JPH11510704A

JPH11510704A - 非内在性細胞シグナル受容体の異所性発現による細胞機能の調節

Info

Publication number: JPH11510704A
Application number: JP9509404A
Authority: JP
Inventors: ガーシェンゴーン，マービン・シー; ファルク−ペダーセン，エリック・エス; クリスタル，ロナルド・ジー
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-08-14
Filing date: 1996-08-12
Publication date: 1999-09-21
Also published as: AU716407B2; WO1997007233A1; AU6772196A; CA2229287A1; EP0845045A1; EP0845045A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞に内在していない細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換されたインビボ細胞を提供する。細胞シグナル受容体は細胞にとって内在性のシグナル形質導入受容体を活性化することができ、細胞シグナル受容体は調整的に活性化され、それによってシグナル形質導入経路を調整的に活性して、シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節する。本発明はまた、細胞における非内在性受容体を異所的に発現する方法、およびインビボ細胞機能を調節する方法を提供する。細胞機能調節方法は、細胞に内在しない細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換する方法、および非内在性細胞シグナル受容体を活性化し得る細胞外分子に細胞を調整的に接触せしめる方法を含む。細胞シグナル受容体の活性化は、内在性シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節するように、内在性シグナル形質導入経路を活性にする。

Description

【発明の詳細な説明】非内在性細胞シグナル受容体の異所性発現による細胞機能の調節本出願の主対象は米国政府の援助のもとになされた(国立衛生研究所認可番号ＲＯＩＤＫ４３０３６)。発明の分野本発明は、細胞機能のコントロールを得るために細胞における非内在性細胞シグナル受容体の発現に関し、特に細胞における内在性シグナル形質導入経路を利用する非内在性細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで細胞を形質転換することに関する。その場合、受容体はシグナル形質導入経路によってコントロールされる細胞機能を調節するために、調整的に活性化され得る。発明の背景本明細書には種々の公表文献が引用され、その多くはカッコ中に記載されている。これらの文献の書示事項は詳細な説明の最後に掲げられている。これらの公表文献の開示は、引用されることにより本明細書の一部とみなされる。細胞の様々な機能は、細胞がその環境にいかに応答するかによって、部分的には定義される。ある細胞が無数のシグナルにさらされると、細胞外調節分子に対する細胞応答の特異性がその細胞に存在する受容体の配置によって変調される( １−５)、細胞調節分子とその細胞シグナル受容体との相互作用は、１以上の細胞内シグナル形質導入経路の活性化をおこし、細胞に特異的な応答をなす。細胞反応の特異性は、受容体の特殊な結合特性およびシグナル形質導入カスケードの分子ターゲット下流の特異性によって決定される。同じ細胞において多数の異なる受容体が同一のシグナル形質導入経路を利用することができ、そして相異する受容体の活性化が時々類似の応答を誘発することがある（１−５）。特定のシグナル形質導入経路がコントロール下、または調節下に特殊な細胞／組織において活性化されると、疾患の表現型が訂正され得るか、少なくとも改善され得るような先天的および後天的なヒトの異常が多数存在する。このアプローチの一般的な適用は、疾患において過度に刺激されるプロセスを抑制するためか、または疾患によって阻害されている細胞応答を刺激するためのシグナルカスケードの活性化であろう。これらの場合、疾患の病因は特殊なシグナル経路に関連しない。疾患表現型は非内在性受容体により引きおこされる他の細胞応答によって克服されるのであろう。このアプローチの特殊な適用は、細胞外調節分子またはその特殊な受容体に関連する異常性による２次的な様々な機能の調節喪失が存在する混乱においてである。これらの場合、非内在性受容体は、疾患により壊されているシグナル経路を引き起こすのに用いられる。発明の概要本発明の目的は、病的または正常な細胞／組織の機能を調節する方法を提供することであり、この方法は、その細胞／組織または他の細胞／組織において病的な表現型に打ち勝つか、または改善するであろう応答を細胞／組織において産生する。特に、本発明は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡで形質転換されたインビボ細胞を提供する。細胞シグナル受容体は細胞にとって内在性のシグナル形質導入受容体を活性化することができ、細胞シグナル受容体は調整的に活性化され、それによってシグナル形質導入経路を調整的に活性して、シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節する。本発明はまた、細胞における非内在性受容体を異所的に発現する方法を提供する。この方法は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡでの形質転換のための細胞を選択することを含む。細胞シグナル受容体は細胞に内在するシグナル形質導入経路を活性化できる。次いで、細胞は細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換され、そしてＤＮＡは発現され、それによって細胞において細胞シグナル受容体を異所的に発現する。本発明はインビボ細胞機能を調節する方法を提供する。この方法は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡでの形質転換のための細胞を選択することを含む。細胞シグナル受容体は細胞に内在するシグナル形質導入経路を活性化できる。次いで、細胞は細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換され、そしてＤＮＡは発現され、それによって細胞において細胞シグナル受容体を異所的に発現する。次いで、インビボ細胞は非内在性細胞シグナル受容体を活性化し得る細胞外分子に調整的に接触され、そこで細胞シグナル受容体の活性化が、内在性シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節するように、内在性シグナル形質導入経路を活性にする。このように本発明は、特定の細胞機能を正常にコントロールしない細胞内分子を用いて細胞機能をコントロールするための方法を提供する。内在性細胞受容体の脱感作あるいは内在性細胞受容体の欠失または変異による細胞機能の様々な機能異常が、本発明の組成物および方法を用いることで、克服される。図面の簡単な説明本発明の上記および他の特徴や利点は、次の添付図面と共に、下記の望ましい実施態様についての詳細な説明を読むことにより明らかになるであろう。図１は、マウスＴＲＨ−Ｒ cＤＮＡプローブ(１−６欄)またはヒトγ−アクチンcＤＮＡプローブ(７−１２欄)を用いての、アデノウイルスベクターとのインキュベート後のインビトロ１次肝細胞からのＲＮＡについてのノーザン解析である。図２は、ＴＲＨ−Ｒ cＤＮＡのアデノウイルス仲介インビトロ転移後のメチルチロトロピン放出ホルモンの肝細胞への結合を表わす。図３は、ＴＲＨ−Ｒ cＤＮＡのアデノウイルス仲介インビトロ転移後の肝細胞におけるイノシトールホスフェート形成のＴＲＨ刺激を表わす。図４は、マウスがインビボでＡdＣＭＶ・βgalベクター(１欄)またはＡdＣＭＶ・mＴＲＨ−Ｒベクター（２欄）を受け入れた後のマウスＴＲＨ−Ｒ cDＮＡプローブを有する肝ＲＮＡのノーザン解析である。図５は、マウスがインビボでＡdＣＭＶ・βgalベクター(３欄)またはＡdＣＭＶ・mＴＲＨ−Ｒベクター（４欄）を受け入れた後のγ−アクチンcＤＮＡプローブを有する肝ＲＮＡのノーザン解析である。図６は、インビボＴＲＨ−Ｒ cＤＮＡのアデノウイルス仲介転移後のメチルチロトロピン放出ホルモンのラットから誘導される１次肝細胞への結合を表わす。図７は、インビボＴＲＨ−Ｒ cＤＮＡのアデノウイルス仲介転移後のイノシトールホスフェート形成のラットから誘導される１次肝細胞へのＴＲＨ刺激を表わす。図８は、ＴＲＨによる血清グルコースの変調を表わす。図９は、血清グルコース値の平均変化を表わす。詳細な説明本発明は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡで形質転換されたインビボ細胞を提供する。細胞シグナル受容体は細胞にとって内在性のシグナル形質導入受容体を活性化することができ、細胞シグナル受容体は調整的に活性化され、それによってシグナル形質導入経路を調整的に活性して、シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節する。本発明はまた、細胞における非内在性受容体を異所的に発現する方法を提供する。この方法は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡでの形質転換のための細胞を選択することを含む。細胞シグナル受容体は細胞に内在するシグナル形質導入経路を活性化できる。次いで、細胞は細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換され、そしてＤＮＡは発現され、それによって細胞において細胞シグナル受容体を異所的に発現する。本発明はインビボ細胞機能を調節する方法を提供する。この方法は、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡでの形質転換のための細胞を選択することを含む。細胞シグナル受容体は細胞に内在するシグナル形質導入経路を活性化できる。次いで、細胞は細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換され、そしてＤＮＡは発現され、それによって細胞において細胞シグナル受容体を異所的に発現する。次いで、インビボ細胞は非内在性細胞シグナル受容体を活性化し得る細胞外分子に調整的にさらされ、そこで細胞シグナル受容体の活性化が、内在性シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節するように、内在性シグナル形質導入経路を活性にする。形質転換されるインビボ細胞は、細胞機能をコントロールしたい適当な細胞である。コントロールは、細胞シグナル受容体（この細胞に内在していない）をコードするＤＮＡで細胞を形質転換し、そして非内在性受容体を細胞の内在性シグナル形質導入経路に利用せしめることにより達成される。シグナル形質導入経路により影響される細胞機能は、非内在性受容体の活性化をコントロールすることにより(すなわち非内在性受容体のその細胞外シグナル分子に対する、コントロールされた接触により)コントロールされ得る。本発明の主題は、本発明で利用し得る種々の受容体およびシグナル形質導入経路について説明することにより、よく理解される。高等動物における細胞は何百種類もの細胞外シグナル分子によって正常に連絡し合っている。この分子には、タンパク質、小ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド、ステロイド、レチノイド、脂肪酸誘導体、さらに酸化窒素および一酸化炭素などの溶存気体も含まれる。