KR20230049891A - 유전자총을 이용한 밀의 형질전환 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미성숙 배아를 이용한 밀(Triticum aestivum L.)의 형질전환 방법, 형질전환 밀의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 형질전환 밀, 제조용 미성숙 배아의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 미성숙 배아, 밀의 미성숙 배아의 유전자총 방법을 이용한 형질전환용 배지 조성물, 밀의 형질전환된 미성숙 배아로부터 캘러스 유도용 배지 조성물, 밀의 캘러스로부터 신초 유도용 배지 조성물 및 밀의 발근 유도용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유전자총을 적용한 형질전환 방법에 의해 우수한 효율로 형질전환 밀을 제조할 수 있으며, 제조된 형질전환 밀은 다음 세대로 전이 유전자를 안정적으로 유전시킬 수 있다.
본 발명의 유전자총을 적용한 형질전환 방법에 의해 우수한 효율로 형질전환 밀을 제조할 수 있으며, 제조된 형질전환 밀은 다음 세대로 전이 유전자를 안정적으로 유전시킬 수 있다.
Description
본 발명은 미성숙 배아를 이용한 밀(Triticum aestivum L.)의 형질전환 방법, 형질전환 밀의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 형질전환 밀, 제조용 미성숙 배아의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 미성숙 배아, 밀의 미성숙 배아의 유전자총 방법을 이용한 형질전환용 배지 조성물, 밀의 형질전환된 미성숙 배아로부터 캘러스 유도용 배지 조성물, 밀의 캘러스로부터 신초 유도용 배지 조성물 및 밀의 발근 유도용 배지 조성물에 관한 것이다.
밀은 쌀, 옥수수와 함께 세계에서 가장 중요한 곡물 중 하나이다. 2018년 연간 밀 생산량은 약 8억 6,500톤으로 추정되며, 복합 탄수화물이 풍부하여 쌀이나 옥수수보다 더 우수한 단백질 공급원이다. 또한 밀은 필수 비타민 B, 비타민 E 및 철, 마그네슘, 인, 칼륨 및 아연과 같은 미네랄을 구성요소로 하며 세계 인구의 3분의 1 이상의 주식을 이루고 있다.
밀은 동종육배체(AABBDD, 2n=6x=42)로서, 밀의 게놈은 초기 조상에서 파생된 세 개의 하위 게놈(A, B, D)으로 구성되며 인간 게놈 크기의 5배, 쌀 게놈 크기의 35배인 전체 16Gb의 크기를 가져, 이러한 크고 복잡한 게놈으로 인해 밀의 육종은 다른 식물에 비해 어렵다.
한편, 유전자 변형기술(Genetic modification)은 수많은 작물 품종을 개발하고 유전자 기능을 연구하는데 사용되며, 생산성, 곡물 품질 및 스트레스 내성이 향상된 새로운 작물 품종을 개발하는데 성공적으로 적용되어왔다.
현재까지 밀의 유전자 변형에 일반적으로 사용되는 방법으로는 유전자총, 아그로박테리움 튜메페시엔스-매개 및 폴리에틸렌 글리콜-매개 방법, 꽃가루 관을 통한 전달 방법 등이 있다. 유전자총을 통한 형질전환은 아그로박테리움 기반 도입 유전자 전달보다 형질전환 효율이 더 높으며 유전자형에 덜 의존적인 장점이 있다. 형질전환에 가장 일반적으로 사용되는 표적 조직은 미성숙 배아(immature embryo)로, 미성숙 배아는 형질전환 초본으로 재분화되는 배발생 캘러스를 쉽게 형성하는 장점이 있으나, 미성숙 배아를 외식편으로 사용하는 데에는 샘플링 시간 제한 및 계절적 제한이라는 어려움이 있다.
밀의 유전자 변형을 통해 특정 용도에 보다 적합한 밀을 개발하고자 하는 요구는 꾸준히 제기되어 왔으나, 밀은 옥수수나 쌀 같은 다를 곡물에 비해 형질전환 효율이 낮고 형질전환된 유전자형에 대한 의존도가 높으므로, 밀의 형질전환을 위한 우수한 방법을 개발하는 것이 시급한 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 최적의 밀 형질전환 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 국내 상업용 밀 품종들에 대해 유전자총이 활용된 최적화된 형질전환 조건을 적용하여 높은 형질전환 효율을 나타나는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 다음의 단계를 포함하는 미성숙배아를 이용한 밀(Triticum aestivum L.)의 형질전환 방법을 제공하는 것이다.
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및
(e) 상기 캘러스로부터 형질전환 밀을 수득하는 단계.
본 발명의 다른 예시적 목적은 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀(Triticum aestivum L.)의 제조방법을 제공하는 것이다.
