DD255943A1

DD255943A1 - METHOD OF CONCENTRATING AND CLEANING INSULIN AND ITS DERIVATIVES

Info

Publication number: DD255943A1
Application number: DD29609686A
Authority: DD
Inventors: Detlef Aster; Peter Henklein; Eberhard Krause
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-11-10
Filing date: 1986-11-10
Publication date: 1988-04-20

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe sich die Konzentrierung und Reinigung von insulinhaltigen Loesungen bei gleichzeitiger Entfernung von Loesungsmitteln, Salzen und/oder anderen niedermolekularen Verunreinigungen realisieren laesst, ohne dass dabei das Insulin bzw. dessen Derivat ausgefaellt, chemisch umgewandelt oder adsorptiv gebunden wird. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dass innerhalb eines bestimmten p H-Bereiches die insulin- bzw. insulinderivathaltige Loesung ueber semipermeable synthetische Membranen unter Wirkung eines Druckgradienten einer Ultrafiltration und/oder Diafiltration unterzogen wird. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a method for concentrating and purifying insulin and its derivatives. A process has been developed to help concentrate and purify insulin-containing solutions while removing solvents, salts, and / or other low-molecular-weight contaminants without precipitating, chemically converting, or adsorptively binding the insulin or its derivative , The object has been achieved by subjecting the insulin- or insulin-derivative-containing solution to ultrafiltration and / or diafiltration via semipermeable synthetic membranes under a pressure gradient within a certain p H range. Field of application of the invention is the pharmaceutical industry.

Description

Field of application of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten mit Hilfe von semipermeablen synthetischen Membranen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.The present invention relates to a method for concentrating and purifying insulin and its derivatives by means of semipermeable synthetic membranes. The field of application of the invention is the pharmaceutical industry.

Characteristic of the known technical solutions

Die Konzentrierung und Reinigung von Insulin und seinen Derivaten stellt in der Industrie nach wie vor ein wichtiges Problem bei der Herstellung von Pharmazeutika sowie bei der chemischen Umwandlung von Insulinen dar. Oft wird nach den in der Industrie gängigen Methoden das Insulin adsorptiv gebunden und anschließend eluiert. Diese Methode ist für die Reinigung von Peptiden, zu denen auch das Insulin zählt, üblich. In dem DD-AP 184298 wird vorgeschlagen, das Insulinmolekül an vernetzten Dextrangelkationenaustauschern zu reinigen und mit anorganischen Salzlösungen zu eluieren. Die DE-OS 1966573 und die GB-PS 1.285.024 beschreiben als Elutionsmittel ein Gemisch aus Wasser und organischen Lösungsmitteln. Ein Verfahren zur Adsorption des Insulins an Carboxymethylcellulose ist in der US-PS 3.468.870 wiedergegeben. In der US-PS 3.878.186 wird die Reinigung von Alkalimetall-oder Ammonium-Insulin über Gelfiltration genannt, während in der DE-PS 3147842 hierfür Kieselgel verwendet wird. H.Zahn et al. säuberten den Benzylesterder Schafinsulin-A-Kette über Gelfiltration an Sephadex LH-20 (z. Naturf. 24b [1969] 1127). In der DE-PS 3.229.674 wird der bei der Humaninsulinherstellung anfallende Humaninsulinmethylester über Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt.Concentration and purification of insulin and its derivatives remains an important industry problem in the manufacture of pharmaceuticals and in the chemical conversion of insulins. Insulin is often adsorbed and then eluted by industry standard methods. This method is common for the purification of peptides, which includes insulin. In DD-AP 184298 it is proposed to purify the insulin molecule on crosslinked dextran cation exchangers and to elute with inorganic salt solutions. DE-OS 1966573 and GB-PS 1,285,024 describe as eluent a mixture of water and organic solvents. A method of adsorbing the insulin to carboxymethylcellulose is shown in U.S. Patent 3,468,870. US Patent 3,878,186 mentions the purification of alkali metal or ammonium insulin by gel filtration, while DE-PS 3147842 uses silica gel for this purpose. H.Zahn et al. purified the benzyl ester of sheep insulin A chain by gel filtration on Sephadex LH-20 (eg, Naturf 24b [1969] 1127). In German Pat. No. 3,229,674, the human insulin methyl ester obtained in human insulin preparation is purified by reverse phase high pressure liquid chromatography.