これらのシグナル分子は他の細胞(“ターゲット細胞”)に、一般的に細胞機能に影響を与えながら、“シグナル”を取り継ぐ。本発明により、このような細胞外シグナル分子はインビボ細胞に調整的に投与すなわち提供される。インビボ細胞は、細胞により発現された非内在性受容体を通して細胞外シグナル分子を細胞が認識するように、形質転換される。非内在性受容体は、細胞外シグナル分子に特異的であって結合し、非内在性受容体の存在が、この非存在では認識できないであろう細胞外シグナル分子をインビボ細胞が認識するのを可能とする。次いで細胞外シグナル分子との非内在性受容体の結合が形質転換細胞における応答を開始する。本明細書では、細胞外シグナル分子についてのこれらの受容体を総括的に“細胞シグナル受容体”と称する。多くの細胞シグナル受容体は、形質転換細胞表面での透過膜タンパク質である。これらが細胞外シグナル分子(リガンド)に結合しすると、細胞の行動を変化せしめる細胞内シグナルのカスケードを生むように活性化される。本明細書ではこれらの受容体を総括的に“細胞表面シグナル受容体”と称する。ある場合には受容体は形質転換細胞の内部にあり、それを活性化するためにシグナルリガンドが細胞内に入れねばならない。従って、これらのシグナル分子は、細胞の細胞質膜を通過するのに充分小さく、かつ疎水性でなければならない。本明細書ではこれらの受容体を総括的に“細胞内細胞シグナル受容体”と称する。細胞表面シグナル受容体は、用いられる形質導入メカニズムにより、一般に３類がある。イオンチャネル連結受容体、グアニンヌクレオチド結合タンパク質連結受容体および酵素連結受容体である。イオンチャネル連結受容体は、伝達物質ゲート・イオンチャネルとしても知られ、電気的に興奮する細胞間の高速シナップシグナルに関与する。この型のシグナルは、神経伝達物質が結合する受容体タンパク質によって形成されるイオンチャネルを、一時的に開閉する伝達物質として知られる少数の細胞外シグナル分子によって仲介される。イオンチャネル連結受容体は、相同の多パス透過膜タンパク質に属し、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびクロライド・イオンのイオンチャネルを含む。イオンチャネルは継続的には開いていない。その代わり、短時間開き、再び閉じる“ゲート”を有している。多くの場合、ゲートは、リガンドの結合（リガンドゲートチャネル）などの特異な刺激に対する応答で開く。リガンドは、細胞外シグナル分子、特殊的には神経伝達物質（伝達物質ゲート・チャネル）か、イオン（イオン−ゲート・チャネル）またはヌクレオチド(ヌクレオチド−ゲート・チャネル)などの細胞内分子かのいずれかである。細胞表面シグナル受容体タンパク質の第２類はグアニンヌクレオチド結合タンパク質連結受容体である。この受容体はＧタンパク質連結受容体としても知られている。この受容体は分離細胞質−膜結合ターゲットタンパク質(酵素またはイオンチャネルであり得る)の活性を調節するために間接的に作用する。受容体とターゲットタンパク質との相互作用は、トリメリックＧＴＰ結合・調節タンパク質(Ｇタンパク質)と呼ばれる第３のタンパク質によって仲介される。ターゲットタンパク質の活性化は、１以上の細胞内仲介物の濃度を変えるか(ターゲットタンパク質が酵素であれば)、あるいは細胞質膜の透過性を変えるか(ターゲットタンパク質がイオンチャネルであれば)である。細胞内メディエーターは細胞内の他のタンパク質の行動を変えるように順番に働く。すべてのＧタンパク質連結受容体は、相同の７−パス透過膜タンパク質の上位ファミリーに属している。Ｇタンパク質連結受容体は細胞表面受容体で最も大きいファミリーである。哺乳動物ですでに１００以上のものが定義されている。Ｇタンパク質連結受容体は、非常に大きい多種性のシグナル分子に対する細胞応答を仲介する。その分子には、ホルモン、神経伝達物質および局所メディエーターがあり、これらは作用も構造も相違している。さらにタンパク質、小ペプチド、アミノ酸、脂肪酸誘導体も含まれる。同じリガンドが多くの相違するファミリー受容体を活性にできる。少なくとも９種のＧタンパク質連結受容体がアドレナリンで活性され、他の５以上がアセチルコリンで、少なくとも１５がセロトニンで活性化される。Ｇタンパク質連結受容体には、例えばα−アドレナリン性受容体、β−アドレナリン性受容体、ドパミン性受容体、セロトニン性受容体、ムスカリン性コリン様受容体、ペプチド作用性受容体およびチロトロピン放出ホルモン受容体が含まれる。大部分のＧタンパク質連結受容体は、１以上の小さい細胞内シグナル分子の濃度を変える鎖を活性化する。これらの小分子は、しばしば細胞内メディエーターと称せられ（細胞内メッセンジャーあるいは第２メッセンジャーとも言う）、選択した細胞タンパク質の行動を変えることによってシグナルを順次伝える。最も広く用いられている細胞内メディエーターの２つは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）およびＣａ²⁺である。濃度の変化はほとんどの動物細胞において明白な経路によって刺激される。大部分のＧタンパク質連絡受容体がその１またはいくつかを調節する。細胞表面受容体タンパク質の第３類は、酵素連結受容体であって、活性化されると、酵素として直接的に、または酵素に関連して機能する。大部分はシングル・パス透過膜タンパク質で、細胞の外側にリガンド結合部位と内側に触媒的部位を有する。他の２つの類と比較すると、酵素連結受容体は、大部分はタンパク質キナーゼであり、またはタンパク質キナーゼに関係しているが不均質で、ターゲット細胞におけるタンパク質の特異的部分はリン酸エステル化されている。酵素連結受容体には５クラスが知られている。（１）透過膜グアニリルシクラーゼで、サイクリックＧＭＰを直接的に生成する。（２）受容体チロシン・ホスファターゼで、特異的タンパク質のホスホチロシン側鎖からホスフェートを除去する、（３）透過膜受容体セリン／スレオニンキナーゼで、これはターゲットタンパク質上でセリンおよびスレオニンの側鎖にホスフェート基を加える；(４)受容体チロシンキナーゼ；および(５)チロシン−キナーゼ関連受容体。後２種の受容体ははるかに数が多く、同様に働くものと考えられている。リガンド結合は受容体が二量体化するのを常に誘発し、それは受容体またはその関連非受容体チロシンキナーゼのキナーゼ活性を活性化する。受容体チロシンキナーゼは多チロシン残基上で自体を相互−リン酸エステル化し、それは細胞内シグナルタンパク質の小さい組のためのドッキング部位として働く。このように、多タンパク質シグナル複合体はシグナルが細胞内部に拡がることから活性化される。これらの多数の型の細胞表面シグナル受容体に加えて、細胞シグナル化は細胞内細胞シグナル受容体を通して達成される。上記したように、これらの受容体はターゲット細胞内に存し、シグナルリガンドは受容体を活性化するために細胞に入らなければならない。ステロイドホルモン、チロイドホルモン、レチノイドおよびビタミンＤは、化学構造および機能の両方において非常に相違している小さい疎水性分子の例である。それにもかかわらず、これらはすべて同様のメカニズムによって作用する。これらはターゲット細胞の細胞質膜にそって直接的に拡散し、細胞内細胞シグナル受容体に結合する。リガンド結合は受容体を活性化し、次いで特殊な遺伝子の転写を調節する。これらの受容体は構造的に関連し、細胞内受容体の上位ファミリー(すなわちステロイドホルモン受容体上位ファミリー) を形成する。ステロイドホルモン受容体には、プロジェステロン受容体、エストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体が含まれる。甲状腺ホルモン受容体には、甲状腺刺激ホルモン受容体が含まれる。レチノイド受容体には、レチノ酸の受容体が含まれる。本発明の主題に従い、細胞は、細胞に内在しないこれら細胞シグナル受容体( 細胞表面シグナル受容体または細胞内細胞シグナル受容体であり得る)の１以上をコードするＤＮＡで形質転換される。非内在性受容体は細胞に内在しないシグナル形質導入経路を活性化し得る。本明細書で用いる“非内在性”受容体は、特定の細胞内／上(相互変換的に本明細書で用いる)に通常は存在しない受容体である。従って、選択した生物体の他の細胞内／上に受容体が存在するけれども、受容体は形質転換された細胞に非内在性であり得る。例えば、心臓筋肉組織にのみ存在する受容体は、肝細胞においては“非内在性”受容体である。他方、本明細書で用いる“内在性”経路は形質転換細胞に正常に存在するシグナル形質導入経路を意味する。同様に、ここで用いる“異所性”発現は、受容体が正常に存在していない特定の細胞内／中における受容体の発現を意味する。他方“ユートピック”発現は、受容体が正常に存在している特定の組織内／上における受容体の発現である。非内在性受容体をコードするＤＮＡは形質転換細胞における内在性シグナル形質導入経路を活性化し得る。シグナル形質導入経路は多数あり、例えばアデニレート・シクラーゼ経路、グアニレート・シクラーゼ経路、ホスホイノシトール代謝回転経路、チロシンキナーゼ経路、イオンチャネル経路およびカルシウムイオン経路を含む。細胞内シグナル分子の細胞シグナル受容体への結合によってつくられる開始シグナルは、多様で相互作用的であるシグナル形質導入経路を通して細胞内的に形質導入される。シグナル形質導入経路は、cＡＭＰ、cＧＭＰ、アラキドン酸、イノシトール１ ,４,５−トリホスフェート(ＩＰ₃)、Ｃa²⁺および第２メッセンジャーとしての他のイオンを含み、酵素(アデニレートおよびグアニレートシクラーゼならびにホスホリパーゼＡ₂およびＣなど)およびイオンチャネルによってつくられる。多くの場合、細胞外分子−受容体複合体はこれらの作用体と直接的に連動せず、中間的仲介シグナル形質導入体、しばしばＧタンパク質を通して作用する。 cＡＭＰは原型的第２メッセンジャーである。cＡＭＰの細胞内レベルは主にリガンド−受容体相互作用により決定される。この生理的事項は細胞質膜の近くに位置する３種の細胞成分の相互作用である。それらは、リガンド受容体、シグナル形質導入体(Ｇタンパク質)および作用体酵素(アデニレートシクラーゼ)である。サイクリックＡＭＰは、エピネフィリン、グルカゴン、ノルエピネフィリン、パラチロイド、黄体化ホルモンならびにチロイド刺激およびメラノサイト刺激ホルモンを含む多くのホルモンの第２メッセンジャーである。サイクリックＡＭＰは広範な細胞プロセスに作用する。すなわち脂肪分解の増化、グリコーゲン分解、糖新生、ケトン体生成、上皮のイオン透過性、腎でのレニン産生、心筋収縮、胃粘膜でのＨＣl分泌、耳下腺によるアミラーゼ放出、メラニン・グラニュールの拡散および膵臓によるインスリン放出、血小板凝固の低下および組織培養における腫瘍細胞の生育である。アデニルシクラーゼの活性化は細胞内でのサイクリックＡＭＰ量を増加せしめる。次いでサイクリックＡＭＰはタンパク質キナーゼを活性にし、１以上のタンパク質をリン酸エステル化する。例えば、筋肉および肝におけるグリコーゲン・シンセターゼおよびホスホリラーゼ・キナーゼのリン酸エステル化は、グリコーゲンの合成を低下し、分解を高める。表１に用いられる経路に従って種々のホルモン受容体と作用体を分類した。いくつかの受容体は内因性ホルモン活性化チロシンキナーゼ活性を含む。グアニレートシクラーゼは、アデニレートシクラーゼと同様に、ＧＴＰからの cＧＭＰの形成に触媒として働く。しかしグアニレートシクラーゼは、可溶および膜関連形態の両方で細胞中に存在する。膜関連形態はホルモンおよび他のリガンドで調節される。チロシンキナーゼのように、そしてアデニレートシクラーゼのようにではなく、グアニレートシクラーゼは受容体および作用体の機能に直接的に働き得る。多くのホルモンおよびリガンドは、カルシウムイオンおよび第２メッセンジャーとしのＤＡＧを通して細胞作用を仲介する。