JP3218193B2 - ペプチドまたは蛋白質を含む生物基質の限外濾過のための方法 - Google Patents
ペプチドまたは蛋白質を含む生物基質の限外濾過のための方法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Description
【０００１】本発明は、複合的な生物基質、特にペプチ
ドまたは蛋白質からなる発酵ブロスを限外濾過すること
によって、予備精製（prepurification）するための方
法に関する。例えばクロマトグラフィー法によって、発
酵ブロスから蛋白質またはペプチドを単離および精製す
るためには、予備精製は最初に実施しなければならず、
これは多くの場合、脱塩法を含む。この一つの例は、遺
伝子工学により改質されたイースト菌のサッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の菌株の培養
上清から、６５個のアミノ酸を有する単鎖ポリペプチド
であるトロンビン抑制剤のヒルジンを単離することであ
る。
ドまたは蛋白質からなる発酵ブロスを限外濾過すること
によって、予備精製（prepurification）するための方
法に関する。例えばクロマトグラフィー法によって、発
酵ブロスから蛋白質またはペプチドを単離および精製す
るためには、予備精製は最初に実施しなければならず、
これは多くの場合、脱塩法を含む。この一つの例は、遺
伝子工学により改質されたイースト菌のサッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の菌株の培養
上清から、６５個のアミノ酸を有する単鎖ポリペプチド
であるトロンビン抑制剤のヒルジンを単離することであ
る。
【０００２】元来、医用ヒルのヒルド（Hirudo）から単
離したポリペプチドヒルジンは、特に優れたトロンビン
抑制剤であり、幅広い治療の可能性を有している（F．M
arkward，Biomed．Biochem．Acta 44（1985）1007〜101
3）。しかしながら、必要な量は、遺伝子工学の経路に
よって、形質転換された微生物を経ることによってしか
製造することができない。かかる情況の許で、イースト
菌のサッカロミセスセレビシエは、正確に折り畳まれた
十分に活性なヒルジンを製造するための適切なホスト有
機体である（ＥＰ Ａ１ １６８ ３４２，ＥＰ Ａ１ ２
００ ６５５）ことが見出されている。蛋白質のセクレ
チンは、培養ろ液１リッター当たり、ヒルジン数百ミリ
グラムまでの濃度で得られる。しかしながら、イースト
エキス、コーンスティープ、ペプトンまたはミートペー
ストを添加した複合的な栄養培地を使用した場合にし
か、蛋白質が高収率で得られないので、その結果、蛋白
質を精製するためには、付随する蛋白質様物質の混合物
の薄い希釈液からヒルジンを単離しなければならないと
いう問題がある。
離したポリペプチドヒルジンは、特に優れたトロンビン
抑制剤であり、幅広い治療の可能性を有している（F．M
arkward，Biomed．Biochem．Acta 44（1985）1007〜101
3）。しかしながら、必要な量は、遺伝子工学の経路に
よって、形質転換された微生物を経ることによってしか
製造することができない。かかる情況の許で、イースト
菌のサッカロミセスセレビシエは、正確に折り畳まれた
十分に活性なヒルジンを製造するための適切なホスト有
機体である（ＥＰ Ａ１ １６８ ３４２，ＥＰ Ａ１ ２
００ ６５５）ことが見出されている。蛋白質のセクレ
チンは、培養ろ液１リッター当たり、ヒルジン数百ミリ
グラムまでの濃度で得られる。しかしながら、イースト
エキス、コーンスティープ、ペプトンまたはミートペー
ストを添加した複合的な栄養培地を使用した場合にし
か、蛋白質が高収率で得られないので、その結果、蛋白
質を精製するためには、付随する蛋白質様物質の混合物
の薄い希釈液からヒルジンを単離しなければならないと
いう問題がある。
【０００３】また、このようにして得られた培養ブロス
の脱塩および製造におけるクロマトグラフィー段階の予
備精製のため、慣用の方法に加えて、例えば抽出または
沈殿、例えば非極性ポリマー物質上での疎水性吸着／脱
着（すなわちＨＩＣ）も使用される（Atkinson，F．Mav
ituna；Biochemical Engineering and BiotechnologyHa
ndbook、第16章“Downstream Processing”および第17
章“Product RecoveryProcesses and Unit Operation
s”第２版、Stockton Press 1991，New York，USA；Bro
cklebank，M．Kalyanpur：G．Schmidt-Kastnerら編:“R
ecovery of Biopuroduct"，European Federation of Bi
otechnology，Study Report of WorkingParty on Downs
tream Processing，1993中の第４章“Primary Separati
on”；Mueller and W．Bruemmer：“Die Chromatograph
ie，eine Zentrale Methode in der biotechnischen Au
farbeitung"［Chromatography，a central method biot
echnical workup］，Chem．Ing．-Tech．62（1990）No.
