JPH0327356A - タンパク質の標識化 - Google Patents

タンパク質の標識化

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JPH0327356A
JPH0327356A JP2041389A JP4138990A JPH0327356A JP H0327356 A JPH0327356 A JP H0327356A JP 2041389 A JP2041389 A JP 2041389A JP 4138990 A JP4138990 A JP 4138990A JP H0327356 A JPH0327356 A JP H0327356A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 従来の技術かよび解決するための課題 本発明は金属イオン、とりわけテクネテウムとレニウム
、を生物学上有用は分子に結合させることりできる二官
能性化合物に関する。
ある種の高分子（例えば、モノクローン抗体）は、イメ
ージングかよび（または）治療を目的として放射性同位
体を特異的な生体内部位に回げるため使用されて来た。
診断用核医薬にテクネチウムの準安定ｉｔ？１位体、”
ｍＴＣ’ａ’使用すること＆工よく確立されてかり、レ
ニウムりベーター線放出同位体、１８６１６　．　ｌｌ
１ｊＨ６　．　１８９１６は治療に使用できる。テクネ
チウムを高分子に付ける幾つかの方法が記載されて来た
。これら方法のあるもりは、高分子（普通＆工免疫グロ
プリン）のジスルフィド基をチオールに還元し、七（１
）　Ｈこれらり基な用いて還元Ｔｏを拘束する工程を含
む（例えば、Ｍｃｘｅｎｚｔｅ等、国際公報第ＷＯ８７
／０４１６４号かよびＢｒｅｍｅｒ等、欧州特許第２　
７　１．８　０　６　Ａ　２号明細書）。この型の方法
は幾つかの潜在的欠点ぞもっ。
ジスル７イド単位を還元するとタンパク質を変性させる
ことがあり、その結果生物学的特異性を失なうかもしれ
ない。普た、こり方法はジスＡ／７イド部分を欠く高分
子の標識化には使用でぎｒｘい。
別法として、ＤＴＰＡりようＴＬ二官能性キレートを経
て９９ｍ７ｃを高分子に結合させることもできるＣＤ，
　Ｌａｎｔｅｉｇｎｅ　ｂよびＤ．　Ｊ，　ＨｎａｔＯ
ＷｉＣｈ，　　■ｎｔ，　，７．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａ
ｔ，工ｇｏｔ．，　３　５　（７）巻、６１７頁（１９
８４）、キレート形成チオセミカルバゾン４２５頁（　
１　９８５　）、釦よびゾアミドージチオール配位子（
Ａ．　Ｆ’ｒｉｔｚｂｅｒｇ，欧州特許願第１　８８２
５６２Ａ号明細書〕。これらり方法に付随する問題は、
テクネチウムがかなり非特異的に結合すること（キレー
ト形或基以外の部位でタンパクに結合すること）かよび
ＴＣ標識化の速度が遅いことである。
従って本発明の目的Ｉ工、ヒドラジン基またはヒドラジ
ド基かよびタンパク質反応基を有しＱ　Ｇｌ　ｍＴＣの
ような金礪イオンを高分子に結合するために使用できる
新規二官能性分子を提供することである。
本発明りもう一つの目的は高分子を金属イオンで標識化
する方法を提供することで、この方法によるとキレート
形成基以外０）部位での金属の結合が最小とはり、比較
的速い速度（室厘で１時間未満）で標識化が起こる。
課題を解決するためＤ手段 新規二官能性ヒドラジンかよびヒドラジド塩ならびにそ
り抱合体が本発明により提供される。抱合体を金属イオ
ンで標識する方法も提供される。
一般に、タンパク質反応性置換基かよび負り対イオンを
もつ二官能性芳香族ヒドラゾンまたはヒドラジドとして
ヒドラジンかよびヒドラジド化合物が本明細書に記載さ
れている。ヒドラジン１たをエヒドラジド官能基を低級
アルキルヒドラゾンとして保護する本発明の変法も提供
する。
本発明りもう一つの具体例にかいては、本発明に係る二
官能性ヒドラジンまた１エヒドラジド化合物を、タンパ
ク質、ポリペゾチド１たに糖タンパク質りよｊ　Ｔｔ高
分子と反応させることにより抱合体聖つくる。二官能性
化合物は高分子の求核基（例えば、リジン残基）と反応
して遊離ヒドラジン／ヒドラジド基を含む抱合体を生或
する。
三番目の具体例にかいては、抱合体と金属イオンとから
なる標識した高分子をつくる。
四番目り具体例では、本発明に係る抱合体を金属種と反
応させることにより高分子を標識する方法が提供される
。
本発明に係る新規ヒドラジンシよびヒドラジド化合物を
工下記の式ＣＩ）あるい＆工（ＩＩ）りいずれかにより
表わされる： 式中、 Ａ｝工炭素または窒素原子であり、 Ｂは炭素普たは窒素原子であり、 Ｄは直接結合（環り２一位、３一位１たは４一位に対す
る）、ＣＨ２，Ｃ＝０、あるい１工８ １１ ＨＮ−０であり、 ＥはＣ＝Ｏであり、あるいｔＸ　Ｆと共にマレイミジル
基を形或し、 Ｆｔ工ＥがＣ＝０かあるいを工Ｅと共にマレイミジル基
を形或する場合、中性または塩基性水性媒質中で第１級
アミンにより容易に置換される基であり、 Ｒは水素１たは低級アルキル基であり、Ｒ′とＢｌは同
じもむでも異なるものでもよく、そして水素かよび低級
アルキルから選ばれ、Ｘは負の対イオンである。
本発明のもう一つり具体例は式（■）：Ｒ （式中、Ｒ，Ｒ’，Ｒ＃ＫかよびＦは前記の意味をもつ
）で表わされる化合物を包含する。
ＥがカルポエルＣ＝Ｏである場合、ｌｍ付いているカル
ポニル基と結合して活性エステルまたは活性アｉドを形
或する基りいずれかである。Ｆに適した基の例にはＮ−
オキシスクシンイミゾル、テトラフルオロフエノレート
、Ｎ−オキソペンゾトリアゾールかよびイミダゾレート
といった種々な基が包含される。これら例は本発明の範
囲を制限するものと解釈すべきでない。
Ｒ　，　Ｒ’　ＤよびＲ　ｙ　Ｋ対して適した基には次
り基、ＥＩ　，　ＯＨ３　，　ｃ２ａ，５　，かよび０
３”？が含１れるがこれだけに制限されたい。
有用なＸイオンの例はハロゲン化物、硝酸塩、｝　ＩＪ
　７ルオロ酢酸塩、テトラフルオロホウ酸塩かよび硫酸
塩である。これら例は適当な対イオンの範囲を制限しよ
うとするものではないヶ前紀化合物は二つの交差反応性
部位、即ちヒドラジン／ヒドラジド基かよびタンパク質
反応性基、例えば活性エステル、活性アミド筐たはマレ
イミド基を含む分子の安定な単離可能誘導体である。
これらの安定な誘導体の合或にかいては、１−デトキシ
力ルポエル（ｔ−ＢＯりのようた酸に不安定な保護基を
