MXPA05012546A - Materiales y metodos que se relacionan con los oligomeros receptores acoplados a la proteina g. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona materiales y metodos que se relacionan con oligomeros receptores acoplados a la proteina G (GPCR). Se proporcionan los compuestos de dos o mas GPCRs asociados con proteinas G. Tambien se proporcionan proteinas de fusion que comprenden un GPCR y una proteina G, acidos nucleicos, vectores de expresion y celulas huesped. Tambien se proporcionan metodos para producir los compuestos y proteinas de fusion de la invencion.

Description

Declaration under Rule 4.17: Fortwo-letter codes and other abbreviations, referto the "G id- — of inver orship (Rule 4.l7(iv)) for US only ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing at the begin- ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazette. Published: — with intemational search report — befare the expiration of the time limit for amending the claims and to be republished in the event of receipt of amendments MATERIALES Y MÉTODOS QU E SE RELACIONAN CON LOS OLIGÓMEROS RECEPTORES ACOPLADOS A LA PROTEÍNA G CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a materiales y métodos que se relacionan con los oligómeros receptores acoplados a la proteína G (GPRC). Particularmente, pero no exclusivamente, la invención proporciona reactivos biológicos que comprenden los oligómeros GPCR, métodos para producir dichos reactivos biológicos y ensayos para determinar su función. La invención tam bién proporciona ensayos para determinar los compuestos que tienen la habilidad de modular la función de los oligómeros GPCR, particularmente hetero-oligómeros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN GPCRs son una de las familias de genes más grandes en el genoma humano y han sido el conjunto de objetivos más tratables para el desarrollo de medicinas, de molécula pequeña, clínicamente efectivas. Se estima que de los fármacos utilizados clínicamente en el hombre el 40% son GPCRs objetivo. De esta manera, existe gran interés en los detalles de la estructura, mecanismo de activación y reg ulación de GPCRs así como tam bién las cascadas de señalización - 2 -aguas abajo que controlan. La clase A o familia similar a rodopsina de GPCRs es hasta ahora la más grande que contiene más del 80% de los miembros de la familia GPCR total. Más de 800 genes que codifican GPCRs se han identificado en el programa de secuenciación de genoma humano pero solamente 25 de estos actualmente son el objetivo para medicinas clínicamente efectivas. Existe de esta manera mayor potencial para expandir esto y encontrar medicinas útiles que tienen como objetivo GPCRs recientemente identificados (Lee et ai.; 2001 ). En el pasado reciente, el concepto que GPCRs existen como dímeros ha movido rápidamente la hipótesis a claramente aceptada (ver Bouvier, 2001 , Milligan, 2001 , George et al., 2002 para revisiones). Aunque los homodímeros (es decir, un dímero conteniendo dos copias de GPCR individual) han sido los mejor estudiados, la creciente evidencia sugiere que la heterodimerización (es decir, el dímero consiste de una molécula de cada uno de dos diferentes GPCRs tanto ocurre como puede tener tanto secuencias funcionales como farmacológicas (Devi, 2001 , George et al., 2002). Sin embargo, las cuestiones importantes permanecen en relación a la selectividad de formación de tales heterodímeros y como monitorear la función de un heterodímero en aislamiento cuando la co-expresión de dos diferentes GPCRs debe resultar también en la producción de pares homodiméricos. Dado que muchos GPCRs son co-expresados en una célula única entonces es probable que el complemento de los dímeros GPCR en una célula sea complejo. - 3 - Se han llevado a cabo estudios en el receptor tipo B de ácido ?-aminobutírico (GABA) (GABABR) (Duthey eí al., 2002). Este es un GPCR inusual debido a que es el único conocido a la fecha que necesita dos subunidades, GB1 y GB2, para funcionar. La subunidad GB1 contiene el sitio de unión GABA pero es incapaz de activar la proteína G solo. GB2 no une GABA pero tiene la habilidad de activar las proteínas G. Duthey eí al., buscó en el papel de cada subunidad dentro del heterómero GB 1 -GB2 en el acoplamiento de la proteína G. El estudio incluyó introducir mutaciones tanto en GB1 como GB2, particularmente dentro del tercer ciclo ¡ntracelular. Determinan que la mutación a GB2 previene la activación de la proteína G, mientras que una mutación similar a GB1 no afecta la función del receptor. Aunque interesante para el receptor GABAB, desafortunadamente no proporciona ninguna información acerca de GPCRs en donde la misma proteína es responsable de tanto activación de la proteína G como de la unión del ligando. Estudios adicionales buscaron en la co-expresión de un primer receptor mutante que fue defectuoso en la unión hormonal y un segundo receptor mutante que fue defectuoso en la generación de celan. Se reportó que la co-expresión de dos mutantes rescató la producción de cAMP activada por hormona (Lee eí al., J. Biol. Chem. Vol. 277, No. 18, 2002; Osuga eí al., J. Biol. Chem. Vol. 272, No. 40, 1997). Sin embargo, aunque se reconoce que GPCRs son extremadamente importantes como objetivos de fármaco potenciales, - 4 -no existe un ensayo de selección satisfactorio que permite que datos confiables se acumule alrededor de las propiedades funcionales, por ejemplo, propiedades de unión de ligando, de oligómeros GPCR que ocurren potencialmente de manera natural, particularmente hetero-oligómeros GPCR.

