JP3221683B2 - ガス駆動型遺伝子搬入装置 - Google Patents

ガス駆動型遺伝子搬入装置

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JP3221683B2
JP3221683B2 JP51966695A JP51966695A JP3221683B2 JP 3221683 B2 JP3221683 B2 JP 3221683B2 JP 51966695 A JP51966695 A JP 51966695A JP 51966695 A JP51966695 A JP 51966695A JP 3221683 B2 JP3221683 B2 JP 3221683B2
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デニス イー マッケイブ
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パウダージェクト ヴァクシンズ， インコーポレイテッド
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、細胞内に物質を搬入する分野に関し、より
詳細には生きた組織に遺伝物質を運び込むことに関する
ものである。
発明の背景 過去十年において、生きた細胞および組織に、物質特
に遺伝物質を粒子−媒介加速注入することが、植物およ
び動物のバイオテクノロジーにおける重要な道具として
出現した。導入されたDNAの一次的発現および生殖系列
への組み込みが、微生物、植物および動物において明ら
かになってきた。
この技術の基礎が打ち立てられるにつれて、作業者に
迅速な継続性をもって、周期的に一連の粒子−媒介遺伝
子搬入を実施する能力をもたらす装置の開発が、ますま
す注目を集めるようになってきた。このような装置は、
ヒトおよび家畜を遺伝的ワクチンで大規模に免疫化する
際に利用するのに特に有利である。
既存の粒子−媒介遺伝子搬入装置の限界の一つは、サ
ンプルを与える形状にある。このような装置の全てにお
いて、該サンプルは小さな、高密度の物質、例えば金ま
たはプラチナの粒子表面に堆積される。この被覆粒子自
体を、次に剛性の表面、例えば金属板、またはマイラー
等の脆い物質の担体シート上に被覆する。この被覆シー
トを、次いでターゲットに向けて加速する。この方法は
幾つかの利点および幾つかの欠点を有する。該利点は平
坦なシートが加速された粒子の極めて均一な拡がりを与
えるという事実に関連している。また、その欠点の一つ
は、各粒子で被覆したプレートまたは担体シートが別々
に調製され、かつ一回だけ使用されることであり、これ
は、特に多数回の反復的遺伝子搬入を想定している場合
に、粒子の加速を時間のかかるものとし、また効率の悪
い方法としている。各被覆担体シートは比較的大きく、
また損傷または汚染を防止するために注意して取り扱う
必要がある。また、往々にして、担体シートの有用な被
覆側と非−被覆側とを識別することが困難でもある。該
担体シートの不適当な配置は処理量を減じ、かつサンプ
ルの浪費をもたらす。
担体粒子の分布または展開パターンが、幾つかの用途
において、即ち生殖系列の獲得が望まれる場合には、他
の用途、特に該組み込み遺伝子の一次的発現のみが必要
とされる場合よりも、より一層臨界的条件となる。稀な
生殖系列形質転換事象が望まれる場合、細胞または組織
の大きな面積に対して粒子を均一に加速する必要があ
る。従って、これまで該被覆粒子をターゲットに向けて
加速する前に、比較的大きな表面上に単層として該被覆
粒子を分布させて、正確に均一な条件下で該粒子を受け
取る細胞の数を最小化し、かつ結果として１個の細胞が
生殖系形質転換を受ける可能性を高めることが望ましい
と考えられてきた。これとは対照的に、細胞内に粒子を
加速注入して体細胞組織、例えば皮膚に一時的な遺伝子
発現を誘発する場合には、該粒子を正確に均一に加速す
ることはあまり必要とされない。というのは、十分な発
現が、実際に粒子が侵入した少数の細胞によっても起こ
るからである。従って、これまでは望ましくなかった粒
子搬入（delivery）技術が、今や望ましいものとなっ
た。
上記のおよび他の限界を克服するために望ましいもの
は、例えば組織中に迅速にかつ周期的に、複数のサンプ
ルを注入することを可能とする高い処理量の遺伝子搬入
装置である。同様に望ましいものは、既存のプラットホ
ームよりも、より永続性のある、より簡単に調製でき、
保存できかつ取り扱えるサンプル保存かつ放出用プラッ
トホームである。
発明の概要 本発明は、大雑把にいえば、加速通路を形成した本体
を含む、圧縮ガス源によって駆動するように設計された
遺伝子搬入装置に関する。バルブによって該圧縮ガスを
該加速通路に送る。この本体には、カートリッジチャン
バーが、生物物質で被覆した担体粒子を含む粒子カート
リッジを受け取るように配置されている。該バルブによ
って解放されたガス流が該加速通路を急速に通過して、
該カートリッジから該担体粒子を受け取るであろう。該
本体から該加速通路の出口端部において、円錐形にテー
パーの付された出口ノズルには、該担体粒子が該装置を
離れる際に、該粒子の分布を外に向かって拡げるように
テーパーが付されている。
本発明の目的の一つは、一貫性のあるかつ反復的様式
で、組織または細胞中に遺伝物質を搬入する装置を提供
することにある。
加圧不活性ガスの噴出によって、該装置から該粒子を
追い出し、かつ該粒子が組織または細胞中に入るのに十
分な力で、これらを運搬することが本発明の特徴の一つ
である。
該装置が、既存の装置のように単一のサンプルを収容
するのではなく、複数のサンプルを収容できることが、
本発明の利点の一つである。
該装置によって搬入されるサンプルは、使用前に調製
でき、また容易に保存並びに取り扱えることも、本発明
の利点の一つである。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の明細書
の記載を、添付図に照らして読むことによって明らかと
