JP3070059B2 - Ａｄｐ−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、作物植物のデンプン生合成能を調節するた
めに作物植物の形質転換に使用する、ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼをコードするDNAに関する。

デンプンは、葉において光合成が行なわれる間の炭酸
固定の重要な最終生成物であり、且つ種子や果実中の重
要な貯蔵生成物である。経済上の見地から、３種の穀物
作物、すなわち小麦、稲及びトロモロコシの食用部分に
よって生産されるデンプンは、カロリーとして計算した
時に世界中の食糧の約2/3を占める。

デンプンは光合成性の細胞中のプラスチド区画中で、
即ち葉緑体中で又は非光合成性の細胞中のアミロプラス
ト中で合成される。葉におけるデンプン生合成の生化学
的経路はすでに十分に特徴づけられている（添付図面の
第１図参照）。これに対して、植物の貯蔵器官における
デンプン生合成の経路は、ほとんど知られていない。し
かしながら、小麦の胚乳細胞から生の（intact）のアミ
ロプラストを単離する方法の最近の進展は、貯蔵器官に
おけるデンプン生合成の経路の解明に寄与している。別
の研究によれば小麦の胚乳におけるデンプン生合成の経
路と、小麦の葉におけるデンプン生合成の経路とは異な
ることが明らかにされている（添付図面の第１図及び第
２図参照）。

プラスチド酵素であるADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼは、光合成植物の諸器官におけるデンプン生合
成の重要な調節酵素である。葉緑体ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼは、アロステリックエフェクターで
ある３−ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸によって
翻訳後（post−trans−lationally）に調節される。従
来研究された植物の葉のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ酵素の全ては試験管内で（in vitro）も３−ホ
スホグリセリン酸によって活性化され、しかもフルクト
ース−1,6−ビスリン酸、フルクトーク−６−リン酸及
びホスホエノールピルビン酸によっては、活性化される
度合は小さい。これらの代謝中間物質は基質のKm値を下
げ、しかも酵素触媒（enzyme−catalyzed）反応の最大
速度Vmaxを増大させる。

更に、植物の葉由来のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ酵素は、試験管内（in vitro）でオルトリン酸
によって阻害されるが、この場合100μＭよりも低いオ
ルトリン酸濃度で該酵素の活性の半値最大阻害（half−
maximal inhibition）が一般に達せられる。

葉のデンプン生合成は、試験管内でADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素のレベル（level）で、３−
ホスホグリセリン酸及びオルトリン酸の葉緑体内濃度の
変動（fluctuation）により調節される。この調節機構
にとって極めて重要なことは、葉緑体の内膜の選択的透
過性である。葉緑体の内膜は、トリオース−リン酸、ジ
カルボキレート、及びオルトリン酸に対して選択的に透
過性であり、それらは葉緑体から細胞質ゾル（cytoso
l）へ急速に且つ特異的に（specifically）輸送され、
またその逆も起ることが明らかにされている。この能動
輸送（能動透過ともいう）の機構は、リン酸／トリオー
ス−リン酸輸送体（translocator）を経て細胞質ゾルか
らオルトリン酸の向流平衡内部移動を伴なう。オルトリ
ン酸／トリオース−リン酸輸送体を経由する代謝中間物
質の能動輸送は、通常の昼−夜（light−dark）の推移
の間のプラスチド内のオルトリン酸と３−ホスホグリセ
リン酸の比（すなわち、〔Pi〕／〔３−PGA〕）の変化
を伴なう。光合成の間に、CO₂−固定から生成した３−
ホスホグリセリン酸は、葉緑体内に蓄積する。葉緑体の
内部から細胞質ゾル迄の間の３−ホスホグリセリン酸に
ついて生じた濃度勾配は、オルトリン酸を移入するのと
引替えに３−ホスホグリセリン酸の若干を細胞質ゾル中
に移送（export）することを招く。移入されたオルトリ
ン酸は、次後に光リン酸化を経てATP生成に利用され、
そのために〔Pi〕／〔３−PGA〕の葉緑体内の総体的な
比（overall chloroplastic ratio）は、昼間周期の間
は低いままである。このようにして、ADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ酵素は、デンプン生合成を続けさ
せながら、明所中ではアロステリックに活性化される。
夜間周期の間は、CO₂−固定の減少及び光リン酸化の低
下があり、それに伴なって、ATPの加水分解の結果とし
て葉緑体内のオルトリン酸濃度の増加がある。これは葉
緑体内の〔Pi〕／〔３−PGA〕の比を大きくし、それに
よってADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性とデ
ンプン生成とを阻害する。

アロステリックエフェクターによるADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼ活性の調整（モジュレーション）
に加えて、葉のデンプン生合成は、葉緑体のアデニル酸
エネルギー充足によっても調節される見込みもある。

発育中の胚乳におけるデンプン生合成の最も重要な調
節因子（regulatory feature）は、デンプン生合成用の
酵素の合成の調節を経る粗い（coarse）制御機構である
可能性が多い。最近の研究では、デンプン生合成経路に
おける律速酵素（ペースメーカー酵素ともいう）の同定
にかなり重点をおいている。あいにく、穀物植物の胚乳
の発育する期間全体にわたるデンプン生合成用酵素につ
いて試験管内（in vitro）の酵素活性の測定に関する研
究は、この問題を余り解明するところがない。その理由
は、試験管内（in vitro）の酵素活性と生体内（in viv
o）の酵素活性とを互いに相関づけることが難しく、ま
た大部分のデンプン生合成用酵素は、同等（co−ordina
tely）に発現すると思われるからである。

現在のところ、ADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼの翻訳後調節が、穀物植物の貯蔵器官において生体内
（in vivo）で発現して働らくことを実質的に示す証拠
はない。穀粒のアミロプラストは、正常な発育中には、
葉緑体になるまで、発育せず、しかも機能上でも関係し
ない。上記因子は、小麦の胚乳でのデンプン生合成経路
にトリオースリン酸が掛かい合いをもたない事実に組合
せて考えると穀物の胚乳のアミロプラストにおけるADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼのアロステリック制
御は、生体内では何らの役割りがないことを示唆する。
しかしながら、トウモロコシの胚乳由来のAPD−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼ酵素は、３−ホスホグリセリ
ン酸によって、試験管内（in vitro）では、植物の葉か
ら単離した該酵素と同じ程度迄活性化させる。反対に、
稲の胚乳由来のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
酵素は、5mMの３−ホスホグリセリン酸（３−phospho−
glycerate）によって試験管内（in vitro）では僅か1.2
倍だけ活性化されるのみである。

