DD255943A1 - Verfahren zur konzentrierung und reinigung von insulin und seinen derivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe sich die Konzentrierung und Reinigung von insulinhaltigen Loesungen bei gleichzeitiger Entfernung von Loesungsmitteln, Salzen und/oder anderen niedermolekularen Verunreinigungen realisieren laesst, ohne dass dabei das Insulin bzw. dessen Derivat ausgefaellt, chemisch umgewandelt oder adsorptiv gebunden wird. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dass innerhalb eines bestimmten p H-Bereiches die insulin- bzw. insulinderivathaltige Loesung ueber semipermeable synthetische Membranen unter Wirkung eines Druckgradienten einer Ultrafiltration und/oder Diafiltration unterzogen wird. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten mit Hilfe von semipermeablen synthetischen Membranen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten stellt in der Industrie nach wie vor ein wichtiges Problem bei der Herstellung von Pharmazeutika sowie bei der chemischen Umwandlung von Insulinen dar. Oft wird nach den in der Industrie gängigen Methoden das Insulin adsorptiv gebunden und anschließend eluiert. Diese Methode ist für die Reinigung von Peptiden, zu denen auch das Insulin zählt, üblich. In dem DD-AP 184298 wird vorgeschlagen, das Insulinmolekül an vernetzten Dextrangelkationenaustauschern zu reinigen und mit anorganischen Salzlösungen zu eluieren. Die DE-OS 1966573 und die GB-PS 1.285.024 beschreiben als Elutionsmittel ein Gemisch aus Wasser und organischen Lösungsmitteln. Ein Verfahren zur Adsorption des Insulins an Carboxymethylcellulose ist in der US-PS 3.468.870 wiedergegeben. In der US-PS 3.878.186 wird die Reinigung von Alkalimetall-oder Ammonium-Insulin über Gelfiltration genannt, während in der DE-PS 3147842 hierfür Kieselgel verwendet wird. H.Zahn et al. säuberten den Benzylesterder Schafinsulin-A-Kette über Gelfiltration an Sephadex LH-20 (z. Naturf. 24b [1969] 1127). In der DE-PS 3.229.674 wird der bei der Humaninsulinherstellung anfallende Humaninsulinmethylester über Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt.

Die genannten Methoden haben den Nachteil, daß die gewonnenen Eluate mit dem jeweiligen Elutionsmittel verunreinigt sind und die Lösungen zum Teil in stark verdünnter Form vorliegen, wodurch eine anschließende thermische Konzentrierung erforderlich wird.

Allgemein wird bei der Konzentrierung des Insulins die thermische Einengung unter Vakuum angewendet. Verschiedene Veröffentlichungen (Span. PS 453658, Myasn. Ind. SSSR 1979 [3] 36, DE-PS 2.460.334) beschäftigen sich mit diesem Problem. Die thermischen Konzentrierungsverfahren sind jedoch mit dem Nachteil eines hohen Dampf- bzw. Elektroenergiebedarfes und Kühlwasserverbrauches behaftet. Zudem erleidet Insulin bei Temperaturen oberhalb von 40⁰C eine irreversible Schädigung, die infolge örtlicher Überhitzungen bzw. bei Schwankungen des Vakuums oft in der Praxis nicht ganz vermieden werden können. Außerdem werden die in der Insulinlösung enthaltenen niedermolekularen Verunreinigungen und Salze mit angereichert. Eine andere Möglichkeit der Reinigung von Insulin und Insulinderivaten besteht darin, das Produkt auszufällen und den so gewonnenen Feststoff mit gängigen Methoden wie Filtration oder Zentrifugation abzutrennen. Die Ausfällung des Insulins durch Zugabe von Metallionen beschreibt die DE-AS 1492044. Ebenso verweist die DE-AS 2.018.588 auf die Möglichkeit der Ausfällung von Insulin aus wäßrigen Lösungen durch Zugabe von Kationen und Einstellung eines alkalischen pH-Wertes. Auch in der DE-PS 3.101.382 wird eine Insulinfällung beschrieben. Die DE-PS 3.104.949 schützt ein Verfahren, bei dem die Ausfällung von Humaninsulinestern durch Zugabe von Azeton erfolgt.

