JP3198304B2 - 弱毒鶏貧血ウイルス - Google Patents
弱毒鶏貧血ウイルスInfo
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Description
hicken anemia virus:CAV)の病原性関連遺伝子部位を
改変することにより作出した弱毒鶏貧血ウイルス、その
作出方法、および該病原性関連遺伝子部位を含む塩基配
列を病原性マーカーとして使用する鶏貧血ウイルスの病
原性判定方法、ならびに弱毒クローンのDNAまたは弱
毒鶏貧血ウイルスを有効成分として含有するワクチンに
関する。
み貧血、死亡、発育不良等の病原性を示すDNAウイル
ス(ゲノムDNAの完全長は約2.3kbである)であり、197
9年に湯浅ら(Yuasa ら、1979 Avian Dis. 23 366-38
5)によって世界で初めてその存在が確認され、その後
現在までにアメリカ、ヨーロッパ、オーストラリアおよ
びアジアの各国においてもその存在が確認されている。
る方法としては、種鶏に生ワクチンを接種する方法がと
られてきた。ところが、これらの生ワクチンは若齢雛に
対して十分に弱毒性であるとはいえない。このため、ワ
クチン接種により却って若齢雛が鶏貧血ウイルスに感染
して発病し、養鶏場の汚染を招く場合がある。そこで、
若齢雛に対しても病原性をもたない弱毒鶏貧血ウイルス
株が望まれている。
o では浮遊培養細胞でのみ増殖させることが可能であ
り、プラック法等を用いての均一な遺伝子構造を有する
ウイルス液を作製することが困難であるため、現在まで
に明らかな弱毒ウイルス株は分離されていない。また、
培養細胞中で高継代(173代)することにより弱毒化し
たとの報告はある(Toodら、1995 Avian Pathol. 24 17
1-187)が、弱毒化に関連した遺伝子部位は特定されて
いない(Toodら、1997 J. Virol. 71 8326-8367)。
ルスの病原性に関連する遺伝子部位を特定することによ
りその遺伝子構造を有する弱毒鶏貧血ウイルスを作出
し、さらにこの病原性関連遺伝子部位の構造を利用して
鶏貧血ウイルスの病原性を判定する技術を提供すること
を目的とする。また本発明は、本発明の弱毒鶏貧血ウイ
ルスを有効成分として含有するワクチンを提供する。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、鶏貧血ウイル
スの完全長ゲノムDNAを挿入した感染性クローンを作
製し、感染性クローンの遺伝子構造と該クローン由来ウ
イルスの病原性とを比較することにより、病原性関連遺
伝子を特定するに至った。本発明はこの知見に基づいて
完成されたものである。
(b)のDNAを有する弱毒鶏貧血ウイルスである。 (a) 配列番号2のアミノ酸配列をコードするDN
A、(b) 配列番号2のアミノ酸配列において1もし
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列をコードするDNAであって、配列番号2
のアミノ酸番号394に相当するアミノ酸がヒスチジンで
あるアミノ酸配列をコードするDNA。
(c): (a) 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムDNAをクローニ
ングする工程、(b) 配列番号2のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードするゲノムDNA上の領域
を、グルタミンをコードする配列から、ヒスチジンをコ
ードする配列に改変する工程、(c) 改変したゲノム
DNAを細胞に導入する工程、よりなる、弱毒鶏貧血ウ
イルスの作出方法である。
(c): (a) 判定対象とする鶏貧血ウイルスのゲノムDNA
をクローニングする工程、(b) 配列番号2のアミノ
酸番号394に相当するアミノ酸をコードするゲノムDN
A上の領域の塩基配列を決定する工程、(c) 決定し
た塩基配列から、判定対象とするウイルスが弱毒性か強
毒性かを判定する工程、よりなる、鶏貧血ウイルスの病
原性判定方法である。
関連遺伝子部位にハイブリダイズするプライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応(以下、「PCR」という)によ
って増幅されるDNA断片の有無により、判定対象とす
るウイルスが弱毒性か強毒性かを判定する、鶏貧血ウイ
ルスの病原性判定方法である。
たは弱毒鶏貧血ウイルスを有効成分として含有するワク