穀物植物の胚乳の酵素の全てに関して、３−ホスホグ
リセリン酸の存在は、オルトリン酸による阻害に対する
前記酵素の感受性を低減し、このことは３−ホスホグリ
セリン酸が、オルトリン酸の結合する部位（サイト）に
近い所で、該酵素に結合することを示している。すなわ
ち、胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素
中においてアロステリックフェクターが結合する部位が
保存されてあることに拘わらず、また３−ホスホグリセ
リン酸によって試験管内（in vitro）でトウモロコシ胚
乳の酵素が強く活性化される能力があるにもかかわら
ず、上記のアロステリック効果が生体内で働く意義（si
gnificance）は未だよくわかっていない。

本発明の目的は、作物植物のデンプン生合成能を調節
するために作物植物の形質転換に使用する、ADP−ゲル
コース・ピロホスホリラーゼをコードするDNAを提供す
ることにある。

本発明の要旨によれば、ADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼをコード又は規定し且つ添付図面の第３図、
第４図又は第５図に示したヌクレオチド配列を有するDN
Aが提供される。

本発明のDNAであってADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼをコードし且つ添付図面の第３図に示したヌクレ
オチド配列を有するDNAを含有するプラスミドはWL:AGA.
1と命名され、該プラスミドを含有して保留している大
腸菌（E.coli）TG2は寄託番号NCIB 40065として1988年1
0月19日付けで英国アバディーンのザ・ナショナル・コ
レクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン
・バクテリアに寄託されてある。

また、本発明のDNAであって添付図面の第４図に示し
たヌクレオチド配列を有するDNAを含有するプラスミド
はWE:AGA.3と命名され、該プラスミドを含有して保留し
ている大腸菌TG2は寄託番号NCIB 40066として1988年10
月19日付けで英国アバディーンのザ・ナショナル・コレ
クション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・
バクテリアに寄託されてある。

さらにまた、本発明のDNAであって添付図面の第５図
に示したヌクレオチド配列を有するDNAを含有するプラ
スミドはWE:AGA.7と命名され、該プラスミドを含有して
保留している大腸菌TG2は寄託番号NCIB 40067として198
8年10月19日付けで英国アバディーンのザ・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリアに寄託されてある。

前記のDNAクローン類は、他の植物種、特に穀類、例
えば小麦、トウモロコシ、大麦及びモロコシ（sorghu
m）、並びに食用作物例えばジャガイモの同等の遺伝子
用のプローブとして使用し得る。

前記で定義したDNA類の主な用途は、デンプン生合成
を調節するために作物植物の形質転換に利用することに
ある。

以下の記載では、小麦からADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼを単離する方法、小麦の胚乳及び葉の前記
酵素の動力学的性質、ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼをコードしたcDNAクローン類の単離方法を説明す
る。また、前記cDNA類の構造上の特徴も詳細に記載す
る。前記クローン類は対応する遺伝子の単離に使用し得
る。また前記cDNA類と前記遺伝子類の両方は、デンプン
の収量の増大を生起させる諸研究に使用できる。１つの
可能な応答の用途は、デンプン生合成における正味（ne
t）の調節にどのようにADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼが寄与しているか決定するために、形質転換され
た作物植物におけるADP−グルコース・ピロホスホリラ
ーゼの遺伝子の導入量を増加させ、次いでその後に、例
えば穀物植物において穀粒がみのる過程中に蓄積された
デンプンの量又は濃度を変えるために、前記DNA配列を
使用することであろう。小麦の胚乳のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼの遺伝子の付加的なコピーの導入
は、小麦の胚乳のアミロプラスト内の酵素の濃度をより
大きくするはずである。遺伝子の発現の増大も、ADP−
グルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子の５′−未転写
領域中にエンハンサー（enhancar）配列の多数のコピー
を導入することによって励起され得る。前記酵素がデン
プン生合成に対して律速酵素である場合には、その場合
にはデンプン生合成速度が、形質転換された植物におい
て増大すると期待される。本発明を利用すると、タンパ
ン質工学により胚乳酵素の動力学的諸性質を変えること
もできる、例えばオルトリン酸結合部位を巧みに加工操
作することによって上記酵素をオルトリン酸阻害に対す
る感受性が低くすることができる。多数の別のパラメー
ターも改善し得ることも明らかであろう。本発明を、実
例として以下の実施例により、添付図面を参照して説明
する。

添付図面の第１図は葉におけるデンプンとグルコース
の生合成経路に伴なう諸反応を示す〔Preiss（1984年）
を修正した〕。使用した略語は以下のものを表わす。す
なわち、Ｇ−３−Ｐはグリセルアルデヒド−３−リン酸
を表わし;DHAPはジヒドロキシアセトンリン酸を表わし;
Piはオルトリン酸を表わし;PPiは無機ピロリン酸を表わ
す。前記反応は次の酵素によって触媒的に促進される。

１）ホスホグリセリン酸・キナーゼ／グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ ２）トリオース−リン酸・イソメラーゼ ３）アルドラーゼ ４）フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ ５）ヘキソース−リン酸・イソメラーゼ ６）ホスホグルコムターゼ ７）ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ ８）デンプンシンターゼ ９）UDP−グルコース・ピロホスホリラーゼ 10）スクロースリン酸シンターゼ 11）スクロースホスファターゼ 12）オルトリン酸／トリオースリン酸輸送体 13）無機ピロホスファターゼ 添付図面の第２図は、小麦の胚乳におけるデンプン生
合成の提案された代謝経路（Keelingら、1988年）を示
す。使用した略号は第１図と同じである。この反応は次
の酵素によって触媒的に促進される。