第２メッセンジャーは、カルシウム結合−調節タンパク質(例えばカルモデュリン)により調節されるタンパク質キナーゼの活性を変調し、そしてＤＡＧはタンパク質キナーゼＣを活性化する。これらの酵素は特殊な細胞内タンパク質をリン酸エステル化し、さらにホルモン作用をもたらす。特殊な組織におけるこのシグナル系を利用するホルモンの例としては、α−１−アドレナリンおよびムスカリンコリン性剤、バゾプレッシン、ヒスタミン、コレシストキニン、ＬＨＲＨ、チロトロピン放出ホルモン、アンギオテンシンIIおよびオキシトシンがある。一般的に、ホスホイノシチド代謝回転を刺激する種々のホルモンリガンドは、アデニレートシクラーゼについて記載したように、Ｇタンパク質を活性化する受容体と相互作用する。これらの活性化Ｇタンパク質はホスホリパーゼＣ活性の刺激にカップルする。利用された経路に従い、多くの異なる細胞機能がそれらの種々の経路によってコントロールされる。多数のホルモン誘発細胞応答がサイクリックＡＭＰにより仲介される。それには、甲状腺において甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）が甲状腺ホルモン合成および分泌の誘発する;副腎皮質において副腎皮質刺激ホルモンが皮質分泌を誘発する;卵巣において黄体ホルモン(ＬＨ)がプロゲステロ分泌を誘発する;筋肉においてアドレナリンがグリコーゲン分解を誘発する;骨においてパラトホルモンが骨吸収を誘発する;心臓においてアドレナリンが心博の増加と収縮の強化をなす;肝においてグルカゴンがグリコーゲンの分解を誘発する。腎臓においてバゾプレッシンが水吸収を誘発する;脂肪においてアドレナリン、ＡＣＴＨグリカゴンおよびＴＳＨがトリグリセライド分解を誘発する。多数の細胞応答がイノシトールホスホリピドシグナル経路にカップルしたＧタンパク質連結受容体によって仲介される。それには、肝臓においてシグナル分子バゾプレシンがグリコーゲン分解を誘発する;膵臓においてシグナル分子アセチルコリンがアミラーゼ分泌を誘発する;平滑筋においてシグナル分子アセチルコリンが収縮を誘発する;マスト細胞においてシグナル分子として抗原がヒスタミン分泌を誘発するのに機能する;血小板においてシグナル分子トロンビンが凝固を誘発することを含む。これらの種々の細胞機能は、１以上の内在性シグナル形質導入経路を活性化できる非内在性細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで細胞を形質転換することによりコントロールされ得る。細胞シグナルの一般的事項については引用文献を参照(３７−４２)。非内在性受容体および内在性シグナル形質導入経路を選択することに加えて、細胞を形質転換する方法も選択されねばならない。種々の方法が知られている。第一の方法の一つはミクロインジェクションで、細いガラス針を通して細胞核中に直接、ＤＮＡが注入される。これは細胞当りでは効率的な方法である。すなわち、注入された細胞の多くがＤＮＡを取得するが、１実験で数百細胞しか注入し得ない。ＤＮＡを細胞に大量に導入する初期の方法は、陽電位の化学基(ＤＥＡＥ、ジメチルアミノエチルについて)をカップルさせておいた不活性カルボキシレート・ポリマー(デキストラン)でＤＮＡをインキュベートすることであった。ＤＮＡは陰電位のホスフェート基を通してＤＥＡＥ−デキストランに接着する。一方、大きいＤＮＡ含有粒子は、細胞表面に接着し、エンドサイト−シスとして知られる過程によって細胞に取りこまれると考えられている。いくつかのＤＮＡは細胞質における分解を免がれ、核にのがれて、そこで細胞中の他の遺伝子と同様にＲＮＡに転写される。ＤＥＡＥ−デキストラン法は、比較的簡単であるが、多くの型の細胞にとって非常に効率が悪く、精製ＤＮＡ製造の生物活性を日常的に検定する方法としては信頼できるものでなかった。その後に哺乳動物細胞の研究者にとって遺伝子移転を日常的なものにした画期的なことは、細胞がＤＮＡをメルシウムホスフェートとの沈澱の形態で効率的に取りこむことの発見であった。この新しい方法において、ウイルスＤＮＡでトラスフェクトされた細胞からのウイルスの収量はＤＥＡＥ−デストラン法より１００倍も大きかった。組換えＤＮＡ分子を有する細胞を同定するために、生物マーカーが用いられる。微生物において、それは一般的な薬剤耐性遺伝子である。薬剤耐性は、クローンＤＮＡを取りこんだ細菌を、取りこんでない細菌の非常に数の大きい集団から選択するのに用いられる。ウイルス遺伝子を含む哺乳動物遺伝子転移の初期の実験では、外因性ＤＮＡの細胞への転移はＤＮＡが生物活性を有することで検出され、これはトランスフェクトされた細胞の生長特性における感染ウイルスの産生または安定的変化をもたらした。次いでＤＮＡ腫瘍ウイルス、単純ヘルペスウイルス (ＨＳＶ)が酵素チミジンキナーゼをコードする遺伝子(tk遺伝子)を含むことが発見された。ＨＳＶtk遺伝子は、細菌における薬剤耐性遺伝子の作用と同じように、哺乳動物における選択され得る遺伝子マーカーとして用いられ、いかなるＤＮＡをも取りこんでいない大集団から稀トランスフェクト細胞を生育するのを可能とする。細胞は選択的生有培地に移され、そこでは機能的tk遺伝子(および望む移転ＤＮＡ)を取りこんだ細胞のみが生長できる。種々の優越的な選択マーカーが現在、知られている。それには：アミノグリコシド、ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)、タンパク質合成を阻害する選択のための薬剤Ｇ４１８を用いる;ＡＰＨインアクチベータＧ４１８; ジヒドロフォレート・リダクターゼ(ＤＨＦＲ):Ｍtx−耐性変種;ＤＨＦＲを阻害する選択のための薬剤メトトレキセート(Ｍtx)を用いる;変種ＤＨＦＲはＭtx に耐性である; ヒグロマイシン−β−ホスホトランスフェラーゼ(ＨＰＨ)、タンパク質合成を阻害する薬剤ヒグロマイシン−βを用いる;ＨＰＨインアクチベーターヒグロマイシンβ; チミジンキナーゼ(ＴＫ)、ノボプリンおよびチミジレート合成を阻害する薬剤アミノプテリンを用いる;ＴＫはチミジレートを合成する; キサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)、ノボＧＭＰ合成を阻害する薬剤ミコフェノール酸を用いる;ＸＧＰＲＴはキサンチンからＧＭＰを合成する; アデノシンデアミラーゼ(ＡＤＡ)、ＤＮＡに障害を与える薬剤９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニン(Ｘyl−Ａ)を用いる;ＡＤＡはＸyl−Ａを不活性する。遺伝子増幅もトランスフェクト遺伝子の発現の高いレベルを得るために利用される。細胞培養をＭtx、必須の代謝酵素の阻害剤、ＤＨＦＲで処理すると、ほとんどの細胞は死滅するが、最後にある種のＭtx耐性細胞が生育する。細胞中で発現されるべき遺伝子は、クローン化dhfr遺伝子でコントランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は低濃度のＭtxでの選択に供せられる。dhfr遺伝子( および多くの場合、コントランスフェクト遺伝子)を取り込んだ耐性細胞が増殖する。徐々に生有培地でのＭtx濃度を増加すると、連結ＤＮＡと共に進行的にdhfr 遺伝子を増幅した細胞集団が生成する。このプロセスに数カ月かかるが、最も高濃度のＭtxで生有し得る細胞培養は、１００倍以上にdhfr遺伝子を含有のＤＮＡを安定的に増幅し、コントランスフェクト遺伝子の発現を顕著に上昇する。カルシウムホスフェート共沈澱はＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するのに最も広く用いられている方法であるが、ある細胞においては役立たない。懸濁液中で生有するリンパ球などの細胞はカルシウムホスフェート共沈澱によるトランスフェクトに特に耐性である。他の方法、エレクトロポレーションにおいて、細胞はＤＮＡ含有の溶液に入れられて、一時的に膜に穴を開ける短い電気博動にかけられる。ＤＮＡはその穴を通って直接に細胞質に入り、ＤＥＡＥ−デキストランおよびカルシウムホスフェート法においてＤＮＡが通るエンドサイトテック小胞(小胞を通る経路は時にＤＮＡを破壊したり、傷つけたりする)をバイパスとする。ＤＮＡは人工的なリピド小胞、リポソームに合体されて細胞膜に融合して、その内容物を直接に細胞質に運ぶ。ミクロインジェクションは、ＤＮＡを細胞に入れる最も確実な方法であり、コンピュータ付の機器で現在実施され、１実験で注入できる細胞の数は１０倍以上となった。より直接なアプローチにおいて、植物の細胞および組織に最初に用いると、ＤＮＡはタングステンミクロ放射体の表面に吸収されて、ショットガンのような器具で細胞中に打ちこまれる。これらの方法のいくつか、ミクロインジェクション、エレクトロポレーションおよびリポソーム溶融は、タンパク質を細胞中に導入するのに用いられている。総説としては、引用文献(４７−５０)を参照のこと。トランスフェクションにより導入された裸のＤＮＡは培養基において細胞の半分まで一時的に発現されるが、よりしばしば一時的にトランスフェクトされた細胞の部分は非常に低い。実際、ある種の細胞は、上記の人的方法によるトランスフェクションに対してほとんど完全に対応しない。組換えＤＮＡ技術の多くの適用が外遺伝子(すなわち非内在性受容体)の反抗的なタイプの細胞への導入するを必要としている。可能性の大きい遺伝子治療は、例えば遺伝子を正常なヒト細胞に転移する効率的な手段を必要としている。この問題を解決するために、研究者達の目はウイルスにもどっている。ウイルスの生長はウイルスゲノムを細胞に入れる能力に依存しており、ウイルスはそれをなすための賢く効率的な方法を創造してきた。最も初期のウイルスベクターは、サル腫瘍ウイルスＳＶ４０に基づくもので、外部遺伝子でウイルス遺伝子を簡単に置きかえることができた。これらの組換分子は、細菌プラスミドとしてつくられ、失なわれているウイルス遺伝子を満たす第２プラスミドでサル細胞中にトランスフェクトされた。細胞内部では、２つのプラスミドからのつくられたウイルス遺伝子産物がプラスミドとパッケイジの両方をウイルス粒子中に複製するために共同作業をする。細胞から出てくるウイルスストックは２ウイルスの混合物であり、その各々は欠損ウイルス(すなわち、自分自体を複製できない、それに要するウイルス遺伝子を欠いている)である。しかし、このウイルスストックは新しい細胞の感染に用いられて、受容体細胞における外部遺伝子を効率的に導入および発現する。ＤＮＡを細胞中にトランスフェクトするのに用いるハイブリド方法および内部でそれを複製するためのウイルスタンパク質がクローン遺伝子からタンパク質の高レベル産生のために普通に用いられる。この手法は、ＳＶ４０ゲノムの安定な組み込み部分を有する細胞系、ＣＯＳ細胞を用いる。これらの細胞はウイルスＴ抗原タンパク質を産生し、これは、複製源と名付けられるＤＮＡ配列と結合することでウイルスＤＮＡの複製を開始する。発現されるべき外部遺伝子は複製ＳＶ４０源を有するプラスミドにクローンされる。ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション後、プラスミドは、外部遺伝子の発現レベルを増加して、非常な多数に複製される。ＳＶ４０を基とするウイルスベクターの使用はいくつかの理由により利用が限定される。それは、ベクターがサル細胞にしか感染しない、挿入できる外部遺伝子のサイズが小さい、およびゲノムがしばしば再編または消失することである。他のウイルスベクターが現在は普通に用いられる。その理由は、広範な細胞に感染することおよび広範な外部遺伝子を受け入れることによる。ワクシニアウイルスは、細胞質中で完全に複製する大きいＤＮＡ含有ウィルスである。初期に、ワクシニアウイルスは外部遺伝子をウイルスゲノムの非必須的領域に直接的組み入れた。組み換えウイルスは生育でき、感染時に隣接のウイルスプロモーターから外部遺伝子を転写する。ウイルスゲノムが大きいので(１８５,０００bp)、外部遺伝子はワクシニアに標準的な組換え方法では挿入できない。