JP3146202B2 - ダニアレルゲン - Google Patents
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
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-
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ダニアレルゲンの
クローニングに関するものであり、詳しくは、家塵埃ダ
ニ(ハウス・ダスト・マイト)アレルゲンをコードしてい
るＤＮＡのクローニングおよび発現に関するものであ
る。
クローニングに関するものであり、詳しくは、家塵埃ダ
ニ(ハウス・ダスト・マイト)アレルゲンをコードしてい
るＤＮＡのクローニングおよび発現に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】デル
マトファゴイデス(Ｄermatophagoides)属のダニに対す
るアレルギーが、喘息、鼻炎、およびアトピー性皮膚炎
のような疾患に関連していることは以前から認識されて
いる(１３、１４)。これに関して、デルマトファゴイデ
ス・プテロニシヌス(D.pteronyssinus)およびデルマト
ファゴイデス・ファリナーエ(Ｄ.farinae)が主要な種で
あり、これらが産生するアレルゲンを同定するために多
くの研究が行われてきた。標準化されたアレルゲンを得
ることの困難さのために、家塵埃ダニに対するアレルギ
ーの研究の発達が妨げられてきた(１)。約６種類の抗原
が、ほとんどのＩgＥ抗ダニ抗体反応を誘発し(２、
３)、ダニの糞中に存在するこれらのうちの１つ、Ｄer
p Ｉ(約２７kＤaの糖タンパク)が、通常主要な抗原とし
て、アレルギー性血清の約８０〜９０％と反応する。ま
た、これは糞の成分であるため、容易に空中に舞い、溶
解し易く(４)、したがって、ダニの身体にあるアレルゲ
ンよりも得易い形態で存在する。
マトファゴイデス(Ｄermatophagoides)属のダニに対す
るアレルギーが、喘息、鼻炎、およびアトピー性皮膚炎
のような疾患に関連していることは以前から認識されて
いる(１３、１４)。これに関して、デルマトファゴイデ
ス・プテロニシヌス(D.pteronyssinus)およびデルマト
ファゴイデス・ファリナーエ(Ｄ.farinae)が主要な種で
あり、これらが産生するアレルゲンを同定するために多
くの研究が行われてきた。標準化されたアレルゲンを得
ることの困難さのために、家塵埃ダニに対するアレルギ
ーの研究の発達が妨げられてきた(１)。約６種類の抗原
が、ほとんどのＩgＥ抗ダニ抗体反応を誘発し(２、
３)、ダニの糞中に存在するこれらのうちの１つ、Ｄer
p Ｉ(約２７kＤaの糖タンパク)が、通常主要な抗原とし
て、アレルギー性血清の約８０〜９０％と反応する。ま
た、これは糞の成分であるため、容易に空中に舞い、溶
解し易く(４)、したがって、ダニの身体にあるアレルゲ
ンよりも得易い形態で存在する。
【０００３】ほとんどの人口の５〜１０％が喘息、即
ち、家塵埃ダニ、デルマトファゴイデス・プテロニシヌ
スに対するアレルギーと密接に関連していることが多い
症状を呈する。この型のアレルギーは、ダニの成分と反
応するＩgＥ抗体によって媒介される。したがって、ハ
チ刺創に対する類似のアレルギーを、ハチ毒物を繰返し
投与し、漸次的に増量することによって脱感作すること
ができるのとほとんど同じ様にして、喘息に関して脱感
作治療が成功するであろうという可能性がある。
ち、家塵埃ダニ、デルマトファゴイデス・プテロニシヌ
スに対するアレルギーと密接に関連していることが多い
症状を呈する。この型のアレルギーは、ダニの成分と反
応するＩgＥ抗体によって媒介される。したがって、ハ
チ刺創に対する類似のアレルギーを、ハチ毒物を繰返し
投与し、漸次的に増量することによって脱感作すること
ができるのとほとんど同じ様にして、喘息に関して脱感
作治療が成功するであろうという可能性がある。
【０００４】したがって、本発明は、このような脱感作
治療およびアレルギーの検出に関する診断試験に用いる
のに適している家塵埃ダニのアレルゲン、特に、Ｄer p
ＩおよびＤer p ＩＩアレルゲンの製造方法を提供する
ものである。
治療およびアレルギーの検出に関する診断試験に用いる
のに適している家塵埃ダニのアレルゲン、特に、Ｄer p
ＩおよびＤer p ＩＩアレルゲンの製造方法を提供する
ものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、デルマトファ
ゴイデス属の家塵埃ダニのアレルゲンの抗原性を示すポ
リペプチドもしくはその少なくとも１つのエピトープを
含むペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列、ま
たはストリンジェンシー(厳格性)の高い条件下でこのよ
うな配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む
組換えＤＮＡ分子を提供するものである。１つの具体的
な態様では、このヌクレオチド配列は家塵埃ダニの主要
なＤer p ＩもしくはＤer p ＩＩアレルゲンとして、ま
たはその少なくとも１つのエピトープを含むペプチドと
して発現され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、図１
および図２または図８および図９に示される配列の実質
的に全部または一部を有することで特徴付けてもよい。
ゴイデス属の家塵埃ダニのアレルゲンの抗原性を示すポ
リペプチドもしくはその少なくとも１つのエピトープを
含むペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列、ま
たはストリンジェンシー(厳格性)の高い条件下でこのよ
うな配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む
組換えＤＮＡ分子を提供するものである。１つの具体的
な態様では、このヌクレオチド配列は家塵埃ダニの主要
なＤer p ＩもしくはＤer p ＩＩアレルゲンとして、ま
たはその少なくとも１つのエピトープを含むペプチドと
して発現され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、図１
および図２または図８および図９に示される配列の実質
的に全部または一部を有することで特徴付けてもよい。
【０００６】本発明に至る研究において、デルマトファ
ゴイデス・プテロニシヌス由来のＤer p ＩおよびＤer
p ＩＩアレルゲンの発現をコードするヌクレオチド配列
を含んでいる組換えＤＮＡ分子を構築した。デルマトフ
ァゴイデス・ファリナーエ種およびデルマトファゴイデ
ス・ミクロセルス(Ｄermatophagoides microcerus)種な
らびに同科の別の家塵埃ダニ、ユーログリファス・マイ
ネイ(Ｅuroglyphus maynei)は、抗原交差反応性および
高度なアミノ酸相同性(ホモロジー)を有する類似のアレ
ルゲンを産生する。したがって、本発明は、デルマトフ
ァゴイデス・プテロニシヌスからのアレルゲンだけでは
なく、ストリンジェンシーの高い条件下で、デルマトフ
ァゴイデス・プテロニシヌスのＤＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡによってコードされた別のダニアレルゲンを
も含む。
ゴイデス・プテロニシヌス由来のＤer p ＩおよびＤer
p ＩＩアレルゲンの発現をコードするヌクレオチド配列
を含んでいる組換えＤＮＡ分子を構築した。デルマトフ
ァゴイデス・ファリナーエ種およびデルマトファゴイデ
ス・ミクロセルス(Ｄermatophagoides microcerus)種な
らびに同科の別の家塵埃ダニ、ユーログリファス・マイ
ネイ(Ｅuroglyphus maynei)は、抗原交差反応性および
高度なアミノ酸相同性(ホモロジー)を有する類似のアレ
ルゲンを産生する。したがって、本発明は、デルマトフ
ァゴイデス・プテロニシヌスからのアレルゲンだけでは
なく、ストリンジェンシーの高い条件下で、デルマトフ
ァゴイデス・プテロニシヌスのＤＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡによってコードされた別のダニアレルゲンを
も含む。
【０００７】また、本発明は、上記のようなヌクレオチ
ド配列およびこれと機能的に連結している発現調節配列
を含むバクテリオファージのような発現ベクターを提供
するものでもある。さらに、本発明は、上記発現ベクタ
ーを含む宿主細胞を提供するものである。
ド配列およびこれと機能的に連結している発現調節配列
を含むバクテリオファージのような発現ベクターを提供
するものでもある。さらに、本発明は、上記発現ベクタ
ーを含む宿主細胞を提供するものである。
【０００８】さらに、本発明は、デルマトファゴイデス
属の家塵埃ダニのアレルゲン、特に主要なＤer p Ｉも
しくはＤer p ＩＩアレルゲン、または抗原交差反応性
および高度なアミノ酸相同性を有する別の家塵埃ダニ由
来のアレルゲン、の全部または一部の抗原性を示す合成
タンパクまたはポリペプチドを提供するものである。こ
のような合成生成物は、家塵埃ダニのアレルゲンの全部
または一部の抗原性を示すポリペプチド成分と、それに
融合している、発現ベクターのＤＮＡによってコードさ
れたβ−ガラクトシダーゼのような別のポリペプチドか
らなる融合タンパクであってもよい。
属の家塵埃ダニのアレルゲン、特に主要なＤer p Ｉも
しくはＤer p ＩＩアレルゲン、または抗原交差反応性
および高度なアミノ酸相同性を有する別の家塵埃ダニ由
来のアレルゲン、の全部または一部の抗原性を示す合成
タンパクまたはポリペプチドを提供するものである。こ
のような合成生成物は、家塵埃ダニのアレルゲンの全部
または一部の抗原性を示すポリペプチド成分と、それに
融合している、発現ベクターのＤＮＡによってコードさ
れたβ−ガラクトシダーゼのような別のポリペプチドか
らなる融合タンパクであってもよい。
【０００９】
【発明の実施の形態】上記合成タンパクまたはポリペプ
チド、特に上記融合タンパクの製造方法は、上記発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する工程、および培養物か