、無水の酸性条件下でヒドラジン／ヒドラジドから除去
して、未変化りタンパク質反応基と反応性のないデａト
ン化形のヒドラゾン／ヒドラジド基とを残す。別法とし
てヒドラジン／ヒドラジド基を低級アルキルヒドラゾン
として保護することもできる。
ｒｃｌ｝ン化された（あるいはヒドラゾンとして保護さ
れた）ヒドラジン／ヒド２ゾド官能基をもつ二官能性化
合物を次に中性かやや塩基性Ｏ媒質（なるべくは一約７
〜８．５）中で高分子、例えばタンパク質、ポリペデチ
ド、あるいは糖タンパク質と一緒にすると、化合物のタ
ンパク質反応性部分はタンパク質、ポリペデチドあるい
は糖タンパク質上の求核基（例えば、リジン残基のよう
たアミン基）と反応して遊離ヒドラジン／ヒドラジド基
を含む抱合体を生或するであろう。ヒドラゾン抱合体の
場合には、酸性（ｐ｝１５．６）緩衝液中に透析するこ
とにより遊離ヒドラゾン／ヒドラジドを生或させる。こ
の型り抱合体は強力な金属結合基であるヒドラジンまた
はヒドラジドを含むので、酸性媒質中で適当ｒｔ金属種
と混合したとき容易に反応して標識されたタンパク質、
ポリペデチドあるい１工糖タンパク質を生ずるであろう
。
金属ｆｆｉ｝工、例えばキレート形或性酸素配位子（例
えば、グルコヘゾトネート）の存在下にＴＣＯ４″″を
還元剤、例えば第一スズイオンと反応させることにより
生ずる還元ＴＣ種でよい。適当な還元ＴＱ種Ｏ例にはＴ
Ｃ−グルコヘデトネート、Ｔｏ−グルコネート、Ｔｃ　
−　’ｌ−ヒドａキシイソプチレート、Ｔｏ−ラクテー
トかよびＴｃ　−　４　＊　５　−ジヒドロキシ１．３
−ベンゼンジスルホネートが包含される。他の金属かよ
び配位子も本発明の範囲内にある。
’１’０６１識化法は水性緩衝液中、なるべく９工約４
．５〜６．５の一で１時間未満で行なうのが便利である
。他の適当な金属種との反応も同様な条件下で同様に起
こる。
ＴＣを使用して高性能液体クロマトグフフィ−（ＨＰＬ
Ｏ）Ｔｈよび薄層クａマトグラ７イ−（’ｒＬｃ）によ
り測定した放射化学収率は≧９０％である。結合不可能
な類縁体（即ち、タンパク質反応性力ルポニル基をもた
ない化合物、例えば４−ヒドラジノ安息香酸あるいは６
−ヒド：７ジノビリジン−３−カルポンａｍ！）による
タンパク質処理は有意なＴＯ結合の可能なタンパク質を
与えず、従ってこの技術の高い特異性が実証される。
テクネチウム原子はヒドラジドあるい１エジアゼ二ド結
合を経て抱合体に結合すると考えられろ：タンパク質一
リンカー−　Ｎ＝Ｎ＝’ｒＯＬ只 １ タンパク質−リンカー−Ｎ−Ｎ＝Ｔ（Ｌ式中、ＴＪｔｚ
補助的二酸素配位子である。
この型の結合の例がＭＯカよびＢｅに対し記述されてい
る［　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｃｏｏｒｄｉｎａ
ｔｔｏｎＣｈｅｍ１ｓｔｒｙ，　２巻、Ｇ．　Ｗｉｌｋ
ｉｎａｏｎｌｉ　，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ（オックスフォ
ード）１９８７．１３０〜１５１頁〕。また９９ＴＣの
幾つかの同様な錯体がオルガノヒドラジン誘導体とＴｏ
（Ｖ）オキソ種との反応によりつくられた。
上記の標識化スキームを用いてポリクローンヒトエｇ（
｝かよびヒトエｇＧのＦＣ領域を標識した。Ｔｏ一抱合
体を用いてラットモデルの感染焦゛点部位をイメージン
グした。筐たこの標識化スキームを用いてフラグメント
１ｌｉｌを標識化し（Ｌ．　Ｏ．　Ｋｎｉｇｈｔ等、．
Ｔ．　ｃｘｔｎ．ｌｎｖｅｓｔ．　７　２巻、１９８３
．２００７〜２０１３頁）（これは深部静脈血栓症に対
する家兎モデルで血栓を映像化するために用いた）かよ
びモノクローン抗体５１８を標識した。
例 例の中に示されたＮＭＲと工ＲＯ）−ｆ″一夕は次のよ
うにして得た： ”Ｈ　ＮＭＲ　ｘベクトルｋｓ　８　Ｑ　ＭＨｚ工ＢＭ
　ＡＦ’　−　８　０分光計で記録した。すべての１Ｈ
　ＮＭＲの結果は特に断らない限りＤＭ８０−ｄ，で則
定した。工Ｒスペクトｓｔｆｌ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｆｉｉ
ｎｅｒ　５　９　８赤外分光計で記録した。
ＮＭＲ　＞よびｘＲスペクトルを工帰属した構造と一致
した。
種々は例中の表題化合物の下の角カツコ内に示した化合
物名はＣｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　８ｅｒ
ｖｉｃｅ工ｎｄｅｚの命名法に従った。反応をスキーム
をスキーム１〜スキーム８に示してある。
例１ ４−ヒドラジノ安息香酸、２−（ｔ−プトキシ力ルポニ
ルオキシイミノ）−２−フエニルアセトニトリル（　Ｂ
ｏｏ−ＯＮ　）　、ジシクロへキシル力ルポジイミドか
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミドはＡｌｄｒｉａｈ　
Ｏｈｅｍ１ｃａｌｇ　（ミルウオーキー　ウイスコンシ
ン州）から購入した。
４　−　ＢＯＣ！−ヒドラジノ安息香酸の合或ジメチル
ホルムアミド（　５．ｄ／ｊｉ　）中で４−ヒドラジノ
安息香酸（１当ｔ）Ｄよびトリエチルアミン（３当量）
をかきまぜた溶液に、ジメチルホルムアミド中Ｂｏｏ−
ＯＮ　（　１当ｔ）の溶液を滴加した。反応混合物を室
温で３時間かきまぜた。１０鳴塩酸水溶液を加えると、
その後溶液が混濁しら溶液を酢酸エチルで抽出し、合わ
せた有機抽出液を水洗し、硫酸マグネシウム上で乾燥し
、濾過し、減圧下で濃縮して褐色固体を得た。この固体
をクａｌ：Ｉホルムから再結晶して望む生放物を淡褐色
固体として得た。収率６９％。分析： ０１２Ｈ１６Ｎ２０番に対する 計算値：　Ｏ−５７．１３；Ｈ−６．３９；Ｎ−１１．
１０。
実測値：Ｃ−５７．０２；Ｉ｛−６．１３；Ｎ−１１．
＜５１。
”Ｈ　ＮＭＲδ：　１．４　５　（８．　９１）．　６
．７　７　（ｄ．，ｒａｂ＝８．６Ｈｚ．　２Ｈ）．　
７．８　５　（ｄ．Ｊａ１，　＝　８．６Ｈｘ２Ｈ）。
スクシンイミジル４　−　Ｂｏｏ−ヒドラジノベンゾエ
一ト ジオキサン（酸１Ｉにつき１０−）中４　−　Ｂｏｏ−
ヒドラジン安息香酸（１当量）かよびＮ−ヒドａキシス
クシンイξド（１当量）の溶液へ、ジオキサン（５＋ｄ
／，？）中ジシクロヘキシルカルポジイミド（１当量）
の溶液を滴加した。反応混合物を室温で１６時間かき筐
ぜた。次に酢酸（０．５ｍ）を加え、かき筐ぜな１時間
続げた。反応混合物を濾過して尿素副生底物を除去した