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
(e) 상기 캘러스를 재분화(regeneration) 배지에서 배양하여 신초(shoot)를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 신초를 발근(rooting) 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 제조방법으로 제조된 형질전환 밀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법을 제공하는 것이다.
(a) 밀 이삭을 수집하는 단계;
(b) 상기 이삭에서 미성숙 알갱이를 분리하여 전처리하는 단계;
(c) 상기 전처리한 미성숙 알갱이에서 미성숙 배아를 분리하는 단계; 및
(d) 미성숙 배아를 박리 배지에서 배양하는 단계.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 제조방법으로 제조된 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L
티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙배아 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙 배아의 유전자총 방법을 이용한 형질전환용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 형질전환된 미성숙 배아로부터 캘러스 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4), 0.1g/L 내지 10 g/L 6-벤질아데닌(6-BA) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 캘러스로부터 신초 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 발근 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 미성숙배아를 이용한 밀(Triticum aestivum L.)의 형질전환 방법을 제공한다.
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및
(e) 상기 캘러스로부터 형질전환 밀을 수득하는 단계.
본 발명의 용어 "밀"은 소맥이라고도 하며, 주로 온대 지방의 밭에서 재배하는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이 풀이다. 줄기에는 20개 내외의 마디가 있고 각 마디에 1개의 작은이삭이 어긋나면서 달린다. 이삭의 모양은 밑동이 굵고 위가 가는 추형과 위아래가 가늘고 중간이 굵은 방추형, 밑동이 가늘고 위가 굵은 곤봉형, 전체가 균등하게 굵은 막대기형의 4가지로 구분된다. 밀의 종자는 타원 모양이고 배가 있는 쪽에 깊은 골이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 밀의 품종은 금강, DH20, 알찬, 그루, 고분, 금강, 탑동 및 우리 품종 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 개화 후 15 내지 18일인 밀 이삭으로부터 분리된 것인 것일 수 있다.
밀 배아의 성숙 단계는 형질전환 효율에 영향을 미치는 중요한 요소이며, 성숙된 밀의 배아보다 어린 밀의 미성숙 배아로부터 유래한 형질전환 식물이 더 우수한 회복력을 가진다. 특히 어린 밀의 성숙 단계 중 형질전환 효율이 높은 단계는 착유가 완료되고 낟알이 형성되기 시작하는 착유기(milk development stage)로, 착유기는 초기, 중기 및 후기 단계로 세분화되며, 개화 후 15 내지 18일 사이의 미성숙 배아는 중간 단계인 유백색을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 밀 이삭으로부터 분리되어 3 내지 5일간 박리(dissection) 배지에서 암배양되는 것일 수 있고, 구체적으로 4일간 암배양되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 박리 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금 입자는 0.3 내지 0.9 μm 직경일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 0.7 μm 직경일 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.6 μm 직경일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 코팅은 상기 목적 유전자를 글리세롤, 스페르미딘 및 염화칼슘이 포함된 용기에서 상기 금 입자와 혼합하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 미성숙 배아는 유전자총 방법 실시 전에, 형질전환 배지에서 3 내지 5시간 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 4시간 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 배지에서 배양하기 전에 미성숙 배아를 원심분리 할 수 있으며, 상기 원심분리는 15,000g 내지 25,000g에서 1 내지 3 분간 4℃에서 수행하는 것일 수 있고, 구체적으로 20,000g에서 2분간 분간 4℃에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 형질전환 수행 전의 원심분리는 세포벽의 투과성을 높여 DNA 전달 및 형질전환 효율을 향상시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계에서 형질전환된 미성숙 배아는, 형질전환 배지에서 15 내지 25 시간 배양하는 것일 수 있으며, 구체적으로 20시간 배양하는 것일 수 있다.
이처럼 형질전환을 수행하기 전 미성숙 배아를 고농도의 당이 포함된 배지에서 배양하고, 형질전환 수행 후 다시 동일한 배지에서 배양하는 삼투성 처리(osmotic treatment)를 하면 형질전환 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 회복 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 박리 배지, 형질전환 배지, 회복 배지, 재분화 배지 및 발근 배지는 pH 5.6 내지 pH 6.0일 수 있고, 구체적으로 pH 5.7 내지 pH 5.9일 수 있으며, 더욱 구체적으로 pH 5.85일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 상기 (c)단계의 유전자총 방법은 상기 발현벡터가 코팅된 금 입자에 1000 내지 1200 psi 헬륨 압력으로 충격을 가하여 이루어지는 것일 수 있으며, 구체적으로 1100 psi 헬륨 압력으로 충격을 가하여 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계는 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지에서 1 내지 3주간 암배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 2주간 암배양하는 것일 수 있으며, 상기 (d) 단계에서의 암배양은 2회 반복되는 것일 수 있다.