なろう。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明を模式的に示した図である。
第２図は、出口ノズルの角度を変えた効果を、模式的
に示す図である。
第３図は、本発明の第一の態様の側面図である。
第４図は、第３図に示した態様のサンプルカートリッ
ジホルダーの正面図である。
第５図は、第３図に示した態様の管状サンプルカート
リッジの一部切除した側面図である。
第６図は、プラスミドpWRG1602の物理的地図である。
第７図は、本発明のもう一つの態様の側面図である。
第８図は、第７図に示した態様の分解図である。
第９図は、第７図に示した態様のバルブの断面図であ
る。
第10図は、第７図に示した態様のアクチュエータ機構
の断面図である。
第11図は、第３図および第７図に示した態様で使用す
る随意のディフューザースクリーンの平面図である。
好ましい態様の詳細な説明 本発明は、遺伝物質で被覆された粒子を、迅速に再現
性よく周期的に、生きたターゲット組織および細胞中に
搬入する装置および方法を提供する。第１図は、ここに
記載する好ましい態様の原理に基いて作動する、粒子加
速による遺伝的形質転換装置の操作の一般的方法を例示
するための模式的な図である。第１図に示した本発明の
装置の部材は、明確化のために幾つかの部分において
は、幾分分解された状態で示されている。この図は、該
装置の構成の詳細というよりも、寧ろその基本的動作原
理を示すものである。
第１図を参照すると、該装置の中心部には担体粒子カ
ートリッジ14が位置している。この粒子カートリッジ14
は長い凹型または管状の構造をもち、これはその中心に
凹型の中空通路を有している。該担体粒子カートリッジ
の内部には、複数の担体粒子16が配置されている。この
担体粒子は、以下に更に詳細に論じられるように、小さ
な高密度の粒子であり、ターゲット生物中に挿入しよう
とする生体物質、即ちDNAまたはRNAで予め被覆されてい
る。該粒子は、更に他の型の生体物質、例えばペプチ
ド、サイトカイン、ホルモンまたはタンパク質で被覆さ
れていてもよい。ガスバルブ18が、該担体粒子カートリ
ッジの上流側に位置し、かつ適当な流体用導管17によっ
て、該担体粒子カートリッジ14の内側に接続されてい
る。このガスバルブは、13で示された適当な管手段によ
って、圧縮ガス源12に接続されている。この圧縮ガス源
12は、公知の市販の圧縮ガスタンク、好ましくはヘリウ
ム等の不活性な圧縮ガスのタンクであり得る。圧縮ガス
のリザーバは、該ガス源12と該バルブ18との間にあるこ
とが望ましいが、該管手段13がこのようなリザーバとし
て機能できることが分かっている。
該担体粒子カートリッジの右側には、オリフィス20が
あり、これは加速チャンバー22の内部での流体の取り出
し口を与え、該チャンバー22は円錐形の出口ノズル24で
終端している。第１図において参照番号19で示された処
置すべき患者、組織または細胞は、図の右側に配置され
る。
該装置の一般的な動作において、該バルブ18をしばら
く動作させて、管13によって形成されるリザーバ中に保
持された圧縮ガスのパルスを放出する。該バルブ18と該
出口ノズル24との間で、その中間部分が粒子加速通路を
形成し、以前圧縮されていた該膨脹ガスがかなりの速度
で該通路を移動するガス流を生成する。このガス流は該
粒子加速通路を介して加速され、該粒子カートリッジ14
の内部を通過するにつれて、該加速ガス流は該担体粒子
を受け取り、そこに同伴する。この加速ガス流は、次に
該チャンバー22を介して該出口ノズル24に達する。次い
で、該粒子は該装置から該患者19の組織上およびその内
部に達し、そこで該担体粒子は該ターゲットまたは患者
の細胞内に止まるが、これを殺すことはない。
第１図に示した如く、本発明の装置の適当な動作にと
って重要なことは、該出口ノズル24の幾何形状である。
その重要性の理由は、第２図に模式的に示されており、
第２図はバージョンＡ、ＢおよびＣとして、該出口ノズ
ル24の可能な３種の幾何形状および該粒子16の飛行に及
ぼすその効果を示している。バージョンＡにおいて、該
出口ノズル24は、該装置の出口端部に向かって大幅に拡
がってはいない。結果として、これを出てゆくガス流は
該出口ノズル24の端部から直線的に進み、直接該ターゲ
ット19に向かう通路を進む。結果として、該担体粒子は
比較的線形の流路を維持し、患者19の、第２図に参照番
号25で示した比較的狭い領域に衝突する。粒子16は幾分
分散するが、その分散は全く僅かであってあまり重要で
ない。
同様に、第２図のバージョンＢでは、該出口ノズル24
は、該装置の出口端部に向かうかなり広い角度の円錐形
のテーパーを有する。この態様においても、該ガス流は
かなり線形で該装置を出、該担体粒子はそれ程広く分散
しない。また、該粒子は患者19の比較的コンパクトな部
分25に衝突する。
第２図のバージョンＣに示したように、該出口ノズル
の円錐形のテーパーの角度が臨界角未満である場合に
は、違った現象が起こる。この例においては、該加速さ
れたガス流が該出口ノズルを通過するにつれて、渦流作
用によって、該ガス流の通路と、該出口ノズル24の側部
との間に真空部を生成する。この真空は、該ガス流の移
動方向に直交するあらゆる方向に外方向に、該ガス流を
引っ張る。換言すれば、該ガス流および該粒子の分散は
該粒子の移動方向に対して横方向であり、該装置から該
患者にまで分散する。かくして、第２図のバージョンＣ
に示した如く、該装置を出てゆく該ガス流は幅広い領域
に渡り横方向に分散され、その結果該ガス流に同伴され
る該担体粒子16は広い領域に渡り分散され、第２図のバ
ージョンＣに示したように、担体粒子のより一層広い分
散パターンを生成する。その結果として、該粒子は、該
円錐形の出口ノズルがこのような形状にない場合に予想
されるよりも、該ターゲット生物のより広い領域25に渡
り分配される。従って、該患者の任意の小領域に対する
担体粒子の過剰−投与が回避され、かつ該粒子を機械的
に分布させる必要なしに、あるいはガスの分散または分
布装置を使用することなしに、該担体粒子の比較的広い