。濾液を減圧下に濃縮して褐色固体を得、これをエーテ
ルで処理し、固体を濾別して淡褐色固体を得た。収率８
６優。
分析：　ＣｘａＨｘ９１Ｊ３０６に対する計算値：　Ｏ
−５５．０１　；ａ−ｓ．４ｓ；Ｎ−１２．０３。
実測値：　Ｏ−５５．１７；Ｈ−５．８４；Ｎ−１１．
８６。
ｌＨ　ＮＭＲδ：　１．４　７（ｓ．　９Ｈ）．　２．
８　８　（ｓ．　４Ｈ）．６．８　５　（ｄ．Ｊａｂ＝
　８．９ＨＺ．　　２Ｈ）８−０　４　（ｄ−　Ｊａｂ
　＝８−９Ｈｚ−　　２Ｈ）″．例２ の合或 ジオキサン中塩化水素り溶液（エステル１ｇ当り５０−
、塩化水素をジオキサン中に約５分間通じることにより
！ｌ＠）へ、スクシンイミジル４一ＢＯＣ−ヒドラジノ
ベンゾエート（１当ｍ）を加えた。反応混合物を室温で
かきまぜた。反応混合物を工均一ではなかったが、その
色１工最初σ）淡黄色から２時間にわたりオレンジ色に
なった。反応混合物を濾過し、エーテルで洗浄して淡黄
色固体を得た。収率７２％、融点２　０　３．５〜２０
５℃。
分析：　Ｏｘ１Ｈｘａ　Ｃｌ　Ｎ３０４に対する計算値
：　ｃ−ａ６．２５；Ｈ−４．２３；ａ１−１２．４０
；Ｎ　−　１　４．７　１。
実測値：　Ｏ−４６．７４；Ｅｌ−４．３８；Ｃｌ−１
２．２４；Ｎ　−　１　４．２　６。
ｌ｝ｉ　ＮＭＲδ：　２．８　７　（ｓ．　４Ｆｌ）．
　７．０　５　（ｄ．　２Ｈ，Ｊ　　＝８．９’Ｈｚ）
　７−９　７　（ｄ−　２Ｈ，Ｊａｂ　＝８−９Ｆ１ｚ
）。
ａｌ） ６−ク００ニコチン酸、ジーｔ−プチルジカーポネート
かよび８５％抱水ヒドラジンはＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ
ｉｃａｌｓ　（ミルウオーキー　ウィスコンシン州冫か
ら購入した。
６−クロロニコチン酸（８．０．９）を８５％抱水ヒド
フジン（３！Ｍ）に加えた。反応混合物を１００℃の油
浴中で４時間加熱した。均一な反応混合物を濃縮乾固し
て白色固体を得た。こり固体を水に溶かし、濃塩酸でｐ
｝１５．５Ｊで酸性にすると沈殿を生じた。この沈殿を
濾別し、固体を９５％エタノールかよびエーテルで洗浄
して淡褐色固体６．０，ＶＣ収率７７％）、融点２９２
〜２９６℃を得た。
分析：　Ｃ！，Ｈ，Ｎ３０２に対する 計算値：　ａ−４７．０６；ｕ−４．６１　；Ｎ−２７
．４４。
実則値：　ａ−４６．８３；Ｈ−４．３８；Ｎ−２７．
２７。
ｌＨＮＭＲδ：　６．６　９　（ｄ，　．Ｔ＝８．８Ｈ
Ｚ．　ＩＩ｛），　７．８　４（ｄｄ．　ｙ＝２．４．
　８．８Ｈｚ．　ＩＨ）．　８．５　１（ｄ，　Ｊ＝２
．４Ｈｚ．　ＩＨ）。
ＩＨ　ＮＭＲδ：　　１．４　０　　（ｓ．　　９Ｈ）
．　　６．５　２　　（ｄ．　　Ｊ＝８．８Ｆｉｚ，　
　ＩＨ）７．９　　７　　（ｄｄ，　　，Ｔ＝２．４．
　　８．８Ｈｓ．ＩＨ）．　　８．５　８　　（（１．
　　Ｊ＝２．４ＨＺ，ＩＨ）。
の合或 ジメチルホルムアミド（１０ｍ）中６−ヒドラジノビリ
ジン−３−カルポン酸（　１．４　！？、９．８ミリモ
ル）、トリエチルアミン（１．２＋ｄ、１１．８ミリモ
ル）り溶液ヘジーｔ−デチルジヵーポネート（　２．１
　３＃，　９．８　ミＩＪモル）を卯えた。反応混合物
は１時間で均一となり、かきまぜを室温で１６時間続げ
た。反応混合物を減圧下で濃縮乾固して褐色固体を得た
。残留物を最少ｔｏ酢酸エチルに溶かし、溶離削として
酢酸エチルを使用しシリヵ’ｆル６０　（　２３０〜４
００メッシュ）Ｋ通Ｌ’Ｃｇ過した。溶離液を濃縮乾固
した。この生底物はそれ以上Ｎ製せずに用いた。
ジメチルホルムアミド（　１　５ｍ）中６　−　ＢＯＣ
　−ヒドラジノビリジン−３−カルボン酸（　１．４　
５　．９、５．７　５ミリモル）会よびＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（　０．６６ｆｌ，５．７５ミリモル）
り溶液に、ジメチルホルムアミド（５−）中ゾシク口へ
キシルカルポジイミド（１．１８ｇ、５．７５ミリモル
）の溶液を加えた。１時間後に反応混合物は混濁して米
た。かき普ぜを室温で１６時間続げた。反応混合物な濾
過し、濾液を濃縮乾固して褐色固体残留物を得た。残留
物を最少ｔｏ酢酸エチルに溶かし、溶離削として酢酸エ
チルを用いてシリカデル６０　（　２３０〜４００メッ
シュ）に通して濾過した。溶離液を濃縮乾固して淡黄色
固体を得、酢酸エチル／ヘキサンから再結晶した。収率
６０％、融点１６９．５〜１７２℃。
分析：　Ｃ’１３Ｈ１８Ｎ４０６に対する計算値：　Ｃ
！−５１．４３；Ｈ−５．１８；Ｎ−１５．９９。
実測値：　ｃ−５１．８１　；Ｈ−５．２６；Ｎ−１５
．６０。
ｌＨ　ＮＭＲδ：　１．４　１　ＣＢ．　９Ｈ）．　　
２．８　７　（８，　４Ｅ！）６．６　４　（ｄ．　．
Ｔ＝８．８ＨｚＩＨ）　８，Ｑ　８（ｄｄ．　：ｒ＝２
．４．　８．８ＨＺ）　８．７　３　（ｄｖＪ＝２．４
Ｈ１？，　１｝１）。
を生或した。かき１ぜ聖４時間続けた。混濁した反応混
合物を濾過して５５−＋１の白色固体を得た。
収率６７％０ 分析：　０１ｏＨｌ１（１１４，０４に対する計算値：
　Ｏ−４１．８７；Ｈ−３．８７；Ｃｌ−１２．３７；
Ｎ−１９．５３。
実測値：　ｃ−４１−９２　；　ｔ＋−３．９０　；Ｃ
ｌ−１　２．３０　：Ｎｌ９．，１７。
’Ｈ　ＮＭＲ　Ｊ：　２．８　８　（ｓ．　４Ｈ），　
７．０　１　（ｄ，　：ｒ＝８．８ＦＩＺ．　ＩＨ）　
８．１　９　（ｄｄ．　，Ｔ＝２．４，　８．８Ｈｚ，
Ｈ｛）　８．８　３　（ｄ，　．７：２．４ＨＺ，　Ｉ
Ｈ）。
例３ ゾオキサン（２０ｍ）中に無水塩化水素を中程度の速度
で１０分間通じることによりジオキサン中塩化水素０）
溶液を調製した。スクシンイミゾル６　−　Ｂｏｏ−ヒ
ド２ジノピリジン−６−カルポキシレート（１００”ｆ
）をゾオキサン（２−）に溶かし、Ｈ’Ｊ．／ジオキサ
ン（２−）を卯え、反応混合物聖室温でかきまぜた。５
分後溶液は混濁し沈殿塩＃ｌ塩 七ノーメチルテレ７タレート、塩化オキサリル、ｔ−プ
チルカルバゼート、ジシクロへキシル力ルポジイミド（
ＤＯＯ）　ＴｈよびＮ−ヒドロキシスクシンィミド（Ｎ
ＨＳ）　ｆ工Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（
ミルウオーキー　ウィスコンシン州）から購入した。
メチルテレフタレートクσリドの合或 モノーメチルテレ７タレート（１当ｆＩｋ】、トルエン
（エステル１ｌ当り３Ｑｄ）：ＴｈよびＤＭ？　３滴の
かきまぜた溶液へ、塩化オキサリル（２．０当ｔ）を滴
