JP2610643B2 - グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖 - Google Patents
グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、カボチャ（Cucurbita moschata Duch.）
が産生するようなsn−グリセロール−３−リン酸アシル
トランスフェラーゼ（以下ATaseという）の生物工学的
産生能を有するDNA鎖に関するものである。
が産生するようなsn−グリセロール−３−リン酸アシル
トランスフェラーゼ（以下ATaseという）の生物工学的
産生能を有するDNA鎖に関するものである。
先行技術 植物の生体膜を構成する脂質は、外界温度の低下によ
り液晶状態から固体状態に変化する。それに伴い生体膜
の性質が変化する。固体状態では物質透過の選択性がな
くなるため、本来の機能を果たせなくなり、その結果細
胞に障害が生ずると考えられている。脂質のうち、フォ
スファチジル・グリセロール（以下PGという）は液晶状
態から固体状態へ変化する温度が高く、高温で固まりや
すい脂質である。従ってPGの性質により生体膜の温度感
受性が大きく変化する。ところで、PGの固まりやすさ
は、それを構成している脂肪酸の種類により決定され
る。sn−グリセロール−３−リン酸（以下sn−Ｇ−３−
Ｐという）への脂肪酸の転移はATaseにより行われる。
即ち、脂肪酸とアシルキャリアータンパク（以下ACPと
いう）の複合体から脂肪酸の部分がsn−Ｇ−３−Ｐへ転
移する反応をATaseが触媒する。
り液晶状態から固体状態に変化する。それに伴い生体膜
の性質が変化する。固体状態では物質透過の選択性がな
くなるため、本来の機能を果たせなくなり、その結果細
胞に障害が生ずると考えられている。脂質のうち、フォ
スファチジル・グリセロール（以下PGという）は液晶状
態から固体状態へ変化する温度が高く、高温で固まりや
すい脂質である。従ってPGの性質により生体膜の温度感
受性が大きく変化する。ところで、PGの固まりやすさ
は、それを構成している脂肪酸の種類により決定され
る。sn−グリセロール−３−リン酸（以下sn−Ｇ−３−
Ｐという）への脂肪酸の転移はATaseにより行われる。
即ち、脂肪酸とアシルキャリアータンパク（以下ACPと
いう）の複合体から脂肪酸の部分がsn−Ｇ−３−Ｐへ転
移する反応をATaseが触媒する。
植物では、脂肪酸合成は専ら葉緑体内で起こり、ATas
eの基質となる脂肪酸とACPの複合体はパルミトイル−AC
P（以下16:0−ACPという）およびオレオイル−ACP（以
下18:1−ACPという）の２種類である。ATaseがそのいず
れの基質を選択するかはATase自体の性質、即ちATaseの
基質選択性に依存する。ATaseの基質選択性について
は、種々の植物で調べられている。例えばホウレンソ
ウ、エンドウのATaseは18:1−ACPに対する基質選択性が
高く、これらの植物のPGは比較的低温でも液晶状態であ
る〔ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Eur.J.Biochem.129（1983）629−636）〕。それ
に対して、本実験で用いたカボチャのATaseは、16:0−A
CPおよび18:1−ACPを区別せず、それぞれの脂肪酸をほ
ぼ同じ量転移するため、カボチャのPGは比較的高温で固
化する（詳細後述）。
eの基質となる脂肪酸とACPの複合体はパルミトイル−AC
P（以下16:0−ACPという）およびオレオイル−ACP（以
下18:1−ACPという）の２種類である。ATaseがそのいず
れの基質を選択するかはATase自体の性質、即ちATaseの
基質選択性に依存する。ATaseの基質選択性について
は、種々の植物で調べられている。例えばホウレンソ
ウ、エンドウのATaseは18:1−ACPに対する基質選択性が
高く、これらの植物のPGは比較的低温でも液晶状態であ
る〔ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Eur.J.Biochem.129（1983）629−636）〕。それ
に対して、本実験で用いたカボチャのATaseは、16:0−A
CPおよび18:1−ACPを区別せず、それぞれの脂肪酸をほ
ぼ同じ量転移するため、カボチャのPGは比較的高温で固
化する（詳細後述）。
カボチャのATaseは本発明者らが完全精製しており
〔プラント・セル・フィジオロジー（Plant Cell Physi
ol.28（1987）1071−1079）〕、その特徴は次のとおり
である。
〔プラント・セル・フィジオロジー（Plant Cell Physi
ol.28（1987）1071−1079）〕、その特徴は次のとおり
である。
ATase1から３までのいずれも葉緑体の中の可溶性画分
に存在する酵素である。ATase2および３は等電点がやや
異なること以外、ハイドロキシアパタイトに対する吸着
性で区別される。即ち、ATase2は非吸着性、ATase3は吸
着性である。
に存在する酵素である。ATase2および３は等電点がやや
異なること以外、ハイドロキシアパタイトに対する吸着
性で区別される。即ち、ATase2は非吸着性、ATase3は吸
着性である。
カボチャATaseの酵素学的性質については、本発明者
らが先に報告している〔プラント・セル・フィジオロジ