Diese genannten Methoden sind mit dem Nachteil behaftet, daß das ausgefällte Insulin bzw. sein Derivat mit dem zugegebenen Fällungsmittel verunreinigt wird und daß die Wiederauflösung des Insulins zum Zweck einer Weiterverarbeitung bzw. Weiterreinigung in der Praxis oftmals problematisch ist. Der Einsatz von Ultrafiltrationsmembranen zur Konzentrierung und Reinigung von hochmolekularen Verbindungen ist schon längere Zeit bekannt. Insulin, das mit seinem vergleichsweise geringen nominellen Molekulargewicht zu der Gruppe der Peptide zählt, würde jedoch bei einem technischen Einsatz der Ultrafiltrationskonzentrierung nur relativ schlechte Ausbeuten oder bei Verwendung entsprechend engporiger Membranen (Umkehrosmosemembranen) bei den für die Ultrafiltration üblichen Drücken zu geringe Durchsatzleistungen liefern. In der DE-PS 2701092 der Fa. Laboratorios Leo S.A. (Madrid) ist die Herstellung von Monokomponenteninsulin unter Verwendung einer Umkehrosmoseeinrichtung, entsprechend dem US-Pat.3.623.610, beschrieben. Hierbei werden zunächst mittels Membranen die großmolekularen Verunreinigungen abgetrennt, während das Insulin hindurchwandert. Anschließend erfolgt die Konzentrierung des Monokomponenteninsulins über GR8-P oder 930-Membranen in einer Ethanol-Wasser-Lösung und das anschließende Nachwaschen des Konzentrates mit 62%igem Ethanol. Vor der Membrankonzentrierung wurde der pH-Wert der Lösung auf pH 2 bis 3 eingestellt. Bei diesem pH-Wert liegt das Insulin alsmonomeres Peptid gelöst vor, wodurch eine sehr engporige Membran erforderlich ist, die eine vergleichsweise geringe Permeatdurchsatzleistung aufweist.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, die Reinigung und Konzentrierung von Insulin und seinen Derivaten in einem Membranapparat durchzuführen, ohne daß dazu die Zugabe von Fällungschemikalien, Elutionsmitteln und/oder eine thermische Konzentrierung erforderlich sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Verfahren sowohl zur Konzentrierung als auch zur Reinigung von Insulin und seinen Derivaten zu entwickein. Essoll möglichst frei von den bei anderen Konzentrierungs-und Reinigungsverfahren genannten Mängeln (wie z. B. Verunreinigung des Produktes mit Elutions- bzw. Fällungsmitteln, zu hohe Verdünnung der Lösung, mögliche Produktschädigung durch thermische Denaturierung, notwendiges Wiederauflösen von ausgeflocktem Insulin für die Weiterverarbeitung, hoher Wärme-und Kühlwasserbedarf usw.) sein. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß das Insulin bzw. Insulinderivat mit Hilfe semipermeabler Membranen durch Anwendung der Ultrafiltration und/oder der Diafiltration mit Hilfe eines Druckgradienten von 0,5 bis 10 bar angereichert wird, ohne daß hierbei eine Phasenumwandlung erfolgt.

Bei der Ultrafiltration wird die Lösung eines Makromoleküles mittels einer Ultrafiltrationsmembran sowie durch Druckeinwirkung aufkonzentriert, wobei der Durchmesser der Membranporen die Trenngrenze bestimmt. Die Membrandurchsatzleistung ist annähernd proportional der angelegten Druckdifferenz. Demgegenüber ist bei der Trennung niedermolekularer Stoffe mit Reversosmosemembranen eine Kraft aufzuwenden, die größer als der osmotische Druck der Lösung ist und diesem entgegengesetzt wirkt.

Das durchschnittliche nominelle Molekulargewicht des Insulins und seiner Derivate liegt bei etwa 6000. Bedingt durch die relativ geringe Größe seines Moleküls würde es sich im technischen Maßstab über Ultrafiltrationsmembranen nur mit verhältnismäßig hohen Verlusten abtrennen lassen. Daher ist für den effektiven Einsatz der Ultrafiltrationsmembranen eine Vorbehandlung der Lösung erforderlich. Durch diese Vorbehandlung wird das Insulinmolekül durch Agglomeration mit anderen Insulinmolekülen derart verändert, daß auf der Basis der so gewonnenen größeren löslichen Molekülassoziate effektiver eine Konzentrierung und Reinigung der Lösung durch Ultrafiltration durchgeführt werden kann. Ein Ausfällen des Insulins ist dabei unbedingt zu vermeiden, da es sonst zu einer Verstopfung der Trennmejnbran kommt. Aus diesem Grunde wurden für die Konzentrierung und Reinigung solche Lösungsbedingungen gewählt, bei denen das Insulin bzw. seine Derivate zwar agglomeriert, aber noch völlig gelöst vorliegen.