加した。反応混合物を４５℃で１６時間かき１ぜた。溶
液を減圧下で濃縮し、望む生或物を淡黄色固体として得
た。この生或物ｔ工それ以上精製せずに用いた。収率８
２．０％。融点５０〜５２゜化工Ｒ（薄膜）：　２９７
０．１　７７５．１　７２０．１　４３０．１　４００
．１　２８０．１　１　０５．８　８　０　ｃｍ−’． ＩＨＮＭＲ　　δ：　　３．９　　７　　（８．　　　
３Ｈ冫．　　　８．１　　４　　（ｓ．　　　４Ｈ）　
　。
ｔ−プチルカルバゼート（１当量）、塩化メチレン（２
０ｍ／／）ｉ？よび２５％重炭酸ナトリウム（２当ｔ）
の激しくかき１ぜた混合物へ、塩化メチレン（４０ｄ／
Ｉ！）中メチルテレフタレートクａリド（１当１：）の
溶液を滴加した，反応混合物を２０°でｌ／２時間かき
まぜた。相を分け、水相を塩化メチレンで抽出した。合
わせた有機相を１０優塩酸かよぴ塩水で洗浄した。有機
相を乾燥し（Ｍｇ８０４）　、濾過し、濃縮して白色固
体を得た。
収率９１．７％。融点１９７　〜１９９°　工Ｒ（ＫＢ
ｒ）：３０１　０．１　７２０，１　６７０，１　４３
０．１　２７０．１　２２０．１　１　３０．１　１　
Ｄ０．１　０　３　０　．　８　７　０　．　７　５　
０　ｔｘ−”　ａ　ＮＭＲ（ＯＤＣ１３）：δ１．，４
　９　（ｓ．　９Ｈ），　３．９　３　（１３．　３Ｈ
）．　７．８　３　（ｄ．ＪＡＢ　＝　８Ｈｇ，　２Ｈ
）−　８−０　７　（ｄ−　ＪＡＢ　＝　８Ｈｚ，　２
Ｈ）。
４　−　Ｂｏｏ−ヒドラジドテレフタル酸の合或メタノ
ール（５０ｍｇ／ｌ）中メチルＡ　−　Ｂｏｏ　−ヒド
ラジドテレフタレート（１当ｉｔｌｌ７）溶液へ水酸化
ナトリウム（　１　０．０当量）を加えた。反応物を室
温で１６時間かきまぜた。反応混合物を減圧下に濃縮し
てメタノールを除去した。水を加え、溶液を慎重にｐＪ
｛１．０まで酸性にした。この酸性溶液な酢酸エチルで
抽出し、有機抽出液を乾燥し（Ｍｇ日０４）、濾過し、
減圧下に濃縮乾固して白色固体を得た。収率８７．５％
、融点２０８〜２１０°ｌＨＮＭＲδ：　１．４　１　
ＣＢ，　９Ｈ）．　７．９　７　（ｄ．　Ｊ＝＝２．４
Ｈｚ，４Ｈ）．　８．９　０　（ｎ，　ＩＨ）　１　０
．３　（ｍ．　ＩＨ）。
テル ＤＭＦ　（　１　０ｓｔ／．９　）中４　−　ＢＯ（：
！−ヒドラジドテレフタル＃（１当ｉｔ）＞よびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（１当ｉｔ）の溶液へ、ＤＭＰ
　＜　５　ｄｌｇ）中ＤＯＯ　（　１当！−）り溶液を
滴加した。反応混合物を２０°で１６時間かきまぜた。
次κ酢酸（０．５一）を加え、かき１ぜｙ！−１時間続
げた。反応混合物を濾過して尿累副生或物を除去した。
濾液を減圧下で濃縮して黄褐色油状物を得た。フラッシ
ュ真空クロマトグラフイー（ヘキサン／酢酸エチル７／
３）を用いて生或物を単離した。収率４７．８優。融点
１８２〜１８５０ 工Ｒ（ＫＢｒ）：　３３３０．３２３０．２９９０．１
　７７０．１　７４０．１　６６０．１　５＋０．１　
５００，１　３７０．１　２８０．１　２００．１　１
　５Ｄ．１　０７０．１　０００．８７０．７９０．６
　４　０　ｔｘ−” ＩＥＩ　ＮＭＲ　（Ｃ！ＤＣＩ３）δ：　１．５　０　
（８．　９Ｈ）．　２．９　１　（θ．ｉ）＊　６．７
　０　（ｍ．　ＩＨ）．　７．９　１　（ｄ．　ＪＡＢ
＝８．８｝ｉｚ．２Ｈ）１　８．２　−０　（ｄ．　：
ｒＡＢ＝　８．８Ｈｚ．　２Ｈ）。
分析：　ＣｌｙＨ１９ＮｓＯｙに対する計算値：　ａ−
５４．１１　；Ｈ−５．０７；１Ｊ−１１．１３。
実測値：　Ｃ−５３．６６；Ｈ−５．１５；Ｎ−１１．
０９。
テトラヒドａフ２ン中り頃化水素溶液（５〇一／Ｍ，塩
化水素をテトラヒド０７ラン中に約１０分間通じること
によりつくる）ヘスクシンイミジル４　−　ＢＯＣ！−
ヒドラジドテレフタレート（１当景）を加えた。反応混
合物は１時間均一で、それから４時間にねたり５ｊい白
色の沈殿を生じた。反応浪合物を濾過し、エーテルで洗
浄して望む生底物をうすい白色の固体として得た。収率
３７．７％、融点２７８〜２８０° 工Ｒ（ＫＢｒ）：　３４００．３２００．２８００．２
６００．１　７７０，１　７３０．１　６９０．１　５
３０．１　４９０．１　２９０．１　２４０．１　０７
０．１　０００．８７０．７３０，６４０．６１０ｃｒ
ＩＬ−１ １１｛　ＮＭＲδ：　２．９　１　（８．　４Ｈ）．　
８．１　１　（ｄ．　，７ＡＢ＝８．８Ｈｚ．　２Ｈ）
．　８．２　５　（ｄ．　，ＴＡＢ＝８．８ＨＺ．　２
Ｈ）。
分析：　ＯｘｚＨｌ２”ｊＮｓｏ５に対する計算値：ｃ
−４５．９５；■−３．８６；ａ１−１１．３０；Ｎ−
１３．４０。
実剣値：Ｏ−４５．８４；ＥＴ−３．９１　；Ｃｌ−１
１．３７；Ｎ　−　１　３．３　３。
例４ ２−クｏｏ−５一二トａビリジン、抱水ヒドラジン、ジ
ーｔ＠ｌｒｔ−プチルジカーポネート、炭末上ｉｏｓパ
ラジウム、無水マレイン酸、酢酸コバルト、かよび無水
酢１１！はＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｇ　（ミ
ｋウオーキー　ウィスコンシン州）から購入しれ２−ヒ
ドラジノ−５−二トロピリジンの合或抱水ヒドラジン（
３０．０当量）、水（ビリゾン１ｇ当り４ｍ）、Ｄよび
エタノール（ビリジン１ｇ当り２−）のかき筐ぜた溶液
へ２−クｏａ−５一二トａビリジン（１当量）を加えた
。反応混合物を２００で１６時間かきまぜた（非常に濃
い緑色スラリーが生成）。沈殿を濾別し、固体をメタノ
ールで、次にエーテルで洗浄して緑色固体を得た。この
生底物はそれ以上ｙｎＩＩＨせずに用いた。収率７７．
３％。融点２０５〜２０７ｏ 工Ｒ（ＫＢｒ）：３３４Ｑ，３２００．２９８０．１　
６７０．ｊ　６０５．１　５８０．１　４８５．１　４
２０．１　３３０．１　３００．１　１　２０．９　８
　０　，　８　３　０　．　７　７　０　ｃｍ−”ｌＨ
ＮＭＲδ：　４．６　４　（ｂｒ　ａ．　　２Ｈ）＊　
　６．７　６　（（１，　　．Ｔ　ｗ８．８Ｈｚ，　　
ＩＨ）−　　８−１　　５　（”’ｖ　　Ｊ＝＝２．４
，　　８．８Ｅｉｇ，　　ＩＨ）−８．８　６　（（Ｌ
，　　．Ｔ＝＝２，４Ｈｇ，　　ＩＨ），　　９．１　
　２．　　（ｍ，　　ＩＨ）。
分析：　Ｏ！ＳＥＩ６Ｎ４０２Ｋ対する計算値：　ｃ−
３９．２１　；　ｕ−３．９３；Ｎ−３６．５１。
実則値：　ｃ−３８．９６；ａ−３．９２；Ｎ−３６．
３５。
２−ヒドラジノ−５−エトクビリジン（１当量）、ＤＭ
