JP3073997B2 - タンパク質の標識化 - Google Patents

タンパク質の標識化

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Description

【発明の詳細な説明】 従来の技術および解決するための課題 本発明は金属イオン、とりわけテクネチウムとレニウ
ム、を生物学上有用な分子に結合させることのできる二
官能性化合物に関する。
ある種の高分子（例えば、モノクローン抗体）は、イ
メージングおよび（または）治療を目的として放射性同
位体を特異的な生体内部位に向けるため使用されて来
た。診断用核医薬にテクネチウムの準安定同位体、99mT
cを使用することはよく確立されており、レニウムのベ
ーター線放出同位体、186Re,188Re,189Reは治療に使用
できる。テクネチウムを高分子に付ける幾つかの方法が
記載されて来た。これら方法のあるものは、高分子（普
通は免疫グロブリン）のジスルフイド基をチオールに還
元し、その後これらの基を用いて還元Tcを拘束する工程
を含む（例えば、McKenzie等、国際公報第WO87/04164号
およびBremer等、欧州特許第271,806A2号明細書）。こ
の型の方法は幾つかの潜在的欠点をもつ。ジスルフイド
単位を還元するとタンパク質を変性させることがあり、
その結果生物学的特異性を失なうかもしれない。また、
この方法はジスルフイド部分を欠く高分子の標識化には
使用できない。
別法として、DTPAのような二官能性キレートを経て
99mTcを高分子に結合させることもできる〔D.Lanteigne
およびD.J,Hnatowich,Int.J.Appl.Radiat.Isot.,35
（７）巻、617頁（1984）、キレート形成チオセミカル
バゾン類（Y.Arano等、Int.J.Nucl.Med.Biol.,12巻、42
5頁（1985）、およびジアミド−ジチオール配位子（A.F
ritzberg,欧州特許願第1882562A号明細書〕。これらの
方法に付随する問題は、テクネチウムがかなり非特異的
に結合すること（キレート形成基以外の部位でタンパク
に結合すること）およびTc標識化の速度が遅いことであ
る。
従つて本発明の目的は、ヒドラジン基またはヒドラジ
ド基およびタンパク質反応基を有し99mTcのような金属
イオンを高分子に結合するために使用できる新規二官能
性分子を提供することである。
本発明のもう一つの目的は高分子を金属イオンで標識
化する方法を提供することで、この方法によるとキレー
ト形成基以外の部位での金属の結合が最小となり、比較
的速い速度（室温で１時間未満）で標識化が起こる。
課題を解決するための手段 新規二官能性ヒドラジンおよびヒドラジド塩ならびに
その抱合体が本発明により提供される。抱合体を金属イ
オンで標識する方法も提供される。
一般に、タンパク質反応性置換基および負の対イオン
をもつ二官能性芳香族ヒドラジンまたはヒドラジドとし
てヒドラジンおよびヒドラジド化合物が本明細書に記載
されている。ヒドラジンまたはヒドラジド官能基を低級
アルキルヒドラゾンとして保護する本発明の変法も提供
する。
本発明のもう一つの具体例においては、本発明に係る
二官能性ヒドラジンまたはヒドラジド化合物を、タンパ
ク質、ポリペプチドまたは糖タンパク質のような高分子
と反応させることにより抱合体をつくる。二官能性化合
物は高分子の求核基（例えば、リジン残基）と反応して
遊離ヒドラジン／ヒドラジド基を含む抱合体を生成す
る。
三番目の具体例においては、抱合体と金属イオンとか
らなる標識した高分子をつくる。
四番目の具体例では、本発明に係る抱合体を金属種と
反応させることにより高分子を標識する方法が提供され
る。
本発明に係る新規ヒドラジンおよびヒドラジド化合物
は下記の式（Ｉ）あるいは（II）のいずれかにより表わ
される： 式中、 Ａは炭素または窒素原子であり、 Ｂは炭素または窒素原子であり、 Ｄは直接結合（環の２−位、３−位または４−位に対
する）、CH2,C＝Ｏ、あるいは であり、 ＥはＯ＝Ｏであり、あるいはＦと共にマレイミジル基
を形成し、 ＦはＥがＣ＝ＯかあるいはＥと共にマレイミジル基を
形成する場合、中性または塩基性水性媒質中で第１級ア
ミンにより容易に置換される基であり、 Ｒは水素または低級アルキル基であり、 Ｒ′とＲ″は同じものでも異なるものでもよく、そし
て水素および低級アルキルから選ばれ、 Ｘは負の対イオンである。
本発明のもう一つの具体例は式（III）： （式中、R,R′,R″,EおよびＦは前記の意味をもつ）で
表わされる化合物を包含する。
ＥがカルボニルＣ＝Ｏである場合、Ｆは付いているカ
ルボニル基と結合して活性エステルまたは活性アミドを
形成する基のいずれかである。Ｆに適した基の例にはＮ
−オキシスクシンイミジル、テトラフルオロフエノレー
ト、Ｎ−オキソベンゾトリアゾールおよびイミダゾレー
トといつた種々な基が包含される。これら例は本発明の
範囲を制限するものと解釈すべきでない。
R,R′およびＲ″に対して適した基には次の基、H,C
H3,C2H5,およびC3H7が含まれるがこれだけに制限されな
い。
有用なＸイオンの例はハロゲン化物、硝酸塩、トリフ
ルオロ酢酸塩、テトラフルオロホウ酸塩および硝酸塩で
ある。これら例は適当な対イオンの範囲を制限しようと
するものではない。
前記化合物は二つの交差反応性部位、即ちヒドラジン
／ヒドラジド基およびタンパク質反応性基、例えば活性
エステル、活性アミドまたはマレイミド基を含む分子の
安定な単離可能誘導体である。
これらの安定な誘導体の合成においては、ｔ−ブトキ