BREVE DESC RI PCIÓN DE LA INVENCIÓN El presente inventor ha encontrado sorprendentemente que, después de la unión del ligando, un GPCR tiene la habilidad de activar una proteína G que se asocia con un segundo GPCR, en situaciones en donde ambos GPCRs han formado un oligómero. Específicamente, y como se ilustra por los ejemplos dados abajo, el inventor ha encontrado que la co-expresión en una célula de (A) una proteína de fusión de un GPCR y una proteína G en donde el GPCR se vuelve no funcional con respecto a la proteína G y (B) una proteína de fusión de un GPCR y una proteína G en donde la proteína G se vuelve no funcional, es decir, no puede actuar en una señal recibida por el GPCR, produce los siguientes compuestos, A, B, AA, BB, AB y BA, en donde solamente AB y BA son funcionales, es decir, la proteína G se activa para unir GTP e inicia la cascada de señalización de GPCR. La estrategia básica toma ventaja del hecho de que proteínas de fusión de subunidad a GPCR/proteína G (Milligan, 2000; Milligan, 2002) pueden considerarse como polipéptidos bifuncionales - 5 -conteniendo las secuencias y las propiedades funcionales de ambos elementos, es decir. , GPCR y la proteína G. Al generar pares de distintos mutantes en los cuales el primero se muta en el GPCR para volverlo incapaz de activar una proteína G tipo salvaje a la cual se fusiona y el segundo se muta en la proteína G de manera que no puede activarse por un GPCR tipo salvaje enlazado a ella, el presente inventor demuestra que la función puede restaurarse cuando los dos mutantes se co-expresan. De esta manera, solamente el oligómero comprendiendo al menos cada muíante produce complementación funcional y es capaz de generar una señal en respuesta a los ligandos agonistas. El inventor ha apreciado que este fenómeno puede utilizarse para proporcionar ensayo de selección confiables para determinar las propiedades de oligómeros GPCR, particularmente hetero-oligómeros, y proporcionar reactivos biológicos para utilizar en tales ensayos. De esta manera, de manera más general, la presente invención proporciona materiales y métodos para determinar las propiedades funcionales de oligómeros GPCR, incluyendo determinar ligandos potenciales. El término GPCR se entiende bien en la materia y se refiere a cualquier proteína de trans-membrana de superficie celular, que cuando se activa por un compuesto adecuado, a su vez activa una proteína de unión a nucleótido de guanina (proteína G). En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un reactivo biológico que comprende un oligómero GPCR - 6 -teniendo (a) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el primer GPCR es no funcional con respecto a la primer proteína G asociada; (b) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional. Por el término "no funcional" se entiende que, en contraste al tipo salvaje, la proteína (GPCR o proteína G) no es capaz de llevar a cabo una función biológica particular. De esta manera, el hecho de que GPCR es no funcional con respecto a la proteína G significa que es incapaz de llevar a cabo su función biológica tipo salvaje con respecto a la proteína G, principalmente, para activar la proteína G después de la unión del ligando. Otras funciones biológicas características del tipo salvaje (por ejemplo, unión del ligando) se mantienen preferentemente. Del mismo modo, la proteína G no funcional es incapaz de llevar a cabo su función biológica tipo salvaje, principalmente, iniciando una cascada de señalización celular después de la estimulación del GPCR. La habilidad de los GPCRs, primero y segundo, para formar un oligómero, trae al segundo GPCR funcional en el ambiente de la primer proteína G funcional. GPCR funcional es entonces capaz de activar la proteína G funcional, que a su vez, origina la cascada de señalización celular. Los GPCRs, primero y segundo, pueden ser el mismo, es - 7 -decir, un homo-oiigómero, por ejemplo, un homodímero, homotrímero u oligómero de orden más alto, o los GPCRs, primero y segundo, pueden ser diferentes, es decir, un hetero-oligómero, por ejemplo, un eterodímero, heterotrímero u oligómero de orden más alto. Idealmente, el oligómero está presente en una membrana celular. Esto puede lograrse convenientemente si los GPCRs, primero y segundo, y sus proteínas G asociadas se co-expresan en la célula. De esta manera, idealmente los GPCRs y sus proteínas G se asocian entre sí como proteínas de fusión. Sin embargo, la persona experta apreciará que otros medios de asociación son posibles. Por ejemplo, las proteínas pueden reunirse por medios de acoplamiento tales como pares de unión, enlaces químicos etc. , o simplemente por asociación natural en un ambiente celular. La presente invención también proporciona una proteína de fusión de GPCR mutante/proteína G nativa para utilizarse en la producción de un reactivo biológico de acuerdo con el primer aspecto, y particularmente para utilizarse en los métodos de acuerdo con la presente invención (es decir, comprendiendo una proteína GPCR no funcional modificada/proteína G funcional), así como también una construcción de ácido nucleico correspondiente. Las modificaciones menores pueden llevarse a cabo para la secuencia de la proteína, por ejemplo, un epítope tag puede agregarse al término N del receptor, un segmento espaciador se introduce, para crear un espacio entre la secuencia de la proteína GPCR y la secuencia de la proteína G y/o una metionina terminal del gen de la proteína G removido. Muchas de - 8 -tales modificaciones pueden contemplarse por el experto, proporcionando la funcionalidad en uso de la proteina de fusión receptor/proteína G que permanece substancialmente sin afectar. Además, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de GPCR mutante/proteína G, como se describe en la presente, en los métodos de acuerdo con la presente invención (es decir. , comprendiendo ya asea un GPCR no funcional modificado/proteína G funcional, o GPCR funcional/proteína G no funcional). Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención comprenden ácido nucleico, típicamente, ADN, ARN , mARN o cADN codificando el receptor particular al cual se fusiona, en cuadro, la secuencia de ácidos nucleicos apropiados codificando la proteína G. Generalmente hablando las construcciones de ácido nucleico se expresan en las células por medio de un vector de expresión. De acuerdo con lo anterior, también se proporciona una célula que comprende un oligómero GPCR teniendo (a) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el primer GPCR es no funcional con respecto a la primer proteína G asociada; (b) un segundo GPCR asociado con una segunda proteina G en donde la segunda proteína G es no funcional. Típicamente, las células son de origen eucariótico, incluyendo levadura, tal como de origen vertebrado, incluyendo - 9 -anfibios, y mamíferos (especialmente, humano), y el vector de expresión elegido es uno que es adecuado para la expresión en el tipo celular particular. Las células adecuadas y vectores de expresión se tratan en más detalle abajo. Con objeto de que el reactivo biológico pueda utilizarse en ensayos para determinar las propiedades naturales de los oligómeros GPCR, es importante que cualquier sitio de unión de ligando presente en los GPCRs, se mantenga. De esta manera, es preferible que el primer GPCR se vuelve no funcional solamente con respecto a la primer proteína G asociada. En otras palabras, el primer GPCR mantiene cualquier habilidad que tiene para unir el ligando pero es incapaz de activar la proteína G después de la unión del ligando. Por supuesto, la combinación actual de los GPCRs puede alterar las propiedades de los sitios de unión del ligando, pero esto será un reflejo de lo que pasaría naturalmente después de la formación de la oligomerización y no debe ser como un resultado de manipulación artificial. Con respecto a la segunda proteína G, es preferible que esta se vuelva no funcional al menos con respecto al segundo GPCR, es decir, de manera que no puede actuar en una señal enviada por GPCR. De esta manera, para que el reactivo biológico sea útil en los ensayos, es importante que la segunda proteína G se vuelva no funcional al menos al grado que es incapaz de activar una señal celular, es decir, incapaz de unir funcionalmente GTP e iniciar la cascada de señalización de GPCR. - 10 - El presente inventor ha encontrado que la proteína G G1 a, glicina 208, que es común para estas proteínas G, pueda mutarse, por ejemplo, por substitución, para volver a la proteína G no funcional. De acuerdo con lo anterior, es preferible modificar la segunda proteína G por al menos una substitución de aminoácido en donde dicho al menos un aminoácido es glicina equivalente a glicina 208 en G 1 a. Como se menciona arriba, es preferible que el primer GPC se modifique para volverlo no funcional solamente con respecto a la proteína G. El campo de biología molecular ha avanzado de manera que es posible modificar una secuencia de aminoácido de la proteína muy específicamente para mantener algunas funciones (por ejemplo, habilidad de unir el ligando) mientras interrumpe otras (por ejemplo, habilidad de activar la proteína G). El presente inventor ha encontrado que los residuos altamente conservados en el 2do ciclo intracelular del GPCR son particularmente adecuados para mutaciones ya que estos vuelven al receptor substancialmente no funcional con respecto a su proteína G asociada. Específicamente, el inventor ha encontrado que la mutación de uno o más residuos en esta región vuelve al GPCR no funcional con respecto a la proteína G (es decir, proteína G no se activa) pero aún es capaz de unir el ligando. Las mutaciones al GPCR se tratan en más detalle abajo. En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un reactivo biológico de acuerdo - 1 1 -al primer aspecto, dicho método comprendiendo las etapas de (a) producir o proporcionar una primer construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de un primer GPCR y una primer proteína G en donde el primer GPCR se muta en comparación con el tipo salvaje de manera que es no funcional con respecto a la proteína G fusionada; (b) producir o proporcionar una segunda construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de un segundo GPCR y una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es mutada en comparación con el tipo salvaje volviéndola no funcional; (c) co-expresar las construcciones de ácido nucleico, primera y segunda, en una célula para producir un oligómero GPCR que comprende dichos GPCRs, primero y segundo. Si la construcción de ácido nucleico, primera y segunda, ya se ha producido, entonces el método puede comprender simplemente las etapas de (a) expresar una primer construcción de ácido nucleico en una célula, dicha construcción de ácido nucleico que codifica una primer proteína de fusión de GPCR/proteína G en donde GPCR se muta en comparación con el GPCR nativo, volviéndolo así no funcional con respecto a su proteína G; (b) expresar una segunda construcción de ácido nucleico en dicha célula, dicha segunda construcción de ácido nucleico codificando una segunda proteína de fusión de GPCR/proteína G en donde la proteína G se muta en comparación con - 12 -la proteína G nativa, volviéndola así no funcional. (c) permitir que dichas proteínas fusionadas, primera y segunda, se ensamblen en un oligómero GPCR en la membrana celular. El método puede comprender además la etapa de aislar una parte de la membrana celular comprendiendo dicho compuesto. Esto puede lograrse al lisar la célula y aislar la membrana celular. Como se menciona arriba, el primer GPCR y el segundo GPCR pueden ser el mismo (homo-oligómero) o diferente (hetero-oligómero). El presente inventor cree que para que los GPCRs, primero y segundo, formen un oligómero, deben tener alguna afinidad entre sí. De acuerdo con lo anterior, el inventor ha contemplado un método mediante el cual esto puede determinarse. De esta manera, como un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar un primer y segundo GPCR teniendo afinidad entre sí, de manera que forman un compuesto (oligómero GPCR), dicho método comprendiendo las etapas de (a) producir o proporcionar una primer construcción de ácido nucleico codificando un primer GPCR y su proteína G asociada como una proteína de fusión en donde el GPCR se muta en comparación con el tipo salvaje de manera que es no funcional con respecto a su proteína G asociada; (b) producir o proporcionar una segunda construcción de ácido nucleico codificando un segundo GPCR y su proteína G - 13 -asociada en donde la proteína se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje de manera que es no funcional; (c) co-expresar dichas construcciones de ácido nucleico, primera y segunda, en una célula; y (d) determinar la presencia de un compuesto que comprende dichos GPCRs, primero y segundo. La presencia de un oligómero GPCR comprendiendo dichos GPCRs, primero y segundo, puede determinarse al contactar la célula con un ligando para dicho segundo GPCR y determinar si dicha proteína G se activa. Como antes, los GPCRs, primero y segundo, pueden ser diferentes. Cuando son diferentes, es preferible que ocurran de manera natural en la misma célula. Esto lo hace razonable para predecir que el oligómero pueda formarse en la naturaleza. Por esta razón, el método puede comprender además la etapa inicial de determinar que GPCRs están presentes en un tipo celular particular, es decir, que son endógenos a la misma célula. Como muchos GPCRs se han caracterizado completamente, esto puede lograrse al seleccionar los productos genéticos de una célula particular, por ejemplo, una pantalla a base de chips o técnicas tales como rt-PCR seguido por secuenciación. La determinación de GPCRs que tienen afinidad entre sí, es decir, son capaces de formar oligómeros, es de gran importancia farmacológica. Por ejemplo, la habilidad de dos receptores para formar oligómeros, (hetero u homo) puede ser específica del tejido. - 14 - De esta manera, estos oligómeros GPCR específicos del tejido pueden formar objetivos de fármaco importantes. La Tabla 1 indica una implicación médica ejemplificativa que puede asociarse con cada tipo celular. La producción de reactivos biológicos de acuerdo con la presente invención, por primera vez, abre la posibilidad de varios ensayos de selección que proporcionan maneras convenientes y confiables de determinar la función del oligómero, particularmente con respecto a la unión del ligando y la cascada de señalización celular subsiguiente. Por ejemplo, en un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar un efecto que un compuesto tiene en un oligómero GPCR, comprendiendo las etapas de: a) proporcionar una célula o membrana celular comprendiendo un reactivo biológico de acuerdo con el primer aspecto de la invención; b) contactar el compuesto con dicha célula o membrana celular; y c) observar un efecto que dicho compuesto tiene en el oligómero GPCR, particularmente en la señalización del oligómero GPCR. También de acuerdo con este aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un compuesto capaz de interactuar con un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo las etapas de - 15 - a) producir una célula que expresa un oligómero GPCR comprendiendo (i) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el primer GPCR es no funcional con respecto a la primer proteína G asociada; (ii) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; b) contactar dicha célula o membrana celular aislada de la misma con dicho compuesto; c) determinar si dichos compuestos interactúan con el oligómero GPCR. Debe entenderse que la célula o membrana celular comprendiendo el oligómero GPCR también puede comprender GPCR no funcionales, o un GPCR substancialmente no funcional, por ejemplo, un monómero comprendiendo ya sea el primer o segundo GPCR (i o ii), un dímero del primer GPCR (i/i), o un dímero del segundo GPCR (ii/ii). La ventaja de la presente invención es que la formación de estos monómeros o dímeros no afecta los resultados del método de selección debido a que, perteneciente a las mutaciones hechas a los GPCRs, primero y segundo, el único receptor funcional (capaz de estimular la proteína G e iniciar una cascada de señalización) es el oligómero que comprende al menos ambos GPCRs, primero y segundo. De esta manera, cualquier monómero u homo-oligómero (es decir. , ambos primeros GPCRs o ambos segundos GPCRs) no tendrán actividad, diferente tal vez a la actividad anterior, en comparación con el oligómero comprendiendo al menos ambos, un primer GPCR y un segundo GPCR. - 16 - La actividad anterior se entiende que significa menos del 20%, 15%, 10% o preferentemente 5% de actividad nativa o de tipo salvaje. La interacción del compuesto bajo prueba con el oligómero GPCR puede resultar en uno o más de un número de eventos biológicos. Por ejemplo, la interacción puede resultar en un cambio conformacional en el sitio de unión del ligando. Esto puede alterar la potencia de los ligandos naturales del receptor. Alternativamente, la interacción entre el compuesto y el oligómero GPCR puede resultar en una cascada de señalización del receptor celular indicando que el compuesto es un agonista potencial. El compuesto puede unirse a un sitio de unión del ligando presente en los monómeros GPCR nativos o puede unirse a un nuevo sitio de unión creado como un resultado de la oligomerización de GPCR. Un método de acuerdo al cuarto aspecto de la invención puede utilizarse para determinar nuevos ligandos (agonistas, antagonistas etc) que son capaces de unir el oligómero GPCR. Puede ser que estos ligandos sean diferentes a aquellos capaces de unir el oligómero GPCR. Puede ser que estos ligandos sean diferentes a aquellos capaces de unir y activar los monómeros GPCR correspondientes, o puede ser que el efecto de unión pueda ser diferente en comparación con aquel del monómero individual. Por ejemplo, la unión del ligando al oligómero, como opuesto a los monómeros correspondientes, puede resultar en una señal alterada, por ejemplo, incrementada o reducida, o puede resultar en una - 17 -trayectoria celular diferente activándose. Estas propiedades del oligómero receptor pueden determinarse todas utilizando el método de acuerdo al cuarto aspecto. Además, el compuesto bajo prueba puede tener lá habilidad de bloquear un ligando conocido, por ejemplo, un agonista, del oligómero GPCR. Para determinar esto, el compuesto puede contactarse con la célula en la presencia del ligando conocido, y la habilidad del ligando para activar el GPCR en comparación con su habilidad para activar el GPCR en la ausencia de dicho compuesto. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona además un método para identificar un compuesto teniendo la habilidad de modular la unión entre un oligómero GPCR y su ligando, dicho método comprendiendo a) producir o proporcionar una célula que expresa un oligómero GPCR comprendiendo (i) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el primer GPCR es no funcional con respecto a la primer proteína G asociada; (ii) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; b) contactar dicha célula con dicho compuesto en la presencia de dicho ligando c) comparar la habilidad de dicho ligando para unir el oligómero GPCR con la habilidad de dicho ligando para unir el GPCR bajo condiciones comparables pero en la ausencia de dicho compuesto. - 18 - De esta manera, el compuesto puede tener la habilidad de inhibir competitivamente la unión del ligando al GPCR o puede, de hecho, resultar en la unión incrementada y/o estimulación del receptor incrementada como un resultado de la unión del ligando, es decir, incrementa la potencia del ligando. Una posibilidad es que un tercer GPCR puede componerse con el oligómero GPCR y tiene un efecto aloestérico. Esto puede determinarse por el método anterior cuando el compuesto es un tercer GPCR. En esta situación, es preferible que el tercer GPCR tipo salvaje junto con los GPCRs, primero y segundo, tipo salvaje, se co-exprese en al menos un tipo celular. Como se menciona arriba, es posible que cuando dos GPCRs forman un oligómero, sus sitios de unión del ligando respectivos pueden alterarse y/o nuevos sitios de unión del ligando se forman. Estos pueden tener mayor importancia farmacológica. Por lo tanto, la presente invención proporciona además, como un quinto aspecto, un método para determinar la presencia de un sitio de unión del ligando, nuevo o alterado, en un oligómero GPCR que no está presente en el(los) monómero(s) correspondiente(s) , dicho método comprendiendo las etapas de a) contactar un compuesto con una primer célula que expresa un compuesto GPCR teniendo (i) un primer GPCR asociado con una proteína G en donde el primer GPCR se modifica de manera que es no funcional con respecto a dicha proteína G; y (¡i) un segundo GPCR asociado con una proteína G en donde la proteína G se - 19 -modifica de manera que es no funcional; b) contactar dicho compuesto con una segunda célula que expresa un primer monómero GPCR no modificado; y c) comparar el efecto del compuesto en la primer célula y la segunda célula para determinar la presencia de un sitio de unión del ligando, nuevo o alterado, creado por el oligómero GPCR. Donde el oligómero GPCR es un hetero-oligómero, es decir, comprende al menos dos GPCRs diferentes, el método puede comprender además la etapa de contactar el compuesto con una tercer célula que expresa un segundo monómero GPCR no modificado, y de nuevo, comparando el efecto del compuesto de la tercer célula para determinar la presencia de un sitio de unión del ligando nuevo o alterado, creándose como un resultado de oligomerización de dos o más GPCRs. Preferentemente, los monómeros GPCR, primero y segundo, no modificados (es decir, funcionales) se expresan en dicha segunda o tercer célula respectivamente, por medios recombinantes. La presencia de un nuevo sitio de unión del ligando puede determinarse por el hecho de que un compuesto particular es capaz de causar una cascada de señalización del receptor en la célula en contacto con el oligómero pero no en contacto con el(los) monómero(s) correspondiente(s). La presencia de un sitio de unión del ligando, alterado puede determinarse por el hecho de que la cascada de señalización del receptor se altera como entre el oligómero y el(los) monómero(s) - 20 -correspondiente(s), por ejemplo, la señal se incrementa o reduce, y/o la trayectoria de señalización se altera. El "efecto" del compuesto en la primer o segunda célula incluye su habilidad de unirse al oligómero GPCR (determinado, por ejemplo, al marcar el compuesto) y su habilidad para iniciar una cascada de señalización celular (determinada, por ejemplo, al detectar cambios en la actividad de compuestos de la trayectoria de señalización). Aún si los diversos sitios de unión del ligando permanecen sin cambiar después de la oligomerización del receptor, otros cambios en la función del receptor pueden ocurrir. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona además un método para determinar un cambio en la función de GPCR como un resultado de formar un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo (a) contactar un compuesto con una primer célula que expresa un oligómero GPCR teniendo (i) un primer GPCR asociado con una proteína G en donde el primer GPCR se modifica de manera que es no funcional con respecto a dicha proteína G; y (ii) un segundo GPCR asociado con una proteína G en donde la proteína G se modifica de manera que es no funcional; (b) contactar dicho compuesto con una segunda célula que expresa un primer GPCR no modificado y/o una segunda célula que expresa un segundo GPCR no modificado; y (c) comparar la función de dicho oligómero GPCR con - 21 -aquella de dicho primer GPCR no modificado y/o con aquella de dicho segundo GPCR para determinar un cambio en la función del receptor resultante de la oligomerización. En los métodos descritos arriba para determinar los compuestos capaces de activar un olígómero GPCR (por ejemplo, de acuerdo con el cuarto aspecto) y para determinar la presencia de un sitio de unión del ligando nuevo o alterado causado por oligomerización de GPCR (por ejemplo, de acuerdo con el quinto aspecto), la persona experta puede elegir agregar mutaciones adicionales al primer y segundo GPCR para determinar adicionalmente cambios en la unión del ligando. La manipulación de al proteína GPCR se encuentra bien dentro de las capacidades de la persona experta. Por ejemplo, para todos los aspectos de la presente invención, puede ser posible modificar adicionalmente las proteínas de fusión GPCR en una forma constitutivamente activa. Ejemplos de métodos para activar constitutivamente secuencias GPCR se proporcionan en la Patente de EE.UU. No. 6,555,339 (incorporada en la presente para referencia) y PCT/US98/07496, WO 98/46995 (incorporadas en la presente para referencia). Los reactivos biológicos de acuerdo con la presente invención también permiten la determinación de acoplamiento de proteína G diferencial como entre monómeros, homo-oligómeros y hetero-oligómeros. A manera de ejemplo, la presente invención permite que un método se lleve a cabo para evaluar si los homodímeros (por - 22 -ejemplo, AA o BB) se acoplan a una proteína G diferente que un heterodímero (por ejemplo, AA o BA), comprendiendo las etapas de (a) producir o proporcionar una pluralidad de proteínas de fusión cada una comprendiendo un GPCR (por ejemplo, A y B) fusionado a una de una pluralidad de diferentes proteínas G cubriendo todas las principales clases de proteína G (por ejemplo, Gs, Gq y Gi). Por ejemplo, un par contendrá un receptor que se vuelve inactivo por mutación en el segundo ciclo intracelular que se fusiona a Gs. El segundo receptor en este par tendrá un receptor funcional fusionado a una Gs mutada de manera que la mutación vuelve a la proteína G inactiva. El segundo par contendrá un receptor que se vuelve inactivo por mutación en el segundo ciclo intracelular que se fusiona a Gq. El segundo receptor en este par tendrá un receptor funcional fusionado a un Gq mutado de manera que la mutación vuelve a la proteína G inactiva. El tercer par contendrá un receptor que se vuelve inactivo por mutación en el segundo ciclo intracelular que se fusiona a Gi. El segundo receptor en este par tendrá un receptor funcional fusionado a un Gi mutado de manera que la mutación vuelve a la proteína G inactiva. Otras proteínas G tale como G12 y G13 pueden evaluarse en una manera similar. (b) producir o proporcionar una proteína de fusión de control para cada proteína G que tiene un receptor funcional - 23 -completamente no modificado (A o B) y una proteina funcional G completamente no modificada. De esta manera, para cualquier proteína G varias construcciones se harán: (a) receptor A, donde el receptor se muta, se fusionará a Gs, Gi y/o Gq completamente funcionales (b) receptor B, donde el receptor es funcional, se fusionará a Gs, Gi y/o Gq mutadas (c) receptor A, donde el receptor es funcional, se fusionará a una Gs, Gi y/o Gq mutada (d) receptor B, donde el receptor se muta, se fusionará a Gs, Gi y/o Gq, completamente funcionales (e) fusiones completamente funcionales de Gs, Gi y Gq se harán para cada uno del receptor A y B. Varias transfecciones celulares pueden llevarse a cabo para comparar el acoplamiento relativo para cada una. Por ejemplo, para comparar la eficiencia del acoplamiento de Gs entre el homodímero y heterodímero, ocurrirá lo siguiente: (a) la primer célula se transfectará con una combinación de a) y b) de arriba. (b) la segunda célula se transfectará con una combinación de c) y d) de arriba. (c) la tercer célula se transfectará con una fusión completamente funcional del receptor A (d) la cuarta se transfectará con una fusión - 24 -completamente funcional del receptor B. La respuesta de cada combinación se comparará para valorar la potencia de los agonistas con el receptor A y B y actividad constitutiva. Este proceso se repetirá para cada proteína G. Jürgen Wess (Pharm . Ther. Vol. 80, No. 3 1998) incorporada en al presente para referencia proporciona información acerca de la base molecular de la selectividad de acoplamiento del receptor/proteína G.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGU RAS Los aspectos y modalidades de la presente invención se ilustrarán ahora, a manera de ejemplo, con referencia a las fig uras acompañantes. Los aspectos adicionales y modalidades serán aparentes para aquellos expertos en la materia. Todos los documentos mencionados en este texto se incorporan en la presente para referencia. La figura 1 muestra un diagrama esquemático de cómo se contempla que ocurre la reconstitución de la función por pares de mutantes. Esta figura ejemplifica el uso de GPCRs fusionados a una proteína G que típicamente resulta en la elevación de las concentraciones de calcio intracelular. La figura 2 muestra un diagrama esquemático de cómo solamente una fusión de GPCR/proteína G del oligómero (en este caso un dímero) es funcional y formas homoméricas son no - 25 -funcionales. La figura 3 muestra una representación de varios GPCRs clase A y sus proteínas G asociadas, así como también residuos (resaltados) en el 2do ciclo intracelular del GPCR que son adecuados para mutación. La figura 4 muestra que los pares de distintos mutantes no funcionales de las proteínas de fusión a1 -adrenoceptor-Giia, reconstituyen la función. A. Membranas de células HEK293 que expresan 40 (I-IV) o 80 (V) fmol de varias proteínas de fusión 1 b-adrenoceptor-G11 ct, se utilizan para medir la unión de [35S]GTPyS en la ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de 10 µ? fenilefrina. (1 ) a1 b-adrenoceptor-G-p a tipo salvaje, (2) a -adrenoceptor-GIy208AlaG1 a, (3) Leu 51Aspaib-adrenoceptor-G-i a, (4 y 5) a1 b-adrenoceptor-GIy203G 1 a + Leu151Aspoc1 b-adrenoceptor-G11 a. B. Leu 51Aspciib-adrenoceptor-G11 a y 1 b-adrenoceptor- Gly208AlaG11 a reconstituyen la función solamente cuando se coexpresan. La unión de [35S]GTPyS en la ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de 10 µ? fenilefrina se mide en membranas de célula HEK293 en las cuales Leu s1Aspa1 b-adrenoceptor-Giia y aib-adrenoceptor-Gly208AlaG11 a se co-expresan (1 ) o en las cuales las dos construcciones se expresan en poblaciones celulares separadas que se mezclan antes de la preparación de la membrana (2) o de la cual las membranas se hacen por separado y después se mezclan antes del ensayo (3). - 26 - La figura 5 muestra que los pares de distintos mutantes no funcionales de proteínas de fusión de receptor de histamina H1-G11a también reconstituyen la fusión. Las membranas de las células HEK293 expresando 25 (1-4) o 50 (5) fmol de varias proteínas de fusión de receptor de histamina H1-G a se utilizan para medir la unión de [35S]GTPyS en la ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de 1mM histamina. (1) receptor de histamina H1-Giia tipo salvaje, (2) receptor de histamina H1-Gly208AlaG11a, (3) receptor de histamina H1 Leu 33Asp-G11ct, (4 y 5) receptor de histamina H1-Gly208AlaG11ct + receptor de histamina H1 Leu 33Asp- La figura 6 muestra dimerización de GPCR y reconstitución funcional en células únicas. Las células EF88 (fibroblastos de embrión de ratón derivados de un animal en el cual los genes que codifican las proteínas G de movilización de calcio, Gqa y G,,a se inactivan), se transfectan para expresar las proteínas de fusión GPCR-Gna y GFP y la habilidad de los ligandos del agonista para elevar Ca2+ intracelular monitoreada. A. células EF88 se transfectan con GFP y receptor de histamina H1-G11o (negro, n = 6), receptor de histamina H1 -Gly208AlaG11ct (azul, n=10), receptor de histamina H1 Leu133Asp -Gna (verde, n=12) y ambos receptor de histamina H1-Gly208AlaGna y receptor de histamina H1 Leu133Asp-G11ct (rojo, n=8). La respuesta de células positivas GFP a 1mM histamina se mide entonces. N= el número de células cuantificadas individuales. - 27 - B. Solamente las células transfectadas positivamente responden al agonista. Las células se co-transfectan con el la fusión del receptor-Gua de histamina tipo salvaje y GFP. En este campo se muestra solamente un GFP expresado por la célula única (izquierda). Básico (centro) y 1 mM histamina (derecha) de Ca2+ estimulado se monitorea entonces en estas células. El color más oscuro representa [Ca2+] elevado. Solamente un incremento (color más oscuro) en fluorescencia se observa en la célula que expresa GFP. La figura 7 muestra dimerización GPCR y reconstitución funcional en células únicas. Específicamente, esta figura muestra la habilidad de dos GPCRs diferentes para formar un oligómero, es decir, un hetero-oligómero. A. Las células EF88 se transfectan para co-expresar una forma no funcional (Leu133Asp) del receptor de histamina H1 fusionada G 1 a tipo salvaje y la forma tipo salvaje de aib-adrenoceptor fusionada a la forma inactiva (Gly208Ala) de G1 1 a). Ambas de estas fusiones de GPCR-proteína G son inactivas cuando se expresan solas debido a que cada una forma un homodímero no funcional. La co-transfección con GFP permitió la detección de células transfectadas positivamente. La adición de fenilefrina (10µ?) resultó en una elevación de concentración de calcio intracelular pero la adición de histamina (1 mM) resultó en poco o nada de cambio en concentración de calcio. Esto puede solamente reflejar que la ocupación del a1 b-adrenoceptor por la fenilefrina del agonista resulta en la activación de Gna tipo salvaje que se enlaza físicamente al receptor de histamina H 1 inactivo - 28 -y refleja la presencia de un heterodímero de a b-adrenoceptor-receptor de histamina H 1 funcional. B. En una manera análoga las células EF88 también se transfectan para co-expresar una forma no funcional (Leu151Asp) de a1 b-adrenoceptor fusionado a G tipo salvaje y la forma tipo salvaje del receptor de histamina H 1 fusionado a la forma inactiva (Gly208Ala) de G1 1 a. En este formato, la adición de fenilefrina (10 µ ) resultó en poco o nada de cambio en concentración de calcio, mientras que la adición de histamina (1 mM) resultó en elevación de calcio intracelular. La figura 8 muestra la co-inmunoprecipitación de formas diferencialmente marcadas de epítope de ambos GPCRs y fusiones de GPCR-proteína G y demuestra que la adición de la proteína H a la parte posterior de terminal C de un GPCR no previene la dimerización. A. construcciones de a1 b-adrenoceptor. B. construcciones del receptor de histamina H 1 . Las células HEK293 se transfectan de manera similar (control) o se transfectan para expresar ya sea FLAG, c-myc o una combinación (FLAG+myc) de ambas formas marcadas de epítope de los GPCRs aislados o fusiones de GCPR-proteína G. Las células que expresan ya sea FLAG o formas marcadas c-myc también se mezclan (mezcla). Las muestras se inmunoprecipitan con anticuerpo anti-FLAG, estos precipitados se resolvieron por SDS-PAGE y se inmunomancharon con anticuerpos anti c-myc. La figura 9 muestra que trFRET demuestra oligómeros de - 29 -la superficie celular de tanto GPCRs como fusiones de GCPR-proteína G. A. construcciones de 1 -adrenoceptor. B. construcciones de receptor de histamina H1 . las células HEK293 se transfectan individualmente (mezcla) para expresar ya sea FLAG o formas marcadas con c-myc de los GPCRs aislados o fusiones de GPCR-proteína G. Estas células se mezclan entonces juntas. Las células HEK293 también se transfectan para co-expresar FLAG y formas marcadas con epítope c-myc de los GPCRs aislados o fusiones de G PCR-proteína G (contransf) . Las células se exponen entonces a anticuerpos anti-c-myc marcados con Eu3 y anticuerpos anti-FLAG marcados con aloficocianina (ver métodos) . La transferencia de energía se monitorea entonces como se describe en McVey et al., (2001 ) . La transferencia de energ ía es consistente con FLAG y polipéptidos marcados con c-myc formando com puestos físicos (dímeros) . Cuando se expresan en diferentes células la distancia entre FLAG y polipéptidos marcados con c-myc es demasiado grande para permitir la efectiva transferencia de energía y cuando en diferentes células no pueden interactuar. Estos experimentos de esta manera, actúan como un control negativo. La figura 1 0 muestra que la co-expresión de pares de fusiones de GCPR-proteína G no funcionales debe generar 50% de dímeros activos. Si dos distintos GPCRs o proteínas de fusión de GCPR-proteína G se co-expresan en una sola célula y la afinidad de interacción de A con A es la misma entre A y B entonces casualmente - 30 -debe esperarse que AA, AB, BA y BB estarán presentes en cantidades equimolares. Como se demuestra en la figura 2, la metodología desarrollada por los inventores asegura que AA y BB no responden funcionalmente a la adición de ligandos a ya sea A o B. Sin embargo, tanto AB como BA son potencialmente funcionales en adición de los ligandos para ya sea A o B (ver Figura 7C). De esta manera, solamente el 50% de los dímeros que forman la siguiente coexpresión de A y B se espera que sean funcionales y estos son la combinación de cada una de las proteínas de fusión diferentemente mutadas, por ejemplo, AB o BA. La figura 1 1 muestra el a1 b-adrenoceptor y el receptor de histamina H 1 puede formar los compuestos hetero-diméricos. A. Una forma marcada con FLAG del receptor de histamina H1 (flag H 1 ) y una forma marcada con c-myc del oc1 b-adrenoceptor (mycccib) se expresan ya sea individualmente o juntos (flag + myc) en células HEK293. Las células que expresan las dos construcciones individualmente también se mezclan antes del análisis. Las muestras se inmunoprecipitan con anti-FLAG y después SDS-PAGE y se transfieren, inmunomanchan con anticuerpos anti-c-myc. B. Células ya sea co-expresando FLAG H1 y c-myc a1b (barras rellenas) o poblaciones separadas de células expresando cualquiera de las dos construcciones que se mezclan entonces, se trataron con una combinación de anti-c-myc marcado con Eu3+ y anticuerpos anti-FLAG marcados con APC se agregan y midieron por tr-FRET. La figura 12 muestra que la co-expresión de una forma - 31 -inactiva del a1b-adrenoceptor suprime la señalización por una proteína de fusión de receptor de histamina H1-G11a. Las células HEK293 se transfectan para expresar la proteína de fusión de receptor de histamina H1-G11a y con cantidades crecientes de cADN codificando el a1b-adrenoceptor Leu151Asp inactivo, aislado. (A) Membranas de estas células se utilizan para medir la expresión de la proteína de fusión de receptor de histamina H1-Gii„ y cantidades que contienen 25fmol de sitios de unión [3H]mepiramina específicos se utilizan para medir la unión básica y [35S]GTPyS estimulada por 1 mM de histamina (B) células EF88 se transfectan para expresar la proteína de fusión de receptor de histamina H1-Gi1(X (1) o co-expresar este con a1b-adrenoceptor Leu151Asp. La habilidad de 1mM histamina para elevar [Ca2+]i celular se valora entonces. Los datos representan promedios +/- S.E.M n=6. La figura 13 muestra que la provisión de G a objetivo de membrana en exceso no considera la reconstitución de la función en células que expresan pares de mutantes no funcionales. Las células HEK293 se transfectan para expresar la proteína de fusión de a^-adrenoceptor-G-pa marcada con c-myc (1), G(1a enlazada al término C de una forma marcada con c-myc del terminal N y la primer región de transmembrana del a1b-adrenoceptor (2), tanto el a1b-adrenoceptor como la construcción c-myc-Nt-TM1a1b-G 1a (3) o c-myc-Nt-TM1ccib-G11ce y la proteína de fusión a1b-adrenoceptor-Gly208AlaG11a (4). (A) muestras de membrana se resuelven por SDS-PAGE e inmunomancha con anticuerpos anti-c-myc. (B) básico (barras abiertas) y 10 µ - 32 -estimulación de fenilefrina (barras rellenadas) de unión de [35S]GTPyS recuperado en inmunoprecipitados anti-c-myc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La figura 1 muestra una representación de cómo el inventor contempla que la reconstitución de la función por pares de mutantes puede ocurrir, formando así un oligómero funcional. Como puede observarse el oligómero funcional se constituye de una primer proteína de fusión (a) comprendiendo un GPCR nativo y una proteína G mutante y una segunda proteína de fusión (b) comprendiendo un GPCR mutante y una proteína G nativa. Cuando estas dos proteínas de fusión combinan activación funcional de GCPR, ocurre la cascada de señalización por ligando de agonista uniéndose a GPCR nativo de la primer proteína de fusión y acoplamiento funcional y señalización a través de la proteína G de la segunda proteína de fusión. La figura 2 muestra como se contempla que los homodímeros no funcionales se forman. Los homodímeros no funcionales comprenden ya sea 2 GPCRs nativos y dos proteínas G mutantes (a), o dos GPCRs mutantes y dos proteínas G nativas (b). En cualquier caso, las 2 formas de homodímero no pueden conducir a señalización funcional cuando un ligando apropiado se une al GPCR. GPCR y proteína G asociada GPCR y proteína G pueden ser cualquier combinación de GPCR/proteína G apropiada. Una lista no exclusiva de GPCRs puede - 33 -encontrarse en http:/fwww. gpcr.org/7tm/. Preferentemente, GPCRs y proteínas G son de origen mam ífero, más preferentemente de origen humano. Los receptores acoplados a la proteína G típica son, por ejemplo, receptores de dopamina, receptores colinérgicos muscarínicos, receptores a-adrenérgicos, receptores ß-adrenérgicos, receptores de opiato, receptores canabinoideos, receptores de serotonina, receptores de somatostatina, receptores de adenosina, receptores de endotelio, receptores de quimoquina, receptores de melanocortina, receptores de neuropéptido Y (NPY) , receptores GnRH, receptores GR. , receptores TSH, receptores LH y receptores FSH. Otros GPCRs que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen (junto con sus ligandos) en Trends in Pharmacological Sciences: Ion Channel Nomenclature Supplement compilado por S. P. H . Alexaqnder & J. A. Peters, 1 1 th Edition , Current Trends, Londres, UK 2000, y The RBl Handbook of Receptor Classification and Signal Transduction, . J . Watling , J. W. Kebabian, J . L. Neumeyer, eds. Research Biomedicals I nternational , Natick, Mass. , 1 995. Vassilatis et al., PNAS, Abril 2003, vol. 1 00, 4903-4908. Estas referencias se incorporan en la presente para referencia. Es preferible para todos los aspectos de la presente invención que los GCPRs, primero y segundo, sean diferentes, se coexpresan endógenamente por al menos un tipo celular. GPCRs se agrupan actualmente en 3 clases principales -A, B & C. La clase A también llama a los receptores de la familia de rodopsina o similar a rodopsina, la clase B son los receptores - 34 -similares a secretina, clase C son los receptores metabotrópicos. Aunque todos son GPCRs, las tres familias no tienen similitudes en secuencia y parecen haber sido un ejemplo de evolución convergente. Ejemplos en la Clase A incluyen receptores para catecolaminas tales como adrenalina, histamina, dopamina y serotonina así como también receptores para (neuro) péptidos incluyendo los péptidos opioides, neuroquininas, orexinas, etc. Los receptores olfatorios son también parte de este grupo. Los receptores de la Clase B son en total alrededor de 65 y los receptores de la Clase C son aproximadamente 18, estos incluyen el receptor GABAb, el receptor detector de calcio y una familia de siete receptores de glutmato metabotrópico. Existen otras familiar de proteínas que aún tienen que clasificarse de manera conclusiva como GPCRs. Estas incluyen la familia de receptores "rizados" y los receptores "Methuselah". La proteína G puede ser cualquier proteína G capaz de asociarse/acoplarse con un GPCR. La proteína G preferentemente tiene la habilidad de modular un nivel intracelular de Ca2+, cAMP, cGMP, ¡nositol 1 , 4, 5 trifosfato, diacilglicerol, actividad de quinasa C de proteína, o actividad de quinasa MAP. Por ejemplo, la activación de Gi, Go, o Gz conduce a una reducción del nivel intracelular de cAMP. La activación de Gq, G1 1 , G 15, o G16 conduce a un incremento en el nivel intracelular de inositol 1 , 4, 5 trisofato y Ca2+. La proteína G puede también seleccionarse del grupo que consiste de Gi, Go, Gz, G 1 1 , G 12, G 13, G 15, G16, Gs y Gq. - 35 - Además de aquella identificada en la presente, se encuentra bien dentro de la experiencia del lector experto identificar GCPRs adicionales en base a la información de la secuencia. Todos los GPCRs poseen siete regiones altamente hidrofóbicas que son lo suficientemente largas (20-25 aminoácidos) para cruzar la membrana de plasma. Dentro de estos, se encuentran substancialmente siembre algunos aminoácidos. Por ejemplo, en GPCRs Clase A virtualmente siempre existe una secuencia ácido aspártico-arginina-tirosina o algo muy similar (esto se denomina el dominio DRY debido al código de aminoácido de una sola letra para ácido aspártico (D)-Arginina (R)-Tirosina (Y). El experto puede también conducir la búsqueda con algoritmos matemáticos tales como el método "Hidden Markov" para identificar GPCRs adicionales. Convenientemente, GPCR puede ser un GCPR clase A, ejemplos de los cuales, junto con sus proteínas G asociadas, se muestran en la figura 3.