チンである。
本明細書中の、「アミノ酸の欠失、置換もしくは付加」
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができる。かかる1もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
るタンパク質は、Molecular Cloning, A laboratory ma
nual,第二版〔Sambrook,Fritsch,Maniatis編、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1988〕、Current Protoc
ols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-
1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Pr
oc. Natl. Acad.Sci., USA, 79,6409(1982)、Gene, 34,
315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (198
5)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記
載の方法に準じて調製することができる。
在するものであっても、遺伝子組換え技術等により人為
的に弱毒化したものであってもよい。
以下の工程(a)〜(c): (a) 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムDNAをクローニ
ングする工程、(b) 配列番号2のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードするゲノムDNA上の領域
を、グルタミンをコードする配列から、ヒスチジンをコ
ードする配列に改変する工程、(c) 改変したゲノム
DNAを細胞に導入する工程、を経て作出することがで
きる。
グ 鶏貧血ウイルス感染MSB1細胞から公知の方法(Hirtら.,
J. Mol. Biol., 36,365-369, 1967)によりウイルスゲ
ノムDNAを抽出し、該DNAを、公知の方法、例え
ば、ユニークな制限酵素で切断したDNA断片をクロー
ニングする方法、あるいは市販のキットを使用してベク
ターに組み込み、得られたクローニングベクターを宿主
細胞に導入することにより、鶏貧血ウイルスDNAクロ
ーンを含むライブラリーを得る。
限酵素としては、限定するものではないが、例えばPst
I、XbaI、BamHI、SacI、SacII、EcoRI等をあげることが
できる。
hia属に属する微生物、例えば大腸菌(Escherichia col
i)をあげることができる。
ニングベクターとしては、宿主細胞中で自律複製できる
ものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター
等いずれでも使用できる、具体的には、pUC(TOYOBO)、p
Bluescript(TOYOBO)、pGEM(Promega)、M13(TOYOBO)、pB
R322(TOYOBO)等をあげることができる。
ンの選択は、例えば市販のDNA標識及び検出キット
(Boehringer Mannheim社)を用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法で検出できる。該方法によって検出さ
れたコロニーを培養し、プラスミドを精製した後、鶏貧
血ウイルスの完全長ゲノムDNAである約2.3kbのフラ
グメントが挿入されていることを電気泳動で確認するこ
とにより、鶏貧血ウイルス遺伝子が挿入されたクローン
が得られる。
病原性関連遺伝子部位(配列番号2のアミノ酸番号394
に相当するアミノ酸をコードする部位)を、部位特異的
変異誘発法(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
488-492, 1985)によりグルタミンをコードする配列か
らヒスチジンをコードする配列に改変することにより、
弱毒鶏貧血ウイルス生成用の感染性クローンを作製す
る。あるいは、上記工程(a)でクローニングされた強
毒性DNAの病原性関連遺伝子部位を含むDNA断片
を、例えば、XbaI及びNcoIの制限酵素で切り出し、弱毒
性クローンの相当するDNA断片と置換することによ
り、弱毒鶏貧血ウイルス生成用の感染性クローンを作製