その代りに、細胞内部での組換えがなされねばならず、厄介で長くかかる手法である。さらに用途の広いワクシニア発現系がバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを発現するレディメイド組換体を利用する。発現されるべき遺伝子はバクテリオファージ、プロモーターを有するプラスミド中に簡単にクローン化される。プラスミドは、ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスで前に感染された細胞中にトランスフェクトされる。プラスミド上の遺伝子はバクテリオファージ・ポリメラーゼによって効率的に転写され、細胞中のＲＮＡの３０％にまでなる。ワクシニアウイルス感染の他の特徴は、ウイルスmＲＮＡ(およびプラスミドからのmＲＮＡ) がタンパク質に優先的に翻訳されるように、ウイルスが宿主細胞タンパク質合成をしめ出すことである。タンパク質産生に広く用いられている他のウイルスは昆虫ウイルスのバキュロウイルスである。バキュロウイルスは、感染中にその構造タンパク質の一つ(コートタンパク質)を非常に高いレベルで産生することから、研究者達の注目を集めた。外部遺伝子がこのウイルス遺伝子に代るときは、高レベルで産生されなければならない。バキュロウイルスは、ワクシニアのように非常に大きく、従って外部遺伝子は組換えによりウイルスゲノムに置かれねばならない。バキュロウイルスにおいて外部遺伝子を発現するために、少量のウイルスゲノムを有するプラスミドにおいてウイルスコートタンパク質遺伝子に代えて、望む遺伝子をクローンする。組換えプラスミドは野生型バキュロウイルスＤＮＡで昆虫細胞中にコトランスフェクトする。低い頻度で、プラスミドとウイルスＤＮＡは均一配列を通して組み換わり、外部遺伝子のウイルスゲノムへの挿入をもたらす。ウイルスプラークが生育し、組換えウイルス含有プラクはコートタンパク質を欠くので、相違してみえる。組換えウイルス含有プラクは取り出され、次いで拡大される。このウイルスストックは昆虫細胞の新しい培養組織を感染するのに用いられ、外部タンパク質の高発現をもたらす。バキュロウイルスベクターについての総説は引用文献を参照(５１)。上記のウイルスはすべて細胞溶解性ウイルスであり、細胞に入り、転換し、大量に複製し、とり出され、プロセス中に細胞を殺す。これらのベクターは遺伝子を細胞中に安定な状態で導入するのに用いることはできない。これはレトロウイルスで最もなされる。レトロウイルスは、細胞溶解性ウイルスとはまったく異なるライフサイクルを有するＲＮＡウイルスである。細胞に感染すると、そのＲＮＡゲノムがＤＮＡ形態に転換される(ウイルス逆転写酵素により)。ウイルスＤＮＡは効率的に宿主ゲノムに組み込まれ、そこに住みついて、各細胞分裂時に宿主ＤＮＡと共に複製される。この組み込まれたプロウイルスは、(長末端反復すなわちＬＴＲと呼ばれる配列において)ゲノムの末端に位置する強力なプロモータからウイルスＲＮＡを着実に産生する。このウイルスＲＮＡは、ウイルスタンパク質の産生のためのmＲＮＡとして、および新ウイルスのゲノムＲＮＡとしての両方に働く。ウイルスは細胞膜に集まり、通常細胞の健康にほとんど作用しないでそこから発育する。このように、レトロウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムの永久的部分となり、レトロウイルスに入れられた外部遺伝子は細胞内で永続的に発現する。このように、レトロウイルスは細胞中で永久的に外部遺伝子を発現できるので魅力的なベクターである。さらにレトロウイルスは哺乳動物細胞のすべての型に実際上感染し得るので例外的に広範な働きをする。その用途の広さからレトロウイルスは遺伝子治療に選択されるベクターでもある。レトロウイルスベクターの設計および利用において、ベクターは発現すべき外部遺伝子と共に選択できるマーカーを常に含有している。大部分のウイルスの構造的遺伝子はgoneであり、これらのベクターはそれ自体にウイルスとして複製しない。ウイルスストックをつくるために、クローン化プロウイルスＤＮＡは封入細胞中にトランスフェクトされる。これらの細胞はすべての不活性遺伝子で組みこまれたプロウイルスを含有するが、封入機器で認識される発現を欠く。封入プロウイルスは、ウイルスＲＮＡを感染ウイルス粒子に封入するのに要するすべてのタンパク質を産生するが、それ自体のＲＮＡを封入することができない。代りに、トラスフェクトウイルスから転写されたＲＮＡは、感染ウイルス粒子中に封入されて細胞から放出される。得たウイルスストックは、野生型複製能ウイルスを欠くことからヘルパーフリーと称せられる。このウイルスストックはターゲット細胞培養を感染さすのに用いられる。組換えゲノムは効率的に導入されて、ＤＮＡに逆転写され(封入細胞によってウイルス中に置かれた逆転写酵素により)、次いでゲノム中に組み入れられる。こうして、細胞は新しい生育的に導入された遺伝子を発現するが、組換えウイルスゲノムが必要なウイルス遺伝子を欠いているので、いかなるウイルスも産生することはない。レトロウイルスベクターの総説として、引用文献(５２、５３)を参照。他のウイルスベクターはＢerkner Ｋ．Ｌ．（５４）に総説されているアデノウイルスである。また他のウイルスベクターとしてヘルペスウイルスもある。細胞を形質転換するこれらの方法のいくつかは、中間プラスミドベクターの使用を必要とする。ＣohenおよびＢoyerのＵＳＰ４,２３７,２２４に、制限酵素解裂およびＤＮＡリガーゼでの連結反応を用いて、組換えプラスミドの形態での発現系をつくることが記載されている。これらの組換えプラスミドは、形質転換の手段によって製造され、組織培養中での生育した原核生物および真核細胞を含む単細胞培養中で複製される。ＤＮＡ発現はプラスミドベクター中に、Ｍaniatis et al．,Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual,Ｃold Ｓprin gs Ｌaboratory,Ｃold Ｓprings Ｈarbor,Ｎew Ｙork(１９８２)記載のように従来技術である標準クローニング法によってクローン化される。望む外部遺伝子(すなわち非内在性受容体)含有の形質転換細胞は、遺伝子治療の目的に使用される。細胞はインビトロで形質転換されて、多細胞生物体に再挿入されるか、あるいは細胞がインビボで形質転換されるかできることに注意。レトロウイルスがベクターとして働いて遺伝子を細胞に運ぶのと同じように、細胞は、遺伝子を患者体中に運ぶベクターとみることができる。形質転換に適した細胞および遺伝子治療への利用は、容易に得られるもので、培養中でよく生育し、例えばレトロウイルスやアデノウイルス感染に関連する種々の手法に適合し得るものでなければならない。インビトロ形質転換については、ベクター細胞は、形質転換後に患者に容易にもどすことができ、長い間、望ましくは患者の生きている間、生き続けられるべきである。遺伝子治療についてはＦriedmann(５５),Ｖerma(５６),Ａnderson(６２)and Ｍulligan(６３)参照。骨髄細胞は多くの望ましい特質を有している。骨髄細胞は造血系のすべての細胞を生み出す幹細胞を含有している。これらの幹細胞の感染は治療遺伝子含有の細胞の継続的供給をもたらす。さらに、患者および実験動物の骨髄を再構成する技法はよく行なわれる。造血幹細胞中に導入された遺伝子が発現すること、およびそれが治療効果を生じること明らかにする根拠は、ミュータント・ジヒドロフォレート・レダクターゼ遺伝子(ＤＨＦＲ)での実験に由来する。参照、Ｃorey et al(５７)。遺伝子移転の担体としてよく研究されている他の型の細胞は、皮膚線維芽細胞である。線維芽細胞は容易に入手でき、培養でよく生育し、多くの実験に用いられている。皮膚線維芽細胞はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターで効率よく感染せしめ得る。参照Ｐalmer et al．(５８)。遺伝子治療の他の標的組織は肝である。多数の遺伝的代謝障害が肝に影響を与え、肝移植においてこのことおよび高コレステロール血症や血友病などの他の状態を処置するために努力がなされて来た。肝細胞を分離し、培養する技術は開発されており、ウイルス仲介遺伝子移植のために適当なターゲット細胞が利用できる。参照Ａnderson et al．(５９)。患者に遺伝子を運ぶための細胞を基とする系での合併症を避ける一つの方法は、ウイルスベクターをターゲット細胞に直接的運ぶことである。この技法は、レトロウイルスベクターを用いて血管の内皮細胞を感染さす効率的な方法が示されている。参照Ｎabel et al(６０)およびＮabel et al(６１)。上記したように、本発明によって形質転換されるべき適当な細胞は、例えば肝細胞であって、その中でグリコーゲン分解をコントロールしようとする。これは、非内在性細胞シグナル受容体(すなわち肝細胞に通常は存在しない)をコードするＤＮＡで肝細胞を形質転換することにより達成され、そこで肝細胞に内在する( すなわち細胞に普通に存在する)シグナル形質導入経路を受容体が活性化し得る。非内在性受容体は、細胞におけるグリコーゲン分解を適合シグナル形質導入経路が調節するように選ばれる。肝細胞の例では、肝細胞内のcＡＭＰ経路およびホスホイノシチド経路がグリコーゲン分解を調節し、チロトロピン放出ホルモン受容体(肝細胞に内在しない受容体)をコードするＤＮＡが肝細胞中に形質転換されて、この２内在性経路を活性化し、それにより経路のコントロール可能な活性化(非内在性受容体に結合し得る細胞外分子を導入すること、およびそれで内在性経路を刺激することによって)を提供する。肝細胞は本発明によるインビボ細胞に適する１例である。他の細胞、肺気道の細胞なども等しく形質転換し得る。これらの細胞は、肺気道の内在性サイクリックＡＭＰシグナル形質導入経路を利用し得る甲状腺刺激ホルモン受容体で形質転換し得る。甲状腺刺激ホルモン受容体を活性化し得る細胞内分子は、（細胞機能を正常にコントロールするためにｃＡＭＰ経路を利用する）アドレナリン性アンタゴニストおよび気管支拡張剤がなすように同じ細胞機能をコントロールするであろう。多数の他の適当な細胞が当業者に明らかであろう。特定の例として、肝細胞を形質転換するためにアデノウイルスを基とするベクターが用いられる。アデノウイルスを基とするベクターは多くの哺乳動物のものを発現するのに成功しているが、インビボ細胞シグナル受容体を異所的に発現するのは用いられない。下記の例からして、特殊な細胞型の機能がアゴニストにより無傷の動物において調節され、このアゴニストの受容体がアデノウイルス仲介遺伝子移転により発現されたときに、このアゴニストはこの細胞型における機能に常に影響することはない（なぜなら、細胞がこのアゴニストの受容体を内在的に発現しないから）。これは発現非内在性受容体が内在性シグナル形質導入経路にカップルし、それによって細胞機能を調節することによる。下記するように、神経ホルモン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）は無傷ラットの肝でアデノウイルス仲介遺伝子移転によって発現される。これらのラットに投与されたとき（非感染ラットにもｎｕｌｌウイルスで感染したラットにも投与されない）、ＴＲＨは血糖を上昇する。この血糖の上昇は、バゾプレッシンをラットに投与したときに観察されるのと同じである。なぜなら、肝細胞は、ＴＲＨ受容体と同じシグナル形質導入系を通してシグナルするバゾブレッシンの受容体を内在的に発現するからである。この仕方によって、いかなる細胞タイプでも内在的に発現する受容体がその細胞の機能をコントロールするようにつくられる。本発明は重要な医療上の適用を有する。この適用には、病的組織および病気プロセスにより影響されない組織における受容体発現でもって、生命を脅かす疾患の一時的な緩解を含む。