Die genannten Methoden haben den Nachteil, daß die gewonnenen Eluate mit dem jeweiligen Elutionsmittel verunreinigt sind und die Lösungen zum Teil in stark verdünnter Form vorliegen, wodurch eine anschließende thermische Konzentrierung erforderlich wird.The methods mentioned have the disadvantage that the eluates obtained are contaminated with the respective eluent and the solutions are partly in highly diluted form, whereby a subsequent thermal concentration is required.

Allgemein wird bei der Konzentrierung des Insulins die thermische Einengung unter Vakuum angewendet. Verschiedene Veröffentlichungen (Span. PS 453658, Myasn. Ind. SSSR 1979 [3] 36, DE-PS 2.460.334) beschäftigen sich mit diesem Problem. Die thermischen Konzentrierungsverfahren sind jedoch mit dem Nachteil eines hohen Dampf- bzw. Elektroenergiebedarfes und Kühlwasserverbrauches behaftet. Zudem erleidet Insulin bei Temperaturen oberhalb von 40⁰C eine irreversible Schädigung, die infolge örtlicher Überhitzungen bzw. bei Schwankungen des Vakuums oft in der Praxis nicht ganz vermieden werden können. Außerdem werden die in der Insulinlösung enthaltenen niedermolekularen Verunreinigungen und Salze mit angereichert. Eine andere Möglichkeit der Reinigung von Insulin und Insulinderivaten besteht darin, das Produkt auszufällen und den so gewonnenen Feststoff mit gängigen Methoden wie Filtration oder Zentrifugation abzutrennen. Die Ausfällung des Insulins durch Zugabe von Metallionen beschreibt die DE-AS 1492044. Ebenso verweist die DE-AS 2.018.588 auf die Möglichkeit der Ausfällung von Insulin aus wäßrigen Lösungen durch Zugabe von Kationen und Einstellung eines alkalischen pH-Wertes. Auch in der DE-PS 3.101.382 wird eine Insulinfällung beschrieben. Die DE-PS 3.104.949 schützt ein Verfahren, bei dem die Ausfällung von Humaninsulinestern durch Zugabe von Azeton erfolgt.Generally, when concentrating the insulin, the thermal constriction is applied under vacuum. Various publications (Span PS 453658, Myasn Indis SSSR 1979 [3] 36, DE-PS 2,460,334) deal with this problem. However, the thermal concentration methods are subject to the disadvantage of high steam or electrical energy demand and cooling water consumption. In addition, insulin suffers irreversible damage at temperatures above 40 ⁰ C, which can often not be completely avoided in practice due to local overheating or fluctuations in the vacuum. In addition, the low molecular weight impurities and salts contained in the insulin solution are also enriched. Another way of purifying insulin and insulin derivatives is to precipitate the product and separate the solid thus obtained by conventional methods such as filtration or centrifugation. The precipitation of insulin by the addition of metal ions is described in DE-AS 1492044. Likewise, DE-AS 2,018,588 refers to the possibility of precipitating insulin from aqueous solutions by adding cations and adjusting an alkaline pH. Also in DE-PS 3,101,382 an insulin precipitation is described. DE-PS 3,104,949 protects a process in which the precipitation of human insulin esters is effected by the addition of acetone.