ー（Plant Cell Physiol.28（1987）1195−1201）〕。A
Tase1から３のいずれも基質選択性がほとんどなく、16:
0と18:1をほぼ等量取り込むことが精製酵素で確かめら
れた。
らが先に報告している〔プラント・セル・フィジオロジ
ー（Plant Cell Physiol.28（1987）1195−1201）〕。A
Tase1から３のいずれも基質選択性がほとんどなく、16:
0と18:1をほぼ等量取り込むことが精製酵素で確かめら
れた。
ATaseの構造解析は、植物ではほとんど行われておら
ず、本発明が初めてである。但し、大腸菌に由来するAT
aseは構造が判明している〔ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.258（1983）108
56−10861）〕。
ず、本発明が初めてである。但し、大腸菌に由来するAT
aseは構造が判明している〔ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.258（1983）108
56−10861）〕。
大腸菌のATaseは膜結合性で分子量約８万と大きく
〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
〔J.Biol.Chem.255（1980）9421−9426）〕、カボチャ
由来のものと構造がかなり異なると想像された。
〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
〔J.Biol.Chem.255（1980）9421−9426）〕、カボチャ
由来のものと構造がかなり異なると想像された。
細胞質で合成されて葉緑体へ転移するタンパクには、
「転移ペプチド」がそのアミノ末端側に必要であるとい
われている〔ネイチャー（Nature313（1985）358−36
3）〕。葉緑体への転移ペプチドについては、同一タン
パクでは植物種が異なっていても一次構造上の相同性が
高いが、タンパクが異なれば相同性はかなり低いことが
判明している〔アニュアル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリー（Ann.Rev.Biochem.55（1986）879−91
2）〕。
「転移ペプチド」がそのアミノ末端側に必要であるとい
われている〔ネイチャー（Nature313（1985）358−36
3）〕。葉緑体への転移ペプチドについては、同一タン
パクでは植物種が異なっていても一次構造上の相同性が
高いが、タンパクが異なれば相同性はかなり低いことが
判明している〔アニュアル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリー（Ann.Rev.Biochem.55（1986）879−91
2）〕。
要 旨 本発明は、葉緑体の膜脂質PGの性質を変換するのに有
用なATaseの生物工学的産生能を有するDNA鎖を提供する
ものである。
用なATaseの生物工学的産生能を有するDNA鎖を提供する
ものである。
即ち、本発明によるsn−グリセロール−３−リン酸ア
シルトランスフェラーゼの生物工学的産生能を有するDN
A鎖は、sn−グリセロール−３−リン酸アシルトランス
フェラーゼ活性を有するポリペプチドであってそのアミ
ノ酸配列が第１図（ａ）および（ｂ）に示されているア
ミノ酸配列のうちＡからＢまでのものまたは該配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置
換されたものであるものをコードする塩基配列を有する
こと、を特徴とするものである。
シルトランスフェラーゼの生物工学的産生能を有するDN
A鎖は、sn−グリセロール−３−リン酸アシルトランス
フェラーゼ活性を有するポリペプチドであってそのアミ
ノ酸配列が第１図（ａ）および（ｂ）に示されているア
ミノ酸配列のうちＡからＢまでのものまたは該配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置
換されたものであるものをコードする塩基配列を有する
こと、を特徴とするものである。
効 果 本発明によるDNA鎖は、種々の植物に導入・発現させ
ればそのPGの性質がカボチャのものと似たものになると
考えられる。DNA鎖を植物へ導入・発現する技術はすで
にタバコ・ペチュニア・ジャガイモなど多くの植物で実
際に行われている普遍的な技術である。
ればそのPGの性質がカボチャのものと似たものになると
考えられる。DNA鎖を植物へ導入・発現する技術はすで
にタバコ・ペチュニア・ジャガイモなど多くの植物で実
際に行われている普遍的な技術である。
また本発明で得られたDNAをプローブに用いれば、近
緑植物中に存在し基質選択性が多少異なる本酵素遺伝子
を遺伝子工学の分野で慣用されている方法により容易に
クローニングできるものと思われる。
緑植物中に存在し基質選択性が多少異なる本酵素遺伝子
を遺伝子工学の分野で慣用されている方法により容易に
クローニングできるものと思われる。
ATase遺伝子 定義 本発明によるATaseの生物工学的産生能を有するDNA鎖
即ちATase遺伝子は、ATase活性を有していてアミノ酸配
列が（「実質的に」の意味は後記）第１図に示されてい
るアミノ酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペ
プチドをコードするもの、である。ここで「DNA鎖」と