均一な分布が達成される。
該円錐形の出口ノズル24のテーパーの正確な角度は、
使用するガス圧および該加速チャンバー22のサイズに依
存して、態様毎に変動するであろう。市販のヘリウムタ
ンクを使用して稼働する装置に対しては、該加速チャン
バー22が径1/16インチを有し、出口ノズルがスパン3.3
インチに渡り1/16インチ〜2/3インチのテーパーが付さ
れたものが、粒子を、径約1/16インチ〜約2/3インチの
分布パターンで拡がるのに十分であり、該粒子が拡がる
領域を100倍まで増大することにより、該粒子分布の密
度は100倍に減じられる。効果的に作業するために、該
円錐形の出口ノズルは、その初期または最終的な径（例
えば、1/16〜2/3インチ）よりも、その長さを著しく大
きくする必要がある。長いというよりも幅広い円錐形テ
ーパーは該粒子の適切な分散を与えないであろう。しか
しながら、該円錐形の出口ノズルは滑らかな円錐である
必要はない。例えば、該出口ノズルは、その全体として
の機能に悪影響をあたえることなく、幾つかの小さな段
階状に増大する径をもつことができる。
該ガスの圧を変えることにより、粒子を該ターゲット
19に衝突させ、その内部に止まらせる力を変えることが
できる。該ガス圧は該カートリッジ14から該被覆粒子16
を分離するのに十分であるが、該ターゲット19に損傷を
与える程に高いものであってはならない。完全な動物の
皮膚に搬入する場合、ガス流は該皮膚に対して有害であ
ってはならない。幾らかの高いガス圧において、僅かな
皮膚の赤変を正に許容し得る程度に生ずる。市販品とし
て入手可能な圧縮ヘリウムタンクのガス圧は、該粒子16
を分離し、かつターゲット動物、例えばブタまたはマウ
スの表皮細胞中に該粒子16を搬入するのに完全に満足で
あることが分かった。ある状況下では、該粒子の密度、
該ターゲット表面の性質および粒子侵入の所定の深さに
依存して、より低い圧力またはより高い圧力を使用でき
る。ブタの皮膚を使用した実験は、ヒトおよびブタの皮
膚の機械的類似性の故に、ヒトの皮膚で見られた結果と
類似している。
該粒子カートリッジ14は、好ましくは凹型であり、最
も好ましくは内部表面に堆積した粒子を有する管状のも
のである。というのは、このようなカートリッジが該担
体粒子に触れることなく、容易に取り扱えるからであ
る。多くの粒子カートリッジ14の形状および幾何が可能
であるが、単純かつ機能的なものは、テフゼル（Tefze
l:登録商標）等の不活性材料の短い管状のセグメントの
使用に基くものである。該管状のものは、その中心を通
して形成された円筒状の通路を有する円筒を形成する。
この管状型の利点は、該生体物質で被覆された該担体粒
子が該装置の壁を汚染し得ないことである。該テフゼル
材料の利点は、これが透明であることにあり、従って担
持したカートリッジを肉眼的に同定可能なことにある。
肉眼視可能な金色の色合いまたは肉眼視可能な金色の縞
をもつその外観によって、この同定が可能となる。該カ
ートリッジの内径は、その内部に粒子の堆積を可能と
し、かつ該粒子を分離するのに十分に高い圧で、十分な
ガス流を確保するのに十分な大きさであればよい。しか
しながら、該カートリッジ14は必ずしも管状でなくても
よいが、加圧ガスを閉じ込め、分離された粒子16を分散
しないが寧ろ該ガス流によって該ターゲットに向けられ
るような、任意の凹型の形状のものであり得る。その例
として、該カートリッジ14は、管の半分に該粒子16を堆
積し、かつ該装置の平坦なまたは平坦でない面によって
しっかりと覆い、ガスを通すことのできる半−円筒状の
通路を形成するような半−管状体であり得る。これに基
いて、該サンプルカートリッジおよび該装置の表面によ
って形成される回りのチャンバーの幾何形状は、これら
２つが一緒に該ガス流を該リザーバ12から該ターゲット
19に導く限り、何等限定されない。
あらゆる高密度の生物学的に不活性な物質で作られた
極めて小さな担体粒子16が、該サンプルカートリッジ14
の表面に堆積される担体粒子として使用可能であるはず
である。この担体粒子16は高密度物質製であって、これ
らは容易にその運動量を維持し、かつ十分に小さなサイ
ズであって、形質転換しようとする生物の細胞に比して
小さなものである。数ミクロンのサイズの担体粒子は、
該生きた細胞の細胞壁を透過させることによって、該生
きた細胞の殆どの生存能力に不当に悪影響を与えること
なく、該細胞内に入ることが可能である。換言すれば、
該担体粒子は生きた細胞を殺すことなく、その内部に入
ることができ、かくして該粒子上の生体物質を該細胞内
に搬入できる。
本発明において、金が該粒子16の最適の材料である。
というのは、これは高密度を有し、生体物質および酸化
両者に対して比較的不活性であり、また0.2〜３μｍの
範囲内の径をもつ球状粒子として容易に市販品として入
手できるからである。測定された寸法範囲0.2〜３μｍ
を有する微晶質粉末として金が市販されているので、１
〜３μの範囲のサイズの金球状粒子またはビーズが首尾
良く使用できる。
密度19のタングステンも利用可能である。密度22を有
するイリジウムも好ましいが、本出願人はこれを使用し
なかった。というのは、比較的粗い粉末としてのみ容易
に入手できるにすぎないからである。タングステンも、
金と比較して恐らくあまり望ましくないものである。と
いうのは、これが空気中でかつ痕跡程度の水分の存在下
で酸化される傾向があるからである。該担体粒子上のこ
のような酸化層は粒子を一緒に結合する傾向をもち、該
粒子が相互に凝集するにつれて、平均粒径を著しく増大
させるからである。不規則な凝集状態で凝集した粒子
は、本発明の実施にとってあまり望ましくない。なんと
なれば、このような凝集はその質量およびサイズを広範
囲に変動せしめ、かくして規則的に反復性のある結果を
得ることを困難にするからである。
第３図には、本発明に従って構築した粒子加速装置10
の一態様の側面図を示すものである。図示したこの装置
は手動型かつ持ち運び可能であり、従って容易かつ簡単
に操作でき、実験者、専門技術者または臨床医によって
稼働できるものであり得る。
