JP3229670B2 - 光熱偏向分光法を用いた免疫測定法 - Google Patents
光熱偏向分光法を用いた免疫測定法Info
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光熱偏向分光法を用い
た免疫測定方法に関する。
た免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】試料に特定波長を有する励起光を照射
し、これより試料中の光熱変換活性を有する物質が発生
する熱量を、試料の上を通過させたプローブ光の偏向に
より検出し、該検出熱量から試料中の特定の光熱変換活
性を有する物質の量を測定する、光熱偏向分光法が知ら
れている〔アナリティカル ケミストリー（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９１年，６３
巻，２１７頁〕。
し、これより試料中の光熱変換活性を有する物質が発生
する熱量を、試料の上を通過させたプローブ光の偏向に
より検出し、該検出熱量から試料中の特定の光熱変換活
性を有する物質の量を測定する、光熱偏向分光法が知ら
れている〔アナリティカル ケミストリー（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９１年，６３
巻，２１７頁〕。
【０００３】抗原抗体反応を利用し、被測定物質の量を
求める免疫測定法のなかで、標識物質として放射性同位
元素等の代わりに光熱変換活性を有する物質を用い、光
熱偏向分光法により被測定物質の量を測定する方法が知
られているが〔アナリティカル サイエンス（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），１９９１年，７
巻，１３８７頁〕、光熱偏向効果を増幅させる担体を用
いる方法は知られていない。
求める免疫測定法のなかで、標識物質として放射性同位
元素等の代わりに光熱変換活性を有する物質を用い、光
熱偏向分光法により被測定物質の量を測定する方法が知
られているが〔アナリティカル サイエンス（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），１９９１年，７
巻，１３８７頁〕、光熱偏向効果を増幅させる担体を用
いる方法は知られていない。
【０００４】免疫測定法は、被測定物質とこれに対する
抗原または抗体とを反応させた後、未反応標識物質と反
応標識物質を分離、洗浄する過程（Ｂ／Ｆ分離）を持つ
ヘテロジニアス系と、未反応標識物質と反応標識物質を
Ｂ／Ｆ分離することなく測定するホモジニアス系に分類
されるが、光熱偏向分光法を用いた免疫測定法において
ホモジニアス系で行う方法は知られていない。
抗原または抗体とを反応させた後、未反応標識物質と反
応標識物質を分離、洗浄する過程（Ｂ／Ｆ分離）を持つ
ヘテロジニアス系と、未反応標識物質と反応標識物質を
Ｂ／Ｆ分離することなく測定するホモジニアス系に分類
されるが、光熱偏向分光法を用いた免疫測定法において
ホモジニアス系で行う方法は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】免疫測定法において、
ホモジニアス系での測定法はヘテロジニアス系での測定
法に比べ方法が簡便で迅速に測定できる利点を有する
が、反応した標識物質以外の未反応標識物質が共存して
いるために、検出される標識物質からの信号には反応物
由来の信号（Ｓ）と共に未反応物由来の信号（ノイズ：
Ｎ）が含まれており、信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が悪
い。このためホモジニアス系での免疫測定法の測定精度
は低く、改善が望まれている。
ホモジニアス系での測定法はヘテロジニアス系での測定
法に比べ方法が簡便で迅速に測定できる利点を有する
が、反応した標識物質以外の未反応標識物質が共存して
いるために、検出される標識物質からの信号には反応物
由来の信号（Ｓ）と共に未反応物由来の信号（ノイズ：
Ｎ）が含まれており、信号／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が悪
い。このためホモジニアス系での免疫測定法の測定精度
は低く、改善が望まれている。
【０００６】本発明の目的は、光熱偏向効果を増幅させ
る担体をサンドイッチ式免疫測定法の固定化担体に結合
させて用いる光熱偏向分光法を提供することにある。
る担体をサンドイッチ式免疫測定法の固定化担体に結合
させて用いる光熱偏向分光法を提供することにある。
【０００７】該方法により、標識物質からの信号のうち
反応物由来の信号が特異的に増幅されてＳ／Ｎ比が向上
し、Ｂ／Ｆ分離を簡易化した系あるいはＢ／Ｆ分離を省
略したホモジニアスな系でも測定を行うことができる。
反応物由来の信号が特異的に増幅されてＳ／Ｎ比が向上
し、Ｂ／Ｆ分離を簡易化した系あるいはＢ／Ｆ分離を省
略したホモジニアスな系でも測定を行うことができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の被測
定抗原または被測定抗体に、被測定抗原に対する抗体ま
たは被測定抗体に対する抗原と光熱偏向効果を増幅させ
る担体とを結合させた固定化抗体または抗原を結合さ
せ、ついで光熱変換活性を有する物質を結合した被測定
抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原を第２