はある長さを有するポリデオキシリボ核酸の相補的２本
鎖を意味するものである。そして、本発明ではこの「DN
A鎖」はそれがコードするRNAおよびポリペプチドのアミ
ノ酸配列によって特定されるところ、このポリペプチド
は上記のように有限のものであるから、この「DNA鎖」
も有限のものである。しかし、このDNA鎖は、ATaseをコ
ードする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工
学的産生を行わせるのに有用なものであるところ、この
有限の長さのDNA鎖のみによって行えるのでなく、その
５′−側上流および３′−側下流に適当な長さのDNA鎖
が結合した状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が
可能となるわけである。また、ATaseが細胞質で合成さ
れて葉緑体に転移するためにはその上流側に転移ペプチ
ドが必要とされていることは前記したところであり、従
ってATaseをコードする遺伝子はこの転移ペプチドをコ
ードするDNA鎖を上流側に持つことが必要になる。
即ちATase遺伝子は、ATase活性を有していてアミノ酸配
列が（「実質的に」の意味は後記）第１図に示されてい
るアミノ酸配列のうちＡからＢまでのものであるポリペ
プチドをコードするもの、である。ここで「DNA鎖」と
はある長さを有するポリデオキシリボ核酸の相補的２本
鎖を意味するものである。そして、本発明ではこの「DN
A鎖」はそれがコードするRNAおよびポリペプチドのアミ
ノ酸配列によって特定されるところ、このポリペプチド
は上記のように有限のものであるから、この「DNA鎖」
も有限のものである。しかし、このDNA鎖は、ATaseをコ
ードする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工
学的産生を行わせるのに有用なものであるところ、この
有限の長さのDNA鎖のみによって行えるのでなく、その
５′−側上流および３′−側下流に適当な長さのDNA鎖
が結合した状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が
可能となるわけである。また、ATaseが細胞質で合成さ
れて葉緑体に転移するためにはその上流側に転移ペプチ
ドが必要とされていることは前記したところであり、従
ってATaseをコードする遺伝子はこの転移ペプチドをコ
ードするDNA鎖を上流側に持つことが必要になる。
従って、本発明で「DNA鎖」というときは、この特定
の長さのもの（第１図（ａ）および（ｂ）の対応アミノ
酸でいえばＡからＢの長さ）のほかに、この特定の長さ
のDNA鎖を構成員とする鎖状または環状DNA鎖の形態にあ
るものを包含するものとする。
の長さのもの（第１図（ａ）および（ｂ）の対応アミノ
酸でいえばＡからＢの長さ）のほかに、この特定の長さ
のDNA鎖を構成員とする鎖状または環状DNA鎖の形態にあ
るものを包含するものとする。
本発明によるDNA鎖の存在形態のうち代表的なもの
は、このDNA鎖を構成員の一部とするプラスミドDNAおよ
びファージDNAの中に挿入された形態並びにプラスミド
またはファージ粒子あるいはゲノムに挿入された形で微
生物、特に細菌、および植物の中に存在する形態であ
る。ここでいう細菌は、大腸菌やアグロバクテリウムを
含むことはいうまでもない。
は、このDNA鎖を構成員の一部とするプラスミドDNAおよ
びファージDNAの中に挿入された形態並びにプラスミド
またはファージ粒子あるいはゲノムに挿入された形で微
生物、特に細菌、および植物の中に存在する形態であ
る。ここでいう細菌は、大腸菌やアグロバクテリウムを
含むことはいうまでもない。
本発明によるDNA鎖の好ましい存在形態は、ATase遺伝
子が植物中で安定に発現しうるように外来遺伝子として
の本発明のDNA鎖とプロモーター、葉緑体への転移シグ
ナルおよびターミネーターとが一体に結合して、これが
ゲノムに挿入された形態で植物中に存在するものであ
る。プロモーターおよびターミネーターとしては、公知
のものを適宜組み合わせて用いることができる。葉緑体
への転移シグナルは本発明で得られたATase遺伝子のも
のでもよいし、公知のもの、例えばホウレンソウのリブ
ロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニ
ット遺伝子のものを用いることができる。
子が植物中で安定に発現しうるように外来遺伝子として
の本発明のDNA鎖とプロモーター、葉緑体への転移シグ
ナルおよびターミネーターとが一体に結合して、これが
ゲノムに挿入された形態で植物中に存在するものであ
る。プロモーターおよびターミネーターとしては、公知
のものを適宜組み合わせて用いることができる。葉緑体
への転移シグナルは本発明で得られたATase遺伝子のも
のでもよいし、公知のもの、例えばホウレンソウのリブ
ロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニ
ット遺伝子のものを用いることができる。
この遺伝子がコードするポリペプチド 上記のように、本発明のDNA鎖は、これがコードする
アミノ酸配列によって特定されている。このポリペプチ
ドは、ATase活性を有していてアミノ酸配列が実質的に
第１図（ａ）および（ｂ）に示されているアミノ酸配列
のうちＡからＢまでのものである。第１図（ｂ）が第１
図（ａ）のつづきであることはいうまでもない。ここで