シカルボニル（ｔ−BOC）のような酸に不安定な保護基
を、無水の酸性条件下でヒドラジン／ヒドラジドから除
去して、未変化のタンパク質反応基と反応性のないプロ
トン化形のヒドラジン／ヒドラジド基とを残す。別法と
してヒドラジン／ヒドラジド基を低級アルキルヒドラゾ
ンとして保護することもできる。
プロトン化された（あるいはヒドラゾンとして保護さ
れた）ヒドラジン／ヒドラジド官能基をもつ二官能性化
合物を次に中性かやや塩基性の媒質（なるべくはpH約７
〜8.5）中で高分子、例えばタンパク質、ポリペプチ
ド、あるいは糖タンパク質と一緒にすると、化合物のタ
ンパク質反応性部分はタンパク質、ポリペプチドあるい
は糖タンパク質上の求核基（例えば、リジン残基のよう
なアミン基）と反応して遊離ヒドラジン／ヒドラジド基
を含む抱合体を生成するであろう。ヒドラゾン抱合体の
場合には、酸性（pH5.6）緩衝液中に透析することによ
り遊離ヒドラジン／ヒドラジドを生成させる。この型の
抱合体は強力な金属結合基であるヒドラジンまたはヒド
ラジドを含むので、酸性媒質中で適当な金属種と混合し
たとき容易に反応して標識されたタンパク質、ポリペプ
チドあるいは糖タンパク質を生ずるであろう。
金属種は、例えばキレート形成性酸素配位子（例え
ば、グルコヘプトネート）の存在下にTcO4 -を還元剤、
例えば第一スズイオンと反応させることにより生ずる還
元Tc種でよい。適当な還元Tc種の例にはTc−グルコヘプ
トネート、Tc−グルコネート、Tc−２−ヒドロキシイソ
ブチレート、Tc−ラクテートおよびTc−4,5−ジヒドロ
キシ1,3−ベンゼンジスルホネートが包含される。他の
金属および配位子も本発明の範囲内にある。
Tc標識化法は水性緩衝液中、なるべくは約4.5〜6.5の
pHで１時間未満で行なうのが便利である。他の適当な金
属種との反応も同様な条件下で同様に起こる。
Tcを使用して高性能液体クロマトグラフイー（HPLC）
および薄層クロマトグラフイー（TLC）により測定した
放射化学収率は90％である。結合不可能な類縁体（即
ち、タンパク質反応性カルボニル基をもたない化合物、
例えば４−ヒドラジノ安息香酸あるいは６−ヒドラジノ
ピリジン−３−カルボン酸）によるタンパク質処理は有
意なTc結合の可能なタンパク質を与えず、従つてこの技
術の高い特異性が実証される。
テクネチウム原子はヒドラジドあるいはジアゼニド結
合を経て抱合体に結合すると考えられる： 式中、Ｌは補助的二酸素配位子である。
この型の結合の例がMoおよびReに対し記述されている
〔Comprehensive Coordination Chemistry,2巻、G.Wilk
inson編,Pergamon（オツクスフオード）1987,130〜151
頁〕。また99Tcの幾つかの同様な錯体がオルガノヒドラ
ジン誘導体とTc（Ｖ）オキソ種との反応によりつくられ
た。
上記の標識化スキームを用いてポリクローンヒトIgG
およびヒトIgGのFc領域を標識した。Tc−抱合体を用い
てラツトモデルの感染焦点部位をイメージングした。ま
たこの標識化スキームを用いてフラグメントE1を標識化
し（L.C.Knight等、J.Clin.Invest.72巻、1983,2007〜2
013頁）（これは深部静脈血栓症に対する家兎モデルで
血栓を映像化するために用いた）およびモノクローン抗
体5E8を標識した。
例 例の中に示されたNMRとIRのデータは次のようにして
得た： 1H NMRスペクトルは80MHz IBM AF−80分光計で記録し
た。すべての1H NMRの結果は特に断らない限りDMSO−d6
で測定した。IRスペクトルはPerkin−Elmer598赤外分光
計で記録した。NMRおよびIRスペクトルは帰属した構造
と一致した。
種々な例中の表題化合物の下の角カツコ内に示した化
合物名はChemical Abstracts Service Indexの命名法に
従つた。反応をスキームをスキーム１〜スキーム８に示
してある。
例１ スクシンイミジル４−ヒドラジノベンゾエート塩酸塩
〔１−〔（４−ヒドラジノベンゾイル）オキシ〕−2,5
−ピロリジンジオン一塩酸塩〕の製造 ４−ヒドラジノ安息香酸、２−（ｔ−ブトキシカルボ
ニルオキシイミノ）−２−フエニルアセトニトリル（BO
C−ON）、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−
ヒドロキシスクシンイミドはAldrich Chemicals（ミル
ウオーキー，ウイスコンシン州）から購入した。
４−BOC−ヒドラジノ安息香酸の合成 ジメチルホルムアミド（5ml/g）中で４−ヒドラジノ
安息香酸（１当量）およびトリエチルアミン（３当量）
をかきまぜた溶液に、ジメチルホルムアミド中BOC−ON
（１当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で３時
間かきまぜた。10％塩酸水溶液を加えると、その後溶液
が混濁した。溶液を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機
抽出液を水洗し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過
し、減圧下で濃縮して褐色固体を得た。この固体をクロ
ロホルムから再結晶して望む生成物を淡褐色固体として
得た。収率69％。分析： C12H16N2O4に対する 計算値:C−57.13;H−6.39;N−11.10。
実測値:C−57.02;H−6.13;N−11.61。
1H NMRδ:1.45（s,9H）,6.77（d,Jab＝8.6Hz,2H）,7.