형질전환시 고농도의 형질전환 배지에서 총 24시간 방치하여 캘러스의 상태가 불안정해지므로, 회복배지에서 불안정한 상태의 캘러스를 회복시켜 건강한 캘러스를 선발하는 과정을 거치게 되며, 2회 암배양을 통해 많은 수의 건강한 캘러스를 생산할 수 있다.
본 발명의 용어 "형질전환"은 특정 DNA 단편을 생명체의 유전체 내로 삽입하여 새로운 유전형질이 발현되도록 하는 방법이다. 현재까지 밀의 유전자 변형에 일반적으로 사용되는 방법으로는 유전자총, 아그로박테리움 튜메페시엔스-매개 및 폴리에틸렌 글리콜-매개 방법, 꽃가루 관을 통한 전달 방법 등이 알려져 있다. 그 중 "유전자총(particle bombardment)"은 외부 DNA를 매우 빠른 속도로 발사하여 식물 세포나 조직 내로 도입하는 방법으로, 조직배양을 통한 재분화가 어려운 식물에 적합하며, 아그로박테리움을 이용한 유전자 전이가 어려운 밀에 효과적으로 적용이 가능하다. 다만, 이러한 유전자 총을 이용하더라도 상업용 밀의 형질전환 효율은 0 내지 1.7% 정도로 매우 낮은 수준이며, 전이 유전자를 다음 세대로 유전하는 것에 어려움이 있다.
본 발명의 실시예에서는, 국내 상업용 밀 품종인 금강 및 DH20의 미성숙 배아에 상기 제조방법을 적용하여 eGFP 유전자를 형질전환하였으며, 금강 품종의 경우 평균 4.4%, DH20 품종의 경우 평균 3.5%의 우수한 형질전환 효율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 형질전환된 금강 및 DH20 품종(T0)의 다음 세대(T1)로 전이유전자가 안정적으로 유전됨을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 일 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀(Triticum aestivum L.)의 제조방법을 제공한다.
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
(e) 상기 캘러스를 재분화(regeneration) 배지에서 배양하여 신초(shoot)를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 신초를 발근(rooting) 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계.
상기 미성숙 배아, 박리 배지, 금 입자, 형질전환 배지, 회복 배지, 유전자총 방법, 코팅 및 밀은 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 개화후 15 내지 18일인 밀 이삭으로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 밀 이삭으로부터 분리되어 3 내지 5일간 박리(dissection) 배지에서 암배양되는 것일 수 있으며, 구체적으로 4일간 암배양되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 미성숙 배아는 유전자총 방법 실시 전에, 형질전환 배지에서 3 내지 5시간 배양할 수 있으며, 구체적으로 4시간 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계에서 형질전환된 미성숙 배아는, 형질전환 배지에서 15 내지 25 시간 배양할 수 있으며, 구체적으로 20시간 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계는 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지에서 1 내지 3주간 암배양하는 것일 수 있으며, 구체적으로 2주간 암배양하는 것일 수 있고, 상기 (d) 단계에서 암배양은 2회 반복하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재분화 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4), 0.1g/L 내지 10 g/L 6-벤질아데닌(6-BA) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발근 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서의 배양은 1일당 14 내지 18시간동안 명배양 및 6 내지 10시간동안 암배양하는 조건으로 1 내지 3주 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 1일당 16시간 명배양 및 8시간 암배양하는 조건으로 2주 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계에서의 배양은 1일당 14 내지 18시간동안 명배양 및 6 내지 10시간동안 암배양하는 조건으로 1 내지 3주 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 1일당 16시간 명배양 및 8시간 암배양하는 조건으로 2주 배양하는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 형질전환 밀을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법을 제공한다.
(a) 밀 이삭을 수집하는 단계;
(b) 상기 이삭에서 미성숙 알갱이를 분리하여 전처리하는 단계;
(c) 상기 전처리한 미성숙 알갱이에서 미성숙 배아를 분리하는 단계; 및
(d) 미성숙 배아를 박리 배지에서 배양하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 수집은 개화 후 15 내지 18일에 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전처리는 상기 미성숙 알갱이를 표면 살균한 후 초음파 처리하고 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표면 살균은 에탄올 및 Tween 20으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 3 내지 5일간 암배양 하는 것일 수 있으며, 구체적으로 4일간 암배양하는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은
말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙배아 배양용 배지 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙 배아의 유전자총 방법을 이용한 형질전환용 배지 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 형질전환된 미성숙 배아로부터 캘러스 유도용 배지 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4), 0.1g/L 내지 10 g/L 6-벤질아데닌(6-BA) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 캘러스로부터 신초 유도용 배지 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 발근 유도용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전자총을 적용한 형질전환 방법에 의해 우수한 효율로 형질전환 밀을 제조할 수 있으며, 제조된 형질전환 밀은 다음 세대로 전이 유전자를 안정적으로 유전시킬 수 있다.