Modificación de GPCR y proteína G La figura 3 también muestra residuos altamente conservados en el 2do ciclo intracelular del GPCR que, por ejemplo, son adecuados para mutación y vuelven al GPCR substancialmente no funcional. La mutación de estos residuos se ha mostrado por el inventor por ser particularmente eficaz en volver un GPCR inactivo pero aún capaz de unir ligandos. Además, como los residuos hidrofóbicos son altamente conservados, se contempla que todos los - 36 - GPCRs clase A pueden mutarse de esta manera para volverlos inactivos. Típicamente, el residuo es uno hidrofóbico, que puede mutarse en un residuo ácido mediante, por ejemplo, técnicas de mutagénesis dirigidas en sitio conocidas en la materia. Sin embargo, cualquier otra mutación que vuelve al GPCR funcionalmente inactivo o substancialmente inactivo de manera funcional, puede llevarse a cabo y sus actividades/falta de actividad probarse utilizando los ensayos descritos en la presente después en relación al ensayo de la actividad del heterodímero. Es decir, un ensayo funcional para un GPCR nativo puede llevarse a cabo en un GPCR mutagenizado para acertar que grado de actividad permanece después de la mutagenización. Si una primer vuelta de mutagénesis no es suficiente para volver un GPCR inactivo, una vuelta adicional de mutagénesis puede llevarse a cabo y la actividad probarse después. También es posible conducir la mutagénesis aleatoria o evolución molecular aplicada y después probar la actividad de los mutantes. Además, las estructuras de cristal de las proteínas G se conocen y son residuos importantes identificados de los mismos, de manera que la mutagénesis objetivo puede llevarse a cabo. Un sitio web públicamente disponible (http://ww.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) puede utilizarse por la persona experta para identificar los dominios de transmembrana con la estructura GPCR. Esto permite que la mutagénesis dirigida en sitio se lleve a cabo para determinar mutantes que vuelven al GPCR inactivo pero aún capaz de unirse al ligando. El 2do ciclo intracelular - 37 - (IC2) se definiría como el segmento de polipéptido entre la transmembrana (TM)3 y TM4. Este sitio, al menos, proporcionaría guía con respecto a la identificación de la proximidad de una secuencia de aminoácidos GPCR que uno desearía alinear con las secuencias IC2 en la figura 3 para el propósito de hacer mutaciones análogas. GPCRs de membrana mencionadas en la presente se modifican típicamente por la fusión de una proteína G asociada al receptor. Típicamente, el ácido nucleico codificando la proteína G puede fusionarse en cuadro al extremo 3', de un gen que codifica GPCR particular del cual el codón de detención se ha eliminado. De esta manera, en expresión del ácido nucleico, la proteína reportadora se expresa funcionalmente y fusiona al extremo de terminal C del GPCR. La modificación del receptor es tal que la funcionalidad del receptor de membrana permanece substancialmente sin afectar por fusión de la proteína G al receptor. La mutación que puede llevarse a cabo en la proteína G, puede ser cualquier mutación adecuada que vuelve la proteína G no funcional (es decir, incapaz de unir funcionalmente GTP e iniciar la cascada de señalización de GPCR). De nuevo, esto puede probarse fácilmente por el experto utilizando los ensayos descritos en la presente. Una mutación adecuada que puede hacerse es la mutación de la glicina en la posición 208 de G1 a a, por ejemplo, alanina. Todas las proteínas G poseen la glicina en la posición 208, o sitio/residuo equivalente y así una mutación equivalente se contempla - 38 -para volver a otras proteínas G inactivas. Otras mutaciones adecuadas pueden identificarse fácilmente como aquellas que afectan las secuencias que permiten que las proteínas se unan e hidrolicen GTP. A la fecha, las secuencias de proteína G se han observado como siendo altamente conservadas a través de la evolución y las secuencias identificadas como incluyéndose en permitir que las proteínas se unan e hidrolicen GTP, son altamente conservadas. Es por lo tanto una tarea relativamente directa para ser capaz de acoplar cualquier receptor (nativo o muíante) a una proteína G apropiada (nativa o muíante).