85（d,Jab＝8.6Hz,2H）。
スクシンイミジル４−BOC−ヒドラジノベンゾエート 〔ヒドラジンカルボン酸、２−〔４−〔〔（2,5−ジオ
キソ−１−ピロリジニル）オキシルカルボニル〕フエニ
ル〕−1,1−ジメチルエチルエステル〕の合成 ジオキサン（酸1gにつき10ml）中４−BOC−ヒドラジ
ン安息香酸（１当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（１当量）の溶液へ、ジオキサン（5ml/g）中ジシ
クロヘキシルカルボジイミド（１当量）の溶液を滴加し
た。反応混合物を室温で16時間かきまぜた。次に酢酸
（0.5ml）を加え、かきまぜを１時間続けた。反応混合
物を濾過して尿素副生成物を除去した。濾液を減圧下に
濃縮して褐色固体を得、これをエーテルで処理し、固体
を濾別して淡褐色固体を得た。収率86％。
分析:C16H19N3O6に対する 計算値:C−55.01;H−5.48;N−12.03。
実測値:C−55.17;H−5.84;N−11.86。
1H NMRδ:1.47（s,9H）,2.88（s,4H）,6.85（d,Jab＝
8.9Hz,2H）8.04（d,Jab＝8.9Hz,2H）。
スクシンイミジル４−ヒドラジノ安息香酸塩酸塩の合成 ジオキサン中塩化水素の溶液（エステル1g当り50ml、
塩化水素をジオキサン中に約５分間通じることにより調
製）へ、スクシンイミジル４−BOC−ヒドラジノベンゾ
エート（１当量）を加えた。反応混合物を室温でかきま
ぜた。反応混合物は均一ではなかつたが、その色は最初
の淡黄色から２時間にわたりオレンジ色になつた。反応
混合物を濾過し、エーテルで洗浄して淡黄色固体を得
た。収率72％、融点203.5〜205℃。
分析:C11H12ClN3O4に対する 計算値:C−46.25;H−4.23;Cl−12.40;N−14.71。
実測値:C−46.74;H−4.38;Cl−12.24;N−14.26。
1H NMRδ:2.87（s,4H）,7.05（d,2H,Jab＝8.9Hz）7.9
7（d,2H,Jab＝8.9Hz）。
例２ スクシンイミジル６−ヒドラジノピリジン−３−カルボ
キシレート塩酸塩 〔１−〔〔（６−ヒドラジノ−３−ピリジニル）カルボ
ニル〕オキシ〕−2,5−ピロリジンジオン一塩酸塩〕の
製造 ６−クロロニコチン酸、ジ−ｔ−ブチルジカーボネー
トおよび85％抱水ヒドラジンはAldrich Chemicals（ミ
ルウオーキー，ウイスコンシン州）から購入した。
６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸の合成 ６−クロロニコチン酸（8.0g）を85％抱水ヒドラジン
（35ml）に加えた。反応混合物を100℃の油浴中で４時
間加熱した。均一な反応混合物を濃縮乾固して白色固体
を得た。この固体を水に溶かし、濃塩酸でpH5.5まで酸
性にすると沈殿を生じた。この沈殿を濾別し、固体を95
％エタノールおよびエーテルで洗浄して淡褐色固体6.0g
（収率77％）、融点292〜293℃を得た。
分析:C6H7N3O2に対する 計算値:C−47.06;H−4.61;N−27.44。
実測値:C−46.83;H−4.38;N−27.27。
1H NMRδ:6.69（d,J＝8.8Hz,1H）,7.84（dd,J＝2.4,
8.8Hz,1H）,8.51（d,J＝2.4Hz,1H）。
６−BOC−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸の合成 ジメチルホルムアミド（10ml）中６−ヒドラジノピリ
ジン−３−カルボン酸（1.4g、9.8ミリモル）、トリエ
チルアミン（1.2ml、11.8ミルモル）の溶液へジ−ｔ−
ブチルジカーボネート（2.13g、9.8ミリモル）を加え
た。反応混合物は１時間で均一となり、かきまぜを室温
で16時間続けた。反応混合物を減圧下で濃縮乾固して褐
色固体を得た。残留物を最少量の酢酸エチルに溶かし、
溶離剤として酢酸エチルを使用しシリカゲル60（230〜4
00メツシユ）に通して濾過した。溶離液を濃縮乾固し
た。この生成物はそれ以上精製せずに用いた。
1H NMRδ:1.40（s,9H）,6.52（d,J＝8.8Hz,1H）7.97
（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）,8.58（d,J＝2.4Hz,1H）。
スクシンイミジル６−BOC−ヒドラジノピリジン−３−
カルボキシレート 〔２−〔５−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニ
ル）オキシルカルボニル〕−２−ピリジニル〕−ヒドラ
ジンカルボン酸1,1−ジメチルエチルエステル〕の合成 ジメチルホルムアミド（15ml）中６−BOC−ヒドラジ
ノピリジン−３−カルボン酸（1.45g、5.75ミリモル）
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（0.66g、5.75ミ
リモル）の溶液に、ジメチルホルムアミド（5ml）中ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（1.18g、5.75ミリモ
ル）の溶液を加えた。１時間後に反応混合物は混濁して
来た。かきまぜを室温で16時間続けた。反応混合物を濾
過し、濾液を濃縮乾固して褐色固体残留物を得た。残留
物を最少量の酢酸エチルに溶かし、溶離剤として酢酸エ
チルを用いてシリカゲル60（230〜400メツシユ）に通し
て濾過した。溶離液を濃縮乾固して淡黄色固体を得、酢
酸エチル／ヘキサンから再結晶した。収率60％、融点16
9.5〜172℃。
分析:C15H18N4O6に対する 計算値:C−51.43;H−5.18;N−15.99。
実測値:C−51.81;H−5.26;N−15.60。
1H NMRδ:1.41（s,9H）,2.87（s,4H）6.64（d,J＝8.8
Hz 1H）8.08（dd,J＝2.4,8.8Hz）8.73（d,J＝2.4Hz,1
H）。
スクシンイミジル６−ヒドラジノピリジン−３−カルボ
キシレート塩酸塩の合成 ジオキサン（20ml）中に無水塩化水素を中程度の速度
で10分間通じることによりジオキサン中塩化水素の溶液
を調製した。スクシンイミジル６−BOC−ヒドラジノピ