다만, 본 명세서에 개시된 기술의 일 실시예에 따른 효과는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 밀의 유전적 형질전환의 과정을 나타낸 것이다(a : 밀 이삭, b : 개화 후 15 내지 18일 경의 미성숙 알갱이, c : 분리된 미성숙 배아, d : 박리 배지에 담긴 미성숙 배아, e : 형질전환 전 형질전환 배지에 담긴 미성숙 배아, f : 형질전환 후 회복 배지에서의 캘러스 유도, g : 재분화 배지에서 싹이 돋는 캘러스, h : 발근 배지에서의 뿌리와 묘목 성장, i : 흙에 심어진 형질전환 밀).
도 2는 본 발명에 따라 제조된 발현벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 사용된 eGFP의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 금강 품종에서의 eGFP 유전자 형질전환에 대한 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도5는 DH20 품종에서의 eGFP 유전자 형질전환에 대한 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 형질전환된 금강 품종에서의 eGFP 발현을 확인하기 위한 RT-qPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환된 DH20 품종에서의 eGFP 발현을 확인하기 위한 RT-qPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 형질전환된 금강 품종에서의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 형질전환된 DH20 품종에서의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 10은 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 11은 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 13은 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 14는 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 발현벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 사용된 eGFP의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 금강 품종에서의 eGFP 유전자 형질전환에 대한 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도5는 DH20 품종에서의 eGFP 유전자 형질전환에 대한 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 형질전환된 금강 품종에서의 eGFP 발현을 확인하기 위한 RT-qPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환된 DH20 품종에서의 eGFP 발현을 확인하기 위한 RT-qPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 형질전환된 금강 품종에서의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 형질전환된 DH20 품종에서의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 10은 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 11은 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 금강 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 13은 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 gPCR 분석을 나타낸 것이다.
도 14는 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 DH20 품종의 T1 유전자 형질전환 밀의 단백질 발현 분석을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 형질전환된 밀의 제조
1-1. 실험재료 준비
한국산 밀(Triticum aestivum L.) 품종인 금강과 DH20을 평균 온도 17 내지 28 ℃, 상대 습도 60 내지 70%로 2018년 11월부터 2020년 6월까지 전주 농촌진흥청 들에서 재배하였다. 재배 중 살균제 또는 살충제는 살포되지 않았다.
DH20 품종은 금강 및 올그루 품종 간의 교잡에서 파생된 이중 반수체로서, 게놈 결실에 의해 Glu-B3 및 Gli-B1 유전자좌가 결여된 품종이다.
1-2. 미성숙 배아의 분리
미성숙 배아가 직경 1 내지 1.5mm 인 밀 이삭을 개화 후 15-18일(15-18 days post anthesis, 15-18 DPA)경 수집하였다(도 1-a). 미성숙 배아는 도 1-b 및 1-c에서 나타낸 것처럼 유백색이며 완전히 딱딱해지지 않은 상태이어야 한다.
밀 알갱이로부터 대략 3-5mm로 이삭에서 까끄라기를 제거하였다. 종자 껍질을 제거한 후 미성숙 알갱이를 이삭에서 분리하여 500ml 멸균된 비커에 담았다. 알갱이를 2 부피의 70% 에탄올(종자를 200ml 표시까지 채우고 70% 에탄올을 500ml까지 채움) 및 0.005% Tween 20으로 표면 살균한 후 5초씩 6번 초음파 처리하고, 2-5 부피의 70% 에탄올(비커의 500ml까지 70% 에탄올로 채움)로 5분간 세척하였다. 70% 에탄올을 제거한 후 2 부피의 20% 표백제 및 0.05% Tween 20으로 대체하여 교반 플레이트에서 15분간 부드럽게 교반하면서 표면 살균하였다. 그 후 알갱이를 멸균 증류수로 세 번 세척하였다.
이후의 후속작업은 층류 후드의 멸균 조건에서 수행하였다. 미성숙 배아는 해부 현미경 및 미세집게를 사용하여 상기 멸균수로 세척된 밀 알갱이로부터 에서 분리하였다. 무균 환경에서 미성숙 배아를 절제하고 배유 및 종자 껍질을 제거하였다. 이후 도 1-d에 나타낸 것처럼 38개 미성숙 배아를 박리 배지(dissection medium)가 담긴 플레이트에 배반이 위로 오도록 배치하였다.
박리 배지의 성분 및 조건은 다음과 같다. 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴(L-asparagine), 49 μl 0.1 M CuSO4, 0.4% agar, pH 5.85.