ら合成タンパクまたはポリペプチドを回収する工程から
なる。
チド、特に上記融合タンパクの製造方法は、上記発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する工程、および培養物か
ら合成タンパクまたはポリペプチドを回収する工程から
なる。
【００１０】本明細書で用いる「合成」という用語は、本
明細書に記載のヌクレオチド配列のクローニングおよび
発現によって産生されたタンパクまたはポリペプチドに
用いる。
明細書に記載のヌクレオチド配列のクローニングおよび
発現によって産生されたタンパクまたはポリペプチドに
用いる。
【００１１】本発明に従って産生された合成タンパクも
しくはポリペプチド、即ち「合成アレルゲン」は、天然ア
レルゲンの抗原性を示す。例えば、主要なアレルゲンＤ
erp ＩをコードしているcＤＮＡクローンは融合タンパ
クを産生し、これはウサギ抗-Ｄer p Ｉ抗血清と反応す
る。したがって、このような融合タンパクは、診断試験
および治療用(例えば、脱感作)組成物および処置におけ
る抗原成分として用いることができる。
しくはポリペプチド、即ち「合成アレルゲン」は、天然ア
レルゲンの抗原性を示す。例えば、主要なアレルゲンＤ
erp ＩをコードしているcＤＮＡクローンは融合タンパ
クを産生し、これはウサギ抗-Ｄer p Ｉ抗血清と反応す
る。したがって、このような融合タンパクは、診断試験
および治療用(例えば、脱感作)組成物および処置におけ
る抗原成分として用いることができる。
【００１２】具体的には、合成アレルゲンは、天然ダニ
アレルゲンとの抗原類似性およびダニに対するアレルギ
ーを有するヒトの血清から得たＩgＥと反応する能力に
よって示されるように、インビトロおよびインビボでの
診断試薬として用いることができる。また、これらは、
成熟Ｄer p Ｉに対するマウスのＩgＥ応答を抑制する合
成Ｄer p Ｉの能力によって示されるように、脱感作に
よる治療物質として用いることができる。
アレルゲンとの抗原類似性およびダニに対するアレルギ
ーを有するヒトの血清から得たＩgＥと反応する能力に
よって示されるように、インビトロおよびインビボでの
診断試薬として用いることができる。また、これらは、
成熟Ｄer p Ｉに対するマウスのＩgＥ応答を抑制する合
成Ｄer p Ｉの能力によって示されるように、脱感作に
よる治療物質として用いることができる。
【００１３】本発明のその他の特徴は、発明を例示する
ために記載した以下の実施例から明らかとなろう。図面
については、以下のとおりである。
ために記載した以下の実施例から明らかとなろう。図面
については、以下のとおりである。
【００１４】図１および図２は、cＤＮＡ λgt １１ p
１(１３Ｔ)のヌクレオチド配列および予想されるアミノ
酸配列を示す。右側の番号は、ヌクレオチドの位置であ
り、配列の上の番号はアミノ酸の位置である。正のアミ
ノ酸残基番号は、トレオニンから始まる分泌された成熟
Ｄer p Ｉの配列に対応する。負の配列番号は、Ｄerp
Ｉの予想される一時的なプレ酵素およびプレプロ酵素形
を示す。矢印は、各々、予想されたプロ酵素配列および
成熟Ｄer p Ｉの開始を示す。オープンボックスで囲ま
れている残基−１５〜−１３は、プロ酵素形成のための
開裂を構成し、破線を引いた残基５２〜５４は、潜在的
なＮ−グリコシル化部位に相当する。終止ＴＡＡコドン
および隣接したポリアデニル化シグナルには下線を引い
た。アミノ酸残基１〜４１、７９〜９５、１１１〜１４
２および１６２〜１７９は、慣用のアミノ酸配列分析に
よって決定された既知のトリプシンのペプチド配列に対
応する。
１(１３Ｔ)のヌクレオチド配列および予想されるアミノ
酸配列を示す。右側の番号は、ヌクレオチドの位置であ
り、配列の上の番号はアミノ酸の位置である。正のアミ
ノ酸残基番号は、トレオニンから始まる分泌された成熟
Ｄer p Ｉの配列に対応する。負の配列番号は、Ｄerp
Ｉの予想される一時的なプレ酵素およびプレプロ酵素形
を示す。矢印は、各々、予想されたプロ酵素配列および
成熟Ｄer p Ｉの開始を示す。オープンボックスで囲ま
れている残基−１５〜−１３は、プロ酵素形成のための
開裂を構成し、破線を引いた残基５２〜５４は、潜在的
なＮ−グリコシル化部位に相当する。終止ＴＡＡコドン
および隣接したポリアデニル化シグナルには下線を引い
た。アミノ酸残基１〜４１、７９〜９５、１１１〜１４
２および１６２〜１７９は、慣用のアミノ酸配列分析に
よって決定された既知のトリプシンのペプチド配列に対
応する。
【００１５】図３は、クローン λgt１１ p１(１３Ｔ)
のcＤＮＡ挿入物の制限地図およびＤＮＡ配列決定のス
トラテジーを示す。矢印は、配列が読まれた方向を示
す。
のcＤＮＡ挿入物の制限地図およびＤＮＡ配列決定のス
トラテジーを示す。矢印は、配列が読まれた方向を示
す。
【００１６】図４は、Ｄer p ＩとＤer f ＩとのＮ−末
端配列の比較である。Ｄer p Ｉのアミノ酸配列は、図
１のアミノ酸１〜２０と同一である。Ｄer f Ｉ配列
は、文献(１２)から引用した。
端配列の比較である。Ｄer p Ｉのアミノ酸配列は、図
１のアミノ酸１〜２０と同一である。Ｄer f Ｉ配列
は、文献(１２)から引用した。
【００１７】図５は、抗Ｄer p １とλgt１１ p１(１３
Ｔ)との反応性を示す。ファージについて生起されたＹ
１０８９溶原からのリゼイトとウサギ抗-Ｄer p １(Ｄe
r pＩ)または正常なウサギ血清(Ｎrs)とを、ドット-ブ
ロット(dot-blot)によって反応させた。λgt１１ p１
(１３Ｔ)(a)またはλgt１１(b)によって感染したバクテ
リアのリゼイトから３つのドット(２μL)を作成した。
125Ｉ-タンパクＡおよびオートラジオグラフィーにより
展開すると、λgt１１ p１(１３Ｔ)リゼイトと抗-Ｄer
p １との反応だけが反応性を示した。
Ｔ)との反応性を示す。ファージについて生起されたＹ
１０８９溶原からのリゼイトとウサギ抗-Ｄer p １(Ｄe
r pＩ)または正常なウサギ血清(Ｎrs)とを、ドット-ブ
ロット(dot-blot)によって反応させた。λgt１１ p１
(１３Ｔ)(a)またはλgt１１(b)によって感染したバクテ
リアのリゼイトから３つのドット(２μL)を作成した。
125Ｉ-タンパクＡおよびオートラジオグラフィーにより
展開すると、λgt１１ p１(１３Ｔ)リゼイトと抗-Ｄer
p １との反応だけが反応性を示した。
【００１８】図６は、アレルギー性血清中のＩgＥとク
ローンpＧＥＸ−p１(１３Ｔ)との反応を示す。pＧＥＸ
またはpＧＥＸ−p１の一夜培養液をブロス中１／１０に
希釈し、３７℃で２時間増殖させた。これらをＩＰＴＧ
によって誘発し、３７℃で２時間増殖させた。バクテリ
アをペレット化し、培養培地の容量の１／１０になるよ
うにＰＢＳ中に再懸濁させた。バクテリアを凍結／解凍
および音波処理によって溶菌した。ダニ-アレルギー性
血清または非アレルギー性血清を用いて、これらのリゼ
イト２μLでラジオイムノ・ドット-ブロットを行った。
１列目のドットは、pＧＥＸを含む大腸菌からのもので
あり、２〜４列目のドットは、pＧＥＸ−p１(１３Ｔ)に
よって感染した大腸菌の異なる培養物からのものであ
る。pＧＥＸ-p１(１３Ｔ)に対する反応性は、非アレル
ギー性血清ではなくアレルギー性血清中のＩgＥとで見
られる。ベクター対照に対する反応性または非アレルギ
ー性血清との反応性は見られなかった。
ローンpＧＥＸ−p１(１３Ｔ)との反応を示す。pＧＥＸ
またはpＧＥＸ−p１の一夜培養液をブロス中１／１０に
希釈し、３７℃で２時間増殖させた。これらをＩＰＴＧ
によって誘発し、３７℃で２時間増殖させた。バクテリ
アをペレット化し、培養培地の容量の１／１０になるよ
うにＰＢＳ中に再懸濁させた。バクテリアを凍結／解凍
および音波処理によって溶菌した。ダニ-アレルギー性
血清または非アレルギー性血清を用いて、これらのリゼ
イト２μLでラジオイムノ・ドット-ブロットを行った。
１列目のドットは、pＧＥＸを含む大腸菌からのもので
あり、２〜４列目のドットは、pＧＥＸ−p１(１３Ｔ)に
よって感染した大腸菌の異なる培養物からのものであ
る。pＧＥＸ-p１(１３Ｔ)に対する反応性は、非アレル
ギー性血清ではなくアレルギー性血清中のＩgＥとで見
られる。ベクター対照に対する反応性または非アレルギ
ー性血清との反応性は見られなかった。
【００１９】図７は、プラークラジオイムノアッセイに
おいてＤer p ＩＩをコードするcＤＮＡクローンの血清
反応性(seroreactivity)を示す。プラークリフトからの
ニトロセルロースフィルターのセグメントを、クローン
１、３、Ａ、Ｂおよびベクター対照Ａmp１から得た。こ
れらを、１列目のアレルギー性血清(ＡＭ)、２列目の非
アレルギー性血清(ＷＴ)と、ヒトＩgＥについてのイム
ノアッセイにより、および３列目のウサギ抗血清と、Ｄ
er p ＩについてのタンパクＡイムノアッセイによって
反応させた。クローン１、３およびＢは、アレルギー性
血清と強く反応するが非アレルギー性またはベクター対
照とは反応しなかった。(クローンＢおよびベクター対
照は、非アレルギー性血清による試験を行わなかっ
た。)
おいてＤer p ＩＩをコードするcＤＮＡクローンの血清
反応性(seroreactivity)を示す。プラークリフトからの
ニトロセルロースフィルターのセグメントを、クローン
１、３、Ａ、Ｂおよびベクター対照Ａmp１から得た。こ
れらを、１列目のアレルギー性血清(ＡＭ)、２列目の非
アレルギー性血清(ＷＴ)と、ヒトＩgＥについてのイム
ノアッセイにより、および３列目のウサギ抗血清と、Ｄ
er p ＩについてのタンパクＡイムノアッセイによって
反応させた。クローン１、３およびＢは、アレルギー性
血清と強く反応するが非アレルギー性またはベクター対
照とは反応しなかった。(クローンＢおよびベクター対
照は、非アレルギー性血清による試験を行わなかっ
た。)
【００２０】図８および図９は、λgt１１ pＩＩ(Ｃl)
のcＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ
酸配列を示す。右側の番号はヌクレオチドの位置であ
り、上の番号はアミノ酸の位置である。アミノ酸に関す