第３図の装置の詳細を説明すると、この装置は好まし
くは長く、かつこの装置の特定の利用者の要求に合っ
た、また該利用者の快適性に合った任意の適当な形状並
びにサイズのものであり得るハンドル28を含む。第３図
に示した如く、このハンドル28は拳銃のグリップの形状
に形成されていて、操作者にしっかりした握りを与え、
かつ容易にバルブトリガ機構30を利用できるようにして
いる。
送入管32が該ハンドル28を貫いて通されており、その
両端部は開放状態にあって、本装置で使用する加圧下に
あるガスを収容できるように固体物質で形成されてい
る。かくして、該加圧ガス流と接触する該送入管32およ
び該装置の他の全ての部分（サンプルカートリッジ以
外）を、非−変形性の固体物質、例えば金属好ましくは
真鍮または高密度熱可塑性または樹脂材料で形成するこ
とが好ましい。この送入管32は上記のようなリザーバと
して機能し、作動圧下で粒子加速搬入を達成するのに十
分なガスの放出が可能な貯蔵部を与える。該送入管32の
寸法に制限はなく、加圧下で十分なガスを収容するべく
高くしあるいは低くすることができる。この送入管32内
の容積が不十分である場合には、別の専用のガスリザー
バを設けることも可能である。
該送入管32内の一端部には、コネクタ31が接続され、
該コネクタは外部のガス源12に接続可能である。このガ
ス源は生物学的および化学的に不活性な圧縮ガスを含む
市販のタンクであり得る。該不活性ガスは、好ましくは
ヘリウムである。該ガス源を出るガスの圧を、有利には
公知の圧力制御バルブによって調節し、かつ作業者がみ
ることのできるゲージ上に表示する。
該送入管32内の反対側の端部には、バルブ34が接続さ
れており、これは該送入管32から該装置10の長い本体33
への該ガスの流れを制御する。第３図の第一の態様にお
いて、このバルブ34は、該ハンドル28上のバルブトリガ
機構30によって操作される電気的に動作するソレノイド
ピストンバルブである。有利には、該ハンドル28内の該
バルブ34と該バルブトリガ機構30との間にワイヤを埋め
込み、使用の際の該装置の安全性および操作性を改善す
る。本発明は、ここに示された特定の型のバルブ、ある
いは任意の特定のアクチュエータまたはトリガ機構に限
定されない。多くのバルブとトリガとの組み合わせが公
知であり、以下に記載する第二の態様によって例示され
るように、当業者はここに記載した該組み合わせを該公
知のものと交換することができる。バルブとアクチュエ
ータとの多くの組み合わせが、該バルブピストンおよび
バルブ本体が、該送入管32から入ってくる該ガス流の圧
に耐え得る限り、何れも本発明において使用するのに適
している。
該バルブ34の流体出口はカートリッジホルダー36と流
体接続状態にある。容易に迅速なサンプルの再充填を可
能とする好ましい態様においては、マルチ−カートリッ
ジホルダー36を備えている。この装置を作動する前に、
単一の工程で予め充填することのできるサンプル数を最
大にするためには、該マルチ−カートリッジホルダーは
円筒状のものである。該円筒状カートリッジホルダー36
の正面図を第４図に示した。複数のカートリッジチャン
バー38（その各々は１個の粒子カートリッジ14を収容す
るサイズをもつ）が、該円筒状ホルダーの半径に沿って
一定の距離で円形に配列されていて、一個のカートリッ
ジチャンバー38は各搬入の際に該ガス流中に位置できる
ようになっている。該ホルダー36はその半径方向の軸の
回りを360゜回転する。該カートリッジホルダー36の周
辺上に複数の戻り止め40が、チャンバー38が該ガス通路
内にある各ピストンを同定するためのコブと嵌合してい
る。このコブは該本体33を貫くバネで偏らせた突起42
を、該カートリッジホルダー上に該コブを嵌合するよう
に設けることにより与えることができる。該カートリッ
ジホルダー36は、利用者の必要に応じて、より多くのま
たより少数のサンプルを収容する他の形状であってもよ
い。該カートリッジホルダー36は図示したような円筒状
である必要はないが、バルブ34を通過する該ガス流を受
け取るために、ピストン内に移動させることのできるサ
ンプルカートリッジの線形配列であってもよい。
該本体33内の中空粒子加速チャンバー44は粒子を同伴
する該ガス流を該ターゲットに送る通路を与える。この
チャンバー44は、径1/16インチ、および長さ12〜15mmを
もつように構成されている。該チャンバー44が長過ぎる
と、該ガス流は摩擦のために減速される。第３図の切除
した部分から明らかな如く、該中空チャンバー44の径は
その遠位端部において大きく、該ガス流に同伴された被
覆粒子の十分な分散を可能とする出口ノズル46を形成し
ている。該出口ノズル46を越えて該粒子加速チャンバー
44の遠位端部には、作業者が該装置10と該ターゲットと
の間に一定の距離を設定することを可能とする、スペー
サ48が取付けられている。この適当な距離は、ターゲッ
ト細胞の外観および搬入後の遺伝子発現の程度を実験的
に観測することにより、必要に応じて決定しかつ設定す
ることができる。哺乳類の皮膚については、3/4〜１イ
ンチのスペーサが良好に機能することが分かっている。
該チャンバー44の内部を研磨することは、該装置10の動
作に有益な効果をもたらす。これは、紐またはパイプク
リーナーを研磨化合物で被覆し、これを該チャンバー44
の内部の研磨に使用することによって達成できる。この
処理は該チャンバー44の側部との相互作用および抵抗を
減じ、かくして該担体粒子が該目的のターゲットに向か
って流動するのを容易にする。該出口ノズル46も同様に
研磨することができる。以下の第７図に示す態様に関連
してより詳細に記載されるように、該バルブ34の背後の
該チャンバー44の開始点に達する前に、該ガスの流動す
る領域を、適当なスペーサによって該空間を満たすこと
によって制限することが有利であることが分かった。
第５図に示したような、被覆粒子16を担持する多数の
有用なサンプルカートリッジ14が、多数の異なる方法に
従って、単一の手順で調製できる。２つの異なる方法が
首尾良く利用できた。