「アミノ酸配列が実質的に第１図（ａ）および（ｂ）に
示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの」
ということは、このポリペプチドがATase活性を有する
かぎりこのアミノ酸配列が該配列において１もしくは数
個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたものであ
ってもよいことを示すものである。なお、ポリペプチド
の所定の生理活性がその構成アミノ酸の１もしくは数個
の付加、欠失もしくは置換によっても変らないことがあ
りうることはよく知られており、また意図的にそのよう
なアミノ酸の変化を生じさせる方法も知られている（た
とえば、Nucleic Acids Res.10（20）6487−6500（198
2）参照）。
アミノ酸配列によって特定されている。このポリペプチ
ドは、ATase活性を有していてアミノ酸配列が実質的に
第１図（ａ）および（ｂ）に示されているアミノ酸配列
のうちＡからＢまでのものである。第１図（ｂ）が第１
図（ａ）のつづきであることはいうまでもない。ここで
「アミノ酸配列が実質的に第１図（ａ）および（ｂ）に
示されているアミノ酸配列のうちＡからＢまでのもの」
ということは、このポリペプチドがATase活性を有する
かぎりこのアミノ酸配列が該配列において１もしくは数
個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたものであ
ってもよいことを示すものである。なお、ポリペプチド
の所定の生理活性がその構成アミノ酸の１もしくは数個
の付加、欠失もしくは置換によっても変らないことがあ
りうることはよく知られており、また意図的にそのよう
なアミノ酸の変化を生じさせる方法も知られている（た
とえば、Nucleic Acids Res.10（20）6487−6500（198
2）参照）。
第１図（ａ）および（ｂ）に示されているアミノ酸配
列のうちＣからＡまでの部分は、転移ペプチドの少なく
とも一部である。この部分もまた、上記したアミノ酸配
列についての各種の改変を包含するものとする。
列のうちＣからＡまでの部分は、転移ペプチドの少なく
とも一部である。この部分もまた、上記したアミノ酸配
列についての各種の改変を包含するものとする。
本発明での典型的なATase活性を有するポリペプチド
は第１図のアミノ酸配列のうちＡからＢまで（またはＣ
からＢまで）のものであって、368個（または396個）の
アミノ酸からなり、従来そのアミノ酸配列は知られてい
なかったものである。
は第１図のアミノ酸配列のうちＡからＢまで（またはＣ
からＢまで）のものであって、368個（または396個）の
アミノ酸からなり、従来そのアミノ酸配列は知られてい
なかったものである。
本発明で対象とするATaseは、EC 2.3.1.15で特定さ
れる酵素である。
れる酵素である。
DNA鎖の塩基配列 ATaseをコードするDNA鎖は、第１図のＡからＢ（また
はＣからＢ）の塩基配列をもつものまたはその縮重異性
体並びにその上記の様なATaseのアミノ酸配列の変化に
対応する塩基配列をもつものまたはその縮重異性体、で
ある。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コードンにお
いてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードする
ことのできるDNA鎖を意味する。たとえば第１図のＡか
らＢまたはＣからＢの塩基配列を持つDNA鎖にたいし
て、そのアミノ酸のどれかに対応するコードン例えばAs
nに対応するコードン（AAC）が、これと縮重関係にある
例えばAATに変ったものを本発明は縮重異性体と呼ぶも
のとする。
はＣからＢ）の塩基配列をもつものまたはその縮重異性
体並びにその上記の様なATaseのアミノ酸配列の変化に
対応する塩基配列をもつものまたはその縮重異性体、で
ある。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コードンにお
いてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードする
ことのできるDNA鎖を意味する。たとえば第１図のＡか
らＢまたはＣからＢの塩基配列を持つDNA鎖にたいし
て、そのアミノ酸のどれかに対応するコードン例えばAs
nに対応するコードン（AAC）が、これと縮重関係にある
例えばAATに変ったものを本発明は縮重異性体と呼ぶも
のとする。
本発明によるDNA鎖の好ましい具体例は、３′−側末
端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばTA
G）を持つものである。更に本発明のDNA鎖の５′−側上
流および（または）３′−側下流には、非翻訳領域とし
てのDNA鎖（３′−側下流の最初の部分は、TAGのような
停止コードンであることが普通である）がある長さ続い
てもよい。
端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばTA
G）を持つものである。更に本発明のDNA鎖の５′−側上
流および（または）３′−側下流には、非翻訳領域とし
てのDNA鎖（３′−側下流の最初の部分は、TAGのような
停止コードンであることが普通である）がある長さ続い
てもよい。
なお、第１図に示したDNA鎖の塩基配列は、カボチャ