미성숙 배아는 실온(22 내지 23℃)에서 4 내지 6일간 암실에서 배양되었다.
1-3. 발현 벡터 제작
도 2에 나타낸 바와 같이 pJL10P5 벡터(A, USDA-ARS, Dr. S.B. Altenbach로부터 받음)에 HapⅠ 제한부위로 pCamhybeGFP1 벡터(GenBank accession number KX223837)의 720bp eEGFP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 서브클로닝하였다. pJL10P5 벡터는 배유 특이적 밀 고분자 글루테닌 유전자 Dy10의 프로모터 및 밀 고분자 글루테닌 유전자 (High-Molecular-Weight Glutenin Subunit (HMW-GS)) Dx5의 터미네이터에 의해 구동되는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, eGFP)을 포함한다. 플라스미드 내 eGFP의 방향 및 유전자의 무결성을 도 3에서 나타낸 바와 같이 PCR 및 시퀀싱으로 확인하였다 (서열번호 1).
1-4. 형질전환 밀 제조
실시예 1-2에서 준비한 미성숙 배아를 20,000g로 4℃에서 2분간 원심분리한 후 500mM 수크로오스가 포함된 형질전환 배지(bombardment medium)에 도 1-e에 나타낸 바와 같이 원형으로 배치시켜 4시간 배양하였다. 형질전환 배지의 성분 및 조건은 다음과 같다 : 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴(L-asparagine), 500mM 수크로오스, 0.4% agar, pH 5.85.
실시예 1-3에서 제작한 발현벡터 DNA 50 μg를 1.5mL 튜브에서 5분간 50% 글리세롤(60 mg/ml) 내 0.6 μm 직경 금 입자(Bio-Rad, Hercules, USA), 0.1M 스페르미딘 10 μl 및 2.5M CaC12 25 μl 와 함께 볼텍싱하여 혼합하였다. 실온에서 10분간 배양한 후 DNA가 코팅된 금입자를 9,100 x g에서 2초간 원심분리하여 수집하고 상등액을 제거하였다. 펠렛을 70% 에탄올 70 μl로 세척한 후 99.5% 에탄올로 다시 세척하였다. 최종 펠렛을 99.55% 에탄올 24 μl로 재현탁한 후 분취량(6 μl)을 거대담체 막(macrocarrier membranes) (BioRad, USA)에 놓고 클린 벤치에서 증발되도록 하였다.
배지 플레이트로부터 6.0 cm 거리에서 PDS-1100/He?? 장치 (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 형질전환을 수행하였으며, DNA가 코팅된 금 입자에 1100 psi (9.3 MPa) 헬륨 압력으로 충격을 가하였다.
형질전환 후 20시간 동안 추가 배양한 다음, 미성숙 배아를 플레이트 당 34개씩 배반이 위를 향하게 하여 회복 배지(recovery medium)로 옮기고 2주간 22 내지 23℃ 실온의 암실에서 배양하였다. 회복 배지의 성분 및 조건은 다음과 같다 : 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 2 ml 2,4-D (1 mg/ml), 49 μl 100 mM CuSO4, 0.3% agar, pH 5.85.
이 과정을 두 번 반복한 후 생성된 캘러스를 재분화 배지(Regeneration medium)로 옮기고 16시간 명배양, 8시간 암배양하였으며, 단일 배아에서 파생된 모든 캘러스를 라벨링하였다. 재분화 배지의 성분 및 조건은 다음과 같다 : 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 200 μl 2,4-D (1 mg/ml), 49 μl 100 mM CuSO4, 100 μl 6-BA (1 mg/ml), 0.3% agar, pH 5.85. 캘러스를 총 8주까지 2주마다 새로운 재분화 배지로 옮겨 배양하였으며, 도 1-h에서 나타낸 바와 같이 캘러스에서 자라난 싹을 발근 배지(rooting medium)로 옮겼다. 발근 배지의 성분 및 조건은 다음과 같다 : 2.2 g MS 염, 20 g 말토스, 5 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 75 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 0.3% agar, pH 5.85. 발근 배지에서 2주간 16시간 빛, 8시간 어둠 하에서 배양한 후 도 1-i에 나타낸 바와 같이 뿌리가 건강한 초본을 토양으로 옮겨 심었다.