第一の方法では、当分野で公知の方法で調製した、生
体物質で被覆した粒子の懸濁液をプラスチック管のある
長さに渡り導入し、該粒子を重力の作用によって該管の
内部表面の底部に沈降させる。該粒子が沈降したら、該
管の全長に沿った粒子のリボンを形成し、該液を該管か
ら排液し、該管を回転させて、該ビーズを窒素雰囲気下
で乾燥しつつ、該管の内部表面に該ビーズを展開させ
る。次いで、該管を、該放出装置の該サンプルチャンバ
ーに挿入するのに適した長さに切断する。当業者は、形
質転換に利用できる被覆粒子の数が該粒子懸濁液の濃度
を調節することにより、あるいはカートリッジを形成す
るのに使用する管の長さを調節することにより変え得る
ことを認識するであろう。また、本発明において有用な
サンプルカートリッジがここに記載した方法以外の方法
で調製できることも認識するであろう。当業者は、サン
プル−被覆粒子を分離可能に表面に固定する他の方法に
精通している。
第二の方法は、該粒子カートリッジ14に該担体粒子16
を固定するのに、弱い接着効果を利用する。このような
弱い接着性は、該ガス流が完全な圧力に達するまで、該
カートリッジの内部凹型表面に一時的に該粒子を付着状
態に維持することによって、該粒子の十分な加速を達成
するのに役立つことが分かっている。これを実現するに
は、該粒子をアルコールに懸濁する際に添加物を使用す
る。ほんの僅かに接着性であり、かつ首尾良く利用され
てきた添加物はポリビニルピロリドン（PVP）、コレス
テロール、グリセリンおよび水である。例えば、コレス
テロールは該懸濁液中において、アルコール1ml当たり
コレステロール1mgの割合で使用される。この粒子／ア
ルコール懸濁液を超音波処理して、懸濁を助け、次いで
この懸濁液を、その側に配置された該カートリッジ14の
内部に単に入れるだけでよい。該担体粒子は迅速に、該
カートリッジ内部表面の一方の側に沿って懸濁液から分
離してくる。次いでアルコールを除去し、該管を回転し
つつ、窒素気流によって該カートリッジを乾燥する。
第７および８図には、本発明に従って組み立てた粒子
加速装置のもう一つの態様を示した。第７および８図の
装置110において、第３図に示した態様における要素と
同一のまたは対応する機能をもつ要素には、100を加え
た同様な参照番号を与えた。例えば、第７図のハンドル
128およびトリガ130は第３図の態様のハンドル28および
トリガ30と同様である。第７図の装置110において、ガ
スパルスを放出するためのバルブ134は、上記態様で使
用した該ソレノイドを改造した流体作動システムによっ
て作動する。このバルブ134は流体導管160によって該ト
リガ130と接続している。
第８図の分解図では、第７図に示された装置の付随的
な内部要素が見えるようになっている。バルブ部材151
は該バルブ134のハウジングの端部にねじ込まれてい
る。このバルブ部材はねじ切りした取付け部材152を含
み、該取付け部材からバネをもつ偏りシャフト154が伸
び、その端部にはバルブ部材156が搭載されている。約5
0μの開口をもつ毛管またはヘリウム放出管158が、該バ
ルブ134を横切って伸びて、該装置110に連続的に低−流
量でヘリウムガスを放出する。管160が、アクチュエー
タブロック162と共に、該バルブ134の左側に接続してい
る。トリガ／プランジャー164が該アクチュエータブロ
ック162の内側に嵌め込まれている。スペーサ166および
取付け部材168は該バルブ134と該円筒状本体133とを接
続するように機能する。このスペーサは内部通路をも
ち、該通路は約1/4インチであって、該バルブ134背後の
ガスの流入する容積を制限している。該ガス通路が該本
体133に入る点において、約0.11インチの流入点が与え
られ、該膨脹ガスは該カートリッジホルダー136を通過
するにつれて加速されるであろう。該本体133および該
カートリッジホルダー136は、これ以外は第３図に示さ
れた態様におけるものと同様であるが、該カートリッジ
ホルダー136は該本体133の底側というよりも上側に位置
している。
該バルブ134の詳細は第９図に示されている。該第一
の態様のガス送入管32と類似するガス送入管132は該バ
ルブのベースに接続し、加圧ガスの導入を可能とする該
バルブ部材156は、該バルブ134が正常な閉じた状態にあ
る場合には、170で示された円錐形にテーパーを付され
たバルブシートに対して休止状態にある。該バルブ134
の内部の孔は、該バルブ部材156と、気密接続ではない
が、密に嵌合されたシリンダー172である。第９図に見
られるように、該バルブ部材156の左側のチャンバーに
おいて、該管160は該バルブ143と接続している。
第10図には、該アクチュエータ162の更なる詳細を示
した。シャフト174が該アクチュエータブロック162内に
水平に伸びており、該アクチュエータブロック162の前
方に対してのみ開放状態にある。３つの垂直な孔176、1
78、180が、該アクチュエータブロックの上部から下方
に伸びるように形成され、該シャフト174との流体接続
状態にある。該孔176の上部の寸法は、該管160の他の端
部を受け入れるようになっており、一方で該シャフト17
8および180は小さく、かつ単に周囲大気に対して開放状
態にある。拘束ピン182は該シャフト174の閉じた端部内
に伸び、トリガプランジャー164の運動を制限し、かつ
該拘束ピンは、第10図に示した如く、該プランジャーを
偏らせて、その位置に休止させるバネを含む。該プラン
ジャー164はその上に２つのＯ−リングをもった長いシ
ャフトであり、該シャフト174の内部を封止する。シャ
フトの延長部186は、該プランジャー164の端部における
実際のトリガボタンを該シャフト174の内部に接続す
る。
該装置110の動作において、該入口131は高圧ガス、好
ましくはヘリウムの供給源に接続されている。該毛管15
8は小さな低流量での漏れまたは該バルブ134を横切り、
かつ該本体133の内部へのヘリウムの放出を与えて、該
出口ノズル146にヘリウムを溢れさせる。これを実施す
ると、該装置を作動する前においてさえ、ヘリウムが該