１）スクロースシンターゼ ２）UDP−グルコース・ピロホスホリラーゼ ３）ヘキソキナーゼ ４）ホスホグルコムターゼ ５）ヘキソース−リン酸・イソメラーゼ ６）ATP−依存ホスホフルクトキナーゼ ７）PPi−依存ホスホフルクトキナーゼ ８）アルドラーゼ ９）トリオース−リン酸・イソメラーゼ 10）ヘキソース−リン酸輸送体（？） 11）ADP−ズルコース・ピロホスホリラーゼ 12）デンプンシンターゼ 13）スクロースホスフェート・シンターゼ 14）スクロースホスファターゼ 第３図はクローンWL:AGA.1のDNA配列を示し；第４図
はクローンWE:AGA.3のDNA配列を示し；第５図はクロー
ンWE:AGA.7のDNA配列を示す。

実施例1.小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼの同定と精製 1.1 酵素の精製 ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼをフェニール
−セファロース上でクロマトグラフィーで部分的に精製
し、次いでイオン交換媒体MonoQ HR 5/5上で２回精製
し、更にゲル濾過媒体、すなわちSuperose12 HR 10/30
を通して１回精製することによって、精製した。代表的
な精製結果を次の第１表に示した。

前記精製操作の各工程でためた（pooled）ADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼ抽出液をSDS/ポリアクリル
アミドゲルで分析した。ゲル濾過の後では、得られた酵
素商品はほとんどタンパク質不純物を含有しておらず、
90％よりも高い純度であった。分子量51,000のポリペプ
チドは、前記精製の各工程で選択的に精製された。すな
わち、得られた小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼ酵素はサブユニット分子量51,000を有す
る。

小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
の本来の（native）分子量は、前記の部分的に精製され
た酵素をSuperose 12 HR 10/30上で再びクロマトグラフ
ィー精製することにより245,000±3,000であると決定さ
れた。これは、タンパク質をSephacryl S−300 sf上で
クロマトグラフィー精製することにより決定された推定
分子量260,000±20,000とほぼ一致している。各々の場
合に、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性の溶
出容量を、既知のタンパク質標品、すなわちフェリチ
ン、カタラーゼ及びウシ血清アルブミンの溶出容量と比
較することによって分子量を決定した。このようにし
て、本発明者らは、小麦の胚乳の酵素は同一の分子量の
４つのサブユニットからなると結論を下した。

1.2 酵素の動力学的性質 部分的に精製した小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼは、３−ホスホグリセリン酸20mM迄の
濃度では活性化されなかった。これに対して、小麦の葉
の酵素は、３−ホスホグリセリン酸10μＭによって14.5
倍活性化される。小麦の胚乳の酵素はオルトリン酸で阻
害されることが認められ、酵素活性の半値最大阻害を得
るためには700μＭのオルトリン酸が必要であった。こ
れは、小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼの半値最大阻害を得るのに必要な濃度（56μＭ）より
もかなり高い。トウモロコシの胚乳のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼはアロステリック応答性（respos
iveness）を同様に欠くことが、先に既に観察されてい
る。トウモロコシの胚乳においては、この現象は、それ
以来、前記酵素に対するプロテアーゼ活性の影響のせい
だとされていた。その理由は、1.5mMフェニルメタンス
ルホニルフルオリド及び10μg/mlキモスタチンの存在下
で精製した場合には、トウモロコシの胚乳のADP−グル
コース・ピロホスホリラーゼは、３−ホスホグリセリン
酸によって試験管内（in vitro）で活性化されることが
証明されているからである。しかしながら、本発明者ら
は、プロテアーゼ阻害物質であるキモスタチン、ロイペ
プチン及びフェニルメタンスルホニルフルオリドの存在
下で小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼを精製した。本発明者らは、３−ホスホグリセリン酸
による、試験管内（in vitro）での上記酵素標品のアロ
ステリック活性化を例証することができなかった。従っ
て、上記の結果は、小麦の胚乳の酵素は３−ホスホグリ
セリン酸によってアロステリックに活性化されないこと
を示唆する。

植物の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵
素に対する３−ホスホグリセン酸とオルトリン酸の組み
合わさった効果と一致して、小麦の胚乳の酵素の阻害は
３−ホスホグリセリン酸によって除去される。1mMの３
−ホスホグリセリン酸の存在下では、オルトリン酸に対
する小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼのＩ_0.5は1.5mM迄増加する。これは前記酵素は３−ホ
スホグリセリン酸の存在下で該酵素をより活性な形に変
えるのに必要な、必要配座変化をすることができない
が、代謝中間物質には結合できることを示す。この３−
ホスホグセリン酸とオルトリン酸との相互作用からみ
て、３−ホスホグリセリン酸の結合部位は、恐らくは前
記酵素の３次元構造内のオルトリン酸結合部位に近いで
あろう。

1.3 酵素に対する抗体の産生 多数の別々の実験から前記のようにして単離した、単
離酵素サブユニットをプール（pool）することによっ
て、ウサギを免疫化させるのに十分なタンパク質を得
た。次いで51KDのADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼポリペプチドをポリアクリルアミドゲルの薄切り（ス
ライス）から電気溶出によって明白な同質性物（homoge
neity）に精製した。51KDのADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼポリペプチドに対する抗血清を調製した。ウ
サギの免疫処理は、本質的にMayer及びWalkerの方法（1
978）に従って行なった。

得られた免疫血清は、小麦の胚乳の粗抽出物からADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性体（Activity）
を沈殿させた。免疫血清と共に抽出物を培養し、酵素−
Igγ−プロティンＡ−セファロース接合体を遠心分離し
た後に、ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性体
の10％のみが上澄画分中に残った。洗滌した酵素−Igγ
−プロティンＡ−セファロース接合体を、酵素活性につ
いて、直接に検定すると、ADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼ活性体をペレット画分中に検出できた。胚乳
抽出物中に存在する全酵素活性体の約70％が、次後にペ
レット画分中に免疫沈殿物として回収された。対照（co
ntrol）実験では、ADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼを用いて動物類を初期免疫処理する前に該動物類から
採取した前免疫（pro−immune）血清は、ADP−グルコー
ス・ピロホスホリラーゼ活性体を分配（portition）し
なかった。抗−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ血清を使用した小麦の胚乳の可溶性タンパク質
全体のウェスタン・ブロット分析によれば、単一の51kD
の免疫活性ポリペプチドの存在が明らかにされた。同様
の実験では、ホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼホロ酵素に対して誘導された抗体もま
た、51kDの分子量の小麦胚乳内にのみ存在する１つのポ
リペプチドと認められた。