본 발명에서 사용된 배지의 성분 및 배양 조건은 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 구분 | 성분 | pH | 배양 조건 |
| 박리 배지 | 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴(L-asparagine), 49 μl 0.1 M 황산구리(CuSO4), 0.4% agar | 5.85 | 4일, 암배양 |
| 형질전환 배지 | 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴(L-asparagine), 500 mM 수크로오스, 0.4% agar | 형질전환 전 4시간, 형질전환 후 20시간 | |
| 회복 배지 | 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 2 ml 2,4-D (1 mg/ml), 49 μl 100 mM CuSO4, 0.3% agar | 2주 암배양, 2회 | |
| 재분화 배지 | 4.4 g MS 염, 40 g 말토스, 10 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 150 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 200 μl 2,4-D (1 mg/ml), 49 μl 100 mM 황산구리(CuSO4), 100 μl 6-BA (1 mg/ml), 0.3% agar | 2주, 일일당 16시간 명배양/8시간 암배양, 4회 | |
| 발근 배지 | 2.2 g MS 염, 20 g 말토스, 5 ml 티아민-염산(thiamine-HCl) (50 μg/ml), 75 mg L-아스파라긴 (L-asparagine), 0.3% agar | 2주, 일일당 16시간 명배양/8시간 암배양 |
결과적으로, 금강 품종의 경우 각각 269, 266, 293 및 319개의 미성숙 배아를 이용해 네 번의 형질전환을 시도하여 각각 17, 10, 35 및 34개의 형질전환된 식물을 얻어 금강 품종 미성숙 배아로부터 캘러스 재분화률이 3.8 내지 11.9%임을 확인하였다.
DH20 품종의 경우 각각 269 및 268개의 미성숙 배아를 이용해 두 번의 형질전환을 시도하여 각각 34 및 14개의 형질전환된 식물을 얻어, DH20 품종 미성숙 배아로부터 캘러스 재분화률이 5.2% 내지 12.6%임을 확인하였다.
실시예 2: 형질전환 분석
2-1. eGFP 유전자 삽입 확인
실시예 1-4에서 얻은 형질전환 밀의 잎 조직에서 제조사의 지침에 따라 DNeasy® Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Fisher Scientifc, Waltham, USA)에서 정량하고 50ng/μl로 희석하였다. 그 후 200 ng 게놈 DNA, 1.25 U Go-Taq DNA 폴리머라제 (Promega, Madison, USA), 1ХGreen Go-Taq 반응 완충액(containing 1.5 mM MgCl2), 200 μM dNTP mix (Bioneer, Daejeon, South Korea), eEGFP 429bp 단편을 증폭하도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머 각각 10 pmol(서열번호 2: Forward 5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3′, 서열번호 3: Reverse 5′CTCCAGCTTGTGCCCCAGGATG-3′)을 포함한 25 μl의 반응 부피로 게놈 PCR(gPCR)을 수행하였다. 게놈 PCR 반응을 위한 증폭은 95℃에서 2분간 초기 변성, 이어서 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초의 35사이클 수행 후 72℃에서 7분간 최종 확장의 순서로 진행된다.
게놈 PCR 산물은 0.5x Tris-acetate-EDTA (TAE, pH 8.0) 완충액의 1.5% 아가로스 겔에 녹아 에티듐 브롬(ethidium bromide)으로 염색되어 UV 광 하에서 가시화되었다.
그 결과, 네 번의 실험에서 형질전환된 금강 품종의 밀(17, 10, 35 및 34개) 중 eGFP가 삽입된 밀은 각각 12, 4, 18 및 16개로, 금강 품종의 형질전환 효율이 1.5 내지 6.1%임을 확인하였다(도 4).
또한, 두 번의 실험에서 형질전환된 DH20 품종의 밀(34 및 14개) 중 EGFP가 삽입된 밀은 각각 13개 및 6개로, DH20 품종의 형질전환 효율이 2.2% 내지 4.8%임을 확인하였다(도 5).
2-2. eGFP 유전자 발현 분석
RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환된 밀의 잎에서 total RNA를 추출하고, RNA의 농도와 품질을 Nanodrop 2000 분광광도계를 이용해 평가하였다. 그 후 RNA 1 μg을 템플릿으로 하여 amfRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, South Korea)를 이용해 cDNA를 합헝하였다. PCR 분석은 eGFP 유전자의 94bp 단편을 증폭하기 위해 설계된 프라이머쌍(서열번호 4: Forward 5'-CTGCTGCCCGACAACCAC-3', 서열번호 5: Reverse 5'-TCACGAACTCCAGCAGGAC-3')을 이용해 수행하였고, RT-qPCR 분석은 AccuPower 2xGreenStar qPCR Master Mix(Bioneer, Daejeon, South Korea)와 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, USA)을 이용해 수행하였다.
합성된 cDNA 20 μl를 200㎕ 증류수로 희석한 후, 2μl를 사용하였다. 각 샘플에 대해 3번의 반응을 수행하였고 발현 수준은 액틴 (서열번호 6: forward 5′-CTTGTATGCCAGCGGTCGAACA-3', 서열번호 7: reverse 5′-CTC ATAATCAAGGGCCACGTA-3′)을 대조군으로 하여 정규화하였다.