GPCRs constitutivamente activos y genómicos funcionales. Tal vez la etapa más retadora en el desarrollo de fármacos hoy en día se refiere con la validación objetiva. Los esfuerzos de secuenciacion de genoma humano, tanto públicos como privados, que han florecido recientemente, han proporcionado números sin precedentes de objetivos genéticos para desarrollo farmacéutico. El desciframiento de la funcionalidad y, más importantemente, la relevancia terapéutica potencial de estos objetivos genéticos, es de alta prioridad como la base para el desarrollo de terapéuticos de la siguiente generación. Este reto es de magnitud no mayor que dentro de la familia genética de GPCR donde grandes números de nuevos genes se han identificado. Habiendo identificando GPCRs mostrando alta o selectiva expresión dentro de los tejidos de interés, es posible refinar además el análisis al nivel - 39 -celular. Esto puede incluir utilizar tanto sondas de ARN como anticuerpos para trazar las poblaciones celulares dentro de los tejidos q ue expresan cualquier GPCRs de interés. Para GPCR huérfanos con ligando no identificado, las formas constitutivamente activas del receptor pueden emplearse entonces como una herramienta para investigar además sus papeles funcionales. Tal planteamiento, en esencia, simula el efecto de la estimulación del ligando en el GPCR objetivo. Por ejem plo , los GPCRS huérfanos se han identificado, los cuales se expresan selectivamente dentro de las células B pancreáticas como un medio para identificar objetivos potenciales para regular la secreción de insulina. La examinación de la forma constitutivamente activa de tal receptor, "receptor de isleta 1 ", en sistemas ¡n vitro confirma q ue el receptor se acopla a las moléculas de señalización celular apropiadas (ciclasa adenilato) para regular la liberación de insulina. Además, la utilización de este receptor constitutivamente activo en una estirpe de célula que produce insulina confirma que la forma activa del receptor aumenta la liberación de insulina sensible a glucosa. Estos datos proporcionan información altamente sugestiva q ue soporta el desarrollo de agonistas GPCR de "isleta 1 "como un medio para regular la liberación de insulina. Para examinar la expresión de GPCR com prensivamente, un chip de GPCR de oligonucleótido se ha sintetizado por Arena Pharmaceuticals I nc. , 6166 Nancy Ridge Drive, San Diego, CA 92121 , USA. , q ue contiene todas las secuencias de GPCR humano - 40 -disponibles, así como también los marcadores para función celular y estado de la enfermedad. Este planteamiento permite la rápida identificación de los perfiles de expresión genética para GPCRs a través de una amplia variedad de tejidos humanos en una macro escala. El análisis por grupo también puede aplicarse para identificar los patrones específicos de tejido de la expresión genética que puede indicar papeles funcionales. La valoración de la distribución de tejido de GPCRs y moléculas de señalización relacionadas, puede por lo tanto, clarificar la complejidad de los mecanismos moleculares mediante los cuales la señalización del receptor traduce los estímulos extracelulares. La secuenciación del genoma humano ha traído nuevas vías mediante las cuales planteamientos globales pueden tomarse para investigar el momento de señalización de GPCR. Ahora se estima que la superfamilia de GPCR consiste de 600-1000 receptores. La vía de tecnología de microconjunto permite que un gran muestreo de la familia de receptores se realice. Esta tecnología permite a uno monitorear los niveles de mensaje de miles de genes simultáneamente en una muestra dada. La evaluación de los niveles transcripcionales para estos genes a través de un gran panel de tejidos proporcionaría así una vista global de señalización de GPCR en el cuerpo humano.

Células adecuadas para expresión de proteína G y GPCR modificado Una variedad de células puede utilizarse para expresar las construcciones de ácido nucleico que codifican las proteínas de - 41 -fusión de la presente invención. Todas las células que pueden transfectarse para expresar los GPCRs modificados se consideran dentro del alcance de al invención. Ejemplos de tales células incluyen células neonatales, células endocrinas, células tumorales, células acinares, células de isleta, células inmunes, células neuroendocrinas, células neuronales, y células pituitarias. También se encuentra dentro de las capacidades de la persona experta determinar otras estirpes de célula que son capaces de expresar los GPCRs modificados de acuerdo con la invención, por ejemplo, células CHO (ovario de hámster chino) (CHO-K1 ) y células HEK (riñon embriónico humano). Para llevar a cabo los ensayos de la presente invención, es preferible utilizar estirpes de célula que no expresan ningún GPCR endógeno a altos niveles. CHO-K1 es un ejemplo de tal estirpe de célula. Ciertas células pueden elegirse para expresar los oligómeros GPCR de la presente invención perteneciendo a su habilidad de reacción a la cascada de señalización GPCR. Por ejemplo, en los ensayos para determinar un ligando para un oligómero GPCR, puede ser conveniente para expresar el GPCR en una célula que tiene un cambio detectable en característica en la activación del receptor, por ejemplo, células de pigmento. US 5,462,856 (incorporada en la presente para referencia) describe métodos para desarrollar bioensayos rápidos y sensibles para evaluar nuevos agonistas y antagonistas para GPCRs utilizando estirpes de célula de - 42 -pigmento. Los ensayos para determinar la actividad GPCR se tratan en más detalle abajo. De acuerdo con lo anterior, las células de pigmento que pueden transfectarse con construcciones de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención incluyen cromatóforos, melanoforos o melanocitos, xantoforos, eritroforos, leucoforos e ¡ridoforos. Tales células pueden obtenerse convenientemente de animales inferiores tales como Reptiles, por ejemplo, Anolis sp: Anfibios, por ejemplo. , Xenopus laevisk^ Peces, por ejemplo, Zaceo temmincki; Crutáceos, por ejemplo, Uca pugilator; Equinoderma, por ejemplo, Diadema antillarum y Cinidiaria, por ejemplo, Nanomsa cara. Las células de pigmento particularmente preferidas para utilizarse en la presente invención son melanoforos cultivados de Xenopus lavéis (Pigment Cell 1 985), ed. Bagnara et al., Universidad de Tokio Pres, páginas 219-227) y Lerner eí al., (1988) P. N.A. S. USA, 85: 261-264. Utilizando construcciones de ácido nucleico para transfectar una célula se encuentra bien dentro de las capacidades de la persona experta en la materia. Los métodos estándar incluyen lipofectamina, precipitación de fosfato de calcio, electroporación, disparadores genéticos, liposomas y vectores virales. Un vector de expresión, por ejemplo, plásmidos, vector viral, etc. , es una construcción de ADN replicable en la cual el ácido nucleico se enlaza operablemente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión de la fusión del receptor de membrana/reportador en la célula particular. Las secuencias de control típicas pueden incluir un promotor transcripcional, una - 43 -secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión ribosomales de mARN adecuados, y secuencias que controlan la terminación de transcripción y/o traducción. Típicamente, los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, bacteriófagos o virus y tales vectores pueden integrarse en el genoma del huésped o replicarse autónomamente en la célula particular. Una variedad de vectores de expresión se encuentran disponibles para la persona experta. Un vector preferido es pCMV que se deposita en ATCC bajo número de depósito ATCC#203351 . Para que la célula particular expresa las proteínas de fusión de GPCR mutante/proteína G, la célula debe transformarse por el vector de expresión apropiado. "Transformación", como se utiliza en la presente, se refiere a la introducción de un fragmento de polinucleótidos heterólogo en una célula huésped, irrespectivo del método utilizado, por ejemplo, toma directa, transfección o transducción. La presente invención, por lo tanto, también se refiere a células que se han transformado por construcciones de ácido nucleico que comprenden fusiones de GPCR mutante/proteína G de la presente invención y que expresan las proteínas de fusión GPCR mutante/proteína G. En los métodos de la presente invención, las células pueden lisarse antes de utilizarse, de manera que solamente las membranas celulares, en las cuales GPCR se ubica, pueden utilizarse. - 44 - Ensayos para determinar actividad de GPCR Habiendo co-transfectado una célula con las construcciones de ácido nucleico que codifican los GPCRs modificados, puede entonces evaluarse para la unión de al menos un ligando específico por al menos el GPCR funcional (segundo). La actividad funcional de un oligómero GPCR de acuerdo con la presente invención puede determinarse por un número de técnicas estándar y bien conocidas. GPCRs son conocidos por afectar la actividad de adenilil ciciasa, para modular la conductancia de los canales de calcio con entrada de voltaje, para modular los canales de potasio, para activar la trayectoria de quinasa MAP, para activar la trayectoria de fosfolipasa C (PLC)-IP3, para activar la fosfatasa de fosfotirosina, para estimular la mutagénesis, para estimular la exocitosis, para estimular citostasis, para estimular quimotaxis e inducir la apoptosis. Estas actividades pueden medirse por la persona experta utilizando métodos de rutina y estándar. La actividad funcional también puede determinarse utilizando estas técnicas en ensayos para determinar un ligando del GPCR (ver abajo). La observación del efecto que dicho compuesto tiene en el funcionamiento del heterodímero GPCR puede llevarse a cabo al ensayar un nivel de un componente aguas debajo de dicha cascada de señalización GPCR. Un componente conveniente para detectar es un nivel/cambio en el nivel de calcio. Típicamente como iones de calcio. Como una alternativa para la detección de calcio, también es posible - 45 - Utilizar análogos de GTP, que se unen a la proteína G activa, como agentes de detección y también ensayos del gen reportador conocidos por aquellos expertos en la materia. El nivel de calcio citosólico dentro de las células normales y anormales puede detectarse por métodos conocidos por el experto que monitorea los niveles de calcio citosólico. Los tintes indicadores pueden utilizarse, por ejemplo, sondas fluorescentes 8tales como fura-2, fluo-3, o -4, indo-1 , quin-2) muestran una respuesta espectral al unir el calcio y entonces es posible detectar cambios en concentraciones de calcio libres intracelulares utilizando, por ejemplo, microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y espectroscopia de fluorescencia. La mayoría de los indicadores fluorescentes son variaciones de los queladores de calcio no fluorescentes EGTA y BAPTA. Otros objetos se obtienen de, por ejemplo, Moleclar Probes, Oregon USA. Adicionalmente, los presentes métodos son particularmente adecuados para el desarrollo de selecciones de alto rendimiento donde la detección puede llevarse a cabo utilizando por ejemplo, una cámara CCD, un luminómetro, o cualquier otro sistema de detección de luz adecuado. De esta manera, las células/membranas celulares pueden proporcionarse, por ejemplo, en placas de múltiples cavidades a las cuales las substancias prueba y reactivos necesarios para la detección de calcio ¡ntracelular pueden agregarse. Además, los instrumentos comercialmente disponibles tales como "lector de placas a base de formación de imágenes - 46 -flumétrica FLIPR (Molecular Devices Corp. , Sunnyvale, CA, USA) pueden utilizarse. Nuevos indicadores fluorescentes para calcio llamados "camaleones" también pueden utilizarse y se codifican genéticamente sin cofactores y son objetivos para ubicaciones intracelulares específicas. Estos así llamados "camaleones" consisten de fusiones aleatorias de un mutante que emite cian o azul de la proteína verde fluorescente (GFP), calmodulina, el péptido de unión a calmodulina M 13, y un GFP que emite amarillo o verde mejorado. La unión de calcio hace la envoltura de calmodulina alrededor del dominio M 13, incrementado (Miyawaki ef al., 1997) o reduciendo (Romoser et al., 1997) la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre GFPs flanqueantes. Otro método para la medición de la concentración de calcio intracelular es el uso de estirpes de célula sobreexpresando un GPCR y apoaecuorina, tal como se describe por Sheu et al., (1993). En este sistema, las células que expresan apoaecuorina se incuban con coelenterazina, que es el co-factor de aecuorina. Durante esta incubación, la coelenterazina entra a la célula y se conjuga con apoaecuorina para formar aecuorina, que es la forma activa de la enzima. En la incubación de las células con un agonista de GPCR, la concentración de calcio intracelular aumenta. Este incremento conduce a la activación de la actividad catalítica de aecuorina, que oxida coelenterazina y produce apoaecuorina, coelenteramida, C02 y luz. Una vez que el fotón se ha emitido, el compuesto debe disociarse y apoaecuorina debe recombinarse con una nueva molécula - 47 -de coelenterazina para ser capaz de emitir luz de nuevo. De esta manera, en este sistema, la medición de emisión de luz después de la adición del agonista refleja su habilidad de activar el GPCR y de esta manera, incrementar la concentración de calcio intracelular. Otros mecanismos de detección adecuados incluyen la detección de otros segundos mensajeros aparte de CA2+ por ejemplo, niveles de cAMP, niveles de cG P, niveles de inositol 1 , 4, 5 trifosfato, niveles de diacilglicerol, actividad de quinasa de proteína C o actividad de quinasa MAP). También es posible utilizar genes reportadores debido a que la activación de GPCRs generalmente resulta en cambios en la expresión genética con el tiempo (esto puede hacerse con reporteros acoplados a elementos promotores que responden a cambios en niveles de cAMP o activación de quinasas). Un método adicional utiliza melanocítos como se describe, por ejemplo, en US5,462,856 (incorporada en la presente para referencia) y US6,051 ,386 (incorporada en la presente para referencia), que describen métodos en los cuales las señales generadas por activación funcional de un GPCR, alteran el estado de agregación del pigmento en las células y la célula ya sea aparece más o menos opaca debido a la pigmentación, que es fácilmente detectada mediante, por ejemplo, medios colorimétricos. La alteración del estado de agregación puede resultar en agregación incrementada o conversamente una reducción en agregación (dispersión). - 48 - Ensayos Reportadores La señalización de los oligómeros GPCR también puede valorase utilizando una variedad de sistemas reportadores. Para medir cambios en niveles de cAMP intracelulares una construcción reportadora accionada por un promotor conteniendo elementos de respuesta AMP cíclicos (CRE) sería preferible. Para medir las respuestas accionadas de una trayectoria Gq que conduce a la activación de quinasa de proteína C, un sistema reportador sensible a P C sería preferible, ya que contiene sitios AP1 en su secuencia promotora. Otros reportadores sensibles a activación de quinasa MAP y reportadores conteniendo elementos de respuesta a suero (SREs) también podrían utilizarse para medir las respuestas de los oligómeros GPCR. Las moléculas reportadoras ellas mismas pueden variar y ejemplos de estas incluyen, luciferaza, beta-galactosidasa, beta-lactamasa, proteína verde fluorescente, proteína amarilla fluorescente y otras.

Determinación de la Unión del Ligando La presente invención se adecúa particularmente para determinar nuevos ligandos que se unen a un GPCR como un resultado de oligomerización. Los ligandos que ocurren de manera natural y sintéticos bien conocidos por la persona experta pueden probarse. Los ligandos prueba adecuados pueden venir de bibliotecas combinatorias, péptido e imitaciones de péptido, entidades químicas definidas, oligonucleótidos, y bibliotecas de productos naturales que - 49 -pueden seleccionarse por su actividad. En un planteamiento posible las substancias candidatas pueden, por ejemplo, utilizarse en una selección inicial en grupos, por ejemplo, 10 substancias por reacción, y las substancias de aquellos grupos que muestran un efecto se probaron individualmente. Típicamente, el ensayo puede utilizarse para seleccionar compuestos por su efecto en GPCRs de membrana particular. Los compuestos identificados como teniendo un efecto en un receptor de membrana particular pueden ser útiles, por ejemplo, para modular la actividad de receptores de membrana de tipo salvaje y/o mutantes, pueden utilizarse para elaborar la función biológica de receptores de membrana particulares; y/o puede utilizarse en selecciones para identificar compuestos que interrumpen las interacciones del receptor de membrana normales, o pueden, ellos mismos, interrumpir tales interacciones. El ensayo es particularmente adecuado para la detección de compuestos que sirven como agonistas inversos, antagonistas o agonistas del receptor de membrana. El término agonista inverso se entiende que significa un compuesto que cuando se une a un receptor, estabiliza selectivamente y de esta manera enriquece la proporción de un receptor en una conformación o conformaciones incapaces de inducir una señal aguas abajo. El agonista se entiende que significa un compuesto que cuando se une a un receptor, estabiliza selectivamente y de esta manera enriquece la proporción del receptor en una conformación o conformaciones capaces de - 50 -inducir una señal aguas abajo. El antagonista se entiende que significa un compuesto que cuando se une a un receptor no tiene habilidad selectiva para enriquecer ya sea las conformaciones activas o inactivas y de esta manera no alterar el equilibrio entre ellas. La presente invención, por lo tanto, se refiere, a agonistas inversos, antagonistas o agonistas de las proteínas receptoras identificadas utilizando los ensayos de acuerdo a la presente invención y al uso de tales agonistas, antagonistas o agonistas en el estudio de la función de GPCR de oligómero o dímero, o terapia. Lo siguiente proporciona ejemplos específicos para trabajar la presente invención, y resalta el trabajo llevado a cabo por el inventor resultando en la presente invención.

