JP2877165B2 - 自己免疫病に関連する配列の特性決定及び検出 - Google Patents

自己免疫病に関連する配列の特性決定及び検出

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、自己免疫に関連するHLAクラスIIベータ遺
伝子およびタンパク質、およびそれらを診断する方法に
関する。詳しくは、本発明における自己免疫病はインス
リン依存性真性糖尿病(IDDM)および尋常性天疱瘡(Pe
mphigus vulgaris)(PV)である。
種々の自己免疫病は、ヒト白血球抗原(HLA)クラスI
II抗原の血清学的に定義された変異型に関連づけられて
きた。HLA領域は、染色体の短いアーム上に位置し、2
つのカテゴリーに分類された多数の異なる糖タンパク質
をコードする。第1カテゴリー、すなわちクラスIの産
生物は、HLA−A,−B、および−Cの位置によりコード
され、すべての有機細胞の表面上に位置し、そして細胞
溶解性T細胞の認識において標的として機能する。第2
カテゴリー、すなわちクラスIIの産生物は、HLA−D領
域によりコードされ、免疫系の細胞間の協力および相互
作用に参加する。これらのクラスIIの産生物は少なくと
も3つの別個遺伝子座、すなわちDR,DQおよびDPにより
コードされるように思われ、各々はその別個のアルファ
およびベータ鎖をもつ。ヒトの主要組織適合性複合体
(MHC)のクラスIIの遺伝子座は、高度に多形性の細胞
表面の糖タンパク質をコードする(マイクロファージお
よびベーター細胞のトランスメンブレン糖タンパク
質)。文献を概観するためには、Gilesら、Adv.in Immu
nol.37、1−71(1985)を参照のこと。クラスIIの抗原
における多形性はNH2−末端の外側のドメインに局在
し、そして第2エクソンによりコードされている。クラ
スIIの多形性の残りは、T細胞の受容体と、または外来
抗原あるいは両者と相互作用することが推定され〔Sett
eら、Nature、328:395−399(1987)〕、特定のクラスI
Iの産生物に関連する抗原ペプチド断片の認識はT細胞
の活性化を導き、結局ベータリンパ球による抗体の産生
の刺激を導く〔Marxら、Science,238:613−614(198
7)〕。
インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、すなわち、I
型糖尿病としても知られている慢性自己免疫病は、ヒト
白血球抗原(HLA)の特定の対立遺伝子変異型に関連す
るグルコース代謝の感受性のよく知られた疾患である。
IDDM患者において起こるグルコース代謝の機能障害的制
御は、膵臓のインスリン産生小島細胞、すなわちベータ
細胞の免疫学的に仲介される破壊から生ずる。IDDMの進
行は6つの段階に分割され、遺伝的感受性で始まり、そ
してベータ細胞の完全な破壊で終わる。G.Eisenbarth,
N.Eng.J.Med.,314:1360−1368(1986)。Donaichら、An
n.Rev.Med.,34:13−20(1983)。すべてのIDDMの患者の
90%より多くはDR3および/またはDR4抗原を有し、そし
てDR3およびDR4の両者をもつ個体はホモ接合性のDR3/3
またはDR4/4の遺伝子型を有する個体より大きい危険状
態にある。L.RaffelおよびJ.Rotter,Clinical Diabete
s,:50−54(1985);Svejgaardら、Immunol.Rev.,70:1
93−218(1983);L.Ryderら、Ann.Rev.Genet.,15:169−
187(1981)。
水疱またはプステル(pustule)を意味するギリシャ
語のペンフィックス(pemphix)に由来する天疱瘡は、
かゆみのある水疱の連続する群により特徴づけられる慢
性または急性の皮膚病につけられた名前である。尋常性
天疱瘡(Pemphigus vulgaris)(PV)は、皮膚および
