JP3198304B2 - 弱毒鶏貧血ウイルス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、鶏貧血ウイルス(c
hicken anemia virus：CAV)の病原性関連遺伝子部位を
改変することにより作出した弱毒鶏貧血ウイルス、その
作出方法、および該病原性関連遺伝子部位を含む塩基配
列を病原性マーカーとして使用する鶏貧血ウイルスの病
原性判定方法、ならびに弱毒クローンのＤＮＡまたは弱
毒鶏貧血ウイルスを有効成分として含有するワクチンに
関する。

【０００２】

【従来の技術】鶏貧血ウイルスは鶏の若齢雛に対しての
み貧血、死亡、発育不良等の病原性を示すＤＮＡウイル
ス(ゲノムＤＮＡの完全長は約2.3kbである)であり、197
9年に湯浅ら（Yuasa ら、1979 Avian Dis. 23 366-38
5）によって世界で初めてその存在が確認され、その後
現在までにアメリカ、ヨーロッパ、オーストラリアおよ
びアジアの各国においてもその存在が確認されている。

【０００３】従来、鶏貧血ウイルスによる疾病を予防す
る方法としては、種鶏に生ワクチンを接種する方法がと
られてきた。ところが、これらの生ワクチンは若齢雛に
対して十分に弱毒性であるとはいえない。このため、ワ
クチン接種により却って若齢雛が鶏貧血ウイルスに感染
して発病し、養鶏場の汚染を招く場合がある。そこで、
若齢雛に対しても病原性をもたない弱毒鶏貧血ウイルス
株が望まれている。

【０００４】しかしながら、鶏貧血ウイルスは in vitr
o では浮遊培養細胞でのみ増殖させることが可能であ
り、プラック法等を用いての均一な遺伝子構造を有する
ウイルス液を作製することが困難であるため、現在まで
に明らかな弱毒ウイルス株は分離されていない。また、
培養細胞中で高継代（173代）することにより弱毒化し
たとの報告はある（Toodら、1995 Avian Pathol. 24 17
1-187）が、弱毒化に関連した遺伝子部位は特定されて
いない（Toodら、1997 J. Virol. 71 8326-8367）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、鶏貧血ウイ
ルスの病原性に関連する遺伝子部位を特定することによ
りその遺伝子構造を有する弱毒鶏貧血ウイルスを作出
し、さらにこの病原性関連遺伝子部位の構造を利用して
鶏貧血ウイルスの病原性を判定する技術を提供すること
を目的とする。また本発明は、本発明の弱毒鶏貧血ウイ
ルスを有効成分として含有するワクチンを提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、鶏貧血ウイル
スの完全長ゲノムＤＮＡを挿入した感染性クローンを作
製し、感染性クローンの遺伝子構造と該クローン由来ウ
イルスの病原性とを比較することにより、病原性関連遺
伝子を特定するに至った。本発明はこの知見に基づいて
完成されたものである。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のＤＮＡを有する弱毒鶏貧血ウイルスである。 （ａ） 配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において１もし
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、配列番号２
のアミノ酸番号394に相当するアミノ酸がヒスチジンで
あるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。

【０００８】また、本発明は、以下の工程（ａ）〜
（ｃ）： （ａ） 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡをクローニ
ングする工程、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡ上の領域
を、グルタミンをコードする配列から、ヒスチジンをコ
ードする配列に改変する工程、（ｃ） 改変したゲノム
ＤＮＡを細胞に導入する工程、よりなる、弱毒鶏貧血ウ
イルスの作出方法である。

【０００９】さらに本発明は、以下の工程（ａ）〜
（ｃ）： （ａ） 判定対象とする鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡ
をクローニングする工程、（ｂ） 配列番号２のアミノ
酸番号394に相当するアミノ酸をコードするゲノムＤＮ
Ａ上の領域の塩基配列を決定する工程、（ｃ） 決定し
た塩基配列から、判定対象とするウイルスが弱毒性か強
毒性かを判定する工程、よりなる、鶏貧血ウイルスの病
原性判定方法である。

