JP4790981B2 - 低圧ガス加速遺伝子銃 - Google Patents
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Description
本特許出願は2003年2月3日に出願した米国特許出願第60/444,775号の優先権を主張する。
本発明は遺伝子銃システムに関する。さらに特定すれば、本発明は遺伝子銃システム、および遺伝子を形質転換するための上記遺伝子銃システムの応用に関し、ここでガスを用いる上記遺伝子銃システムは、低圧下で生物材料を含有する溶液を高速に加速して、生物材料を、金属粒子担体を用いることなく、細胞膜/壁または動物の皮膚を貫通させ、遺伝子形質転換をほんの低い圧力で達成することができる。
遺伝子材料の発見および遺伝学の急速な発展に従って、今や科学者は遺伝子工学技術を巧みに実施し、例えば、外来遺伝子を導入して細胞、またはさらに生物の性質を制御することができる。基礎科学研究においておよび農産物の改良において、生物学的特性および形態を変える目的でDNAなどの異種遺伝子材料を宿主細胞に導入することが広く応用されている。例えば、遺伝子工学は、農産物の耐虫性、耐霜性または栄養組成の改良を助ける。最近、遺伝子形質転換技術は遺伝子治療または遺伝子ワクチンの形態でヒト疾患の治療に応用されている。医学分野における遺伝子形質転換技術応用の成功によって、癌を含むまだ少数ではあるが遺伝性疾患の臨床治療に著しいブレークスルーが行われている。
本特許のファイルは少なくとも1枚のカラーによる図面を含む。カラー図面を伴う本特許のコピーは必要な費用を添えて申請すれば特許所管官庁から提供されるであろう。添付図面は本発明のさらなる理解を提供するために含まれるものであり、本明細書に組込まれてその一部分を構成するものである。図面は本発明の実施形態を図解し、本説明と一緒に本発明の原理を説明するのに役立つ。
図1を参照すると、図1は本発明の好ましい実施形態による遺伝子銃100の断面図である。本発明の遺伝子銃100は4つの部分に区分され、少なくとも加圧室102、スプレヤー104、後部コネクター106および材料送達システム108からなる。後部コネクターはバルブを経由して高圧ガス源(図2)と接続される。ガス(流れ方向を矢印で示す)を後部コネクター106から加圧室102へ送る。加圧室102内のガスが予め設定した圧力まで増加すると、その高圧ガスおよび高圧ガスにより運ばれるサンプル溶液はスプレヤー104を通ってスプレーされる。加圧室の材料は軽金属、例えばアルミニウム合金である。スプレヤー104の材料は生体適合性金属、例えばステンレス鋼またはその合金である。
流れ場が等エントロピー流れであると仮定すると、スプレーノズルの面積(Ae)とスプレーネックの面積A*の比は次式で与えられる;
[式中、Meはマッハ(Mach)数、すなわちガス流速の音速に対する比であり、かつγは比熱比である]。もしMe、Aeおよびγが規定されると、A*が決定される。
(1)スプレーノズルに存在するガス流速が均一でない単純化設計。
(B)もしMe=1.3、De=5mmであれば、P=2.771(atm.)、Ae/At=1.0663、De/Dt=1.0326、Dt=4.842mm、L=7.58mm;
(C)もしMe=1.4、De=5mmであれば、P=3.182(atm.)、Ae/At=1.1115、De/Dt=1.0543、Dt=4.7425mm、L=12.356mm;
(D)もしMe=1.5、De=5mmであれば、P=3.67(atm.)、Ae/At=1.1762、De/Dt=1.0845、Dt=4.6104mm、L=18.7mm;
(E)もしMe=1.6、De=5mmであれば、P=4.25(atm.)、Ae/At=1.2502、De/Dt=1.118、Dt=4.4723mm、L=25.33mm;
(F)もしMe=1.2、De=4mmであれば、P=2.425(atm.)、Ae/At=1.034、De/Dt=1.0151、Dt=3.9405mm、L=2.856mm;
(G)もしMe=1.3、De=4mmであれば、P=2.771(atm.)、Ae/At=1.0663、De/Dt=1.0326、Dt=3.8736mm、L=6.06mm;
(H)もしMe=1.4、De=4mmであれば、P=3.182(atm.)、Ae/At=1.1115、De/Dt=1.0543、Dt=3.794mm、L=9.8886mm;