Diese genannten Methoden sind mit dem Nachteil behaftet, daß das ausgefällte Insulin bzw. sein Derivat mit dem zugegebenen Fällungsmittel verunreinigt wird und daß die Wiederauflösung des Insulins zum Zweck einer Weiterverarbeitung bzw. Weiterreinigung in der Praxis oftmals problematisch ist. Der Einsatz von Ultrafiltrationsmembranen zur Konzentrierung und Reinigung von hochmolekularen Verbindungen ist schon längere Zeit bekannt. Insulin, das mit seinem vergleichsweise geringen nominellen Molekulargewicht zu der Gruppe der Peptide zählt, würde jedoch bei einem technischen Einsatz der Ultrafiltrationskonzentrierung nur relativ schlechte Ausbeuten oder bei Verwendung entsprechend engporiger Membranen (Umkehrosmosemembranen) bei den für die Ultrafiltration üblichen Drücken zu geringe Durchsatzleistungen liefern. In der DE-PS 2701092 der Fa. Laboratorios Leo S.A. (Madrid) ist die Herstellung von Monokomponenteninsulin unter Verwendung einer Umkehrosmoseeinrichtung, entsprechend dem US-Pat.3.623.610, beschrieben. Hierbei werden zunächst mittels Membranen die großmolekularen Verunreinigungen abgetrennt, während das Insulin hindurchwandert. Anschließend erfolgt die Konzentrierung des Monokomponenteninsulins über GR8-P oder 930-Membranen in einer Ethanol-Wasser-Lösung und das anschließende Nachwaschen des Konzentrates mit 62%igem Ethanol. Vor der Membrankonzentrierung wurde der pH-Wert der Lösung auf pH 2 bis 3 eingestellt. Bei diesem pH-Wert liegt das Insulin alsmonomeres Peptid gelöst vor, wodurch eine sehr engporige Membran erforderlich ist, die eine vergleichsweise geringe Permeatdurchsatzleistung aufweist.These methods mentioned are associated with the disadvantage that the precipitated insulin or its derivative is contaminated with the added precipitant and that the re-dissolution of insulin for the purpose of further processing or further purification in practice is often problematic. The use of ultrafiltration membranes for the concentration and purification of high molecular weight compounds has been known for some time. Insulin, which belongs to the group of peptides with its comparatively low nominal molecular weight, would, however, only give relatively poor yields in the case of technical use of the ultrafiltration concentration or too low throughputs at the pressures customary for ultrafiltration if correspondingly tight-pored membranes (reverse osmosis membranes) are used. In DE-PS 2701092 Fa. Laboratorios Leo S.A. (Madrid) describes the preparation of monocomponent insulin using a reverse osmosis device, corresponding to US Pat. No. 6,623,610. Here, the large molecular weight impurities are first separated by means of membranes, while the insulin moves through. Subsequently, the concentration of Monokomponenteninsulins on GR8-P or 930 membranes in an ethanol-water solution and the subsequent washing of the concentrate with 62% ethanol. Before the membrane concentration, the pH of the solution was adjusted to pH 2 to 3. At this pH, the insulin is dissolved as a monomeric peptide, requiring a very narrow pore membrane that has a comparatively low permeate throughput.

Object of the invention

Es ist das Ziel der Erfindung, die Reinigung und Konzentrierung von Insulin und seinen Derivaten in einem Membranapparat durchzuführen, ohne daß dazu die Zugabe von Fällungschemikalien, Elutionsmitteln und/oder eine thermische Konzentrierung erforderlich sind.It is the object of the invention to carry out the purification and concentration of insulin and its derivatives in a membrane apparatus without the necessity of adding precipitation chemicals, eluents and / or thermal concentration.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Verfahren sowohl zur Konzentrierung als auch zur Reinigung von Insulin und seinen Derivaten zu entwickein. Essoll möglichst frei von den bei anderen Konzentrierungs-und Reinigungsverfahren genannten Mängeln (wie z. B. Verunreinigung des Produktes mit Elutions- bzw. Fällungsmitteln, zu hohe Verdünnung der Lösung, mögliche Produktschädigung durch thermische Denaturierung, notwendiges Wiederauflösen von ausgeflocktem Insulin für die Weiterverarbeitung, hoher Wärme-und Kühlwasserbedarf usw.) sein. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß das Insulin bzw. Insulinderivat mit Hilfe semipermeabler Membranen durch Anwendung der Ultrafiltration und/oder der Diafiltration mit Hilfe eines Druckgradienten von 0,5 bis 10 bar angereichert wird, ohne daß hierbei eine Phasenumwandlung erfolgt.The invention has for its object to develop a suitable method both for the concentration and for the purification of insulin and its derivatives. Essoll as free as possible from the deficiencies mentioned in other concentration and purification processes (such as contamination of the product with elution or precipitation agents, excessive dilution of the solution, possible product damage by thermal denaturation, necessary re-dissolution of flocculated insulin for further processing, high heat and cooling water requirements, etc.). The object has been achieved in that the insulin or insulin derivative is enriched by means of semipermeable membranes by using ultrafiltration and / or diafiltration with the aid of a pressure gradient of 0.5 to 10 bar, without a phase transformation taking place here.

Bei der Ultrafiltration wird die Lösung eines Makromoleküles mittels einer Ultrafiltrationsmembran sowie durch Druckeinwirkung aufkonzentriert, wobei der Durchmesser der Membranporen die Trenngrenze bestimmt. Die Membrandurchsatzleistung ist annähernd proportional der angelegten Druckdifferenz. Demgegenüber ist bei der Trennung niedermolekularer Stoffe mit Reversosmosemembranen eine Kraft aufzuwenden, die größer als der osmotische Druck der Lösung ist und diesem entgegengesetzt wirkt.In ultrafiltration, the solution of a macromolecule is concentrated by means of an ultrafiltration membrane and by pressure, the diameter of the membrane pores determining the separation limit. The membrane throughput is approximately proportional to the applied pressure difference. In contrast, in the separation of low molecular weight substances with Reversosmosemembranen spend a force that is greater than the osmotic pressure of the solution and this counteracts.