することもできる。
限酵素で切断し、自己連結させることにより環状DNA
を作製する。作製した環状DNAを、市販のDNAの細
胞導入キット(例えばAmersham Pharmacia Biotech社,
CellPhect Transfection Kit)を用いてMSB1細胞に導入
することにより、弱毒鶏貧血ウイルスを作出する。
連遺伝子部位を利用して、鶏貧血ウイルスの病原性を判
定することができる。鶏貧血ウイルスの病原性の判定
は、例えば、以下の工程(a)〜(c): (a) 判定対象とする鶏貧血ウイルスのゲノムDNA
をクローニングする工程、(b) 配列番号2のアミノ
酸番号394に相当するアミノ酸をコードするゲノムDN
A上の領域の塩基配列を決定する工程、(c) 決定し
た塩基配列から、判定対象とするウイルスが弱毒性か強
毒性かを判定する工程、により実施することができる。
ング 上記工程(a)と同様にして、病原性が未知である鶏貧
血ウイルスのゲノムDNAをクローニングする。
遺伝子部位の塩基配列の決定 工程(a)で得られた鶏貧血ウイルスのゲノムDNAク
ローンの病原性関連遺伝子部位について、公知の方法、
例えばSanger法により、合成プライマー(5'-GACCATCAC
CGACAGCTACATG-3':配列番号3)を用いて塩基配列を決
定する。
定 工程(b)で決定した配列がヒスチジンをコードしてい
れば、対象とした鶏貧血ウイルスは弱毒ウイルスである
と判定され、前記配列がグルタミンをコードしていれば
強毒ウイルスであると判定される。
部位にハイブリダイズするプライマーを用いたPCRに
よって増幅されるDNA断片の有無を調べることによ
り、鶏貧血ウイルスの病原性を判定することもできる。
含むDNA断片を増幅することのできるプライマーとし
ては、配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列
の一部と対応し、かつ配列番号2のアミノ酸番号394に
相当するアミノ酸をコードする塩基配列を含むDNA断
片を増幅することのできるオリゴヌクレオチドであれば
よく、制限するものではないが、アンチセンスプライマ
ーとしては、例えば、5'-TGTAGCTGTGCCGAACTTGTAG- 3'
(配列番号4)を挙げることができる。
もので良いが、例えば、94℃で30秒間、55℃で3
0秒間、72℃で30秒間からなる反応工程を1サイク
ルとして15サイクル行った後、72℃で7分間反応さ
せる条件をあげることができる。
は弱毒鶏貧血ウイルスは、鶏貧血ウイルス感染症に対す
るワクチンとして用いることができる。本発明の弱毒ク
ローンのDNAを使用する場合には、鶏1羽あたり、例
えば約200 ngの該DNAを直接筋肉内に注射するこ
とにより接種する。本発明の弱毒鶏貧血ウイルスを使用
する場合には、鶏1羽あたり、例えば、103.0 〜106.0
TCID50の該ウイルスを筋肉内に注射することにより接種
する。鶏貧血ウイルスの完全長ゲノムDNAをタンデム
に連結したクローンを細胞にトランスフェクトして感染
性ウイルスを回収する技術は公知である(Todd,Dら、Arc
h.Virol.141,1523-1534,1996)。しかし、クローンDN
Aを直接鶏に接種した場合にも感染性ウイルスができ、
鶏がウイルスに感染することは報告されていない。
説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。 〔実施例1〕鶏貧血ウイルスの病原性に関連する遺伝子
部位の改変 鶏貧血ウイルスゲノムDNAのクローニング 公知の方法(Yuasa., Nat. Inst.Anim. Health Q., 23,
13-20, 1983)用いて、鶏貧血ウイルス野外分離株(AH9
410)(高木ら、1996、鶏病研報、32 90-96)をMSB1細胞
に感染させて増殖させた。感染MSB1細胞から、鶏貧血ウ
イルスゲノムDNAを制限酵素PstIで切断して線状化す
る。 線状化したDNAを、Ligation Pack(ニッポン
ジーン)を使用してクローニングベクター(pBluescrip
t)に連結した後、大腸菌(DH5α)に導入することによ
り、鶏貧血ウイルスDNAクローンを含むライブラリー
を得た。得られたライブラリーから、Dig−Labeling an
d Detection Kit(Boehringer Mannheim社)を使用してコ
ロニーハイブリダイゼーション法により、鶏貧血ウイル
スDNAが挿入されたクローンを選択した。