Ｆ　（ビリジン１ｇ当り１５−）、およびトリエチルア
ミン（１．１当ｉ−）のかきまぜた溶液へ、ＤＭＦ　（
ジカーポネート１Ｉ！ｉ＋当り４−）中ジーｔａｒｔ−
プチルジカーポネート（１．０当ｆｌｋ）の溶液を滴卯
した。反応混合物を２０°で４８時間かき１ぜた。反応
混合物を減圧下で濃縮して黄褐色油状物を得た。フラッ
シュ真空クロマトグクフィー（ヘキサン／酢酸エテル８
／２）を用いて生底物を単離した。生底物を酢酸エチル
／ヘキサンから再結晶した。収率６３．４％、融点１３
５〜１６７０工Ｒ（ＫＢｒ）：　３２８０．２９８０．
１　７１　０．１　６００．１　５００．１　５５０．
１　２９０．１　　２７０．１　　２５０．１　　１　
　５０．　　１　　１　　２０．１　　０１　　０．８
３０，７６０，６５０．５００α−１ＩＨ　ＮＭＲδ：
　１．４　１　（８．　９Ｈ），　　６．６　０　（ｄ
．　ＪＡＢ＝８．８Ｈｚ，　　１ＦＫ），　　８．２　
８　　（ｄｄ，　　Ｊ＝２．４．　　８．８ＨＺ，ＩＨ
）．　　８．９　３　（ｄ．　　ＪＡＢ＝２．４Ｅｉｚ
，　　ＩＨ），９−１４　　（ｍ，ＩＨ）＊　　９−５
　６　（ｍ−　　ＩＨ）。
分析：　ＯＩＯＨ１４Ｎ４０４に対する計算値：　ｃ−
４７．２４；Ｈ−５．５５：Ｎ−２２．０３。
実剣値：　ｃ−４６．９９；ｕ−５．５０；Ｎ−２１．
９３．２　−　（　Ｂｏｏ−ヒドラジノ）−５−アミノ
ビリジンの合或 ｐａｒｒ水素化びんに２　−　Ｂｏｏ　−　ｔ：ドラジ
ノ−５−エトａビリジン（１当量）、炭末上１０畳パラ
ジウム（ビリジン１ｙ当りＰｄＯ．３ｇ）、＞よびエタ
ノール（ピリジン１ｙ当り１００ｍ）を加えた。反応物
をＰａｒｒ水素化ｖ７ｃｍで室温にかいてＨ２５０ポン
ド／平方インチで２時間水素化した。反応混合物をフィ
ルターセルデラグを通して濾過し、エタノールですすい
だ。黄緑色溶液を減圧下で濃縮して淡黄色固体を得た。
生底物をエタノールから再結晶した。収率８　１．６４
　％、融点１４０〜１４２０ 工Ｒ（ＫＢｒ）：３３＜５０．５２００．２９８０．１
　６５０．１　６３５．１　５８０．１　４９０．１　
３９０．１　３６０．１　３００．１　２６０．１　１
　６０．１　０２０．８８０．８６０．８３０，７５０
，５９０．５３０備−１． ”Ｈ　ＮＭＲδ：　ｊ−３７　（’−　９Ｈ）−　６−
３　４　（ｄｓ　Ｊ＝＝＋８．８Ｈｚ，ＩＨ），　６．
８　９　（ｄｄ，　Ｊ＝２．４．　８．８Ｈｚ．　１Ｈ
）．７．１　４　（ｍ．　ＩＨ）．　７．４　９　（ｄ
．　Ｊ＝＝　２．４ＨＺ．ＩＨ），　８．５　０　（ｍ
，　ＩＨ）。
分析二〇１ｏＨ１６Ｎ４０２に対する 計算値：　Ｏ−５３．５５；Ｈ−７．１９；Ｎ−２４．
９８。
実測値：　ｃ−５３．７３；Ｈ−７．２１　；Ｎ−２５
．０５。
アセトン（　５　０−ｓｔ／ｌ　）中で２　−　ＢＯＯ
−ヒドクジノー５一アミノビリジン（１当量）をかき筐
ぜた溶液に無水マレイン＠（１．１当＠）を加えた。
反応混合物を２５°で２時間かきまぜた。反応混合物へ
無水酢酸（１．２当量冫、酢酸コバルト（　０．０　０
　７当ｔ）かよびトリエチルアミン（０．６当量）を加
えた。反応混合物を６０°で２時間かきまぜた。反応物
の色は始まりは明るい黄色、終りは暗黄色であった。反
応混合物を減圧下で濃縮して黄褐色油状物を得た。フラ
ッシュ真空クａマトグラ７イ−（ヘキサン／酢酸エチル
８／２）’ｋ用いて生成物を単離した。この生底物をエ
ーテル／ヘキサンから再結晶した。収率２８．３％。融
点１８２〜１８４０ 工Ｒ（ＫＢｒ）：３４００．３３００．３１　００．２
９９０．１　７００．１　６１　０．１　５００．１　
４１　０．１　３６０．１　３　２０．１　２７０．１
　２１　０．１　１　５０，１　０５０．８３０，７５
０．６　９　０　ｃＩＬ−”　， ｌＨ　ＮＭＲδ：　１．３　９　（８．　９Ｈ）．　６
．５　８　（ｄ，　Ｊ＝８．８ＨＺ，ＩＨ）．　７．１
　４　（ｓ。２Ｈ）．　７．４　５　（ｄｄ，Ｊ＝：？
．４．　　８．８Ｈｒ；，　　１Ｆｌ），　　７．９　
４　　（ｄ，　　Ｊ＝２．４Ｈｚ，　　ＩＨ）．　　８
．３　７　　（ｆｆｌ．　　ＩＨ）。
分析：Ｃｌ４Ｈ１６Ｎ４０４に対する 計算値：　Ｏ−５５．２６；Ｈ−５．３０；ｎ−１　８
．４１。
実則＠　：　ｃ−５５．１　４　；　Ｅｌ−５．３０　
；　Ｎ−１　８．３３。
塩の合或 ジオキサン（５０ｄ）に無水塩化水素を中程度の速度で
１０分間通じろことによりジオキサン中の塩化水素溶液
をｖ４！Ａシた。２　−　（　Ｂｏｏ−ヒドラゾノ）−
５−マレイミジ／１／ビリジン（２００ｗｇ）をジオキ
サン（５−）に溶かし、ＨＣｊ／ジオキサン（１０ｄ）
を加え、反応混合物を室温でかき筐ぜた。３０分後溶液
は混濁して来て沈殿を生じた。
反応混合物を２５°で計５時間かきまぜた。スラリーｆ
ｔ濾過し、エーテルで洗浄して５０′ｑの白色固体を得
た。収率３１．６優。融点２８０〜２９０Ｑ（分解、黄
から褐色）。工Ｒ（ＫＢｒ）：　３　４　４　［１　．
３１　００．２５８０．１　７２０．１　６１　０．１
５６０．１　４８０．１　３９０．１　２００．？　　
１　　５０．８３０．６９０■−１ｌＨ　ＮＭＲ　δ：
　　７．０　　（ｄ，　　，Ｔ＝８．８ＨＺ，　　ＩＨ
），　　７．１　　９　　（Ｓ．２Ｈ）．　　７．６　
３　　（ｄｄ，：ｒ＝２．４，　　８．８Ｈｚ，ＩＨ）
，８．１　　５　　Ｃｄ．　　Ｉ＝２．４Ｈｚ，　　Ｉ
Ｈ）。
質量スペクトル：　ｍ／Ｚ　＝　２　０　４　（Ｍ−Ｈ
ＣＩ）＋例５ ６−ヒドラゾノニコチン酸は前述したようにして調製し
、ゾａビオンアルデヒドはＡ１ｄｒｉｃｈｏｈｅｍｉｃ
ａ１ｇ　（ミルウオーキー．ウィスコンシン州）から購
入した。
ＤＭＰ　（　４　０−／＃　）中６−ヒドラジノニコチ
ン酸（１当量）の懸濁液へプロｔオンアルデヒド（３当
ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１時間かきまぜた。
反応混合物が均一にならなかったりで、反応混合物が均
一になる１でフラスコをヒートがンでかだやかに加熱し
た。反応混合物を室温まで冷却し、ＤＭＦ中Ｎ−ヒドａ
キシスクシンイミド（１当量）の溶液を加えた。そり後
ＤＭＦ中ＤＯＯ（１当量）の溶液を滴加した。反応混合
物を室温で１６時間かきｉぜた。生じた沈殿を吸引濾過
により除去し、母液を濃縮乾固した。褐色固体残留物を
酢酸エチル中に懸濁し、１時間かき筐ぜ、濾過した。酢
酸エチル溶液から淡褐色固体が沈殿したのでこれを濾別