Das durchschnittliche nominelle Molekulargewicht des Insulins und seiner Derivate liegt bei etwa 6000. Bedingt durch die relativ geringe Größe seines Moleküls würde es sich im technischen Maßstab über Ultrafiltrationsmembranen nur mit verhältnismäßig hohen Verlusten abtrennen lassen. Daher ist für den effektiven Einsatz der Ultrafiltrationsmembranen eine Vorbehandlung der Lösung erforderlich. Durch diese Vorbehandlung wird das Insulinmolekül durch Agglomeration mit anderen Insulinmolekülen derart verändert, daß auf der Basis der so gewonnenen größeren löslichen Molekülassoziate effektiver eine Konzentrierung und Reinigung der Lösung durch Ultrafiltration durchgeführt werden kann. Ein Ausfällen des Insulins ist dabei unbedingt zu vermeiden, da es sonst zu einer Verstopfung der Trennmejnbran kommt. Aus diesem Grunde wurden für die Konzentrierung und Reinigung solche Lösungsbedingungen gewählt, bei denen das Insulin bzw. seine Derivate zwar agglomeriert, aber noch völlig gelöst vorliegen.The average nominal molecular weight of the insulin and its derivatives is about 6000. Due to the relatively small size of its molecule, it would be on technical scale ultrafiltration membranes with relatively high losses can be separated. Therefore, a pretreatment of the solution is required for the effective use of the ultrafiltration membranes. By this pretreatment, the insulin molecule is changed by agglomeration with other insulin molecules such that on the basis of the thus obtained larger soluble molecular associates more effective concentration and purification of the solution by ultrafiltration can be performed. A failure of the insulin is to be avoided at all costs, because otherwise it comes to a blockage of Trennmejnbran. For this reason, such solution conditions were chosen for the concentration and purification, in which the insulin or its derivatives, although agglomerated, but are still completely dissolved.

Hierzu wird in wäßriger Lösung der pH-Wert auf den Bereich 6,8 bis 8,5 eingestellt, wobei bei den neutralen pH-Werten geringere Insulinverluste aber niedrigere Permeatdurchsatzleistungen beobachtet werden konnten. Als optimal für die Ultrafiltration erwies sich der pH-Bereich 7,0 bis 7,5. Hier konnten bei vertretbaren Permeatdurchsatzleistungen von etwa 20 bis 40 l/m²h Ausbeuten von etwa 98% erzielt werden.For this purpose, the pH is adjusted to the range from 6.8 to 8.5 in aqueous solution, with lower insulin losses but lower permeate throughputs being observed at the neutral pH values. The pH range proved to be optimal for the ultrafiltration 7.0 to 7.5. Here, at reasonable permeate throughput rates of about 20 to 40 l / m ² h yields of about 98% could be achieved.

Einen wesentlichen Einfluß auf die Ultrafiltrierbarkeit von Insulin- bzw. Insulinderivat-Lösungen hat die Zusammensetzung des Lösungsmittels. Bekanntlich gilt Insulin in neutralen bis schwach sauren wäßrigen Lösungen als schwer löslich und demzufolge als nicht ultrafiltrierbar. Andererseits ist bekannt, daß der Zusatz von organischen Lösungsmitteln bei Eiweißen zu einer Ausfällung infolge einer Löslichkeitsverringerung führt. In praktischen Versuchen zur Ultrafiltration von Insulinlösungen unter Zusatz von organischem Lösungsmittel (vorzugsweise Alkohol) konnte jedoch überraschenderweise festgestellt werden, daß gerade durch die Lösungsmittelzugabe die Löslichkeit der Insulinassoziate verbessert und der für die Ultrafiltration anwendbare pH-Bereich erweitert wird. Während in wäßrigen Lösungen das Insulin in dem pH-Bereich zwischen 4,3 und 6,8 als schwer löslich gilt (Chem. Ztg. 100 [1976] 3,111), konnte durch den Zusatz des organischen Lösungsmittels der für die Ultrafiltration nicht anwendbare pH-Bereich auf 6,0 bis 6,5 eingeengt werden. Dadurch wurde die Ultrafiltration auch im schwach sauren Medium ermöglicht. Je weiter man sich von dem einschränkenden pH-Bereich 6,0 bis 6,5 nach oben und unten entfernt, um so höher werden zwar die Permeatdurchsatzleistungen, aber auch gleichzeitig die Insulinverluste.The composition of the solvent has a significant influence on the ultrafiltrability of insulin or insulin derivative solutions. As is known, insulin is considered sparingly soluble in neutral to weakly acidic aqueous solutions and therefore not ultrafiltratable. On the other hand, it is known that the addition of organic solvents to proteins results in precipitation due to solubility reduction. In practical experiments for the ultrafiltration of insulin solutions with the addition of organic solvent (preferably alcohol), however, it has surprisingly been found that the solubility of the insulin associates is improved and the pH range applicable for ultrafiltration is widened, especially as a result of the addition of the solvent. While in aqueous solutions the insulin is considered to be sparingly soluble in the pH range between 4.3 and 6.8 (Chem. Ztg. 100 [1976] 3,111), the addition of the organic solvent did not allow the pH value to be used for ultrafiltration. Range be narrowed to 6.0 to 6.5. As a result, ultrafiltration was also possible in a weakly acidic medium. The further you move away from the limiting pH range 6.0 to 6.5 up and down, the higher the permeate throughputs, but also the insulin losses.