粘膜の基底上の、表皮内の水疱により発現される再発す
ることの希な病気である;しかしながら、緩解はコルチ
コステロイドホルモンおよび免疫抑制薬物の使用により
得られている。自己免疫病であるPVは、HLA血清型DR4お
よびDRw6と強く関連づけられきており〔Brautbarら、Ti
ssue Antigens,16:238−241(1980)〕、PV患者の5%
未満はマーカーをもたない。2つのハプロタイプと病気
の関連は、次のことを意味すると解釈することができ
る:(1)2つのハプロタイプは共通の対立遺伝子また
はエピトープを共有するか、あるいは(2)2つのハプ
ロタイプ上の異なる対立遺伝子は疾患感受性を与えるこ
とができる。
HLAクラスIIベータ遺伝子の分子分析が示すところに
よれば、HLA血清型が遺伝学的に異種であり、そしてと
くに、DR4ハプロタイプがDw4、DW10,Dw13,Dw14およびDw
15型と定義された5つの混合されたリンパ球培養物(ML
C)に相当する5つの異なるDR−ベータ−I対立遺伝子
配列〔Gregersenら、PNAS(USA)83:2642:2646(198
6)〕並びにDQ−ベータ−3.1、DQ−ベータ−3.2およびD
Q−ブランク型に相当する3つの異なるDQ−ベータ対立
遺伝子配列〔Erlichら、組織適合性の抗原の分子の分析
(The Molecular Analysis of Histocompatibility Ant
igens)、pp.93−109(Schacterら、編、1987)〕から
成る。クラスIIの遺伝子座に特徴的な広範な多形性は事
実上すべて、第2エクソンに位置付けられている。
DR−ベータ遺伝子座におけるコード配列の多形性の配
列分析は、DW10を他のDR4サイブタイプと区別するDR4 D
R−ベータI鎖中の配列またはエピトープがDRw6ハプロ
タイプのDR−ベータ−I鎖により共有されることを明ら
かにした。Gorskiら、Nature,322:67−70(1986)。最
近、DR4およびDRw6ハプロタイプを再分類する制限断片
長多形性(RFLPs)は、HLA−DQ−ベータcrnaプローブを
使用して得られた。このようなRFLPsは血清型のマーカ
ーよりもPVとより一層高度に関連すると報告されている
〔Szferら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6542−6545(1
987)〕。
すべての免疫学的に定義される多形性のうちで、HLA
−DR−ベータ領域は、IDDMに最も強く関連することが見
出されている。したがって、HLAクラスIIベータDNAの制
限断片は、インスリン依存性真性糖尿病の遺伝子マーカ
ーとして使用するため分析された。D.Owerbach et al.,
PNAS(USA),82:3335−3339(1985);D,Steltlerら、P
NAS(UNA),82:8100−8104(1985)。
Arnheimら、PNAS(USA),82:6970−6974(Oct.198
5)は、IDDMに対する感受性に関連するHLAクラスII遺伝
子座内のDNA多性形を、DQ−ベータおよびDR−ベータcDN
Aプローブを使用するゲノムブロット−ハイブリダイゼ
ーション分析により検査した。DR4ハプロタイプのDQ−
ベータの再分類が記載され、ここで1つのDR4変異型は
1.8kbのRsa I制限断片長多形(RFLP)を有し、そして他
は1.5kbのRsa I RFLPを有する。DQ−ベータに関係する
1.5kbのRsa I断片は、多数の非−DR4 IDDMおよびすべて
のIDDM DR4個体の90%を同定することが報告された。
他の制限酵素(例えば、BamH I,Hind III)を使用す
る他の研究者らは、DQ−ベータプローブを使用するDR4
ハプロタイプのRFLP再分類を報告した。Holbeckら、Imm
unogenetics(1986)24:251−258;Hensenら、Immunogen