病的組織での適用の例は、慢性閉塞性肺疾患または激しい再発性喘息の患者における気管支拡張応答を、サイクリックＡＭＰの上昇を通して（アドレナリン性アゴニストおよび気管支拡張剤に用いられるのと同じ経路）仲介するために、肺気道における甲状腺刺激ホルモンの受容体を発現することである。望む応答を仲介するために１以上の受容体を用いる治療上の利点は、多くの薬剤の効率が繰り返し投与において、受容体の脱感作によって常におきる過耐性と呼ばれるプロセスを低下せしめる。異なる時に異なる受容体を活性化することによって、良い治療上の応答を知ることができる。例えば、下記したように激しい気管支の収縮に悩む患者においては、アドレナリン性アゴニストを慢性的に用いていたときには、アドレナリン性アゴニストに対する応答よりも甲状腺刺激ホルモンに対してよい応答であると予測できる。他の適用は、健康な臓器における生理的機能の調節が疾病プロセスの効果に対抗して調和をとるような疾患の処置である。この例は下記の実施例に示されるが、血糖が肝のＴＲＨ受容体の異所性発現の後にＴＲＨによって上昇する。このアプローチは、処理不能のインスリン分泌腫瘍（膵細胞腫）を持つ重い低血糖症の患者に、正常血糖を長期間保つように、用いられる。このような患者において、ｃＡＭＰ形質導入システムを通してシグナルする非内在性受容体、例えば甲状腺刺激ホルモンを異所的に発現するのが好ましい。ヒト肝でのグリコーゲン分解は、この経路によって、ＴＲＨ受容体がカップルするホスホイノシチド経路よりも効果的に調節される。天然のペプチド・アゴニストよりも非ペプチドアゴニスト剤を用いるのがよく、受容体活性化が経口投与で達成されることは重要である。肝でのグリコーゲン分解による血糖の維持は、ｃＡＭＰまたはホスホイノシチドシグナル形質導入経路を活性化するために、肝細胞上の特殊な受容体を引き起こすグルカゴンおよびバゾプレシンなどの細胞外調節分子によって正常に開始される。本発明は、ラット肝インビボで非内在性マウス下垂体チロトロピン放出ホルモン受容体（ＴＲＨ−Ｒ）ｃＤＮＡを異所的に発現するために、アデノウイルスベクターを用いてグリコーゲン分解の正常なリガンド受容体調節体がバイパスされることを明らかにする。異所的に発現されたＴＲＨ−Ｒはホスホイノシチド経路に連結し、肝生理に正常には関連しない細胞外リガンド、ＴＲＨでグリコーゲン分解を活性化する手段を提供する。ＴＲＨがこれらの動物に投与されたときに、ホスホイノシチド経路が活性化されて、血糖が持続的に上昇することになる。相違する細胞において特殊なシグナル形質導入経路の活性化がシグナル形質導入経路を正常に活性化するリガンドまたは受容体に独立的な細胞特異的応答を引き起こすので（８、９）、本発明は、正常な細胞外調節分子およびその特殊な内在性受容体を関連内在性シグナル形質導入経路を引き起こすために、代替のリガンドおよび非内在性受容体を用いて、迂回すべきであるような異常を治療するアプローチを提供する。かかる戦略は、特殊なシグナル形質導入経路の再構築コントロールにより細胞外調節分子またはその特殊な内在性受容体の異常を正すために、また、疾患状態の特殊な生理機能を調整するために用いられる。本発明は、正常には発現しない天然の受容体を臓器細胞中で異所的に発現せしめる遺伝子移転ベクターを用いて（非内在性受容体）、特殊なシグナル形質導入経路を引き起こす手段を提供することによりインビボで細胞の相違する機能を特異的にコントロールする新しい戦略を提供する。発現受容体は、その天然シグナル形質導入経路に連結し、この受容体に関連するリガンドによって、ターゲット細胞中で引き起こされる特異的応答を可能とする。インビトロ・データについては、引用を参照のこと（１０−１２）。下記の例において、アデノウイルス仲介移転後のチロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）の全身投与およびインビボ肝細胞でのチロトロピン放出ホルモン受容体（ＴＲＨ−Ｒ）の異所性発現を示す。ＴＲＨ−Ｒは、下垂体前方で正常に発現され、肝細胞では発現されないセブン透過膜スパニング受容体である（１３）。下垂体におけるＴＲＨ−ＲｓがＴＲＨにより刺激されると、ＴＲＨ−Ｒは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を通して、ホスホイノシチド−カルシウム−タンパク質キナーゼＣ形質導入経路を引き起こし、次いで下垂体が甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を放出する（２、１３、１４）。一方、肝細胞におけるホスホイノシチド経路が引き起こされると（例えば、バゾプレシンで）、ＴＳＨ放出を生じないで、グリコーゲンを分解し、グルコースの循環中への放出をもたらす（５）。本発明は、発現受容体の肝細胞ホスホイノシチド経路との連結でインビボ肝細胞におけるＴＲＨ−ＲｃＤＮＡの転移と発現を提供する。従って、肝においてＴＲＨ受容体を発現する動物にＴＲＨを全身的に投与することは、肝細胞でのホスホイノシチド経路を引き起こし、血糖を上昇する。実施例１ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒの構築親プラスミドｐＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒは、マウスＴＲＨ−ＲｃＤＮＡのタンパク質暗号化領域、プラスミドｐＢＳｍＴＲＨＲ（４３）のヌクレオチド２３３−１４６２を含む１.２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位におけるプラスミドｐＧＥＭ２−Ｌ３−１１４へ挿入することにより構築された。ＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて平滑ＤＮＡ末端を形成させた後、ＨｉｎｄIIIリンカーをライゲーションし、マウスＴＲＨ−ＲｃＤＮＡおよびアデノウイルスＥ２ポリ（Ａ）シグナル配列を含む１.４ｋｂのＨｉｎｄIII断片を単離し、アデノウイルスの左端複製およびパッケージング成分、サイトメガロウイルス−１プロモーターおよびプラスミドｐＭＬ−ＩＳＣａｔ（４４）からのスプライシング成分を含むｐＡｄＣＭＶ −ＨＳ−ベクターのＨｉｎｄIII部位へ挿入した。制限部位地図作製によりプラスミドを証明し、ｐＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−ＲをＣＯＳ−１細胞へ一時的トランスフェクションしてＴＲＨ−Ｒ発現を立証した後、タントラヴァヒらによる記載（４５）に従いオーバーラップ組換えによりウイルスＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒを構築した。トランスフェクションは全て、グラハムらの方法（４６）に従いアデノウイルス５型のＥ１領域により形質転換されたヒト胚腎臓細胞において行われた。プラーク精製後、タントラヴァヒらによる記載（４５）に従い懸濁液培養中２９３細胞においてウイルスを培養した。アデノウイルスＥ１ａ遺伝子をコードする全配列を、５´１.８ｋｂのＥ１ｂ遺伝子と同様に除去した。ｐＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒをアデノウイルスの大断片（３.８−１００地図単位）と共に２９３細胞へ同時トランスフェクションすることにより、組換えウイルスＡｄＣＭＶｍＴＲＨＲが製造された。ｐＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒと称する組換えプラスミドおよびＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒと称するアデノウイルスベクターの構築は、ガーシェンゴーンら（１０）およびファルク-ペーダーゼンら（３０）により詳述されている。実施例２ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−ＲがマウスＴＲＨ−ＲｃＤＮＡを転移し、ラット肝細胞で発現させ得ることを、まずインビトロで立証した。複製欠失組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス５型に基づく全Ｅ１ａ^-、部分Ｅ１ｂ^-、部分Ｅ３^-であり、そこでは組換え遺伝子の発現を推進するプロモーターを含む発現カセットがＥ１欠失部位に挿入されている。ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒは、サイトメガロウイルス初期中間プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ）、次いでマウスチロトロピン放出ホルモン受容体（ＴＲＨ−Ｒ）ｃＤＮＡ（３０）を伴う発現カセットを含む。ＡｄＣＭＶ.βｇａｌは、ＣＭＶプロモーターおよびエシェリヒア・コリＬａｃＺ遺伝子を運ぶ［β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）をコード化する］（３１）。以前に記載されている要領で（３２、３３）、アデノウイルスベクターを製造し、精製し、滴定した。２５０−３００ｇ雄スプラーグ-ドーリーラット（１９）から確立された一次肝細胞培養物を、様々な感染多重度（感染多重度（ｍｏｉ）、１、１０、５０、１００）のＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒに暴露した。非感染細胞およびＡｄＣＭＶ.βｇａｌ（感染多重度５０）に感染した細胞を対照として用いた。図１のノーザン分析で示されているように、マウスＴＲＨ−ＲｃＤＮＡプローブ（欄１-６）または陽性対照としてヒトγ−アクチンｃＤＮＡプローブ（欄７-１２）を用いるベクターとのインキュベーションの２４時間後に、一次肝細胞からのＲＮＡ（１０μｇ／欄）を評価した。転写物の大きさは示されている。肝細胞をＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒとインキュベーションすることにより、ＴＲＨ−ＲｍＲＮＡ転写物が用量依存的に発現された（図１、欄３−６参照）。対照的に、非感染または対照ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌにより感染した肝細胞は、ＴＲＨ−ＲｍＲＮＡ転写物を全く示さなかったが（図１、欄１および２参照）、対照γ−アクチンｍＲＮＡ転写物はどの試料においても類似していた（図１、欄７−１２参照）。図２は、ＴＲＨ−ＲｃＤＮＡのアデノウイルス伝達インビトロ転移後のメチル−チロトロピン放出ホルモン（メチル−ＴＲＨ）と肝細胞との結合を説明している。予備試験は、メチル−ＴＲＨ結合が３.１８±０.３９ナノモルのＫｄを有することを証明していた。これに基づき、１ナノモルのメチル−ＴＲＨを結合性試験に使用した。ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌまたはＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒと２４時間インキュベーション後、肝細胞（１０⁶／ウェル）を、［³Ｈ］メチル −ＴＲＨ（８２.５Ｃｉ／ミリモル、ニューイングランド・ヌクリアー-デュポン、ボストン、マサチューセッツ）または［³Ｈ］メチル−ＴＲＨ＋過剰の非標識メチル−ＴＲＨ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）と６０分間インキュベーションした。培地を吸引し、細胞を２ｍｌ（４℃）ハンクス平衡塩溶液で５回洗浄することにより、遊離リガンドを除去した。１ｍｌの０.４ＮＮａＯＨで細胞を溶解し、計数することにより、細胞性放射能を測定した。［³Ｈ］メチル−ＴＲＨの特異結合を次の要領で計算した：［（［³Ｈ］メチル−ＴＲＨのｄｐｍ）− （非標識メチル−ＴＲＨの存在下における［³Ｈ］メチル−ＴＲＨのｄｐｍ）］（３４）。