集が誘
導される場合には、外来性PPGタンパク質を活性化する
ことによる色素の凝集を誘導することができる第二の刺
激物質を添加すること、そして 第二の刺激物質が色素性状の変化を引き起こすかどうか
を決定し、変化がないことにより上記化学物質がアンタ
ゴニストであることの示唆を得ること、 により、工程（ｂ）において化学物質がアンタゴニスト
かどうかを決定する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】被験細胞に対して記載されているのと同一
の対照細胞を使用し、そして対照細胞は前記化学物質で
処理しない点以外は被験細胞に対して適用された条件と
同一の条件下で、対照細胞を使用することによる対照を
さらに含む、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載
の方法。 - 【請求項７】PPGタンパク質がGPC受容体である、請求項
１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】PPGタンパク質がセロトニン受容体であ
る、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】PPGタンパク質がMSH受容体である、請求項
２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】PPGタンパク質が、タンパク質キナーゼ
Ａ、タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホ
リパーゼA2またはＧタンパク質である、請求項１〜請求
項６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】下記の工程からなる、GPC受容体のクロ
ーニング方法： （ａ）爬虫類、両生類、魚類、甲殻類および棘皮動物か
らなる群から選択される動物由来であって、in vitroで
継続的に増殖をすることができる色素細胞に、外来性の
細胞表面受容体をコードする外来性の核酸クローンを導
入し； （ｂ）該細胞に、内在性の受容体を活性化することによ
り該細胞中の色素配置を初期状態にする刺激を与え； （ｃ）色素配置が初期状態になった上記細胞を、GPC受
容体を活性化する化学物質と接触させ、そして （ｄ）該化学物質との接触により色素配置がその初期状
態から変化した細胞を同定し、細胞の色素配置の変化を
GPC受容体をコードする外来性クローン発現の指標とす
る。 - 【請求項１２】PPGタンパク質をコードする外来性の遺
伝子を発現し、そして刺激物質を与えたときに細胞中で
色素を分散しまたは凝集することができる、爬虫類、両
生類、魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択
される動物の色素細胞。 - 【請求項１３】細胞がアフリカツメガエル（Xenopus la
evis）の黒色素胞である、請求項12に記載の細胞。 - 【請求項１４】PPGタンパク質がセロトニン受容体また
はMSH受容体であるか、またはタンパク質キナーゼＡ、
タンパク質キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパ
ーゼA2またはＧタンパク質である、請求項12または13に
記載の細胞。 - 【請求項１５】化学物質が外来性PPGタンパク質に対す
るアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかど
うかを決定するためのキットであって、 （ａ）外来性PPGタンパク質をコードする外来性クロー
ンを発現する、１またはそれ以上の、爬虫類、両生類、
魚類、甲殻類および棘皮動物からなる群から選択される
動物の色素被験動物； （ｂ）外来性PPGタンパク質の活性化により色素の分散
が誘導される場合には、外来性PPGタンパク質を活性化
することによる色素の凝集を誘導することができるか、
または外来性PPGタンパク質の活性化により色素の凝集
が誘導される場合には、外来性PPGタンパク質を活性化
することによる色素の分散を誘導することができる刺激
物質（例えば第一の刺激物質）；そして （ｃ）アンタゴニストのキットについては、外来性PPG
タンパク質の活性化により色素の分散が誘導される場合
には、外来性PPGタンパク質を活性化することによる色
素の分散を誘導することができるか、または外来性PPG
タンパク質の活性化により色素の凝集が誘導される場合
には、外来性PPGタンパク質を活性化することによる色
素凝集を誘導することができる、第二の刺激物質、 を１またはそれ以上のコンテナ中に含む、前記キット。 - 【請求項１６】（ａ）色素被験細胞がアフリカツメガエ
ルの黒色素胞であり； （ｂ）刺激物質（例えば第一の刺激物質）が、外来性PP
Gを活性化することにより色素の分散が誘導される場合
にはメラトニン、または外来性PPGタンパク質の活性化
により色素の凝集が誘導される場合にはメラニン細胞刺
激ホルモンまたはイソプロテレノールである、 請求項15に記載のキット。 - 【請求項１７】PPGタンパク質がGPC受容体である、請求
項12〜請求項14のいずれか一項に記載の細胞。 - 【請求項１８】PPGタンパク質がGPC受容体である、請求
項15または請求項16に記載のキット。 - 【請求項１９】外来性の核酸クローンが、プラスミドベ
クター中で作成したcDNAライブラリーより得たものであ
り、それがエレクトロポレーションにより色素細胞に導
入される、請求項11の方法。
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