etics,(1987)25:152−16)。Holbeckら、前掲には、D
Qw3.1およびDQw3.2と表示されるDR4のRFLPサブセット
が、特異的モノクローナル抗体TA10と発現したそれらの
産生物との反応性により区別されることを発見した。Ki
mら、PNAS(USA),82:8139−8142(1985);Taitら、Ti
ssue Antigens,(1986)28:65−71。DQw3.1サイブタイ
プは血清学的特異性TA10+と相関関連し、これに対してD
Qw3.2はTA10-と相関関係する。
欧州特許発行第237,362号は、DR4ハプロタイプのRsa
I 1.5kb(DQw3.2)およびRsa I 1.8kb(DQw3.1)変異型
のクローニングおよび配列決定を開示しており、そして
それらの配列の差を説明している。(このような差は表
IIIおよびIVに示されている。) WO86/07646号は、IDDMに関連する特異的ゲノムのマー
カーとして、特異的DQ−ベータ対立遺伝子変異型DQw
3.2を開示しており、そして糖尿病の危険が増大した個
体を同定する2つの方法を提供する。第1方法はDQw3.2
対立遺伝子の検出に標識したプローブの使用するもので
あり、これに対して第2方法はDQw3.2対立遺伝子の血清
学的検出を用いる。
Frlichら、免疫遺伝学および組織適合性における概観
(Perspectivs in Immunogenetics and Histocompatibi
lity),Vol.7:93−106(Schacterら、編、1987)は、DQ
w3.1および3.2変異型についてのタンパク質翻訳配列を
報告した。
Michelsonら、J.Clin.Invest.79:1141−1152(April
1987)は、DQw3.1変異型についてのヌクレオチド配列を
報告した。
Acha−Orbeaら、PNAS(USA),84(8):2435−2435
(1987)は、対照マウスおよび糖尿病感受性NOD(非肥
満の糖尿病)マウスのH−2 I−A領域における差の不
存在を報告した。正常マウスは前記領域の位置57におけ
るアスラギン酸残基を有するが、これに対してNODマウ
スはその位置に中性のセリン残基を有する。ヒトHLA−D
Q−ベータ領域はマウスのH−2 I−A領域に類似する。
Yoonら、Diabetes Care,(sul 1.1):39−44(Sep
t.−Oct.1985)は、動物およびヒトにおけるIDDMのため
のトリガーとしてウイルスの証拠を概観している。ま
た、Bodanskyら、Lancet,(1986)、ii:1351−1353:Kag
noffら、J.Exp.Med.,(1984)、160:1544−1557;McChes
neyら、Ann.Rev.Immunol.,:279−304;Oldstoneら、No
tkinsら(編)、J.Exp.Med.,(1987)、166:173−181;S
ilverら、Disease Markers(1986)、:155−168;およ
びSrinivasappaら、J.Virology,57:397−401を参照のこ
と。
Roudierら、American Rheumatism Associationからの
Abstracts(Western Region)、カリフォルニア州サン
ディエゴにおける会合、1987年11月5−7日は、HLA Dw
4 DR−ベータ−I鎖およびエプスタイン−バーウイルス
(EBV)の糖タンパク質はヘキサペプチド共有すること
を報告した。
Toddら、Nature,329:599−604(Oct.15,1987)は、ID
DMに対する感受性および抵抗性へのHLA DQ−ベータ遺伝
子の寄与を論じている。著者らは「DQ分子の構造、とく
にベータ鎖の残基57は、インスリン産生小島細胞に対す
る自己免疫応答を特定する」と結論している。
多数のHLA DR−ベータ配列が従来発表されてきてい
る。配列Asp Ile Leu Glu Asp Glu Argが、Gregersen