し望む生底物を得た。収率６５鳴。
ｉｔ｛　ＮＭＲδ：　１．０　６　（ｔ．　３Ｈ）．　
２．３　４　＜へ２Ｂ）．２．８　６　（８．　４Ｈ）
，　７．１　１　（ｄ．　Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＩＨ）．　
７．５　４　（ｔｅ　ＩＨ，　Ｊ＝４．９Ｈｙｔ），６
．１　０　（ａａ，　Ｊ＝９．４　４．　２．３　３Ｅ
！ｚ．　ＩＦ１１）．８．７　２　（ｄ．　Ｊ＝２．３
　３Ｈｚ，　ＩＨ）。
分析二０１３Ｈ１４Ｎ４０４に対する 計算値：　Ｏ−５３．７９；Ｈ−４．８６；Ｎ−１９．
３０。
実測値：　Ｃ−５３．６６；ａ−，ａ．８９；Ｎ−１９
．１２。
例６ スクシンイｉジル２−（２−（１−ゾａペニル）チオセ
ミ力ルバジドかよびデａモ乳酸はＡｌｌｒｉｃｈ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　（ミルウォーキー　ウィスコンシン州
）から購入した。
ＭｅＯＨ中チオセミカルバゾド（１当ｔ）Ｄよびゾロピ
オンアルデヒド（１．５当量）の溶液へ氷酢酸数滴を加
えた。混合物を４５分間加熱還流した。
反応混合物を回転蒸発器で濃縮したところ沈殿を生じた
。固体な゛濾別し、エーテルで洗浄し、真空で乾燥した
。収率７１％。
Ｍ１ｉ１０Ｈ中デロビオンアルデヒドチオセミ力ルバゾ
ン（１当ｔ）の溶液へデロモ乳酸（１当ｔ）’ｋ加えた
。反応混合物￥１−１時間還流加熱し、次に室温筐で冷
却し、溶媒を回転蒸発器で除去した。生じた黄色固体な
ｙｅｏａ　／エーテルとすりまぜ、淡黄色固体を単離し
、エーテルで洗浄し、真空で乾燥した。
ｌＦｉ　ＮＭＲδ：　１−０　０　（ｔ−　Ｊ＝＝７，
９［Ｊ　５Ｈ）−　２−１５　（ｒｎ．２Ｈ）．　７．
４　４　（ｔ，　．Ｔ＝４．９Ｈｚ）。
トり合或 ＤＭＦ　中酸（１当ｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（１当ｔ）、ｂよびトリエチルアミン（１．５当ｔ）
の溶液へ、ＤＭＦ中Ｄｅｃ　（　１当量）の溶液を滴加
した。反応混合物を室温で１６時間かき１ぜた。生じた
沈殿を濾別し、母液を濃縮乾固した。その残留物に酢酸
エチルを加え１時間かきまぜた。不溶物を濾別し、母液
を濃縮乾固した。
生或物を溶離削としてヘキサン／酢酸エチル（１／２）
’＆用いてフラッシュクａマトグラフィーを行ない望む
生底物聖灰色の固体として得た。
収率３５％。
１ＨＮＭＲδ：　ＬＯ　８　（ｔ，　　Ｊ＝７．９ｑＺ
，　　３Ｆ！）．　　２．２　４　（ｍ．２Ｆ！）．７
．４　０　　（ｔ．Ｉ＝４．９Ｈｚ，ＩＨ），８．１　
　１　　ＣＢ．　　１Ｆ１）。
例７ 造 ２−（メチルエテニルヒドラゾン）一４−チアゾールカ
ルポン酸臭化水素酸塩（１当量）〔田Ｊｏｈｎｅ，　Ｄ
，　Ｓｅｉｆｅｒｔ，　８．　Ｊｏｈｎｅおよびｌｌｊ
，　Ｉ３ｕ１ｋａ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　３　３　．　
２　５　９　（　１　９　７　Ｂ　）の方法によりｌｉ
Ｉｌ製〕をＤＭＩＰ　（　２　０ｓｄ／．？　）に溶か
した。Ｎ−ヒドａキシスクシンイミド（１当ｔ）かよび
トリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この均一混
合物へＤＯＯ　（　１当ｔ）の溶液を１５分にわたり滴
加した。反応混合物を室温で１６時間かきまぜた。
生じた沈殿を濾別し、母液を濃縮乾固して橙褐色固体を
得た。こり固体を酢酸エチル中に懸濁させ、室温で１時
間かきまぜた。不溶物を濾別し、母液を濃縮して褐色固
体を得た。固体をエーテルとすりまぜ、再び濾別して黄
褐色固体を得た。収率４０４。生底物の試料を溶離削と
してヘキサン／酢酸エチル＜　２／１　）を用いてシリ
カゲルの短い充填物に通して濾過した。溶離液を濃縮し
て望む生底物を淡黄色固体として得た。融点２０２〜２
０５°（分解）。
ＡＨ　ＮＭＲ　Ｊ：　１．９　２　（１１，　３Ｈ），
　１．９　６　（ａ．　３Ｅ［）．２．８　６　（８．
　４Ｈ）．　８．１　１　（８．　１幻。
質量スペクトｋ　：　ｌ／ｆｌ　＝　２　９　７　ＣＭ
＋１　）”例８ ４−アミノカルボン酸ｋｓ　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｇ（ミルウオーキー　ウィスコンシン州）から
購入した。
ＤＭＩＦ中４−インチオシアナト安息香酸（１当量）［
Ｄ，　Ｗ．　ＢｒｏｗｎｅおよびＧ．　Ｍ．　Ｄ７ｓｏ
ｎ，　Ｊ．　（！ｈｅｍ．　８ｏｃ，１７８（１９３４
）の方法に従い調珈〕およびトリエチルアξン（１，２
当ｔ）の溶液に、ｔ−プチルカルパゼート（１当量）の
溶液を加えた。反応混合物を室温で３時間かき筐ぜ、そ
の後濃縮乾固した。残留物を酢酸エチルに溶かし、１０
φクエン酸かよび塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｍ
ｇ８０４）　、濾過し、濃縮して望む生底物を灰色固体
として得た。収率７０％、融点１３１〜１３３０（分解
）。１ＨＮＭＲδ：　１．４　２　ＣＢ，　９Ｅ［）．
　７．６　７（ｄ．　ＪＡＢ＝８，９１｛ｚ，　２ｍ）
．　７．８　７　（ｄ，’，ｒＡＢ＝８．９ＨＺ，２Ｈ
）。
ル〕の合或 アセトエトリル中酸（１当量）かよびＮ−メチルモルホ
リン（１．１当ｔ）の溶液へ、アセトニトリル中スクシ
ンイミジルテトラクｏｏエチルカルポネート（１当ｔ）
の溶液を加えた。反応混合物を室温で１６時間かきまぜ
た。反応混合物へ酢酸エチルを加え、均一溶液を冷５％
クエン酸、冷水、冷飽和重炭酸ナトリウム水溶液、冷水
かよび冷塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｍｇ８ｏ，
）　、濾過し、濃縮して淡黄油状物を得た。この油を溶
離削としてヘキサ／／酢酸エチルを使用してシリカｒル
上でのフラッシュクａマトグラフイーを行なった。
生成物は黄色油状物として単離され、エーテルを加える
と固化した。固体を濾別し望む生我物を得た。収率２５
％。融点１６１〜１６３′ＪＩＨ　ＮＭＲδ：　１．５
　２　（８．　９Ｈ）．　２．８　８　（８．　４Ｈ）
．７．７　４　（ｄｌ　ＩＡＢ＝　１　０．０Ｈｚ．　
２Ｆ１）。
８．０　５　（ｄ．　　ＪＡＢ＝　１［１．ＱＨｚ，　
　２Ｈ）。
分析：　ＯｘｙＨａｏＮ４Ｅ’０６に対する計算値：　
Ｃ！−４９．９９；ＥＩ−４．９４；Ｎｌ３．７２８−
７．８５。