【００１０】また、本発明は、鶏貧血ウイルスの病原性
関連遺伝子部位にハイブリダイズするプライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応(以下、「ＰＣＲ」という)によ
って増幅されるＤＮＡ断片の有無により、判定対象とす
るウイルスが弱毒性か強毒性かを判定する、鶏貧血ウイ
ルスの病原性判定方法である。

【００１１】さらに本発明は、弱毒クローンのＤＮＡま
たは弱毒鶏貧血ウイルスを有効成分として含有するワク
チンである。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。
本明細書中の、「アミノ酸の欠失、置換もしくは付加」
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
るタンパク質は、Molecular Cloning, A laboratory ma
nual,第二版〔Sambrook,Fritsch,Maniatis編、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1988〕、Current Protoc
ols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-
1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Pr
oc. Natl. Acad.Sci., USA, 79,6409(1982)、Gene, 34,
315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (198
5)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記
載の方法に準じて調製することができる。

【００１３】本発明の弱毒鶏貧血ウイルスは、天然に存
在するものであっても、遺伝子組換え技術等により人為
的に弱毒化したものであってもよい。

【００１４】本発明の弱毒鶏貧血ウイルスは、例えば、
以下の工程（ａ）〜（ｃ）： （ａ） 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡをクローニ
ングする工程、（ｂ） 配列番号２のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードするゲノムＤＮＡ上の領域
を、グルタミンをコードする配列から、ヒスチジンをコ
ードする配列に改変する工程、（ｃ） 改変したゲノム
ＤＮＡを細胞に導入する工程、を経て作出することがで
きる。

【００１５】以下に各行程を説明する。工程（ａ）：鶏貧血ウイルスゲノムＤＮＡのクローニン
グ 鶏貧血ウイルス感染MSB1細胞から公知の方法（Hirtら.,
J. Mol. Biol., 36,365-369, 1967）によりウイルスゲ
ノムＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを、公知の方法、例え
ば、ユニークな制限酵素で切断したＤＮＡ断片をクロー
ニングする方法、あるいは市販のキットを使用してベク
ターに組み込み、得られたクローニングベクターを宿主
細胞に導入することにより、鶏貧血ウイルスＤＮＡクロ
ーンを含むライブラリーを得る。

【００１６】上記において、ゲノムＤＮＡを切断する制
限酵素としては、限定するものではないが、例えばPst
I、XbaI、BamHI、SacI、SacII、EcoRI等をあげることが
できる。

【００１７】上記において、宿主細胞として、Escheric
hia属に属する微生物、例えば大腸菌(Escherichia col
i)をあげることができる。

【００１８】上記宿主細胞を形質転換するためのクロー
ニングベクターとしては、宿主細胞中で自律複製できる
ものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター
等いずれでも使用できる、具体的には、pUC(TOYOBO)、p
Bluescript(TOYOBO)、pGEM(Promega)、M13(TOYOBO)、pB
R322(TOYOBO)等をあげることができる。

【００１９】鶏貧血ウイルス遺伝子が挿入されたクロー
ンの選択は、例えば市販のＤＮＡ標識及び検出キット
（Boehringer Mannheim社）を用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法で検出できる。該方法によって検出さ
れたコロニーを培養し、プラスミドを精製した後、鶏貧
血ウイルスの完全長ゲノムＤＮＡである約2.3kbのフラ
グメントが挿入されていることを電気泳動で確認するこ
とにより、鶏貧血ウイルス遺伝子が挿入されたクローン
が得られる。

