JP3059214B2 - 新規のプロモーター領域 - Google Patents
新規のプロモーター領域Info
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- JP3059214B2 JP3059214B2 JP3510339A JP51033991A JP3059214B2 JP 3059214 B2 JP3059214 B2 JP 3059214B2 JP 3510339 A JP3510339 A JP 3510339A JP 51033991 A JP51033991 A JP 51033991A JP 3059214 B2 JP3059214 B2 JP 3059214B2
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- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、アシビャ・ゴシピィ（Ashbya gossypii）
からのプロモーター領域、このプロモーター領域で遺伝
的に変えられた菌類及びその使用に関する。
からのプロモーター領域、このプロモーター領域で遺伝
的に変えられた菌類及びその使用に関する。
A.ゴシピィは、ビタミンB2の発酵的生産に使用され
る。タンパク質産物の生産によるA.ゴシピィのための発
酵工学の使用を遺伝子工学の方法の使用下に拡大するこ
とは望ましいことである。この目的のためにA.ゴシピィ
についての表現系が必要とされる。若干の高等子嚢菌
類、例えばアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus nig
er）について、そのような系がすでに記載された（Ramb
osek及びLeach、CRC Critical Reviews in Biotech
nology6（1987）、357−393）。それに対して、その属
の唯一の代表である半子嚢菌類（Hemiascomyceten）、
A.ゴシピィでの遺伝子工学分野上の経験は今までに無
い。
る。タンパク質産物の生産によるA.ゴシピィのための発
酵工学の使用を遺伝子工学の方法の使用下に拡大するこ
とは望ましいことである。この目的のためにA.ゴシピィ
についての表現系が必要とされる。若干の高等子嚢菌
類、例えばアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus nig
er）について、そのような系がすでに記載された（Ramb
osek及びLeach、CRC Critical Reviews in Biotech
nology6（1987）、357−393）。それに対して、その属
の唯一の代表である半子嚢菌類（Hemiascomyceten）、
A.ゴシピィでの遺伝子工学分野上の経験は今までに無
い。
所望の生産物についてコードする遺伝子の発現のため
の系の基本的成分は、いわゆるプロモーター領域であ
り、これは １） 遺伝子の転写のためになくてはならない機能的プ
ロモーターから、かつ ２） mRNAにおける転写後に翻訳のために必要である
５′非−コード化領域（プロモーター及び翻訳開始の
間）から成る。
の系の基本的成分は、いわゆるプロモーター領域であ
り、これは １） 遺伝子の転写のためになくてはならない機能的プ
ロモーターから、かつ ２） mRNAにおける転写後に翻訳のために必要である
５′非−コード化領域（プロモーター及び翻訳開始の
間）から成る。
本発明の目的は、翻訳延長因子EF−１α（＝TEF−１
α）をコードするA.ゴシピィ−TEF−遺伝子のプロモー
ター領域である。
α）をコードするA.ゴシピィ−TEF−遺伝子のプロモー
ター領域である。
この遺伝子は極めて強力に発現され、従って極めて有
効なプロモーター領域を有する。
効なプロモーター領域を有する。
本発明により得られるプロモーター領域は、配列−記
録No.1に示されたヌクレオチド配列を有する。転写及び
翻訳の開始のための能力を有する新規のかつ配列決定さ
れたプロモーター領域の機能範囲を、３′−末端では良
好にかつ５′−末端ではあまり良好ではなく制限するこ
とができるので、A.ゴシピィ−遺伝子の自然のプロモー
ター領域は、その長さで容易に挙げられた配列からはず
されることは除外することはできない。
録No.1に示されたヌクレオチド配列を有する。転写及び
翻訳の開始のための能力を有する新規のかつ配列決定さ
れたプロモーター領域の機能範囲を、３′−末端では良
好にかつ５′−末端ではあまり良好ではなく制限するこ
とができるので、A.ゴシピィ−遺伝子の自然のプロモー
ター領域は、その長さで容易に挙げられた配列からはず
されることは除外することはできない。
本発明のもう１つの目的は、翻訳延長因子EF−１α
（＝TEF−１α）をコードするA.ゴシピィ−TEF−遺伝子
のターミネーター領域である。
（＝TEF−１α）をコードするA.ゴシピィ−TEF−遺伝子
のターミネーター領域である。
このターミネーター領域は、有効な転写停止のために
使用されうる。
使用されうる。
本発明により得られるターミネーター領域は、配列−
記録No.2、位置1513−2095に所定のヌクレオチド配列を
有する。この配列の３′−末端短縮も転写ターミネータ
ーとして考慮される。
記録No.2、位置1513−2095に所定のヌクレオチド配列を
有する。この配列の３′−末端短縮も転写ターミネータ
ーとして考慮される。
ターミネーターの領域は、TEF−プロモーター領域又
は他の同種又は異種のプロモーターと関連して使用され
得る。
は他の同種又は異種のプロモーターと関連して使用され
得る。
更に本発明の目的は、前記のプロモーター領域又はそ
の一部及び／又は前記のターミネーター領域又はその一
部を有する菌類である。
の一部及び／又は前記のターミネーター領域又はその一
部を有する菌類である。
プロモーター領域は、特に次の菌類中に挿入され得
る：アシビヤ・ゴシピィ、アシビヤと近縁の種類、例え
ば特にエルモテシウム・アシビ（Eremothecium as−hb
yi）及びアシビヤとは類縁ではない属、例えば特にアス
ペルギルス（Aspergillus）及びノイロスポラ（Ne−uro
spora）。
る：アシビヤ・ゴシピィ、アシビヤと近縁の種類、例え
ば特にエルモテシウム・アシビ（Eremothecium as−hb
yi）及びアシビヤとは類縁ではない属、例えば特にアス
ペルギルス（Aspergillus）及びノイロスポラ（Ne−uro
spora）。
新規のプロモーター領域は、 ａ） 隣接するDNA−配列を含むA.ゴシピィからの翻訳
延長因子EF−１αのための遺伝子（TEF−遺伝子）のク
ローニング及び引続いての分離により、 ｂ） A.ゴシピィ中で選択可能なプロモーター欠失遺伝
子の解放読み枠（offenes Leseraster）へのA.ゴシピ
ィ−DNA−フラグメントの融合、強い表現性の形質転換
体の単離及び次のTEF−プロモーターの選択により、 ｃ） 公知方法による化学的合成により製造することが
できる。
延長因子EF−１αのための遺伝子（TEF−遺伝子）のク
ローニング及び引続いての分離により、 ｂ） A.ゴシピィ中で選択可能なプロモーター欠失遺伝
子の解放読み枠（offenes Leseraster）へのA.ゴシピ
ィ−DNA−フラグメントの融合、強い表現性の形質転換
体の単離及び次のTEF−プロモーターの選択により、 ｃ） 公知方法による化学的合成により製造することが
できる。
新規のプロモーター領域は、適当なベクター系と一緒
に、A.ゴシピィ及び他の菌類中で同種及び異種のタンパ
ク質を過剰発現させる可能性を開示する。その際、例え
ばビタミンB2−生合成の遺伝子並びにビタミンB2の過剰
生産に責任のある構造的に強化された遺伝子の発現又は
経済的に重要であるタンパク質の過剰発現及び単離が問
題でありうる。更に新規のプロモーター領域を用いて、
場合によっては他の菌類とは異なっているA.ゴシピィの
転写後の変性ポテンシャル（例えばグリコシル化（Glyk
osihierung））が利用するこができる。従来使用された
形、例えばアスペルギルス又はサッカロミセス（Saccha
romyces）により全ての異種タンパク質が十分な量で製
造され得るわけではないので、新規の宿主主体（この場
合例えばA.ゴシピィ）のための効果的TEF−プロモータ
ー領域を有する表現系の開発が極めて重要である。
に、A.ゴシピィ及び他の菌類中で同種及び異種のタンパ
ク質を過剰発現させる可能性を開示する。その際、例え
ばビタミンB2−生合成の遺伝子並びにビタミンB2の過剰
生産に責任のある構造的に強化された遺伝子の発現又は
経済的に重要であるタンパク質の過剰発現及び単離が問
題でありうる。更に新規のプロモーター領域を用いて、
場合によっては他の菌類とは異なっているA.ゴシピィの
転写後の変性ポテンシャル（例えばグリコシル化（Glyk
osihierung））が利用するこができる。従来使用された
形、例えばアスペルギルス又はサッカロミセス（Saccha
romyces）により全ての異種タンパク質が十分な量で製
造され得るわけではないので、新規の宿主主体（この場
合例えばA.ゴシピィ）のための効果的TEF−プロモータ
ー領域を有する表現系の開発が極めて重要である。
例 1.アシビヤ・ゴシピィ−TEF−遺伝子の単離 A.ゴシピィ−ミセルから単離されたDNAを、制限エン
ドヌクレアーゼEcoR I及びBamH Iを用いて切断した。TE
F−遺伝子又はその一部を有するDNA−フラグメントを、
制限フラグメントのサイズ分けの後に、アガロース−ゲ
ル電気泳動法及び引続く32P−標識化の異種TEF−遺伝子
試料とのハイブリド形成により同定した、。TEF−遺伝
子試料は、S.セレビジアエ（Cerevisiae）TEF2−遺伝子
の1377bp長さの開放読み枠のヌクレオチド363〜1235を
包含する（Schirmaier及びPhilippsen、EMBOJ.3（198
4）、3311−3315）。4.6kb長さのEcoR I−フラグメント
及び6.4kb長さのBamH I−フラグメントを、異種TEF−遺
伝子試料と、ハイブリド形成させた。この長さ範囲のフ
ラグメントをアガロースゲルから溶離させ、EcoR Iもし
くはBamH I−で切断されたベクターpUC8（Vieira及びMe
ssing、Gene19（1982）259−268）中でクローニングし
かつE.coli中に形質転換させた。TEF−DNAを有するクロ
ーンは、32P−標識化の異種試料とのコロニーハイブリ
ド形成（Grunstein及びHogness、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA72（1975）、3961−3965）により認識された。陽性ク
ローンは、4.6kb長さのEcoR I−フラグメント又は6.4kb
長さのBamH I−フラグメントを有した。両クローンは、
2.1kbの範囲で重なり、これはTEF−遺伝子試料への相同
を有しかつそれは配列決定された（配列No.2）。この2.