実６１ｉ（［　：　Ｃ！−５０．０５；Ｅｌ−４．９５
　；Ｎ−１　６．６４ｓ　−　７．９　５。
エーテル中Ｂｏｏスクシンイミジルエステルの懸濁液へ
エーテル中乾燥ＨＣｊ（３Ｊ）の溶液（乾燥エーテルに
ＨＪがスを通じることによりｖＩ４ｍ）を加えた。懸濁
液を室温で１６時間かきまぜた。反応混合物は全反応過
程にわたり不均一であった。
固体を濾別して望む壇酸塩生底物を得た。収率８０畳、
融点１５５〜１６０° ｌＨ　ＮＭＲδ：　２．８　８　（ｓ．　４Ｈ）．　８
．０　１　（ｓ，　，４｝｛）。
分析：　ＯｘａＨｘ３Ｎ４８０ｖ０．５ＨＣｊに対する
計算値：　Ｃ！−４４．００；Ｉ｛−４．１５；Ｎ−１
７．１０８−９．７９。
実測値：　ｃ−４４．５６；Ｉ｛−３．８８；Ｎ−１７
．０４８−９．７４。
例９ 工ｇＧの抱合 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（＋＝Ｊ｛７．８）２
ｄ中工ｇＧ　（分子量＝１　５５．０００　）１　０ｑ
の溶液へ、ジメチルホルムアミド中スクシンイミジル４
−ヒドラジノペンゾエート塩ＨｔＸ　（　３　０　１Ｉ
ＩＭ　）　１　７．２μＪｙ，−加えた。室温で５時間
かきまぜた後、反応混合物を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐ８５．２）に対して透析した。タンパク質に抱
合されたヒド５７７４．１　９８６）の方法により測定
した。要するに、ヒドラジノータンパク質抱合体を４−
二トロベンズアルデヒドと反応させることによりヒドラ
ジノ基をヒドラゾンに変えた。標準としてｐ−ニトａフ
エニルペンズアルデヒドと７エニルヒドラジンとのヒド
ラゾン（λｍ，エ＝４１２，ε＝２．４　１　Ｘ　１　
０’）な用いてヒド２ゾン／タンパク質分子の数聖分党
光度法で剣定した。２５〜３５優の修飾収率な得た。
例１０ ｎｕｐｏｎｔ　’Ｉ’ｃ−グルコサンキットを、９＆′
ｍＴｃ０４−１ＱＩ！１０１＠含有する水３−でｖ４製
しπ。この溶液２５０μＪ−聖０．１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（−５．２）中１〜５岬／一抱合工ｇ０２５０μ
１と混合した。室温で１時間インキュペーション後、活
性の〉９５％がタンパク質に保有されていることが放射
分析用ＥＩＰＩ，Ｏ　（Ｔ８Ｋ３０００カラム）かよび
インスタント薄層クロマトグラフイ−（ＩＴＬＯ）　Ｋ
より測定さ１１た。
Ｔｏで標識した１ｇＧ　８　０　（）　ｕａｔを片方の
後足に膿傷をもつラットに注射した。２４時間でラット
を殺した。放射能分布を測った。
器　官　　　　　注射用ｔ／組織グラム優血　　液　　
　　　　　　　　　１．３　６腎臓　　　１．１１ 感染筋　　　　　　０．７６ 正常筋　　　　　　０．１２ 肝臓　　　０．８１ 感染筋／正常筋比＝６．３ 例１１ （ＤＤ）１！！夕冫パク質な５〜１０ａｖ／一に濃縮し
、ｆＪ｛８．５り１２．５ｍＭホウ酸塩緩衝液中２０倍
モル過剰のスクシンイミゾル６−ヒドラジノビリジン−
３−カルポキシレート塩酸塩で修飾した。４℃で５時間
インキュベーション後（かだやかにかきまぜながら）、
試料をがス抜きした高純度水（不純物１　０−’）に対
して約１２時間透析した。
酢酸中で試料０．５　５　Ｍをつくり６Ｍ尿素により１
　：　１　ｖ／ｖで希釈することによって修飾ＤＤ（Ｆ
ｌｉ）複合体から７ラグメントｘ１″４！：分離した。
試料の一Ｙ　１　０　Ｎ　ＮａＯＨで５．５に調節し、
次に試料ヲ１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（　ｐＨ．５．７
　）に対して透析し過剰の試薬を除いた。透析中にＤＤ
タンパク質が沈殿し修飾されたプラグメン｝　Ｅｌが溶
液中に残った。ＤＤ沈殿を工遠心により容易κ除去され
た。
修飾Ｉ！！１を前記のようにＴＯ　−　９　９　ｍグル
コヘデトネートとの反応によりＴＯ　−　９　９　ｍで
標識しπ。このＴＣ−９９ｍＷ識Ｅ１を用いて家兎モデ
ルノ血栓を造影Ｌ　タ（　Ｄ．　Ｃｏｌｌｅｎ等，　Ｊ
．０１１ｎ．工ｎｖθａｔ，７１，３６８〜３７６頁（
　１　９８９　）参照〕。
例１２ モノクａ−ン抗体５Ｅ８の抱合［Ｅ−　Ａ．　Ｏｈｓｎ
等，ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４　９　＊　３
　６　４　２〜３６４９（１９８９）参照〕 ｐＨ８．５の１　２．５　ｍＭホウ酸塩緩衝液中１４倍
過剰のスクシンイミジル６−ヒドラジノビリジンー３−
力ルポキシレート塩酸塩を用いて５　Ｅ８　（＠度５〜
１０η／一）を修飾した（室温で５時間）。
この抗体抱合体を２Ｑ　ｍＭクエンｆＲ塩緩衝液（ｐ｝
Ｉ５，２　Ｎａ’ｊｊ中Ｉ　Ｄ　Ｄ　ｍＭ）に対して透
析した。遠心して少量の混濁を除去後、そり修飾の度合
（前記のように分光光度法で副定）はタンパク質分子当
りヒドラジン基６．１５であることが分った。ＥＬ工８
Ａかよび免疫細胞接着による分析は免疫反応性が失なわ
れていないことを示した。
前記の特定化合物かよび方法の詳細は例示であって本発
明の範囲を制限するもりではない。
▼ 六 ヘ ト Ｋ 第１頁の続き ＠Ｉｎｔ．　ＣＩ，’ 識別記号 庁内整理番号 ＠発 ＠発 クリステイン　エム． ギアンドメニコ ジョン　エイ．ズビエ タ アメリカ合衆国ペンシルバニア州　エクストン，へりテ
ツジ　レーン　１３７ アメリカ合衆国ニューヨーク州　アルバニイ，フエアー
ローン　アベニュー　１０８ 書　（自発） Ｓ 平ｔｉ．２年希月 特許庁長官殿 １．事件の表示 平威２年特許願第４１３８９号 ２．発明の名称 タンパク質の標識化 ３．補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ジョンソン　マセイ インコーボレーテツド ４．代理人 居所 〒１００東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町
ビルヂング３３１

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式（ I ）または（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ａは炭素または窒素原子であり、 Ｂは炭素または窒素原子であり、 Ｄは直接の結合、ＣＨ＿２、Ｃ＝Ｏまたは▲数式、化学