ら、PNAS(USA),83:2642−2646(1986)により、HLA
DR4ハプロタイプからの種々のDR−ベータ遺伝子の鎖の
一部分として報告された。糖尿病とのその関連について
は何も述べられていない。さらに、J.GorskiおよびB.Ma
ch,Nature,322:67−70(1986)は、ハプロタイプDR3,DR
5およびDRw6を包含する群内のHLA−DRの多形性について
報告している。ベータ−I位置における多形性領域中に
見いだされるヌクレオチド配列は、糖尿病との関連性に
関して論じられていない。糖尿病からのHLA配列につい
ての最初の発表は、D.Owerbachら、Immunogenetics,24:
41−46(1986)によりものである。この論文はIDDM患者
からのHLA−DR−ベータ遺伝子のライブラリーについて
の研究に基づく。クラスIIの多形性および病気の感受性
の分析は、患者およびHLA合致対照に由来する多数の配
列の比較を必要とする。
クラスIIの抗原における対立遺伝子の多様性は、タン
パク質の第2エクソンによりコードされる外側ドメイン
に限定される。HLAクラスII遺伝子の多形性を検出する
血清学的方法は、DNA法により検出可能な多様性の多く
を検出することができない。
対立遺伝子の差異は、配列特異的合成オリゴヌクレオ
チドプローブを使用することによって、制限部位多形性
とは独立に検出することができる。Connerら、PNAS(US
A),80:278−(1983)。この技術はサザンブロッティ
ングを使用するHLA DR−ベータの多形性を研究するため
に適用されてきている。Angeliniら、PNAS(USA),83:
4489−4493(1986)。
配列特異的オリゴヌクレオチドのプローグを使用する
技術の更なる改良は、上の欧州特許(EP)237,362号に
記載されているように、プライマー、4種類のヌクレオ
チドトリホスフェート、および適当な酵素、例えばDNA
ポリメラーゼを使用して、分析すべき核酸試料を増幅
し、次いでドットブロットのフォーマットにおいてプロ
ーブを使用して配列中のヌクレオチドの差異を検出する
ことを包含する。。熱安定性酵素を増幅方法において1
回だけ添加する温度サイクリング方法は、欧州特許発行
第258,017号に記載されていおり、これは、また、この
増幅方法において使用することができる、熱安定性酵
素、精製したまたは組み換え体を開示している。
自己免疫病IDDMおよびPVに対する感受性についてのよ
り情報に富みかつより精密に定義されたマーカーをえる
ために、血清学的マーカーのHLA DR3,DR4およびDRw6の
再分類が、この分野において要求される。さらに、DR3,
DR4またはDRw6のいずれでもないハプロタイプを与える
感受性を同定することが、この分野において、要求され
る。
従来、DR4ハプロタイプのIDDM関連DQ−ベータ変異
型、DQw3.1およびDQw3.2の間の区別は、RFLPによるか、
あるいは抗体の使用によりなされてきた。本発明は、1
つの面において、このようなDQ−ベータ変異型を同定す
る方法に関する。
したがって、本発明は、インスリン依存性真性糖尿病
(IDDM)に関連しかつ尋常性天疱瘡(Pemphigus vulga
ris)(PV)に対するDR4関連感受性に関連するHLAクラ
スIIベータ遺伝子からのマーカーDR−ベータ−I DNA配
列を提供する。
詳しくは、1つの面において、本発明は、GACATCCTGG
AAGAGGAGCGG、またはそれに対して相補性のDNA鎖であ
る、IDDMに関連しかつ尋常性天疱瘡に対するDR4関連感
受性に関連するHLAクラスIIベータ遺伝子からのマーカ
ーDR−ベータ−I DNA配列を提供する。さらに、本発明
は、前記DNA配列によりコードされるアミノ酸配列Asp I
le Leu Glu Asp Glu Argを提供する。
本発明は、また、GGAGCAGAAGCGGGCCGCG、またはそれ