(I)もしMe=1.5、De=4mmであれば、P=3.67(atm.)、Ae/At=1.1762、De/Dt=1.0845、Dt=3.688mm、L=14.96mm;
(J)もしMe=1.6、De=4mmであれば、P=4.25(atm.)、Ae/At=1.2502、De/Dt=1.118、Dt=3.5778mm、L=20.26mm;
(K)もしMe=1.2、De=3mmであれば、P=2.425(atm.)、Ae/At=1.034、De/Dt=1.0151、Dt=2.9554mm、L=2.14mm;
(L)もしMe=1.3、De=3mmであれば、P=2.771(atm.)、Ae/At=1.0663、De/Dt=1.0326、Dt=2.905mm、L=4.549mm;
(M)もしMe=1.4、De=3mmであれば、P=3.182(atm.)、Ae/At=1.1115、De/Dt=1.0543、、Dt=2.845mm、L=7.416mm;
(N)もしMe=1.5、De=3mmであれば、P=3.67(atm.)、Ae/At=1.1762、De/Dt=1.0845、Dt=2.766mm、L=11.22mm;
(O)もしMe=1.6、De=3mmであれば、P=4.25(atm.)、Ae/At=1.2502、De/Dt=1.118、Dt=2.6834mm、L=15.198mm;
(P)もしMe=1.2、De=2.5mmであれば、P=2.425(atm.)、Ae/At=1.034、De/Dt=1.0151、Dt=2.463mm、L=1.776mm;
(Q)もしMe=1.3、De=2.5mmであれば、P=2.771(atm.)、Ae/At=1.0663、De/Dt=1.0326、Dt=2.426mm、L=3.565mm;
(R)もしMe=1.4、De=2.5mmであれば、P=3.182(atm.)、Ae/At=1.1115、De/Dt=1.0543、Dt=2.371mm、L=6.180mm;
(S)もしMe=1.5、De=2.5mmであれば、P=3.67(atm.)、Ae/At=1.1762、De/Dt=1.0845、Dt=2.305mm、L=9.350mm;
(T)もしMe=1.6、De=2.5mmであれば、P=4.25(atm.)、Ae/At=1.2502、De/Dt=1.118、Dt=2.236mm、L=12.665mm。
スプレーノズルにおけるガス流の方向は中心軸に平行でない。中心軸に平行なガス流を得るためには、分散部の上記単純設計のスプレーネックで発生した膨張波をスプレーノズルの特別な曲面設計により補償しなければならない。
サンプル溶液の調製は含有する生物材料に基づいて改定および改変することができるが、特定の技術または方法に限定されるものでない。一般的に生物材料を処理し、次いでサンプル溶液として適当な溶液に溶解することができ、金属粒子担体は使用しない。
完全なタンパク質発現システムを用いて構築したDNAプラスミドを、無菌蒸留水中に溶解する。調製した溶液は遺伝子銃のボンバードメント用として直接適用することができる。
キトサン(Sigma C-3646)を6%酢酸溶液中に5mg/mLの濃度で溶解し、次いで8% KNO2(キトサンに対してw/w)を加えて、室温下で1時間反応させた。1時間後、同じ容積の0.1N NaOHを加えて反応を終結させ、次いで無水アルコールを加え(溶液容積/無水アルコール容積=1/3)、次いで4℃で一夜置換えた。混合物を4℃で遠心分離(1500rpm)して沈降物を採集し、その沈降物を0.5%酢酸溶液に2mg/mLの濃度で再溶解し、そして0.45μmフィルターによりろ過した。
キトサンオリゴマーを2mg/mLカルボキシメチルセルロース(CMC)と3:1(容積で)の比で混合して攪拌し、キトサンオリゴマー-CMC複合体を得る。
0.3μlの(濃度1μg/μl)pEGFP-N2ベクター(Clontech)に4μlのキトサンオリゴマー-CMC複合体を加え、その混合物を均一になるまで攪拌した。
遺伝子銃実験に用いた検体はほぼ数週齢のBALB/cマウスである。マウス腹部の毛を剃ってマウスの皮膚を露出させる。3-4週齢Balb/cマウスを選択し、剃って腹部皮膚を露出させる。裸DNAまたはキトサン-CMC-DNA溶液を遺伝子銃に充填した後、露出したマウス皮膚にボンバードメントを実施する。各マウスの腹部皮膚のサイズは、容積4.3μlの各ショットのボンバードメントを平均4ショット受けることができる。1日後、マウスを犠牲にしてその皮膚を除去し、蛍光顕微鏡下でまたは顕微切片を作成して観察する。