Als optimal für die Ultrafiltration von Insulinen in Gemischen mit organischen Lösungsmitteln und Wasser erwies sich der pH-Wert 7,2. Bei diesem pH-Wert liegen das Insulin bzw. dessen Derivate weitestgehend als Hexamer bzw. Quaternär gelöst vor, die gegenüber dem einfachen Monokomponenteninsulin ein völlig verändertes Abtrennverhalten während der Ultrafiltration aufweisen.The optimal pH for the ultrafiltration of insulins in mixtures with organic solvents and water was 7.2. At this pH, the insulin or its derivatives are largely dissolved as hexamer or quaternary, which have a completely different separation behavior compared to the simple Monokomponenteninsulin during ultrafiltration.

Wenn man während der Ultrafiltration die als Permeat abgehende Flüssigkeit durch sauberes Lösungsmittel ergänzt, so erfolgt ein Herauswaschen der niedermolekularen Verbindungen und damit eine Reinigung der Insulinlösungen. Bei einer solchen, als Diafiltration bezeichneten, Verfahrensweise kann die Zugabe des Lösungsmittels auch periodisch oder in geänderter Menge erfolgen. Besonders vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise ist, daß dabei sowohl gelöste Salze, niedermolekulare Verbindungen als auch Lösungsmittel gleichzeitig entfernt werden können.If, during the ultrafiltration, the liquid emerging as permeate is supplemented by a clean solvent, the low molecular weight compounds are washed out and thus a purification of the insulin solutions. In such a procedure, referred to as diafiltration, the addition of the solvent may also be carried out periodically or in a modified amount. Particularly advantageous in the procedure according to the invention is that both dissolved salts, low molecular weight compounds and solvents can be removed simultaneously.

Die in den vorangegangenen Absätzen genannten optimalen Bedingungen für die Ultrafiltration gelten auch für die Diafiltration, wobei die Diafiltration sowohl mit der Einsatzlösung als auch mit Konzentraten durchgeführt werden kann. Entscheidend für den Grad der Abtrennung und für den Insulinverlust ist die Membranselektivität. Die Membranselektivität ist eine Konstante, die die statistische Verteilung der Poren innerhalb der Membran ausdrückt. Der begrenzte Anteil größerer Poren in der Membran führt zu einem Schlupf höhermolekularer Stoffe durch die Membran hindurch, so daß auch bei Konzentrationsänderungen eine einigermaßen gleichbleibende Membranselektivität zu erwarten ist. Bei Versuchen zur Diafiltration mit Insulinlösungen unterschiedlicher Konzentration konne jedoch überraschenderweise festgestellt werden, daß sich die Membranselektivität in Abhängigkeit von der Insulinkonzentration ändert, so daß trotz einer höheren Einsatzkonzentration im Permeat ein niedrigerer Insulingehalt gemessen wurde. Eine solch starke Veränderung der Membranselektivität gegenüber dem Insulin war nicht vorauszusehen. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß — bedingt durch die bessere Abtrennbarkeit des Insulins bzw. der Insulinderivate bei höheren Konzentrationen — zweckmäßigerweise zunächst eine Aufkonzentrierung mittels Ultrafiltration und danach die Reinigung durch Diafiltration stattfinden sollte. Eine weitere Auf konzentrierung der diafiltrierten Lösung durch eine nochmalige nachfolgende Ultrafiltration ist möglich. Beide Prozesse, Ultrafiltration und Diafiltration, lassen sich beliebig kombinieren, wobei erfindungsgemäß auch getrennte Apparate eingesetzt werden können bzw. beide Stufen mit zeitlicher Unterbrechung bzw. auch einzeln durchgeführt werden können. Die Erfindung soll nachfolgend an einigen Beispielen näher erläutert werden:The optimal conditions for ultrafiltration mentioned in the previous paragraphs also apply to diafiltration, whereby diafiltration can be carried out both with the starting solution and with concentrates. Decisive for the degree of separation and insulin loss is the membrane selectivity. The membrane selectivity is a constant that expresses the statistical distribution of the pores within the membrane. The limited proportion of larger pores in the membrane leads to a slip of relatively high molecular weight substances through the membrane, so that even with changes in concentration a reasonably constant membrane selectivity is to be expected. In experiments on diafiltration with insulin solutions of different concentrations, however, it was surprisingly found that the membrane selectivity changes as a function of the insulin concentration, so that a lower insulin content was measured despite a higher use concentration in the permeate. Such a dramatic change in membrane selectivity to insulin was unpredictable. From the results obtained can be concluded that - due to the better separability of the insulin or the insulin derivatives at higher concentrations - expediently first a concentration by ultrafiltration and then the purification by diafiltration should take place. Another concentration of the diafiltered solution by a subsequent subsequent ultrafiltration is possible. Both processes, ultrafiltration and diafiltration, can be combined as desired, and according to the invention it is also possible to use separate apparatus or both stages can be carried out with a time interruption or even individually. The invention will be explained in more detail below with reference to some examples:

embodiments example 1

100ml einer 0,25%igen Schweine-Insulin-Lösung in einem Wasser/Isopropanol (50:50)-Gemisch wird mit 10%iger Salzsäure und Tris/HCI-Puffer auf pH 7,2 eingestellt und in einer Ultrafiltrationszelle aufkonzentriert. Als Trennmembran dient eine Celluloseacetatmembran UF40 (VEB Zellstoffwerk Wittenberge). Die Ultrafiltration erfolgt bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa unter Rühren mit einem Magnetrührer. Konzentriert wird bis zu einem Konzentrierungsgrad von 1:10. Im Anschluß an die Konzentrierung ist unter Konstanthaltung des Flüssigkeitsspiegels auf der Konzentratseite in der Ultrafiltrationszelle kontinuierlich die als Permeat die ZeIIe verlassende Flüssigkeitsmenge durch destilliertes Wasser zu ergänzen. Der Arbeitsdruck von 0,3MPa bleibt erhalten.100 ml of a 0.25% pig insulin solution in a water / isopropanol (50:50) mixture is adjusted to pH 7.2 with 10% hydrochloric acid and Tris / HCl buffer and concentrated in an ultrafiltration cell. The separating membrane used is a cellulose acetate membrane UF40 (VEB Pulp Mill Wittenberge). The ultrafiltration is carried out at a working pressure of ρ = 0.3 MPa while stirring with a magnetic stirrer. Concentration is up to a concentration of 1:10. Following concentration, while maintaining constant the liquid level on the concentrate side in the ultrafiltration cell, continuously add the quantity of liquid leaving the cell as permeate through distilled water. The working pressure of 0.3MPa is maintained.

Nachdem auf diese Weise etwa 40 bis 50 ml destilliertes Wasser dem Konzentrat zugesetzt wurde, ist eine weitere Aufkonzentrierung der Insulinlösung durch Ultrafiltration bis auf V3 des ursprünglichen Konzentratvolumens möglich.After adding about 40 to 50 ml of distilled water to the concentrate in this manner, further concentration of the insulin solution is possible by ultrafiltration down to V3 of the original concentrate volume.

Verluste im Permeat bezogen auf den Anfangsinsulingehalt etwa 3%.Losses in the permeate relative to the initial insulin content about 3%.

Example 2

400 ml einer 0,25%igen Rinder-Insulin-Lösung in einem Isopropanol/Wasser-Gemisch werden unter Zusatz von 15 mg ZnCI₂ auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und in einer Amicon-Rührzelle über eine Celluloseacetatmembran auf 50 ml bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa aufkonzentriert. Nach Unterbrechung des Prozesses wird die konzentrierte Insulinlösung auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und bei einem Arbeitsdruck von ρ = 0,3MPa über Diafiltration gereinigt. Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes.400 ml of a 0.25% bovine insulin solution in an isopropanol / water mixture are adjusted to pH 7.5 with the addition of 15 mg ZnCl ₂ and at 50 ml in an Amicon stirred cell via a cellulose acetate membrane concentrated to a working pressure of ρ = 0.3 MPa. After interrupting the process, the concentrated insulin solution is adjusted to pH 7.2 and purified by diafiltration at a working pressure of ρ = 0.3 MPa. Yield: 95% of the initial insulin content.