【００２０】工程（ｂ）：病原性関連遺伝子部位の改変 上記の工程（ａ）でクローニングされた強毒性ＤＮＡの
病原性関連遺伝子部位（配列番号２のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードする部位）を、部位特異的
変異誘発法（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
488-492, 1985）によりグルタミンをコードする配列か
らヒスチジンをコードする配列に改変することにより、
弱毒鶏貧血ウイルス生成用の感染性クローンを作製す
る。あるいは、上記工程（ａ）でクローニングされた強
毒性ＤＮＡの病原性関連遺伝子部位を含むＤＮＡ断片
を、例えば、XbaI及びNcoIの制限酵素で切り出し、弱毒
性クローンの相当するＤＮＡ断片と置換することによ
り、弱毒鶏貧血ウイルス生成用の感染性クローンを作製
することもできる。

【００２１】工程（ｃ）：ゲノムＤＮＡの細胞への導入 上記で改変したゲノムＤＮＡをクローニングに用いた制
限酵素で切断し、自己連結させることにより環状ＤＮＡ
を作製する。作製した環状ＤＮＡを、市販のＤＮＡの細
胞導入キット（例えばAmersham Pharmacia Biotech社,
CellPhect Transfection Kit）を用いてMSB1細胞に導入
することにより、弱毒鶏貧血ウイルスを作出する。

【００２２】また、上記のようにして改変した病原性関
連遺伝子部位を利用して、鶏貧血ウイルスの病原性を判
定することができる。鶏貧血ウイルスの病原性の判定
は、例えば、以下の工程（ａ）〜（ｃ）： （ａ） 判定対象とする鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡ
をクローニングする工程、（ｂ） 配列番号２のアミノ
酸番号394に相当するアミノ酸をコードするゲノムＤＮ
Ａ上の領域の塩基配列を決定する工程、（ｃ） 決定し
た塩基配列から、判定対象とするウイルスが弱毒性か強
毒性かを判定する工程、により実施することができる。

【００２３】以下に各工程を説明する。工程（ａ）：鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡのクローニ
ング 上記工程（ａ）と同様にして、病原性が未知である鶏貧
血ウイルスのゲノムＤＮＡをクローニングする。

【００２４】工程（ｂ）：鶏貧血ウイルスの病原性関連
遺伝子部位の塩基配列の決定 工程（ａ）で得られた鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡク
ローンの病原性関連遺伝子部位について、公知の方法、
例えばSanger法により、合成プライマー（5'-GACCATCAC
CGACAGCTACATG-3'：配列番号３）を用いて塩基配列を決
定する。

【００２５】工程（ｃ）：鶏貧血ウイルスの病原性の判
定 工程（ｂ）で決定した配列がヒスチジンをコードしてい
れば、対象とした鶏貧血ウイルスは弱毒ウイルスである
と判定され、前記配列がグルタミンをコードしていれば
強毒ウイルスであると判定される。

【００２６】また、鶏貧血ウイルスの病原性関連遺伝子
部位にハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲに
よって増幅されるＤＮＡ断片の有無を調べることによ
り、鶏貧血ウイルスの病原性を判定することもできる。

【００２７】鶏貧血ウイルスの病原性関連遺伝子部位を
含むＤＮＡ断片を増幅することのできるプライマーとし
ては、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列
の一部と対応し、かつ配列番号２のアミノ酸番号394に
相当するアミノ酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断
片を増幅することのできるオリゴヌクレオチドであれば
よく、制限するものではないが、アンチセンスプライマ
ーとしては、例えば、5'-TGTAGCTGTGCCGAACTTGTAG- 3'
(配列番号４)を挙げることができる。

【００２８】ＰＣＲの反応条件は、通常の反応と同様の
もので良いが、例えば、９４℃で３０秒間、５５℃で３
０秒間、７２℃で３０秒間からなる反応工程を１サイク
ルとして１５サイクル行った後、７２℃で７分間反応さ
せる条件をあげることができる。