1kb長さのフラグメントは、1377bpの開放読み枠、５′
−非コード化領域の136bp及び３′−非コード化領域の5
82bpを有する。EcoR I−切断部位を過ぎてその先のHind
III−切断部位までの５′−非コード化領域の278bpが
測定された、引続きプロモーター領域を、出発コドンの
前の379bpのほかに更にTEF−遺伝子の開放読み枠の最初
の24bpを有する403bp長さのHind III/Hinc II−フラグ
メントとして単離し、かつpAG−100及びpAG−101の構築
のために使用した（配列No.1）。
ドヌクレアーゼEcoR I及びBamH Iを用いて切断した。TE
F−遺伝子又はその一部を有するDNA−フラグメントを、
制限フラグメントのサイズ分けの後に、アガロース−ゲ
ル電気泳動法及び引続く32P−標識化の異種TEF−遺伝子
試料とのハイブリド形成により同定した、。TEF−遺伝
子試料は、S.セレビジアエ（Cerevisiae）TEF2−遺伝子
の1377bp長さの開放読み枠のヌクレオチド363〜1235を
包含する（Schirmaier及びPhilippsen、EMBOJ.3（198
4）、3311−3315）。4.6kb長さのEcoR I−フラグメント
及び6.4kb長さのBamH I−フラグメントを、異種TEF−遺
伝子試料と、ハイブリド形成させた。この長さ範囲のフ
ラグメントをアガロースゲルから溶離させ、EcoR Iもし
くはBamH I−で切断されたベクターpUC8（Vieira及びMe
ssing、Gene19（1982）259−268）中でクローニングし
かつE.coli中に形質転換させた。TEF−DNAを有するクロ
ーンは、32P−標識化の異種試料とのコロニーハイブリ
ド形成（Grunstein及びHogness、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA72（1975）、3961−3965）により認識された。陽性ク
ローンは、4.6kb長さのEcoR I−フラグメント又は6.4kb
長さのBamH I−フラグメントを有した。両クローンは、
2.1kbの範囲で重なり、これはTEF−遺伝子試料への相同
を有しかつそれは配列決定された（配列No.2）。この2.
1kb長さのフラグメントは、1377bpの開放読み枠、５′
−非コード化領域の136bp及び３′−非コード化領域の5
82bpを有する。EcoR I−切断部位を過ぎてその先のHind
III−切断部位までの５′−非コード化領域の278bpが
測定された、引続きプロモーター領域を、出発コドンの
前の379bpのほかに更にTEF−遺伝子の開放読み枠の最初
の24bpを有する403bp長さのHind III/Hinc II−フラグ
メントとして単離し、かつpAG−100及びpAG−101の構築
のために使用した（配列No.1）。
2.プラスミド構築 ａ） ベクターpAG−１（第１図）（寄託DSM6010）、ベ
クターpEX4の誘導体を、Ernst及びChan、J.Bacteriol.1
63（1985）８−14によって製造した。pAG−１は、アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH（３′）
Ｉ）に関してコードするトランスポゾンTn903のカナマ
イシン耐性遺伝子を有する1.7kb Sal I−フラグメント
を含有する。最初のpEX4−構築体中で、先ずTn903の169
5bp Pvu II−フラグメント（0ka等、J.Mol.Biol.147（1
981）、217−226）を、補充されたSal I−切断部位を有
するプラスミド中に連結させた。その際、Sal I−切断
部位は保持されたままであり、かつ耐性遺伝子は、1.7k
b Sal I断片として単離され得る。pAG−１はサッカロミ
セス・セルビジアエ、ARS−エレメントARS1及び２μARS
を含有し、かつアシビヤゴシビィ中に自発的に複製する
（repliziert）。
クターpEX4の誘導体を、Ernst及びChan、J.Bacteriol.1
63（1985）８−14によって製造した。pAG−１は、アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH（３′）
Ｉ）に関してコードするトランスポゾンTn903のカナマ
イシン耐性遺伝子を有する1.7kb Sal I−フラグメント
を含有する。最初のpEX4−構築体中で、先ずTn903の169
5bp Pvu II−フラグメント（0ka等、J.Mol.Biol.147（1
981）、217−226）を、補充されたSal I−切断部位を有
するプラスミド中に連結させた。その際、Sal I−切断
部位は保持されたままであり、かつ耐性遺伝子は、1.7k
b Sal I断片として単離され得る。pAG−１はサッカロミ
セス・セルビジアエ、ARS−エレメントARS1及び２μARS
を含有し、かつアシビヤゴシビィ中に自発的に複製する
（repliziert）。
ｂ） pAG−２（第２図）。カナマイシン耐性遺伝子を
有する1.7kb Sal I−フラグメントをpAG−１から切断
し、かつS.セルビジアエのSal I切断部位に、E.coliシ
ャトルベクターXEp24（Botstein等、Gene8（1979）、17
−24;New England Biolabs Inc.、Beverly、MA、US
A、1988−1989Catalog、112−113）を挿入した。新たに
生じたプラスミド−pAG−２−の構造を、制限酵素切断
地図作製によって調べ、この際1.7kb Sal I−フラグメ
ント中にあるXho I−切断部位を、挿入配向の調査に使
用した。pAG−２は、サッカロミセス・セルビジアエARS
−エレメント２μARSを含有し、かつアシビャ・ゴシピ
ィ中に自発的に複製された。
有する1.7kb Sal I−フラグメントをpAG−１から切断
し、かつS.セルビジアエのSal I切断部位に、E.coliシ
ャトルベクターXEp24（Botstein等、Gene8（1979）、17
−24;New England Biolabs Inc.、Beverly、MA、US
A、1988−1989Catalog、112−113）を挿入した。新たに
生じたプラスミド−pAG−２−の構造を、制限酵素切断
地図作製によって調べ、この際1.7kb Sal I−フラグメ
ント中にあるXho I−切断部位を、挿入配向の調査に使
用した。pAG−２は、サッカロミセス・セルビジアエARS
−エレメント２μARSを含有し、かつアシビャ・ゴシピ
ィ中に自発的に複製された。
ｃ） pAG−100（第３図）。３′−方向でカナマイシ
ン、耐性遺伝子の翻訳出発の後の30bpにあるpAG−２のX
ho I切断部位に、プロモーター領域及びA.ゴシピィから
の翻訳延長因子EF−１αのための遺伝子（TEF−遺伝
子）の開放読み枠の最初の24bpを含有する403bp長さのH
ind III/Hinc II−フラグメントを、突出末端の相補後
に挿入した。こうして生じたプラスミドpAG−100中のフ
ラグメントの配向を、制限酵素切断地図作製によってHi
nd IIIで調べた。403bp長さのフラグメントの挿入によ
って、APH（３′）Ｉの10N−末端アミノ酸をA.ゴシピィ
翻訳延長因子EF−１αの最初の８アミノ酸に代えた。他
のアミノ酸によるAPH（３′）Ｉの最初の19アミノ酸の
除去又は交換は、活性の損失に結びつかない（Chen及び
Fukuhara、Gene69（1988）、181−192）。TEF−プロモ
ーター領域の挿入後のSal I−フラグメントの配列は、
配列No.2に示す。pAG−100は、サッカロミセス・セルビ
ジアエARS−エレメント２μARSを含有し、かつアシビャ
・ゴシピィ中に自発的に複製する ｄ） pAG−５（第４図）。pAG−１からのカナマイシン
耐性遺伝子を有する1.7kbフラグメントを、pBR322（Bol