Materiales y Métodos Una estirpe de célula de fibroblasto (EF88) (Gohla et al., 1999) derivada de un ratón inconsciente de Gaq/Gar, doble, combinada (Offermans, ef al., 1998) fue regalo del Dr. M.l. Simón, California Institute of Technology, Pasadena CA. Todos los materiales para cultivo de tejido se suministran por Life Technologies Inc. (Paisley, Stratchlyde, UK). [3H]prazosina (80 Ci/mmol), [3H]mepiramina (30 Ci/mmol) y [35S]GTPyS (1250 Ci/mmol) fueron de NEN/Perkin Elmer. Los oligonucleótidos se compran de Cruachem (Glasgow, Strachlyde, UK). Los reactivos para transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resulta en tiempo fueron de Wallac. Los ligandos - 51 -receptores se compran de RBI (Gillingham, Kent, U. K. Producción y caracterización del CQ antisuero anti-Gq/Gn fue descrito por ( itchell et al., 1991 ; Mitchell et al., 1 993). La distribución difundida de Gq/G1 1 a detecta inm unológicamente por un anticuerpo antipéptido se dirigió contra el decapéptido de terminal C predicho. FEBS Lett. 287 , 171 -1 74. Todos otros químicos fueron de Sigma (Poole, Dorset, U. K.) y fueron del grado más alto disponible .

Construcción de proteínas de fusión La producción y subclonación de proteínas de fusión a1b-adrenoceptor-Ga1 1 mutadas y de tipo salvaje se realiza como se describe en (Carillo, et al., 2002) . La producción y subclonación de las proteínas de fusión de receptor de histamina H 1 de humano-G 1 ct se realiza en dos etapas separadas. En la primer etapa, utilizando el cebador de terminal amino 5'- GATACTGGGCTATCCAAGCTTATGAGCCTCCCCAATTCCTC-3'. un sitio de restricción Hindi (subrayado) se introduce por PCR ag uas arriba de la secuencia de codificación del receptor de histamina humano. Utilizando un cebador de terminal carboxilo 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGAGCGAATATGCAGAATTCTCT-3' un separador de tres aminoácidos (SerGIy-Arg) y un sitio de restricción Not\ se introducen inmediatamente aguas arriba del codón de detención. De manera similar, la secuencia de Gna de ratón se amplifica por PCR utilizando el cebador de terminal amino 5'- - 52 - AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGACTCTGGAGTCCATGATGGC-3' y el cebador de terminal carboxilo 5'- ATGAAACCGCTCGAGTCACACCAGGTTGTACTCCTTCAG-3'. Esto introdujo sitios de restricción Not\ y Xho\ flanqueando la secuencia de codificación G1 (X respectivamente. En la segunda etapa, el fragmento receptor amplificado se digiere con H/ndl l l/A/oíl y el fragmento G11 a se digiere con Not\IXho\ . Estos fragmentos se purifican y ligan en vector pcADN 3 (l nvitrogen) previamente digeridos con Hind\ \\/Xho\. La elección de ciclo intracelular 2 Leu a mutantes Asp se basa en los estudios de Greasley et al., 2001 . En la vasta mayoría de los GPCRs clase A la posición equivalente también es un aminoácido hidrofóbico (ver figura 2) . Tales mutaciones se introducen en las construcciones de proteína de fusión utilizando mutagénesis PCR por métodos estándar de mutagénesis dirigida en sitio (Sambrook et al., y Carillo et al., Manufactures Kit etc.) . Para co-inm unoprecipitación y estudios trFRET, los epítopes c-myc (EQKLISEEDL) o FLAG (DYKDDDDK) se introducen inmediatamente después de la metionina de terminal NH2. Cada construcción se secuenció completamente antes de su expresión y análisis (Mitchell eí al., 1991 ; Mitchell et al., 993).

Transfección transitoria de células HEK293 Las células HEK293 se mantienen en DMEM complementado con 0.292 g/litro L-glutamina y 10% (v/v) cercano de suero de bovino a 37°C en un 5% de atmósfera humidificada de C02. - 53 - Las células se desarrollan a 60-80% confluencia antes de la transfección trasitoria en platos de 60 mm . La transfección se realiza utilizando reactivo LipotectAMINE (Life Technologies, Inc.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Unión de Í35 S1GTPYS Los experimentos de unión de [35S]GTPyS se inician por la adición de membranas conteniendo cantidades definidas de las construcciones de fusión (ver Resultados para detalles) a un regulador de ensayo (20 mM HEPES (pH 7.4), 3 mM MgCI2, 100 m NaCI, 1 µ? guanosina 5'-difosfato, 0.2 M ácido ascórbico, 50 nCi [35S]GTPyS) conteniendo las concentraciones indicadas de ligandos receptores. La unión no específica se determina en las mismas condiciones pero en la presencia de 100 µ? GTPyS. Las reacciones se incuban por 15 min a 30°C y se terminan por la adición de 0.5 mi de regulador frío, conteniendo 20 mM HEPES (pH 7.4) , 3 mM MgCI2 y 100 mM NaCI. Las muestras se centrifugan a 16,000g por 15 min a 4°C, y las pildoras resultantes se resuspenden en regulador de solubilización ( 1 00 mM Tris, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 .25% Nonidet P-40) más 0.2% dodecilsulfato de sodio. Las muestras se predespejan con Pansorbin (Calbiochem) , seguido por inm unoprecipitación con antisuero CQ (Mitchell et al., 1 993). Finalmente, los inmunocompuestos se enjuagan dos veces con regulador de solubilización, y [35S]GTPyS unido medido por espectrometría de centelleo líquido. - 54 - Estudios de unión de ligando G3?1 Los estudios de unión de [3H]prazosina, para monitorear la expresión de las construcciones que contienen a1 b-adrenoceptor, se realizan como en (Carillo, ef al., 2002) . Los ensayos de unión de [3H]mepiramina, para monitorear la expresión de las construcciones que contienen el receptor de histamina H 1 se inician por la adición de 3 µ9 de membranas celulares a un regulador de análisis (50 m Tris-HCI), 1 00 mM NaCI, 3 mM MgCI2, pH 7.4) conteniendo [3H]mepiram ina (0. 1 -10 nM) . La unión no específica se determina en la presencia de 100 µ? mepiramina. Las reacciones se incuban por 30 min a 25°C, y el ligando unido separado del libre por filtración al vacío a través de filtros G F/B. Los filtros se enjuagan dos veces con regulador de ensayo, y el ligando unido se estimó por espectrometría de centelleo de líquido.

Formación de imágenes fCa2+1 Las células EF88 se desarrollaron en DMEM complementado con 1 0% (v/v) de suero de bovino fetal inactivado por calor y L-glutamina ( 1 mM) en un 95% de aire y 5% de C02 atmosférico a 37°C. Una porción de las células recolectadas durante la tripsinizacion se colocaron en portaobjetos de vidrio y después de un periodo de desarrollo de 24 horas que transfectan utilizando LipofectAMI N E (Life Technologies, Inc. ) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de 3 h las células se - 55 -enjuagaron dos veces con OPTIMEM 1 y después se cultivan en medio de crecimiento DMEM por 24 h más. Un total de 3 µ? de pcADN3 conteniendo las especies de cADN relevantes se utilizan para transfectar cada portabobjeto. Las células EF88 transfectadas se cargan con el tinte Fura-2 sensible a Ca2+ mediante incubación (15-20 min , 37°C) bajo luz reducida en medio de crecim iento DMEM conteniendo la forma acetometiléster permeante de membrana del tinte (1 .5 µ?). Los detalles de los estudios de formación de imágenes y su análisis se describe en Liu et al., 2002).

Estudios de co-inmunoprecipitación de GPC Los estudios de co-inmunoprecipitación utilizando formas marcadas con FLAG y c-myc del a1 -adrenoceptor y construcciones del receptor de histamina H 1 se realizan como en (McVey ef al., 2001 ). En los estudios con el receptor de histamina H 1 30U/ml de endoglicosidasa F se agregan .

Transferencia de energ ía de resonancia de fluorescencia resuelta en tiempo Se realiza en células HEK293 intactas utilizando anticuerpos anti-c-myc marcados con Eu3+ y anticuerpos anti-FLAG marcados con aloficocianina como se describe en (McVey et al., 2001 ). Resultados El presente inventor ha generado previamente una - 56 -proteína de fusión entre el a-ib-adrenoceptor y la subunidad de Gn que une ambos agonistas y ligandos antagonistas incluyendo [3H[prazosina (Carillo, et al., 2002). La adición de la fenilefrina agonista a membranas de las células HEK293 transfectadas para expresa esta construcción resulto en una gran estimulación de la unión de [35S]GTPyS monitoreada seguida por el fin del ensayo de imunoprecipitación utilizando un antisuero contra el decapéptido de terminal C de Gn a (Fig . 4A). La introducción de un mutante Gly208AlaG1 1 a en la proteína de fusión eliminó esencialmente la estimulación de fenilefrina de la unión de [35S]GTPyS cuando las membranas expresando cantidades iguales de esta construcción se utilizan (Figura 4A(2) debido a que esta forma de la proteína G es incapaz de liberar GDP unido. Sin embargo, esta mutación no altera las propiedades de unión de ya sea [3H]prazosina o fenilefrina). Los estudios previos han mostrado q ue la m utación de aminoácidos hidrofobicos en ciclo intracelular 2 del a1 -adrenoceptor puede eliminar la transducción de señal mediada por agonista (Greasley et al., 2001 ). El presente inventor de esta manera generó una proteína de fusión entre i b-adrenoceptor Leu1 51Asp y G1 1 ct. Esto unió tanto [3H]prazosina como fenilefrina como la proteína de fusión tipo salvaje (no mostrada) pero fenilefrina fue de nuevo incapaz de estim ular la unión de [35S]GTPyS (Figura 4A(3)) . Sin embargo, la coexpresión de los dos mutantes no funcionales reconstituyó la unión mediada por fenilferina de [3SSIGTPyS (Figura 4A(4)) y cuando las - 57 -cantidades de membrana se emplearon contuvieron dos veces más de sitios de unión de [3H]prazosina como se utilizaron para cada construcción individual, el nivel de [35S]GTPyS mediado por agonista casi fue tan alto como cuando se emplea la construcción de fusión tipo salvaje (Figura 4A(5)). La reconstitución de la función requirió la co-expresión de las dos fusiones mutantes. Si las dos construcciones se expresan en poblaciones celulares separadas y cualquiera de las células mezcladas antes de la preparación de membrana o membranas se preparan individualmente y después se combinan antes del ensayo, ninguna unión estimulada por agonista de [35S]GTPyS se observa (Figura 4B). Tales resultados fueron consistentes con la hipótesis de que la dimerización de GPCR se requiere para función agonista. Además, dentro del dímero, un elemento GPCR activa la proteína G enlazada físicamente al GPCR compañero. Para extender este concepto básico un conjunto equivalente de experimentos se realizó utilizando funciones entre el receptor de histamina H1 y G a. Los resultados básicos son los mismos. La fusión conteniendo formas tipo salvaje de tanto GPCR como proteína G produjeron una gran estimulación de unión de [35S]GTPyS en la presencia de histamina (Figura 5(1 )). Esto estuvo ausente en expresión separada de ya sea una proteína de fusión de receptor de histamina H1 -Gly208AlaG1 1 ct (Figura 5 (2)) o una fusión entre el receptor de histamina H 1 Leu133Asp y G11 a tipo salvaje (Figura 5(3)). La co-expresión de estos dos mutantes de nuevo - 58 -reconstituyó la activación del agonista de la proteína G (Figura 5(4)). De nuevo, después de la co-expresión de los dos mutantes, las membranas expresando un doblez 2 el número de sitios de unión de [3H]antagonista produjo tan alto un nivel de unión de [35S]GTPyS en la adición de la histamina agonista como la proteína de fusión del receptor de histamina H 1 tipo salvaje-GnA expresada en aislamiento (Figura 5(5)) . Como una extensión a estos estudios los presentes inventores intentaron monitorear la reconstitución funcional y dimerización en una sola célula. Para hacer esto emplean formación de imágenes de Ca2+ utilizando células EF88. Las células EF88 son una estirpe de fibroblastos de embrión de ratón que se derivan de un ratón inconsciente de Gqa/G i ia doble (Mao eí al. , 1 998; Yu and Hinkle, (1 999). De esta manera, req uieren la expresión de tanto un GPCR funcional como una proteína G que moviliza Ca2+ funcional para producir la elevación de [Ca2+] intracelular (Liu eí al., (2002; Stevens eí al. , 2001 ) . En la introducción de fusiones entre formas de tipo salvaje de ya sea el receptor de histamina H 1 o el 1 b-adrenoceptor y agonistas G A, se produjo la elevación de [Ca2+] intracelular (Figura 6). Esto ocurrió solamente en células positivamente transfectadas. Como células EF88 son recalcitrantes a transfección, los presentes inventores co-transfectan con proteína verde fluorescente (GFP) mejorada para permitir la visualización de las células positivamente transfectadas. Solamente aq uellas células que - 59 -son positivas a GFP respondieron a ligandos agonistas (Figura 6b). Tanto para receptor de histamina H 1 como ai -adrenoceptor, las fusiones conteniendo ya sea el GPCR no responsivo a agonista o el muíante de proteína G, fallaron en elevar [Ca2+] intracelular. Sin embargo, la co-expresión de los pares de fusiones no funcionales de nuevo resultó en generación de señal positiva (Figuras 6a, 6b, 7a y 7b). El presente inventor también ha demostrado directamente la habilidad de tanto los GPCRs aislados como las fusiones de GPCR/proteína G para formar dímeros y oligómeros. Las construcciones fuer marcadas con epítope en terminal N con ya sea marcas c-myc o FLAG. Después de la co-expresión en células HEK293 de ambas formas marcadas del 1 b-adrenoceptor, pero no su expresión separada seguida por mezclado celular, la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FLAG resultó en la presencia de inmunoreactividad anti-c-myc en el precipitado (Figura 8a). SDS-PAGE demostró la presencia de bandas identificadas por el anticuerpo c-myc de tamaño aparente de 53kDa y 0kDa que sería consistente con formas monoméricas y diméricas del a1 b-adrenoceptor. La inmunoreactividad de anti-c-myc también se observa cerca de la parte superior del gen y esto puede representar ya sea un oligómero de orden más alto o proteína agregada (Figura 8a). Cuando los experimentos equivalentes se realizan con la proteína de fusión a1 b-adrenoceptor-G1 ct, los resultados similares se obtienen, excepto que las bandas reactivas anti-c-myc son ahora de - 60 -masa aparente de 90kDa y 200kDa, consistentes con el tamaño anticipada de formas monoméricas y diméricas de esta proteína de fusión (figura 8a). Los resultados similares se obtienen por formas marcadas con FLAG y c-myc del receptor de histamina H1 (figura 8b). La forma monomérica del receptor aislado migró como un polipéptido de aproximadamente 50kDa con la forma dimérica migrando como se anticipa para un polipéptido de algunos 100kDa (figura 8b). De nuevo, como con el aib-adrenoceptor, una serie de especias de masa molecular más alta también se detecta. Cuando se utiliza la proteína de fusión de receptor de histamina H1-Gnia, ambas especies, monomérica como dimérica, también se detectan fácilmente (figura 8b). Una serie de asuntos se han originado acerca del significado y validez de los datos de dimerización GPCR que se basan exclusivamente en la co-inmunoprecipitación (Milligan G, 2001; Salim ef al., 2002). Los presentes inventores de esta manera, monotorearon la dimerización/oligomerización de ambos, el a^-adrenoceptor como la proteína de fusión 1b-adrenoceptor-G11a en células HEK293 intactas utilizando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en tiempo (tr-FRET). Cuando se co-expresan las formas marcadas con FLAG y c-myc de ya sea el GPCR aislado o la proteína de fusión, una señal de transferencia de energía clara se obtiene en la adición de una combinación de anticuerpos anti-c-myc marcados con Eu3+, como donador de energía, y anticuerpos anti-FLAG marcados con aloficocianina (APC) como aceptador de energía - 61 - (figura 9A) . Una señal de transferencia de energía no se obtiene cuando las formas marcadas de las construcciones de GPCR se expresan en población separada de células que se mezclan antes de la adición de los anticuerpos. Los resultados equivalentes se obtienen en células HEK293 expresando formas marcadas con FLAG y c-myc en terminal N de tanto el receptor de histamina H 1 como la proteína de fusión de receptor de histamina H1 -G11 a, (figura 9B). Para examinar la posibilidad de hetero-dimerización entre el receptor de histamina H1 y el a1 b-adrenoceptor y el mecanismo de activación de proteína G por dímeros GPCR, el inventor co-expresa una forma marcada con FLAG del receptor de histamina H 1 y la forma marcada con c-myc del a1 -adrenoceptor. Después de la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FLAG y SDS-PAGE, inmunoreactividad c-myc se detecta en polipéptidos de masa molecular aparente de 50 y 100 kDa consistente con la inmunoprecipitación de los hetero-dímeros de receptor de histamina 1 H-cc^-adrenoceptor que son solamente parcialmente separados por las condiciones de electroforesis empleadas (figura 1 1 A). Los estudios de tr-FRET después de la co-expresión de la forma marcada con FLAG del receptor de histamina H 1 y la forma marcada con c-myc del a b-adrenoceptor confirmaron la presencia de los hetero-dímeros de receptor de histamina H 1 /aib-adrenoceptor en la superficie celular (figura 1 1 B) aunque el nivel absoluto de la señal indicó que estos hetero-dímeros se formaron menos eficientemente que los pares de homo-dímeros correspondientes (ver, eje y de las figuras 9A y 9B en - 62 -comparación con la figura 1 1 B). Como en los estudios de homo-dímero ninguna señal de tr-FRET se observa cuando las poblaciones celulares separadas expresando cada uno de estos receptores se mezclan antes del análisis (figura 1 1 B). Cuando el receptor de histamina H1 Leu 33Asp-G iia se coexpresa en células EF88 con oci b-adrenoceptor-Gly208AlaG1 a, la fenilefrina fue capaz de elevar [Ca2+] intracelular pero la histamina no (figura 12A). Esto solamente puede ocurrir sí el a1 b-adrenoceptor activa la proteína G físicamente enlazada al receptor de histamina H 1 Leu133Asp. Cuando el procedimiento se invierte por co-expresión del a1 b-adrenoceptor-Giia Leu151Asp y el receptor de histamina H1 -Gly208AlaGi1 a, la histamina ahora causó elevación de [Ca2+] intracelular pero fenilferina no (figura 7B). Para extender este tipo de análisis, la fusión de el receptor de histamina H 1 -Gi1 a se co-expresa con el oc1 b-adrenoceptor Leu15 Asp que es incapaz de inactivar la proteína G y de esta manera estimular la unión de [35S]GTPyS. La estimulación de histamina de unión de [35S]GTPyS se reduce significativamente en comparación con las membranas que expresan el mismo nivel de solamente la fusión de receptor de histamina H1 -G-ii„ (figura 12A). Tales datos fueron consistentes con el a-i b-adrenoceptor Leu151Asp generando hetero-dímeros inactivos con receptor de histamina H1 -G1 a e indican que el receptor de histamina H1 en el hetero-dímero no activa la proteína G físicamente asociada con él. La señal restante producida por histamina en la co-transfección refleja que alguno del homo-dímero del receptor de - 63 -histamina H1 funcional-Gi 1 a aún se forma en la presencia del ot1 b-adrenoceptor Leu151Asp. En realidad, cuando el inventor co-expresa el receptor de histamina ? ? -T^ a con cantidades crecientes de cADN de a1 b-adrenoceptor Leu151Asp, la habilidad de la histamina para causar la unión de [35S]GTPyS en membranas expresando el mismo número de sitios de unión del receptor de histamina H 1 disminuyó a medida que los niveles de cADN de oc -adrenoceptor Leu15 Asp aumentaron (figura 12A). Los resultados similares se obtienen después de la co-transfección de aib-adrenoceptor Leu151Asp con el receptor de histamina H1 -G 1 a en células EF88. La estimulación de la histamina de [Caz+] intracelular se reduce marcadamente (figura 12B). La co-expresión de dos GPCRs distintos debe resultar en la presencia de los homo-dímeros respectivos así como también proporcionar el potencial para formación de hetero-dímero. El inventor desea asegurar que la reconstitución de señalización de Ca2+ observada en la co-expresión de receptor de histamina H 1 Leu133Asp-G11 a con ctib-adrenoceptor Gly20SAla G11 a no reflejó que solamente el a1 b-adrenoceptor y los homo-dímeros de receptor de histamina H1 están presentes y que los homo-dímeros de a b-adrenoceptor Gly208Ala Gna fueron simplemente capaces de contactar y activar G1 1 ce enlazado a homo-dímeros del receptor de histamina H1 -G 1 a. Para aumentar los niveles de proteína G marcada apropiadamente en la membrana, generó una construcción en la cual G11 a se enlaza al término C de una forma marcada con c-myc de la terminal N y la primer región de transmembrana del ai ~adrenoceptor (c-myc-Nt- - 64 - TMI a-i b-G a). Cuando este se transfecta en células HEK293, las inmunomanchas de fracciones de membrana claramente demostraron su expresión como un doblete de 53 y 47kDa si la detección fue a través de anti-c-myc (figura 13A) o antisuero de anti-proteína G (datos no mostrados). En base a la inmunodetección por los niveles de anticuerpo anti-c-myc, los niveles de c-myc-Nt-TM1 a b-G1 a fueron significativamente mayores que aquellos de la proteína de fusión c-myc-a1 b-adrenoceptor-G a (figura 13A). Los ensayos de unión de [35S]GTPyS, al final de los cuales la construcción de c-myc-Nt-TM1 ib-G1 1 a fue inmunoprecipitada con anticuerpos anti-c-myc, confirmaron que esta construcción no une [35S]GTPyS en respuesta a fenilefrina (figura 13B). Los experimentos paralelos mostraron que los anticuerpos anti-c-myc no capturan la unión estimulada por fenilefrina de [35S]GTPyS a la proteína de fusión a b-adrenoceptor-Gi1 a marcada con c-myc (figura 13B). Sin embargo, la co-expresión de c-myc-Nt-TM1 a^-Gna con el a1 -adrenoceptor aislado igualmente no resulta en estimulación significativa de unión de [35S]GTPyS en inmunoprecipitados anti-c-myc (figura 13B) y esto también fue verdadero cuando c-myc-Nt-TM1 ib-G1 a se co-expresa con la proteína de fusión a1 b-adrenoceptor-Gly208AlaG11 a (figura 13B). De esta manera, incrementando simplemente la concentración de proteína G asociada a membrana no permite que el a b-adrenoceptor u homo-dímeros de la proteína de fusión de a1 b-adrenoceptor activen esta proteína G. Esto argumenta fuertemente que los datos de la co-expresión de los pares de receptor de histamina H 1 inactivo y - 65 -fusiones de proteína G de receptor a^-adrenoceptor deben resultar de la trans-activación dentro del heterodímero.