５、第380〜390頁）。これらの方法は、通常、幾つかの
場合、製造する生成物の量と比べて、多量の溶剤または
塩を使用することを特徴としている。このため、溶剤ま
たは塩を回収および／または廃棄するのに、余分の費用
がかかったり、または技術的に複雑さが増したりする。
さらに、使用済み吸着樹脂は、廃棄物として除去しなけ
ればならない。
の脱塩および製造におけるクロマトグラフィー段階の予
備精製のため、慣用の方法に加えて、例えば抽出または
沈殿、例えば非極性ポリマー物質上での疎水性吸着／脱
着（すなわちＨＩＣ）も使用される（Atkinson，F．Mav
ituna；Biochemical Engineering and BiotechnologyHa
ndbook、第16章“Downstream Processing”および第17
章“Product RecoveryProcesses and Unit Operation
s”第２版、Stockton Press 1991，New York，USA；Bro
cklebank，M．Kalyanpur：G．Schmidt-Kastnerら編:“R
ecovery of Biopuroduct"，European Federation of Bi
otechnology，Study Report of WorkingParty on Downs
tream Processing，1993中の第４章“Primary Separati
on”；Mueller and W．Bruemmer：“Die Chromatograph
ie，eine Zentrale Methode in der biotechnischen Au
farbeitung"［Chromatography，a central method biot
echnical workup］，Chem．Ing．-Tech．62（1990）No.
５、第380〜390頁）。これらの方法は、通常、幾つかの
場合、製造する生成物の量と比べて、多量の溶剤または
塩を使用することを特徴としている。このため、溶剤ま
たは塩を回収および／または廃棄するのに、余分の費用
がかかったり、または技術的に複雑さが増したりする。
さらに、使用済み吸着樹脂は、廃棄物として除去しなけ
ればならない。
【０００４】これに対して、本発明の目的は、ペプチド
または蛋白質を含む発酵ブロスの予備精製、特に脱塩お
よび濃縮のために、ペプチドまたは蛋白質の高い保持率
を有する、次なる精製段階に必要な程度に培養ブロスを
脱塩および濃縮するのに適した膜限外濾過法を提供する
ことである。
または蛋白質を含む発酵ブロスの予備精製、特に脱塩お
よび濃縮のために、ペプチドまたは蛋白質の高い保持率
を有する、次なる精製段階に必要な程度に培養ブロスを
脱塩および濃縮するのに適した膜限外濾過法を提供する
ことである。
【０００５】クロマトグラフィー段階用のための調整に
発酵ブロスを予備精製するための限外濾過法は、現在ま
でのところ、細胞を除去する目的は別として、大規模な
工業的スケールで、これらの初期のプロセス段階で使用
されることはなかった（T．J．O'Sullivianら、Chem．E
ng．Prog．80(1)，68〜75（1984）；A．Erikson，Desal
ination，53（1985），259〜263）。この理由の一つ
は、膜がしばしば性質の異なる副生物および汚染物質に
よって遮断され、このため、製造が目的であるのに、透
過物の流速が不適切に低くなるということである。ま
た、このため、付加的に膜の洗浄または再生という問題
が生じる（Winzeler：“Membran -Filtration mit hohe
r Trennleistung und minimalem Energiebedarf"［Memb
ran filtration with a high separation efficiency a
nd minimal energy requirment]，Cimia 44（1990）288
〜291）。このことは、特に低分子量（Ｍ＜５０,０００
ダルトン）の蛋白質およびペプチドの製造法に当てあま
り、これらは、おそらく非常に低い分離限界（分子量の
カットオフ）を有する限外濾過膜が必要である。
発酵ブロスを予備精製するための限外濾過法は、現在ま
でのところ、細胞を除去する目的は別として、大規模な
工業的スケールで、これらの初期のプロセス段階で使用
されることはなかった（T．J．O'Sullivianら、Chem．E
ng．Prog．80(1)，68〜75（1984）；A．Erikson，Desal
ination，53（1985），259〜263）。この理由の一つ
は、膜がしばしば性質の異なる副生物および汚染物質に
よって遮断され、このため、製造が目的であるのに、透
過物の流速が不適切に低くなるということである。ま
た、このため、付加的に膜の洗浄または再生という問題
が生じる（Winzeler：“Membran -Filtration mit hohe