ivar等、Gene2（1977）95−113）のSal I−切断部位に
サブクローン化した。生じたプラスミド−pJL3A−は、p
BR322−成分中に各々１個のBamH I−及び１個のEcoR I
−切断部位を有し、従ってpJL3Aは、二重消化（Doppelv
erdau）によって375bp及び5688bpフラグメントに分解さ
れる。大きなフラグメントを、翻訳延長因子EF−１α
（TEF−遺伝子）に関する遺伝子の開放読み枠を含有す
る（配列No.1）2.1kb EcoR I/BamH I A.ゴシピィフラ
グメントと連結させた。生じたプラスミドを、pAG−５
と表示した。pAG−５は、サッカロミセス・セルビジア
エARS−エレメントを含有しない。
ン、耐性遺伝子の翻訳出発の後の30bpにあるpAG−２のX
ho I切断部位に、プロモーター領域及びA.ゴシピィから
の翻訳延長因子EF−１αのための遺伝子（TEF−遺伝
子）の開放読み枠の最初の24bpを含有する403bp長さのH
ind III/Hinc II−フラグメントを、突出末端の相補後
に挿入した。こうして生じたプラスミドpAG−100中のフ
ラグメントの配向を、制限酵素切断地図作製によってHi
nd IIIで調べた。403bp長さのフラグメントの挿入によ
って、APH（３′）Ｉの10N−末端アミノ酸をA.ゴシピィ
翻訳延長因子EF−１αの最初の８アミノ酸に代えた。他
のアミノ酸によるAPH（３′）Ｉの最初の19アミノ酸の
除去又は交換は、活性の損失に結びつかない（Chen及び
Fukuhara、Gene69（1988）、181−192）。TEF−プロモ
ーター領域の挿入後のSal I−フラグメントの配列は、
配列No.2に示す。pAG−100は、サッカロミセス・セルビ
ジアエARS−エレメント２μARSを含有し、かつアシビャ
・ゴシピィ中に自発的に複製する ｄ） pAG−５（第４図）。pAG−１からのカナマイシン
耐性遺伝子を有する1.7kbフラグメントを、pBR322（Bol
ivar等、Gene2（1977）95−113）のSal I−切断部位に
サブクローン化した。生じたプラスミド−pJL3A−は、p
BR322−成分中に各々１個のBamH I−及び１個のEcoR I
−切断部位を有し、従ってpJL3Aは、二重消化（Doppelv
erdau）によって375bp及び5688bpフラグメントに分解さ
れる。大きなフラグメントを、翻訳延長因子EF−１α
（TEF−遺伝子）に関する遺伝子の開放読み枠を含有す
る（配列No.1）2.1kb EcoR I/BamH I A.ゴシピィフラ
グメントと連結させた。生じたプラスミドを、pAG−５
と表示した。pAG−５は、サッカロミセス・セルビジア
エARS−エレメントを含有しない。
ｅ） pAG−101（第５図）。カナマイシン耐性遺伝子の
開放読み枠中にあるXho I切断部位中に、pAG−100の構
築のために記載したように、プロモーター領域及びA.ゴ
シピィからのTEF−遺伝子の開放読み枠の最初の24bpを
有する403bp Hind III/Hinc II−フラグメントを挿入し
た。そうして生じたプラスミドを、pAG−101と表示し
た。pAG−101は、サッカロミセス・セルビジアエARS−
エレメントを含有しない。
開放読み枠中にあるXho I切断部位中に、pAG−100の構
築のために記載したように、プロモーター領域及びA.ゴ
シピィからのTEF−遺伝子の開放読み枠の最初の24bpを
有する403bp Hind III/Hinc II−フラグメントを挿入し
た。そうして生じたプラスミドを、pAG−101と表示し
た。pAG−101は、サッカロミセス・セルビジアエARS−
エレメントを含有しない。
ｆ） pBKS1871（TEF−プロモーターIacZ−融合のため
の前駆プラスミド）：プラスミドpBKS+（Short等、Nucl
eic Acid.Res.、16（1988）、7583−7600）のPst I切
断部位中に、プラスミドpMC1871（Shapira等、Gene、25
（1983）、71−82）からの3113bp長さのPst Iフラグメ
ントをクローン化した。このフラグメントは、最初の７
コドンが欠けているE.coli（Kalnins等、EMBO J.、２
（1983）、593−597）からのlacZ−遺伝子の開放読み枠
を有する。
の前駆プラスミド）：プラスミドpBKS+（Short等、Nucl
eic Acid.Res.、16（1988）、7583−7600）のPst I切
断部位中に、プラスミドpMC1871（Shapira等、Gene、25
（1983）、71−82）からの3113bp長さのPst Iフラグメ
ントをクローン化した。このフラグメントは、最初の７
コドンが欠けているE.coli（Kalnins等、EMBO J.、２
（1983）、593−597）からのlacZ−遺伝子の開放読み枠
を有する。
ｇ） pPL1（第６図）。pBKS1871をlacZ−遺伝子の前の
Sma I切断部位で線状にした。線状化されたプラスミド
中に、TEF−プロモーター及びA.ゴシピィからのTEF−遺
伝子の最初の８コドンを含む隣接配列を有する1500bp H
inc II−フラグメントをクローン化挿入（einklonier
t）させた。それによって、β−ガラクトシダーゼに関
してコード化し、その最初の７アミノ酸がA.ゴシピィか
らのEF−１αの最初の８アミノ酸に代えられている開放
読み枠が生じた。このプラスミドから、TEF−プロモー
ターの種々の長さの範囲を有するTEF−プロモーターlac
Z−融合を単離することができた。
Sma I切断部位で線状にした。線状化されたプラスミド
中に、TEF−プロモーター及びA.ゴシピィからのTEF−遺
伝子の最初の８コドンを含む隣接配列を有する1500bp H
inc II−フラグメントをクローン化挿入（einklonier
t）させた。それによって、β−ガラクトシダーゼに関
してコード化し、その最初の７アミノ酸がA.ゴシピィか
らのEF−１αの最初の８アミノ酸に代えられている開放
読み枠が生じた。このプラスミドから、TEF−プロモー
ターの種々の長さの範囲を有するTEF−プロモーターlac
Z−融合を単離することができた。
ｈ） pPL2（第９図）。pBKS1871をlacZ−遺伝子の前の
Sma I−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミ
ド中に、TEF−プロモーター（270bp）の一部並びにA.ゴ
シピィからのTEF−遺伝子の最初の８コドンを有する（2
4bp）294bp長さのRsa I/Hinc II−フラグメントをクロ
ーン化挿入させた。
Sma I−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミ
ド中に、TEF−プロモーター（270bp）の一部並びにA.ゴ
シピィからのTEF−遺伝子の最初の８コドンを有する（2
4bp）294bp長さのRsa I/Hinc II−フラグメントをクロ
ーン化挿入させた。
ｉ） pPL3（第10図）。pBKS1871をlacZ−遺伝子の前の
Sma I−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミ
ド中に、TEF−遺伝子（24bp）の最初の８コドン及び
５′−方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前に
ある範囲の215bpを有する239bp長さのHal III/フラグメ
ントをクローン化挿入した。
Sma I−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミ
ド中に、TEF−遺伝子（24bp）の最初の８コドン及び
５′−方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前に