る正の番号は、既知のＤer p ＩＩのＮ−末端で始ま
り、既知の最初の４０個の残基の配列と一致する。残基
−１〜−１６は、疎水性コアを有する典型的なリーダー
配列に似ている。
のcＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ
酸配列を示す。右側の番号はヌクレオチドの位置であ
り、上の番号はアミノ酸の位置である。アミノ酸に関す
る正の番号は、既知のＤer p ＩＩのＮ−末端で始ま
り、既知の最初の４０個の残基の配列と一致する。残基
−１〜−１６は、疎水性コアを有する典型的なリーダー
配列に似ている。
【００２１】図１０は、Ｄer p ＩＩおよびＤer f ＩＩ
のＮ−末端アミノ酸相同性を示す。(Ｄer f ＩＩ配列は
文献３０から引用)
のＮ−末端アミノ酸相同性を示す。(Ｄer f ＩＩ配列は
文献３０から引用)
【００２２】
【実施例】実施例１ 材料および方法 cＤＮＡのクローニングおよび発現 コモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ(Commonwea
lth Serum Laboratories)[パークビル、オーストラリア]
によって培養されたダニ デルマトファゴイデス・プテ
ロニシヌスからポリアデニル化mＲＮＡを単離し、キッ
ト[アマーシャム(Amersham)、インターナショナル、バ
ックス]を用いてＲＮＡ-ase Ｈ法(５)によってcＤＮＡ
を合成した。ＥcoＲＩリンカーを付加した後、cＤＮＡ
をλgt１１にライゲートし、大腸菌Ｙ１０９０(r-)[プ
ロメガ・バイオテック(Promega Biotec)、マディソン、
ウィスコンシン]に植えつけ、５×１０5の組換え体ライ
ブラリーをつくった。ウサギ抗-Ｄer p １抗血清を用い
(７)、プラークラジオイムノアッセイによって(６)、ス
クリーニングを行った。125Ｉ-ブドウ球菌性タンパクＡ
およびオートラジオグラフィーによる展開(８)によって
反応性を検出した。抗血清と反応性のあるプラークを産
生するファージを、そのＤＮＡが糞のＤer p １から得
た３つのトリプシンペプチドから得られたアミノ酸配列
をもとに構築された１７-merオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズする能力を有するかどうかについて検査した
(１７)。
lth Serum Laboratories)[パークビル、オーストラリア]
によって培養されたダニ デルマトファゴイデス・プテ
ロニシヌスからポリアデニル化mＲＮＡを単離し、キッ
ト[アマーシャム(Amersham)、インターナショナル、バ
ックス]を用いてＲＮＡ-ase Ｈ法(５)によってcＤＮＡ
を合成した。ＥcoＲＩリンカーを付加した後、cＤＮＡ
をλgt１１にライゲートし、大腸菌Ｙ１０９０(r-)[プ
ロメガ・バイオテック(Promega Biotec)、マディソン、
ウィスコンシン]に植えつけ、５×１０5の組換え体ライ
ブラリーをつくった。ウサギ抗-Ｄer p １抗血清を用い
(７)、プラークラジオイムノアッセイによって(６)、ス
クリーニングを行った。125Ｉ-ブドウ球菌性タンパクＡ
およびオートラジオグラフィーによる展開(８)によって
反応性を検出した。抗血清と反応性のあるプラークを産
生するファージを、そのＤＮＡが糞のＤer p １から得
た３つのトリプシンペプチドから得られたアミノ酸配列
をもとに構築された１７-merオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズする能力を有するかどうかについて検査した
(１７)。
【００２３】すなわち、ゲル濾過、クロマトフォーカス
処理(chromatofocusing)、およびＴＳＫ ３０００ ＳＷ
カラムによる高速液体タンパククロマトグラフィー、次
いで高速逆相液体クロマトグラフィーによってＤer p
１を単離した。標準的な技術(９)によって還元、カルボ
キシメチル化およびトリプシン消化を行い、Ａが１０m
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4(pＨ６.５)でありＢがアセトニトリルで
ある０〜６０％Ａ-Ｂの直線勾配液およびブラウンリー
(Ｂrownlee) Ｂu-３００カラムを用いたＨＰＬＣによっ
てペプチドを単離した。アプライド・バイオシステムズ
(Ａpplied Ｂiosystems)(モデル４７０Ａ)気相配列決定
装置によってアミノ酸配列を決定した(９)。アプライド
・バイオシステム・モデル３７０Ａ合成器を用いてオリ
ゴヌクレオチドを合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製し
た。ハイブリダイゼーションに関して、ＤＮＡ ２０ピ
コモルおよび１４００Ｃi／ミリモルのγ-３２Ｐ-ＡＴ
Ｐ ２０ピコモルを用い、ポリヌクレオチドキナーゼ(プ
ロメガ・バイオテック)によってオリゴヌクレオチドを
標識化した(１０)。１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって、標識化したオリゴヌクレオチドを精製し
た。ニトロセルロース[シュライヒャー(Schleicher)お
よびシュール(Schull)、ダゼル、西ドイツ]上にプラー
クを拾い上げ、変性させ、焼いた(１０)。６×塩化ナト
リウム・クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)(pＨ７)(１０)、
０.１％ＳＤＳ中、３７℃、１０6cpm／mlでハイブリダ
イゼーションを一晩行い、０.１％トリトン(Ｔriton)Ｘ
−１００を含有する６×ＳＳＣ中、３７℃で１時間洗浄
した。
処理(chromatofocusing)、およびＴＳＫ ３０００ ＳＷ
カラムによる高速液体タンパククロマトグラフィー、次
いで高速逆相液体クロマトグラフィーによってＤer p
１を単離した。標準的な技術(９)によって還元、カルボ
キシメチル化およびトリプシン消化を行い、Ａが１０m
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4(pＨ６.５)でありＢがアセトニトリルで
ある０〜６０％Ａ-Ｂの直線勾配液およびブラウンリー
(Ｂrownlee) Ｂu-３００カラムを用いたＨＰＬＣによっ
てペプチドを単離した。アプライド・バイオシステムズ
(Ａpplied Ｂiosystems)(モデル４７０Ａ)気相配列決定
装置によってアミノ酸配列を決定した(９)。アプライド
・バイオシステム・モデル３７０Ａ合成器を用いてオリ
ゴヌクレオチドを合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製し
た。ハイブリダイゼーションに関して、ＤＮＡ ２０ピ
コモルおよび１４００Ｃi／ミリモルのγ-３２Ｐ-ＡＴ
Ｐ ２０ピコモルを用い、ポリヌクレオチドキナーゼ(プ
ロメガ・バイオテック)によってオリゴヌクレオチドを
標識化した(１０)。１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって、標識化したオリゴヌクレオチドを精製し
た。ニトロセルロース[シュライヒャー(Schleicher)お
よびシュール(Schull)、ダゼル、西ドイツ]上にプラー
クを拾い上げ、変性させ、焼いた(１０)。６×塩化ナト
リウム・クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)(pＨ７)(１０)、
０.１％ＳＤＳ中、３７℃、１０6cpm／mlでハイブリダ
イゼーションを一晩行い、０.１％トリトン(Ｔriton)Ｘ
−１００を含有する６×ＳＳＣ中、３７℃で１時間洗浄
した。
【００２４】ゲノムＤＮＡの単離 改良グアニジウム-ＨＣl／塩化セシウム(ＣsＣl)法(１
５)によってダニゲノムＤＮＡの抽出を行った。液体窒
素および砂の存在下、生きているダニ１０gを粉砕し、
ペーストを形成した。次いで、０.１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５.２)に入れた６Ｍグアニジン・塩酸塩８ml
を添加し、混合物をホモジナイズし、ソーバル(Ｓorva
l) ＳＳ３４ローター中、１０,０００rpmで３０分間回
転させた。上清を回収し、ＣsＣlパッド(１０mＭ ＥＤ
ＴＡ中、４.８Ｍ ＣsＣl ５ml)上に積層し、ＳＷ４１
Ｔ１ローター[ベックマン・インストゥルメンツ・イン
コーポレイテッド(Ｂeckman Ｉnstruments,Ｉnc.)、フ
ラートン、カリフォルニア]中、１５℃で１６時間、３
７,０００rpmで遠心分離した。相内のＤＮＡバンドを回
収し、１０mＭトリス(Ｔris)ＨＣl／１mＭ ＥＤＴＡ緩
衝液(pＨ８.０)中、１：１５に希釈した。標準的な方法
によって、ＣsＣl中のゲノムＤＮＡのバンディングを行
った。
５)によってダニゲノムＤＮＡの抽出を行った。液体窒
素および砂の存在下、生きているダニ１０gを粉砕し、
ペーストを形成した。次いで、０.１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液(pＨ５.２)に入れた６Ｍグアニジン・塩酸塩８ml
を添加し、混合物をホモジナイズし、ソーバル(Ｓorva
l) ＳＳ３４ローター中、１０,０００rpmで３０分間回
転させた。上清を回収し、ＣsＣlパッド(１０mＭ ＥＤ
ＴＡ中、４.８Ｍ ＣsＣl ５ml)上に積層し、ＳＷ４１
Ｔ１ローター[ベックマン・インストゥルメンツ・イン
コーポレイテッド(Ｂeckman Ｉnstruments,Ｉnc.)、フ
ラートン、カリフォルニア]中、１５℃で１６時間、３
７,０００rpmで遠心分離した。相内のＤＮＡバンドを回
収し、１０mＭトリス(Ｔris)ＨＣl／１mＭ ＥＤＴＡ緩
衝液(pＨ８.０)中、１：１５に希釈した。標準的な方法
によって、ＣsＣl中のゲノムＤＮＡのバンディングを行
った。
【００２５】λgt１１ p１ cＤＮＡクローンからＤＮＡ
の単離 迅速な単離方法によって、λgt１１ p１ クローン由来
のファージＤＮＡを調製した。透明なファージプレート
リゼイト(１ml)と、２.５Ｍ ＮaＣlに入れた２５重量／
容量％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ６０００)２７０