    式、表等があります▼であり、 ＥはＣ＝ＯあるいはＦと共にマレイミジル基を形成し、 Ｆは、ＥがＣ＝ＯあるいはＥと共にマレイミジル基を形
    成する場合、中性または塩基性水性媒質中で第１級アミ
    ンにより容易に置換される基であり、 Ｒは水素または低級アルキル基であり、 Ｒ′とＲ″は同じでも異なつてもよく、水素および低級
    アルキルから選ばれ、 Ｘは負の対イオンである）を有するヒドラジンまたはヒ
    ドラジド化合物。
  2. （２）Ｄは環４−位への直接結合である、 請求項第１項記載の化合物。
  3. （３）Ｅはカルボニルであり、ＦはＮ−オキシスクシン
    イミジル、テトラフルオロフェノレート、Ｎ−オキシベ
    ンゾトリアゾールおよびイミダゾレートからなる群から
    選ばれ、Ｘはハロゲン化物、硝酸塩、トリフルオロ酢酸
    塩、テトラフルオロホウ酸塩、および硫酸塩からなる群
    から選ばれる、請求項第２項記載の化合物。
  4. （４）Ｒは水素またはメチル、Ｅはカルボニル、ＦはＮ
    −オキシスクシンイミジルであり、そしてＸはＣｌであ
    る、 請求項第２項記載の化合物。
  5. （５）ＡとＢ両方とも炭素原子あるいはＡとＢの一方が
    炭素で、他方は窒素である、請求項第４項記載の化合物
    。
  6. （６）Ａは炭素、Ｂは窒素、そしてＲは水素である、請
    求項第４項記載の化合物。
  7. （７）ＡとＢは窒素原子でＲは水素である、請求項第４
    項記載の化合物。
  8. （８）ＤはＣ＝Ｏ、ＣＨ＿２またはチオアミド▲数式、
    化学式、表等があります▼で、環の４−位につく、請求
    項第１項記載の化合物。
  9. （９）ＤはＣ＝Ｏまたはチオアミドである、請求項第８
    項記載の化合物。
  10. （１０）ＥはＣ＝Ｏ、ＦはＮ−オキシスクシンイミジル
    、テトラフルオロフェノレート、Ｎ−オキシベンゾトリ
    アゾールおよびイミダゾレートからなる群から選ばれ、
    Ｘはハロゲン化物、硝酸塩、トリフルオロ酢酸塩、テト
    ラフルオロホウ酸塩および硫酸塩からなる群から選ばれ
    る、請求項第９項記載の化合物。
  11. （１１）ＤとＥはカルボニル、ＦはＮ−オキシスクシン
    イミジルであり、ＸはＣｌである、請求項第８項記載の
    化合物。
  12. （１２）Ｄはチオアミド、Ｅはカルボニル、ＦはＮ−オ
    キシスクシンイミジルであり、ＸはＣｌである、請求項
    第８項記載の化合物。
  13. （１３）Ｅはカルボニル、ＦはＮ−オキシスクシンイミ
    ジル、Ａは炭素、Ｂは窒素、ＲおよびＲ′は水素、そし
    てＲ″はエチルである、請求項第２項記載の化合物。
  14. （１４）型： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｆ，Ｅ，Ｒ，Ｒ′およびＲ″は請求項第１項で
    定義した通りである）を有するヒドラジン化合物。
  15. （１５）Ｅはカルボニル、ＦはＮ−オキシスクシンイミ
    ジル、Ｒ′は水素そしてＲ″はエチルである、請求項第
    １４項記載の化合物。
  16. （１６）Ｅはカルボニル、ＦはＮ−オキシスクシンイミ
    ジルであり、Ｒ′とＲ″は両方ともメチルである、請求
    項第１５項記載の化合物。
  17. （１７）請求項第１項記載のヒドラジンまたはヒドラジ
    ド化合物と高分子との反応により形成される抱合体。
  18. （１８）高分子が免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トからなる、請求項第１７項記載の抱合体。
  19. （１９）金属イオンと請求項第１７項記載の抱合体とか
    らなる標識した高分子。
  20. （２０）金属イオンはＴｃおよびＲｅからなる群から選
    ばれる、請求項第１９項記載の標識した高分子。
  21. （２１）高分子は免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トからなる、請求項第１９項記載の標識した高分子。
  22. （２２）高分子を金属イオンで標識する方法において、
    少なくとも一つの遊離ヒドラジン基またはヒドラジド基
    をもつ化合物と少なくとも一種の高分子とからなる抱合
    体を適当な金属種と標識化を誘発する条件で反応させる
    工程を含む上記方法。
  23. （２３）少なくとも一つのヒドラジン基またはヒドラジ
    ド基をもつ化合物と少なくとも一種の高分子とを、反応
    を誘発する条件で反応させることにより抱合体を形成さ
    せる、 請求項第２２項記載の方法。
  24. （２４）金属種は還元Ｔｃ種からなる、 請求項第２２項記載の方法。
  25. （２５）キレート形成酸素配位子存在下にＴｃｏ＿４＾
    −を還元剤と反応させることにより還元Ｔｃ種をつくる
    、請求項第２４項記載の方法。
  26. （２６）キレート形成酸素配位子はグルコヘプトネート
    、グルコネート、２−ヒドロキシイソブチレート、ラク
    テートおよび４，５−ジヒドロキシ−１，３−ベンゼン
    ジスルホネートからなる群から選ばれる、 請求項第２５項記載の方法。
  27. （２７）還元剤は第一スズイオンからなる、請求項第２
    ５項記載の方法。
  28. （２８）少なくとも一種の高分子は免疫グロブリンから
    なり、少なくとも一つのヒドラジン基またはヒドラジド
    基をもつ化合物は、スクシンイミジル４−ヒドラジノベ
    ンゾエート塩酸塩、スクシンイミジル６−ヒドラジノピ
    リジン−３−カルボキシレート塩酸塩、スクシンイミジ
    ル２−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチネートおよ
    びスクシンイミジル４−チオセミカルバジドベンゾエー
    ト半塩酸塩からなる群から選ばれる、請求項第２３項記
    載の方法。
  29. （２９）金属種は還元Ｒｅ種からなる、 請求項第２２項記載の方法。
  30. （３０）高分子を金属イオンで標識する方法において、
    適当な金属種を請求項第１８項記載の抱合体と標識化を
    誘発する条件下で反応させる工程を含む上記方法。
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