Hierzu wird in wäßriger Lösung der pH-Wert auf den Bereich 6,8 bis 8,5 eingestellt, wobei bei den neutralen pH-Werten geringere Insulinverluste aber niedrigere Permeatdurchsatzleistungen beobachtet werden konnten. Als optimal für die Ultrafiltration erwies sich der pH-Bereich 7,0 bis 7,5. Hier konnten bei vertretbaren Permeatdurchsatzleistungen von etwa 20 bis 40 l/m²h Ausbeuten von etwa 98% erzielt werden.

Einen wesentlichen Einfluß auf die Ultrafiltrierbarkeit von Insulin- bzw. Insulinderivat-Lösungen hat die Zusammensetzung des Lösungsmittels. Bekanntlich gilt Insulin in neutralen bis schwach sauren wäßrigen Lösungen als schwer löslich und demzufolge als nicht ultrafiltrierbar. Andererseits ist bekannt, daß der Zusatz von organischen Lösungsmitteln bei Eiweißen zu einer Ausfällung infolge einer Löslichkeitsverringerung führt. In praktischen Versuchen zur Ultrafiltration von Insulinlösungen unter Zusatz von organischem Lösungsmittel (vorzugsweise Alkohol) konnte jedoch überraschenderweise festgestellt werden, daß gerade durch die Lösungsmittelzugabe die Löslichkeit der Insulinassoziate verbessert und der für die Ultrafiltration anwendbare pH-Bereich erweitert wird. Während in wäßrigen Lösungen das Insulin in dem pH-Bereich zwischen 4,3 und 6,8 als schwer löslich gilt (Chem. Ztg. 100 [1976] 3,111), konnte durch den Zusatz des organischen Lösungsmittels der für die Ultrafiltration nicht anwendbare pH-Bereich auf 6,0 bis 6,5 eingeengt werden. Dadurch wurde die Ultrafiltration auch im schwach sauren Medium ermöglicht. Je weiter man sich von dem einschränkenden pH-Bereich 6,0 bis 6,5 nach oben und unten entfernt, um so höher werden zwar die Permeatdurchsatzleistungen, aber auch gleichzeitig die Insulinverluste.

Als optimal für die Ultrafiltration von Insulinen in Gemischen mit organischen Lösungsmitteln und Wasser erwies sich der pH-Wert 7,2. Bei diesem pH-Wert liegen das Insulin bzw. dessen Derivate weitestgehend als Hexamer bzw. Quaternär gelöst vor, die gegenüber dem einfachen Monokomponenteninsulin ein völlig verändertes Abtrennverhalten während der Ultrafiltration aufweisen.

Wenn man während der Ultrafiltration die als Permeat abgehende Flüssigkeit durch sauberes Lösungsmittel ergänzt, so erfolgt ein Herauswaschen der niedermolekularen Verbindungen und damit eine Reinigung der Insulinlösungen. Bei einer solchen, als Diafiltration bezeichneten, Verfahrensweise kann die Zugabe des Lösungsmittels auch periodisch oder in geänderter Menge erfolgen. Besonders vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise ist, daß dabei sowohl gelöste Salze, niedermolekulare Verbindungen als auch Lösungsmittel gleichzeitig entfernt werden können.