μLとを混合し、室温で１５分間インキュベートした。
次いで、混合物をマイクロヒュージ[エッペンドルフ(Ｅ
ppendorf)、ドイツ連邦共和国]中で５分間回転させ、上
清を除去した。このペレットを、１mＭ ＥＤＴＡおよび
１００mＭ ＮaＣlを含有する１０mＭ トリス／ＨＣl(p
Ｈ８.０)１００μＬに溶解した。このＤＮＡ調製物をフ
ェノール／クロロホルム(１：１)で３回抽出し、ＤＮＡ
をエタノールによって沈澱させた。
の単離 迅速な単離方法によって、λgt１１ p１ クローン由来
のファージＤＮＡを調製した。透明なファージプレート
リゼイト(１ml)と、２.５Ｍ ＮaＣlに入れた２５重量／
容量％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ６０００)２７０
μLとを混合し、室温で１５分間インキュベートした。
次いで、混合物をマイクロヒュージ[エッペンドルフ(Ｅ
ppendorf)、ドイツ連邦共和国]中で５分間回転させ、上
清を除去した。このペレットを、１mＭ ＥＤＴＡおよび
１００mＭ ＮaＣlを含有する１０mＭ トリス／ＨＣl(p
Ｈ８.０)１００μＬに溶解した。このＤＮＡ調製物をフ
ェノール／クロロホルム(１：１)で３回抽出し、ＤＮＡ
をエタノールによって沈澱させた。
【００２６】ＤＮＡハイブリダイゼーション ニック翻訳によって32Ｐで核酸を放射性標識化した(１
０)。供給者によって推奨された条件を用いて、適切な
制限酵素でＤＮＡ試料を消化した。ゼータ-プローブ(Ｚ
eta-Ｐrobe)膜[バイオ-ラッド・ラボラトリーズ(Ｂio-
Ｒad Ｌaboratories)、リッチモンド、カリフォルニア]
を用いてサザーン・ブロットを作成した。製造者の推奨
に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイ
ゼーション、ポストハイブリダイゼーション洗浄を行っ
た(ブレチン１２３４、バイオ-ラッド・ラボラトリー
ズ)。
０)。供給者によって推奨された条件を用いて、適切な
制限酵素でＤＮＡ試料を消化した。ゼータ-プローブ(Ｚ
eta-Ｐrobe)膜[バイオ-ラッド・ラボラトリーズ(Ｂio-
Ｒad Ｌaboratories)、リッチモンド、カリフォルニア]
を用いてサザーン・ブロットを作成した。製造者の推奨
に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイ
ゼーション、ポストハイブリダイゼーション洗浄を行っ
た(ブレチン１２３４、バイオ-ラッド・ラボラトリー
ズ)。
【００２７】クローニングおよびＤＮＡ配列 クローンλgt１１ p １からプラスミドpＵＣ８へ、０.
８kb cＤＮＡ挿入物をクローンするために、ＥcoＲＩ制
限酵素でファージＤＮＡを消化し、次いで、ＥcoＲＩ消
化pＵＣ８ ＤＮＡにライゲートし、大腸菌ＪＭ８３を形
質転換するために用いた。得られた組換えプラスミドを
pＨＤＭ １と命名した。
８kb cＤＮＡ挿入物をクローンするために、ＥcoＲＩ制
限酵素でファージＤＮＡを消化し、次いで、ＥcoＲＩ消
化pＵＣ８ ＤＮＡにライゲートし、大腸菌ＪＭ８３を形
質転換するために用いた。得られた組換えプラスミドを
pＨＤＭ １と命名した。
【００２８】ＤＮＡ配列分析用のクローンを得るため
に、cＤＮＡ挿入物をpＨＤＭ １から単離し、Ｍ１３か
ら誘導された配列決定用ベクターmp１８およびmp１９と
ライゲートした(１６)。大腸菌ＪＭ１０７を用いて形質
転換を行い、ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止反応法
によって配列決定を行った(１１)。
に、cＤＮＡ挿入物をpＨＤＭ １から単離し、Ｍ１３か
ら誘導された配列決定用ベクターmp１８およびmp１９と
ライゲートした(１６)。大腸菌ＪＭ１０７を用いて形質
転換を行い、ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止反応法
によって配列決定を行った(１１)。
【００２９】結果 いくつかのファージクローンがウサギの抗Ｄer p Ｉ血
清と反応し、３つのオリゴヌクレオチドプローブ全てと
ハイブリダイズした。これらのうちの一つ、λgt１１ p
１(１３Ｔ)をさらに研究した。このクローン、λgt１１
p１からのcＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を、図３
に示す配列決定ストラテジーを用いて決定した。完全な
配列は８５７塩基の長さであり、６９塩基の長さの５'
近接末端配列、推定分子量が２５,３７１である２２２
アミノ酸からなる完全な天然Ｄerp Ｉタンパクの暗号領
域(coding region)、８９塩基の長さの３'非暗号領域お
よび３３残基のポリ(Ａ)尾部を含んでいることがわかっ
た(図１および図２)。
清と反応し、３つのオリゴヌクレオチドプローブ全てと
ハイブリダイズした。これらのうちの一つ、λgt１１ p
１(１３Ｔ)をさらに研究した。このクローン、λgt１１
p１からのcＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を、図３
に示す配列決定ストラテジーを用いて決定した。完全な
配列は８５７塩基の長さであり、６９塩基の長さの５'
近接末端配列、推定分子量が２５,３７１である２２２
アミノ酸からなる完全な天然Ｄerp Ｉタンパクの暗号領
域(coding region)、８９塩基の長さの３'非暗号領域お
よび３３残基のポリ(Ａ)尾部を含んでいることがわかっ
た(図１および図２)。
【００３０】Ｄer p ＩのＮＨ2末端アミノ酸としての位
置１にあるトレオニン残基の帰属は、ダニの排泄物から
単離した純粋なタンパクのＮＨ2末端アミノ酸配列によ
って得られたデーターに基づいた(１７)。予想したアミ
ノ酸配列は、ＮＨ2末端領域のアミノ酸配列分析によっ
て得られたデータ、およびトリプシンペプチドの分析に
よって得られた内部の配列と一致した(図１および図
２)。完全な成熟タンパクは、ヌクレオチド位置７３６
〜７３８のＴＡＡ停止コドンで終る単一のオープンリー
ディングフレームによってコードされている。現在、ヌ
クレオチド位置１６〜１８の第１ＡＴＧコドンが翻訳開
始コドンであるかどうかは確かではない。これは、この
ＡＴＧコドンに隣接している配列(ＴＴＧＡＴＧＡ)が真
核性翻訳開始部位に関するコザック・コンセンサス配列
(Ｋozak consenses sequence)(ＡＣＣＡＴＧＧ)と相同
性がないからである。また、５'近接末端配列は、典型
的なシグナルペプチド配列をコードしていない(以下、
参照)。
置１にあるトレオニン残基の帰属は、ダニの排泄物から
単離した純粋なタンパクのＮＨ2末端アミノ酸配列によ
って得られたデーターに基づいた(１７)。予想したアミ
ノ酸配列は、ＮＨ2末端領域のアミノ酸配列分析によっ
て得られたデータ、およびトリプシンペプチドの分析に
よって得られた内部の配列と一致した(図１および図
２)。完全な成熟タンパクは、ヌクレオチド位置７３６
〜７３８のＴＡＡ停止コドンで終る単一のオープンリー
ディングフレームによってコードされている。現在、ヌ
クレオチド位置１６〜１８の第１ＡＴＧコドンが翻訳開
始コドンであるかどうかは確かではない。これは、この
ＡＴＧコドンに隣接している配列(ＴＴＧＡＴＧＡ)が真
核性翻訳開始部位に関するコザック・コンセンサス配列
(Ｋozak consenses sequence)(ＡＣＣＡＴＧＧ)と相同
性がないからである。また、５'近接末端配列は、典型
的なシグナルペプチド配列をコードしていない(以下、
参照)。
【００３１】ヌクレオチド分析によって予想されるアミ
ノ酸配列を図１および図２に示す。タンパクのデータ-
ベースを調査することによって、Ｄer p Ｉアミノ酸配
列がシステインプロテアーゼ群との一致を示すことがわ
かった。以前のcＤＮＡ研究によって、リゾソームカテ
プシンＢ、マウスマクロファージプロテアーゼおよびア
メーバーからのシステインプロテアーゼが一時的なプレ
-およびプロ型中間体を有することがわかり(１９〜２
１)、λgt１１ p１ cＤＮＡクローンの５'近接末端のア
ミノ酸配列の検査によって、Ｄer p Ｉが類似している
かもしれないことが示唆される。まず、成熟タンパク配
列の前にある配列の親水性部分(２２)が、シグナルペプ
チドの特徴的な疎水性領域を欠いており(２３)、第２
に、シグナルペプチダーゼ開裂部位の前にある最もよく
ある配列、Ａla−Ｘ−Ａla配列(２４、２５)が位置−１
３、−１４、−１５にある(図１)。従って、プロ-Ｄer
p Ｉ配列とプレ-Ｄer p Ｉ配列の間の開裂はＡla(−１
３)とＰhe(−１２)との間で起こると考えられる。すな
わち、プロ-Ｄer p Ｉ配列は、残基Ｐhe(−１２)で始ま
り、残基Ｇlu(−１)で終わる。故に、番号−１３〜−２
３のアミノ酸残基は、部分的なシグナルペプチド配列に
対応するのであろう。
ノ酸配列を図１および図２に示す。タンパクのデータ-
ベースを調査することによって、Ｄer p Ｉアミノ酸配
列がシステインプロテアーゼ群との一致を示すことがわ
かった。以前のcＤＮＡ研究によって、リゾソームカテ
プシンＢ、マウスマクロファージプロテアーゼおよびア
メーバーからのシステインプロテアーゼが一時的なプレ
-およびプロ型中間体を有することがわかり(１９〜２
１)、λgt１１ p１ cＤＮＡクローンの５'近接末端のア
ミノ酸配列の検査によって、Ｄer p Ｉが類似している
かもしれないことが示唆される。まず、成熟タンパク配
列の前にある配列の親水性部分(２２)が、シグナルペプ
チドの特徴的な疎水性領域を欠いており(２３)、第２
に、シグナルペプチダーゼ開裂部位の前にある最もよく
ある配列、Ａla−Ｘ−Ａla配列(２４、２５)が位置−１
３、−１４、−１５にある(図１)。従って、プロ-Ｄer
p Ｉ配列とプレ-Ｄer p Ｉ配列の間の開裂はＡla(−１
３)とＰhe(−１２)との間で起こると考えられる。すな
わち、プロ-Ｄer p Ｉ配列は、残基Ｐhe(−１２)で始ま
り、残基Ｇlu(−１)で終わる。故に、番号−１３〜−２
３のアミノ酸残基は、部分的なシグナルペプチド配列に
対応するのであろう。
【００３２】８５７-bp cＤＮＡ挿入物を放射能標識化