1.4 胚乳及び葉の酵素のサブユニット構造 小麦の胚乳及び小麦の葉の中のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼの器官特異的（organ−specific）イ
ソ酵素の存在を、酵素サブユニットを検出するための抗
−小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ血清
を使用して、前記の器官由来のタンパク質抽出物のウェ
スタンブロット分析によって確認した。前述のように、
小麦胚乳の酵素は４つの51kDサブユニットからなる。小
麦の葉のイソ酵素のサブユニット構造を決定するための
ウェスタンブロット試験では、小麦の葉の粗抽出物中に
は免疫活性タンパク質のバンド（band）は検出できなか
った。小麦の葉の抽出物を、フェニル−セファロース及
びSuperose 12 HR 10/30上でクロマトグラフィー精製し
た後には、48.5〜49.0kDの分子量を有する単一の免疫活
性ポリペプチドがウェスタンブロット中に検出された。
従って、小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラ
ーゼポリペプチドは、小麦の胚乳由来の対応するタンパ
ク質よりも約2.5kD小さい。小麦の葉の酵素と胚乳の酵
素との間の相異を示す別の証拠（evidence）を以下に示
す。

実施例２ 小麦のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼのcDNA類の単離と特定 2.1 小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼc
DNAクローンの同定 小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼを
コードしたcDNAクローンを同定するために、抗−ホウレ
ンソウ葉ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ血清を
用いて、増殖させた小麦の葉cDNAライブラリーから３×
10⁴個のバクテリオファージを選別した。最初の選別で
選択した７つの陽性クローンのうち、最も強い信号を発
生する３つのクローンを再選別した。これら３つのクロ
ーンのうち１つだけが次回の選別で強い陽性信号を発生
した。非組換体λgT11に関連して、上記cDNAクローンが
出した信号の強さは、該クローンが小麦の葉のADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼをコードしたcDNAを含有
することができることを示唆する。小麦の葉のADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼのcDNAクローンと推定さ
れるものをWL:AGA.1と命名した。DNAはクローンWL:AGA.
1から調製した。

上記DNAを酵素EcoR1を用いて制限エンドヌクレアーゼ
消化し、アガロースゲルで電気泳動にかけた後で、クロ
ーンWL:AGA.1は950bpの大きさのcDNA挿入断片を含有す
ることが明らかにされた。上記cDNA挿入断片をニックト
ランスレーションによって³²Pでラベルし、小麦の葉及
び小麦の胚乳由来のポリ（Ａ）−含有RNAのノーザンブ
ロットをプローブするのに使用した。このプローブは、
小麦の胚乳及び小麦の葉のRNA試料中の、それぞれ約1.8
kb及び1.7kbのmRNAバンドとハイブリダイズする。ここ
で決定された小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−ズルコー
ス・ピロホスホリラーゼmRNAの大きさは、稲の胚乳のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼをコードしたcDNA
でプローブした小麦RNA類のノーザンブロットから、Kri
shnanらによって得られた評価（estimate）（1986年）
と密接に一致した。前記のcDNA挿入断片の大きさと同様
のmRNA種の大きさの比較によって、WL:AGA.1cDNA挿入断
片は、完全な小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼmRNA配列の約50％を含有することが示された。

2.2 クローンWL:AGA.1の配列分析 クローンWL:AGA.1由来のcDNA挿入断片は947bpの長さ
であり、且つ小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼのＣ−末端に301個のアミノ酸をコードする
（第３図参照）。上記WL:AGA.1タンパク質中には、成熟
した小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ
ポリペプチド配列の約70％が含まれる。前記cDNAは、対
応するmRNAの３′−未翻訳領域中に45個のヌクレオチド
まで伸び（extend）、且つ位置942〜947に配置された推
定のポリアデニル化信号AATAAAで終わる。従って、小麦
の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA配列
中にはポリ（Ａ）尾（tail）は存在しない。前記WL:AG
A.1タンパク質について、Devereuxら（1987年）のプロ
グラムを使用してヒドロパシー・インデックス（hydrop
athy index）（KyteとDoolittle、1982年）及び第２の
構造予測値（prediction）（ChouとFasman、1978年）を
算出した。前記WL:AGA.1のKyteとDoolittle（1982年）
のヒドロパシー・インデックスは、葉緑体の可溶性画分
中の配置（location）（KaiserとBasshom、1979年）と
一致している。ChouとFasmanの第２の構造予測値は、小
麦の葉と小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼタンパク質の比較に用いた（後記参照）。

2.3 小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラー
ゼcDNAクローン類の単離 小麦の胚乳のcDNAライブラリーを作った。一本鎖cDNA
の前精製（GublerとHoffman、1983年）を行なわずに、
第二の鎖cDNAの合成にRNアーゼＨ（リボヌクレアーゼ
Ｈ）と大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いる方法で、オリ
ゴdT−セルロース精製した小麦の胚乳RNAから２本鎖cDN
Aを調製した。未増殖小麦胚乳のcDNAライブラリーは、
小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA
挿入断片、WL:AGA.1に対して相同性の配列の存在につい
て選別された。３×10⁴個の組換えバクテリオファージ
の選別において、10個の陽性信号が検出された。これら
10個のクローン類のうちの６個を２回の追加の選別の間
にプラーク精製し、これらをクローンWE:AGA.1、WE:AG
A.3、WE:AGA.4、WE:AGA.5、WE:AGA.6及びWE:AGA.7と命
名した。これら６個の小麦の胚乳のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼcDNAクローンと推定されるものから
DNAを調製した。上記DNA類をECoR1を用いて制限エンド
ヌクレアーゼ消化し、アガロースゲル電気泳動を行なっ
た後には、前記クローン類のcDNA挿入断片類の大きさは
400bp〜1800bpの範囲にわたることが示された。