各用量のベクターについて、２種の異なる動物からの肝細胞で３回全く同じ測定を行った。リガンド対受容体の１対１化学量論およびＴＲＨ−Ｒの均一分布を仮定してＴＲＨ−Ｒ受容体部位の数を計算した。標識メチル−ＴＲＨ［親和力がＴＲＨより高い類似体（１５）］を加えると、メチル−ＴＲＨの特異結合が立証され、結合量は肝細胞の感染に使用されたＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒの用量に依存していた（図２参照）。対照的に、非感染または対照ベクターＡｄＣＭＶ．βｇａｌにより感染した肝細胞を分析しても、メチル−ＴＲＨの特異結合は全く示されなかった（図２参照）。メチル−ＴＲＨの結合部位数を定量すると、５．７×１０⁵部位／細胞で、Ｋｄが３.１８±０.３９ナノモルであることが立証された（ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ５０ｍｏｉ）。ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ− Ｒにより感染した肝細胞にメチル−ＴＲＨを加えた後、リガンド−受容体複合体をインターナリゼーションした（図示せず）。図３は、ＴＲＨ−ＲｃＤＮＡのアデノウイルス伝達インビトロ転移後の肝細胞におけるイノシトールホスフェート形成のＴＲＨ刺激を示している。一次肝細胞をベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌまたはＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒに暴露した。２４時間後、細胞を２４時間ミオ−［³Ｈ］イノシトール（ミオ−［２−³Ｈ］イノシトール、２０Ｃｉ／ミリモル、アマーシャム・コーポレーション、アーリントン・ハイツ、イリノイ）により標識し、１０ミリモルのＬｉＣｉとインキュベーション(５分、３７℃)し、メチル−ＴＲＨで刺激を加えた（６０分、３７℃）。次いで細胞を溶解し、アニオン交換クロマトグラフィーによりイノシトールホスフェートを分離し、放射能を計数した。イノシトールホスフェート形成の比刺激を次の要領で算出した：（イノシトールホスフェートにおけるｄｐｍ×１００／刺激細胞の脂質におけるｄｐｍ）−（イノシトールホスフェートにおけるｄｐｍ×１００／非刺激細胞の脂質におけるｄｐｍ）（３５）。各用量のベクターについて、２種の異なる動物からの肝細胞で３回全く同じ測定を行った。ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ感染肝細胞におけるＴＲＨによるホスホイノシチド経路の特異的活性化の直接的証拠は、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒにより感染し、メチル−ＴＲＨにより刺激された肝細胞においてイノシトールホスフェートの量が増加したことの証明であった（図３参照）。重要なことに、イノシトールホスフェートの増加は、細胞の感染に使用されたＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒの用量に依存していたが、非感染肝細胞および対照ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌにより感染した肝細胞は、メチル−ＴＲＨとのインキュベーション時にイノシトールホスフェートの増加を示さなかった。実施例３インビトロでの観察によると、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−ＲベクターがＴＲＨ− ＲｃＤＮＡをインビボでラット肝臓に効果的に転移した結果、肝細胞において機能的ＴＲＨ−Ｒの異所性発現がみられた。これを達成するため、ＡｄＣＭＶ. ｍＴＲＨ−Ｒを動物に静脈内投与したが、複製欠失アデノウイルスベクターの投与経路は肝細胞における外性遺伝子の発現が＞９０％の割合で検出されるものである（１６）。スプラーグ-ドーリーラット（２５０−３００ｇ、３か月令、食餌制限無し）に対しケタミン−ＨＣｌ（６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）により麻酔をかけた。Ａｄベクター［ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ、ＡｄＣＭＶ.β ｇａｌ、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（「Ｎｕｌｌ」ベクターは、発現カセットがＣＭＶプロモーターを含むが組換え遺伝子を全く含まない点を除き、他のベクターに類似している）（３１）］を、右外頚静脈から投与した（５×１０⁹pfu、１００ μｌ、０.９％ＮａＣｌ）。肝臓を５日後に採取した。ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒにより５日前にインビボ感染させた動物からの一次肝細胞の培養物は、ＴＲＨ−ＲｍＲＮＡ転写物の存在を示し、ＴＲＨと特異結合し得、ホスホイノシチド経路を活性化することを立証した（図４−７）。図４および５はノーザン分析である。肝臓ＲＮＡ（１０μｇ／欄）を、マウスＴＲＨ −ＲｃＤＮＡプローブ（図４、欄１および２）または陽性対照としてγ−アクチンｃＤＮＡ（図５、欄３および４）により評価した。転写物の大きさは示されている。欄１および３（それぞれ図４および図５）は、ＡｄＣＭＶ.βｇａｌが投与された動物である。欄２および４（それぞれ図４および図５）は、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒが投与された動物である。対照ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌが投与された動物から得られた肝細胞のノーザン分析は、ＴＲＨ−ＲｍＲＮＡ特異的転写物の存在を全く示さなかった（図４、欄１および図５、欄３）。対照的に、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ感染動物から得られた肝細胞は、予想された大きさのＴＲＨ−ＲｍＲＮＡ転写物を示した（図４、欄２参照）。対照として、γ −アクチンｍＲＮＡ転写物は全試料で観察された。この観察結果と一致して、インビボでＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒが投与された動物から採取した肝細胞は、高レベルのメチル−ＴＲＨ特異的結合を示したが、特定の実験を受けたことがない動物または対照ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌが投与された動物においては特異的メチル−ＴＲＨ結合は全く観察されなかった（図６）。［³Ｈ］メチル−ＴＲＨ結合の分析結果は、図２に関して記載されたものと同一であった。一条件につき個々の３動物から同様の方法による３測定結果を得た。ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ −Ｒ感染動物から誘導された肝細胞は、６.１×１０⁵ＴＲＨ−Ｒ受容体／細胞を示し、Ｋｄは２.５１±０.３２ナノモルであった。メチル−ＴＲＨ複合体に対し、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ感染動物からの肝細胞においてインターナリゼーションを行った（図示せず）。最後に、非感染動物および対照ベクターＡｄＣＭＶ.βｇａｌによりインビボ感染した動物からの肝細胞にＴＲＨを加えても、イノシトールホスフェート形成の刺激を示さなかった（図７）。イノシトールホスフェート形成の測定結果は、図３に関して記載されたものと同一であった。一条件につき個々の３動物から同様の方法による３測定結果を得た。対照的に、ＴＲＨは、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ −Ｒベクターにより５日前に感染させた動物からの肝細胞においてホスホイノシチド経路を活性化した（メチル−ＴＲＨを加えなかった対照に対し１６.９±１. ８倍の刺激）。これらの培養物における時間の関数としてＴＲＨ刺激を評価すると、メチル−ＴＲＨを加えてから少なくとも１時間にわたってイノシトールホスフェート形成の増加を立証した（図示せず）。実施例４肝臓は、肝細胞グリコーゲン貯蔵から誘導されたグルコースを循環系へ分泌することにより血中グルコースレベルを維持する。このプロセスは、２種のシグナル変換経路、すなわちｃＡＭＰ経路またはホスホイノシチド経路のいずれかを活性化する特異的細胞表面受容体により調節される。両方が収斂してホスホリラーゼＢを活性化し、グリコーゲンがグルコース−１−ホスフェートに開裂され、次いでホスホグルコムターゼによりグルコース−６−ホスフェートに異性化され、最後にグルコース−６−ホスファターゼにより脱燐酸化されてグルコースとなり、分泌される（１７）。この実施例は、ＴＲＨ−ＲｃＤＮＡが肝臓へインビボで転移された後の動物におけるＴＲＨによる血清グルコースレベルの調節について開示している。ベクターＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−ＲまたはＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（５×１０⁹pfu）、または陰性対照として食塩水（０．９％）（全て１００μｌ中）を、上記要領でラットに投与した。５日後、メトキシフルレイン（ピットマン-ムーア、ムンデレイン、イリノイ）吸入により動物に麻酔をかけ、左右外頚静脈にカニューレを挿入した。１５分安定化させた後、１５分のベースライン期間が開始され、その間５分毎にグルコースレベルに関する血清試料を採取した。「０時点」でメチル− ＴＲＨ（１００μｌ中５００μｇ）または食塩水（０．９％、１００μｌ）を一方のカニューレで投与し、５５分間５分毎に他方のカニューレから血清試料を採取した。比色分析検定法（シグマ・ダイアグノスティックス、セントルイス、ミズーリ）により、血清グルコースレベルを測定した。図８は、ＴＲＨによる血清グルコースの調節について説明している。メチル− ＴＲＨまたは食塩水投与前に平均−１５〜０として、ベースラインのグルコースレベルを各動物について測定した。データは、個々の各動物をそれ自体の対照として用い、各動物群について各時点での平均値をとって、平均ベースライン血清グルコースレベル（ミリモル）からの絶対変化として示されている。ＡｄＣＭＶ .ｍＴＲＨ−Ｒ（ＩＶ）／ＴＲＨ＝０日目にベクターを静脈投与、５日目にメチル−ＴＲＨを投与、ｎ＝６動物、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ（ＩＰ）／ＴＲＨ＝０日目にベクターを門脈から投与、５日目にメチル−ＴＲＨを投与、ｎ＝５、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（ＩＶ）／ＴＲＨ＝０日目にベクターを静脈内投与、５日目にメチル−ＴＲＨを投与、ｎ＝６、食塩水／ＴＲＨ＝０日目にベクターではなく食塩水を投与、５日目にメチル−ＴＲＨ、ｎ＝６、および無投薬／食塩水＝０日目に何も投与せず、５日目に食塩水、ｎ＝５。データは、各時点での群における全動物に関する平均として示されている。スプラーグ-ドーリーラットの血清グルコースに関する正常範囲は、２.５−６.７ミリモルである（３６）。平均ベースライン値（平均±標準偏差）は、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ（ＩＶ）／ＴＲＨ群６.１±０.８ミリモル、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒ（ＩＰ）／ＴＲＨ群５.６± ０.