그 결과, 금강 품종 및 DH2 품종의 형질전환 밀들은 각각 다양한 eGFP 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7).
2-3. eGFP 단백질 발현 분석
실시예 2-2에서 금강 품종 중 가장 높은 eGFP 발현을 나타낸 GK4 및 DH20 품종의 GD4, GD5 및 GD12를 대상으로 단백질 발현 분석을 수행하였다.
구체적으로, 형질전환된 밀을 eGFP필터(여기 파장 470nm, 대역통과 필터 40nm, 방출 파장 525nm, 대역통과 필터 50nm)가 장착된 현미경으로 관찰하였다. 형질전환된 밀(T0)의 뿌리 끝에서 분리된 원형질체의 형광 이미지를 Zeiss SteREO microscope (Carl Zeiss, Germany)로 캡쳐하였다.
원형질체 분리는 Jia et al. (2016)에 기재된 방법을 변형하여 수행하였으며, 효소 용액은 20 mM MES pH 5.8, 1.0% (w/v) 셀룰라아제 R 10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan), 0.25% (w/v) macerozyme R-10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)를 포함하였다.
그 결과, 형질전환된 금강 품종 GK4 및 DH20 품종 GD4, GD5 및 GD12의 잎에서 유래한 원형질체는 도 8 및 도 9에서 나타낸 바와 같이 녹색 형광을 나타내어, eGFP 벡터가 밀의 핵 게놈에 안정적으로 삽입되어 발현됨을 확인하였다.
실시예 3: 형질전환 밀(T
0
)에서 eGFP의 안정적인 유전 확인
이식유전자가 안정적으로 다음 세대로 유전되는지 확인하기 위하여, 형질전환된 밀(T0)로부터 얻은 T1 종자를 수집하여 온실에서 발아한 후, 실시예 2-1 내지 2-3과 동일한 방법으로 gPCR에 의해 eGFP 이식유전자의 존재를 확인하고 RT-qPCR에 의해 발현을 분석하였으며, T1 묘목의 뿌리 끝에서 분리된 원형질체의 녹색 형광 신호를 관찰하였다.
그 결과, 형질전환된 금강 품종 GK4에서 파생된 GK4-1(T1)에서 eGFP 유전자의 존재(도 10) 및 전사체 발현(도 11)이 확인되었으며 녹색 형광이 나타나는 것을 관찰하였다(도 12).
또한 형질전환된 DH20 품종 GD4, GD5 및 GD12에서 각각 파생된 GD4-6, GD5-10 및 GD12-1에서 eGFP 유전자의 존재(도 13) 및 전사체 발현(도 14)이 확인되었으며 녹색 형광이 나타나는 것을 관찰하였다(도 15).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
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ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
720
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
ctccagcttg tgccccagga tg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 4
ctgctgcccg acaaccac 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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tcacgaactc cagcaggac 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 6
cttgtatgcc agcggtcgaa ca 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 7
ctcataatca agggccacgt a 21
Claims (45)
- 다음의 단계를 포함하는, 미성숙 배아를 이용한 밀(Triticum aestivum L.)의 형질전환 방법:
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및
(e) 상기 캘러스로부터 형질전환 밀을 수득하는 단계.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 개화 후 15 내지 18일인 밀 이삭으로부터 분리된 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 밀 이삭으로부터 분리되어 3 내지 5일간 박리(dissection) 배지에서 암배양되는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)단계의 금 입자는 0.3 내지 0.9 μm 직경인 것을 특징으로 하는, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)단계의 코팅은 상기 목적 유전자를 글리세롤, 스페르미딘 및 염화칼슘이 포함된 용기에서 상기 금 입자와 혼합하여 수행하는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 박리 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 미성숙 배아는 유전자총 방법 실시 전에, 형질전환 배지에서 3 내지 5시간 배양하는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 형질전환된 미성숙 배아는, 형질전환 배지에서 15 내지 25 시간 배양하는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 형질전환 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 회복 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계의 유전자총 방법은 상기 발현벡터가 코팅된 금 입자에 1000 내지 1200 psi 헬륨 압력으로 충격을 가하여 실시되는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (d)단계는 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지에서 1 내지 3주간 암배양하는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 암배양은 2회 반복되는 것인, 밀의 형질전환 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 밀은 금강, DH20, 알찬, 그루, 고분, 금강, 탑동 및 우리 품종 중 선택되는 하나 이상인, 밀의 형질전환 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀(Triticum aestivum L.)의 제조방법:
(a) 밀의 미성숙 배아를 준비하는 단계;
(b) 목적 유전자를 포함하는 발현벡터를 금 입자에 코팅하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 미성숙 배아에 상기 (b)단계의 발현벡터가 코팅된 금 입자를 이용해 유전자총(particle bombardment)방법을 실시하여 형질전환된 미성숙 배아를 수득하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지(recovery medium)에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
(e) 상기 캘러스를 재분화(regeneration) 배지에서 배양하여 신초(shoot)를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 신초를 발근(rooting) 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계.