ある範囲の215bpを有する239bp長さのHal III/フラグメ
ントをクローン化挿入した。
ｊ） pPL4（第11図）。pBKS1871をlacZ−遺伝子の前の
Sma I−切断部位で線状にした。この線状化されたプラ
スミド中に、TEF−遺伝子の最初の８コドン及び５′−
方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前にある範
囲の134bpを有する158bp長さのEcoR I/Hinc II−フラグ
メントをクローン化挿入した。
Sma I−切断部位で線状にした。この線状化されたプラ
スミド中に、TEF−遺伝子の最初の８コドン及び５′−
方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前にある範
囲の134bpを有する158bp長さのEcoR I/Hinc II−フラグ
メントをクローン化挿入した。
ｋ） pAG−110（第７図）。Xba I及びSal IでpPL1の分
断することによって、1500bp長さのTEF−プロモーター
フラグメントとlacZ遺伝子との融合を有する4600bpフラ
グメントを単離した。このフラグメントを、突出末端の
補充後に、pAG−100の補充されたBamH I切断部位にクロ
ーン化挿入した。
断することによって、1500bp長さのTEF−プロモーター
フラグメントとlacZ遺伝子との融合を有する4600bpフラ
グメントを単離した。このフラグメントを、突出末端の
補充後に、pAG−100の補充されたBamH I切断部位にクロ
ーン化挿入した。
１） pAG−111（第８図）。Hind IIIでpPL1を分離する
ことによって、3509bp長さのフラグメントを単離した。
このフラグメント中で、TEF−プロモーター領域は約110
0bp短くされている。従ってこれは、pAG−100、pAG−10
1、pAG−110及びpAG−111中でG418耐性遺伝子の転写を
制御するプロモーター領域に相応する。突出末端の補充
後に、3509bp長さのフラグメントをpAG−100の相補され
たBamH I切断部位中にクローン化挿入した。
ことによって、3509bp長さのフラグメントを単離した。
このフラグメント中で、TEF−プロモーター領域は約110
0bp短くされている。従ってこれは、pAG−100、pAG−10
1、pAG−110及びpAG−111中でG418耐性遺伝子の転写を
制御するプロモーター領域に相応する。突出末端の補充
後に、3509bp長さのフラグメントをpAG−100の相補され
たBamH I切断部位中にクローン化挿入した。
ｍ） pAG−112（第12図）。Xba I及びSal IでpPL2を分
断した後に、294bp長さのプロモーターフラグメントとl
acZ−遺伝子との融合を有する3392bp長さのフラグメン
トを単離し、かつ突出末端の補充後にプラスミドpAG−1
00の補充されたBamH I−フラグメント中に装入した。
断した後に、294bp長さのプロモーターフラグメントとl
acZ−遺伝子との融合を有する3392bp長さのフラグメン
トを単離し、かつ突出末端の補充後にプラスミドpAG−1
00の補充されたBamH I−フラグメント中に装入した。
ｎ） pAG−113（第13図）。Xba I及びSal IでpPL3を分
断した後に、239bp長さのプロモーターフラグメントとl
acZ−遺伝子との融合を有する3337bp長さのフラグメン
トを単離し、かつ突出末端の補充後に、プラスミド−pA
G−100の補充されたBamH I−切断部位中に装入した。
断した後に、239bp長さのプロモーターフラグメントとl
acZ−遺伝子との融合を有する3337bp長さのフラグメン
トを単離し、かつ突出末端の補充後に、プラスミド−pA
G−100の補充されたBamH I−切断部位中に装入した。
ｏ） pAG−114（第14図）。Hind IIIでpPL4を分断した
後に、158bp長さのプロモーターフラグメントとlacZ−
遺伝子との融合を有する3273bp長さのフラグメントを単
離しかつ突出末端の補充後にプラスミドpAG−100の補充
されたBamH I−切断部位中に装入した。
後に、158bp長さのプロモーターフラグメントとlacZ−
遺伝子との融合を有する3273bp長さのフラグメントを単
離しかつ突出末端の補充後にプラスミドpAG−100の補充
されたBamH I−切断部位中に装入した。
ｐ） pAG−115（第15図）。BamH IでpBKS1871を分断し
た後に、lacZ−遺伝子の開放読み枠を有する3069bp長さ
のフラグメントを単離し、この際開放読み枠の最初の７
コドンは無くかつ開放読み枠の前のプロモーターフラグ
メントはどれも融合されなかった。このフラグメントを
プラスミドpAG−100のBamH I−切断部位に挿入した。
た後に、lacZ−遺伝子の開放読み枠を有する3069bp長さ
のフラグメントを単離し、この際開放読み枠の最初の７
コドンは無くかつ開放読み枠の前のプロモーターフラグ
メントはどれも融合されなかった。このフラグメントを
プラスミドpAG−100のBamH I−切断部位に挿入した。
ｑ） pAG−120。pB II KS−（Short等、Nucleic Acid
Res.16（1988）、7583−7600）をSsp I及びSca Iで分
断しかつ2084bp長さのフラグメントを単離した。YEP24
（Botstein等、Gene8（1979）、17−24）をSca I及びCl
a Iで分断し、かつ2782bp大きさのフラグメントを単離
した。これを突出末端の補充後に、pB II KS-からの208
4bp長さのSca I/Ssp I−フラグメントと連結させ、従っ
て再び完全なアンピシリン耐性遺伝子が生じた（Sca I
はpB II KS-でかつYEP24はアンピシリン耐性遺伝子で切
断する）。
Res.16（1988）、7583−7600）をSsp I及びSca Iで分
断しかつ2084bp長さのフラグメントを単離した。YEP24
（Botstein等、Gene8（1979）、17−24）をSca I及びCl
a Iで分断し、かつ2782bp大きさのフラグメントを単離
した。これを突出末端の補充後に、pB II KS-からの208
4bp長さのSca I/Ssp I−フラグメントと連結させ、従っ
て再び完全なアンピシリン耐性遺伝子が生じた（Sca I
はpB II KS-でかつYEP24はアンピシリン耐性遺伝子で切
断する）。
ｒ） pAG−121。pAG−100をSal I及びHind IIIで切断
しかつG418−耐性遺伝子の一部を有する669bp長さのフ
ラグメントを単離する。これをSAl I/Hind IIIで切断さ
れたプラスミドpB II KS+（Short等、Nucleic Acid R
es.16（1988）、7583−7600）中にクローン化挿入し
た。
しかつG418−耐性遺伝子の一部を有する669bp長さのフ
ラグメントを単離する。これをSAl I/Hind IIIで切断さ
れたプラスミドpB II KS+（Short等、Nucleic Acid R
es.16（1988）、7583−7600）中にクローン化挿入し
た。
ｓ） pAG−122。pAG−100をHind IIIで切断しかつTEF
−プロモーターの制御下でG418−耐性遺伝子の一部を有
する940bp長さのフラグメントを単離する。これをHind
IIIで切断されたプラスミドpAG−121中に、完全なG418
−耐性遺伝子が生じるように、挿入した。このプラスミ
ドのE.coliにおける形質転換は、カナマイシン−含有培
地上での形質転換体選択を許す。
−プロモーターの制御下でG418−耐性遺伝子の一部を有
する940bp長さのフラグメントを単離する。これをHind
IIIで切断されたプラスミドpAG−121中に、完全なG418