2.4 クローンWE:AGA.3の配列分析 クローンWE:AGA.3の由来のcDNA挿入断片は1272bpの長
さであり（第４図参照）、該cDNAは３′−末端に65個の
ヌクレオチドの長さのポリ（Ａ）尾（tail）を含む。TA
G終止コドンからポリ（Ａ）尾の始め迄のWE:AGA.3cDNA
の３′−未翻訳領域は、317bpの長さである。317bpのW
E:AGA.3cDNAの３′−未翻訳領域には２つの重複したポ
リアデニル化信号が存在し；このうちの１つの配列AATA
AAはポリアデニル化部位の104bp上流に配置され、もう
１つの配列AATAAGはポリアデニル化部位の100bp上流に
配置される。

クローンWE:AGA.3はまた、ポリアデニル化部位から31
bp上流の位置1176〜1181に第３のポリアデニル化信号と
推定される信号、AATAAAを含む。植物mRAN中のポリアデ
ニル化信号の位置は、通常ポリアデニル化部位のヌクレ
オチド22〜36個分上流に存在する（Joshi,1987年）の
で、この場合クローンWE:AGA.3中の上記第３のポリアデ
ニル化信号は、多分対応するADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼmRNAのプロセッシング（processing）の間
に、ポリ（Ａ）付加部位の選択を意味する信号であるら
しい。クローンWE:AGA.3の転写解読枠は、小麦の胚乳の
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼのアミノ酸296個
をコードした890bpの長さである。すなわち、分子量33,
200のタンパク質が、クローンWE:AGA.3によってコード
され、該クローンは成熟中麦の胚乳のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼサブユニットの65％の大きさに相
当する。

2.5 クローンWE:AGA.7の配列分析 最も大きな小麦胚乳ADP−グルコース・ピロホスホリ
ラーゼcDNA、すなわちWE:AGA.7は、1798bpの長さであり
（第５図参照）、1500bpの転写解読枠を含有する。この
転写解読枠は分子量55,000のタンパク質をコードし、該
タンパク質は成熟小麦の胚乳のADP−グルコースピロホ
スホリラーゼポリペプチドの約4.5kDと推定された分子
量を越える。クローンWE:AGA.7によってコードされた最
初の33個の残基からなるアミノ酸配列は、葉緑体タンパ
ク質のシグナルペプチド（transit peptideともいう）
（ColmanとRobinson、1986年）及びアミロプラストのシ
グナルペプチド、すなわち顆粒結合（granule−bound）
デンプンシンターゼ（Klosgenら、1986年）に似た性質
を示す。上記配列は加水分解されてあり且つ塩基性のア
ミノ酸類、特にアルギニンが多く、該アルギニンは該配
列中に４〜５残基毎に見出される。ADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼシグナルペプチドと推定されるシグ
ナルペプチドと顆粒結合したデンプンシンターゼシグナ
ルペプチドとは、アミノ酸含有量において類似している
のにもかかわらず、明らかな配列相同性は依存しない。
また、核をコードした葉緑体タンパク質のシグナルペプ
チド配列、例えばRubiseoの小さいサブユニット（Mazur
とChui、1985年）及び酸素放出錯体の16kDのポリペプチ
ド（Jansenら、1987年）に相同性の（homolgy）配列は
存在しない。プレーADP−グルコース・ホスホリラーゼ
ポリペプチドの正確なプロセッシング部位は、上記の諸
研究では決定されておらず、しかも小麦の胚乳由来の成
熟タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列の分析を必要とす
る。しかしながら、Met（メチオニン）とCes（システイ
ン）の間の前駆体ポリペプチドの切断は、成熟したADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼの概略の分子量、す
なわち51,800の、タンパク質を生成するであろう。更に
また、Rubiscoの小さいサブユニットの葉緑体特異的シ
グナルペプチドもまた、システインとメチオニン残基の
間の境界で除かれる。これに対してアミノプラスト特異
的デンプンシンターゼシグナルペプチドは、システイン
とアラニン残基との間の境界で除かれる（Klosgenら、1
986年）。

さらに、クローンWE:AGA.7は、TAG終止コドンからポ
リ（Ａ）尾の始め迄の278bpの３′−未翻訳領域を含
む。前記未翻訳領域は、２つの重複するポリアデニル化
信号と推定される信号すなわち、位置1728〜1733のAATA
AAと位置1732〜1737のAATAAGとを含む。これらのポリデ
アニル化信号は、ポリアデニル化部位からそれぞれ45bp
及び41bp上流に配置され、且つクローンWE:AGA.3中に存
在する２つの配列と同じ配列である。現在、上記２つの
信号のどちらが機能を営み（functional）得るかを決定
することは不可能である。クローンWE:AGA.7について、
Devereuxら（1987年）のプログラムを使用してKyteとDo
olittle（1982年）のヒドロパシーインデックスとChou
とFasman（1978年）の第２の構造予測値とを計算した。
KyteとDoolittle（1982年）のヒドロパシーのプロフィ
ール（profile）は、クローンWE:AGA.7タンパク質がそ
の長さ全体に散在する疎水性領域（domain）と親水性領
域とを含有し、それが可溶性タンパク質であることと一
致していることを示す。