DNA溶液によるボンバードメント方法と同様に、マウスを剃って腹部皮膚を露出させる。EGFPタンパク質(4μg)溶液を遺伝子銃に充填した後、露出したマウス皮膚にボンバードメントを実施する。ボンバードメント後、皮膚を洗浄溶液を用いて洗浄して皮膚外部に残ったタンパク質を洗い落とす。その後、マウスを犠牲にしてその皮膚を除去し、蛍光顕微鏡下でまたは顕微切片を作成して観察する。
マウス皮膚を除去して立方体の切片を作り、O.C.T.包埋剤(Tissue-Tek, Sakura Finetechnical Co. Ltd.)を用いて処理する。次いで組織を深冷凍結顕微切片作成法により10μm厚みのスライス切片とし、蛍光顕微鏡下で観察する。
3週齢Balb/cマウスを選択し、マウスの腹部皮膚を遺伝子銃により、DNA溶液24μl(1.8μgの裸pEGFP DNAベクターを含有する)を用いて4週間にわたり毎週1回ボンバードメントを実施する。ボンバードメントは100psiのヘリウム圧力を用いて実施する。第1週から第5週まで、眼窩から毎週1回血液を採取することにより血清を採集する。血清をウェスタンブロットにより分析する。EGFPタンパク質(0.5μg)を電気泳動(SDS-PAGE)により分離してニトロセルロースペーパーに移し、マウスから得た血清を用いて100倍に希釈し、TBSバッファー(Tris塩基20mM、NaCl 150mM、Tween20 0.3%、pH 7.2)を用いて3回洗浄し、次いで抗マウスIgGとコンジュゲートしたペルオキシダーゼ(Sigma A-5906)を用いて処理する。次に、生成物をTBSバッファーにより4回洗浄し、そしてニトロセルロースペーパーをLumiGLO(商標)(KPL 50-60-00および50-59-60)を用いて現像し、表示しかつ記録する。
裸DNA溶液を用いるボンバードメント
シューティング(ボンバードメント)は60psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは0.2μg DNAを含む。マウスの腹部表皮細胞上に存在する緑色蛍光を、蛍光顕微鏡下で観察した。図4A(拡大率40倍、40X)に示すように、左側はショット領域であり、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を放射し;一方、右側は非シューティング領域(ショットしていない)であり、従って蛍光を示さない。腹部領域のショット領域については、図4B(400X)に示すように、ほとんど全ての表皮細胞は緑色蛍光を示し、遺伝子銃のボンバードメントの高い有効性を示す。
シューティング(ボンバードメント)は50psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは0.3μg DNA(キトサン:CMC=3:1)を含む。マウスの腹部表皮細胞上に存在する緑色蛍光を、蛍光顕微鏡下で観察する。図5(拡大率40倍、40X)はDNA-キトサンのナノ粒子によるボンバードメントの結果を示す。遺伝子銃のボンバードメントから得た緑色蛍光の分布は広範であり所望のボンバードメントの結果を得たことを示す。
シューティング(ボンバードメント)は100psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは4μg EGFPタンパク質を含む。マウスの腹部細胞上に存在する蛍光を、蛍光顕微鏡により観察する。マウス皮膚の凍結切片に対する図6(400X)の蛍光観察結果は、EGFPタンパク質が表皮中に導入されるが、さらに深い組織(例えば、筋組織)中には導入されないことを示す。
4週齢Balb/cマウスを選択してマウスの腹部皮膚を遺伝子銃により、60psiのヘリウム圧力により、金属粒子担体を含まない裸DNAサンプル溶液(DNA溶液グループ)またはDNAコートした金粒子サンプル(粒子グループ)を用いてボンバードメントする。粒子を含まないDNA溶液は0.2μg pEGFP-N2ベクターを含有し、一方、DNAコートした粒子サンプルはスペルミジン/CaCl2によりコートした0.2μg pEGFP-N2ベクター/0.1mg金粒子を含む。ボンバードメント後の翌日に、マウス腹部皮膚を2グループから除去し、蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。