に対して相補性のDNA鎖である、IDDMに対するDR4,Dw4関
連感受性に関連するマーカーDR−ベータ−I DNA配列を
提供する。さらに、本発明は、IDDMおよび前記アミノ酸
配列に対する抗体に対するDR4,Dw4関連感受性に関連す
るマーカーDR−ベータI DNA配列によりコードされるア
ミノ酸配列に関する。
本発明は、尋常性天疱瘡に対するDRw6関連感受性に関
連するHLAクラスIIベータ遺伝子からのマーカーDQ−ベ
ータDNA配列を提供する。詳しくは、このようなDQ−ベ
ータのDNA配列は、およそコドン20〜約コドン80のユニ
ークDQB1.3対立遺伝子の第2エクソンからの1または2
以上の配列を含んでなる。さらに、本発明は、このよう
なDQB1.3 DNA配列によりコードされるアミノ酸配列およ
び該アミノ酸配列に対する抗体に関する。
他の面において、本発明は、DQ−ベータタンパク質の
配列の位置57におけるコドンの同一性を直接または間接
に検出するために使用することができる、インスリン依
存性真性糖尿病に対する感受性に関連するHLA DQ−ベー
タ対立遺伝子からのマーカーDNA配列、および前記位置5
7におけるコドンがアラニン、バリン、およびアスパラ
ギン酸のためのコドンから成る群より選択されるマーカ
ーDNA配列に関する。前記DNA配列は、好ましくは、 またはそれに対して相補性のDNA鎖から成る群より選択
される。
本発明は、さらに、DR4ハプロタイプの1.5kb(DQ−ベ
ータ−3.2)変異型および1.8kb(DQ−ベータ−3.1)変
異型のDQ−ベータの再分類に対して特異的なオリゴヌク
レオチドプローブに関する。詳しくは、1.5kb(DQ−ベ
ータ−3.2)変異型に対して特異的なこのようなオリゴ
ヌクレオチドのプローブは、GH74と表示し、19マーであ
り、そして配列:CCGCTGGGGCCGCCTGCCGを有する。
GH92と表示し、1.8kb(DQ−ベータ−3.1)RFLPに対し
て特異的なオリゴヌクレオチドのプローブもまた、19マ
ーであり、そしてCGTGGAGGTGTACCGGGCGを有する。適当
なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に、これら
のオリゴヌクレオチドは、例えば、キナーゼ処理により
32Pで標識するか、あるいは非放射性同位元素のリポー
ター、例えば、ビオチンまたは酵素セイヨウワサビペル
オキシダーゼで標識して、DQ−ベータ−3.2およびDQ−
ベータ−3.1変異型を特異的に同定する。本発明は、さ
らに、このようなプローブの診断的使用に関する。
さらに、本発明は、第2DNAを間接的に検出するための
ものであり、前記第2DNA配列が位置57におけるコドンを
含んでなり、前記コドン57はアラニン、バリン、および
アスパラギン酸のためのコドンから成る群より選択され
る、マーカーDNA配列を提供する。第2DNAを間接に検出
するために使用する前記マーカーDNA配列は、好ましく
は、 またはそれに対して相補性のDNA鎖から成る群より選択
される。
さらに、本発明は、DQ−ベータ遺伝子座におけるコド
ン57の同一性を間接的に同定するために使用することが
できる、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ
(ASO)を提供し、ここでこのようなプローブは、好ま
しくは、 (1)ヌクレオチド配列:CGGCAGGCAGCCCCAGCAGを有す
る、DR3ハプロタイプのDQ−ベータ−B領域からのGH61
と表示する19マー、 (2)ヌクレオチド配列:TGTTTGCCTGTTCTCAGACを有す
る、DR3ハプロタイプのDQ−ベータ−B領域からのGH66
と表示される19マー、および (3)ヌクレオチド配列:GATGCTTCTGCTCACAAGACGを有す
る、DR3ハプロタイプのDQ−ベータ−B領域からのGH70
と表示される21マー、 から成る群より選択される。
本発明は、また、工程: (a)試料を処理してその中のDNAをハイブリダイゼー