リジン−３−カルボキシレート（100mg）をジオキサン
（2ml）に溶かし、HCl/ジオキサン（2ml）を加え、反応
混合物を室温でかきまぜた。５分後溶液は混濁し沈殿を
生成した。かきまぜを４時間続けた。混濁した反応混合
物を濾過して55mgの白色固体を得た。収率67％。
分析:C10H11ClN4O4に対する 計算値:C−41.87;H−3.87;Cl−12.37;N−19.53。
実測値:C−41.92;H−3.90;Cl−12.30;N−19.47。
1H NMRδ:2.88（s,4H）,7.01（d,J＝8.8Hz,1H）8.19
（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）8.83（d,J＝2.4Hz,1H）。
例３ スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩 〔４−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキ
シ〕カルボニル−安息香酸ヒドラジド、一塩酸塩〕の製
造 モノ−メチルテレフタレート、塩化オキサリル、ｔ−
ブチルカルバゼート、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は
Aldrich Chemicals（ミルウオーキー，ウイスコンシン
州）から購入した。
メチルテレフタレートクロリドの合成 モノ−メチルテレフタレート（１当量）、トルエン
（エステル1g当り30ml）およびDMF3滴のかきまぜた溶液
へ、塩化オキサリル（2.0当量）を滴加した。反応混合
物を45℃で16時間かきまぜた。溶液を減圧下で濃縮し、
望む生成物を淡黄色固体として得た。この生成物はそれ
以上精製せずに用いた。収率82.0％。融点50〜52℃。
IR（薄膜）:2970,1775,1720,1430,1400,1280,1105,880c
m-1。1 H NMRδ:3.97（s,3H）,8.14（s,4H）。
メチル４−BOC−ヒドラジドテレフタレート〔1,4−ベン
ゼンジカルボン酸モノメチルエステル２−〔（1,1−ジ
メチルエトキシ）カルボニル〕ヒドラジドの合成 ｔ−ブチルカルバゼート（１当量）、塩化メチレン
（20ml/g）および25％重炭酸ナトリウム（２当量）の激
しくかきまぜた混合物へ、塩化メチレン（40ml/g）中メ
チルテレフタレートクロリド（１当量）の溶液を滴加し
た。反応混合物を20゜で1/2時間かきまぜた。相を分
け、水相を塩化メチレンで抽出した。合わせた有機相を
10％塩酸および塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（MgSO
4）、濾過し、濃縮して白色固体を得た。収率91.7％。
融点197〜199゜。IR（KBr）:3010,1720,1670,1430,127
0,1220,1130,1100,1030,870,750cm-1。1H NMR（CDC
l3）：δ1.49（s,9H）,3.93（s,3H）,7.83（d,JAB＝8H
z,2H）,8.07（d,JAB＝8Hz,2H）。
４−BOC−ヒドラジドテレフタル酸の合成 メタノール（50ml/g）中メチル４−BOC−ヒドラジド
テレフタレート（１当量）の溶液へ水酸化ナトリウム
（10.0当量）を加えた。反応物を室温で16時間かきまぜ
た。反応混合物を減圧下に濃縮してメタノールを除去し
た。水を加え、溶液を慎重にpH1.0まで酸性にした。こ
の酸性溶液を酢酸エチルで抽出し、有機抽出液を乾燥し
（MgSO4）、濾過し、減圧下に濃縮乾固して白色固体を
得た。収率87.5％、融点208〜210゜。1 H NMRδ:1.41（s,9H）,7.97（d,J＝2.4Hz,4H）,8.90
（m,1H）10.3（m,1H）。
スクシンイミジル４−BOC−ヒドラジドテレフタレート
の合成 ２−〔４−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニル）
オキシ〕カルボニル〕ベンゾイル〕−ヒドラジンカルボ
ン酸1,1−ジメチルエチルエステル DMF（10ml/g）中４−BOC−ヒドラジドテレフタル酸
（１当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１当
量）の溶液へ、DMF（5ml/g）中DCC（１当量）の溶液を
滴加した。反応混合物を20゜で16時間かきまぜた。次に
酢酸（0.5ml）を加え、かきまぜを１時間続けた。反応
混合物を濾過して尿素副生成物を除去した。濾液を減圧
下で濃縮して黄褐色油状物を得た。フラツシユ真空クロ
マトグラフイー（ヘキサン／酢酸エチル7/3）を用いて
生成物を単離した。収率47.8％。融点182〜185゜。
IR（KBr）:3330,3230,2990,1770,1740,1660,1530,150
0,1370,1280,1200,1150,1070,1000,870,790,640cm-1。1 H NMR（CDCl3）δ:1.50（s,9H）,2.91（s,4H）,6.70
（m,1H）,7.91（d,JAB＝8.8Hz,2H）,8.20,d,JAB＝8.8H
z,2H）。
分析:C17H19N3O7に対する 計算値:C−54.11;H−5.07;N−11.13。
実測値:C−53.66;H−5.15;N−11.09。
スクシンイミジル−４−ヒドラジドテレフタレート塩酸
塩の合成 テトラヒドロフラン中の塩化水素溶液（50ml/g、塩化
水素をテトラヒドロフラン中に約10分間通じることによ
りつくる）へスクシンイミジル４−BOC−ヒドラジドテ
レフタレート（１当量）を加えた。反応混合物は１時間
均一で、それから４時間にわたりうすい白色の沈殿を生
じた。反応混合物を濾過し、エーテルで洗浄して望む生
成物をうすい白色の固体として得た。収率37.7％、融点
278〜280゜。
IR（KBr）:3400,3200,2800,2600,1770,1730,1690,153
0,1490,1290,1240,1070,1000,870,730,640,610cm-1。1 H NMRδ:2.91（s,4H）,8.11（d,JAB＝8.8Hz,2H）,8.25
（d,JAB＝8.8Hz,2H）。