（ククルビタ・モスカタ）の実生の葉より取得したATas
eについて、ダイデオキシ法によって決定したものであ
る。
（ククルビタ・モスカタ）の実生の葉より取得したATas
eについて、ダイデオキシ法によって決定したものであ
る。
DNA鎖の取得 上記のATaseのアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するDNA鎖を取得する一つの方法は、核酸合成の方法
に従ってそのDNA鎖の少なくとも一部を化学合成するこ
とである。
有するDNA鎖を取得する一つの方法は、核酸合成の方法
に従ってそのDNA鎖の少なくとも一部を化学合成するこ
とである。
ATaseのアミノ酸残基数が少なくとも368個であるとい
うことを考えれば、この化学合成法よりも、ククルビタ
・モスカタの葉由来のmRNAから遺伝子工学の分野で慣用
されている方法例えば岡山・バーグ法〔モレキュラー・
アンド・セル・バイオロジー（Mol.Cell Biol.2（198
2）161−170）〕によりmRNAに相補的なDNAのライブラリ
ーを取得し、これも慣用されている方法例えば適当なプ
ローブによる免疫学的方法による取得あるいはハイブリ
ダイゼイション法による取得が好ましいと言える。
うことを考えれば、この化学合成法よりも、ククルビタ
・モスカタの葉由来のmRNAから遺伝子工学の分野で慣用
されている方法例えば岡山・バーグ法〔モレキュラー・
アンド・セル・バイオロジー（Mol.Cell Biol.2（198
2）161−170）〕によりmRNAに相補的なDNAのライブラリ
ーを取得し、これも慣用されている方法例えば適当なプ
ローブによる免疫学的方法による取得あるいはハイブリ
ダイゼイション法による取得が好ましいと言える。
なお、本発明者は、ククルビタ・モスカタの葉のATas
eをコードする塩基配列およびアミノ酸配列が未知であ
ったため、ATaseを精製し、それに特異的な抗体を用い
て、mRNAに相補的なDNAのライブラリーより本発明のDNA
鎖を免疫学的方法により取得した（詳細は後記実施例参
照）。
eをコードする塩基配列およびアミノ酸配列が未知であ
ったため、ATaseを精製し、それに特異的な抗体を用い
て、mRNAに相補的なDNAのライブラリーより本発明のDNA
鎖を免疫学的方法により取得した（詳細は後記実施例参
照）。
実 験 例 （１）ATaseの精製、抗ATase血清の調製およびATaseの
アミノ酸シークエンスの決定 酵素の精製は公知の方法〔プラント・セル・フィジオ
ロジー（Plant Cell Physiol.28（1987）1071−107
9）〕に準じて行った。
アミノ酸シークエンスの決定 酵素の精製は公知の方法〔プラント・セル・フィジオ
ロジー（Plant Cell Physiol.28（1987）1071−107
9）〕に準じて行った。
ククルビタ・モスカタ（品種シラキクザ、渡辺採種場
株式会社（宮城県）より入手）を30℃暗黒下で湿ったバ
ーミキュライトで４−５日間生育させた後、螢光灯下に
９−12時間置いて緑化した子葉を用いた。酵素の精製は
上記文献と同様に行い、ACP−アフィニティーカラムを
通して、約20,000倍に精製したATase3をマウスに免疫し
た。免疫方法は約１週間間隔で約１−６μｇの酵素タン
パク質をフロインドの完全アジュバンドと混合した後マ
ウス腹腔に注射し、注射開始後約１ケ月目から尾を切っ
て採血する操作をくり返し、抗ATase血清を得た。抗血
清の最適希釈率は、精製ATase3をウェスタン・ブロッテ
ィングし、パーオキシダーゼの発色で検出する方法によ
り、約1,000倍と決定した。この抗血清は、ATase2ともA
Tase3と同程度に反応した。
株式会社（宮城県）より入手）を30℃暗黒下で湿ったバ
ーミキュライトで４−５日間生育させた後、螢光灯下に
９−12時間置いて緑化した子葉を用いた。酵素の精製は
上記文献と同様に行い、ACP−アフィニティーカラムを
通して、約20,000倍に精製したATase3をマウスに免疫し
た。免疫方法は約１週間間隔で約１−６μｇの酵素タン
パク質をフロインドの完全アジュバンドと混合した後マ
ウス腹腔に注射し、注射開始後約１ケ月目から尾を切っ
て採血する操作をくり返し、抗ATase血清を得た。抗血
清の最適希釈率は、精製ATase3をウェスタン・ブロッテ
ィングし、パーオキシダーゼの発色で検出する方法によ
り、約1,000倍と決定した。この抗血清は、ATase2ともA
Tase3と同程度に反応した。
また、得られたDNAがATaseをコードしていることを確
認するためには、子葉から精製したATaseのアミノ酸配
列が明らかになっていることが望ましい。この目的のた
め、先に精製したATase2をさらに陰イオン交換高速液体
クロマトグラフィー［FPLC（モルＱ），ファルマシア
製］で約40,000倍まで精製し、Ｎ−末端からのアミノ酸
配列分析に供した。Ｎ−末端側からのアミノ酸配列は、
気相シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社;4
70A）により行い、Ｎ−末より17残基決定した。
認するためには、子葉から精製したATaseのアミノ酸配
列が明らかになっていることが望ましい。この目的のた
め、先に精製したATase2をさらに陰イオン交換高速液体
クロマトグラフィー［FPLC（モルＱ），ファルマシア
製］で約40,000倍まで精製し、Ｎ−末端からのアミノ酸
配列分析に供した。Ｎ−末端側からのアミノ酸配列は、