4週齢Balb/cマウスを選択し、剃って腹部皮膚を露出させる。裸DNA サンプル溶液(溶液グループ)またはDNAコートした金粒子(粒子グループ)を遺伝子銃中に充填した後、ボンバードメントをマウス皮膚に対して実施し、2グループから得られる免疫応答を比較する。
Claims (13)
- 遺伝子銃を用いて生物材料を送達する方法であって:
加圧室、スプレヤー、制御器および材料送達システムを含んでなる遺伝子銃を提供するステップ;
少なくとも生物材料を含むサンプル溶液を材料送達システム中に置くステップ;
遺伝子銃をトリガーし、制御器の制御を通して加圧室へガスを送ってガスの圧力を確立するステップ;
サンプル溶液を材料送達システムから放出し、加圧室内のガスによりサンプル溶液を加速するステップ;および
スプレヤーから、サンプル溶液の噴出速度が超音速でありかつ生物材料が標的中に均一に注入されるようにサンプル溶液を噴出するステップであって、該スプレヤーはスプレーノズルおよびスプレーチューブを含み、スプレーノズルは発散部および収束部を含んでなる内部形状を有し、スプレーチューブは直線的に発散するチューブであり、スプレーノズルはさらに発散部と収束部の間に位置するスプレーネックを含んでなり、収束部の内部形状のある範囲は、r t <R t <2r t [式中、R t は収束部の曲率半径を表し、r t はスプレーネックの半径である]であり;θ<15度[ここで、θは発散部とスプレーチューブの中心軸との間の角度である]であることを特徴とする前記ステップ、
を含んでなる上記方法。 - 生物材料が核酸である、請求項1に記載の方法。
- 生物材料がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 生物材料がビリオンである、請求項1に記載の方法。
- 生物材料が、動物に対してまたは臨床前試験のために使用されるワクチンである、請求項1に記載の方法。
- サンプル溶液をガスにより200〜300m/sの速度まで加速する、請求項1に記載の方法。
- スプレヤー出口の圧力が1気圧である、請求項1に記載の方法。
- ガスが窒素ガスまたはヘリウムガスを含む、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子銃を使用する遺伝子形質転換方法であって:
加圧室、スプレヤー、制御器および材料送達システムを含んでなる遺伝子銃を提供するステップ;
少なくとも核酸を含むサンプル溶液を材料送達システム中に置くステップ;
遺伝子銃をトリガーし、制御器の制御を通して加圧室へガスを送るステップ、ただしここでガスは窒素ガスまたはヘリウムガスである;
加圧室内のガスが圧力を確立した後にサンプル溶液を材料送達システムから放出して、加圧室内のガスによりサンプル溶液を加速するステップ;および
スプレヤーから、サンプル溶液の噴出速度が超音速でありかつ生物材料が標的中に均一に注入されるようにサンプル溶液を噴出するステップであって、該スプレヤーはスプレーノズルおよびスプレーチューブを含み、スプレーノズルは発散部および収束部を含んでなる内部形状を有し、スプレーチューブは直線的に発散するチューブであり、スプレーノズルはさらに発散部と収束部の間に位置するスプレーネックを含んでなり、収束部の内部形状のある範囲は、r t <R t <2r t [式中、R t は収束部の曲率半径を表し、r t はスプレーネックの半径である]であり;θ<15度[ここで、θは発散部とスプレーチューブの中心軸との間の角度である]であることを特徴とする前記ステップ、
を含んでなる上記方法。 - サンプル溶液をガスにより200〜300m/sの速度まで加速する、請求項9に記載の方法。
- スプレヤー出口の圧力が1気圧である、請求項9に記載の方法。
- 遺伝子銃をトリガーして、ガスを制御バルブを通して4atmより低い圧力を確立するまで加圧室に送る、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子銃をトリガーして、ガスを制御バルブを通して4atmより低い圧力を確立するまで加圧室に送る、請求項9に記載の方法。
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