Example 3

400 ml einer Schweine-Insulin-Lösung in einem Azeton/Wasser-Gemisch werden mit HCI/Tris-Pufferauf den pH-Wert 7,2 eingestellt und in einem Ultrafiltrationsrührmodul bei einem Druck von 0,2MPa mit 21 Wasser diafiltriert. Anschließend erfolgt die Aufkonzentrierung der Lösung über Ultrafiltration400 ml of a porcine insulin solution in an acetone / water mixture are adjusted to pH 7.2 with HCl / Tris buffer and diafiltered in an ultrafiltration agitation module at a pressure of 0.2 MPa with 21% water. Subsequently, the concentration of the solution is carried out by ultrafiltration

Ausbeute: 85% des Anfangsinsulingehaltes. Yield: 85% of the initial insulin content.

Example 4

100 ml einer 0,25%igen Lösung von Insulin und einem Isopropanol/Wasser-Gemisch werden bei einem pH-Wert von 5,0 sowie bei einem Arbeitsdruck von 0,5MPa überCelluloseacetatmembranen ultrafiltriert. Die auf einen Insulingehalt von 25g/l aufkonzentrierte Lösung wird anschließend mit 50 ml Tris/HCI-Puffer pH 7,2 diafiltriert, um daslsopropanolzu entfernen. Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes.100 ml of a 0.25% solution of insulin and an isopropanol / water mixture are ultrafiltered at pH 5.0 and at a working pressure of 0.5 MPa over cellulose acetate membranes. The solution concentrated to an insulin content of 25 g / l is then diafiltered with 50 ml Tris / HCl buffer pH 7.2 to remove the isopropanol. Yield: 90% of the initial insulin content.

Example 5

1001 einer Lösung von Schweine-Insulin in einem salzhaltigen Ethanol/Wasser-Gemisch mit einem Insulingehalt von 3g/l Lösung werden bei einem pH-Wert von 7,2 mit einem Plattenfiltrationsmodul bei einem Druck von 0,3MPa auf Viodes ursprünglichen Lösungsvolumens aufkonzentriert. Anschließend erfolgt zur Entfernung störender Salzrestmengen die Diafiltration mit 501 eines Ethanol/Wasser-Gemisches derart, daß kontinuierlich der pH-Wert der Lösung gemessen und auf pH 7,2 eingestellt wird100 L of a solution of porcine insulin in a saline ethanol / water mixture with an insulin content of 3 g / L of solution is concentrated at pH 7.2 with a plate filtration module at a pressure of 0.3 MPa to V of the original solution volume. Subsequently, to remove interfering amounts of salt, the diafiltration with 501 of an ethanol / water mixture is carried out in such a way that the pH of the solution is continuously measured and adjusted to pH 7.2

Ausbeute: 98% des Anfangsinsulingehaltes. Yield: 98% of the initial insulin content.

Example 6

100ml eines humaninsulinhaltigen Chromatographiesäulenablaufes mit einem Insulingehalt von 2,5g/l werden zunächst bei einem pH-Wert von 7,2 ultrafiltriert (Konzentrierungsgrad 1:10) und anschließend ohne Unterbrechung mit 40 ml destilliertem Wasser diafiltriert100 ml of a human insulin chromatography column effluent with an insulin content of 2.5 g / l are first ultrafiltered at a pH of 7.2 (concentration 1:10) and then diafiltered without interruption with 40 ml of distilled water

Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes. Yield: 95% of the initial insulin content.

Example 7

11 einer salzhaltigen Lösung von 2,5 g Des-Ala-Schweine-Insulin in destilliertem Wasser wird nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,2 bei einem Druck von 0,4MPa über Ultrafiltration auf einen Insulingehalt von 25g/l aufkonzentriert. Anschließend wird der Prozeß unterbrochen, dem Konzentrat 21 Wasser zugesetzt und nochmals nach Korrektur des pH-Wertes die Ultrafiltration bis zur Erreichung der gewünschten Endkonzentration von 50g/l durchgeführt11 of a saline solution of 2.5 g Des-Ala porcine insulin in distilled water is concentrated after adjusting the pH to 7.2 at a pressure of 0.4 MPa via ultrafiltration to an insulin content of 25 g / l. The process is then discontinued, water is added to the concentrate 21 and, after correcting the pH, the ultrafiltration is again carried out until the desired final concentration of 50 g / l has been reached

Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes. Yield: 90% of the initial insulin content.