出口ノズル146および該出口ノズルと該ターゲットとの
間における支配的なガスとなる。この領域におけるヘリ
ウムは、該担体粒子の流れおよびより一貫した該装置11
0の動作に対して低い抵抗を及ぼす。
該バルブ部材156は、第９図に示したように、通常該
バルブシート170に対して当接されている。該バルブ134
の内部全体は、該アクチュエータブロック162内で、該
管160によって該垂直孔176に接続されている。該プラン
ジャー164が第10図に示したように、その所定の位置に
ある限り、該孔176の下方端部は該Ｏ−リング184によっ
て封止されており、かつ如何なるガスもこの通路から失
われることはない。該拘束ピン182上のバネの力に抗し
て該トリガ／プランジャー164を利用者が押した場合、
該Ｏ−リングは該孔176のベースの左側による。これ
は、該抗176内のガスが該孔180を介して大気中に排出す
ることを可能とする。この排気は該バルブ部材156の左
側における圧力を低下する効果を有する。該チャンバー
172の壁は制限されていない流体流を該バルブ部材156の
左側に制限し、結果として該バルブ部材156の右側の圧
力が左側の圧力よりも大きくなる。該バネ154は、この
圧力差が、第９図に示したように、該バルブ部材156を
強制的に左側にシフトさせるのに十分な値となるように
選択され、また該バルブ部材156は該バルブシート170か
ら離れ、該カートリッジを介する高圧ガスの流れを解放
して、該本体133に送る。この状態を、該トリガが解放
されるまで持続し、その後該トリガ／プランジャー164
は第10図に示す所定の位置に戻り、孔176の底部を封止
する。これにより、高圧状態が該バルブ134の左側に戻
り、かつ該バルブ部材156は該バルブシート170に対する
当接状態に戻り、かくして該バルブ134を介するガスの
流れを閉じる。
該バルブ134の背後で、該装置は該カートリッジ担体
を入れる前の拘束状態まで、ガス流動装置に対して比較
的一定の面積を維持する。該スペーサ166は、該取付け
部材168と該バルブシート170との間に残される空間を満
たすためのものであるが、該スペーサ166を貫通する中
央の孔の径は、ほぼ該本体133を貫く孔の径と等しい。
この概念は、該ガスが膨脹する領域を、該カートリッジ
ホルダーの0.11インチの入口に達するまで、1/4インチ
の孔に制限することである。
第７図に示したように、右端部において、該装置110
の出口端部に位置するディフューザが遺伝子搬入の効率
を高めるであろうことを示するある証拠がある。このよ
うなディフューザ２個が第11図に図示され、190および1
91によって示されている。各ディフューザは環状リング
およびそれぞれ所定の位置にワイヤー194および195によ
って吊り下げられた中央部に位置するスクリーン192お
よび193を含む。このディフューザは該パターンの中心
から該ビーズの一部を選択的に分離し、該ターゲット領
域における担体粒子のより均一な分布を得るように作用
する。
本明細書に記載する装置は、遺伝子ワクチンを使用し
た、ヒトまたは家畜の大規模ワクチン接種で使用するの
に有利である。遺伝子ワクチンは、遺伝物質、通常はDN
Aで作られ、病原性薬物を由来とし、次いでここに記載
した如き装置を使用して生物の生きた細胞内に搬入され
る。生物体内での免疫応答を生ずるタンパク質またはペ
プチドを生成する細胞転写および翻訳機器によって、一
旦細胞内で該遺伝物質が発現されれば、該免疫応答は、
該遺伝物質の起源である該薬物による後の感染に対し
て、動物またはヒトを耐性にする。本発明の装置は、ま
た生物に欠乏しているが該生物によって必要とされる遺
伝子の搬入が行われる、遺伝子治療に対しても使用でき
る。また、遺伝子欠損の生物の遺伝物質内にこのような
遺伝物質を安定に組み込むことも可能であり、その実施
によって、少なくとも幾つかの体細胞中の該遺伝子欠損
を修復することが可能となる。
本明細書に記載した装置は、遺伝子ワクチンの大規模
な反復的搬入において使用するように設計されている
が、既存の粒子各速装置が単一回の搬入で使用されてい
るのと同様にして、例えば遺伝物質の器官、組織および
植物並びに動物の培養細胞に移す（これらに限定されな
い）のに使用することも可能である。本発明の装置は、
形質転換植物を形成するために、生きた植物の分裂組織
中に遺伝子を搬入するのに上首尾で利用できた。本発明
の装置の利点の全て、特にその持ち運び性およびサンプ
ル取扱いの容易性は、粒子加速による遺伝子の単一回の
搬入のために使用する場合にも、同様に首尾よく適用で
きる。しかしながら、本発明の原理は持ち運び不能な設
置型の装置に組み込んで、迅速性、再現性および利用の
容易性における実質的な利点を達成することができる。
実施例 1.プラスミド 第５図のプラスミド地図に示されているように、プラ
スミドpWRG1602においては、該hCMV即時型プロモータ
は、ヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子の発現を導く。こ
のhGHコート配列（coating sequence）は約2.2kbpのXba
I−EcoR Iフラグメント内に含まれており、該フラグメ
ント自体はプラスミドpGH（ニコルインスティチュート
（Nichols Institute）から入手できる）から得られ
た。5 EMBO J.,1986,pp.1367−1371に記載されているこ
のhCMV即時型プロモータは619塩基対をもつAcc IIフラ
グメント内に含まれており、該フラグメントは該CMV即
時型転写開始サイトの上流側の522塩基対から下流側の9
6塩基対までの領域を包含している。プラスミドDNAは標
準的な分子生物学的技術を利用して調製した。
2.DNA被覆粒子の調製 次いで、プラスミドpWRG1602のコピーを金担体粒子上
に被覆した。この被覆は26mgの沈殿金粒子粉末（平均粒
径0.95μ）と、25μｇのDNA中の200μｌの0.1Mスペルミ
ジンとを混合することにより行った。DNA対金の比は金1
mg当たりDNA2.5μｇとした。次いで、連続的に攪拌しつ