し、家塵埃ダニからのＥcoＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザ
ーンブロットに対してハイブリダイズし、１.５、０.５
および０.３５kbのバンドに対するハイブリダイゼーシ
ョンが見られた(データーは示さない)。cＤＮＡ挿入物
の制限酵素地図に示すように(図３)、内部ＥcoＲＩ部位
がなく、観察された複数のハイブリダイゼーションバン
ドは、Ｄer p Ｉが非隣接遺伝子によってコードされて
いることを示唆している。ハイブリダイゼーションが全
長２.４kbを有するフラグメントに限られているので、
この結果はまた、遺伝子重複の形跡が少ないことを示し
ている。
し、家塵埃ダニからのＥcoＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザ
ーンブロットに対してハイブリダイズし、１.５、０.５
および０.３５kbのバンドに対するハイブリダイゼーシ
ョンが見られた(データーは示さない)。cＤＮＡ挿入物
の制限酵素地図に示すように(図３)、内部ＥcoＲＩ部位
がなく、観察された複数のハイブリダイゼーションバン
ドは、Ｄer p Ｉが非隣接遺伝子によってコードされて
いることを示唆している。ハイブリダイゼーションが全
長２.４kbを有するフラグメントに限られているので、
この結果はまた、遺伝子重複の形跡が少ないことを示し
ている。
【００３３】Ｎ-末端は、デルマトファゴイデス・ファ
リナーエ(Ｄer f １)からの等価のタンパクのＮ-末端と
比較することができる(１２)。比較に使用することがで
きる配列の１１／２０の位置において同一性がある(図
４)。
リナーエ(Ｄer f １)からの等価のタンパクのＮ-末端と
比較することができる(１２)。比較に使用することがで
きる配列の１１／２０の位置において同一性がある(図
４)。
【００３４】λgt１１ p１(１３Ｔ)によって産生される
タンパクを試験するために、Ｙ１０８９(r−)をファー
ジで溶原化し、この細菌を３０℃でブロス培養物中で増
殖させた。温度切替えおよびイソプロピルチオガラクト
ピラノシド(ＩＰＴＧ)によってファージを誘導し(６)、
培養物の容量の１／２０になるようにバクテリアをＰＢ
Ｓ中に懸濁させて、抗原調製のために音波処理した。
７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって試験して、
λgt１１ p１(１３Ｔ)がＭr １１６Ｋ β−ガラクトシ
ダーゼバンドを生じず、代わりに、２４kＤa部分に相当
するＤer p Ｉとの融合タンパクと一致する１４０Ｋ バ
ンドを生じたことがわかった(６)。ウサギ抗Ｄer p Ｉ
がλgt１１ p１(１３Ｔ)からのリゼイトと反応すること
がわかった(図５)。
タンパクを試験するために、Ｙ１０８９(r−)をファー
ジで溶原化し、この細菌を３０℃でブロス培養物中で増
殖させた。温度切替えおよびイソプロピルチオガラクト
ピラノシド(ＩＰＴＧ)によってファージを誘導し(６)、
培養物の容量の１／２０になるようにバクテリアをＰＢ
Ｓ中に懸濁させて、抗原調製のために音波処理した。
７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって試験して、
λgt１１ p１(１３Ｔ)がＭr １１６Ｋ β−ガラクトシ
ダーゼバンドを生じず、代わりに、２４kＤa部分に相当
するＤer p Ｉとの融合タンパクと一致する１４０Ｋ バ
ンドを生じたことがわかった(６)。ウサギ抗Ｄer p Ｉ
がλgt１１ p１(１３Ｔ)からのリゼイトと反応すること
がわかった(図５)。
【００３５】実施例２ アレルギー性血清からのＩgＥと反応性のあるＤer p Ｉ
cＤＮＡ産物の発現 Ｄer p Ｉをコードしているλgt１１ p１(１３Ｔ)から
のＤＮＡ挿入物を、これをグルタチオントランスフェラ
ーゼ分子との融合物として発現することができるプラス
ミド発現ベクター(pＧＥＸ)のＥcoＲＩ部位にサブクロ
ーンした(２６)。このプラスミドpＧＥＸ-p１(１３Ｔ)
またはベクターだけで感染した大腸菌を対数増殖させ、
遠心分離によって集めた。細菌を、培養物の容量の１／
２０になるようにＰＢＳ中に懸濁させ、凍結-解凍によ
って溶菌した。リゼイトは、ジドデシル硫酸ナトリウム
・ポリアクリルアミド電気泳動によって、予期されたＭ
r５０,０００を有する高濃度の融合タンパクを発現する
ことがわかった。次いで、これらのリゼイトを、トーマ
ス(Ｔomas)およびロッシィ(Ｒossi)によって開示された
方法(２７)によって行うラジオイムノ・ドット-ブロッ
トによって、アレルギー性血清からのＩgＥと反応する
ことができる能力を有するかについて試験した。ダニア
レルギー性であることが知られている患者または非アレ
ルギー性対照から血清を採取した。125Ｉ-モノクローナ
ル抗ＩgＥおよびオートラジオグラフィーによって反応
性を調べた。図６には、pＧＥＸ-p１(１３Ｔ)からのリ
ゼイトはアレルギー性血清中のＩgＥと反応するがベク
ター対照は反応せず、また前者は非アレルギー性血清と
は反応しないことを示す。
cＤＮＡ産物の発現 Ｄer p Ｉをコードしているλgt１１ p１(１３Ｔ)から
のＤＮＡ挿入物を、これをグルタチオントランスフェラ
ーゼ分子との融合物として発現することができるプラス
ミド発現ベクター(pＧＥＸ)のＥcoＲＩ部位にサブクロ
ーンした(２６)。このプラスミドpＧＥＸ-p１(１３Ｔ)
またはベクターだけで感染した大腸菌を対数増殖させ、
遠心分離によって集めた。細菌を、培養物の容量の１／
２０になるようにＰＢＳ中に懸濁させ、凍結-解凍によ
って溶菌した。リゼイトは、ジドデシル硫酸ナトリウム
・ポリアクリルアミド電気泳動によって、予期されたＭ
r５０,０００を有する高濃度の融合タンパクを発現する
ことがわかった。次いで、これらのリゼイトを、トーマ
ス(Ｔomas)およびロッシィ(Ｒossi)によって開示された
方法(２７)によって行うラジオイムノ・ドット-ブロッ
トによって、アレルギー性血清からのＩgＥと反応する
ことができる能力を有するかについて試験した。ダニア
レルギー性であることが知られている患者または非アレ
ルギー性対照から血清を採取した。125Ｉ-モノクローナ
ル抗ＩgＥおよびオートラジオグラフィーによって反応
性を調べた。図６には、pＧＥＸ-p１(１３Ｔ)からのリ
ゼイトはアレルギー性血清中のＩgＥと反応するがベク
ター対照は反応せず、また前者は非アレルギー性血清と
は反応しないことを示す。
【００３６】実施例３ Ｄer p ＩをコードするcＤＮＡクローンからの産物での
処理によるＤer p Ｉに対するＩgＥ抗体応答の抑制 λgt１１ p１(１３Ｔ)によって溶原化した大腸菌を増殖
させ、温度切替えによって誘導し、２４kd Ｄer p Ｉ部
分と１１６kd β−ガラクトシダーゼ部分(p１(１３Ｔ))
に一致する組換え融合タンパクを産生させた(２８)。こ
のタンパクは、ほとんど不溶性であり、純度約９０％
(ナトリウム・ジドデシル・ポリアクリルアミド電気泳
動、分画遠心分離によって判断した)まで単離すること
ができた。別のgt１１ cＤＮＡダニクローンλgt pＸ
(２c)から類似のタンパクを産生した。組換えタンパク
がＤer p Ｉに対するＩgＥ抗体応答を変えることができ
るかどうかを試験をするために、p１(１３Ｔ)またはpＸ
(２c)融合タンパク２mgを１群４〜５匹のＣＢＡマウス
に腹腔内注射し、２日後、水酸化アルミニウムゲルに入
れた天然のＤer p Ｉ(ダニ培養培地から得た)５μgの皮
下注射をした。３週間後および６週間後に、受身皮膚ア
ナフィラキシー(ＰＣＡ)によってＩgＥ抗体力価を測定
した。これらの応答に関する方法およびバックグランド
データは、スチュワート(Ｓtewart)およびホルト(Ｈol
t)によって開示されている(２９)。特異性対照として、
p１(１３Ｔ)またはpＸ(２c)を注射した一群のマウス
に、ミョウバンに入れた卵アルブミン１０μgを注射し
た。p１(１３Ｔ)またはpＸ(２c)による前処理なしのマ
ウスと応答を比較した(表１)。３週間後、組換えタンパ
クを注射されなかったマウスおよび対照pＸ(２c)を注射
されたマウスは、検出可能な抗Ｄer p Ｉ ＰＣＡ力価
(１／２またはそれ以上)を有していた。組換えp１(１３
Ｔ)で処理したマウスの１／５だけが検出可能な力価を
有し、これは、両対照グループの全ての力価よりも１／
４低かった。６週目の全てのグループの力価は低いかま
たは存在しなかった(示さない)。卵アルブミンに対する
ＰＣＡ応答は、組換えタンパクでの処理の影響をあまり
受けなかった。これらのデータは、組換えタンパクが脱
感作剤として必要とされる、ＩgＥ応答を特異的に減少
させる能力を有することを示す。
処理によるＤer p Ｉに対するＩgＥ抗体応答の抑制 λgt１１ p１(１３Ｔ)によって溶原化した大腸菌を増殖
させ、温度切替えによって誘導し、２４kd Ｄer p Ｉ部
分と１１６kd β−ガラクトシダーゼ部分(p１(１３Ｔ))
に一致する組換え融合タンパクを産生させた(２８)。こ
のタンパクは、ほとんど不溶性であり、純度約９０％
(ナトリウム・ジドデシル・ポリアクリルアミド電気泳
動、分画遠心分離によって判断した)まで単離すること
ができた。別のgt１１ cＤＮＡダニクローンλgt pＸ
(２c)から類似のタンパクを産生した。組換えタンパク
がＤer p Ｉに対するＩgＥ抗体応答を変えることができ
るかどうかを試験をするために、p１(１３Ｔ)またはpＸ
(２c)融合タンパク２mgを１群４〜５匹のＣＢＡマウス
に腹腔内注射し、２日後、水酸化アルミニウムゲルに入
れた天然のＤer p Ｉ(ダニ培養培地から得た)５μgの皮
下注射をした。３週間後および６週間後に、受身皮膚ア
ナフィラキシー(ＰＣＡ)によってＩgＥ抗体力価を測定
した。これらの応答に関する方法およびバックグランド
データは、スチュワート(Ｓtewart)およびホルト(Ｈol
t)によって開示されている(２９)。特異性対照として、
p１(１３Ｔ)またはpＸ(２c)を注射した一群のマウス
に、ミョウバンに入れた卵アルブミン１０μgを注射し
た。p１(１３Ｔ)またはpＸ(２c)による前処理なしのマ
ウスと応答を比較した(表１)。３週間後、組換えタンパ
クを注射されなかったマウスおよび対照pＸ(２c)を注射
されたマウスは、検出可能な抗Ｄer p Ｉ ＰＣＡ力価