r Trennleistung und minimalem Energiebedarf"［Memb
ran filtration with a high separation efficiency a
nd minimal energy requirment]，Cimia 44（1990）288
〜291）。このことは、特に低分子量（Ｍ＜５０,０００
ダルトン）の蛋白質およびペプチドの製造法に当てあま
り、これらは、おそらく非常に低い分離限界（分子量の
カットオフ）を有する限外濾過膜が必要である。
【０００６】先行技術では、製造の際に、すでに予備精
製が実施された、プロセスの後の方の段階、例えば次な
るクロマトグラフィー段階との間でのみ、例えば脱塩お
よび濃縮のための限外濾過が実施されていた。さらに、
膜による限外濾過の方法は、サイズの異なる蛋白質の分
離のため、発熱物質の除去のため、または生体触媒の単
離のために使用される（T．J．O'Sullivanら、Chem．En
g．Prog．80（1），68〜75（1984）；E．Flaschelら、A
dv．inBiochem．Engineering／Biotechnologie、第26
巻、“Downstream Processing"、第73〜142頁、N．Y．1
983；編者：D．J．Bell）。
製が実施された、プロセスの後の方の段階、例えば次な
るクロマトグラフィー段階との間でのみ、例えば脱塩お
よび濃縮のための限外濾過が実施されていた。さらに、
膜による限外濾過の方法は、サイズの異なる蛋白質の分
離のため、発熱物質の除去のため、または生体触媒の単
離のために使用される（T．J．O'Sullivanら、Chem．En
g．Prog．80（1），68〜75（1984）；E．Flaschelら、A
dv．inBiochem．Engineering／Biotechnologie、第26
巻、“Downstream Processing"、第73〜142頁、N．Y．1
983；編者：D．J．Bell）。
【０００７】上に記載した方法は、すべて、ペプチドま
たは蛋白質を分離するために、保持すべきペプチドまた
は蛋白質の分子量の範囲内またはそれ未満の分離限界
（分子量のカットオフ）を有する膜を使用する原理をベ
ースにしている。本発明によれば、３０.０００ダルト
ンまでの公称分離限界（分子量のカットオフ）を有する
膜上で、低分子量の蛋白質またはペプチドを脱塩および
濃縮して、生成物保持率を非常に高くすることが、全く
可能であることがわかった。したがって、本発明は、膜
の定められた分離限界が、膜によって保持されるペプチ
ドまたは蛋白質の分子量の２〜５倍、好ましくは３〜４
倍である膜上での限外濾過により、ペプチドまたは蛋白
質を含む、細胞を含まない培養ブロスの予備精製のため
の方法に関する。
たは蛋白質を分離するために、保持すべきペプチドまた
は蛋白質の分子量の範囲内またはそれ未満の分離限界
（分子量のカットオフ）を有する膜を使用する原理をベ
ースにしている。本発明によれば、３０.０００ダルト
ンまでの公称分離限界（分子量のカットオフ）を有する
膜上で、低分子量の蛋白質またはペプチドを脱塩および
濃縮して、生成物保持率を非常に高くすることが、全く
可能であることがわかった。したがって、本発明は、膜
の定められた分離限界が、膜によって保持されるペプチ
ドまたは蛋白質の分子量の２〜５倍、好ましくは３〜４
倍である膜上での限外濾過により、ペプチドまたは蛋白
質を含む、細胞を含まない培養ブロスの予備精製のため
の方法に関する。
【０００８】本発明は、特に、組換え型のヒルジン、特
にサッカロミセスセレビシエ中に発現したヒルジンを含
む、細胞を含まない培養ブロスの予備精製に使用する。
ヒルジンは、少なくとも１０００AT-Ｕ／mgの特異活性
を有するペプチド様トロンビン抑制剤を意味するものと
して理解すべきで、これは医用ヒルド種の知られている
イソヒルジンから誘導され、これは、本質的な構造の特
徴、殊に三つのジスルフィド橋の特徴を有する（J．Dod
tら、Biol．Chem．Hoppe-Seyler 366（1985）379〜38
5）；（例えばEP A1 158 564、EP A1 168 342、DE 34 4
5 517、EPA2 193 175、EP A1 200 655、EP A1 158 98
6、EP A1 209 061、DE 33 42 199、EP A1 171 024参
照）。特に、これは、EP A1 171 024、EP A1 158 986お
よびEP A1 209 061に記載されているようなヒルジンを
意味するものとして理解される。
にサッカロミセスセレビシエ中に発現したヒルジンを含
む、細胞を含まない培養ブロスの予備精製に使用する。
ヒルジンは、少なくとも１０００AT-Ｕ／mgの特異活性
を有するペプチド様トロンビン抑制剤を意味するものと
して理解すべきで、これは医用ヒルド種の知られている