５ミリモル、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（ＩＶ）／ＴＲＨ群４.６±０.５ミリモル、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（ＩＶ）／食塩水群７.９±１.８ミリモル、食塩水（ＩＶ）／ＴＲＨ群９.２±１.４ミリモル、および無投薬／食塩水群８.６±０.７ミリモルであった。図９は、ベースラインからの血清グルコースレベルの平均変化について説明している。ベースラインからの血清グルコースレベルの平均変化を、５日目のメチル−ＴＲＨまたは食塩水投与の１５〜５５分後における各時点について測定した。データは、平均±標準偏差として示されている。両側スチューデントのｔ−テストを用いて全統計比較を行った。初期の試験は、安定した血中グルコースレベルが、吸入麻酔を用い、実験的試験中に環境刺激因子を制限することにより確立され得ることを立証していた（１８）。陽性対照として、［Ａｒｇ⁸］バソプレッシン（１００μｌの０.９％ＮａＣｌ中１μｇ）を静脈内経路により投与したとき、血中グルコースが増加し、次いで５５分の評価期間にわたって減少した（図示せず）。５日前にＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒベクターを投与された動物から単離された肝細胞においてＴＲＨがホスホイノシチド経路を活性化し得ること、および肝細胞におけるホスホイノシチド経路の活性化によりグリコーゲン分解が始まるという認識と一致して、メチル−ＴＲＨの静脈内投与により、５日前にＡｄＣＭＶ. ｍＴＲＨ−Ｒを投与された動物群において血中グルコースレベルの顕著な増加が誘導された（図８）。食塩水、および５日後に静脈内メチル−ＴＲＨを投与された動物群では、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ、次いで５日後に静脈内メチル−ＴＲＨを投与された群、および食塩水を投与された無投薬群で観察された結果と同様、ベースラインレベルを越える血中グルコースの小さな増加が観察された。しかしながら、これらの対照群の各々において観察されたベースラインを越える血中グルコースの増加は、５日前に静脈内経路によりＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒベクターを与えられた動物においてメチル−ＴＲＨにより誘導されたベースラインを越える血中グルコースの増加と比べて極僅かであった。これらの動物において、血中グルコースの増加は、メチル−ＴＲＨ投与の１５分後にピークに達し、血中グルコースレベルの上昇が少なくとも５５分間維持された時点で、実験は終結した。メチル−ＴＲＨ投与の１５〜５５分後におけるベースラインを越える血中グルコースの増加は１.７３±０.２６ミリモルであり、同期間にわたり対照のいずれかで（食塩水（ＩＶ）／ＴＲＨ、無投薬／食塩水、ＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（ＩＶ）／ＴＲＨおよびＡｄＣＭＶ.Ｎｕｌｌ（ＩＶ）／食塩水、ｐ＜０.０００１全対照）観察された結果よりも著しく高い増加であった（図９）。肝臓が血中グルコースの上昇に関与するという概念に対する直接的支持は、門脈を介したラットへのＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒベクターの投与［肝細胞においてのみベクター遺伝子発現の限界をもたらすことが知られているラットへのアデノウイルスベクターの投与経路（１９、２０）］、続いて５日後のメチル−ＴＲＨの静脈内投与から得られた。これらの動物において、観察された血中グルコースの上昇は、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒベクターを静脈内投与、次いで５日後メチル−ＴＲＨを投与された動物（門脈から投与されたＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒを静脈内投与されたＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒと比較し、メチル−ＴＲＨの１５〜５５分後に平均をとった、ｐ＝０.０９、ＡｄＣＭＶ.ｍＴＲＨ−Ｒの門脈投与後メチル−ＴＲＨを、対照群と比較、ｐ＜０.０００１全対照）で観察される結果と重ね合わせることができた（図８および９）。実施例５この発明は、非内在性の天然に存する受容体の異所性発現を用いることによりインビボで分化した細胞機能を制御することができ、この場合受容体に対する天然リガンドを用いて受容体を活性化し、今度は細胞における特異的シグナル変換経路を活性化することにより、細胞特異応答を誘発し得るという概念を立証するものである。ほとんどの臓器へインビボで遺伝子を転移できるベクターの利用能を考慮に入れると、この方法は代替的手段として使用され得るもので、天然に存するリガンドまたは受容体特異的薬剤およびその細胞型に通常は関係しないそれらの対応する受容体を用いて細胞の特異的分化機能を調節することができる。ここに記載された要領による天然受容体の発現方法は、特異的シグナル変換経路による細胞の特異的分化機能の活性化を誘発する手段として自然な位置（２１）における天然受容体および人工リガンド（２２）に応答する「デザイナー」受容体の過剰発現、および正常受容体をそれらの正常位置へ転移して天然受容体における突然変異を補正すること（２３、２４）を含む、受容体数および／または機能の修正方法の増大するリストに加えられる。この方法の臨床適用には、シグナル発生分子またはそれらの特異的受容体に伴う先天的または後天的異常が副因となった虚弱および／または機能不全である分化機能の活性化がある。ホルモンまたは受容体をコードする遺伝子における突然変異が副因であるシグナル発生の欠乏に加えて（１、６、２５、２６）、リガンドを指向した抗体、例えばヒトおよび非ヒト起源のインスリンを投与されている糖尿病を患う個体で観察されるもの、様々な自己免疫疾患を患う個体におけるポリクローナル抗インスリン抗体および免疫甲状腺疾患および形質細胞異形成の患者における抗チロキシン抗体に伴う後天的リガンド欠乏状態を副行路で置き換えるといった方法が使用され得る（１、６、７）。さらに、細胞外調節分子がそれらの特異的受容体と相互作用する能力を受容体特異的自己抗体が奪う一群の後天的疾患が存在し、上記抗体には、特発性拡張型心筋症およびシャーガス病に伴う心筋症の病原に関与するβ１−アドレナリン性受容体に対する自己抗体、若干の喘息形態の病原に結合したβ２−アドレナリン性受容体に対する自己抗体、黒色表皮症および毛細管拡張性運動失調を患う個体から見いだされ、Ｂ型インスリン耐性が観察された糖尿病に伴うインスリン受容体に対する抗体、重症筋無力症におけるアセチルコリン受容体およびラスムッセン脳炎におけるグルタミン酸受容体に対する自己抗体がある（１、６、７、２７、２８）。最後に、この方法はまた、健康な臓器における生理学的機能の調節により病的状態の影響が相殺される疾患の処置に適用され得る。この一例は前記実施例により示唆されており、この場合肝臓におけるＴＲＨ−Ｒの異所性発現後に血中グルコースがＴＲＨにより高められた。この方法は、手術不能なインスリン分泌性腫瘍（インスリノーマ）がある重度の低血糖症患者においてさらに長期間にわたって正常血糖を維持するために使用され得る（２９）。これは、ホスホイノシチド経路（例、肝臓で発現されるＴＲＨおよびＴＲＨ−Ｒ）を誘発することにより、またおそらくはさらに効果的には、ｃＡＭＰ変換系によりシグナルを発する非内在性受容体を肝臓で発現させることによっても達成され得、これはヒト肝臓におけるグリコーゲン分解が、ホスホイノシチド経路よりもこの経路によってさらに有効に調節されるためであり、このためには経口非ペプチド性アゴニスト薬剤が活性化に利用可能である。好ましい実施態様を詳細に描写および記載したが、この発明の精神から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などが為され得、従ってこれらも後記する請求の範囲に記載された本発明の範囲内に含まれるとみなされることは、当業者には明白なはずである。引用文献リスト１．S．Gammeltoft 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファルク−ペダーセン，エリック・エスアメリカ合衆国10522ニューヨーク州ドッブズ・フェリー、ブエナ・ビスタ・ドライブ87番 (72)発明者クリスタル，ロナルド・ジーアメリカ合衆国20854メリーランド州ポトマック、カナル・ビスタ・コート13712 番

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞シグナル受容体（該細胞に内在していない）をコードするＤＮＡで形質転換されたインビボ細胞を含み、該細胞シグナル受容体は該細胞にとって内在性のシグナル形質導入経路を活性化することができ、該細胞シグナル受容体は調整的に活性化され、それによって該シグナル形質導入経路を調整的に活性して、該シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節する、インビボ細胞における組換体。２．該細胞が臓器細胞である、請求項１のインビボ細胞の組換体。３．該臓器が肝臓であり、そして該細胞が肝細胞である、請求項２のインビボ細胞の組換体。４．該受容体が細胞表面シグナル受容体である、請求項１のインビボ細胞の組換体。５．該細胞表面シグナル受容体がイオンチャネル連結受容体である、請求項４のインビボ細胞の組換体。６．該イオンチャネル連結受容体がナトリウムチャネル連結受容体、カリウムチャネル連結受容体、カルシウムチャネル連結受容体およびクロライドチャネル連結受容体よりなる群から選択される、請求項５のインビボ細胞の組換体。７．該細胞表面シグナル受容体がグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体である、請求項４のインビボ細胞の組換体。８．該グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体がα−アドレナリン性受容体、β−アドレナリン性受容体、ドパミン性受容体、セロトニン性受容体、ムスカリン性コリン様受容体およびペプチド作用性受容体よりなる群から選択される、請求項７のインビボ細胞の組換体。９．該グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質の連結受容体がチロトロピン放出ホルモン受容体である、請求項７のインビボ細胞の組換体。１０．該細胞表面シグナル受容体が酵素連結受容体である、請求項４のインビボ細胞の組換体。１１．該酵素連結受容体が透過膜グアニリルシクラーゼ受容体、受容体チロシン・ホスファターゼ、透過膜受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体チロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼ関連受容体よりなる群から選択される、請求項１０のインビボ細胞の組換体。１２．該受容体が細胞内細胞シグナル受容体である、請求項１のインビボ細胞の組換体。１３．該細胞内細胞シグナル受容体がステロイドホルモン受容体である、請求項１２のインビボ細胞の組換体。１４．該ステロイドホルモン受容体がプロゲステロン受容体、エストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体からなる群より選択される、請求項１３のインビボ細胞の組換体。１５．該細胞内細胞シグナル受容体が甲状腺ホルモン受容体である、請求項１２のインビボ細胞の組換体。１６．該甲状腺ホルモン受容体が甲状腺刺激ホルモンの受容体を含む、請求項１５のインビボ細胞の組換体。１７．