験 挿入クローンDNAを制限酵素PstIで切断し、ライゲー
ションして自己連結させることにより、環状DNAを作
製した。さらに、該環状DNAを市販の細胞導入キット
(Amersham Pharmacia Biotech社, CellPhect Transfec
tion Kit)を用いて再びMSB1細胞に導入することによ
り、感染性クローン由来ウイルスを作出した。得られた
6株の感染性クローン由来ウイルス(#140、#363、#36
4、#368、#369、#370)各106.2TCID50/雛を1日齢の改
変病原体不在(SPF)鶏雛に筋肉内注射して接種し、その
後21日間にわたり、赤血球容積率(%)および死亡率(%)
(死亡数(羽)/試験数(羽))を測定して病原性を判定した
ところ、3株(#364、#368、#370)が強毒で、3株(#14
0、#363、#369)が弱毒であった。結果を下記表1に示
す。
解析による、鶏貧血ウイルスの病原性に関連する遺伝子
部位の推定 6株の感染性クローンDNA全領域について、ABI社のD
ye terminator CycleSequencing Kit を用いたSanger法
により塩基配列を決定し、相互に比較したところ、VP1
タンパク質コード領域の3個所のみにおいて変異が検出
された(各塩基配列がコードするアミノ酸配列を併せて
図1に示す)。それらの変異部位を含むコドンがコード
する3個のアミノ酸(VP1−141、VP1−394、 VP1−444:
表1中に併せて示す)のうち、VP1タンパク質の394番目
のアミノ酸変異(VP1−394)が病原性の型に一致してお
り、このアミノ酸が病原性に関連していることが推定さ
れた。
に関連しているかどうかを証明する目的で、この部位の
アミノ酸をコードする塩基のみが異なる以外は同一の塩
基配列を有する2組のクローンを作製し、その病原性を
比較した。 (i) VP1タンパク質の394番目のアミノ酸のみが異な
る2組のクローンの作製 弱毒性(#140)または強毒性(#364)であることが判明して
いる感染性クローンのVP1タンパク質コード遺伝子中、1
330番目の塩基を部位特異的突然変異誘発法によりシト
シンからグアニン、グアニンからシトシンにそれぞれ変
異させ、これによりVP1タンパク質の394番目のアミノ酸
をヒスチジン(H)からグルタミン(Q)またはグルタミンか
らヒスチジンに変異させた感染性クローン(#531および
#545)を作製した。Sanger法を用いてこの2つのクロー
ンの全塩基配列を決定したところ、#140および#364クロ
ーンのゲノムは2,298塩基長であった(データは示さ
ず)。また、#531および#545は設計通りにVP1タンパク質
コード遺伝子1330番目の塩基シトシンがグアニン、およ
びグアニンがシトシンにそれぞれ変異したことが確認さ
れ、VP1タンパク質の394番目のアミノ酸がヒスチジンか
らグルタミンまたはグルタミンからヒスチジンに変異し
たと考えられる。
スについて病原性を試験した。両感染性クローンを市販
の細胞導入キット(Amersham Pharmacia Biotech社,Cel
lPhect Transfection Kit)を用いてMSB1細胞に導入
し、感染性クローン由来ウイルスを作出した。MSB1細胞
でさらに1回継代した培養液を接種用ウイルス液とし
た。各接種用ウイルス液の感染価をMSB1細胞で測定した
ところ、4株の感染性クローン由来ウイルスのMSB1細胞
における増殖性および細胞変性効果の形態は親株と同様
であり、感染価はそれぞれ106.2〜107.2TCID50/0.1ml
に達した。感染性クローン由来のウイルスを1日齢のSPF
雛9〜10羽に1羽あたり106.2TCID50(0.1ml)ずつ筋肉内
注射して接種した。対照群10羽にはウイルスを含まない
培養液を0.1ml接種し、病原性試験を行った。体重測定
は接種後0、14、21日目に、赤血球容積率(%)は接種後1
4および21日目に測定した。また、死亡数は接種後21日
にわたって観察した。
る#140由来のウイルス接種群と比較して、平均赤血球容
積率(%)が8%低下、平均体重が有意に低下、および死
亡率(%)が10%から90%へと有意に上昇し、明らかに強
毒化した。一方、変異導入クローン#545由来ウイルス接
種群は、親株である#364由来のウイルス接種群と比較し
て、平均赤血球容積率(%)および平均体重が有意に上昇
して対照群と近似値を示し、死亡率(%)が67%から0%
へと減少し、、明らかに弱毒化した。結果を下記表2に
示す。