【００２９】また、本発明の弱毒クローンのＤＮＡまた
は弱毒鶏貧血ウイルスは、鶏貧血ウイルス感染症に対す
るワクチンとして用いることができる。本発明の弱毒ク
ローンのＤＮＡを使用する場合には、鶏１羽あたり、例
えば約２００ ngの該ＤＮＡを直接筋肉内に注射するこ
とにより接種する。本発明の弱毒鶏貧血ウイルスを使用
する場合には、鶏１羽あたり、例えば、10^3.0 〜10^6.0
TCID₅₀の該ウイルスを筋肉内に注射することにより接種
する。鶏貧血ウイルスの完全長ゲノムＤＮＡをタンデム
に連結したクローンを細胞にトランスフェクトして感染
性ウイルスを回収する技術は公知である(Todd,Dら、Arc
h.Virol.141,1523-1534,1996)。しかし、クローンＤＮ
Ａを直接鶏に接種した場合にも感染性ウイルスができ、
鶏がウイルスに感染することは報告されていない。

【００３０】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。 〔実施例１〕鶏貧血ウイルスの病原性に関連する遺伝子
部位の改変 鶏貧血ウイルスゲノムＤＮＡのクローニング 公知の方法（Yuasa., Nat. Inst.Anim. Health Q., 23,
13-20, 1983）用いて、鶏貧血ウイルス野外分離株(AH9
410)（高木ら、1996、鶏病研報、32 90-96）をMSB1細胞
に感染させて増殖させた。感染MSB1細胞から、鶏貧血ウ
イルスゲノムＤＮＡを制限酵素PstIで切断して線状化す
る。 線状化したＤＮＡを、Ligation Pack（ニッポン
ジーン）を使用してクローニングベクター（pBluescrip
t）に連結した後、大腸菌（DH5α）に導入することによ
り、鶏貧血ウイルスＤＮＡクローンを含むライブラリー
を得た。得られたライブラリーから、Dig−Labeling an
d Detection Kit(Boehringer Mannheim社)を使用してコ
ロニーハイブリダイゼーション法により、鶏貧血ウイル
スＤＮＡが挿入されたクローンを選択した。

【００３１】感染性クローン由来ウイルスの病原性試
験 挿入クローンＤＮＡを制限酵素PstIで切断し、ライゲー
ションして自己連結させることにより、環状ＤＮＡを作
製した。さらに、該環状ＤＮＡを市販の細胞導入キット
（Amersham Pharmacia Biotech社, CellPhect Transfec
tion Kit）を用いて再びMSB1細胞に導入することによ
り、感染性クローン由来ウイルスを作出した。得られた
６株の感染性クローン由来ウイルス（#140、#363、#36
4、#368、#369、#370）各10^6.2TCID₅₀／雛を1日齢の改
変病原体不在(SPF)鶏雛に筋肉内注射して接種し、その
後21日間にわたり、赤血球容積率(％)および死亡率(％)
(死亡数(羽)／試験数(羽))を測定して病原性を判定した
ところ、3株（#364、#368、#370）が強毒で、3株（#14
0、#363、#369）が弱毒であった。結果を下記表１に示
す。

【００３２】

【表１】

【００３３】感染性クローン全塩基配列の遺伝子構造
解析による、鶏貧血ウイルスの病原性に関連する遺伝子
部位の推定 ６株の感染性クローンＤＮＡ全領域について、ABI社のD
ye terminator CycleSequencing Kit を用いたSanger法
により塩基配列を決定し、相互に比較したところ、VP1
タンパク質コード領域の３個所のみにおいて変異が検出
された(各塩基配列がコードするアミノ酸配列を併せて
図１に示す)。それらの変異部位を含むコドンがコード
する３個のアミノ酸(VP1−141、VP1−394、 VP1−444：
表１中に併せて示す)のうち、VP1タンパク質の394番目
のアミノ酸変異(VP1−394)が病原性の型に一致してお
り、このアミノ酸が病原性に関連していることが推定さ
れた。