気相シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社;4
70A）により行い、Ｎ−末より17残基決定した。
（２）ATase遺伝子の調製 （ｉ） RNAの取得 酵素精製と同一の条件でククルビタ・モスカタ種子を
発芽させ、約10gの子葉よりシャーグウイン（Chirgwi
n）らの方法〔バイオケミストリー（Biochemistry 18
（1979）5294−5299）〕にしたがって全RNAを得た。こ
の全RNAをもとにアビブ（Aviv）らの方法〔プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69（1972）140
8−1412）〕に従ってポリＡを有するRNAを分離した。
発芽させ、約10gの子葉よりシャーグウイン（Chirgwi
n）らの方法〔バイオケミストリー（Biochemistry 18
（1979）5294−5299）〕にしたがって全RNAを得た。こ
の全RNAをもとにアビブ（Aviv）らの方法〔プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69（1972）140
8−1412）〕に従ってポリＡを有するRNAを分離した。
（ii） RNAに相補的なRNAのライブラリーの作成 上記のポリＡを有するRNAにたいして相補的なDNAをガ
ブラー（Gubler）らの方法〔ジーン（Gene,25（1983）2
63−269）〕に従って合成した。この際プライマーとし
て、オリゴ（dT）およびランダムオリゴヌクレオチドを
使用した。合成した２本鎖からなるDNAはEcoRIメチラー
ゼで制限酵素EcoRIの切断部位をメチル化した後、EcoRI
リンカー（dGGAATTCC;宝酒造株式会社製）を両末端に付
けた。更に制限酵素EcoRIで余分なリンカー部分を切断
し、遊離のリンカーをゲル過法でcDNA画分から除き、
cDNAとファージλgt11アームとを連結した。さらに、こ
のDNAを試験管内パッケイジング法（GIGAPACK GOLD;STR
ATAGENE）でλファージ粒子にパッケイジングし、λgt1
1でのライブラリーを得た。
ブラー（Gubler）らの方法〔ジーン（Gene,25（1983）2
63−269）〕に従って合成した。この際プライマーとし
て、オリゴ（dT）およびランダムオリゴヌクレオチドを
使用した。合成した２本鎖からなるDNAはEcoRIメチラー
ゼで制限酵素EcoRIの切断部位をメチル化した後、EcoRI
リンカー（dGGAATTCC;宝酒造株式会社製）を両末端に付
けた。更に制限酵素EcoRIで余分なリンカー部分を切断
し、遊離のリンカーをゲル過法でcDNA画分から除き、
cDNAとファージλgt11アームとを連結した。さらに、こ
のDNAを試験管内パッケイジング法（GIGAPACK GOLD;STR
ATAGENE）でλファージ粒子にパッケイジングし、λgt1
1でのライブラリーを得た。
（iii）ATase遺伝子保持株のスクリーニング 上記のようにして得たファージ・ライブラリーよりカ
ボチャATase3に特異的な抗血清に反応する株を選び出す
ことによりATase遺伝子保持株を得た。
ボチャATase3に特異的な抗血清に反応する株を選び出す
ことによりATase遺伝子保持株を得た。
まず、得られたcDNAライブラリーを大腸菌Y1090株に
感染させ、１プレート当り１万個のプラークを形成させ
た約150枚のプレートを、ヒーン（Huynh）らの方法〔DN
Aクローニング（1985）IRL,オックスフォード、第１
巻、49−78〕により、探索した。各プレートはイソプロ
ピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドにあらかじめ漬け
ておいたニトロセルロースフィルターと37℃で２時間密
着保持した後、0.15M NaClと0.1％Triton Ｘ−100を
含む50mMリン酸バッファー（pH6.8）で各20分間３回洗
浄した。次にマウスから得た抗血清を上記バッファーで
1,000倍に希釈し、この中にニトロセルロースフィルタ
ーを４℃下で１晩漬けて振とうした。次に、上記バッフ
ァーで３回洗浄した後、西洋ワサビ由来のパーオキシダ
ーゼを結合した二次抗体と室温で２時間反応させ、上記
と同様に３回洗浄した。その後、４−クロロ−１−ナフ
トールおよび過酸化水素を基質として発色処理し、強く
発色した形質導入株を取り出し、更に抗体による二次選
抜を行った。まず各々の形質導入株が特異的に産生する
タンパク質をニトロセルロースフィルター上に固定し、
そのタンパクに抗血清を反応させた。洗浄後のフィルタ
ーに残った抗体は、形質導入株が特異的に産生するタン
パクにのみ反応するものである。この抗体を5mMグリシ
ン−HCl（pH2.3）、0.15M NaClの液でフィルターから
解離させた後、精製したATase3をSDS・電気泳動後、ブ
ロットしたフィルターと反応させた。精製したATase3と
反応する抗体が得られた形質導入株がATase産生形質導
入株と判断された。この株からファージを大量調製し、
そのDNAから制限酵素EcoRIにより外来DNAを切り出した
ところ、その大きさは約400bpであった。
感染させ、１プレート当り１万個のプラークを形成させ
た約150枚のプレートを、ヒーン（Huynh）らの方法〔DN
Aクローニング（1985）IRL,オックスフォード、第１
巻、49−78〕により、探索した。各プレートはイソプロ
ピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドにあらかじめ漬け
ておいたニトロセルロースフィルターと37℃で２時間密
着保持した後、0.15M NaClと0.1％Triton Ｘ−100を
含む50mMリン酸バッファー（pH6.8）で各20分間３回洗
浄した。次にマウスから得た抗血清を上記バッファーで
1,000倍に希釈し、この中にニトロセルロースフィルタ
ーを４℃下で１晩漬けて振とうした。次に、上記バッフ
ァーで３回洗浄した後、西洋ワサビ由来のパーオキシダ
ーゼを結合した二次抗体と室温で２時間反応させ、上記
と同様に３回洗浄した。その後、４−クロロ−１−ナフ
トールおよび過酸化水素を基質として発色処理し、強く
発色した形質導入株を取り出し、更に抗体による二次選
抜を行った。まず各々の形質導入株が特異的に産生する
タンパク質をニトロセルロースフィルター上に固定し、
そのタンパクに抗血清を反応させた。洗浄後のフィルタ
ーに残った抗体は、形質導入株が特異的に産生するタン
パクにのみ反応するものである。この抗体を5mMグリシ
ン−HCl（pH2.3）、0.15M NaClの液でフィルターから
解離させた後、精製したATase3をSDS・電気泳動後、ブ
ロットしたフィルターと反応させた。精製したATase3と
反応する抗体が得られた形質導入株がATase産生形質導
入株と判断された。この株からファージを大量調製し、
そのDNAから制限酵素EcoRIにより外来DNAを切り出した
ところ、その大きさは約400bpであった。
このクローンを32P−dATP（宝酒造株式会社）により
ニックトランスレーションして、約107dpm/μｇのプロ
ーブを得た。このプローブを用いて、相補的なDNAのラ
イブラリーの再選抜を行った。ファージを吸着したフィ
ルターを50％ホルムアミド、５×デンハート液（0.1％
フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％牛血清
アルブミン）、５×SSPE（0.75M NaCl,50mMリン酸ナト
リウム、5mM EDTA,pH7.4）,0.1％SDSおよび100μg/ml
のサケ精子DNAを含む液中で42℃、１晩保持した。32Pで
ラベルしたDNAプローブを加えて、さらに24時間ハイブ
リダイゼイションした。フィルターは常法にしたがい洗
浄し、プローブと強くハイブリダイズするファージを選
抜した。
ニックトランスレーションして、約107dpm/μｇのプロ
ーブを得た。このプローブを用いて、相補的なDNAのラ
イブラリーの再選抜を行った。ファージを吸着したフィ
ルターを50％ホルムアミド、５×デンハート液（0.1％
フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％牛血清
アルブミン）、５×SSPE（0.75M NaCl,50mMリン酸ナト
リウム、5mM EDTA,pH7.4）,0.1％SDSおよび100μg/ml
のサケ精子DNAを含む液中で42℃、１晩保持した。32Pで
ラベルしたDNAプローブを加えて、さらに24時間ハイブ
リダイゼイションした。フィルターは常法にしたがい洗
浄し、プローブと強くハイブリダイズするファージを選
抜した。
この形質導入株から制限酵素EcoRIにより外来DNAを切
り出し、1.2％アガロースゲル電気泳動でサイズを測定
したところ、約1.5kbpのものがあった。このクローンを
プラスミドベクターpTZ18R（Pharmacia製）にサブクロ
ーニングし、ダイデオキシ法〔プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proc.Natl.Acad,Sci.USA84（1987）4767−4771〕によ
り塩基配列を決定した。
り出し、1.2％アガロースゲル電気泳動でサイズを測定
したところ、約1.5kbpのものがあった。このクローンを
プラスミドベクターpTZ18R（Pharmacia製）にサブクロ
ーニングし、ダイデオキシ法〔プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proc.Natl.Acad,Sci.USA84（1987）4767−4771〕によ
り塩基配列を決定した。
これを解析した結果、外来DNAの長さは1426bpであ
り、その中に1188bpのオープンリーティングフレームが
存在した。ここにはアミノ酸396個、分子量約44,000の
タンパク質がコードされていると推定された。この1426
bpからなるDNAをプラスミドベクターpTZ18R（Pharmacia
製）にクローニングして得た組換体プラスミドを、pAT
−03と名付けた。pAT−03を形質導入して得た大腸菌（A
T−03と命令）は、微工研に寄託されていて、受託番号F
ERM Ｐ−9934を与えられている（受託日：昭和63年３
月11日）。一方、精製ATase2で決定したＮ−末端よりＮ
−末を含まない17残基のアミノ酸配列は、第１図（ａ）
の211残基から261残基までのDNA配列から推定されたア
ミノ酸配列と完全に一致した。このＡの上流のペプチド
は酵素本来の機能に関係のない、おそらく葉緑体への転
位シグナルペプチドと推測された。ＡからＢまでの間に
は塩基数1104bp,アミノ酸残基368個で分子量約41,000の
タンパク質がコードされており、精製したATase2および
ATase3の分子量とほぼ一致した。また、大腸菌由来のAT