つ200μｌの2.5M塩化カルシウム溶液を該混合物に添加
し、その後該サンプルを室温にて更に10分間インキュベ
ートして、該担体粒子上に該DNAを沈殿させた。該混合
物を小型遠心機内で３秒間遠心処理して、該DNAを担持
する該担体粒子を濃縮し、次いで該担体粒子を穏やかに
エタノールで洗浄し、キャップ付きバイアル中で3mlの
エタノール中に再懸濁させた。エタノール中に該担体粒
子を含む該再懸濁を、数秒間、超音波照射した水浴中で
該バイアルを浸漬することにより補助した。
3.動物細胞中への被覆粒子の搬入 麻酔したマウスを、そのターゲット部位から殆どの毛
を除去すべく、厳密に毛を刈り取った。該動物のこの脱
毛した部位に形質転換を誘起させた。
このようにして調製したサンプルカートリッジを、実
験室テスト用の本発明の装置に搭載した。最初のテスト
においては、圧縮ガスを種々の圧力の下で放出して、遺
伝子放出に及ぼすガス圧の効果を決定した。この処置の
有効性をアッセイするために、該処置の24時間後に、該
ターゲット皮膚を取り出してホモジナイズした。各サン
プル中のヒト成長ホルモン（hGH）の濃度は、hGHに関す
る市販のELISA−を基礎とするアッセイを利用して定量
した。第１表の結果は、搬入部位当たりのマウスの表皮
における形質転換された細胞によって生産されたヒト成
長ホルモン（hGH）のおよその量を示している。 第１表 マウス 圧力（psi） 搬入部位 量（ng） Ａ 500 １ 40 ２ 22 700 １ 59 ２ 140 Ｂ 500 １ 40 ２ 38 300 １ 75 １ 50 hGHタンパク質発現を測定するために工夫した実験に
おいて、上記のようにして調製したもう一つのpWRG1602
サンプルカートリッジを該装置に搭載し、被覆した該粒
子を、500psiにて、外科的に露出させたマウス肝臓内に
インビボで搬入した。該搬入後24時間後に該肝臓および
血清を検査したところ、両者はそれぞれバックグラウン
ド濃度の３および２倍の低いhGH濃度を示した。
カートリッジ当たり全体で約0.5mgの金およびDNAを含
有する一組のサンプルカートリッジを調製した。これら
のカートリッジを該装置に搭載し、麻酔したブタの表皮
に、種々の圧力の下で粒子を搬入した。粒子の搬入前
に、皮膚の予備処理は何等行わなかった。処理の24時間
後に、処理した皮膚パッチを取り出し、該ELISAアッセ
イを利用してhGHにつきアッセイした。650psiにおい
て、数個の部位は、該搬入部位に紅斑を示した。最小の
紅斑を示した一つの部位においては、937ngのhGHが検出
された。800psiにおいては、多くの部位が紅斑を示し、
最小の紅斑を示した部位において、412ngのhGHが検出さ
れた。1100psiにおいては何れの部位においてもhGHは検
出されず、この搬入圧力下では全てのサンプルが著しい
紅斑を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−227764（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504061（ＪＰ，Ａ) 米国特許4945050（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 C12N 15/87 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】圧縮ガス源と接続するのに適した、遺伝子
    搬入装置であって、以下： 内部に形成された粒子加速通路および一端部における開
    口を有する本体であって、該粒子加速通路の直径が該一
    端部において増大し、実質的に円錐形の出口ノズルを形
    成する、本体； 該圧縮ガス源に接続するのに適しており、そして選択的
    に圧縮ガスを該粒子加速通路に通すように接続されて、
    加速ガス流を形成するバルブ；および 担体粒子上に堆積された遺伝物質で被覆された該担体粒
    子を有する粒子カートリッジを内部に受け取るのに適し
    た形状のカートリッジチャンバーであって、該チャンバ
    ーは該本体内および該粒子加速通路内に配置され、その
    結果該粒子加速通路を膨脹しつつ通る該ガス流は、該粒
    子カートリッジ近傍を通過し、そして該カートリッジか
    ら該担体粒子を受け取りかつ加速する、カートリッジチ
    ャンバー、を備える装置であって、 ここで、該本体からの該粒子加速通路の該開口における
    該出口ノズルの円錐は、ガス流に対して直交方向の幅よ
    りも、該ガス流の方向の長さが長いものであり、このこ
    とによって、使用の際に、該本体から出る該ガス流を外
    方向に膨張して、該出口ノズルが実質的に円錐形でない
    場合よりも広い領域に渡り該担体粒子の分布を生ぜしめ
    る、遺伝子搬入装置。
  2. 【請求項２】カートリッジホルダーを有し、該ホルダー
    はその中に形成された多数のカートリッジチャンバーを
    有し、該カートリッジホルダーは該本体に移動可能に取
    り付けられて、その結果、該カートリッジチャンバーの
    任意の一つを該粒子加速通路に配置することができるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の装置。
  3. 【請求項３】該カートリッジホルダーがシリンダーであ
    り、該シリンダーが該本体に対して回転して、異なるカ
    ートリッジチャンバーを該粒子加速通路に配置する、請
    求の範囲第２項に記載の装置。
  4. 【請求項４】該カートリッジホルダーを、該カートリッ
    ジチャンバーの一つが回転されて、該粒子加速通路内に
    ある、複数の位置の各々における所定の位置を固定する
    ためのレジストレーション機構を有する、請求の範囲第
    ３項に記載の装置。
  5. 【請求項５】該カートリッジチャンバーの背後の該粒子
    加速通路内にオリフィスを有し、該オリフィスが該粒子
    カートリッジの内部の凹型部の寸法よりも狭くて、該粒