分析:C12H12ClN3O5に対する 計算値:C−45.95;H−3.86;Cl−11.30;N−13.40。
実測値:C−45.84;H−3.91;Cl−11.37;N−13.33。
例４ ５−マレイミジル−２−ヒドラジノピリジン塩酸塩〔１
−（６−ヒドラジノ−３−ピリジニル）−1H−ピロール
−2,5−ジオン一塩酸塩〕の製造 ２−クロロ−５−ニトロピリジン、抱水ヒドラジン、
ジ−tert−ブチルジカーボネート、炭末上10％パラジウ
ム、無水マレイン酸、酢酸コバルト、および無水酢酸は
Aldrich Chemicals（ミルウオーキー，ウイスコンシン
州）から購入した。
２−ヒドラジノ−５−ニトロピリジンの合成 抱水ヒドラジン（30.0当量）、水（ピリジン1g当り4m
l）、およびエタノール（ピリジン1g当り2ml）のかきま
ぜた溶液へ２−クロロ−５−ニトロピリジン（１当量）
を加えた。反応混合物を20゜で16時間かきまぜた（非常
に濃い緑色スラリーが生成）。沈殿を濾別し、固体をメ
タノールで、次にエーテルで洗浄して緑色固体を得た。
この生成物はそれ以上精製せずに用いた。収率77.3％。
融点205〜207゜。
IR（KBr）:3340,3200,2980,1670,1605,1580,1485,142
0,1330,1300,1120,980,830,770cm-1。1 H NMRδ:4.64（br s,2H）,6.76（d,J＝8.8Hz,1H）,8.1
5（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）,8.86（d,J＝2.4Hz,1H）,9.1
2,（m,1H）。
分析:C5H6N4O2に対する 計算値:C−39.21;H−3.93;N−36.51。
実測値:C−38.96;H−3.92;N−36.35。
２−（BOC−ヒドラジノ）−５−ニトロピリジンの合成 ２−ヒドラジノ−５−ニトロピリジン（１当量）、DM
F（ピリジン1g当り15ml）、およびトリエチルアミン
（1.1当量）のかきまぜた溶液へ、DMF（ジカーボネート
1g当り4ml）中ジ−tert−ブチルジカーボネート（1.0当
量）の溶液を滴加した。反応混合物を20゜で48時間かき
まぜた。反応混合物を減圧下で濃縮して黄褐色油状物を
得た。フラツシユ真空クロマトグラフイー（ヘキサン／
酢酸エチル8/2）を用いて生成物を単離した。生成物を
酢酸エチル／ヘキサンから再結晶した。収率63.4％、融
点135〜137゜。
IR（KBr）:3280,2980,1710,1600,1500,1330,1290,1270,
1250,1150,1120,1010.830,760,650,500cm-1。1 H NMRδ:1.41（s,9H）,6.60（d,JAB＝8.8Hz,1H）,8.28
（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）,8.93（d,JAB＝2.4Hz,1H）,9.1
4（m,1H）,9.56（m,1H）。
分析:C10H14N4O4に対する 計算値:C−47.24;H−5.55;N−22.03。
実測値:C−46.99;H−5.50;N−21.93。
２−（BOC−ヒドラジノ）−５−アミノピリジンの合成 Parr水素化びんに２−BOC−ヒドラジノ−５−ニトロ
ピリジン（１当量）、炭末上10％パラジウム（ピリジン
1g当りPd0.3g）、およびエタノール（ピリジン1g当り10
0ml）を加えた。反応物をParr水素化装置で室温におい
てH250ポンド／平方インチで２時間水素化した。反応混
合物をフイルターセルプラグを通して濾過し、エタノー
ルですすいだ。黄緑色溶液を減圧下で濃縮して淡黄色固
体を得た。生成物をエタノールから再結晶した。収率8
1.64％、融点140〜142゜。
IR（KBr）:3360,3200,2980,1650,1635,1580,1490,139
0,1360,1300,1260,1160,1020,880,860,830,750,590,530
cm-1。1 H NMRδ:1.37（s,9H）,6.34（d,J＝8.8Hz,1H）,6.89
（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）,7.14（m,1H）,7.49（d,J＝2.4
Hz,1H）,8.50（m,1H）。
分析:C10H16N4O2に対する 計算値:C−53.55;H−7.19;N−24.98。
実測値:C−53.73;H−7.21;N−25.05。
２−BOC−ヒドラジノ−５−マレイミジルピリジン〔２
−〔５−（2,5−ジヒドロ−2,5−ジオキソ−1H−ピロー
ル−１−イル）−２−ピリジニル〕−ヒドラジンカルボ
ン酸1,1−ジメチルエチルエステル〕の合成 アセトン（50ml/g）中で２−BOC−ヒドラジノ−５−
アミノピリジン（１当量）をかきまぜた溶液に無水マレ
イン酸（1.1当量）を加えた。反応混合物を25゜で２時
間かきまぜた。反応混合物へ無水酢酸（1.2当量）、酢
酸コバルト（0.007当量）およびトリエチルアミン（0.3
当量）を加えた。反応混合物を60゜で２時間かきまぜ
た。反応物の色は始まりは明るい黄色、終りは暗黄色で
あつた。反応混合物を減圧下で濃縮して黄褐色油状物を
得た。フラツシユ真空クロマトグラフイー（ヘキサン／
酢酸エチル8/2）を用いて生成物を単離した。この生成
物をエーテル／ヘキサンから再結晶した。収率28.3％。
融点182〜184゜。
IR（KBr）:3400,3300,3100,2990,1700,1610,1500,141
0,1360,1320,1270,1210,1150,1050,830,750,690cm-1。1 H NMRδ:1.39（s,9H）,6.58（d,J＝8.8Hz,1H）,7.14
（s,2H）,7.45（dd,J＝2.4,8.8Hz,1H）,7.94（d,J＝2.4
Hz,1H）,8.37（m,1H）。
分析:C14H16N4O4に対する 計算値:C−55.26;H−5.30;N−18.41。
実測値:C−55.14;H−5.30;N−18.33。
５−マレイミジル−２−ヒドラジノピリジン塩酸塩の合
成 ジオキサン（50ml）に無水塩化水素を中程度の速度で
10分間通じることによりジオキサン中の塩化水素溶液を
調製した。２−（BOC−ヒドラジノ）−５−マレイミジ
ルピリジン（200mg）をジオキサン（5ml）に溶かし、HC