ションに暴露し、 (b)前記処理した試料を膜に固定し、 (c)前記膜を、ハイブリダイゼーション条件下で、標
識された配列特異的オリゴヌクレオチドのプローブで処
理し、前記プローブは、 から成る群より選択されるDNA配列の1または2以上
と、あるいはそれに対して相補性のDNA鎖とハイブリダ
イゼーションすることができるものであり、そして (d)前記プローブが試料中のいずれかのDNAとハイブ
リダイゼーションしたかどうかを検出する、 ことを含んでなる、DNA試料中のインスリン依存性真性
糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在または不存
在を検出する方法に関する。
本発明は、また、DQ−ベータタンパク質の位置57に相
当するアミノ酸残基を含んでなるエピトープを含有する
ペプチドに結合する抗体であって、前記抗体はヒト永続
性ウイルス病原体によりコードされる相同性ペプチド配
列との交差反応性を有し、そして前記アミノ酸残基はア
ラニンおよびバリンから成る群より選択される、抗体に
関する。前記抗体は、好ましくは から成る群より選択されるペプチドに結合する。さら
に、ウイルスの病原体は、好ましくは、エプスタインバ
ー(Epstein−Barr)ウイルス、風疹ウイルス、コクサ
ッキーウイルス、サイトメガロウイルス、およびレオウ
イルスから成る群より選択される。
なおさらに、本発明は工程: (a)試料を抗体の1または2以上の存在下にインキュ
ベーションし、前記抗体は、 から成る群より選択されるペプチドに結合し、前記抗体
は検出可能な部分で標識されており、そして (b)前記部分を検出する、 ことを含んでなる、タンパク質試料中のインスリン依存
性真性糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在また
は不存在を検出する方法に関する。IDDM関連配列を検出
する前記方法は、標識した抗体とのインキュベーション
の前、間、または後に、前記試料をモノクローナル抗体
の存在下にインキュベーションし、ここで前記モノクロ
ーナル抗体は固体の支持体に固定化されておりそして から成る群より選択される1又は複数のアミノ酸配列に
結合する、方法を包含する。
本発明は、さらに、工程: (a)血清試料をGly Pro Ala Ala、Gly Leu Pro Ala A
la、およびGly Arg Pro Val Alaから成る群より選択さ
れるペプチドの1または2以上の存在下にインキュベー
ションし、 (b)前記ペプチドと前記血清試料中に存在する抗体と
の間で形成された免疫複合体の存在を検出し、そして (c)工程(b)の結果から、感受性のハプロタイプが
存在するかどうかを決定する、 ことからなる、血清試料中のインスリン依存性真性糖尿
病に対する感受性に関連するハプロタイプを同定する方
法に関する。前記方法において使用するペプチドは、検
出可能な成分で標識し、そして検出は酵素反応、蛍光性
または発光の放射により行うことができる。
本発明は、さらに、前述の抗体およびペプチドの予防
的または治療的使用に関する。
他の面において、本発明は、DNA試料中のインスリン
依存性真性糖尿病または尋常性天疱瘡に対する感受性に
関連する配列の存在または不存在を検出するキットを提
供し、前記キットは、包装された形態で、上に特定した
DNA配列の1または2以上と、またはそれに対する相補
性のDNA鎖とハイブリダイゼーションすることができ
る、各標識した配列特異的DNAプローブにつき1つの容
器を有する複数の容器からなる。
最後の面において、本発明は、タンパク質試料中のイ
ンスリン依存性真性糖尿病または尋常性天疱瘡に対する
感受性に関連するアミノ酸配列の存在または不存在を検
出するキットを提供し、前記キットは、包装された形態
で、上に同定したアミノ酸配列の1または2以上と結合
する検出可能な成分で標識した各抗体につき1つの容器
を有する複数の容器からなる。