実施例３ ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列
同士の比較 3.1 クローンWE:AGA.3とクローンWE:AGA.7の比較 クローンWE:AGA.3及びクローンWE:AGA.7の、小麦の胚
乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA挿入断
片同士は、これらの転写解読枠の共有領域において96.3
％の相同性である。TAG終止コドンからポリアデニル化
部位迄の、上記クローン類の３′−未翻訳領域において
は、相同性の範囲は72.3％迄低くなる。WE:AGA.3cDNAと
WE:AGA.7cDNAのヌクレオチド配列同士の比較は、30塩基
の置換の全部が明らかになり、そのうちの72％がトラン
ジション（塩基転位ともいう）である。転写解読枠内に
は18個の塩基の置換、すなわち11個のトランジションと
７個のトランスバージョン（塩基置換ともいう）がある
だけである。前記のトランジションの全ては、コドンの
第３番目の塩基の位置に配置され、それらのいずれもア
ミノ酸の置換を生起しないことは注目すべきである。W
E:AGA.7中の位置1296に配置された前記トランスバージ
ョンの１つは、黙字（silent）である。残りの６つのト
ランスバージョンは、３つの保存的（comservative）ア
ミノ酸置換（スレオニン−セリン、グルタミン−リシ
ン、アラニン−セリン）と２つの半保存的アミノ酸置換
（アルギニン−メチオニン、イソロイシン−メチオニ
ン）を生ずる。さらに、前記転写解読枠には９個所だけ
挿入／欠落が存在し、WE:AGA・３ヌクレオチド配列の位
置579〜585及び位置592〜593に発生している。これらの
挿入／欠落は、WE:AGA.3タンパク質とWE:AGA.7タンパク
質との間の付加的な５個のアミノ酸の変換、３個の挿入
及び２個の置換を生ずる。すなわち、小麦の胚乳のADP
−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA類の誘導された
アミノ酸配列は、296個のアミノ酸残基のうち10個だけ
が異なり、96.7％のアミノ酸相同性を生ずる。前記の
３′−未翻訳領域においては、WE:AGA.3配列とWE:AGA.7
配列の間に85個の挿入／欠落の全部があり、８つの可変
領域に密集している。

3.2 クローンWE:AGA.7とクローンWE:AGA.1の比較 小麦の葉のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDN
A配列（WE:AGA.1）と小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼcDNA配列（WE:AGA.7）を、Devereuxら
（1987年）のDIAGONプログラムを使用して比較した。上
記２つのヌクレオチド配列の間には、10個の良く保存さ
れた領域がある。クローンWE:AGA.1とクローンWE:AGA.7
との間には、322個のヌクレオチド置換があり、そのう
ちの290個は転写解読枠内にあり、これに148個の挿入／
欠落が加わる。従って、クローンWL:AGA.1及びクローン
WE:AGA.7のcDNA配列が重複する転写解読枠内では、DNA
レベルでわずか55.7％の相同性があるだけである。前記
のクローン中に示された３′−未翻訳領域には相同性は
ない。

WE:AGA.7及びWL:AGA.1をコードしたポリペプチド同士
の間の相同性を決定するために、誘導されたアミノ酸配
列を一列に整列させた（aligned）。転写解読枠内の290
個のヌクレオチド置換のうち、97個は黙字（silent）で
ある。残りの193個のヌクレオチド置換と、148個の挿入
／欠落のうちの91個とにより生成された、小麦の葉及び
小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼポ
リペプチド配列同士の間には全体で110個のアミノ酸変
換（alteration）がある。このデータは、ほとんどの場
合に、WL:AGA.1とWE:AGA.7のcDNA配列同士の間のヌクレ
オチド置換は、コドンの３つのヌクレオチド位置の全て
を含むことを示す。従って、前記２つのcDNAの誘導され
たアミノ酸配列同士の間の相同性はわずか55.3％であ
る。

小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホ
スホリラーゼポリペプチド配列同士の間の110個のアミ
ノ酸置換のうちの62個は、保存的変化（conservative c
hange）であり、荷電の相異あるいは中性アミド（すな
わち、グルタミン、アスパラギン）に代わる荷電残基に
よる置換、両親媒性残基に代わる他の両親媒性残基への
置換又は疎水性残基に代わる他の疎水性残基への置換は
いずれも伴なわない。39個の半保存的アミノ酸置換があ
り、これらは荷電の逆転あるいは荷電されてあるか又は
中性もしくは疎水性の残基に代わる両親媒性アミノ酸へ
の置換を伴なっている。非保存的アミノ酸置換のうちの
９つは、荷電されてあるか又は中性のアミノ酸いずれか
に代わる疎水性残基への置換を伴なう。小麦の葉及び小
麦の胚乳の、ADP−グルコース．ピロホスホリラーゼポ
リペプチド同士の間の前記の非保存的アミノ酸置換のう
ちの２つ（His₅₁₂−Tyr₅₁₂:Lys₅₂₁−Gln₅₂₁）及び２つ
の半保存的置換（Ser₅₀₈−Glu₅₀₈:Ala₅₂₇−Lys₅₂₇）
は、ホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピロホスホ
リラーゼ（Preissら、1988年）上の推定の（putative）
３−ホスホグリセリン酸結合部位に相同性の領域にほぼ
近いか又はその領域内に配置されている。しかしなが
ら、小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロ
ホスホリラーゼ酵素のｃ−末端27残基内では、前記のCh
ouとFasman（1978年）の予測値はほとんど一致してい
る。

3.3 制限酵素切断地図作成によるクローン類の比較 小麦の葉と小麦の胚乳のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼcDNAそれぞれの制限酵素切断地図を作成しそ
れらの関係を例証した。小麦の葉のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼcDNAの制限酵素切断地図は、一般に
分子内制限酵素部位を有せず小麦の胚乳のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼcDNAの制限酵素切断地図とは
極めて異なる。この結果は、小麦の葉と小麦の胚乳のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子cDNAが、別
々の遺伝子サブファミリー（亜科）を表わすことを示し
た先のハイブリダイゼーション分析を追認する。これに
対して、小麦の胚乳のcDNA類すなわちWE:AGA.1、WE:AG
A.3、WE:AGA5、WE:AGA.6及びWE:AGA.7は、密接に関連し
ている。上記cDNA類の全ては、３′−末端に配置された
唯一のHind III部位及びHind III部位に対して−680の
位置に配置されたSst I部位を含有する。唯一のBamH I
部位はより長いcDNA挿入断片類、すなわちWE:AGA.1、W
E:AGA.6及びWE:AGA.7の５′−領域に存在する。小麦の
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA類のH
ind III部位に対して−400の位置に配置されたSst I部
位の周りには多形性（polymorphism）が存在する。その
理由は、この部位がクローンWE:AGA.1、WE:AGA.6及びW
E:AGA.7中にのみ存在するからである。されに、Hind II
I部位に対して−340の位置に配置されたBgl II部位は、
クローンWE:AGA.3及びWE:AGA.5中に存在するだけであ
る。これらの結果は、小麦の胚乳のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼ遺伝子サブファミリー（亜科）は、
少なくとも２つの異なる遺伝子分類、すなわちクローン
WE:AGA.3、WE:AGA.5によって代表されるクラスとクロー
ンWE:AGA.1、WE:AGA.6及びWE:AGA.7によって代表される
クラスIIに区分し得る。