【００３４】病原性関連遺伝子部位の改変 次に、VP1タンパク質の394番目のアミノ酸変異が病原性
に関連しているかどうかを証明する目的で、この部位の
アミノ酸をコードする塩基のみが異なる以外は同一の塩
基配列を有する２組のクローンを作製し、その病原性を
比較した。 （ｉ） VP1タンパク質の394番目のアミノ酸のみが異な
る２組のクローンの作製 弱毒性(#140)または強毒性(#364)であることが判明して
いる感染性クローンのVP1タンパク質コード遺伝子中、1
330番目の塩基を部位特異的突然変異誘発法によりシト
シンからグアニン、グアニンからシトシンにそれぞれ変
異させ、これによりVP1タンパク質の394番目のアミノ酸
をヒスチジン(H)からグルタミン(Q)またはグルタミンか
らヒスチジンに変異させた感染性クローン（#531および
#545）を作製した。Sanger法を用いてこの２つのクロー
ンの全塩基配列を決定したところ、#140および#364クロ
ーンのゲノムは2,298塩基長であった(データは示さ
ず)。また、#531および#545は設計通りにVP1タンパク質
コード遺伝子1330番目の塩基シトシンがグアニン、およ
びグアニンがシトシンにそれぞれ変異したことが確認さ
れ、VP1タンパク質の394番目のアミノ酸がヒスチジンか
らグルタミンまたはグルタミンからヒスチジンに変異し
たと考えられる。

【００３５】（ii）病原性試験 上記クローン#140、#364、#531および#545由来のウイル
スについて病原性を試験した。両感染性クローンを市販
の細胞導入キット（Amersham Pharmacia Biotech社,Cel
lPhect Transfection Kit）を用いてMSB1細胞に導入
し、感染性クローン由来ウイルスを作出した。MSB1細胞
でさらに1回継代した培養液を接種用ウイルス液とし
た。各接種用ウイルス液の感染価をMSB1細胞で測定した
ところ、4株の感染性クローン由来ウイルスのMSB1細胞
における増殖性および細胞変性効果の形態は親株と同様
であり、感染価はそれぞれ10^6.2〜10^7.2TCID₅₀／0.1ml
に達した。感染性クローン由来のウイルスを1日齢のSPF
雛9〜10羽に１羽あたり10^6.2TCID₅₀(0.1ml)ずつ筋肉内
注射して接種した。対照群10羽にはウイルスを含まない
培養液を0.1ml接種し、病原性試験を行った。体重測定
は接種後0、14、21日目に、赤血球容積率(％)は接種後1
4および21日目に測定した。また、死亡数は接種後21日
にわたって観察した。

【００３６】（iii）結果 変異導入クローン#531由来ウイルス接種群は、親株であ
る#140由来のウイルス接種群と比較して、平均赤血球容
積率(％)が8％低下、平均体重が有意に低下、および死
亡率(％)が10％から90％へと有意に上昇し、明らかに強
毒化した。一方、変異導入クローン#545由来ウイルス接
種群は、親株である#364由来のウイルス接種群と比較し
て、平均赤血球容積率(％)および平均体重が有意に上昇
して対照群と近似値を示し、死亡率(％)が67％から0％
へと減少し、、明らかに弱毒化した。結果を下記表２に
示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】以上の結果から、鶏貧血ウイルスVP1タン
パク質の394番目のアミノ酸変異は病原性に関連し、ヒ
スチジンからグルタミンに変異することで強毒化し、グ
ルタミンからヒスチジンに変異することで弱毒化するこ
とが明らかとなった。

【００３９】現在ＤＮＡデータベース(GenBank, EMBL)
に登録されている全て(10株)の鶏貧血ウイルスでは、VP
Iタンパク質の394番目のアミノ酸は全てグルタミンであ
り、また、この部位を特徴とする塩基配列を病原性マー
カーとして使用した例はない。また、遺伝子組換え技術
により、短期間でかつ確実に弱毒鶏貧血ウイルスを作出
する技術は知られていない。