aseとは、有意な相同性はなかった。
り、その中に1188bpのオープンリーティングフレームが
存在した。ここにはアミノ酸396個、分子量約44,000の
タンパク質がコードされていると推定された。この1426
bpからなるDNAをプラスミドベクターpTZ18R（Pharmacia
製）にクローニングして得た組換体プラスミドを、pAT
−03と名付けた。pAT−03を形質導入して得た大腸菌（A
T−03と命令）は、微工研に寄託されていて、受託番号F
ERM Ｐ−9934を与えられている（受託日：昭和63年３
月11日）。一方、精製ATase2で決定したＮ−末端よりＮ
−末を含まない17残基のアミノ酸配列は、第１図（ａ）
の211残基から261残基までのDNA配列から推定されたア
ミノ酸配列と完全に一致した。このＡの上流のペプチド
は酵素本来の機能に関係のない、おそらく葉緑体への転
位シグナルペプチドと推測された。ＡからＢまでの間に
は塩基数1104bp,アミノ酸残基368個で分子量約41,000の
タンパク質がコードされており、精製したATase2および
ATase3の分子量とほぼ一致した。また、大腸菌由来のAT
aseとは、有意な相同性はなかった。
第１図（ａ）および（ｂ）は、本発明で対象とするATas
eを鎖員として含むペプチドのアミノ酸配列およびそれ
をコードする塩基配列の一例を示す説明図である。
eを鎖員として含むペプチドのアミノ酸配列およびそれ
をコードする塩基配列の一例を示す説明図である。
Claims (2)
- 【請求項１】sn−グリセロール−３−リン酸アシルトラ
ンスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってその
アミノ酸配列が下記（ａ）および（ｂ）に示されている
アミノ酸配列のうちＡからＢまでのものまたは該配列に
おいて１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは
置換されたものであるものをコードする塩基配列を有す
ることを特徴とする、sn−グリセロール−３−リン酸ア
シルトランスフェラーゼの生物工学的産生能を有するDN
A鎖。 - 【請求項２】ポリペプチドをコードする塩基配列が下記
（ａ）および（ｂ）に示されている塩基配列のうち、Ａ
からＢまでのものまたはその縮重異性体である、請求項
１記載のDNA鎖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6007988A JP2610643B2 (ja) | 1988-03-14 | 1988-03-14 | グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6007988A JP2610643B2 (ja) | 1988-03-14 | 1988-03-14 | グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01235594A JPH01235594A (ja) | 1989-09-20 |
| JP2610643B2 true JP2610643B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=13131725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6007988A Expired - Lifetime JP2610643B2 (ja) | 1988-03-14 | 1988-03-14 | グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2610643B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3007119B2 (ja) * | 1990-01-12 | 2000-02-07 | 紀夫 村田 | グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖 |
| WO1995014094A1 (fr) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Chaine d'adn codant pour la glycerol-3-phosphate acyltransferase et son utilisation |
| AU706899B2 (en) * | 1995-07-27 | 1999-07-01 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | DNA strands coding for glycerol-3-phosphate acyltransferase |
| CN1301815A (zh) * | 1999-12-27 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——磷脂酰转移酶14和编码这种多肽的多核苷酸 |
-
1988
- 1988-03-14 JP JP6007988A patent/JP2610643B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01235594A (ja) | 1989-09-20 |
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