抗体または第２抗原として反応させ、結合した第２抗体
または第２抗原の量を光熱偏向分光法により測定する抗
原または抗体の定量法に関する。
定抗原または被測定抗体に、被測定抗原に対する抗体ま
たは被測定抗体に対する抗原と光熱偏向効果を増幅させ
る担体とを結合させた固定化抗体または抗原を結合さ
せ、ついで光熱変換活性を有する物質を結合した被測定
抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原を第２
抗体または第２抗原として反応させ、結合した第２抗体
または第２抗原の量を光熱偏向分光法により測定する抗
原または抗体の定量法に関する。
【０００９】本発明における被測定抗原または被測定抗
体としては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブリ
ン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体
（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ１ｑ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲ
Ｐ）、α1 −アンチトリプシン、α1 −マイクログロブ
リン、β2 −マイクログロブリン、ハプトグロブリン、
トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、ア
ルブミン、ヘモグロビンＡ1 、ヘモグロビンＡ1C、ミオ
グロブリン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロ
テイン（ＡＦＰ）、前立腺由来酸性ホスファターゼ（Ｐ
ＡＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、神経特異エ
ノラーゼ（ＮＳＥ）、アポリポ蛋白Ａ1、アポリポ蛋白
Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、
フィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フ
ィブリン分解産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分
解産物Ｄ−Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ Ｄｉｍｅｒ）、フィブ
リン分解産物Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン
−III （ＡＴ−III)、フィブリノーゲン、プラスミノー
ゲン等の蛋白質、エラスターゼ、クレアチンキナーゼ心
筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、インシュリン、甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳＨ）、3,5,3 ´−トリヨードサイロニ
ン（Ｔ3 ）、サイロキシン（Ｔ4 ）、副腎皮質刺激ホル
モン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモン（ＧＨ）、黄体化ホル
モン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗
体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗
体、ＨＴＬＶ（成人Ｔ細胞白血病ウイルス）抗体、ＨＩ
Ｖ（エイズウイルス）抗体、クラミジア抗体、梅毒の抗
体、トキソプラズマ抗体等各種感染症の原因ウイルスに
対する抗体等があげられる。
体としては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブリ
ン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体
（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ１ｑ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲ
Ｐ）、α1 −アンチトリプシン、α1 −マイクログロブ
リン、β2 −マイクログロブリン、ハプトグロブリン、
トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、ア
ルブミン、ヘモグロビンＡ1 、ヘモグロビンＡ1C、ミオ
グロブリン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロ
テイン（ＡＦＰ）、前立腺由来酸性ホスファターゼ（Ｐ
ＡＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、神経特異エ
ノラーゼ（ＮＳＥ）、アポリポ蛋白Ａ1、アポリポ蛋白
Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、
フィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フ
ィブリン分解産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分