パク質の394番目のアミノ酸変異は病原性に関連し、ヒ
スチジンからグルタミンに変異することで強毒化し、グ
ルタミンからヒスチジンに変異することで弱毒化するこ
とが明らかとなった。
に登録されている全て(10株)の鶏貧血ウイルスでは、VP
Iタンパク質の394番目のアミノ酸は全てグルタミンであ
り、また、この部位を特徴とする塩基配列を病原性マー
カーとして使用した例はない。また、遺伝子組換え技術
により、短期間でかつ確実に弱毒鶏貧血ウイルスを作出
する技術は知られていない。
び判定するための方法を提供する。これらの方法は、鶏
貧血ウイルス感染症の予防等に有用である。
配列を決定するために設計したプライマー。 配列番号4:鶏貧血ウイルスの病原性関連遺伝子部位を
含むDNA断片を増幅するためのアンチセンスプライマ
ー。
クローン6株のVP1タンパク質のアミノ酸配列を比較した
図。
Claims (3)
- 【請求項1】 以下の(a)または(b)のDNAを有
する弱毒鶏貧血ウイルス。 (a) 配列番号2のアミノ酸配列をコードするDN
A、 (b) 配列番号2のアミノ酸配列において1もしくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列をコードするDNAであって、配列番号2のア
ミノ酸番号394に相当するアミノ酸がヒスチジンである
アミノ酸配列をコードし、かつ病原性に関与しているD
NA。 - 【請求項2】 以下の工程(a)〜(c): (a) 強毒鶏貧血ウイルスのゲノムDNAをクローニ
ングする工程、 (b) 配列番号2のアミノ酸番号394に相当するアミ
ノ酸をコードするゲノムDNA上の領域を、グルタミン
をコードする配列から、ヒスチジンをコードする配列に
改変する工程、 (c) 改変したゲノムDNAを細胞に導入する工程、 よりなる、請求項1記載の弱毒鶏貧血ウイルスの作出方
法。 - 【請求項3】 請求項1記載の弱毒鶏貧血ウイルスを有
効成分として含有するワクチン。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19028299A JP3198304B2 (ja) | 1999-07-05 | 1999-07-05 | 弱毒鶏貧血ウイルス |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19028299A JP3198304B2 (ja) | 1999-07-05 | 1999-07-05 | 弱毒鶏貧血ウイルス |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001017178A JP2001017178A (ja) | 2001-01-23 |
JP3198304B2 true JP3198304B2 (ja) | 2001-08-13 |
Family
ID=16255584
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19028299A Expired - Lifetime JP3198304B2 (ja) | 1999-07-05 | 1999-07-05 | 弱毒鶏貧血ウイルス |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP3198304B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6061168B1 (ja) * | 2016-08-01 | 2017-01-18 | 沖縄子育て良品株式会社 | 授乳用クッション |
-
1999
- 1999-07-05 JP JP19028299A patent/JP3198304B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
鶏病研究会報,Vol.32,No.2(1996)p.90−97 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6061168B1 (ja) * | 2016-08-01 | 2017-01-18 | 沖縄子育て良品株式会社 | 授乳用クッション |
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---|---|
JP2001017178A (ja) | 2001-01-23 |
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