−耐性遺伝子が生じるように、挿入した。このプラスミ
ドのE.coliにおける形質転換は、カナマイシン−含有培
地上での形質転換体選択を許す。
ｔ） pAG−123。pAG−122をSal I及びBamH Iで切断し
かつTEF−プロモーターの制御下にG418−耐性遺伝子を
有する1639bp長さのフラグメントを単離した。これをSc
a Iで切断されたプラスミドpAG−120中に挿入し、それ
によってカナマイシン−含有培地上でのE.coli形質転換
体の選択が可能とされた。
かつTEF−プロモーターの制御下にG418−耐性遺伝子を
有する1639bp長さのフラグメントを単離した。これをSc
a Iで切断されたプラスミドpAG−120中に挿入し、それ
によってカナマイシン−含有培地上でのE.coli形質転換
体の選択が可能とされた。
ｕ） pAG−130。pB II KS+（Short等、Nucleic Acid
Res.16（1988）、7583−7600）をHind III及びHinc I
Iで分断し、かつ403bp長さのHind III/Hinc II−TEF−
プロモーターフラグメントを挿入した。
Res.16（1988）、7583−7600）をHind III及びHinc I
Iで分断し、かつ403bp長さのHind III/Hinc II−TEF−
プロモーターフラグメントを挿入した。
ｖ） pAG−131。ゲノムのA.gossypiiDNAの2.1kbの大き
さのフラグメントを有し、その上にTEF−遺伝子を含有
しているクローンから、TEF−遺伝子の３′−末端の25
ヌクレオチド並びに３′−方向でそれに続く範囲を有す
る（ターミネーターフラグメント）260bp大きさのHae I
II/Acc I−フラグメントを単離した。このフラグメント
を突出末端の補充後に、Hinc IIで分断されたプラスミ
ドpB II KS-（Short等、Nucleic Acid Res.16（198
8）、7583−7600）中に挿入した。
さのフラグメントを有し、その上にTEF−遺伝子を含有
しているクローンから、TEF−遺伝子の３′−末端の25
ヌクレオチド並びに３′−方向でそれに続く範囲を有す
る（ターミネーターフラグメント）260bp大きさのHae I
II/Acc I−フラグメントを単離した。このフラグメント
を突出末端の補充後に、Hinc IIで分断されたプラスミ
ドpB II KS-（Short等、Nucleic Acid Res.16（198
8）、7583−7600）中に挿入した。
ｗ） pAG−132。pag−130をSca I及びXho Iで切断しか
つ2248bp大きさのフラグメントを単離した。pAG−131を
同様にSca I及びXho Iで分断しかつ1442bp大きさのフラ
グメントを単離し、これを新たに完全なアンシピリン耐
性遺伝子が生じるようにpAG−103からの2248bpフラグメ
ントと連結させた。
つ2248bp大きさのフラグメントを単離した。pAG−131を
同様にSca I及びXho Iで分断しかつ1442bp大きさのフラ
グメントを単離し、これを新たに完全なアンシピリン耐
性遺伝子が生じるようにpAG−103からの2248bpフラグメ
ントと連結させた。
ｘ） M13PT。pAG−132をBamH Iで分離しかつTEF−プロ
モーター及びTEF−ターミネーターフラグメントからの
融合を含有する752bp大きさのフラグメントを単離し
た。これをM13mp9のBamH I−切断部位にクローン挿入し
た。
モーター及びTEF−ターミネーターフラグメントからの
融合を含有する752bp大きさのフラグメントを単離し
た。これをM13mp9のBamH I−切断部位にクローン挿入し
た。
ｙ） M13PT1、M13T2、M13T3。
M13PTを、オリゴヌクレオチド−指向の突然変異（Kra
mer等、Nucl.Acid Res.24（1984）、9441−9556）によ
り、TEF−遺伝子の停止コドンの後で（ターミネーター
フラグメント中）、Sca I−切断部位を、かつTEF−遺伝
子の出発コドン中で（プロモーターフラグメント中）、
Nco I−切断部位（M13PT1）、Nsi I−切断部位（M13PT
2）又はSph I−切断部位（M13PT3）が産生されるように
変換させた（第17図）。
mer等、Nucl.Acid Res.24（1984）、9441−9556）によ
り、TEF−遺伝子の停止コドンの後で（ターミネーター
フラグメント中）、Sca I−切断部位を、かつTEF−遺伝
子の出発コドン中で（プロモーターフラグメント中）、
Nco I−切断部位（M13PT1）、Nsi I−切断部位（M13PT
2）又はSph I−切断部位（M13PT3）が産生されるように
変換させた（第17図）。
ｚ） pAG−201。pAG−202 pAG−203（第18図） M13PT1、M13PT2及びM13PT3をBamH Iで分断しかつ分断
体からTEF−遺伝子のプロモーター及びターミネーター
領域を有する751bp大きさのフラグメントを単離した。
このTEF−シグナル配列をプラスミドpAG−123のBamH I
−切断部位中に挿入し、かつプラスミドpAG−201を得
た。同じ方法により、M13PT2からプラスミドpAG−202
を、かつM13PT3からプラスミドpAG−203を構築させた。
体からTEF−遺伝子のプロモーター及びターミネーター
領域を有する751bp大きさのフラグメントを単離した。
このTEF−シグナル配列をプラスミドpAG−123のBamH I
−切断部位中に挿入し、かつプラスミドpAG−201を得
た。同じ方法により、M13PT2からプラスミドpAG−202
を、かつM13PT3からプラスミドpAG−203を構築させた。
3.TEF−プロモーター領域−プラスミドでのAGゴシピィ
の形質転換 形質転換は、次の概要により行なった： −MA2（200ml）に胞子約１−２×107を接種する、 −32−40時間27℃で350Upmでシカネンフラスコ（Schika
nenbolben）中で培養する、 −ミセルを吸引濾過で濾取しかつH2O30ml中で1x洗浄す
る、 −未乾燥重量（Frischgewicht）を測定する（約２−3
g）、 −ミセルをSD30ml中に懸濁させ、かつ30分間30℃で振盪
器中で培養する、 −ミセルを未乾燥重量1g当りSPEZ5−10ml中に懸濁させ
る、 −30℃で木浴振盪器中で培養し、プロトプラスト化を顕
微鏡で調べる（30分間後に90％以上のプロトプラスト化
度が達成されているはずである）、 −プロトプラスト懸濁液をガラス濾過器（Schott、有孔
率１）を通して濾過する、 −濾液を５分間遠心分離する（Sorvall SM24Rotor、180
0Upm）、 −沈殿をST20ml中で1x及びSTC20ml中で1x洗浄する、 −プロトプラストをSTC20ml中に懸濁させかつ力価（Tit
er）を計算室で測定する、 −プロトプラストを遠心分離後にSTC中に４×108/mlの
濃度に再懸濁させる、 −プロトプラスト懸濁液100μをTE最高15μ中のDNA
に加えかつ混合する、（DNA−量：複製TEF−プロモータ
ー領域−プラスミドのために:1−10μg;線状化のTEF−
プロモーター領域−プラスミドのために:15−20μ
ｇ）、 −15分間室温で培養する、 −慎重にPTC40（1ml）を加えかつ転回混合する、 −５分間遠心分離（Heraeus BiofugeA.1500Upm）、 −上澄液を慎重に除去しかつ沈殿をSMTCI（1ml）中に懸
濁させる、 −３時間27℃で培養し、約全45分間転回により混合す
る、 −遠心分離後に沈殿をSM1ml中に懸濁させる、 −懸濁液をSMA2上層（Toplayer）9mlと混合しかつSMA2
平板培地上に加える（１平板培地当りSMA2−寒天20m
l）、 −平板培地を18時間27℃で培養、 −平板培地にG418を被層する（G418原液0.54ml＋H2O 0.