l/ジオキサン（10ml）を加え、反応混合物を室温でかき
まぜた。30分後溶液は混濁して来て沈殿を生じた。反応
混合物を25゜で計５時間かきまぜた。スラリーを濾過
し、エーテルで洗浄して50mgの白色固体を得た。収率3
1.6％。融点280〜290゜（分解、黄から褐色）。IR（KB
r）:3440,3100,2580,1720,1610,1560,1480,1390,1200,1
150,830,690cm-1。1 H NMRδ:7.0（d,J＝8.8Hz,1H）,7.19（s,2H）,7.63（d
d,J＝2.4,8.8Hz,1H）,8.15（d,J＝2.4Hz,1H）。
質量スペクトル:m/z＝204（Ｍ−HCl）＋。
例５ スクシンイミジル２−（２−プロペニルヒドラゾン）ニ
コチネート〔プロパナール〔５−〔〔（2,5−ジオキソ
−１−ピロリジニル）オキシ〕カルボニル〕−２−ピリ
ジニル〕ヒドラゾン〕の製造 ６−ヒドラジノニコチン酸は前述したようにして調製
し、プロピオンアルデヒドはAldrich Chemicals（ミル
ウオーキー，ウイスコンシン州）から購入した。
スクシンイミジル２−（２−プロペニルヒドラゾン）ニ
コチネートの合成 DMF（40ml/g）中６−ヒドラジノニコチン酸（１当
量）の懸濁液へプロピオンアルデヒド（３当量）を加え
た。反応混合物を室温で１時間かきまぜた。反応混合物
が均一にならなかつたので、反応混合物が均一になるま
でフラスコをヒートガンでおだやかに加熱した。反応混
合物を室温まで冷却し、DMF中Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（１当量）の溶液を加えた。その後DMF中DCC（１
当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で16時間か
きまぜた。生じた沈殿を吸引濾過により除去し、母液を
濃縮乾固した。褐色固体残留物を酢酸エチル中に懸濁
し、１時間かきまぜ、濾過した。酢酸エチル溶液から淡
褐色固体が沈殿したのでこれを濾別し望む生成物を得
た。収率65％。1 H NMRδ:1.06（t,3H）,2.34（m,2H）,2.86（s,4H）,7.
11（d,J＝9.4Hz,1H）,7.54（t,1H,J＝4.9Hz）,8.10（d
d,J＝9.44,2.33Hz,1H）,8.72（d,J＝2.33Hz,1H）。
分析:C13H14N4O4に対する 計算値:C−53.79;H−4.86;N−19.30。
実測値:C−53.66;H−4.89;N−19.12。
例６ スクシンイミジル２−（２−（１−プロペニル）ヒドラ
ゾン））−チアゾール−４−カルボキシレート〔プロパ
ナール〔４−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピロリジニ
ル）オキシ〕カルボニル〕−２−チアゾリル〕ヒドラゾ
ン〕の製造 チオセミカルバジドおよびブロモ乳酸はAldrich Chem
icals（ミルウオーキー，ウイスコンシン州）から購入
した。
プロピオンアルデヒドチオセミカルバゾンの合成 MeOH中チオセミカルバジド（１当量）およびプロピオ
ンアルデヒド（1.5当量）の溶液へ氷酢酸数滴を加え
た。混合物を45分間加熱還流した。反応混合物を回転蒸
発器で濃縮したところ沈殿を生じた。固体を濾別し、エ
ーテルで洗浄し、真空で乾燥した。収率71％。
２−（２−（１−プロペニルヒドラゾン））チアゾール
−４−カルボン酸臭化水素酸塩 MeOH中プロピオンアルデヒドチオセミカルバゾン（１
当量）の溶液へブロモ乳酸（１当量）を加えた。反応混
合物を１時間還流加熱し、次に室温まで冷却し、溶媒を
回転蒸発器で除去した。生じた黄色固体をMeOH/エーテ
ルとすりまぜ、淡黄色固体を単離し、エーテルで洗浄
し、真空で乾燥した。1 H NMRδ:1.00（t,J＝7.9Hz,3H）,2.15（m,2H）,7.44
（t,J＝4.9Hz）。
スクシンイミジル２−（２−（１−プロペニル）ヒドラ
ゾン）−チアゾール−４−カルボキシレートの合成 DMF中酸（１当量）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（１当量）、およびトリエチルアミン（1.5当量）の溶
液へ、DMF中DCC（１当量）の溶液を滴加した。反応混合
物を室温で16時間かきまぜた。生じた沈殿を濾別し、母
液を濃縮乾固した。その残留物に酢酸エチルを加え１時
間かきまぜた。不溶物を濾別し、母液を濃縮乾固した。
生成物を溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（1/2）を
用いてフラツシユクロマトグラフイーを行ない望む生成
物を灰色の固体として得た。収率35％。1 H NMRδ:1.08（t,J＝7.9Hz,3H）,2.24（m,2H）,7.40
（t,J＝4.9Hz,1H）,8.11（s,1H）。
例７ スクシンイミジル２−（２−メチルエテニルヒドラゾ
ン）チアゾール−４−カルボキシレートの製造 ２−（メチルエテニルヒドラゾン）−４−チアゾール
カルボン酸臭化水素酸塩（１当量）〔H.Johne,D.Seifer
t,S.JohneおよびE.Bulka,Pharmazie33,259（1978）の方
法により調製〕をDMF（20ml/g）に溶かした。Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（１当量）およびトリエチルアミ
ン（1.5当量）を加えた。この均一混合物へDCC（１当
量）の溶液を15分にわたり滴加した。反応混合物を室温
で16時間かきまぜた。生じた沈殿を濾別し、母液を濃縮
乾固して橙褐色固体を得た。この固体を酢酸エチル中に
懸濁させ、室温で１時間かきまぜた。不溶物を濾別し、
母液を濃縮して褐色固体を得た。固体をエーテルとすり
まぜ、再び濾別して黄褐色固体を得た。収率40％。生成
物の試料を溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（2/1）
を用いてシリカゲルの短い充填物に通して濾過した。溶
離液を濃縮して望む生成物を淡黄色固体として得た。融
点202〜205゜（分解）。1 H NMRδ:1.92（s,3H）,1.96（s,3H）,2.86（s,4H）,8.