解産物Ｄ−Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ Ｄｉｍｅｒ）、フィブ
リン分解産物Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン
−III （ＡＴ−III)、フィブリノーゲン、プラスミノー
ゲン等の蛋白質、エラスターゼ、クレアチンキナーゼ心
筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、インシュリン、甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳＨ）、3,5,3 ´−トリヨードサイロニ
ン（Ｔ3 ）、サイロキシン（Ｔ4 ）、副腎皮質刺激ホル
モン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモン（ＧＨ）、黄体化ホル
モン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗
体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗
体、ＨＴＬＶ（成人Ｔ細胞白血病ウイルス）抗体、ＨＩ
Ｖ（エイズウイルス）抗体、クラミジア抗体、梅毒の抗
体、トキソプラズマ抗体等各種感染症の原因ウイルスに
対する抗体等があげられる。
【００１０】また被測定抗原に対する抗体は、被測定抗
原に対するポリクローナル抗体、被測定抗原に対するモ
ノクローナル抗体等通常抗原に対して作成し得る抗体が
あげられる〔「単クーロン抗体実験マニュアル」，富山
朔二ら編、講談社サイエンティフィック刊，１９８７
年：新生化学実験講座 第１２巻，「分子免疫学 III抗
原、抗体、補体」，日本生化学会編，東京化学同人社
刊，１９９２年〕。
原に対するポリクローナル抗体、被測定抗原に対するモ
ノクローナル抗体等通常抗原に対して作成し得る抗体が
あげられる〔「単クーロン抗体実験マニュアル」，富山
朔二ら編、講談社サイエンティフィック刊，１９８７
年：新生化学実験講座 第１２巻，「分子免疫学 III抗
原、抗体、補体」，日本生化学会編，東京化学同人社
刊，１９９２年〕。
【００１１】また被測定抗体に対する抗原は、遺伝子操
作等により人工的に作製するかまたは天然の抗原の抗体
結合部位を用いる。例えば、被測定抗体が各種感染症の
原因ウイルスに対する抗体である場合、被測定抗体に対
する抗原は上述の感染症のウイルスのマーカー蛋白質等
を用いることができる。
作等により人工的に作製するかまたは天然の抗原の抗体
結合部位を用いる。例えば、被測定抗体が各種感染症の
原因ウイルスに対する抗体である場合、被測定抗体に対
する抗原は上述の感染症のウイルスのマーカー蛋白質等
を用いることができる。
【００１２】光熱偏向効果を増幅させる担体とは、光熱
偏向分光法に用いる光源の励起波長付近の光を吸収しな
い物質であればよくポリスチレン、カルボキシル化ポリ
スチレン、ポリビニルトルエン、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、スチレンーブタジエン共重合体、カル
ボキシル化スチレンーブタジエン共重合体、アクリル酸
エステル共重合体またはメタクリル酸エステル共重合体
等より得られるラテックス等の有機高分子、ガラス、カ
オリン等の無機物質があげられる。該担体の粒子径は１
〜５００μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍであ
る。
偏向分光法に用いる光源の励起波長付近の光を吸収しな
い物質であればよくポリスチレン、カルボキシル化ポリ
スチレン、ポリビニルトルエン、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、スチレンーブタジエン共重合体、カル
ボキシル化スチレンーブタジエン共重合体、アクリル酸
エステル共重合体またはメタクリル酸エステル共重合体
等より得られるラテックス等の有機高分子、ガラス、カ
オリン等の無機物質があげられる。該担体の粒子径は１
〜５００μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍであ
る。
【００１３】固定化抗原または抗体は、前述の被測定抗
原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原と前述の
光熱偏向効果を増幅させる担体とを、ジアゾ法、ペプチ
ド法、アルキル化法もしくはカルボジイミド、Ｎ−サク
シニミジル−２−ピリジルチオ−３−プロピオン酸（Ｓ
ＰＤＰ）、塩化シアン等の架橋試薬を用いた担体結合法
等からなる化学的結合法または疎水的な結合を利用した
物理的吸着法からなる物理的結合法により結合させて得
ることができる（新生化学実験講座 第１巻，「タンパ
ク質 IV 構造機能相関」，日本生化学会編，東京化学
同人社刊，１９９１年：「固定化酵素」、千畑一郎編、
講談社サイエンティフィック刊，１９７５年）。
原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原と前述の
光熱偏向効果を増幅させる担体とを、ジアゾ法、ペプチ
ド法、アルキル化法もしくはカルボジイミド、Ｎ−サク
シニミジル−２−ピリジルチオ−３−プロピオン酸（Ｓ
ＰＤＰ）、塩化シアン等の架橋試薬を用いた担体結合法
等からなる化学的結合法または疎水的な結合を利用した
物理的吸着法からなる物理的結合法により結合させて得