3.4 他のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼポリペ
プチド類との比較 小麦のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼcDNA類
由来のアミノ酸配列を、稲の胚乳のADP−グルコース・
ピロホスホリラーゼcDNA（Preissら、1987年）及び大腸
菌glgC遺伝子（Bachorら、1983年）由来のアミノ酸配列
と共に一直線に配列した（aligned）。５通りのタンパ
ク質配列の直線状化（alignment）を行なった。アミノ
酸配列同士の相同性は、次後に、重複領域同士の中の同
一の残基の割合として上記直線状化（alignment）を基
準として計算し、従って、重複の間の間隙の大きさは考
慮に入れない。小麦の胚乳の２つのADP−グルコース、
ピロホスホリラーゼ配列（WE:AGA.3とWE:AGA.7）と、稲
の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列と
の間の相同性は40％である。小麦の葉の上記配列は、稲
の胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ配列に
対し44％の相同性である。上記２つの相同性は、小麦の
葉と小麦の胚乳の配列同士の間の相同性55％よりもわず
かに低いだけである。さらにまた、小麦の葉又は小麦の
胚乳のADP−グルコース・ピロホスホリラーゼと大腸菌A
DP−グルコース・ピロホスホリラーゼとの間の相同性が
わずか24％であるのに比べて、稲の胚乳と大腸菌のアミ
ノ酸配列同士の間の相同性は29.5％である。

3.5 ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼの機能性タ
ンパク質領域 大腸菌及びホウレンソウの葉のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼポリペプチド配列の領域は、先に既に
基質、活性化物質又は阻害物質の結合部位として同定さ
れている（ParsonsとPreiss,1978年a,1978年b;Larsen
ら,1986年;LeeとPreiss,1986年;J.Preiss,個人的書
信）．小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコース・ピ
ロホスホリラーゼの誘導されたアミノ酸配列は、他のAD
P−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素類で同定され
た基質、活性化物質又は阻害物質の結合部位と比較され
ている。上記結合部位は５つのタンパク質領域を形成す
る。

1.フルクトース−1,6−ビスリン酸結合部位 大腸菌のADP−グリコース・ピロホスホリラーゼのア
ロステリック活性化剤（フルクトース−1,6−ビスリン
酸）結合部位は、Lys₉₀残基（ParsonとPreiss,1978年
ｂ）に近いタンパク質のＮ−未端近くに位置している。
大腸菌酵素のフルクトース−1,6−ビスリン酸結合部位
（ParsonとPress,1978年ｂ）に相同性の、小麦の胚乳の
ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ中のアミノ酸配
列は、固定されている。残基78〜100由来の領域は、小
麦の胚乳及び大腸菌の配列同士の間に保存された23個の
アミノ酸の中から14個を有する。しかしながら、小麦の
胚乳の配列中の疎水性又は両親媒性の残基例えばArg₈₀
−Thr₈₀,Lys₈₅−Phe₈₅,Asp₈₆−Pro₈₆,Lys₉₀−Thr₉₀,Lys
₉₃−Thr₉₃,His₉₇−Pro₉₇に代えて大腸菌配列内の荷電残
による置換を伴なって、幾つかのアミノ酸部分で主な変
換（alteration）がある。ピリドキサール−５′−リン
酸は、大腸菌ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ中
のLys₉₀で結合し、フルクトース−1,6−ビスリン酸もこ
の領域で結合する（ParsonとPreiss,1978年a,1978年
ｂ）ので、この部位は、多分、小麦の胚乳タンパク質内
では機能を営まないであろう。従って、大腸菌ADP−グ
ルコース・ピロホスホリラーゼのアロスラリック部位に
相同性の中麦の胚乳配列では、フルクトース−1,6−ビ
スリン酸とタンパク質領域の間でシッフベース（Schiff
base）を形成する機会がない。この知見は、フルクト
ース−1,6−ビスリン酸による小麦の胚乳のADP−グルコ
ース・ピロホスホリラーゼの検出可能な活性化の欠除と
一致している。あいにく、小麦の葉のADP−グルコース
・ピロホスホリラーゼcDNA配列は、５′−コード領域中
に十分遠く迄伸びず、フルクトース−1,6−ビスリン酸
結合部位の配列を含有しない。それ故、フルクトース−
1,6−ビスリン酸による葉のADP−グルコース・ピロホス
ホリラーゼのアロステリック活性化が、大腸菌酵素内と
同じ部位に対する活性化剤の結合によって達成されるか
どうかを本発明者らは確認できない。

2.基質結合部位： 大腸菌ADP−グリコール・ピロホスホリラーゼの２個
所の基質結合部位は、小麦の葉及び小麦の胚乳の２つの
ADP−グリコール・ピロホスホリラーゼ配列において十
分に保存されている。残基166〜173の間の領域は、この
領域内の小麦の胚乳、稲の胚乳及び大腸菌タンパク質の
配列それぞれの比較から得られたコンセンサス配列（共
通塩基配列ともいう）WXXGTADAを含む。あらゆる場合に
おいて、アミノ酸位置167は、芳香族疎水性残基、すな
わちチロシン又はフェニルアラニンのどちらかによって
占有される。ADP−グリコール・ピロホスホリラーゼ同
士の比較によれば、残基252〜256としてコンセンサス配
列FXEXPが明らかにされる。さらにまた、大腸菌ADP−グ
リコール・ピロホスホリラーゼのLys₂₅₅に対するピリド
キサール−５′−リン酸の結合は、ADP−グルコースに
よって阻害され、基質結合部位が近くにあることを示
す。ピリドキサール−５′−リン酸は、リシンのｅ−ア
ミノ基とシッフベースを形成するが、Lys₂₅₅がそれ自体
基質結合中に含まれるということはありそうもない。そ
の理由はLys₂₅₅は、植物ADP−グルコール・ピロホスホ
リラーゼ配列中に厳密に保存されないからである。例え
ば、クローンWE:AGA.7は位置255でグルタミン残基をコ
ードする。しかしながら、Phe₂₅₁は調べられたADP−グ
リコール・ピロホスホリラーゼ配列の全ての中に厳密に
保存されており、この残基が、フェニルアラニン側鎖の
平坦な芳香族環と基質分子のアデニン環との間の疎水性
相互作用によって、結合ATP及びADP−グルコース内に含
まれるかもしれないことを示す。それにもかかわらず、
ATP又はADP−グルコースのリン酸部分とArg₂₅₇（又はLy
s₂₅₇）のアミノ基との間のイオン相互作用を伴なう別の
機構は、除外し得ない。