11（s,1H）。
質量スペクトル:m/z＝297（Ｍ＋１）＋。
例８ スクシンイミジル４−チオセミカルバジドベンゾエート
半塩酸塩〔Ｎ−〔４−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピロ
リジニル）オキシル〕カルボニル〕フエニル〕−ヒドラ
ジンカルボチオアミド半塩酸塩〕の製造 ４−アミノカルボン酸はAldrich Chemicals（ミルウ
オーキー，ウイスコンシン州）から購入した。
BOC−４−チオセミカルバジド安息香酸〔２−
〔〔（４−カルボキシフエニル）アミノ〕チオキソメチ
ル〕−ヒドラジンカルボン酸１−（1,1−ジメチルエチ
ル）エステル〕の合成 DMF中４−イソチオシアナト安息香酸（１当量）〔D.
W.BrowneおよびG.M.Dyson,J.Chem.Soc.178（1934）の方
法に従い調製〕およびトリエチルアミン（1.2当量）の
溶液に、ｔ−ブチルカルバゼート（１当量）の溶液を加
えた。反応混合物を室温で３時間かきまぜ、その後濃縮
乾固した。残留物を酢酸エチルに溶かし、10％クエン酸
および塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（MgSO4）、濾
過し、濃縮して望む生成物を灰色固体として得た。収率
70％、融点131〜133゜（分解）。1H NMRδ:1.42（s,9
H）,7.67（d,JAB＝8.9Hz,2H）,7.87（d,JAB＝8.9Hz,2
H）。
スクシンイミジルBOC−４−チオセミカルバジドベンゾ
エート〔２−〔〔〔４−〔〔（2,5−ジオキソ−１−ピ
ロリジニル）オキシル〕カルボニル〕フエニル〕アミ
ノ〕チオキソメチル〕−ヒドラジンカルボン酸1,1−ジ
メチルエチルエステル〕の合成 アセトニトリル中酸（１当量）およびＮ−メチルモル
ホリン（1.1当量）の溶液へ、アセトニトリル中スクシ
ンイミジルテトラクロロエチルカルボネート（１当量）
の溶液を加えた。反応混合物を室温で16時間かきまぜ
た。反応混合物へ酢酸エチルを加え、均一溶液を冷５％
クエン酸、冷水、冷飽和重炭酸ナトリウム水溶液、冷水
および冷塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（MgSO4）、
濾過し、濃縮して淡黄油状物を得た。この油を溶離剤と
してヘキサン／酢酸エチルを使用してシリカゲル上での
フラツシユクロマトグラフイーを行なつた。生成物は黄
色油状物として単離され、エーテルを加えると固化し
た。固体を濾別し望む生成物を得た。収率25％。融点16
1〜163゜。1 H NMRδ:1.52（s,9H）,2.88（s,4H）,7.74（d,JAB＝1
0.0Hz,2H）,8.05（d,JAB＝10.0Hz,2H）。
分析:C17H20N4SO6に対する 計算値:C−49.99;H−4.94;N−13.72 S−7.85。
実測値:C−50.05;H−4.95;N−13.64 S−7.95。
スクシンイミジル４−チオセミカルバジドベンゾエート
半塩酸塩の合成 エーテル中BOCスクシンイミジルエステルの懸濁液へ
エーテル中乾燥HCl（ｇ）を溶液（乾燥エーテルにHClガ
スを通じることにより調製）を加えた。懸濁液を室温で
16時間かきまぜた。反応混合物は全反応過程にわたり不
均一であつた。固体を濾別して望む塩酸塩生成物を得
た。収率80％、融点155〜160゜。1 H NMRδ:2.88（s,4H）,8.01（s,4H）。
分析:C12H13N4SO4・0.5HClに対する 計算値:C−44.00;H−4.15;N−17.10 S−9.79。
実測値:C−44.56;H−3.88;N−17.04 S−9.74。
例９ IgGの抱合 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.8）2ml中IgG（分
子量＝155,000）10mgの溶液へ、ジメチルホルムアミド
中スクシンイミジル４−ヒドラジノベンゾエート塩酸塩
（30mM）17.2μを加えた。室温で５時間かきまぜた
後、反応混合物を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.2）
に対して透析した。タンパク質に抱合されたヒドラジノ
基の数をT.P.King等（Biochemistry,25:5774,1986）の
方法により測定した。要するに、ヒドラジノ−タンパク
質抱合体を４−ニトロベンズアルデヒドと反応させるこ
とによりヒドラジノ基をヒドラゾンに変えた。標準とし
てｐ−ニトロフエニルベンズアルデヒドとフエニルヒド
ラジンとのヒドラゾン（λmax＝412,ε＝2.41×104）を
用いてヒドラゾン／タンパク質分子の数を分光光度法で
測定した。25〜35％の修飾収率を得た。
例10 抱合IgGの99mTcによる標識化 DuPont Tc−グルコサンキツトを、99mTcO4 -10m Ciを
含有する水3mlで調製した。この溶液250μを0.1M酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.2）中１〜5mg/ml抱合IgG 250μ
と混合した。室温で１時間インキユベーシヨン後、活
性の＞95％がタンパク質に保有されていることが放射分
析用HPLC（TSK3000カラム）およびインスタント薄層ク
ロマトグラフイー（ITLC）により測定された。
Tcで標識したIgG 800uCiを片方の後足に膿傷をもつラ
ツトに注射した。24時間でラツトを殺した。放射能分布
を測つた。
器 官 注射用量／組織グラム％ 血 液 1.36 腎 臓 1.11 感染筋 0.76 正常筋 0.12 肝 臓 0.81 感染筋／正常筋比＝6.3 例11 フラグメントE1の抱合 （DD）Ｅタンパク質を５〜10mg/mlに濃縮し、pH8.5の
12.5mMホウ酸塩緩衝液中20倍モル過剰のスクシンイミジ
ル６−ヒドラジノピリジン−３−カルボキシレート塩酸
塩で修飾した。４℃で５時間インキユベーシヨン後（お
だやかにかきまぜながら）、試料をガス抜きした高純度
水（不純物10-9）に対して約12時間透析した。
酢酸中で試料0.55Mをつくり6M尿素により1:1v/vで希
釈することによつて修飾DD（Ｅ）複合体からフラグメン
トE1を分離した。試料のpHを10N NaOHで5.5に調節し、
次に試料を10mMクエン酸塩緩衝液（pH5.7）に対して透