【００４０】

【発明の効果】本発明の弱毒鶏貧血ウイルスを作出およ
び判定するための方法を提供する。これらの方法は、鶏
貧血ウイルス感染症の予防等に有用である。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nobuyuki Terakado, Director of National Institute of Animal Health , Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. <120> Attenuated Chicken Anemia Virus <130> P99-0241 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2298 <212> DNA <213> Chicken Anemia Virus <220> <221> CDS <222> (832)..(2178) <400> 1 gcattccgag tggttactat tccatcacca ttctagcctg tacacagaaa gtcaagatgg 60 acgaatcgct cgacttcgct cgcgattcgt cgaaggcggg gggccggagg ccccccggtg 120 gcccccctcc aacgagtgga gcatgtacag gggggtacgt catccgtaca ggggggtacg 180 tcacaaagag gcgttcctgt acaggggggt acgtcacgcg tacagggggg tacgtcacag 240 ccaatcagaa gctgccacgt tgcgaaagtg acgtttcgaa agtgggcggc gcaagcctct 300 ctatatattg agcgcacata ccggtcggca gtaggtatac gcaaggcggt ccgggtggat 360 gcacgggaac ggcggacaac cggccgctgg gggcagtgaa tcggcgctta gccgagaggg 420 gcaacctggg cccagcggag ccgcgcaggg gcaagtaatt tcaaatgaac gctctccaag 480 aagatactcc acccggacca tcaacggtgt tcaggccacc aacaagttca cggccgttgg 540 aaacccctca ctgcagagag atccggattg 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Ile Phe Leu Thr Glu Gly Leu 70 75 80 att ctg cct aaa aac agc aca gcg ggg ggc tat gca gac cac atg tac 1125 Ile Leu Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Gly Tyr Ala Asp His Met Tyr 85 90 95 ggg gcg aga gtc gcc aag atc tct gta aac ctg aag gag ttc ctg cta 1173 Gly Ala Arg Val Ala Lys Ile Ser Val Asn Leu Lys Glu Phe Leu Leu 100 105 110 gcg tca atg aac cta aca tac gtg agc aaa ctc gga ggc ccc atc gcc 1221 Ala Ser Met Asn Leu Thr Tyr Val Ser Lys Leu Gly Gly Pro Ile Ala 115 120 125 130 ggt gag ttg att gcg gac ggg tct aaa gca gaa gcc gcg gag aac tgg 1269 Gly Glu Leu Ile Ala Asp Gly Ser Lys Ala Glu Ala Ala Glu Asn Trp 135 140 145 cct aat tgc tgg ctg ccg cta gat aat aac gtg ccc tcc gcg aca cca 1317 Pro Asn Cys Trp Leu Pro Leu Asp Asn Asn Val Pro Ser Ala Thr Pro 150 155 160 tcg gca tgg tgg aga tgg gcc tta atg atg atg cag ccc acg gac tct 1365 Ser Ala Trp Trp Arg Trp Ala Leu Met Met Met Gln Pro Thr Asp Ser 165 170 175 tgc cgg ttc ttt aat cac cct aag caa atg acc ctg caa gac atg ggt 1413 Cys Arg Phe Phe Asn His Pro Lys Gln Met Thr Leu Gln Asp Met Gly 180 185 190 cgc atg ttt ggg ggc tgg cac ctg ttc cga cac att gaa acc cgc ttt 1461 Arg Met Phe Gly Gly Trp His Leu Phe Arg His Ile Glu Thr Arg Phe 195 200 205 210 cag ctc ctt gcc act aag aat gag gga tcc ttc agc ccc gtg gcg agt 1509 Gln Leu Leu Ala Thr Lys Asn Glu Gly Ser Phe Ser Pro Val Ala Ser 215 220 225 ctt ctc tcc cag gga gag tac ctc acg cgt cgg gac gat gtt aag tac 1557 Leu Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Leu Thr Arg Arg Asp Asp Val Lys Tyr 230 235 240 agc agc gat cac cag aac cgg tgg cga aaa ggc gaa caa ccg atg acg 1605 Ser Ser Asp His Gln Asn Arg Trp Arg Lys Gly Glu Gln Pro Met Thr 245 250 255 ggg ggt att gct tat gcg acc ggg aaa atg aga ccc gac gag caa cag 1653 Gly Gly Ile Ala Tyr Ala Thr Gly Lys Met Arg Pro Asp Glu Gln Gln 260 265 270 tac cct gct atg ccc cca gac ccc ccg ata atc acc agt act aca gcg 1701 Tyr Pro Ala Met Pro Pro Asp Pro Pro Ile Ile Thr Ser Thr Thr Ala 275 280 285 290 caa ggc acg caa gtc cgc tgc atg aat agc acg caa gct tgg tgg tca 1749 Gln Gly Thr Gln Val Arg Cys Met Asn Ser Thr Gln Ala Trp Trp Ser 295 300 305 tgg gac aca tat atg agc ttt gca aca ctc aca gca ctc ggt gca caa 1797 Trp Asp Thr Tyr Met Ser Phe Ala Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Gln 310 315 320 tgg tct ttt cct cca ggg caa cgt tca gtt tct aga cgg tcc ttc aac 1845 Trp Ser Phe Pro Pro Gly Gln Arg Ser Val Ser Arg Arg Ser Phe Asn 325 330 335 cac cat aag gcg aga gga gcc ggg gac ccc aaa ggc cag aga tgg cac 1893 His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro Lys Gly Gln Arg Trp His 340 345 