ることができる（新生化学実験講座 第１巻，「タンパ
ク質 IV 構造機能相関」，日本生化学会編，東京化学
同人社刊，１９９１年：「固定化酵素」、千畑一郎編、
講談社サイエンティフィック刊，１９７５年）。
【００１４】光熱変換活性を有する物質としては、通常
２００〜１０００nmの波長の光線に対し特異的な吸収を
有する化学物質であればよく、アゾ系色素、キノン系色
素、ポリエン系色素、フェノチアジオン系色素、インジ
ゴ系色素、トリフェニルメタン系色素、ポリメチン系色
素、アクリジン系色素、フタロシアニン系色素、スクア
リン酸系色素等の色素、金コロイド等の金属、鉄オキシ
ン錯体、ヘム等の無機錯体、ペルオキシダーゼ、ヘモグ
ロビン、シトクロム、クロロフィル等の金属含有蛋白
質、フィコシアニン等の色素蛋白質等があげられる。
２００〜１０００nmの波長の光線に対し特異的な吸収を
有する化学物質であればよく、アゾ系色素、キノン系色
素、ポリエン系色素、フェノチアジオン系色素、インジ
ゴ系色素、トリフェニルメタン系色素、ポリメチン系色
素、アクリジン系色素、フタロシアニン系色素、スクア
リン酸系色素等の色素、金コロイド等の金属、鉄オキシ
ン錯体、ヘム等の無機錯体、ペルオキシダーゼ、ヘモグ
ロビン、シトクロム、クロロフィル等の金属含有蛋白
質、フィコシアニン等の色素蛋白質等があげられる。
【００１５】第２抗体または第２抗原は、前述の光熱変
換活性を有する物質と前述の被測定抗原に対する抗体ま
たは被測定抗体に対する抗原とを、前述の固定化抗原ま
たは抗体の作製方法に準じて結合させて作製するか、ま
たは両者を担体を介して前述の方法により結合させて作
製することができる。担体としては、光熱変換活性およ
び光熱偏向効果の増幅活性を持たないものであればよ
く、例えば、粒子径０．５μｍ以下のポリスチレンラテ
ックス等を用いることができる。
換活性を有する物質と前述の被測定抗原に対する抗体ま
たは被測定抗体に対する抗原とを、前述の固定化抗原ま
たは抗体の作製方法に準じて結合させて作製するか、ま
たは両者を担体を介して前述の方法により結合させて作
製することができる。担体としては、光熱変換活性およ
び光熱偏向効果の増幅活性を持たないものであればよ
く、例えば、粒子径０．５μｍ以下のポリスチレンラテ
ックス等を用いることができる。
【００１６】本発明におけるサンドイッチ法による抗原
抗体反応は、一般的な抗原抗体反応の条件下で行われ、
中性、弱酸性または弱塩基性に調製したリン酸緩衝液、
トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液の存在下、固定化抗体ま
たは抗原と試料中の被測定抗原または被測定抗体とを反
応させる。反応は４〜４０℃で３０秒〜２４時間で終了
する。ついで該反応溶液に第２抗体または第２抗原を加
え被測定抗原または被測定抗体と反応させる。反応は４
〜４０℃で３０秒〜７２時間で終了する。反応系には反
応の促進剤、アルブミン等の安定化剤等を適宣添加する
ことができる。これらの添加物は被測定物を失活させる
ことがなく、かつ抗原抗体反応および光熱偏向分光法を
阻害しないものであればいずれも利用できる。
抗体反応は、一般的な抗原抗体反応の条件下で行われ、
中性、弱酸性または弱塩基性に調製したリン酸緩衝液、
トリス−塩酸緩衝液等の緩衝液の存在下、固定化抗体ま
たは抗原と試料中の被測定抗原または被測定抗体とを反
応させる。反応は４〜４０℃で３０秒〜２４時間で終了
する。ついで該反応溶液に第２抗体または第２抗原を加
え被測定抗原または被測定抗体と反応させる。反応は４
〜４０℃で３０秒〜７２時間で終了する。反応系には反
応の促進剤、アルブミン等の安定化剤等を適宣添加する
ことができる。これらの添加物は被測定物を失活させる
ことがなく、かつ抗原抗体反応および光熱偏向分光法を
阻害しないものであればいずれも利用できる。
【００１７】該抗原抗体反応により、試料中の被測定抗
原または被測定抗体と相当量の第２抗体または第２抗原
が固定化抗原または抗体と結合して存在し、過剰の標識
化第２抗体または第２抗原は溶液中に存在する。
原または被測定抗体と相当量の第２抗体または第２抗原
が固定化抗原または抗体と結合して存在し、過剰の標識
化第２抗体または第２抗原は溶液中に存在する。
【００１８】本発明の光熱偏向分光法による測定法は、
通常の光熱偏向分光法であれば良く以下の測定手順およ
び原理で行われる。抗原抗体反応終了後の反応液を合成
石英、ガラス、パイレックス、ポリスチレン、メタクリ
レート等のセルにいれ、光熱偏向分光装置に装着する
か、または該装置に装着した上記のセル中で当該反応を
行った後、セル中の反応液に光熱偏向分光装置の光源か
ら励起光を照射する。このとき励起光は試料に対してい
ずれの角度から照射しても良い。第２抗体または第２抗
原は光熱変換活性を有する物質を結合しているので励起
光の照射により、熱を発生するが、固定化抗原または抗
体と連結して存在する第２抗体または第２抗原は、光熱
偏向効果を増幅させる担体の効果により、とりわけ高い
熱を発生する。該発熱反応により光熱偏向分光装置中の
プローブ光が偏向現象をおこし、これを偏向分光装置に
より検出し、標識化合物の量を測定することができる。
光熱偏向効果を増幅させる担体の効果により、測定され
る熱量の大部分が被測定抗原または被測定抗体と結合し
ている第２抗体または第２抗原に由来するため、本方法
においては測定された標識化合物の量は被測定抗原量ま
たは被測定抗体量に対応している。つまり本方法を用い