- 제15항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 개화 후 15 내지 18일인 밀 이삭으로부터 분리된 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 미성숙 배아는 밀 이삭으로부터 분리되어 3 내지 5일간 박리(dissection) 배지에서 암배양되는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (b)단계에서 금 입자는 0.3 내지 0.9 μm 직경인 것을 특징으로 하는, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (b)단계의 코팅은 상기 목적 유전자를 글리세롤, 스페르미딘 및 염화칼슘이 포함된 용기에서 상기 금 입자와 혼합하여 수행하는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제17항에 있어서,
상기 박리 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 미성숙 배아는 유전자총 방법 실시 전에, 형질전환 배지에서 3 내지 5시간 배양하는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (c)단계에서 형질전환된 미성숙 배아는, 형질전환 배지에서 15 내지 25 시간 배양하는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제21항에 있어서,
상기 형질전환 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 회복 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 재분화 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4), 0.1g/L 내지 10 g/L 6-벤질아데닌(6-BA) 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 발근 배지는 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴 및 아가(agar)를 포함하는 MS배지인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (c)단계의 유전자총 방법은 상기 발현벡터가 코팅된 금 입자에 1000 내지 1200 psi 헬륨 압력으로 충격을 가하여 실시되는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (d)단계는 형질전환된 미성숙 배아를 회복 배지에서 1 내지 3주간 암배양하는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제28항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 암배양은 2회 반복되는 것인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 밀은 금강, DH20, 알찬, 그루, 고분, 금강, 탑동 및 우리 품종 중 선택되는 하나 이상인, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (e) 단계에서의 배양은 1일당 14 내지 18시간동안 명배양 및 6 내지 10시간동안 암배양하는 조건으로 1 내지 3주 배양하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항에 있어서,
상기 (f) 단계에서의 배양은 1일당 14 내지 18시간동안 명배양 및 6 내지 10시간동안 암배양하는 조건으로 1 내지 3주 배양하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 밀의 제조방법.
- 제15항 내지 제32항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 형질전환 밀.
- 다음의 단계를 포함하는 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법:
(a) 밀 이삭을 수집하는 단계;
(b) 상기 이삭에서 미성숙 알갱이를 분리하여 전처리하는 단계;
(c) 상기 전처리한 미성숙 알갱이에서 미성숙 배아를 분리하는 단계; 및
(d) 미성숙 배아를 박리 배지에서 배양하는 단계.
- 제34항에 있어서,
상기 수집은 개화 후 15 내지 18일에 이루어지는 것인, 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법.
- 제34항에 있어서,
상기 전처리는 상기 미성숙 알갱이를 표면 살균한 후 초음파 처리하고 세척하는 단계를 포함하는, 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법.
- 제36항에 있어서,
상기 표면 살균은 에탄올 및 Tween 20으로 수행되는 것인, 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법.
- 제34항에 있어서,
상기 배양은 3 내지 5일간 암배양 하는 것인, 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아의 제조방법.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아.
- 제39항에 있어서,
상기 밀은 금강, DH20, 서둔, 새올, 진품, 밀성, 조은, 안백, 조품, 신미찰, 조농, 조경 또는 연백 품종 중 선택되는 하나 이상인, 형질전환 밀 제조용 미성숙 배아.
- 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙배아 배양용 배지 조성물.
- 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 300 mM 내지 700 mM 수크로오스 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 미성숙 배아의 유전자총 방법을 이용한 형질전환용 배지 조성물.
- 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 형질전환된 미성숙 배아로부터 캘러스 유도용 배지 조성물.
- 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴, 0.1g/L 내지 10 g/L 2,4-D, 0.01 내지 0.2 M 황산구리(CuSO4), 0.1g/L 내지 10 g/L 6-벤질아데닌(6-BA) 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 캘러스로부터 신초 유도용 배지 조성물.
- 말토스, 0.01 g/L 내지 0.1 g/L 티아민-HCl, L-아스파라긴 및 아가(agar)를 포함하고, pH 5.6 내지 6.0으로 조절된, 밀의 발근 유도용 배지 조성물.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2004236657A (ja) | 2003-02-03 | 2004-08-26 | Bioware Technology Co Ltd | 低圧ガス加速遺伝子銃 |
-
2021
- 2021-10-07 KR KR1020210132939A patent/KR20230049891A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004236657A (ja) | 2003-02-03 | 2004-08-26 | Bioware Technology Co Ltd | 低圧ガス加速遺伝子銃 |
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