46ml＋0.5％アガロース6ml（H2O中、42℃に予備加
熱））、 −平板培地を27℃で更に培養し、形質転換は複製プラス
ミドで２−３日後に、組み込み時に３−６日後に可視可
能である 培地及び溶液 培地:MA2:ペプトン（Gibcoカゼイン加水分解物、No.14
0）： 10g/ 酵母エキス（Gibco）： 1g/ ブドウ糖 10g/ ミオ−イノシトール 0.3g/ SMA2−寒天：ソルビトール： 1M ペプトン： 10g/ 酵母エキス： 1g/ ブドウ糖： 20g/ ミオ−イノシトール 0.3g/ 寒天（Gibco） 12g/ SMA2−上層:SMA2−寒天と同様、寒天の代わりに0.8％
アガロース 溶液:SD:ソルビトール1M;ジチオトレイトール50mM SPEZ:ソルビトール1M;Na−ホスフェート緩衝液pH5.8
（10mM）;EDTA10mM;チモリエーゼ（Zymolyase）20T2mg/
ml（Seikagaku Kogyo Co.Tokyo） ST:ソルビトール1M;トリス−ClpH8（10mM） STC:ソルビトール1M;トリス−ClpH8（10mM）;CaCl210
mM TE:トリス−C110mM;EDTA1mM PTC40:ポリエチレングリコール4000（Merck）40％（w
/v）；トリス−ClpH8（10mM）;CaCl210mM SMTCI:SM（下記参照）50％;STC50％；ミオ−イノシト
ール0.03g/ SM:ソルビトール50％2M;MA2 50％ G418−原液:H2O中G418（Geneticin Gibco）20mg/ml 4.TEF−プロモーター領域プラスミドでの形質転換結果 例３により実施された種々の形質転換の結果を第１表
にまとめる。全実験において形質転換体は、形質転換平
板培地当りG418−濃度0.3mg/mlで選択した。このG418−
濃度では、A.ゴシピィミセルの増殖は完全に阻止され
る。組換体DNA−ベクターpAG−１及びpAG−２での形質
転換では（この際G418−耐性遺伝子は最初の細菌プロモ
ーターの制御下にありかつTEFプロモーター領域の制御
下にない）、この濃度では形質転換体は生じなかった。
この組換体DNAベクターで形質転換体を得るためには、
形質転換平板培地当りG418−濃度0.1mg/mlを越えてはな
らない。この濃度では、出現するコロニーの80％までが
形質転換体ではない。
の形質転換 形質転換は、次の概要により行なった： −MA2（200ml）に胞子約１−２×107を接種する、 −32−40時間27℃で350Upmでシカネンフラスコ（Schika
nenbolben）中で培養する、 −ミセルを吸引濾過で濾取しかつH2O30ml中で1x洗浄す
る、 −未乾燥重量（Frischgewicht）を測定する（約２−3
g）、 −ミセルをSD30ml中に懸濁させ、かつ30分間30℃で振盪
器中で培養する、 −ミセルを未乾燥重量1g当りSPEZ5−10ml中に懸濁させ
る、 −30℃で木浴振盪器中で培養し、プロトプラスト化を顕
微鏡で調べる（30分間後に90％以上のプロトプラスト化
度が達成されているはずである）、 −プロトプラスト懸濁液をガラス濾過器（Schott、有孔
率１）を通して濾過する、 −濾液を５分間遠心分離する（Sorvall SM24Rotor、180
0Upm）、 −沈殿をST20ml中で1x及びSTC20ml中で1x洗浄する、 −プロトプラストをSTC20ml中に懸濁させかつ力価（Tit
er）を計算室で測定する、 −プロトプラストを遠心分離後にSTC中に４×108/mlの
濃度に再懸濁させる、 −プロトプラスト懸濁液100μをTE最高15μ中のDNA
に加えかつ混合する、（DNA−量：複製TEF−プロモータ
ー領域−プラスミドのために:1−10μg;線状化のTEF−
プロモーター領域−プラスミドのために:15−20μ
ｇ）、 −15分間室温で培養する、 −慎重にPTC40（1ml）を加えかつ転回混合する、 −５分間遠心分離（Heraeus BiofugeA.1500Upm）、 −上澄液を慎重に除去しかつ沈殿をSMTCI（1ml）中に懸
濁させる、 −３時間27℃で培養し、約全45分間転回により混合す
る、 −遠心分離後に沈殿をSM1ml中に懸濁させる、 −懸濁液をSMA2上層（Toplayer）9mlと混合しかつSMA2
平板培地上に加える（１平板培地当りSMA2−寒天20m
l）、 −平板培地を18時間27℃で培養、 −平板培地にG418を被層する（G418原液0.54ml＋H2O 0.
46ml＋0.5％アガロース6ml（H2O中、42℃に予備加
熱））、 −平板培地を27℃で更に培養し、形質転換は複製プラス
ミドで２−３日後に、組み込み時に３−６日後に可視可
能である 培地及び溶液 培地:MA2:ペプトン（Gibcoカゼイン加水分解物、No.14
0）： 10g/ 酵母エキス（Gibco）： 1g/ ブドウ糖 10g/ ミオ−イノシトール 0.3g/ SMA2−寒天：ソルビトール： 1M ペプトン： 10g/ 酵母エキス： 1g/ ブドウ糖： 20g/ ミオ−イノシトール 0.3g/ 寒天（Gibco） 12g/ SMA2−上層:SMA2−寒天と同様、寒天の代わりに0.8％
アガロース 溶液:SD:ソルビトール1M;ジチオトレイトール50mM SPEZ:ソルビトール1M;Na−ホスフェート緩衝液pH5.8
（10mM）;EDTA10mM;チモリエーゼ（Zymolyase）20T2mg/
ml（Seikagaku Kogyo Co.Tokyo） ST:ソルビトール1M;トリス−ClpH8（10mM） STC:ソルビトール1M;トリス−ClpH8（10mM）;CaCl210
mM TE:トリス−C110mM;EDTA1mM PTC40:ポリエチレングリコール4000（Merck）40％（w
/v）；トリス−ClpH8（10mM）;CaCl210mM SMTCI:SM（下記参照）50％;STC50％；ミオ−イノシト
ール0.03g/ SM:ソルビトール50％2M;MA2 50％ G418−原液:H2O中G418（Geneticin Gibco）20mg/ml 4.TEF−プロモーター領域プラスミドでの形質転換結果 例３により実施された種々の形質転換の結果を第１表
にまとめる。全実験において形質転換体は、形質転換平
板培地当りG418−濃度0.3mg/mlで選択した。このG418−
濃度では、A.ゴシピィミセルの増殖は完全に阻止され
る。組換体DNA−ベクターpAG−１及びpAG−２での形質
転換では（この際G418−耐性遺伝子は最初の細菌プロモ
ーターの制御下にありかつTEFプロモーター領域の制御
下にない）、この濃度では形質転換体は生じなかった。
この組換体DNAベクターで形質転換体を得るためには、
形質転換平板培地当りG418−濃度0.1mg/mlを越えてはな
らない。この濃度では、出現するコロニーの80％までが
形質転換体ではない。
5.lacZ−プラスミドでの形質転換結果 TEF−プロモーター機能性を更に調べるために、E.col
iからのβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子（lacZ−
遺伝子）がTEF−プロモーターの制御下にあるプラスミ
ドpAG−100の誘導体を構築した。このために、TEF−遺
伝子のプロモーター領域の種々の範囲をlacZ−遺伝子の
開放読み枠前で融合させ、この際、lacZ−遺伝子の最初
の７コドンはTEF−遺伝子の最初の８コドンに代えられ
た。プラスミドpAG−110はlacZ−遺伝子の前で約1.5kb
長さのHinc II TEF−プロモーターフラグメントを有
し、かつプラスミドpAG−111は403bp長さのHind III/Hi
nc II−TEF−プロモーターフラグメントを有し、これは
すでにpAG−100及びpAG−101の構築のために使用され
た。プラスミドpAG−112は294bp長さのTEF−プロモータ
ーフラグメントを有し、プラスミドpAG−113は、239bp
長さのTEF−プロモーターフラグメントを有しかつpAG−
114は158bp長さのTEF−プロモーターフラグメントを有
する。
iからのβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子（lacZ−
遺伝子）がTEF−プロモーターの制御下にあるプラスミ
ドpAG−100の誘導体を構築した。このために、TEF−遺
伝子のプロモーター領域の種々の範囲をlacZ−遺伝子の
開放読み枠前で融合させ、この際、lacZ−遺伝子の最初
の７コドンはTEF−遺伝子の最初の８コドンに代えられ
た。プラスミドpAG−110はlacZ−遺伝子の前で約1.5kb
長さのHinc II TEF−プロモーターフラグメントを有
し、かつプラスミドpAG−111は403bp長さのHind III/Hi
nc II−TEF−プロモーターフラグメントを有し、これは
すでにpAG−100及びpAG−101の構築のために使用され
た。プラスミドpAG−112は294bp長さのTEF−プロモータ
ーフラグメントを有し、プラスミドpAG−113は、239bp
長さのTEF−プロモーターフラグメントを有しかつpAG−
114は158bp長さのTEF−プロモーターフラグメントを有
する。
付加的に、対照プラスミドとして、プロモーターフラ
グメントの融合なしにlacZ−遺伝子の開放読み枠を有す
るpAG−115を構築した。
グメントの融合なしにlacZ−遺伝子の開放読み枠を有す
るpAG−115を構築した。
A.ゴシピィにおけるこのプラスミドの形質転換後に、
lacZ−遺伝子の発現を発色試験により検査した。lacZ−
遺伝子によってコードされたβ−ガラクトシダーゼは、
青色染料５−ブロム−４−クロル−インジゴ中で、Ｘ−
Gal（５−ブロム−４−クロル−３−インドイル−β−
Ｄ−ガラクトシド）を分解する。pAG−110−、pAG−111
−及びpAG−112−形質転換体は、Ｘ−Gal（Miller、Exp
eriments in Molecular Genetics、Cold Spring Har
bor、New Mork1972、48）を濃度100μg/mlで含有する
培地上に青色のコロニーを形成した。pAG−113、pAG−1
14又はpAG−115を含有する形質転換体では、青色呈色は
見られなかった。
lacZ−遺伝子の発現を発色試験により検査した。lacZ−
遺伝子によってコードされたβ−ガラクトシダーゼは、
青色染料５−ブロム−４−クロル−インジゴ中で、Ｘ−
Gal（５−ブロム−４−クロル−３−インドイル−β−
Ｄ−ガラクトシド）を分解する。pAG−110−、pAG−111
−及びpAG−112−形質転換体は、Ｘ−Gal（Miller、Exp
eriments in Molecular Genetics、Cold Spring Har
bor、New Mork1972、48）を濃度100μg/mlで含有する
培地上に青色のコロニーを形成した。pAG−113、pAG−1
14又はpAG−115を含有する形質転換体では、青色呈色は
見られなかった。
lacZ−遺伝子の前で融合された種々のTEF−プロモー
ターフラグメントについての概要を第16図に示す。＋は
Ｘ−Gal−含有培地上のコロニーの青色呈色を表わし、
−は可能可能な青色呈色が無いことを表わす。
ターフラグメントについての概要を第16図に示す。＋は
Ｘ−Gal−含有培地上のコロニーの青色呈色を表わし、
−は可能可能な青色呈色が無いことを表わす。
β−ガラクトシダーゼ−発現のもう１つの検査のため
に、pAG−110−、pAG−111−、pAG−112−、pAG−113
−、pAG−114−及びpAG−115−形質転換体の液体培地か
らのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。このために
ミセルをガラス球で破壊した（Rose、M.;Casadaban、M.