    子カートリッジから該担体粒子を受け取った後に、該ガ
    ス流による該粒子の加速を促進する、請求の範囲第１項
    に記載の装置。
  6. 【請求項６】該出口ノズルの端部において該装置に取り
    付けられたスペーサを有し、該装置を、処理すべき組織
    または生きた生物から所定の距離離す、請求の範囲第１
    項に記載の装置。
  7. 【請求項７】該圧縮ガスがヘリウムである、請求の範囲
    第１項に記載の装置。
  8. 【請求項８】該カートリッジチャンバーが円筒形であ
    り、かつ該カートリッジが管状であり、該担体粒子が該
    カートリッジの内部に堆積されている、請求の範囲第１
    項に記載の装置。
  9. 【請求項９】該加速通路が平滑となるまで研磨されてい
    る、請求の範囲第１項に記載の装置。
  10. 【請求項１０】該バルブを横切って伸びるように設けら
    れたヘリウム放出管を有していて、該装置の作動前に、
    該出口ノズルに残留ヘリウムを導入する、請求の範囲第
    １項に記載の装置。
  11. 【請求項１１】該バルブと該本体との間において提供さ
    れるガス拘束要素をさらに含み、ここで、該要素が、該
    バルブからの圧縮ガス流を、該粒子加速通路にまで拘束
    するサイズの孔を有する、請求の範囲第１項に記載の装
    置。
  12. 【請求項１２】該ガス拘束要素が、該本体および該バル
    ブとは別個の要素である、請求の範囲第11項に記載の装
    置。
  13. 【請求項１３】製造物品としての、圧縮ガス駆動型遺伝
    子搬入装置で使用するためのカートリッジであって、該
    カートリッジは、その内部に形成されたアーチ形の線形
    通路を有する凹型の剛性本体と、該カートリッジ内の該
    通路中に堆積された遺伝物質で被覆された担体粒子の堆
    積物とを含み、その結果、該粒子は、該通路を通る膨脹
    するガス流によって分離でき、該カートリッジは、使用
    者が該カートリッジ上に堆積された該担体粒子に触れる
    ことなしに、該使用者が手動で操作するものであること
    を特徴とする、カートリッジ。
  14. 【請求項１４】該カートリッジが、その中心部を貫いて
    伸びるように形成された円筒状の通路をもつ、管状形状
    のものである、請求の範囲第13項に記載のカートリッ
    ジ。
  15. 【請求項１５】該担体粒子が金粒子である、請求の範囲
    第13項に記載のカートリッジ。
  16. 【請求項１６】該担体粒子が、該通路の軸と整列する線
    形のパターンで、該通路内に堆積されている、請求の範
    囲第13項に記載のカートリッジ。
  17. 【請求項１７】製造物品としての、圧縮ガス駆動型遺伝
    子搬入装置で使用するためのカートリッジであって、該
    カートリッジは、その内部を貫いて形成された円筒形の
    通路を有する円筒形の剛性管状本体と、該カートリッジ
    内の該通路中に堆積された遺伝物質で被覆された担体粒
    子の堆積物とを含み、その結果、該粒子は該通路を通る
    膨脹するガス流によって分離でき、該カートリッジは、
    使用者が該カートリッジ上に堆積された該担体粒子に触
    れることなく、該使用者が手動で操作するものであるこ
    とを特徴とする、カートリッジ。
  18. 【請求項１８】ターゲット生物に遺伝物質を搬入するた
    めの、制御されたバルブを介して圧縮ガス源に接続され
    た遺伝子搬入装置であって、以下： 粒子加速通路、および 該遺伝子搬入装置の該粒子加速通路内に適切に形成され
    たカートリッジチャンバー内に配置された適切な形状の
    粒子カートリッジであって、該粒子カートリッジは、生
    きた細胞を死滅させることなく該細胞に入ることが可能
    な生物学的に不活性な担体粒子を、該カートリッジの内
    部の凹型の表面に予め担持しており、該担体粒子は該遺
    伝物質のコピーで被覆されている、カートリッジ、 を備え、 ここで、該制御されたバルブの作動によって、該遺伝子
    搬入装置の該粒子加速通路内におよびこれを通しての圧
    縮ガスの流動を可能とし、該ガス流が該粒子カートリッ
    ジから該担体粒子を受け取り、かつ該担体粒子を該ター
    ゲット生物に向けて同伴する条件下で、該粒子加速通路
    内に該ガス流を発生させ、 該遺伝子搬入装置がさらに、該ガス流が該装置を出てい
    く際に該ガス流を該ガス流の方向に対してほぼ直交方向
    に膨脹するように該ガス流に対して作用する円錐形にテ
    ーパーの付された出口ノズルを備え、その結果該粒子は
    該ターゲット生物に衝突する際に拡がる、 装置。
  19. 【請求項１９】担体粒子を液体中に懸濁し、該液体懸濁
    液を該カートリッジ内に入れ、該懸濁液から該液体を蒸
    発させることにより、該担体粒子が該カートリッジ内部
    の凹型の表面に配置される、請求の範囲第18項に記載の
    遺伝子搬入装置。
  20. 【請求項２０】該液体懸濁液がさらに、該担体粒子を該
    カートリッジの内部表面に僅かに接着させる穏やかな接
    着剤を含有する、請求の範囲第19項に記載の遺伝子搬入
    装置。
  21. 【請求項２１】該ターゲット生物に対するスペーサを備
    える、請求の範囲第18項に記載の遺伝子搬入装置。
  22. 【請求項２２】該圧縮ガスがヘリウムである、請求の範
    囲第18項に記載の遺伝子搬入装置。
  23. 【請求項２３】多数の粒子カートリッジが、その内部に
    形成された多数のカートリッジチャンバーを有するカー
    トリッジホルダー中に配置され、そして該カートリッジ
    ホルダーが該装置内に配置され、その結果、該装置の多
    数回に渡る操作が実施され得る、請求の範囲第18項に記
    載の遺伝子搬入装置。
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