(１／２またはそれ以上)を有していた。組換えp１(１３
Ｔ)で処理したマウスの１／５だけが検出可能な力価を
有し、これは、両対照グループの全ての力価よりも１／
４低かった。６週目の全てのグループの力価は低いかま
たは存在しなかった(示さない)。卵アルブミンに対する
ＰＣＡ応答は、組換えタンパクでの処理の影響をあまり
受けなかった。これらのデータは、組換えタンパクが脱
感作剤として必要とされる、ＩgＥ応答を特異的に減少
させる能力を有することを示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】２日前にマウスに前注射し、０日目にＤer
p Ｉまたは卵アルブミンで免疫した。２１および４２
日目に、ラット皮膚でのＰＣＡによって血清抗体力価を
測定した。４２日目には有意な抗Ｄer p Ｉ力価は検出
されなかった(示さない)。グループ１〜３についてはＤ
er p Ｉについて、そしてグループ４〜６については卵
アルブミンについてＰＣＡを測定した。組換えＤer p
Ｉ p１(１３Ｔ)で前処理をすると、抗Ｄer p Ｉ力価は
低かった(p＜０.００１)*。*マン・ホワイトネイ(Ｍann
Ｗhitney)分析。
p Ｉまたは卵アルブミンで免疫した。２１および４２
日目に、ラット皮膚でのＰＣＡによって血清抗体力価を
測定した。４２日目には有意な抗Ｄer p Ｉ力価は検出
されなかった(示さない)。グループ１〜３についてはＤ
er p Ｉについて、そしてグループ４〜６については卵
アルブミンについてＰＣＡを測定した。組換えＤer p
Ｉ p１(１３Ｔ)で前処理をすると、抗Ｄer p Ｉ力価は
低かった(p＜０.００１)*。*マン・ホワイトネイ(Ｍann
Ｗhitney)分析。
【００３９】実施例４ λgt１１ p１(１３Ｔ)からのcＤＮＡのフラグメントに
よるＤer p Ｉ抗原決定因子の発現 Ｄer p Ｉをコードしているλgt１１ (１３Ｔ)からのc
ＤＮＡを、音波処理によってフラグメント化した。この
フラグメント(さまざまなサイズ範囲で)を電気泳動によ
って単離し、クレノウ(Ｋlenow)反応によって充填し
て、平滑末端を作成した。ＥcoＩリンカーを付着させ、
フラグメントライブラリーをλgt１１にクローンした。
フラグメントをクローニングするために用いられる方法
は、cＤＮＡクローニングに用いられる方法と同じであ
った(６)。ウサギ抗Ｄer p Ｉでスクリーニングするた
めにプラークイムノアッセイを用いた。抗血清と反応す
る３つのファージクローンを単離し、クローンしたフラ
グメントのオリゴヌクレオチド配列を得た。これらのう
ちの２つは、Ｄer p Ｉアミノ酸１７〜５５(番号付けに
ついては図１を参照)をコードし、１つはアミノ酸７０
〜１００をコードすることがわかった。限定されたアレ
ルゲン性を有する分子は脱感作の安全性を増大するだろ
うから、このようなフラグメントは、いずれは、エピト
ープ反応性を決定するための診断試薬および治療用に有
用となろう。
よるＤer p Ｉ抗原決定因子の発現 Ｄer p Ｉをコードしているλgt１１ (１３Ｔ)からのc
ＤＮＡを、音波処理によってフラグメント化した。この
フラグメント(さまざまなサイズ範囲で)を電気泳動によ
って単離し、クレノウ(Ｋlenow)反応によって充填し
て、平滑末端を作成した。ＥcoＩリンカーを付着させ、
フラグメントライブラリーをλgt１１にクローンした。
フラグメントをクローニングするために用いられる方法
は、cＤＮＡクローニングに用いられる方法と同じであ
った(６)。ウサギ抗Ｄer p Ｉでスクリーニングするた
めにプラークイムノアッセイを用いた。抗血清と反応す
る３つのファージクローンを単離し、クローンしたフラ
グメントのオリゴヌクレオチド配列を得た。これらのう
ちの２つは、Ｄer p Ｉアミノ酸１７〜５５(番号付けに
ついては図１を参照)をコードし、１つはアミノ酸７０
〜１００をコードすることがわかった。限定されたアレ
ルゲン性を有する分子は脱感作の安全性を増大するだろ
うから、このようなフラグメントは、いずれは、エピト
ープ反応性を決定するための診断試薬および治療用に有
用となろう。
【００４０】実施例５ 主要なダニアレルゲンＤer p ＩＩをコードしているcＤ
ＮＡのクローニングおよび発現 前述のλgt１１におけるデルマトファゴイデス・プテロ
ニシヌスcＤＮＡライブラリーを、ニトロセルロースリ
フト(６)を用いてプラークラジオイムノアッセイによっ
てスクリーニングした。特異的抗血清を用いる代わりに
用いた血清は家塵埃ダニに対してアレルギー性であるヒ
トからのものであった。血清(１／２に希釈)を大腸菌で
吸収した。反応性を検出するため、125Ｉ標識化モノク
ローナル抗ＩgＥを用いた[２×１０6cpm／mlを有する３
０ng／ml(計数効率約３０％)]。１時間後、フィルター
を洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。この方法
を用いて、ヒトＩgＥと反応する４つのクローンを単離
した。それらがＤＮＡハイブリダイゼーションと関連し
ており、アレルギー性血清のパネルに対して同一の反応
性パターンを有することがわかった。図７には、アレル
ギー性血清(ＡＭ)(最上列)または非アレルギー性(ＷＴ)
に対するプラークラジオイムノアッセイにおけるＩgＥ
反応性を示す。ここで、クローン１、３および８は、ア
レルギー性血清に対してだけ、強く反応する。amp １セ
グメント(１列目にある)は、λgt１１ベクター対照であ
る。最下列は125Ｉブドウ球菌タンパクＡによって測定
されたウサギ抗Ｄer p Ｉによるイムノアッセイであ
り、有意な反応性は示さない。血清のパネルに対してク
ローンを試験した。ダニに対するアレルギーを有してい
ない５人の患者からの血清は反応しなかったが、ダニア
レルギーを有するヒトの１４／１７の血清は反応性を示
した。クローンλgt１１ pＩＩ(Ｃ１)からのＤＮＡ挿入
物を、Ｍ１３ mp１８およびＭ１３ mp１９にサブクロー
ンし、鎖成長停止反応法によって配列決定した。ヌクレ
オチド配列(図８および図９)によって、(ａ)Ｄer p Ｉ
ＩのＮ−末端アミノ酸の配列と残基１〜４０の推察され
るアミノ酸配列との相同性(３０)および(ｂ)デルマトフ
ァゴイデス・ファリナーエからの等価のＤer f ＩＩア
レルゲンとこの配列との相同性によって、このアレルゲ
ンがＤer p ＩＩであることがわかった。
ＮＡのクローニングおよび発現 前述のλgt１１におけるデルマトファゴイデス・プテロ
ニシヌスcＤＮＡライブラリーを、ニトロセルロースリ
フト(６)を用いてプラークラジオイムノアッセイによっ
てスクリーニングした。特異的抗血清を用いる代わりに
用いた血清は家塵埃ダニに対してアレルギー性であるヒ
トからのものであった。血清(１／２に希釈)を大腸菌で
吸収した。反応性を検出するため、125Ｉ標識化モノク
ローナル抗ＩgＥを用いた[２×１０6cpm／mlを有する３
０ng／ml(計数効率約３０％)]。１時間後、フィルター
を洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。この方法
を用いて、ヒトＩgＥと反応する４つのクローンを単離
した。それらがＤＮＡハイブリダイゼーションと関連し
ており、アレルギー性血清のパネルに対して同一の反応
性パターンを有することがわかった。図７には、アレル
ギー性血清(ＡＭ)(最上列)または非アレルギー性(ＷＴ)
に対するプラークラジオイムノアッセイにおけるＩgＥ
反応性を示す。ここで、クローン１、３および８は、ア
レルギー性血清に対してだけ、強く反応する。amp １セ
グメント(１列目にある)は、λgt１１ベクター対照であ
る。最下列は125Ｉブドウ球菌タンパクＡによって測定
されたウサギ抗Ｄer p Ｉによるイムノアッセイであ
り、有意な反応性は示さない。血清のパネルに対してク
ローンを試験した。ダニに対するアレルギーを有してい
ない５人の患者からの血清は反応しなかったが、ダニア
レルギーを有するヒトの１４／１７の血清は反応性を示
した。クローンλgt１１ pＩＩ(Ｃ１)からのＤＮＡ挿入
物を、Ｍ１３ mp１８およびＭ１３ mp１９にサブクロー
ンし、鎖成長停止反応法によって配列決定した。ヌクレ
オチド配列(図８および図９)によって、(ａ)Ｄer p Ｉ
ＩのＮ−末端アミノ酸の配列と残基１〜４０の推察され
るアミノ酸配列との相同性(３０)および(ｂ)デルマトフ
ァゴイデス・ファリナーエからの等価のＤer f ＩＩア
レルゲンとこの配列との相同性によって、このアレルゲ
ンがＤer p ＩＩであることがわかった。
【００４１】引用文献 １. Ford,A.W., Rawle,F.C., Lind,P., Spieksma,F.T.
M., Lowenstein,H., Platts-Mills,T.A.E. (1985). Sta
ndardisation of Dermatophagoides pteronyssinus. As
sessment of potency and allergen content in the co
ded extracts. Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 76 :
58-67. ２. Lind,P., Lowenstein,H. (1983). Identification
of allergens in Dermatophagoides pteronyssinus mit
e body extract by crossed radioimmunelectrophoresi
s with two different rabbit antibody pools. Scand.
J.Immunol. 17 :263-273. 3. Krilis,S., Baldo,B.A., Basten,A. (1984) Antigen
s and allergens from the common house dust mite De
rmatophagoides pteronyssinus Part ＩＩ. Identifica
tion of the major IgE binding antigens by crossed
radioimmunoelectrophoresis. J.Allergy Clin.Immuno