J.and Botstein、D.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.7
8、No.4（1981）、2460−2464）。G418200μg/mlを有す
るMA2−液体培地中で生育したミセル0.5gを、トリス0.1
mM、pH8.0/グリセリン20％（vol/vol）/DTT 1mM/PMSF1
mM中に入れかつガラス球（直径0.45−0.5mm）0.5gの添
加後に−20℃で凍結除去した。ミセルの破壊のために４
℃で15秒間12回激しく振盪した（ボルテックス）。引続
き10000prmで20分間２回遠心分離した（ソルバール（So
rball）冷却遠心分離機）。上澄液をＺ−緩衝液（Na2HP
O40.06M/NaH2PO40.04M/KC10.01M/MgSO40.001M/β−メル
カプトエタノール0.05M）中で、1:10もしくは1:20に希
釈した。希釈されたタンパク質−粗製抽出液中でβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドの分解により測定した（Miller、Ex
periments in Molecular Genetics、Cold Spring Harb
or、New York1972、353ff）。酵素活性を粗製抽出液中
のタンパク質濃度に相対させ、これをブラッドフォード
（Bradford）の方法により測定した（Bradford、M.M.、
Anal.Biochem.72（1976）、248−254）。β−ガラクト
シダーゼ−活性測定の結果を第２表に示す。１分間当り
及び総タンパク質1mg当りに遊離されたｏ−ニトロフェ
ノールの量が挙げられている（OD420として測定）。
に、pAG−110−、pAG−111−、pAG−112−、pAG−113
−、pAG−114−及びpAG−115−形質転換体の液体培地か
らのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。このために
ミセルをガラス球で破壊した（Rose、M.;Casadaban、M.
J.and Botstein、D.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.7
8、No.4（1981）、2460−2464）。G418200μg/mlを有す
るMA2−液体培地中で生育したミセル0.5gを、トリス0.1
mM、pH8.0/グリセリン20％（vol/vol）/DTT 1mM/PMSF1
mM中に入れかつガラス球（直径0.45−0.5mm）0.5gの添
加後に−20℃で凍結除去した。ミセルの破壊のために４
℃で15秒間12回激しく振盪した（ボルテックス）。引続
き10000prmで20分間２回遠心分離した（ソルバール（So
rball）冷却遠心分離機）。上澄液をＺ−緩衝液（Na2HP
O40.06M/NaH2PO40.04M/KC10.01M/MgSO40.001M/β−メル
カプトエタノール0.05M）中で、1:10もしくは1:20に希
釈した。希釈されたタンパク質−粗製抽出液中でβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドの分解により測定した（Miller、Ex
periments in Molecular Genetics、Cold Spring Harb
or、New York1972、353ff）。酵素活性を粗製抽出液中
のタンパク質濃度に相対させ、これをブラッドフォード
（Bradford）の方法により測定した（Bradford、M.M.、
Anal.Biochem.72（1976）、248−254）。β−ガラクト
シダーゼ−活性測定の結果を第２表に示す。１分間当り
及び総タンパク質1mg当りに遊離されたｏ−ニトロフェ
ノールの量が挙げられている（OD420として測定）。
配列記録 No.1: 配列の種類：ヌクレオチド 配列の長さ:409塩基対 鎖形態：一本鎖 トポロジー：線状 分子の種類：ゲノム−DNA 由来:A.ゴシピィ 形質：プロモーター領域 第１〜８図の説明 第１図：プラスミドpAG−１。ARS:S.セレビジアエARS1
配列;2ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２
μプラスミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジア
エURA3遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性；閉鎖
矢印:S.セレビジアエcycl−13プロモーター；ブラック
ボックス:S.セレビジアエcyclターミネーター；開放矢
印は転写方向を示す。
配列;2ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２
μプラスミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジア
エURA3遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性；閉鎖
矢印:S.セレビジアエcycl−13プロモーター；ブラック
ボックス:S.セレビジアエcyclターミネーター；開放矢
印は転写方向を示す。
第２図：プラスミドpAG−２。amp:アンピシリン耐性;2
ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラ
スミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジアエURA3
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliに
おけるプラスミド複製のオリジン；開放矢印は転写方向
を示す。
ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラ
スミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジアエURA3
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliに
おけるプラスミド複製のオリジン；開放矢印は転写方向
を示す。
第３図：プラスミドpAG−100。amp:アンピシリン耐性;2
ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラ
スミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジアエURA3
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliに
おけるプラスミド複製のオリジン；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメント；開
放矢印は転写方向を示す。
ミクロン：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラ
スミドのEcoR Iフラグメント;URA3:S.セレビジアエURA3
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliに
おけるプラスミド複製のオリジン；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメント；開
放矢印は転写方向を示す。
第４図：プラスミドpAG−５。amp:アンピシリン耐性;G4
18r:（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliにおけるプラス
ミド複製のオリジン;TEF:翻訳延長因子のためのORFを有
するA.ゴシピィEcoR I/BamH Iフラグメント；開放矢印
は転写方向を示す。
18r:（カナマイシン）耐性;ORI:E.coliにおけるプラス
ミド複製のオリジン;TEF:翻訳延長因子のためのORFを有
するA.ゴシピィEcoR I/BamH Iフラグメント；開放矢印
は転写方向を示す。
第５図：プラスミドpAG−101。amp:アンピシリン耐性;G
418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coli中のプラス
ミド複製のオリジン;TEF:翻訳延長因子のためのORFを有
するA.ゴシピィEcoR I/BamH Iフラグメント；閉鎖矢印:
TEF−プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメ
ント；開放矢印は転写方向を示す。
418r:G418（カナマイシン）耐性;ORI:E.coli中のプラス
ミド複製のオリジン;TEF:翻訳延長因子のためのORFを有
するA.ゴシピィEcoR I/BamH Iフラグメント；閉鎖矢印:
TEF−プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメ
ント；開放矢印は転写方向を示す。
第６図：プラスミドpPL1。amp:アンピシリン耐性;M13
＋：一本鎖−DNA−単離のための複製開始点、ori:E.col
iにおけるプラスミド複製用オリジン;lacZ:E.coli lacZ
遺伝子;PromTEF−プロモーター領域を有する1500bp A.
ゴシピィDNAフラグメント 第７図：プラスミドpAG−110。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoRIフラグメント;
URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモータ
ー領域を有する1500bp A.ゴシピィDNAフラグメント;la
cZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐
性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用オリジ
ン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有する1500bp A.ゴシピィ、DNAフラグメ
ント；開放矢印は転写方向を示す。
＋：一本鎖−DNA−単離のための複製開始点、ori:E.col
iにおけるプラスミド複製用オリジン;lacZ:E.coli lacZ
遺伝子;PromTEF−プロモーター領域を有する1500bp A.