れば、光熱偏向分光法を用いたホモジニアス系での被測
定抗原または被測定抗体の定量が可能になる。
通常の光熱偏向分光法であれば良く以下の測定手順およ
び原理で行われる。抗原抗体反応終了後の反応液を合成
石英、ガラス、パイレックス、ポリスチレン、メタクリ
レート等のセルにいれ、光熱偏向分光装置に装着する
か、または該装置に装着した上記のセル中で当該反応を
行った後、セル中の反応液に光熱偏向分光装置の光源か
ら励起光を照射する。このとき励起光は試料に対してい
ずれの角度から照射しても良い。第２抗体または第２抗
原は光熱変換活性を有する物質を結合しているので励起
光の照射により、熱を発生するが、固定化抗原または抗
体と連結して存在する第２抗体または第２抗原は、光熱
偏向効果を増幅させる担体の効果により、とりわけ高い
熱を発生する。該発熱反応により光熱偏向分光装置中の
プローブ光が偏向現象をおこし、これを偏向分光装置に
より検出し、標識化合物の量を測定することができる。
光熱偏向効果を増幅させる担体の効果により、測定され
る熱量の大部分が被測定抗原または被測定抗体と結合し
ている第２抗体または第２抗原に由来するため、本方法
においては測定された標識化合物の量は被測定抗原量ま
たは被測定抗体量に対応している。つまり本方法を用い
れば、光熱偏向分光法を用いたホモジニアス系での被測
定抗原または被測定抗体の定量が可能になる。
【００１９】光熱偏向分光法の光源としては特定の波長
の光を発振するものであればよく、白色光源好ましくは
レーザー光源を用いる。適当なレーザー光源としてはヘ
リウム−ネオンレーザー、エキシマレーザー、アルゴン
レーザー、炭酸ガスレーザー、ルビーレーザー、Ｎｄ−
ＹＡＧレーザー、半導体レーザー、色素レーザーがあげ
られる。光源としてアルゴンレーザーを用いる場合は、
光熱変換活性を有する物質としてサンセットイエロー等
のアゾ色素、鉄オキシン錯体、ヘム等の無機錯体、金コ
ロイド等を用いるのが好ましく、半導体レーザーを用い
る場合はシアニン系色素、スクアリン酸系色素、フタロ
シアニン系色素を用いることが好ましい。励起光の波長
については紫外部、可視部、近赤外部の領域で使用可能
であるが、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長であること
が好ましい。
の光を発振するものであればよく、白色光源好ましくは
レーザー光源を用いる。適当なレーザー光源としてはヘ
リウム−ネオンレーザー、エキシマレーザー、アルゴン
レーザー、炭酸ガスレーザー、ルビーレーザー、Ｎｄ−
ＹＡＧレーザー、半導体レーザー、色素レーザーがあげ
られる。光源としてアルゴンレーザーを用いる場合は、
光熱変換活性を有する物質としてサンセットイエロー等
のアゾ色素、鉄オキシン錯体、ヘム等の無機錯体、金コ
ロイド等を用いるのが好ましく、半導体レーザーを用い
る場合はシアニン系色素、スクアリン酸系色素、フタロ
シアニン系色素を用いることが好ましい。励起光の波長
については紫外部、可視部、近赤外部の領域で使用可能
であるが、２００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長であること
が好ましい。
【００２０】以下に本発明の実施例を示す。
【００２１】
実施例 （１）固定化マウス抗ＣＥＡ抗体の作製法 １０％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（粒子径
１０μｍ）〔ダウケミカル社製〕を用いて１％ポリスチ
レンラテックス粒子含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７）を調製した。該ラテックス含有緩衝液１ｍｌにマウ
ス由来の抗がん胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（宝酒造社
製）１ｍｇを加え、３７℃で約２時間攪拌した後、遠心
分離し（５０００ｒｐｍ、２０分）て上清を除き、得ら
れた固定化抗体を０．５％牛血清アルブミン含有の０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再度分散させた。
１０μｍ）〔ダウケミカル社製〕を用いて１％ポリスチ
レンラテックス粒子含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７）を調製した。該ラテックス含有緩衝液１ｍｌにマウ
ス由来の抗がん胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（宝酒造社
製）１ｍｇを加え、３７℃で約２時間攪拌した後、遠心
分離し（５０００ｒｐｍ、２０分）て上清を除き、得ら
れた固定化抗体を０．５％牛血清アルブミン含有の０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再度分散させた。
【００２２】（２）第２抗体の作製法 鉄標準液〔和光純薬社製、１０００ｐｐｍ〕１ｍｌと
０．８５％オキシン含有１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）２ｍ
ｌを混和し、混和溶液のｐＨを１Ｍ酢酸緩衝液で４に調
整した。また１０％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス
粒子（粒子径０．０７μｍ）〔ダウケミカル社製〕を用
いて調製した１％ポリスチレンラテックス粒子含有水１