l. 74 : 142-146. 4. Tovey,E.R., Chapman,M.D., Platts-Mills,T.A.E.
(1981). Mite faeces area major source of house dus
t allergens. Nature 289 : 592-593. 5. Gubler,U., Hoffman,B.J. (1983) A simple and ver
y efficient method forgenerating cDNA libraries. G
ene 25 : 263-269. 6. Huynh,T.V., Young,R.A., Davis,R.W. Constructing
and screening cDNA libraries in λ10 and λgt11.
p48-78 in DNA Cloning Col.1, A practical approach.
Ed. D.M.Glover, IRL press. 7. Stewart,G.A., Thomas,W.R. (1987). In vitro tran
slationof messenger RNA from the house mite Dermat
ophagoides pteronyssinus. Int .Arch.Allergy Appl.Im
munol. 83:384-389. 8. Thomas,W.R., Rossi,A.A. (1986) Molecular clonin
g of DNA coding for outer membrane proteins of Hae
mophilus influenzae type b. Infection and Immunit
y. 52 : 812-817. 9. Simpson,R.J., Smith,J.A., Mortiz,R.L., O'Hare,
M.J., Rudland,P.S., Morrison,J.R., Lloyd,C.J., Gre
go,B., Burgess,A.W. and Nice,E.L. (1985) RatEpider
mal Growth Factor : Complete amino acid sequence.
Eur.J.Biochem. 153:629-637. 10. Maniatis,T., Fritsch,E.F., Sambrook,J. (1982)
Molecular cloning. A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory,. 11. Sanger,F.,Nicklen,S., Coulson,A.R. (1977). DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Pro
c.Natl.Acad.Sci. 74 : 5463-5467. 12. Heyman,P.W., Chapman,M.D., Platts-Mills,T.A.E.
(1986) Antigen Der f1 from the house dust mite De
rmatophagoides farinae : structural comparison wit
h Der p 1 from Dermatophagoides pteronyssinus and
epitope specificity of murine IgG and human IgE an
tibodies. J.Immunol. 137 : 2841-2847. 13. Voorhorst,R., Spieksma-Boezeman,M.I.A., and Sp
ieksma,F.Th.M. (1964). Is a mite (Dermatophagoides
sp) the producer of the housedust allergen. Aller
g.Asthma. 10 : 329. 14. Voorhorst,R., Spieksma,F.Th.M., Varekamp,H., L
eupen,M.J. and Lyklema,A.W., (1967). The house dus
t mite (Dermatophagoides pteronyssinus) andthe all
ergens it produces. Identity with the house dust a
llergen. J.Allergy. 39 : 325. 15. Stewart,G.A. and Thomas,W.R. (1987). In vitro
translation of messenger RNA from the house dust m
ite Dermatophagoides pteronyssinus. Int.Arch.Aller
gy Appl.Immunol. 83 : 384. 16. Messing,J. (1983). New M13 vectors for clonin
g. Methods Enzymol. 101: 20. 17. Stewart,G.A., Simpson,R.J., Thomas,W.R. and Tu
rner,K.J.(1986). The physicochemical characterisat
ion of a major protein allergen from the house dus
t mite, EP. Asian Pac.J.Allergy Immunol. 5 : 71. 18. Kozak,M. (1984). Compilation and analysis of s
equencesupstream from the translational start site
in eukaryotic mRNAs. Nucleic.Acids Res. 12 : 857. 19. San Sequndo,B., Chain,S.J. and Steiner,D.F. (1
985). Identification of cDNA clones encoding a pre
cursor of rat liver cathepsin B. Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA. 82 : 2320. 20. Portnoy,D.A., Erickson,A.H., Kochan,J., Ravetc
h,J.V. and Unkeless,J.C. (1986). Cloning and chara
cterization of a mouse cysteine proteinase.J.Biol.
Chem. 261 : 14697. 21. Williams,J.G., North,M.J. and Mahbubani,H. (19
85). A developmentallyregulated cysteine proteinas
e in Dictyostelium discoideum. EMBO(Eur.Mol.Biol.O
rgan.)J. 4 : 999. 22. Hopp,T.P. (1986). Protein surface analysis. Me
thod foridentifying antigenic determinants and oth
er interaction sites. J.Immunol.Methods. 88 : 1. 23. Von Heijne,G. (1984). Analysis of the distribu
tion of charged residues in the N-terminal region
of signal sequences: implications of proteinexport
in prokaryotic and eukaryotic cells. EMBO(Eur.Mo
l.Biol.Organ.)J.3 : 2315. 24. Ullrich,A., Shine,J., Chirgwin,J., Pictet,R.,
Tischer,E., Rutter,W.J. and Goodman,H.W. (1977). R
at insulin genes: Construction of plasmids contain
ing th coding sequnces. Science(Wash.DC) 196 : 131
3. 25. Carne,T. and Scheele,G.(1985). Cell Biology of
the Secretory Process. M.Cantin, editor. S.Karger
AG, Basel. 73. 26. Smith,D. and Johnson (1988), Gene (in press). 27. Thomas,W.R. and Rossi,A.A. (1986). Molecular c
loning of DNA coding for outer membrane proteins o
f Haemophilus influenzae Type b. Infection a nd Imm
unity 52 : 812-817. 28. Thomas,W.R., Stewart,G.A., Simpson,R.J., Chua,
K.Y., Plozza,T.M., Dilworth,Dr.U., Nisbet,A. and T
urner,K.J.(1987).Cloning and expression of DNA cod
ing for the major housedust mite allergen Der p I
in Escherichia coli. Int.Arch.Allergy Appl.Immuno
l. 85 : 127-129. 29. Stewart,G.A. and Holt,P.G. (1987). Immunogenic
ity and tolerogenicityof a major house dust mite a
llergen Der p I. Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 83
: 44-51. 31. Chapman,M.D., Heymann,P.W. and Platts-Mills,T.