Ejemplo de un Ensayo del Lector de Placa de Formación de Imágenes Fluorométrlcas (FLIPR) para la Medición de Concentración de Calcio Intracelular Las células establemente transfectadas del receptor objetivo (experimental) y pCMV (control negativo) de líneas clonadas respectivas, se colocan en placas de 96 cavidades pre-tratadas con poli-D-lisina (Becton-Dickinson, #356640) en células 5.5x1 04 células/cavidad con medio de cultivo completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio) para ensayo al siguiente día. Para preparar la reserva de regulador de incubación Fluo4-AM (Sonda Molecular, #F14202), 1 mg Fluo-4-?? se disuelve en 467 µ? DMSO y 467 µ? ácido plurónico (Sonda Molecular, #P3000) para dar una solución de reserva de 1 mM que puede almacenarse a -20°C por un mes. Fluo4-Am es un tinte indicador de calcio fluorescente. Los compuestos candidatos se preparan en regulador de enjuague (1 X HBSS/2.5 mM Probenicid/20 mM HEPES a pH 7.4). En el momento del ensayo, el medio de cultivo se remueve de las cavidades y las células se cargan con 100 µ? de 4 µ? Fluo4-AM/2.5 mM Probenicid (Sigtna, #P8761 )/20 mM HEPES/medio completo a pH 7.4. La incubación a 37°C/5% C02 se deja proceder por 60 min. Después de 1 hr de incubación, el regulador de - 66 -incubación Fluo4-AM se remueve y las células se enjuagan 2X con 100 µ? de regulador de lavado. En cada cavidad se dejan 1 00 µ? de regulador de lavado. La placa se regresa a la incubadora a 37°C/5% C02 por 60 min. FLI PR (Lector de Placa de Formación de Imágenes Flurométricas; Dispositivo Molecular) se programa para agregar 50 µ? de compuesto candidato en el segundo 30 y registrar los cambios transitorios en la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]) evocada por el compuesto candidato por otros 150 segundos. Los conteos de cambio de fluorescencia totales se utilizan para determinar la actividad agonista utilizando el software FLIPR. El software del instrumento normaliza la lectura fluorescente para dar lecturas iniciales equivalentes a cero. En algunas modalidades, las células que comprenden el Receptor Objetivo comprenden además alfa G promiscua 15/16 o la unidad alfa Gq/Gi quimérica. Aunque lo anterior proporciona un ensayo FLIPR para actividad agonista utilizando células establemente transfectadas, una persona de experiencia en la materia fácilmente sería capaz de modificar el ensayo para caracterizar la actividad antagonista. Dicha persona de experiencia en la materia también apreciaría fácilmente que, alternativamente, las células transitoriamente transfectadas podrían utilizarse. Ejemplo de un ensayo de melanoforo para detectar la unión del ligando - 67 - Los melanoforos son células de la piel encontradas en vertebrados inferiores. Contienen organelos pigmentados denominados melanosomas. Los melanoforos son capaces de redistribuir estos melanosomas a lo largo de una red mictrotubular en la activación del receptor acoplado a proteína G (GPCR). El resultado de este movimiento del pigmento es una iluminación o oscuridad aparente de las células. En melanoforos, los niveles reducidos de cAMP ¡ntracelular que resultan de la activación de un receptor acoplado a Gi, causan que los melanosomas migren al centro de la célula, resultando en una iluminación dramática en color. Si los niveles de cAMP se elevan entonces, después de la activación de un receptor acoplado a Gs, los melanosomas se re-dispersan y las células aparecen obscuras de nuevo. Los niveles incrementados de diacilglicerol que resultan de la activación de receptores acoplados a Gq también pueden inducir esta re-dispersión. Además, la tecnología también es adecuada al estudio de ciertas quinasas de tirosina receptoras. La respuesta de los melanoforos tiene lugar dentro de minutos de la activación del receptor y resulta en un cambio de color, robusto, simple. La respuesta puede detectarse fácilmente utilizando un lector de microplaca de absorbencia convencional o un sistema de formación de imágenes de video modesto. Diferentes a otras células de la piel, los melanoforos derivan de la cresta neural y parecen expresar un complemento completo de proteínas de señalización. En particular, las células expresan un rango extremadamente amplio de las proteínas G y así son capaces de expresar funcionalmente casi - 68 -todos los GPCRs. Los melanoforos pueden utilizarse para identificar los compuestos, incluyendo ligandos naturales, contra GPCRs. Este método puede conducirse al introducir células prueba de una estirpe de célula pigmento capaz de dispersar o agregar su pigmento en respuesta a un estímulo específico y expresar un clon exógeno que codifica GCPR. Un estimulante, por ejemplo, melatonina, fija un estado inicial de disposición de pigmento en donde el pigmento se agrega dentro de las células prueba si la activación del GPCR induce la dispersión del pigmento. Sin embargo, la estimulación de la célula con un estimulante para fijar un estado inicial de disposición de pigmento en donde el pigmento se dispersa si la activación del GPCR induce la agregación del pigmento. Las células prueba se contactan entonces con compuestos químicos, y se determina si la disposición del pigmento en las células cambió el estado inicial de la disposición del pigmento. La dispersión de las células de pigmentos debido al compuesto candidato, incluyendo pero no limitándose a un ligando, acoplándose al GPCR, aparecerán obscuras en un cápsula de Petri, mientras que la agregación de células de pigmento aparecerá clara. Los materiales y métodos se seguirán de acuerdo con la descripción de la Patente de EE.UU. número 5,462,856 y la Patente de EE.UU. número 6,051 ,386. Estas descripciones de patente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Las células se colocan en placas de 96 cavidades (un receptor por placa). 48 horas después de la transfección, la mitad de - 69 -las células en cada placa se tratan con 1 0nM melatonina. La melatonina activa un receptor acoplado a Gi endógeno en los melanoforos y causa que agreguen su pigmento. La mitad restante de las células se transfectan a medio libre de suero 0.7x L-15 (Gibco). Después de una hora, las células en medio libre de suero permanecen en estado disperso en el pigmento mientras que las células tratadas con melatonina están en un estado agregado al pigmento. En este punto, las células se tratan con una respuesta de dosis del compuesto prueba seleccionado. Si los GPCRs colocados en placas se unen al compuesto prueba seleccionado, los melanoforos esperarían experimentar un cambio de color en respuesta al compuesto. Si el receptor fuera ya sea un receptor acoplado a Gq o Gs, entonces los melanoforos agregados a melatonina experimentarían una dispersión del pigmento. En contraste, si el receptor fue un receptor acoplado a Gi, entonces las células dispersas en pigmento esperarían experimentar una agregación de pigmento dependiente de dosis.