ｍｌを加え、室温で２時間攪拌し、濾過、乾燥させて鉄
−オキシン結合ラテックスを調製した。１％鉄−オキシ
ン結合ラテックス含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）
１ｍｌにマウス由来の抗ＣＥＡモノクローナル抗体（生
化学工業製）１ｍｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、３７℃で約２
時間攪拌した後、遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５０
分）て上清を除いて、沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７）に懸濁させた。該懸濁液を良く攪拌した後、再度
遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５０分）て上清を除い
た。得られた第２抗体を０．５％牛血清アルブミン含有
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再度分散させた。
０．８５％オキシン含有１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）２ｍ
ｌを混和し、混和溶液のｐＨを１Ｍ酢酸緩衝液で４に調
整した。また１０％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテックス
粒子（粒子径０．０７μｍ）〔ダウケミカル社製〕を用
いて調製した１％ポリスチレンラテックス粒子含有水１
ｍｌを加え、室温で２時間攪拌し、濾過、乾燥させて鉄
−オキシン結合ラテックスを調製した。１％鉄−オキシ
ン結合ラテックス含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）
１ｍｌにマウス由来の抗ＣＥＡモノクローナル抗体（生
化学工業製）１ｍｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、３７℃で約２
時間攪拌した後、遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５０
分）て上清を除いて、沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７）に懸濁させた。該懸濁液を良く攪拌した後、再度
遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５０分）て上清を除い
た。得られた第２抗体を０．５％牛血清アルブミン含有
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再度分散させた。
【００２３】（３）ＣＥＡ量の測定 固定化マウス抗ＣＥＡ抗体を粒子量として０．０５ｍｇ
とＣＥＡ（１ng/ml、１０ng/ml、１００ng/ml ）とをリ
ン酸緩衝液中３７℃で１０分間反応させた。これに第２
抗体（０．０１ｍｇ）を加えさらに１０分反応させた。
反応溶液をセルに移し光熱偏向分光装置に装着した。ア
ルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源とし
て、光チョッパー２の変調周波数は３２０Ｈｚの条件下
で励起光を照射した。励起光の照射により生じたプロー
ブ光の偏向を測定した。第１表に信号強度を、また図１
にＣＥＡの検量線を示した。
とＣＥＡ（１ng/ml、１０ng/ml、１００ng/ml ）とをリ
ン酸緩衝液中３７℃で１０分間反応させた。これに第２
抗体（０．０１ｍｇ）を加えさらに１０分反応させた。
反応溶液をセルに移し光熱偏向分光装置に装着した。ア
ルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）を光源とし
て、光チョッパー２の変調周波数は３２０Ｈｚの条件下
で励起光を照射した。励起光の照射により生じたプロー
ブ光の偏向を測定した。第１表に信号強度を、また図１
にＣＥＡの検量線を示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】第１表および図１によれば、粒子径１０μ
ｍの光熱偏向効果を増幅させる担体（粒子径１０μｍの
ポリスチレンラテックス粒子）を用いた本発明方法はホ
モジニアスな系においても良好な検量線が得られた。
ｍの光熱偏向効果を増幅させる担体（粒子径１０μｍの
ポリスチレンラテックス粒子）を用いた本発明方法はホ
モジニアスな系においても良好な検量線が得られた。
【００２６】さらにＳ／Ｎ比を測定するため、第２抗体
を加えて反応を終了させた後、反応溶液を遠心分離（５
０００ｒｐｍ、２０分）にて固相（反応標識物）と液相
（未反応標識物）に分離した。液相および緩衝液に再懸
濁させた固相を各々セルに移し、光熱偏向分光法により
信号強度を測定した。結果を第２表に示した。
を加えて反応を終了させた後、反応溶液を遠心分離（５
０００ｒｐｍ、２０分）にて固相（反応標識物）と液相
（未反応標識物）に分離した。液相および緩衝液に再懸
濁させた固相を各々セルに移し、光熱偏向分光法により
信号強度を測定した。結果を第２表に示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】参考例 粒子径が１０ｍｍのポリスチレンラテックス粒子に結合
したマウス由来の抗ＣＥＡ抗体（０．０５ｍｇ）を固定