該細胞内細胞シグナル受容体がレチノイド受容体である、請求項１２のインビボ細胞の組換体。１８．該レチノイド受容体がレチノン酸の受容体を含む、請求項１７のインビボ細胞の組換体。１９．該細胞内細胞シグナル受容体がビタミンＤ受容体である、請求項１２のインビボ細胞の組換体。２０．該シグナル形質導入経路がアデニレートシクラーゼ経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２１．該シグナル形質導入経路がグアニレートシクラーゼ経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２２．該シグナル形質導入経路がホスホイノシトル・ターンオーバ経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２３．該シグナル形質導入経路がチロシンキナーゼ経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２４．該シグナル形質導入経路がイオンチャネル経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２５．該シグナル形質導入経路がカルシウムイオン経路である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２６．該細胞機能がグリコーゲン分解である、請求項１のインビボ細胞の組換体。２７．該細胞機能が脂肪分解、糖新生、ケトン体生成、イオン透過性、レニン産生、筋収縮、タンパク質リン酸エステル化、甲状腺ホルモン合成、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、骨吸収、水分吸収、トリグリセリド分解、アミラーゼ分泌、ヒスタミン分泌および凝集からなる群より選択される、請求項１のインビボ細胞の組換体。２８．細胞において非内在性受容体を異所的に発現する方法で、該細胞に内在していない細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換するためのインビボ細胞を選択し（該細胞シグナル受容体は該細胞にとって内在性のシグナル形質導入受容体を活性化することができる）、該細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで該細胞を形質転換し、そして該細胞において該細胞シグナル受容体を異所的に発現すること、を含む該方法。２９．該形質転換がウイルス仲介形質転換を含む、請求項２８の方法。３０．該ウイルス仲介形質転換がアデノウイルス仲介形質転換を含む、請求項２９の方法。３１．該ウイルス仲介形質転換がヘルペスウイルス仲介形質転換を含む、請求項２９の方法。３２．該形質転換がリポソーム仲介形質転換を含む、請求項２８の方法。３３．該形質転換が化学的仲介形質転換を含む、請求項２８の方法。３４．該化学的仲介形質転換がカルシウムホスフェート仲介形質転換を含む、請求項３３の方法。３５．該細胞が臓器細胞である、請求項２８の方法。３６．該臓器が肝臓であり、そして該細胞が肝細胞である、請求項３５の方法。３７．該受容体が細胞表面シグナル受容体である、請求項２８の方法。３８．該細胞表面シグナル受容体がイオンチャネル連結受容体である、請求項３７の方法。３９．該イオンチャネル連結受容体がナトリウムチャネル連結受容体、カリウムチャネル連結受容体、カルシウムチャネル連結受容体およびクロライドチャネル連結受容体よりなる群から選択される、請求項３８の方法。４０．該細胞表面シグナル受容体がグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体である、請求項３７の方法。４１．該グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体がα−アドレナリン性受容体、β−アドレナリン性受容体、ドパミン性受容体、セロトニン性受容体、ムスカリン性コリン様受容体およびペプチド作用性受容体よりなる群から選択される、請求項４０の方法。４２．該グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質の連結受容体がチロトロピン放出ホルモン受容体である、請求項４０の方法。４３．該細胞表面シグナル受容体が酵素連結受容体である、請求項３７の方法。４４．該酵素連結受容体が透過膜グアニリルシクラーゼ受容体、受容体チロシン・ホスファターゼ、透過膜受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体チロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼ関連受容体よりなる群から選択される、請求項４３の方法。４５．該受容体が細胞内細胞シグナル受容体である、請求項２８の方法。４６．該細胞内細胞シグナル受容体がステロイドホルモン受容体である、請求項４５の方法。４７．該ステロイドホルモン受容体がプロゲステロン受容体、エストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体からなる群より選択される、請求項４６の方法。４８．該細胞内細胞シグナル受容体が甲状腺ホルモン受容体である、請求項４５の方法。４９．該甲状腺ホルモン受容体が甲状腺刺激ホルモンの受容体を含む、請求項４８の方法。５０．該細胞内細胞シグナル受容体がレチノイド受容体である、請求項４５の方法。５１．該レチノイド受容体がレチノン酸の受容体を含む、請求項５０の方法。５２．該細胞内細胞シグナル受容体がビタミンＤ受容体である、請求項４５の方法。５３．該シグナル形質導入経路がアデニレートシクラーゼ経路である、請求項２８の方法。５４．該シグナル形質導入経路がグアニレートシクラーゼ経路である、請求項２８の方法。５５．該シグナル形質導入経路がホスホイノシトル・ターンオーバ経路である、請求項２８の方法。５６．該シグナル形質導入経路がチロシンキナーゼ経路である、請求項２８の方法。５７．該シグナル形質導入経路がイオンチャネル経路である、請求項２８の方法。５８．該シグナル形質導入経路がカルシウムイオン経路である、請求項２８の方法。５９．該細胞機能がグリコーゲン分解である、請求項２８の方法。６０．該細胞機能が脂肪分解、糖新生、ケトン体生成、イオン透過性、レニン産生、筋収縮、タンパク質リン酸エステル化、甲状腺ホルモン合成、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、骨吸収、水分吸収、トリグリセリド分解、アミラーゼ分泌、ヒスタミン分泌および凝集からなる群より選択される、請求項２８の方法。６１．細胞機能を調節する方法で、該細胞に内在していない細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで形質転換するためのインビボ細胞を選択し（該細胞シグナル受容体は該細胞にとって内在性のシグナル形質導入受容体を活性化することができる）、該細胞シグナル受容体をコードするＤＮＡで該細胞を形質転換し、該細胞において該細胞シグナル受容体を異所的に発現し、そして該細胞シグナル受容体を活性化し得る細胞外分子に該細胞を調整的に接触せしめること（該細胞シグナル受容体の活性化は該シグナル形質導入経路を活性化し、該シグナル形質導入経路によりコントロールされる細胞機能を調節する）、を含む方法。６２．該形質転換がウイルス仲介形質転換を含む、請求項６１の方法。６３．該ウイルス仲介形質転換がアデノウイルス仲介形質転換を含む、請求項６２の方法。６４．該ウイルス仲介形質転換がヘルペスウイルス仲介形質転換を含む、請求項６２の方法。６５．該形質転換がリポソーム仲介形質転換を含む、請求項６１の方法。６６．該形質転換が化学的仲介形質転換を含む、請求項６１の方法。６７．該化学的仲介形質転換がカルシウムホスフェート仲介形質転換を含む、請求項６６の方法。６８．該細胞が臓器細胞である、請求項６１の方法。６９．該臓器が肝臓であり、そして該細胞が肝細胞である、請求項６８の方法。７０．該受容体が細胞表面シグナル受容体である、請求項６１の方法。７１．該細胞表面シグナル受容体がイオンチャネル連結受容体である、請求項７０の方法。７２．該イオンチャネル連結受容体がナトリウムチャネル連結受容体、カリウムチャネル連結受容体、カルシウムチャネル連結受容体およびクロライドチャネル連結受容体よりなる群から選択される、請求項７１の方法。７３．該細胞表面シグナル受容体がグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体である、請求項７０の方法。７４．該グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質連結受容体がα−アドレナリン性受容体、β−アドレナリン性受容体、ドパミン性受容体、セロトニン性受容体、ムスカリン性コリン様受容体およびペプチド作用性受容体よりなる群から選択される、請求項７３の方法。７５．グアニン−ヌクレオチド結合タンパク質の連結受容体がチロトロピン放出ホルモン受容体である、請求項７３の方法。７６．該細胞表面シグナル受容体が酵素連結受容体である、請求項７０の方法。７７．該酵素連結受容体が透過膜グアニリルシクラーゼ受容体、受容体チロシン・ホスファターゼ、透過膜受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体チロシンキナーゼおよびチロシンキナーゼ関連受容体よりなる群から選択される、請求項７６の方法。７８．該受容体が細胞内細胞シグナル受容体である、請求項６１の方法。７９．該細胞内細胞シグナル受容体がステロイドホルモン受容体である、請求項７８の方法。８０．該ステロイドホルモン受容体がプロゲステロン受容体、エストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体からなる群より選択される、請求項７９の方法。８１．該細胞内細胞シグナル受容体が甲状腺ホルモン受容体である、請求項７８の方法。８２．該甲状腺ホルモン受容体が甲状腺刺激ホルモンの受容体を含む、請求項８１の方法。８３．該細胞内細胞シグナル受容体がレチノイド受容体である、請求項７８の方法。８４．該レチノイド受容体がレチノン酸の受容体を含む、請求項８３の方法。８５．該細胞内細胞シグナル受容体がビタミンＤ受容体である、請求項７８の方法。８６．該シグナル形質導入経路がアデニレートシクラーゼ経路である、請求項６１の方法。８７．該シグナル形質導入経路がグアニレートシクラーゼ経路である、請求項６１の方法。８８．該シグナル形質導入経路がホスホイノシトル・ターンオーバ経路である、請求項６１の方法。８９．該シグナル形質導入経路がチロシンキナーゼ経路である、請求項６１の方法。９０．該シグナル形質導入経路がイオンチャネル経路である、請求項６１の方法。９１．該シグナル形質導入経路がカルシウムイオン経路である、請求項６１の方法。９２．該細胞機能がグリコーゲン分解である、請求項６１の方法。９３．該細胞機能が脂肪分解、糖新生、ケトン体生成、イオン透過性、レニン産生、筋収縮、タンパク質リン酸エステル化、甲状腺ホルモン合成、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、骨吸収、水分吸収、トリグリセリド分解、アミラーゼ分泌、ヒスタミン分泌および凝集からなる群より選択される、請求項６１の方法。９４．該細胞外分子が薬剤を含む、請求項６１の方法。９５．該細胞機能が該細胞外分子に該細胞を接触せしめる前の該細胞における機能悪化である、請求項６１の方法。９６．該機能悪化が、該細胞に正常に存在し、該シグナル形質導入経路を正常に活性化し得る内在性受容体の脱感作によるものである、請求項６１の方法。９７．該機能悪化が、該細胞に正常に存在し、該シグナル形質導入経路を正常に活性化し得る内在性受容体の不存在または変異によるものである、請求項６１の方法。