析し過剰の試薬を除いた。透析中にDDタンパク質が沈殿
し修飾されたフラグメントE1が溶液中に残つた。DD沈殿
は遠心により容易に除去された。
修飾E1を前記のようにTc−99mグルコヘプトネートと
の反応によりTc−99mで標識した。このTc−99m標識E1を
用いて家兎モデルの血栓を造影した〔D.Collen等,J.Cli
n.Invest.71,368〜376頁（1989）参照〕。
例12 モノクローン抗体5E8の抱合〔E.A.Chen等,Cancer Res
earch49,3642〜3649（1989）参照〕 pH8.5の12.5mMホウ酸塩緩衝液中14倍過剰のスクシン
イミジル６−ヒドラジノピリジン−３−カルボキシレー
ト塩酸塩を用いて5E8（濃度５〜10mg/ml）を修飾した
（室温で５時間）。この抗体抱合体を20mMクエン酸塩緩
衝液（pH5.2 NaCl中100mM）に対して透析した。遠心し
て少量の混濁を除去後、その修飾の度合（前記のように
分光光度法で測定）はタンパク質分子当りヒドラジン基
6.5であることが分つた。ELISAおよび免疫細胞接着によ
る分析は免疫反応性が失なわれていないことを示した。
前記の特定化合物および方法の詳細は例示であつて本
発明の範囲を制限するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 249/18 Ｃ０７Ｄ 401/12 401/12 417/12 417/12 Ｃ０７Ｋ 2/00 Ｃ０７Ｋ 2/00 16/18 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/60 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/60 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ (72)発明者 マイクル ジェイ．アブラムズ アメリカ合衆国ペンシルバニア州 グレ ンモアー，ボックス 31 ルーラル デ リバリイ ナンバー ２，クリーク ロ ード（番地なし) (72)発明者 クリスティン エム．ギアンドメニコ アメリカ合衆国ペンシルバニア州 エク ストン，ヘリテッジ レーン 137 (72)発明者 ジョン エイ．ズビエタ アメリカ合衆国ニューヨーク州 アルバ ニイ，フェアーローン アベニュー 108 (56)参考文献 特開 昭57−181058（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−1972（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07D 207/00 - 207/50 A61K 39/395 A61K 49/00 C07D 249/18 C07D 401/12 C07D 417/12 C07K 16/18 G01N 33/60 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（Ｉ）′： 〔式中、 Ｒは水素または低級アルキル基であり、 Ｄは直接の結合、CH2、Ｃ＝Ｏまたは であり、 Ｘは負の対イオンであり、 Ｙは次式で示される基であり、 （式中、 Ａは炭素または窒素原子であり、 Ｂは炭素または窒素原子であり、 Ｆ−Ｅは、ＥがＣ＝Ｏであるとき、ＦはＮ−オキシスク
    シンイミジル、テトラフルオロフェノレート、Ｎ−オキ
    シベンゾトリアゾールおよびイミダゾレートからなる群
    から選ばれる基であるか、またはＥはＦと共にマレイミ
    ジル基を形成する）〕 または式（II）′： 〔式中、 Ｒは水素または低級アルキル基であり、 Ｒ′またはＲ″は同じであっても異なってもよく、水素
    および低級アルキル基から選ばれ、 Ｚは、Ｙ−Ｄ−（Ｄ及びＹは上記で定義した通りであ
    る）または、 次式で示される基であり、 （式中、Ｆ−Ｅは上記で定義した通りである）〕 を有するヒドラジンまたはヒドラジド化合物。
  2. 【請求項２】Ｅはカルボニルであり、ＦはＮ−オキシス
    クシンイミジル、テトラフルオロフエノレート、Ｎ−オ
    キシベンゾトリアゾールおよびイミダゾレートからなる
    群から選ばれ、Ｘはハロゲン化物、硝酸塩、トリフルオ
    ロ酢酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、および硫酸塩から
    なる群から選ばれる、請求項第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｒは水素またはメチル、Ｅはカルボニル、
    ＦはＮ−オキシスクシンイミジルであり、そしてＸはCl
    である、 請求項第１項記載の化合物。
  4. 【請求項４】ＡとＢ両方とも炭素原子あるいはＡとＢの
    一方が炭素で、他方は窒素である、請求項第３項記載の
    化合物。
  5. 【請求項５】ＤはＣ＝O,CH2またはチオアミド で、環の４−位につく、請求項第１項記載の化合物。
  6. 【請求項６】Ｄはチオアミド、Ｅはカルボニル、または
    ＦはＮ−オキシスクシンイミジルであり、ＸはClであ
    る、請求項第５項記載の化合物。
  7. 【請求項７】型： （式中、F,E,R,R′およびＲ″は請求項第１項で定義し
    た通りである）を有するヒドラジン化合物。
  8. 【請求項８】Ｅはカルボニル、ＦはＮ−オキシスクシン
    イミジル、Ｒ′は水素そしてＲ″はエチルあるいはＲ′
    とＲ″の両方がメチルである、請求項第７項記載の化合
    物。
  9. 【請求項９】請求項第１項記載のヒドラジンまたはヒド
    ラジド化合物と遊離アミノ基を有する高分子との反応に
    より形成される抱合体。
  10. 【請求項１０】金属イオンと請求項第９項記載の抱合体
    とからなる標識した高分子。
  11. 【請求項１１】高分子を金属イオンで標識する方法にお
    いて、少なくとも一つの遊離ヒドラジン基またはヒドラ
    ジド基をもつ請求項１から８のいずれかの化合物と少な
    くとも一種の遊離アミノ基を有する高分子とからなる抱
    合体を適当な金属種と標識化を誘発する条件で反応させ
    る工程を含む上記方法。
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