350 acg ctg gtg ccg ctc ggc acg gag acc atc acc gac agc tac atg gga 1941 Thr Leu Val Pro Leu Gly Thr Glu Thr Ile Thr Asp Ser Tyr Met Gly 355 360 365 370 gca ccc gca tca gag ata gac acg aat ttc ttt acg ctt tac gta gcg 1989 Ala Pro Ala Ser Glu Ile Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr Val Ala 375 380 385 caa ggc aca aat aag tcg cag cac tac aag ttc ggc aca gct aca tac 2037 Gln Gly Thr Asn Lys Ser Gln His Tyr Lys Phe Gly Thr Ala Thr Tyr 390 395 400 gcg ctg aag gag ccg gta atg aag agc gat tca tgg gca gtg gta cgc 2085 Ala Leu Lys Glu Pro Val Met Lys Ser Asp Ser Trp Ala Val Val Arg 405 410 415 gtc cag tcg gtc tgg caa ctg ggt aac agg caa agg cct tac cca tgg 2133 Val Gln Ser Val Trp Gln Leu Gly Asn Arg Gln Arg Pro Tyr Pro Trp 420 425 430 gac gtc aac tgg gcc aac agc acc atg tac tgg ggg tcg cag ccc 2178 Asp Val Asn Trp Ala Asn Ser Thr Met Tyr Trp Gly Ser Gln Pro 435 440 445 tgaaaagggg ggggggctaa agcccccccc ccttgaaccc ccccctgggg gggattcccc 2238 cccagacccc ccctttatat agcactcaat aaacgcagca aatggcttta tcgcacaatc 2298 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Chicken Anemia Virus <400> 2 Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Trp His His Leu Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe 20 25 30 Arg His Arg Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys Ala 35 40 45 Phe His Asn Pro Arg Pro Gly Thr Tyr Ser Val Arg Leu Pro Asn Pro 50 55 60 Gln Ser Thr Met Thr Ile Arg Phe Gln Gly Val Ile Phe Leu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Ile Leu Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Gly Tyr Ala Asp His 85 90 95 Met Tyr Gly Ala Arg Val Ala Lys Ile Ser Val Asn Leu Lys Glu Phe 100 105 110 Leu Leu Ala Ser Met Asn Leu Thr Tyr Val Ser Lys Leu Gly Gly Pro 115 120 125 Ile Ala Gly Glu Leu Ile Ala Asp Gly Ser Lys Ala Glu Ala Ala Glu 130 135 140 Asn Trp Pro Asn Cys Trp Leu Pro Leu Asp Asn Asn Val Pro Ser Ala 145 150 155 160 Thr Pro Ser Ala Trp Trp Arg Trp Ala Leu Met Met Met Gln Pro Thr 165 170 175 Asp Ser Cys Arg Phe Phe Asn His Pro Lys Gln Met Thr Leu Gln Asp 180 185 190 Met Gly Arg Met Phe Gly Gly Trp His Leu Phe Arg His Ile Glu Thr 195 200 205 Arg Phe Gln Leu Leu Ala Thr Lys Asn Glu Gly Ser Phe Ser Pro Val 210 215 220 Ala Ser Leu Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Leu Thr Arg Arg Asp Asp Val 225 230 235 240 Lys Tyr Ser Ser Asp His Gln Asn Arg Trp Arg Lys Gly Glu Gln Pro 245 250 255 Met Thr Gly Gly Ile Ala Tyr Ala Thr Gly Lys Met Arg Pro Asp Glu 260 265 270 Gln Gln Tyr Pro Ala Met Pro Pro Asp Pro Pro Ile Ile Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ala Gln Gly Thr Gln Val Arg Cys Met Asn Ser Thr Gln Ala Trp 290 295 300 Trp Ser Trp Asp Thr Tyr Met Ser Phe Ala Thr Leu Thr Ala Leu Gly 305 310 315 320 Ala Gln Trp Ser Phe Pro Pro Gly Gln Arg Ser Val Ser Arg Arg Ser 325 330 335 Phe Asn His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro Lys Gly Gln Arg 340 345 350 Trp His Thr Leu Val Pro Leu Gly Thr Glu Thr Ile Thr Asp Ser Tyr 355 360 365 Met Gly Ala Pro Ala Ser Glu Ile Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr 370 375 380 Val Ala Gln Gly Thr Asn Lys Ser Gln His Tyr Lys Phe Gly Thr Ala 385 390 395 400 Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Pro Val Met Lys Ser Asp Ser Trp Ala Val 405 410 415 Val Arg Val Gln Ser Val Trp Gln Leu Gly Asn Arg Gln Arg Pro Tyr 420 425 430 Pro Trp Asp Val Asn Trp Ala Asn Ser Thr Met Tyr Trp Gly Ser Gln 435 440 445 Pro <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer designed for sequencing Chicken Anemia Virus genomic DNA cl one. <400> 3 gaccatcacc gacagctaca tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer designed for amplifying the DNA fragment cotainin g pathogenicity-associated gene of Chicken Anemia Virus. <400> 4 tgtagctgtg ccgaacttgt ag 22