Die in den vorangegangenen Absätzen genannten optimalen Bedingungen für die Ultrafiltration gelten auch für die Diafiltration, wobei die Diafiltration sowohl mit der Einsatzlösung als auch mit Konzentraten durchgeführt werden kann. Entscheidend für den Grad der Abtrennung und für den Insulinverlust ist die Membranselektivität. Die Membranselektivität ist eine Konstante, die die statistische Verteilung der Poren innerhalb der Membran ausdrückt. Der begrenzte Anteil größerer Poren in der Membran führt zu einem Schlupf höhermolekularer Stoffe durch die Membran hindurch, so daß auch bei Konzentrationsänderungen eine einigermaßen gleichbleibende Membranselektivität zu erwarten ist. Bei Versuchen zur Diafiltration mit Insulinlösungen unterschiedlicher Konzentration konne jedoch überraschenderweise festgestellt werden, daß sich die Membranselektivität in Abhängigkeit von der Insulinkonzentration ändert, so daß trotz einer höheren Einsatzkonzentration im Permeat ein niedrigerer Insulingehalt gemessen wurde. Eine solch starke Veränderung der Membranselektivität gegenüber dem Insulin war nicht vorauszusehen. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß — bedingt durch die bessere Abtrennbarkeit des Insulins bzw. der Insulinderivate bei höheren Konzentrationen — zweckmäßigerweise zunächst eine Aufkonzentrierung mittels Ultrafiltration und danach die Reinigung durch Diafiltration stattfinden sollte. Eine weitere Auf konzentrierung der diafiltrierten Lösung durch eine nochmalige nachfolgende Ultrafiltration ist möglich. Beide Prozesse, Ultrafiltration und Diafiltration, lassen sich beliebig kombinieren, wobei erfindungsgemäß auch getrennte Apparate eingesetzt werden können bzw. beide Stufen mit zeitlicher Unterbrechung bzw. auch einzeln durchgeführt werden können. Die Erfindung soll nachfolgend an einigen Beispielen näher erläutert werden:

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

100ml einer 0,25%igen Schweine-Insulin-Lösung in einem Wasser/Isopropanol (50:50)-Gemisch wird mit 10%iger Salzsäure und Tris/HCI-Puffer auf pH 7,2 eingestellt und in einer Ultrafiltrationszelle aufkonzentriert. Als Trennmembran dient eine Celluloseacetatmembran UF40 (VEB Zellstoffwerk Wittenberge). Die Ultrafiltration erfolgt bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa unter Rühren mit einem Magnetrührer. Konzentriert wird bis zu einem Konzentrierungsgrad von 1:10. Im Anschluß an die Konzentrierung ist unter Konstanthaltung des Flüssigkeitsspiegels auf der Konzentratseite in der Ultrafiltrationszelle kontinuierlich die als Permeat die ZeIIe verlassende Flüssigkeitsmenge durch destilliertes Wasser zu ergänzen. Der Arbeitsdruck von 0,3MPa bleibt erhalten.

Nachdem auf diese Weise etwa 40 bis 50 ml destilliertes Wasser dem Konzentrat zugesetzt wurde, ist eine weitere Aufkonzentrierung der Insulinlösung durch Ultrafiltration bis auf V3 des ursprünglichen Konzentratvolumens möglich.

Verluste im Permeat bezogen auf den Anfangsinsulingehalt etwa 3%.

Beispiel 2

400 ml einer 0,25%igen Rinder-Insulin-Lösung in einem Isopropanol/Wasser-Gemisch werden unter Zusatz von 15 mg ZnCI₂ auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und in einer Amicon-Rührzelle über eine Celluloseacetatmembran auf 50 ml bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa aufkonzentriert. Nach Unterbrechung des Prozesses wird die konzentrierte Insulinlösung auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa über Diafiltration gereinigt. Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 3

400 ml einer Schweine-Insulin-Lösung in einem Azeton/Wasser-Gemisch werden mit HCI/Tris-Pufferauf den pH-Wert 7,2 eingestellt und in einem Ultrafiltrationsrührmodul bei einem Druck von 0,2MPa mit 21 Wasser diafiltriert. Anschließend erfolgt die Aufkonzentrierung der Lösung über Ultrafiltration

Ausbeute: 85% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 4

100 ml einer 0,25%igen Lösung von Insulin und einem Isopropanol/Wasser-Gemisch werden bei einem pH-Wert von 5,0 sowie bei einem Arbeitsdruck von 0,5MPa überCelluloseacetatmembranen ultrafiltriert. Die auf einen Insulingehalt von 25g/l aufkonzentrierte Lösung wird anschließend mit 50 ml Tris/HCI-Puffer pH 7,2 diafiltriert, um daslsopropanolzu entfernen. Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 5

1001 einer Lösung von Schweine-Insulin in einem salzhaltigen Ethanol/Wasser-Gemisch mit einem Insulingehalt von 3g/l Lösung werden bei einem pH-Wert von 7,2 mit einem Plattenfiltrationsmodul bei einem Druck von 0,3MPa auf Viodes ursprünglichen Lösungsvolumens aufkonzentriert. Anschließend erfolgt zur Entfernung störender Salzrestmengen die Diafiltration mit 501 eines Ethanol/Wasser-Gemisches derart, daß kontinuierlich der pH-Wert der Lösung gemessen und auf pH 7,2 eingestellt wird