Discusión Al emplear las proteínas de fusión entre ambos, el a^-adrenoceptor y el receptor de histamina H 1 con la proteína G , G a, los presentes inventores ahora muestran que estos GPCRs se dimerízan y que esto no se compromete por la adición de la proteína G al extremo posterior de terminal C del GPCR. Igualmente, al emplear trFRET para detectar dímeros/oligómeros GPCR en células intactas, fueron capaces de demostrar la presencia de estos - 70 -complejos en la superficie celular. Esto también no se compromete por la adición de la secuencia de proteína G a GPC s. Además, al introducir mutaciones que evitan la activación del agonista de la proteína G en ya sea el GPCR o la proteína G, los inventores produjeron pares de proteínas de fusión no funcionales que son capaces de restaurar la función mediada por el agonista cuando se co-expresan. La reconstitución funcional se monitorea de dos maneras. Primero, los agonistas fueron capaces de producir la elevación de [Ca2+] intracelular en células EF88 solamente después de la co-expresión de dos mutantes que son cada uno no funcional en aislamiento. Las células EF88 carecen de expresión de proteínas G acopladas a fosfolipasa C y de esta manera es necesario introducir tanto un GPCR adecuado como proteína G en estas células para generar una señal Ca2+. Este ensayo tuvo el beneficio obvio de que la formación de imágenes de Ca2+ permitió que los inventores monitoreen la dimerización funcional en células únicas. Una de las etapas previas que puede medirse en la cascada de transducción de señal es el intercambio de nucleótido guanina inducido por el agonista en la proteína G. Esto puede monitorearse convenientemente por la unión de [35S]GTPyS. En todos los ensayos de unión de [35S]GTPyS los inventores inicialmente midieron el nivel de co-expresión de cada una de las fusiones de proteína G de GPCR al utilizar los estudios de unión del [3H]antagonista de saturación. Esto les permitió agregar cantidades de membrana conteniendo cantidades definidas de las construcciones a los ensayos. Los inventores han demostrado - 71 - previamente q ue existe un incremento lineal en unión de [35S]GTPyS estimulada por el agonista con la adición de cantidades crecientes de una proteína de fusión GPCR-G-|1 a (Stevens et al. , 2001 ). Cuando la co-expresión el receptor de histamina H1 -Gly208AlaG1 1 a y proteínas de fusión de receptor de histamina H 1 Leu133Asp-G -l ci, se requiere la presencia de dos veces el número de sitios de unión de [3H]antagonista para generar aproximadamente la misma cantidad de unión de [35S]GTPyS estimulada por el agonista como cuando solamente la proteína de fusión de receptor de histamina H 1 -G1 ce se expresa. Esto proporciona buena evidencia de que el elemento funcional es un dimero o un oligómero de orden más alto. Si el receptor de histam ina H 1 funcional es un dimero, entonces casualmente, cuando se co-expresan las dos fusiones mutantes no funcionales, la m itad de los dímeros producidos deberían ser no funcionales debido a que serán homodímeros de ya sea receptor de histamina H1 -GlyZ08AlaG1 1 cí o receptor de histamina H 1 Leu133Asp-G1 1 a. Solamente el 50% de los dímeros se esperaría que fueran heterodímeros funcionales conteniendo una copia de receptor de histamina H 1 -Gly208AlaG1 1 a y uno de receptor de histamina H 1 Leu 33Asp-G 1 a (figura 10) . Estos estudios tam bién soportan la idea de que, en cuanto a los GPCRs clase C, los GPCRs clase A aminérgicos funcionan a través del mecanismo de trans-activación. La copia de la proteína G en el dimero que puede activarse se enlaza a la forma no funcional del GPCR mientras que la forma funcional del GPCR se asocia con proteína G no funcional. - 72 - Para soportar además este mecanismo, el inventor toma ventaja de la capacidad conocida de GPCRs relacionados estructurales para formar hetero-dímeros. Los estudios iniciales demostraron que cuando se co-expresan el receptor de histamina H1 y el a-ib-adrenoceptor podrían co-inmunoprecipitarse. Además, la coexpresión en células EF88 de receptor de histamina H1 Leu133Asp-G-p a y a1 b-adrenoceptor-Gly208AlaGi ia resultó en fenilefrina pero no elevación mediada por histamina de [Ca2+]¡. Esto solamente puede ocurrir si el a1 b-adrenoceptor activa la proteína G físicamente enlazada al receptor de histamina H1 inactivo (figura 2). Cuando el experimento se invierte de manera que el a-i b-adrenoceptor inactivo se enlaza a la proteína G tipo salvaje y el receptor de histamina H 1 tipo salvaje se enlaza a la proteína G muíante, ahora la histamina fue funcional pero fenilefrina no. El inventor extendió esta idea al examinar la efectividad de la histamina para estimular la unión de [35S]GTPyS cuando la proteína de fusión de receptor de histamina H1 se co-expresa con cantidades crecientes del a b-adrenoceptor Leu151Asp aislado pero inactivo. El efecto de histamina se reduce. Tal información es consistente con el concepto de que niveles crecientes de un hetero-dímero de receptor de histamina H1 -a1 b-adrenoceptor-G1 a-Leu151Asp reduce las cantidades del homo-dímero del receptor de histamina H1 -G11 ct y que la unión de histamina al hetero-dímero es incapaz de activar la proteína G que se asocia físicamente con el receptor de histamina H1 . En esta situación, la fenilefrina se inactiva ya que el a1 b-adrenoceptor- Leu151Asp es - 73 -incapaz de estimular cualquier proteína G . Un número de reportes ha indicado que las fusiones de GPCR-proteína G pueden interactuar con y activar endógenamente las proteínas G expresadas así como •también el elemento de proteína . G de la fusión (Burt et al., 1 998, J. Biol. Chem 273, 10367-10375; Molinari et al., 2003 J . Biol. Chem 278, 1 5778-1 5788). Sin embargo, en estos estudios las fusiones de GPCR-proteína G se han expresado en niveles muy altos que se encuentran dentro del rango en el cual los efectos del 'bisoportador' no específico (Mercier et al., 2002 J . Biol. Chem 277, 44925-44931 ) se han reportado, debido a la proximidad física en la membrana. El uso de células EF88 eliminó la posibilidad de interacción con proteínas G endógenas ya que no expresan Gq y Gu a y de esta manera los efectos tienen que reflejar la activación de las proteínas G fusionadas. Además, después de la introducción de la m utación de Gly208Ala en la proteína G, el elemento de la estimulación del agonista por fusiones de la unión de [35S]GTPyS en membranas de células HEK293 transfectadas , se eliminó virtualmente. Esto indica que al nivel de expresión logrado, no existe virtualmente activación de Gqa y G-n oc endógenas en células HEK293 aún cuando ambas se co-expresan . En los experimentos de hetero-dimerización en células HE 293 la proteína G en exceso se introduce en una proporción molar 1 : 1 con el segundo GPCR debido a la estoquiometría 1 : 1 de GPCR y la proteína G definida por la fusión . Para valorar si los resultados podrían adscribirse sim plemente a la presencia de la proteína G extra, el inventor proporcionó proteína G extra a través de estrategia - 74 -alternativa. Para hacer esto generó una forma de G( 1a enlazada a la terminal N y la primer región de transmembrana del a1 b-adrenoceptor. Las construcciones equivalentes para otras proteínas G se han empleado previamente (Lee et al., 1 999 Biochemistry 38, 1 3801 -1 3809, Guzzi et al. , 2001 Biochem J. 355, 323-331 , Molinari et al., 2003 J. Biol. Chem 278, 15778-15788) y se ha sugerido que el enlace a una hélice a de transmembrana proporciona la proteína G en una orientación particularmente efectiva para activación (Molinari eí al., 2003 como arriba). Aunque esta construcción podría expresarse a niveles marcadamente más altos que las fusiones de a b-adrenoceptor-Gn a. Estos estudios confirmaron que la reconstitución de la señal con co-expresión de pares no funcionales de fusiones de GPCR-proteína G deben reflejar una transactivación interna dentro del dímero reconstituido. - 75 - Tabla 1 Músculo liso del tracto Motilidad del estómago e gastrointestinal intestinos Fibras del nervio gangliónico del Motilidad del estómago e tracto gastrointestinal intestinos Músculo liso del tracto urinario Función de uretra y función de la vejiga urinaria Glándula salival Secreción salival Células alfa del páncreas Secreción de glucagones Células beta del páncreas Secreción de insulina Músculo liso uterino Contracción uterina Músculo del corazón Contracción del músculo del corazón Músculo liso vascular Contracción del músculo liso Adipositos Lipólisis Plaquetas Agregación de plaquetas en respuesta a la lesión del vaso sanguíneo Unión neuromuscular esquelética Contracción del músculo esquelético Músculo liso bronquinal Respiración Vaso sanguíneos mucosales Volumen de mucosa nasales - 76 - Músculo trígona de vejiga uretra Flujo exterior urinario Condorcitos Formación de cartílago Cuerpo ciliar del ojo Producción de humor acuoso Tiroides Secreción de hormona tiroidea Mastocitos Reacciones de hipersensibilidad inmediata Basóficlos Reacciones de hipersensibilidad inmediata Osteoblastos Remodelación del hueso Osteoblastos Remodelación del hueso Células endoteliales capilares del Permeabilidad de la barrera cerebro sangre-cerebro Células T Respuesta inmune Células B Respuesta inmune Células epiteliales tubulares Intercambio de ácidos orgánicos próximas del riñon Neutrófilos Respuesta inmune Eosinófilos Respuesta inmune Monocitos Respuesta inmune Tubulo distal posterior del riñon Intercambio de bases orgánicas Células princopales del ducto Intercambio de bases orgánicas recolector Células yuxtaglomerulaes Secreción de renina granulares del riñon - 77 - Meuronas adrenérgicas Función simpatética postgangliónicas periféricas Hepatocitos Síntesis de colesterol y lipoproteína Células apriétales Secreción de ácido estomacal gastrointestinales Célilas epiteliales superficiales Secreción de factores gastrointestinales citoprotectores, moco y bicarbonato Células epidérmicas Mantenimiento de la piel Células germinales de médula Producción de eritropoyesis ósea Estructuras angulares del ojo Flujo exterior de humor acuoso Estructuras uveoesclerales del ojo Flujo exterior de humor acuoso Núcleo supraquiasmático Ritmo circadiano Baroreceptores Presión sanguínea Ganglio básico Control de movimiento Cuerno dorsal y periacueductal de Nocicepción la médula espinal Postrema área Vómito Tálamo Procesamiento sensomotriz y excitación Corteza cerebral sensorimotriz Procesamiento sensomotriz Neuronas de motor de médula Control de función motriz - 78 -espinal Neuronas de ganglio de raíz Transmisión de información dorsal sensorial Oligodendrocitos Producción de cubierta de mielina neuronal Núcleo basils Reconocimiento y memoria Núcleo acumbens Ansias adictivas Formación reticular lateral de Vómito médula Neuronas hipotalámicas que Secreción de GHRH contienen factor de liberación de la hormona de crecimiento (GHRH) Neuronas hipotalámicas Secreción de somatostatina conteniendo somatosfatina Neuronas hipotalámicas Secreción de TRH conteniendo hormona de liberación de tirotropina (THR) Neuronas hipotalámicas Secreción de GnRH conteniendo hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) Neuronas hipotalámicas Secreción de CRF conteniendo factor de liberación - 79 -corticotropina (CRF) Somatrotopos de pituitaria Secreción de la hormona de anterior crecimiento Lactotropos de pituitaria anterior Secreción de prolactina Gonadotropos de pituitaria Secreción de hormona anterior letuenizante Gonadotropos de pituitaria Secreción de hormona estimulante anterior del folículo Corticotropos de pituitaria anterior Secreción de hormona adrenocorticotrópica Células leydig de los testículos Secreción de testosterona Células sertoli de los testículos Espermatogénesis Células de granulosa del ovario Síntesis de estrógeno Células teca del ovario Síntesis de estrógeno Sinovio Función de unión Amígdala Modulación de emoción Glándula pineal Regulación de ritmo circadiano Núcleo de tracto solitario Regulación cardiovascular Médula ventrolateral del núcleo Regulación cardiovascular Médula ventrolateral del rostral Actividad, del vasopresor Núcleo parabraquial Respuesta de aversión a sabor y respuesta nociceptiva Corteza entorinal Reconocimiento Corteza piriforme Reconocimiento - 80 - Corteza temporal Adquisición de memoria Corteza frontal Regulación de respuesta emocional y adquisición de memoria Corteza parietal Agudeza visual, percepción al tacto y movimiento voluntario Corteza occipital Agudeza visual Hipocampo Aprendizaje y memoria Giro dentado Aprendizaje y memoria Formación reticular de medio Excitación cerebro Núcleo supraóptico del hipotálamo Funciones reproductivas agnocelular del hipotálamo Modulación del estrés, presión sanguínea y lactación Neuronas parvocelulares del Metabolismo hipotálamo Núcleo arqueado del hipotálamo Liberación de hormonas pituitarias Área trigerminal Dilatación del vaso cerebral y presión sanguínea Vasos sanguíneos cerebrales Dilatación del vaso cerebral Tallo cerebral Respiración, ritmo cardiaco, respuesta a sobresalto, sudoración, presión sanguínea, digestión y temperatura corporal - 81 - Terminales de lámina ventral Presión sanguínea Nervio vago Presión sanguínea y ritmo cardiaco Núcleo del tracto solitario Presión sanguónea Medula adrenal Respuesta de catecolamina a tensión Corteza adrenal Liberación de coticoesterona inducida por estrés Locus coeruleus Excitación y respuesta a estrés Sustancia negra Control del movimiento corporal Área tegmental ventral Control del movimiento corporal Bulbo olfativo Percepción de olor Eminencia promedio de Función de la pituitaria. hipotálamo Núcleo rafe Sueño y excitación Habenula Actividad sexual Cerebelo Control del movimiento corporal Hipotálamo posterior Motilidad intestinal y presión sanguínea Médula dorsal Presión sanguínea Hipotálamo lateral Toma de alimentos y secreción de ácido estomacal Hipotálamo rostral Ritmo cardiaco Formación reticular modular de Respiración y ritmo cardiaco - 82 -pontina Médula Respiración y ritmo cardiaco Mesencéfalo Ritmo cardiaco Hipotálamo ventral Respuesta a estrés Núcleo paranventricular de Respuesta a estrés hipotálamo Área preóptica de hipotálamo Actividad sexual Región mamaria Toma de alimentos Área perifornica de hipotálamo Toma de alimentos Hipotálamo ventral Toma de alimentos Puente Formación reticular Saliva Control emocional Núcleo tegmental Excitación pedunculopontina Astrositos Metabolismo neuronal Microglia Respuesta a lesión neuronal Plexo coroide Producción de fluido cerebroespinal Células Schwann Mielinacion de nervios periféricos Endoneurio Producción de cubierta nerviosa de tejido conectivo Trayectoria espinotalámica lateral Respuesta a estímulos de temperatura y dolor Trayectoria espinotalámica ventral Sensación al tacto - 83 - Trayectoria lemniscal media de Sensación al tacto columna dorsal Terminaciones del nervio libres Respuesta a dolor y temperatura Terminaciones del folículo capilar Sensación al tacto Bulbo final de Krauase Sensación a tacto-presión Corpúsculos de Merkel Sensación a tacto-presión Corpúsculo Pacinianos Sensación a tacto-presión Corpúsculo de Ruffini Sensación a temperatura Retina Agudeza visual Glándula paratiroidea Equilibrio de calcio Placenta Actividad de placenta Fibras del músculo esquelético Contracción muscular Corpora carvenoso Vasodilatación genital Tracto cortioespinal Control de movimiento Corteza cerebral motriz Control de vomiento Neuronas postganglióncias Control de presión sanguínea y actividad adrenal Galnglio intramural Peristalsis de colon distal Plexo hipogástrico Control de uretra y esfínter anal Plexo pélvico Vasodilatación genital y erección Plexo vesicular Control de vejiga urinaria Plexo celiac Peristolisis intestinal - 84 - REFERENCIAS 1. 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Claims (1)