【００４２】

【配列表フリーテキスト】

配列番号３：鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡクローンの
配列を決定するために設計したプライマー。 配列番号４：鶏貧血ウイルスの病原性関連遺伝子部位を
含むＤＮＡ断片を増幅するためのアンチセンスプライマ
ー。

【図面の簡単な説明】

【図１】鶏貧血ウイルスAH9410株から単離された感染性
クローン6株のVP1タンパク質のアミノ酸配列を比較した
図。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＰＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒ ｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを有
   する弱毒鶏貧血ウイルス。 （ａ） 配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮ
   Ａ、 （ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは
   複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
   ノ酸配列をコードするＤＮＡであって、配列番号２のア
   ミノ酸番号394に相当するアミノ酸がヒスチジンである
   アミノ酸配列をコードし、かつ病原性に関与しているＤ
   ＮＡ。
2. 【請求項２】 以下の工程（ａ）〜（ｃ）： （ａ） 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムＤＮＡをクローニ
   ングする工程、 （ｂ） 配列番号２のアミノ酸番号394に相当するアミ
   ノ酸をコードするゲノムＤＮＡ上の領域を、グルタミン
   をコードする配列から、ヒスチジンをコードする配列に
   改変する工程、 （ｃ） 改変したゲノムＤＮＡを細胞に導入する工程、 よりなる、請求項１記載の弱毒鶏貧血ウイルスの作出方
   法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の弱毒鶏貧血ウイルスを有
   効成分として含有するワクチン。