Ausbeute: 98% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 6

100ml eines humaninsulinhaltigen Chromatographiesäulenablaufes mit einem Insulingehalt von 2,5g/l werden zunächst bei einem pH-Wert von 7,2 ultrafiltriert (Konzentrierungsgrad 1:10) und anschließend ohne Unterbrechung mit 40 ml destilliertem Wasser diafiltriert

Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 7

11 einer salzhaltigen Lösung von 2,5 g Des-Ala-Schweine-Insulin in destilliertem Wasser wird nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,2 bei einem Druck von 0,4MPa über Ultrafiltration auf einen Insulingehalt von 25g/l aufkonzentriert. Anschließend wird der Prozeß unterbrochen, dem Konzentrat 21 Wasser zugesetzt und nochmals nach Korrektur des pH-Wertes die Ultrafiltration bis zur Erreichung der gewünschten Endkonzentration von 50g/l durchgeführt

Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 8

0,25g Humaninsulin-(Threonin-B30-)monoethylester werden in 100ml eines Gemisches aus Isopropanol/Wasser (50:50) sowie 0,05g EDTA und 0,03 M Tris-Puffer gelöst und bei einem pH-Wert von 7,2 in einem Ultrafiltrationsrührmodul bei einem Arbeitsdruck von 0,3 MPa über eine CellulosacetatmembranUF40 auf/10 des ursprünglichen Lösungsvolumens aufkonzentriert. Anschließend wird das Konzentrat mit 50 ml destilliertem Wasser zur Entfernung von gelösten Salzen und des Isopropanols diafiltriert. Im Anschluß an die Diafiltration ist eine weitere Aufkonzentrierung der Lösung mittels Ultrafiltration auf V3 des Ausgangsvolumens möglich

Ausbeute: 96% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 9

2Ol eines insulinesterhaltigen Chromatographie-Säulenablaufes werden bei einem pH-Wert von 7,5 über Celluloseacetatmembranen in einem Plattenmodul bei einem Druck von 0,4MPa ultrafiltriert. Im Anschluß daran wird bei einer kontinuierlichen Statierung des pH-Wertes auf 7,3 die Diafiltration unter Hinzufügen von 1201 Wasser durchgeführt. Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes.

Beispiel 10

21 einer insulinbutylhaltigen Lösung mit einem Gehalt von 0,2% Insulinbutylester in einem Aceton/Wasser-Gemisch werden nach Zugabe von 35mg ZnCI₂ auf den pH-Wert 7,3 eingestellt und zunächst über Celluloseacetatmembranen auf V10 des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert. Im Anschluß daran wird die Konzentrierung unterbrochen, dem Konzentrat 1,81 destilliertes Wasser zugegeben, der pH-Wert ebenfalls wieder auf 7,3 korrigiert und nochmals ultrafiltriert. Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes.

Claims (6)

1. Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß agglomeriertes, in Lösung verbliebenes Insulin bzw. agglomerierte, in Lösung verbliebene Insulinderivate einer Ultrafiltration und/oder Diafiltration bei einem Druckgradienten von 0,5 bis 10 bar unterworfen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unter Insulinderivaten deren carboxylgeschützte bzw. aminogruppengeschützte Abkömmlinge sowie deren Salze und salzhaltige Lösungen, als auch Insuline mit substituierten sowie fehlenden Teilsequenzen zu verstehen sind.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der als treibende Kraft wirkende Druckgradient vorzugsweise 3 bis 5 bar beträgt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrierung und Reinigung mit den Methoden der Ultrafiltration und/oder Diafiltration jeweils getrennt als auch in Kombination beider Prozesse, vorzugsweise in der Reihenfolge Ultrafiltration-Diafiltration erfolgt, wobei beide Prozesse sowohl stufenlos aufeinanderfolgend als auch mit zwischenzeitlicher Unterbrechung und/oder in getrennten Apparaten durchgeführt werden können.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung innerhalb des pH-Bereiches 4,0 bis 6,0 sowie 6,5 bis 8,5, vorzugsweise 7,0 bis 7,5, erfolgt und das Insulin gelöst vorliegt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung der Ultrafiltrierbarkeit der wäßrigen insulinhaltigen Lösung organische Lösungsmittel, vorzugsweise Alkohole, bis zu einer Endkonzentration von 80% zugesetzt werden können.