イソヒルジンから誘導され、これは、本質的な構造の特
徴、殊に三つのジスルフィド橋の特徴を有する（J．Dod
tら、Biol．Chem．Hoppe-Seyler 366（1985）379〜38
5）；（例えばEP A1 158 564、EP A1 168 342、DE 34 4
5 517、EPA2 193 175、EP A1 200 655、EP A1 158 98
6、EP A1 209 061、DE 33 42 199、EP A1 171 024参
照）。特に、これは、EP A1 171 024、EP A1 158 986お
よびEP A1 209 061に記載されているようなヒルジンを
意味するものとして理解される。
【０００９】本発明の方法は、ＥＰ ０ ３２４ ７１２
に開示されているアミノ酸配列を有するヒルジン誘導体
（［Leu1，Thr2］−63−ジスルホヒルジン）を含む、細
胞を含まない培養ブロスの予備精製に使用するのが特に
好ましい。ヒルジンを含む培養ブロスを予備精製するた
めの膜の分離限界は、２０〜３０ｋＤ、好ましくは２０
ｋＤである。
に開示されているアミノ酸配列を有するヒルジン誘導体
（［Leu1，Thr2］−63−ジスルホヒルジン）を含む、細
胞を含まない培養ブロスの予備精製に使用するのが特に
好ましい。ヒルジンを含む培養ブロスを予備精製するた
めの膜の分離限界は、２０〜３０ｋＤ、好ましくは２０
ｋＤである。
【００１０】本発明の方法における特定的な透過物流速
は、濾過全体の過程にわたって１０〜３５リットル／m2
／時が好ましい。発酵培地中にコーンスティープを使用
する場合は、培養ブロスの温度は、５〜１５℃が好まし
い。本発明の方法では、透過物中の生成物の濃度がもは
や上昇せず、すなわち一定となったことが示され、定常
状態となるまでは、透過物は粗溶液に再循環させるのが
好ましい。
は、濾過全体の過程にわたって１０〜３５リットル／m2
／時が好ましい。発酵培地中にコーンスティープを使用
する場合は、培養ブロスの温度は、５〜１５℃が好まし
い。本発明の方法では、透過物中の生成物の濃度がもは
や上昇せず、すなわち一定となったことが示され、定常
状態となるまでは、透過物は粗溶液に再循環させるのが
好ましい。
【００１１】
【実施例】ヒルジンを製造するための、コーンスティー
プおよびイーストエキスを含む複合培地中で、遺伝子工
学によって改質したサッカロミセスセレビシエの菌株を
発酵させて最後に、０.２２５±０.０２５％のベンズア
ルコニウムクロリド、例えば０.４５±０.０５％のDodi
genR ２２６（水中アルキルジメチル−ベンジル−アン
モニウムクロリドの混合物の５０％強度の溶液）を培地
に添加して細胞を不活性にし、混合物を３０分間培養し
た。次いで、ブロスを分離器またはデカンターに通過さ
せて細胞を除去し、それから圧搾濾過器において、微細
段階および滅菌段階からなる２段階層濾過によって浄化
した。ろ液をＴ≦１５℃の温度に冷却し、温度に関して
可逆的に存在する、再生した沈殿物を除いた。
プおよびイーストエキスを含む複合培地中で、遺伝子工
学によって改質したサッカロミセスセレビシエの菌株を
発酵させて最後に、０.２２５±０.０２５％のベンズア
ルコニウムクロリド、例えば０.４５±０.０５％のDodi
genR ２２６（水中アルキルジメチル−ベンジル−アン
モニウムクロリドの混合物の５０％強度の溶液）を培地
に添加して細胞を不活性にし、混合物を３０分間培養し
た。次いで、ブロスを分離器またはデカンターに通過さ
せて細胞を除去し、それから圧搾濾過器において、微細
段階および滅菌段階からなる２段階層濾過によって浄化
した。ろ液をＴ≦１５℃の温度に冷却し、温度に関して
可逆的に存在する、再生した沈殿物を除いた。
【００１２】このようにして製造したろ液の導電率は、
χ＝６±０.５mS／cmであった。２０.０００ダルトンの
排除限界を有する酢酸セルロースの膜（例えば、３.８
インチの螺旋コイルモジュールの形態のNadirR ＵＦ−
ＣＡ−２０）を備えた限外濾過装置を、操作の際に、最
初に以下の条件下に６０分間設定し、透過物を循環させ
た。 平均経膜圧力 ４±１バール 圧力管当たりの体積流量 ４〜５m3／時 次いで、ろ液を同じ条件下で６：１の程度に濃縮し、透
過物を除去し、次いで導電率が≦２.０mS／cmになるま
で、透析濾過（diafiltration）にかける、すなわち体
積を一定に保ちながら、脱イオン水および濾過した水
（精製水）を添加することによって脱塩した。透析濾過
後、全体の中での濃度を８：１にするために、生成物を
再び濃縮した。ここでは、導電率をχ＜２.２mS／cmに
維持しなければならない。
χ＝６±０.５mS／cmであった。２０.０００ダルトンの
排除限界を有する酢酸セルロースの膜（例えば、３.８
インチの螺旋コイルモジュールの形態のNadirR ＵＦ−
ＣＡ−２０）を備えた限外濾過装置を、操作の際に、最
初に以下の条件下に６０分間設定し、透過物を循環させ