ゴシピィDNAフラグメント 第７図：プラスミドpAG−110。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoRIフラグメント;
URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモータ
ー領域を有する1500bp A.ゴシピィDNAフラグメント;la
cZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐
性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用オリジ
ン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有する1500bp A.ゴシピィ、DNAフラグメ
ント；開放矢印は転写方向を示す。
第８図；プラスミドpAG−111。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する403bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオ
リジン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−
プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメン
ト；開放矢印は転写方向を示す。
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する403bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオ
リジン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−
プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメン
ト；開放矢印は転写方向を示す。
第９図；プラスミドpPL2。amp:アンピシリン耐性遺伝
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製開始点;ori:
E.coli中のプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.coli l
acZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部（270b
p）を有する294bp A.ゴシピィDNAフラグメント。
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製開始点;ori:
E.coli中のプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.coli l
acZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部（270b
p）を有する294bp A.ゴシピィDNAフラグメント。
第10図：プラスミドpPL3。amp:アンピシリン耐性遺伝
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製用開始点;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.
coli lacZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部
（215bp）を有する239bp A.ゴシピィDNA−フラグメン
ト。
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製用開始点;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.
coli lacZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部
（215bp）を有する239bp A.ゴシピィDNA−フラグメン
ト。
第11図：プラスミドpPL4。amp:アンピシリン耐性遺伝
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製用開始点;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.
coli lacZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部
（134bp）を有する158bpA.ゴシピィDNAフラグメント。
子;M13＋：一本鎖−DNA−単離のための複製用開始点;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリジン;lacZ:E.
coli lacZ遺伝子;Prom:TEF−プロモーター領域の一部
（134bp）を有する158bpA.ゴシピィDNAフラグメント。
第12図；プラスミドpAG−112。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する294bp A.セレビジアエDNAフラグメ
ント;lacZ:E.coli lacZ遺伝子:G418（カナマイシン）耐
性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリ
ジン;amp:アムピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プ
ロモーター領域を有するA.ゴシピィDNA断片；開放矢印
は転写方向を示す。
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する294bp A.セレビジアエDNAフラグメ
ント;lacZ:E.coli lacZ遺伝子:G418（カナマイシン）耐
性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオリ
ジン;amp:アムピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プ
ロモーター領域を有するA.ゴシピィDNA断片；開放矢印
は転写方向を示す。
第13図；プラスミドpAG−113。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する239bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coli中のプラスミド複製用のオリジ
ン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメント；開
放矢印は転写方向を示す。
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する239bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coli中のプラスミド複製用のオリジ
ン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−プロ
モーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメント；開
放矢印は転写方向を示す。
第14図；プラスミドpAG−114。２μ：複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する158bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオ
リジン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−
プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメン
ト；開放矢印は転写方向を示す。
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子;Prom:TEF−プロモ
ーター領域を有する158bp A.ゴシピィDNAフラグメント;
lacZ:E.coli lacZ遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）
耐性遺伝子;ori:E.coliにおけるプラスミド複製用のオ
リジン;amp:アンピシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印:TEF−
プロモーター領域を有するA.ゴシピィDNAフラグメン
ト；開放矢印は転写方向を示す。
第15図；プラスミドpAG−115。２μm:複製開始点を有す
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子:lacZ:E.coli lacZ
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性遺伝子;ori:E.
coli中のプラスミド複製用のオリジン;amp:アンピシリ
ン耐性遺伝子；開放矢印は転写方向を示す。
るS.セレビジアエ２μプラスミドのEcoR Iフラグメン
ト;URA3:S.セレビジアエURA3遺伝子:lacZ:E.coli lacZ
遺伝子;G418r:G418（カナマイシン）耐性遺伝子;ori:E.
coli中のプラスミド複製用のオリジン;amp:アンピシリ
ン耐性遺伝子；開放矢印は転写方向を示す。
第16図；β−ガラクトシダーゼ−表現プラスミドのTEF
−プロモーターフラグメント。
−プロモーターフラグメント。
第17図;ATG−範囲及びM13PT1、M13PT2、M13PT3、pAG−2
01、pAG−202、pAG−203のターミネーター範囲における
ヌクレオチド配列。
01、pAG−202、pAG−203のターミネーター範囲における
ヌクレオチド配列。
第18図；プラスミドpAG−201、pAG−202、pAG−203。２
μ：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラスミド
のECORIフラグメント:Prom、Term:TEF−プロモータータ
ーミネーター融合を有する751bp A.ゴシピィDNA−フラ
グメント。G418r:G418（カナマイシン）耐性遺伝子;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用の開始点;amp:アン
ピシリン耐性遺伝子；開放矢印は転写方向を示す。
μ：複製開始点を有するS.セレビジアエ２μプラスミド
のECORIフラグメント:Prom、Term:TEF−プロモータータ
ーミネーター融合を有する751bp A.ゴシピィDNA−フラ
グメント。G418r:G418（カナマイシン）耐性遺伝子;or
i:E.coliにおけるプラスミド複製用の開始点;amp:アン
ピシリン耐性遺伝子；開放矢印は転写方向を示す。
第19図;TEF−遺伝子のプロモーター及びターミネーター
からの融合のヌクレオチド配列。
からの融合のヌクレオチド配列。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 シュタイナー，ザビーネ ドイツ連邦共和国 Ｄ―6300 ギーセン ザールラントシュトラーセ 14 (72)発明者 ライト，マーチン シー. ドイツ連邦共和国 Ｄ―7950 ビーベラ ッハ／リス マルティン―ルター―シュ トラーセ13 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】配列No.1: のヌクレオチド配列を有する、翻訳延長ファクターEF−
１αをコードするA.ゴシピイ−遺伝子のプロモーター領
域。 - 【請求項２】請求項１に記載のプロモーター領域で遺伝
子技術的に変更された真菌。 - 【請求項３】タンパク質の製造のために請求項２に記載
の真菌を使用する方法。 - 【請求項４】真菌はA.ゴシピイである、請求項３に記載
の使用法。 - 【請求項５】配列No.2: 中の位置1513−2095に記載のヌクレオチド配列を有し、
短縮された末端領域がなお機能的に有効であることを前
提として、３′−末端で短縮されていてよい、翻訳延長
ファクターEF−αをコードするA.ゴシピイ−遺伝子のタ
ーミネーター領域。 - 【請求項６】ビタミンB2−生合成の遺伝子又はビタミン
B2の過剰発現に関与する遺伝子の構造的に強化された発
現のために請求項２に記載の真菌を使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4020181.3 | 1990-06-25 | ||
| DE4020181A DE4020181A1 (de) | 1990-06-25 | 1990-06-25 | Neue promotorregion |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06500007A JPH06500007A (ja) | 1994-01-06 |
| JP3059214B2 true JP3059214B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=6409025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3510339A Expired - Lifetime JP3059214B2 (ja) | 1990-06-25 | 1991-06-15 | 新規のプロモーター領域 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0536192B1 (ja) |
| JP (1) | JP3059214B2 (ja) |
| AT (1) | ATE110779T1 (ja) |
| CA (1) | CA2080482C (ja) |
| DE (2) | DE4020181A1 (ja) |
| DK (1) | DK0536192T3 (ja) |
| ES (1) | ES2060392T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992000379A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7673432B2 (en) * | 2004-03-11 | 2010-03-09 | The Hong Kong Polytechnic University | Double-skin tubular structural members |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989870A (en) * | 1986-04-30 | 1999-11-23 | Rohm Enzyme Finland Oy | Method for cloning active promoters |
| EP0599945A1 (de) * | 1991-08-22 | 1994-06-08 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur gezielten genetischen veränderung von ashbya gossypii |
| ATE209682T1 (de) * | 1992-05-11 | 2001-12-15 | Basf Ag | Dna-verbindungen und rekombinante, die ribloflavinsynthetaseaktivität von s. cerevisiae codierende dna-expressionsvektoren |
| DE19521314A1 (de) * | 1995-06-12 | 1996-12-19 | Max Planck Gesellschaft | Adhärenzgen aus Helicobacter pylori und davon codiertes Polypeptid |
| EP0927761A3 (de) | 1997-12-23 | 2001-09-05 | Basf Aktiengesellschaft | Gene der Purinbiosyntese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese |
| DE19801120A1 (de) | 1998-01-15 | 1999-07-22 | Basf Ag | Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung |
| CN108251476B (zh) * | 2018-02-01 | 2021-09-07 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 从酶制剂废水中提取维生素b12的方法 |
-
1990
- 1990-06-25 DE DE4020181A patent/DE4020181A1/de not_active Withdrawn
-
1991
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7673432B2 (en) * | 2004-03-11 | 2010-03-09 | The Hong Kong Polytechnic University | Double-skin tubular structural members |
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