ADP−グリコール・ピロホスホリラーゼ酵素の推定上
の基質結合領域（domain）においては、ATP結合部位に
対し、Higginsら（1986年）のコンセンサス配列と相同
性を有するアミノ酸は存在しない。上記コンセンサス配
列（GXXXXGKS）は、結晶構造分析によってリン酸結合領
域（Paiら,1979年,Higginsらに引用された、1986年）を
形成していることが明らかにされている。この配列の変
異すなわち小麦の葉の配列中のGDQLAEGKVと小麦内胚乳
の配列中のSRLMSEGKVは、位置460〜468に配置される。

4.3−ホスホグリセリン酸結合部位： 各アミノ酸配列を、ホウレンソウの葉のADP−グルコ
ール・ピロホスホリラーゼ上の推定上の３−ホスホグリ
セリン酸結合部位のアミノ酸配列と比較した。この部位
は、小麦の葉の配列と小麦の胚乳の配列との間で高く
（highly）保存される。小麦の葉と小麦の胚乳の２つの
ADP−グリコール・ピロホスホリラーゼ酵素の異なる活
性化動力学は、３−ホスホグリセリン酸の変換された
（altered）結合部位の点からは説明されない。その理
由は、３−ホスホグリセリン酸結合部位の酵素活性化と
保存との間には明白な関係がないからである。更に、小
麦の胚乳と小麦の葉のADP−グリコール・ピロホスホリ
ラーゼの主要な（Primary）配列は、３−ホスホグリセ
リン酸結合部位の13個の残基のうち６個が異なるが、こ
の配列の第２の構造予測値はほとんど一致している。

３−ホスホグリセリン酸は、オルトリン酸による小麦
の胚乳のADP−グリコール・ピロホスホリラーゼの阻害
を防止できるが、このことは、該酵素が機能的な３−ホ
スホグリセリン酸結合部位を有すること示唆する。残基
515〜522の間の３−ホスホグリセリン酸が結合するコン
センサス配列は、全ての利用可能な植物のADP−グリコ
ール・ピロホスホリラーゼ配列の比較によって得られた
SGIXXXXKである。残基Lys₅₂₂は全ての配列中に厳密に保
存され、且つピリドキサール−５′−リン酸の結合を含
み、しかもホウレンソウの葉のADP−グリコール・ピロ
ホスホリラーゼ酵素中に見出されるような３−ホスホグ
リセリン酸の結合を多分含む。

従って、推定上の３−ホスホグリセリン酸結合部位以
外の領域中の小麦の葉及び小麦の胚乳のADP−グルコー
ル・ピロホスホリラーゼアミノ酸配列それぞれの間の変
換は、上記酵素類のアロステリック特性において観察さ
れた相違が原因である。

上記２つの酵素のアミノ酸配列同士は、わずか55％の
相同性であるので、観察されたアミノ酸の変換のいずれ
も、その異なるアロステリック特性を説明するかもしれ
ない。このことは、小麦の胚乳の酵素が、３−ホスホグ
リセリン酸の存在下で、より活性な形に変わるのに必要
とされる必要な構造変化を行なうことができないことを
示唆する。

【図面の簡単な説明】

第１図は葉におけるデンプンとグルコースの生合成経路
に伴なう諸反応を示し、図中、Ｇ−３−Ｐはグリセルア
ルデヒド−３−リン酸を表わし;DHAPはジヒドロキシア
セトンリン酸を表わし;Piはオルトリン酸を表わし;PPi
は無機ピロリン酸を表わし;1はホスホグリセリン酸キナ
ーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、２はトリオース−リン酸イソメラーゼ、３はアルド
ラーゼ、４はフルクトース−1,6−ビスホスファター
ゼ、５はヘキソース−リン酸イソメラーゼ、６はホスホ
グルコムターゼ、７はADP−グリコール・ピロホスホリ
ラーゼ、８はデンプンシンターゼ、９はUDP−グリコー
ルピロホスホリラーゼ、10はスクロースリン酸シンター
ゼ、11はスクロールホスファターゼ、12はオルトリン酸
／トリオースリン酸輸送体、13は無機ピロホスファター
ゼを表わす。 第２図は、小麦の胚乳におけるデンプン生合成の提案さ
れた代謝経路を示し、図中のＧ−３−Ｐ、DHAP、Pi、PP
iは第１図と同じ意味を表わし、１はスクロースシンタ
ーゼ、２はUDP−グリコールピロホスホリラーゼ、３は
ヘキソキナーゼ、４はホスホグルコムターゼ、５はヘキ
ソース−リン酸イソメラーゼ、６はATP−依存ホスホフ
ルクトキナーゼ、７はPPi−依存ホスホフルクトキナー
ゼ、８はアルドラーゼ、９はトリオース−リン酸イソメ
ラーゼ、10はヘキソース−リン酸輸送体（？）、11はAD
P−グリコールピロホスホリラーゼ、12はデンプンシン
ターゼ、13はスクロースホスフェートシンターゼ、14は
スクロースホスファターゼを表わす。 第３図はクローンWL:AGA.1のDNA配列を示し；第４図は
クローンWE:AGA.3のDNA配列を示し；第５図はクローンW
E:AGA.7のDNA配列を示す。

フロントページの続き (72)発明者 マーク・オリーブ オーストラリア連邦共和国．アクト・ 2614．クック．デックスター・ストリー ト．138 (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．81［２ ］（1986）ｐ．642−645 Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．82［１ ］（1986）ｐ．34−40 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅｓｅｑ

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼを
   コード又は規定し且つ添付図面の第３図、第４図又は第
   ５図に示したヌクレオチド配列を有するDNA。