た。 平均経膜圧力 ４±１バール 圧力管当たりの体積流量 ４〜５m3／時 次いで、ろ液を同じ条件下で６：１の程度に濃縮し、透
過物を除去し、次いで導電率が≦２.０mS／cmになるま
で、透析濾過（diafiltration）にかける、すなわち体
積を一定に保ちながら、脱イオン水および濾過した水
（精製水）を添加することによって脱塩した。透析濾過
後、全体の中での濃度を８：１にするために、生成物を
再び濃縮した。ここでは、導電率をχ＜２.２mS／cmに
維持しなければならない。
【００１３】方法のデータおよび結果 初期容積 ： ４６００リットル ヒルジンの初期濃度 ： １００％ 最終容積 ： ７１０リットル ヒルジンの最終濃度 ： ６０７.２％ 初期導電率 ： ５.８３mS／cm 最終導電率 ： １.９７mS／cm ヒルジンの収率 ： ９３.７％ 回収率 ： ９６.９％ 透過物中の生成物の損失 ： ３.３％
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランク・リヒヤルト ドイツ連邦共和国61476クロンベルク. フレゼーニウスヴエーク４ (56)参考文献 特開 平６−145198（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−48399（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−22799（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233098（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00
Claims (7)
- 【請求項１】 膜の定められた分離限界が、膜によって
保持されるべきペプチドまたは蛋白質の分子量の２〜５
倍である膜上で限外濾過することによって、ペプチドま
たは蛋白質を含み、細胞を含まない培養ブロスを予備精
製するための方法。 - 【請求項２】 膜の定められた分離限界が、膜によって
保持されるべきペプチドまたは蛋白質の分子量の３〜４
倍である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ペプチドがヒルジンである、請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項４】 膜の分離限界が２０〜３０ｋＤである、
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 濾過全体の過程にわたっての透過物の比
流速が１０〜３５リットル／m2／時である、請求項１〜
４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 コーンスティープを含む培養ブロスの温
度は５〜１５℃である、請求項１〜５のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項７】 透過物中の生成物の濃度の上昇が止ま
り、その濃度が一定になるまで透過物を再循環させる、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19543737A DE19543737A1 (de) | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19543737:3 | 1995-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173793A JPH09173793A (ja) | 1997-07-08 |
| JP3218193B2 true JP3218193B2 (ja) | 2001-10-15 |
Family
ID=7778254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31154296A Expired - Fee Related JP3218193B2 (ja) | 1995-11-24 | 1996-11-22 | ペプチドまたは蛋白質を含む生物基質の限外濾過のための方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6103502A (ja) |
| EP (1) | EP0775710A1 (ja) |
| JP (1) | JP3218193B2 (ja) |
| KR (1) | KR970027104A (ja) |
| AU (1) | AU726264B2 (ja) |
| CA (1) | CA2191023A1 (ja) |
| DE (1) | DE19543737A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
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