化マウス抗ＣＥＡ抗体に用いる以外は実施例と同様の方
法でＣＥＡ量（１ng/ml 、１０ng/ml 、１００ng/ml ）
を測定した。第１表に信号強度を、また図１にＣＥＡの
検量線を示した。
したマウス由来の抗ＣＥＡ抗体（０．０５ｍｇ）を固定
化マウス抗ＣＥＡ抗体に用いる以外は実施例と同様の方
法でＣＥＡ量（１ng/ml 、１０ng/ml 、１００ng/ml ）
を測定した。第１表に信号強度を、また図１にＣＥＡの
検量線を示した。
【００２９】第１表および図１によれば、光熱偏向効果
を増幅させる担体を用いた実施例は該担体を用いない参
考例より、良好な検量線が得られた。
を増幅させる担体を用いた実施例は該担体を用いない参
考例より、良好な検量線が得られた。
【００３０】さらにＳ／Ｎ比を測定するため、実施例と
同様の方法により固相（反応標識物）と液相（未反応標
識物）の信号強度を測定した。結果を第２表に示した。
同様の方法により固相（反応標識物）と液相（未反応標
識物）の信号強度を測定した。結果を第２表に示した。
【００３１】第２表によれば、光熱偏向効果を増幅させ
る担体を用いた実施例は該担体を用いない参考例より、
Ｓ／Ｎ比が著しく向上した。
る担体を用いた実施例は該担体を用いない参考例より、
Ｓ／Ｎ比が著しく向上した。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、高いＳ／Ｎ比が得られ簡
便なホモジニアス系でも行うことができる光熱偏向分光
法による抗原または抗体の定量法が提供される。
便なホモジニアス系でも行うことができる光熱偏向分光
法による抗原または抗体の定量法が提供される。
【図１】ＣＥＡの検量線
−●− 光熱偏向効果を増幅させる担体を用いた方法 −○− 光熱偏向効果を増幅させる担体を用いない方法
Claims (6)
- 【請求項１】 試料中の被測定抗原または被測定抗体
に、被測定抗原に対する抗体または被測定抗体に対する
抗原と光熱偏向効果を増幅させる担体粒子とを結合させ
た固定化抗体または固定化抗原を結合させ、ついで光熱
変換活性を有する物質を結合した被測定抗原に対する抗
体または被測定抗体に対する抗原を第２抗体または第２
抗原として反応させ、結合した第２抗体または第２抗原
の量をＢ／Ｆ分離することなく、光熱偏向分光法により
測定する試料中の被測定抗原または被測定抗体の定量
法。 - 【請求項２】 光熱偏向効果を増幅させる担体粒子の粒
子径が１〜５００μｍである請求項１記載の試料中の被
測定抗原または被測定抗体の定量法。 - 【請求項３】 光熱偏向効果を増幅させる担体粒子が、
光熱偏向分光法に用いる光源の励起波長付近の光を吸収
しない物質からなる請求項１または２記載の試料中の被
測定抗原または被測定抗体の定量法。 - 【請求項４】 光熱偏向分光法に用いる光源の励起波長
付近の光を吸収しない物質が、ポリスチレン、カルボキ
シル化ポリスチレン、ポリビニルトルエン、スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重
合体、カルボキシル化スチレン−ブタジエン共重合体、
アクリル酸エステル共重合体、メタクリル酸エステル共
重合体、ガラスおよびカオリンからなる群より選ばれる
物質である請求項３記載の試料中の被測定抗原または被
測定抗体の定量法。 - 【請求項５】 光熱変換活性を有する物質が、２００〜
１０００ｎｍの波長の光線に対し特異的な吸収を有する
化学物質である請求項１記載の試料中の被測定抗原また
は被測定抗体の定量法。 - 【請求項６】 化学物質がアゾ系色素、キノン系色素、
ポリエン系色素、フェノチアジオン系色素、インジゴ系
色素、トリフェニルメタン系色素、ポリメチン系色素、
アクリジン系色素、フタロシアニン系色素、スクアリン
酸系色素、金コロイド、鉄オキシン錯体、ヘム、ペルオ
キシダーゼ、ヘモグロビン、シトクロム、クロロフィル
およびフィコシアニンからなる群より選ばれる化学物質
である請求項５記載の試料中の被測定抗原または被測定
抗体の定量法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28133092A JP3229670B2 (ja) | 1992-10-20 | 1992-10-20 | 光熱偏向分光法を用いた免疫測定法 |
| EP93308350A EP0594412B1 (en) | 1992-10-20 | 1993-10-20 | Method of performing an immunoassay using photothermal deflection spectroscopy |
| AT93308350T ATE153134T1 (de) | 1992-10-20 | 1993-10-20 | Immunoassayverfahren unter anwendung photothermischer strahlablenkungsspektroskopie |
| US08/138,069 US5439830A (en) | 1992-10-20 | 1993-10-20 | Method of performing at immunoassay using photothermal deflection spectroscopy |
| DE69310667T DE69310667T2 (de) | 1992-10-20 | 1993-10-20 | Immunoassayverfahren unter Anwendung photothermischer Strahlablenkungsspektroskopie |