A.E.(1987). Mite allergens 1. Epitope mapping of m
ajor dust mite(Dermatophagoides) allergens using m
onoclonal antibodies. Mite Allergy - A World Wide
Problem. Ed.A.L.deWeck and A.Todt. The UCB Institu
te of Allergy.
M., Lowenstein,H., Platts-Mills,T.A.E. (1985). Sta
ndardisation of Dermatophagoides pteronyssinus. As
sessment of potency and allergen content in the co
ded extracts. Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 76 :
58-67. ２. Lind,P., Lowenstein,H. (1983). Identification
of allergens in Dermatophagoides pteronyssinus mit
e body extract by crossed radioimmunelectrophoresi
s with two different rabbit antibody pools. Scand.
J.Immunol. 17 :263-273. 3. Krilis,S., Baldo,B.A., Basten,A. (1984) Antigen
s and allergens from the common house dust mite De
rmatophagoides pteronyssinus Part ＩＩ. Identifica
tion of the major IgE binding antigens by crossed
radioimmunoelectrophoresis. J.Allergy Clin.Immuno
l. 74 : 142-146. 4. Tovey,E.R., Chapman,M.D., Platts-Mills,T.A.E.
(1981). Mite faeces area major source of house dus
t allergens. Nature 289 : 592-593. 5. Gubler,U., Hoffman,B.J. (1983) A simple and ver
y efficient method forgenerating cDNA libraries. G
ene 25 : 263-269. 6. Huynh,T.V., Young,R.A., Davis,R.W. Constructing
and screening cDNA libraries in λ10 and λgt11.
p48-78 in DNA Cloning Col.1, A practical approach.
Ed. D.M.Glover, IRL press. 7. Stewart,G.A., Thomas,W.R. (1987). In vitro tran
slationof messenger RNA from the house mite Dermat
ophagoides pteronyssinus. Int .Arch.Allergy Appl.Im
munol. 83:384-389. 8. Thomas,W.R., Rossi,A.A. (1986) Molecular clonin
g of DNA coding for outer membrane proteins of Hae
mophilus influenzae type b. Infection and Immunit
y. 52 : 812-817. 9. Simpson,R.J., Smith,J.A., Mortiz,R.L., O'Hare,
M.J., Rudland,P.S., Morrison,J.R., Lloyd,C.J., Gre
go,B., Burgess,A.W. and Nice,E.L. (1985) RatEpider
mal Growth Factor : Complete amino acid sequence.
Eur.J.Biochem. 153:629-637. 10. Maniatis,T., Fritsch,E.F., Sambrook,J. (1982)
Molecular cloning. A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory,. 11. Sanger,F.,Nicklen,S., Coulson,A.R. (1977). DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Pro
c.Natl.Acad.Sci. 74 : 5463-5467. 12. Heyman,P.W., Chapman,M.D., Platts-Mills,T.A.E.
(1986) Antigen Der f1 from the house dust mite De
rmatophagoides farinae : structural comparison wit
h Der p 1 from Dermatophagoides pteronyssinus and
epitope specificity of murine IgG and human IgE an
tibodies. J.Immunol. 137 : 2841-2847. 13. Voorhorst,R., Spieksma-Boezeman,M.I.A., and Sp
ieksma,F.Th.M. (1964). Is a mite (Dermatophagoides
sp) the producer of the housedust allergen. Aller
g.Asthma. 10 : 329. 14. Voorhorst,R., Spieksma,F.Th.M., Varekamp,H., L
eupen,M.J. and Lyklema,A.W., (1967). The house dus
t mite (Dermatophagoides pteronyssinus) andthe all
ergens it produces. Identity with the house dust a
llergen. J.Allergy. 39 : 325. 15. Stewart,G.A. and Thomas,W.R. (1987). In vitro
translation of messenger RNA from the house dust m
ite Dermatophagoides pteronyssinus. Int.Arch.Aller
gy Appl.Immunol. 83 : 384. 16. Messing,J. (1983). New M13 vectors for clonin
g. Methods Enzymol. 101: 20. 17. Stewart,G.A., Simpson,R.J., Thomas,W.R. and Tu
rner,K.J.(1986). The physicochemical characterisat
ion of a major protein allergen from the house dus
t mite, EP. Asian Pac.J.Allergy Immunol. 5 : 71. 18. Kozak,M. (1984). Compilation and analysis of s
equencesupstream from the translational start site
in eukaryotic mRNAs. Nucleic.Acids Res. 12 : 857. 19. San Sequndo,B., Chain,S.J. and Steiner,D.F. (1
985). Identification of cDNA clones encoding a pre
cursor of rat liver cathepsin B. Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA. 82 : 2320. 20. Portnoy,D.A., Erickson,A.H., Kochan,J., Ravetc
h,J.V. and Unkeless,J.C. (1986). Cloning and chara
cterization of a mouse cysteine proteinase.J.Biol.
Chem. 261 : 14697. 21. Williams,J.G., North,M.J. and Mahbubani,H. (19
85). A developmentallyregulated cysteine proteinas
e in Dictyostelium discoideum. EMBO(Eur.Mol.Biol.O
rgan.)J. 4 : 999. 22. Hopp,T.P. (1986). Protein surface analysis. Me
thod foridentifying antigenic determinants and oth
er interaction sites. J.Immunol.Methods. 88 : 1. 23. Von Heijne,G. (1984). Analysis of the distribu
tion of charged residues in the N-terminal region
of signal sequences: implications of proteinexport
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te of Allergy.
【図１】 cＤＮＡ λgt １１ p１(１３Ｔ)のヌクレオ
チド配列および予想されるアミノ酸配列である。
チド配列および予想されるアミノ酸配列である。
【図２】 図１の続きである。cＤＮＡ λgt １１ p１
(１３Ｔ)のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸
配列を示す。
(１３Ｔ)のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸
配列を示す。
【図３】 クローンλgt１１ p１(１３Ｔ)のcＤＮＡ挿
入物の制限地図およびＤＮＡ配列決定のストラテジーを
示す図である。
入物の制限地図およびＤＮＡ配列決定のストラテジーを
示す図である。
【図４】 Ｄer p ＩとＤer f ＩとのＮ−末端配列の比
較を示す図である。
較を示す図である。
【図５】 抗Ｄer p １とλgt１１ p１(１３Ｔ)との反
応性を示すオートラジオグラフィーの結果を示す図であ
る。
応性を示すオートラジオグラフィーの結果を示す図であ
る。
【図６】 アレルギー性血清中のＩgＥとクローンpＧＥ
Ｘ−p１(１３Ｔ)との反応を示すラジオイムノアッセイ
の結果を示す図である。
Ｘ−p１(１３Ｔ)との反応を示すラジオイムノアッセイ
の結果を示す図である。
【図７】 プラークラジオイムノアッセイにおけるＤer
p ＩＩをコードするcＤＮＡクローンの血清反応性を示
す図である。
p ＩＩをコードするcＤＮＡクローンの血清反応性を示
す図である。
【図８】 λgt１１ pＩＩ(Ｃl)のcＤＮＡのヌクレオチ
ド配列および予想されるアミノ酸配列である。
ド配列および予想されるアミノ酸配列である。
【図９】 図８の続きである。λgt１１ pＩＩ(Ｃl)のc
ＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配
列を示す。
ＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配
列を示す。
【図１０】 Ｄer p ＩＩおよびＤer f ＩＩのＮ−末端
アミノ酸相同性を示す図である。
アミノ酸相同性を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェフリー・アレキサンダー・ステュワ ート オーストラリア国ウエスターン・オース トラリア6153、リーミング、アンスコウ ン・ループ25番 (72)発明者 ケブン・ジェイムス・ターナー オーストラリア国ウエスターン・オース トラリア6009、ダルケイス、アレキサン ダー・ロード43番 (72)発明者 リチャード・ジョン・シンプソン オーストラリア国ビクトリア3121、リッ チモンド、スタンリィ・ストリート42番 (56)参考文献 特表 平３−501920（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ，137（1986）ｐ．2841−2847 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ，125（1980）ｐ．587−592 Ａｓｉａｎ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊｏｕ ｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎ ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（1986) ｐ．71 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 39/00 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 図１および図２もしくは図８および図９
に示されたアミノ酸配列を有するデルマトファゴイデス
属タンパクアレルゲンの抗原性断片を含むペプチドをコ
ードする単離された核酸であって、該ペプチドは図１お
よび図２のアミノ酸残基１〜２２２および図８および図
９のアミノ酸残基１〜１２９に対応する成熟部分の全長
は含まない単離された核酸。 - 【請求項２】 図１および図２もしくは図８および図９
に示されたアミノ酸配列または図１および図２のアミノ
酸残基１〜２２２もしくは図８および図９のアミノ酸残
基１〜１２９に対応するその成熟部分を含むデルマトフ
ァゴイデス属の単離されたタンパクアレルゲンであっ
て、該タンパクアレルゲンが糖鎖を有しない、単離され
たタンパクアレルゲン。 - 【請求項３】 図１および図２または図８および図９に
示されたアミノ酸配列を有するデルマトファゴイデス属
のタンパクアレルゲンの抗原性断片を含む単離されたペ
プチドであって、合成により製造されるかまたは該ペプ
チドをコードする核酸によって形質転換された宿主細胞
中で組換え法により製造され、該ペプチドが糖鎖を有し
ない、単離されたペプチド。 - 【請求項４】 請求項２または３に記載の単離されたタ
ンパクアレルゲンまたはペプチドと、薬学的に許容し得
る担体とを含む、家塵埃ダニに対する感受性を処置する
ための組成物。 - 【請求項５】 請求項２または３に記載の単離されたタ
ンパクアレルゲンまたはペプチドと薬学的に許容し得る
担体とを含む、家塵埃ダニに対する感受性を診断するた
めの組成物。 - 【請求項６】 ＴまたはＢ細胞エピトープを含んでい
る、請求項３の単離されたペプチド。
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