1. - 87 - REIVI N DICACION ES 1 . Un reactivo biológico comprendiendo un compuesto teniendo (a) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverlo no funcional con respecto a la primer proteína G; (b) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional, en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 2. Un reactivo biológico según la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto está presente en una membrana celular. 3. Un reactivo biológico según la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque el primer GPCR y primer proteína G se asocian como una proteína de fusión, y en donde el segundo GPCR y segunda proteína G se asocian como una proteína de fusión. 4. Un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de - 88 -aminoácidos del primer GPCR se modifica dentro del 2do ciclo intracelular. 5. Un reactivo biológico según la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del primer GPCR se modifica por substitución de residuo de aminoácido. 6. Un reactivo biológico según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del primer GPCR se modifica por una substitución de un residuo de aminoácido hidrofóbico por un residuo de aminoácido ácido. 7. Un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el primer GPCR tiene un 2do ciclo intracelular, la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y uno o más de los residuos de aminoácido resaltados se modifican. 8. Un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda proteína G tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la proteína G tipo salvaje para volverla no funcional. 9. Un reactivo biológico según la reivindicación 8, caracterizado porque la segunda proteína G se modifica en comparación con la secuencia de aminoácido tipo salvaje por al menos una substitución del residuo de aminoácido. 10. Un reactivo biológico según la reivindicación 9, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. - 89 - 1 1 . Un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 12. Un reactivo biológico se,gún la reivindicación 1 1 , caracterizado porque los GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 13. Un método para producir un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende las etapas de (a) expresar una primer construcción de ácido nucleico en una célula, dicha construcción de ácido nucleico que codifica una primer proteína de fusión de GPCR/proteína G en donde GPCR se muta en comparación con el GPCR tipo salvaje, volviéndolo así no funcional con respecto a su proteína G; (b) expresar una segunda construcción de ácido nucleico en dicha célula, dicha segunda construcción de ácido nucleico codificando una segunda proteína de fusión de GPCR/proteína G en donde la proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje, volviéndola así no funcional; y (c) permitir que dichas proteínas de fusión, primera y segunda, se ensamblen en un compuesto en la membrana celular, - 90 -en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 14. Un método para producir un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho método comprendiendo las etapas de (a) producir una primer construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de un primer GPCR y una primer proteína G en donde el primer GPCR se muta en comparación con el tipo salvaje de manera que es no funcional con respecto a la proteína G fusionada; (b) producir una segunda construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de un segundo GPCR y una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es mutada en comparación con el tipo salvaje volviéndola no funcional; y (c) co-expresar las construcciones de ácido nucleico, primera y segunda, en una célula para producir un compuesto que comprende dichos GPCRs, primero y segundo, en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente del segundo GPCR. método según la reivindicación - 91 -reivindicación 14 comprendiendo además la etapa (d) aislar una parte de la membrana celular comprendiendo el compuesto. 16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 1 5, caracterizado porqué el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 17. Un método según la reivindicación 16, caracterizado porque al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 18. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porq ue el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 19. Un método según la reivindicación 17 o reivindicación 18, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácido resaltados. 20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. - 92 - 21 . Un método según la reivindicación 20, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21 , caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 23. Un método según la reivindicación 22, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 24. Un método para determinar un primer y segundo GPCR teniendo afinidad entre sí de manera que forman un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo las etapas de (a) producir una primer construcción de ácido nucleico codificando un primer GPCR y su proteína G asociada como una proteína de fusión en donde el GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje de manera que es no funcional con respecto a su proteína G asociada; (b) producir una segunda construcción de ácido nucleico codificando un segundo GPCR y su proteína G asociada como una proteína de fusión en donde la proteína G se muta en comparación con su proteína G tipo salvaje de manera que es no funcional; (c) co-expresar dichas construcciones de ácido - 93 -nucleico, primera y segunda, en una célula; y (d) determinar la presencia de un compuesto que comprende dichos GPCRs, primero y segundo, en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 25. Un método según la reivindicación 24, caracterizado porque la presencia de un compuesto se determina al contactar la célula con un ligando para dicho segundo GPCR y determinar si dicha primer proteína G se activa. 26. Un método según la reivindicación 24 o reivindicación 25, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 27. Un método según la reivindicación 26, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 28. Un método según la reivindicación 27, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 29. Un método según la reivindicación 27 o reivindicación 28, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de - 94 -aminoácido resaltados. 30. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 31 . Un método según la reivindicación 30, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 32. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31 , caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 33. Un método según la reivindicación 32, caracterizado porque los GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 34. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, tipo salvaje, se co-expresan endógenamente por al menos un tipo celular. 35. Un método para determinar la presencia de un sitio de unión de ligando, nuevo o alterado, resultante de oligomerización de GPCR, dicho método comprendiendo las etapas de a) contactar un compuesto con una primer célula que expresa un oligómero GPCR teniendo (i) un primer GPCR asociado con una proteína G en donde el primer GPCR se modifica de manera que es no funcional con respecto a dicha proteína G; y (ii) un - 95 -segundo GPCR asociado con una proteína G en donde la proteína G se modifica de manera que es no funcional; b) contactar dicho compuesto con una segunda célula que expresa un primer GPCR no modificado y/o contactar dicho compuesto con una segunda célula que expresa un segundo GPCR no modificado; y c) comparar el efecto del compuesto en la primer célula y la segunda célula para determinar la presencia de un sitio de unión del ligando, nuevo o alterado, creado por el oligómero GPCR. 36. Un método para determinar un cambio en la función de GPCR como un resultado de formar un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo a) contactar un compuesto con una primer célula que expresa un oligómero GPCR teniendo (i) un primer GPCR asociado con una proteína G en donde el primer GPCR se modifica de manera que es no funcional con respecto a dicha proteína G; y (¡i) un segundo GPCR asociado con una proteína G en donde la proteína G se modifica de manera que es no funcional; b) contactar dicho compuesto con una segunda célula - 96 -que expresa un primer GPCR no modificado y/o una segunda célula que expresa un segundo GPCR no modificado; y c) comparar la función de dicho oligómero GPCR con aquella de dicho primer GPCR no modificado y/o con aquella de dicho segundo GPCR para determinar un cambio en la función del receptor resultante de oligomerización. 37. Un método según la reivindicación 36, caracterizado porque el cambio en la función del receptor es un cambio en la potencia del compuesto. 38. Un método según la reivindicación 36, caracterizado porque el cambio en la función del receptor es un cambio en la trayectoria de señalización celular resultante de la activación del receptor por dicho compuesto. 39. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 40. Un método según la reivindicación 39, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. > 41 . Un método según la reivindicación 39 o reivindicación 40, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un - 97 -residuo de aminoácido ácido. 42. Un método según la reivindicación 40 o reivindicación 41 , caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácido resaltados. 43. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 42, caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 44. Un método según la reivindicación 43 , caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 45. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 46. Un método según la reivindicación 45, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 47. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 46, caracterizado porque el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada comparada con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G, y en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente del segundo GPCR. 48. Un método para determinar el efecto que un - 98 -compuesto tiene un oligómero GPCR, comprendiendo las etapas de: a) contactar dicho compuesto con una primer célula que expresa un oligómero GPCR teniendo (i) un primer GPCR asociado con una proteína G en donde el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G; y (ii) un segundo GPCR asociado con una proteína G en donde la proteína G se modifica de manera que es no funcional; b) detectar la presencia de una señal celular resultante del contacto entre dicho compuesto y dicho oligómero GPCR; y c) determinar un efecto que dicho compuesto tiene en el oligómero GPCR, en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 49. Un método según la reivindicación 48, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 50. Un método según la reivindicación 49, - 99 -caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 51 . Un método según la reivindicación 50, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 52. Un método según la reivindicación 49 o reivindicación 50, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácidos resaltados. 53. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 48 a 52, caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 54. Un método según la reivindicación 53, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 55. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 48 a 54, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 56. Un método según la reivindicación 55, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 57. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 48 a 56, caracterizado porque comprende además la - 1 00 -etapa de comparar dicho efecto con aquel resultante del contacto entre dicho compuesto y un primer GPCR no modificado y/o con aquel resultante del contacto entre dicho compuesto y un segundo GPCR no modificado. 58. Un método para identificar un compuesto capaz de interactuar con un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo las etapas de a) proporcionar una célula que expresa un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; b) contactar dicho reactivo biológico con dicho compuesto; y c) determinar si dicho compuesto interactúa con el oligómero GPCR. 59. Un método según la reivindicación 58, caracterizado porque la interacción entre el compuesto y el oligómero GPCR se determina al identificar la presencia de una señal celular resultante de dicha interacción. 60. Un método según la reivindicación 59, caracterizado porque la señal celular se determina por la presencia de niveles de Ca2+, cAMP, inositol 1 , 4, 5 trifosfato, activación de quinasa C de proteína, o activación de quinasa MAP. - 101 - 61 . Un método según la reivindicación 59, caracterizado porque dicha señal celular se determina utilizando un ensayo reportador. 62. Un método según la reivindicación 58 o reivindicación 59, caracterizado porque dicha célula es una célula de pigmento y la señal celular se determina por un cambio en el estado de agregación de pigmento en la célula. 63. Un método según la reivindicación 62, caracterizado porque la célula de pigmento es un melanocito. 64. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 58 a 63, caracterizado porque dicho compuesto interactúa con dicho oligómero GPCR como un agonista, antagonista o un agonista inverso. 65. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 58 a 64, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 66. Un método según la reivindicación 65, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 67. Un método según la reivindicación 66, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 68. Un método según la reivindicación 65 o - 102 -reivindicación 66, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácidos resaltados. 69. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 58 a 68 caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 70. Un método según la reivindicación 69, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 71 . Un método según cualquiera de las reivindicaciones 58 a 70, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 72. Un método según la reivindicación 71 , caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 73. Un método para identificar un compuesto que tiene la habilidad de modular la unión entre un oligómero GPCR y su ligando, dicho método comprendiendo a) proporcionar una célula que expresa un oligómero GPCR que comprende un (i) primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde GPCR es no funcional con respecto a la proteína G; (ii) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; - 103 - b) contactar dicha célula con un compuesto prueba la presencia de dicho ligando; y c) comparar la habilidad de dicho ligando para unir oligómero GPCR con la habilidad de dicho ligando para unir el oligómero GPCR bajo condiciones comparables pero en la ausencia de dicho compuesto. 74. Un método según la reivindicación 73, caracterizado porque dicho compuesto es una proteína. 75. Un método según la reivindicación 74, caracterizado porque la proteína es un tercer GPCR. 76. Un método según la reivindicación 75, caracterizado porque dicho primer, segundo y tercer, GPCR se coexpresan endógenamente por al menos un tipo celular. 77. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 73 a 76, caracterizado porque dicho ligando se une a un sitio de unión del ligando, nuevo o alterado, determinado por estar presente en el oligómero por un método según cualquiera de las reivindicaciones 35, y 39 a 57. 78. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 73 a 77, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. - 1 04 - 79. Un método según la reivindicación 78, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 80. Un método según la reivindicación 79, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 81 . Un método según la reivindicación 78 o reivindicación 79, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácidos resaltados. 82. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 73 a 81 caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 83. Un método según la reivindicación 82, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 84. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 73 a 83, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 85. Un método según la reivindicación 84, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 86. Un método según cualquiera de las - 105 -reivindicaciones 73 a 85 caracterizado porque el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G y en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 87. Un método para evaluar acoplamiento de proteína G diferencial que comprende las etapas de (a) proporcionar una primer célula que expresa un oligómero GPCR comprendiendo (i) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el GPCR es no funcional con respecto a la proteína G; (ii) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; (b) proporcionar una segunda célula que expresa un oligómero GPCR que comprende (i) dicho primer GPCR asociado con dicha primer proteína G en donde dicho primer GPCR es funcional y dicha proteína G es no funcional; (ii) dicho segundo GPCR asociado con dicha segunda proteína G en donde dicho segundo GPCR es no funcional con respecto a la proteína G; (c) proporciona una célula de control que expresa un monómero de dicho primer GPCR asociado con dicha primer proteína G en donde tanto GPCR como la proteína G son funcionales;} - 1 06 - (d) contactar dicho primer, segundo y célula de control con un compuesto capaz de unirse al sitio de unión del ligando presente en los GPCR primero y/o segundo; (e) repetir las etapas (a) a (d) con una proteína G diferente, primera y/o segundo; y (f) evaluar un acoplamiento de proteína G diferencial. 88. Un método según la reivindicación 87, caracterizado porque la primer y segunda proteína G se selecciona de Gs, Gi, Gq, G 1 1 , G12, G1 3, G15, G16, Go o Gz. 89. Un método según la reivindicación 87, caracterizado porque dicha primer y segunda proteína G se selecciona de una proteína G que modula un nivel intracelular seleccionado de Ca2+, cA P, cGMP, inositol 1 , 4, 5 trifosfato, diacilglicerol, actividad de quinasa C de proteína, o actividad de quinasa MAP. 90. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 87 a 89, caracterizado porque el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G y en donde dicha forma tipo salvaje del primer GPCR es el mismo que el segundo GPCR. - 107 - 91 . Un método según cualquiera de las reivindicaciones 87 a 89, caracterizado porque el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G y en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente del segundo GPCR. 92. Un método según la reivindicación 87, caracterizado porque el primer y segundo GPCR tipo salvaje se coexpresan endógenamente en al menos un tipo celular. 93. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 87 a 92, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipos salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 94. Un método según la reivindicación 93, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo intracelular del GPCR. 95. Un método según la reivindicación 94, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 96. Un método según la reivindicación 93 o reivindicación 94, caracterizado porque el 2do ciclo intracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácidos resaltados. - 108 - 97. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 87 a 96 caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 98. Un método según la reivindicación 97 , caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 99. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 87 a 98, caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 100. Un método según la reivindicación 99, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 101 . Un método para evaluar acoplamiento de proteína G diferencial que comprende las etapas de (a) proporcionar una primer célula que expresa un oligómero GPCR comprendiendo (i) un primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el GPCR es no funcional con respecto a la proteína G; (ii) el segundo G PCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; (b) proporciona una segunda célula que expresa el segundo GPCR asociado con la primer proteína G en donde tanto el GPCR y la proteína G son funcionales; - 109 - (c) contactar dichas células, primera y segunda, con un compuesto capaz de unirse al sitio de unión del ligando presente en el segundo GPCR; (d) repetir las etapas (a) a (c) una o más veces con una primer proteína G diferente; (e) repetir opcionalmente las etapas (a) a (d) una o más veces con un primer GPCR diferente; y (f) evaluar acoplamiento de proteína G diferencial por el segundo GPCR. 102. Un método según la reivindicación 1 01 , caracterizado porque la primer y segunda protelna G se selecciona de Gs, Gi, Gq, G1 1 , G12, G13, G15, G16, Go o Gz. 103. Un método según la reivindicación 1 01 , caracterizado porque dicha primer y segunda proteína G se selecciona de una proteína G que modula un nivel intracelular seleccionado de Ca2+, cAMP, cGMP, ¡nositol 1 , 4, 5 trifosfato, diacilglicerol, actividad de quinasa C de proteína, o actividad de quinasa AP. 104. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 101 a 1 03, caracterizado porque el primer GPCR tiene una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con - 1 10 -la secuencia GPCR tipo salvaje para volverla no funcional con respecto a la primer proteína G y en donde la forma tipo salvaje del primer GPCR es diferente al segundo GPCR. 105. Un método según la reivindicación 1 01 , caracterizado porque el primer y segundo GPCR tipo salvaje se coexpresan endógenamente en al menos un tipo celular. 106. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 101 a 105, caracterizado porque el primer GPCR se muta en comparación con su GPCR tipos salvaje por substitución de al menos un residuo de aminoácido. 107. Un método según la reivindicación 106, caracterizado porque el al menos un aminoácido está presente en el 2do ciclo ¡ntracelular del GPCR. 108. Un método según la reivindicación 1 07, caracterizado porque el al menos un aminoácido es un residuo de aminoácido hidrofóbico y se substituye por un residuo de aminoácido ácido. 109. Un método según la reivindicación 105 o reivindicación 107, caracterizado porque el 2do ciclo ¡ntracelular tiene una secuencia seleccionada del grupo mostrado en la figura 3 y el al menos un residuo de aminoácido se selecciona de los residuos de aminoácidos resaltados. 1 1 0. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 01 a 1 09 caracterizado porque la segunda proteína G se muta en comparación con la proteína G tipo salvaje por - 1 1 1 -substitución de al menos un residuo de aminoácido. 1 1 1 . Un método según la reivindicación 1 10, caracterizado porque el residuo de aminoácido substituido es glicina. 1 12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 01 a 1 1 1 , caracterizado porque los GPCRs, primero y segundo, son GPCRs clase A. 1 13. Un método según la reivindicación 1 12, caracterizado porque GPCRs clase A se seleccionan del grupo proporcionado en la figura 3. 1 14. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende un compuesto capaz de interactuar con un oligómero GPCR, dicho método comprendiendo las etapas de a) proporcionar una célula que expresa un reactivo biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; b) contactar dicho reactivo biológico con dicho compuesto; c) determinar si dicho compuesto interactúa oligómero GPCR; y d) mezclar dicho compuesto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. - 1 12 - 1 15. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la habilidad de modular la unión entre un oligómero GPCR y su ligando, dicho método comprendiendo a) producir una célula que expresa un oligómero GPCR que comprende un (i) primer GPCR asociado con una primer proteína G en donde el GPCR es no funcional con respecto a la proteína G; (ii) un segundo GPCR asociado con una segunda proteína G en donde la segunda proteína G es no funcional; b) contactar dicha célula con un compuesto prueba en la presencia de dicho ligando; c) comparar la habilidad de dicho ligando para unir oligómero GPCR con la habilidad de dicho ligando para unir el oligómero GPCR bajo condiciones comparables pero en la ausencia de dicho compuesto; y d) mezclar dicho compuesto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. 1 16. Un método para tratar un desorden en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva del compuesto identificado según la reivindicación 58 o - 1 13 -reivindicación 73 , en donde dicho desorden se relaciona con un tipo celular conocido por coexpresar endógenamente dicho primer GPCR y dicho segundo GPCR. 1 17. El método según la reivindicación 1 1 6, caracterizado porque dicho primer GPCR y dicho segundo GPCR se coexpresan por un tipo celular incluido en la Tabla 1 . 1 1 8. El método según la reivindicación 1 16 o reivindicación 1 17, caracterizado porque dicho compuesto es un agonista y dicho desorden se alivia al incrementar la actividad del oligómero. 1 19. El método según la reivindicación 1 16 o reivindicación 1 17, caracterizado porque dicho compuesto es un antagonista y dicho desorden se alivia al reducir la actividad del oligómero. 120. El método según la reivindicación 1 1 6 o reivindicación 1 1 7, caracterizado porque dicho compuesto es un agonista inverso y dicho desorden se alivia al reducir la actividad del oligómero. 121 . Un método para tratar un desorden en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva del compuesto identificado según el método de la reivindicación 58 o reivindicación 73, caracterizado porque dicho desorden se relaciona con un tipo celular conocido para coexpresar endógenamente dicho primer GPCR y dicho segundo GPCR. 122. El método según la reivindicación 1 21 , - 1 14 -caracterizado porque dicho primer GPCR y dicho segundo GPCR se coexpresan por un tipo celular incluido en la Tabla 1 . 123. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un agonista, dicho compuesto incrementa la unión de dicho agonista a dicho oligomero, y dicho desorden se alivia al incrementar la actividad del oligomero. 124. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un agonista, dicho compuesto reduce la unión de dicho agonista a dicho oligomero, y dicho desorden se alivia al reducir la actividad del oligomero. 125. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un antagonista, dicho compuesto incrementa la unión de dicho antagonista a dicho oligomero, y dicho desorden se alivia al reducir la actividad del oligomero. 126. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un antagonista, dicho compuesto reduce la unión de dicho antagonista a dicho oligomero, y dicho desorden se alivia al incrementar la actividad del oligomero. 127. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un agonista inverso, dicho compuesto incrementa la unión de dicho - 1 15 -agonista inverso a dicho oligómero, y dicho desorden se alivia al reducir la actividad del oligómero. 128. El método según la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizado porque dicho ligando es un agonista inverso, dicho compuesto reduce la unión de dicho agonista inverso a dicho oligómero, y dicho desorden se alivia al incrementar la actividad del oligómero. - 1 16 - RESUM EN La invención proporciona materiales y métodos que se relacionan con oligómeros receptores acoplados a la proteína G (GPCR) . Se proporcionan los compuestos de dos o más GPCRs asociados con proteínas G. También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden un GPCR y una proteína G, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped. También se proporcionan métodos para producir los com puestos y proteínas de fusión de la invención.