| ES93308350T ES2101959T3 (es) | 1992-10-20 | 1993-10-20 | Procedimiento para llevar a cabo un ensayo inmunologico utilizando la espectroscopia de desviacion fototermica. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP28133092A Expired - Fee Related JP3229670B2 (ja) | 1992-10-20 | 1992-10-20 | 光熱偏向分光法を用いた免疫測定法 |
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| US6709857B2 (en) * | 2001-06-26 | 2004-03-23 | Becton, Dickinson And Company | System and method for optically monitoring the concentration of a gas in a sample vial using photothermal spectroscopy to detect sample growth |
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| WO2005065935A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | Collins & Aikman Products Co. | In-mold lamination of a decorative product to a primary substrate |
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| JP4878223B2 (ja) | 2006-06-16 | 2012-02-15 | 国立大学法人東京農工大学 | 核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置 |
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| US10094823B2 (en) | 2015-01-23 | 2018-10-09 | Tokitae Llc | Photothermal spectroscopy assay readers, and related assay kits and methods |
| US10094793B2 (en) * | 2015-09-19 | 2018-10-09 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Nanomaterial-based photothermal immunosensing for quantitative detection of disease biomarkers |
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| US4867840A (en) * | 1986-05-16 | 1989-09-19 | Exxon Research And Engineering Company | Method of making artifically textured layered catalyst |
| US5268746A (en) * | 1989-09-26 | 1993-12-07 | Ente Per Le Nuove Tecnologie, L'energia E L'ambiente (Enea) | Devices for measuring the optical absorption in thin layer materials by using the photothermal deflection spectroscopy |
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- 1992-10-20 JP JP28133092A patent/JP3229670B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-20 ES ES93308350T patent/ES2101959T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-20 DE DE69310667T patent/DE69310667T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-20 EP EP93308350A patent/EP0594412B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-20 US US08/138,069 patent/US5439830A/en not_active Expired - Fee Related
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