Example 8

0,25g Humaninsulin-(Threonin-B30-)monoethylester werden in 100ml eines Gemisches aus Isopropanol/Wasser (50:50) sowie 0,05g EDTA und 0,03 M Tris-Puffer gelöst und bei einem pH-Wert von 7,2 in einem Ultrafiltrationsrührmodul bei einem Arbeitsdruck von 0,3 MPa über eine CellulosacetatmembranUF40 auf/10 des ursprünglichen Lösungsvolumens aufkonzentriert. Anschließend wird das Konzentrat mit 50 ml destilliertem Wasser zur Entfernung von gelösten Salzen und des Isopropanols diafiltriert. Im Anschluß an die Diafiltration ist eine weitere Aufkonzentrierung der Lösung mittels Ultrafiltration auf V3 des Ausgangsvolumens möglich0.25 g of human insulin (threonine B30) monoethyl ester are dissolved in 100 ml of a mixture of isopropanol / water (50:50) and 0.05 g EDTA and 0.03 M Tris buffer and at a pH of 7.2 in an ultrafiltration agitation module at a working pressure of 0.3 MPa over a cellulose acetate membrane UF40 to / 10 of the original solution volume. Subsequently, the concentrate is diafiltered with 50 ml of distilled water to remove dissolved salts and isopropanol. Subsequent to the diafiltration, further concentration of the solution by ultrafiltration to V3 of the starting volume is possible

Ausbeute: 96% des Anfangsinsulingehaltes. Yield: 96% of the initial insulin content.

Example 9

2Ol eines insulinesterhaltigen Chromatographie-Säulenablaufes werden bei einem pH-Wert von 7,5 über Celluloseacetatmembranen in einem Plattenmodul bei einem Druck von 0,4MPa ultrafiltriert. Im Anschluß daran wird bei einer kontinuierlichen Statierung des pH-Wertes auf 7,3 die Diafiltration unter Hinzufügen von 1201 Wasser durchgeführt. Ausbeute: 95% des Anfangsinsulingehaltes.2Ol of an insulin ester-containing chromatography column effluent are ultrafiltered at pH 7.5 over cellulose acetate membranes in a plate module at a pressure of 0.4 MPa. Following this, the diafiltration is carried out with the addition of 120 liters of water while the pH is continuously fixed at 7.3. Yield: 95% of the initial insulin content.

Example 10

21 einer insulinbutylhaltigen Lösung mit einem Gehalt von 0,2% Insulinbutylester in einem Aceton/Wasser-Gemisch werden nach Zugabe von 35mg ZnCI₂ auf den pH-Wert 7,3 eingestellt und zunächst über Celluloseacetatmembranen auf V10 des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert. Im Anschluß daran wird die Konzentrierung unterbrochen, dem Konzentrat 1,81 destilliertes Wasser zugegeben, der pH-Wert ebenfalls wieder auf 7,3 korrigiert und nochmals ultrafiltriert. Ausbeute: 90% des Anfangsinsulingehaltes.21 of an insulin-butyl-containing solution containing 0.2% insulin butyl ester in an acetone / water mixture are adjusted to pH 7.3 after addition of 35 mg ZnCl ₂ and initially concentrated on cellulose acetate membranes to V 10 of the original volume. Subsequently, the concentration is interrupted, the concentrate 1.81 distilled water was added, the pH is also corrected again to 7.3 and again ultrafiltered. Yield: 90% of the initial insulin content.

Claims

1. A method for concentrating and purifying insulin and its derivatives, characterized in that agglomerated insulin remaining in solution or agglomerated insulin derivatives remaining in solution are subjected to ultrafiltration and / or diafiltration at a pressure gradient of 0.5 to 10 bar.

2. The method according to claim 1, characterized in that insulin derivatives whose carboxyl-protected or amino-protected derivatives and their salts and saline solutions, as well as insulins with substituted and missing partial sequences are to be understood.

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the acting as a driving force pressure gradient is preferably 3 to 5 bar.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the concentration and purification with the methods of ultrafiltration and / or diafiltration is carried out separately and in combination of both processes, preferably in the order ultrafiltration diafiltration, both processes both continuously can be performed sequentially and with intermittent interruption and / or in separate apparatuses.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the separation within the pH range 4.0 to 6.0 and 6.5 to 8.5, preferably 7.0 to 7.5, takes place and the insulin solved present.

6. Process according to claims 1 to 5, characterized in that to improve the ultrafiltrability of the aqueous insulin-containing solution, organic solvents, preferably alcohols, can be added up to a final concentration of 80%.