前述のように、IDDMに対する遺伝学的感受性は、族お
よび集団の研究において、血清学的マーカーのHLA DR3
およびDR4の存在と相関関係づけられている。IDDMの最
高の危険は、HLA DR3,4ヘテロ接合体に関連し、これら
の2つのDR型に関連する感受性対立遺伝子は異なること
ができ、そしてIDDMに対する高い危険のために2つの投
与が要求されうることが示唆される。従来の制限断片長
多形性の分析は、DR3およびDR4を各2つのサブセットに
再分類した。
同様に、前述のように、PVに対する遺伝学的感受性
は、血清学的マーカーであるHLA DR3およびDR4の存在と
相関関係づけられた。従来の制限断片長多形性の分析
は、DR3およびDR4ハプロタイプに再分類した。
ここにおけるHLA遺伝子の分子分析は、HLA DR3、DR4
およびDRw6血清学的型をさらに再分類し、そして新規
な、より情報に富む、かつより正確に定義されたIDDMお
よびPVに対する感受性のマーカーの生成をもたらした。
ここにおける分子技術が示すところによれば、クラスII
の遺伝子座の数が予想外に多いばかりでなく、これらの
遺伝子座における対立遺伝子変化が血清学的型分けによ
り定義される多形性系列より大でありそしてより正確に
位置付けすることができる。
第1図は、実施例IIIに従い増幅されたDR−ベータ断
片PCR(ポリメラーゼ鎖反応)の配列を示す。PCRプライ
マーの配列は長い矢印により示されており、この矢印
は、また、ポリメラーゼによる伸長の方向をも示す。破
線は、クローニングのための制限部位の発生のために使
用されたBamH IおよびPst Iの認識配列を示す。第2エ
クソン配列の開始は短い矢印により示されており、そし
てDW10配列特異的オリゴヌクレオチドGH78に相当する断
片の領域は括弧セグメントにより示されている。BamH I
およびPst Iによる消化は、クローニングのための248bp
の断片を生成した。ここに示す配列は、DR4 10ハプロタ
イプからのプロトタイプのDRB1対立遺伝子を表す。
第2図は、標準的1文字アミノ酸コード(参照、下表
VIII)を使用する3つの尋常性天疱瘡(PV)(参照、実
施例III)からおよびDR−ベータプロトタイプ〔Gregers
enら、PNAS(USA),83:2642−2646(1986)〕からのHL
A DR−ベータ第2エクソンについてのアミノ酸配列を示
す。DR4 Dw4ハプロタイプからのDR−ベータ−I対立遺
伝子の全体のアミノ酸配列が示されており、これに対し
て他の配列はそれと整列されており、ダッシュで相同性
を示し、そして文字で多形性アミノ酸を示す。DR型(お
よび適当ならばDw型)およびDR−ベータの割り当てを各
配列の右端に示す。「I」はDR−ベータ−I遺伝子を意
味し、「III」はDRw52特異性をコードするDR−ベータ−
III遺伝子座を意味し、そして「IV」はDRw53の特異性を
コードするDR−ベータ−IVを意味する。PCRクローニン
グにより得られる断片は、cDNAクローンから誘導される
プロトタイプの配列より小さい。
第3図は、第2図のコンベンション(convention)に
従い3人のPV患者のHLA DR−ベータ第2エクソンからの
アミノ酸配列を示し、ここで配列は、cDNAクローンから
のDR4 DQ−ベータ−3.1およびDQ−ベータ−3.2のプロト
タイプ配列と整列されている。Michelsenら、J.Clin.In
v.79:1144−1152(1987);Gregersen et al.supra。各
配列の右において、DR型およびDQ−ベータ型が存在す
る。PCRクローニングにより得られるDQ−ベータ配列
は、プロトタイプ配列より短い。
第4図は、HLA−DQ−ベータタンパク質の整列を示
す。DQ−ベータの対立遺伝子を標準的1文字アミノ酸コ
ード(下表VIII)に翻訳し、そして相同性のパターンを
示すために整列してある。ダッシュはプロトタイプのDQ
−ベータ(DR4)対立遺伝子中の同等のアミノ酸との相
同性を示す。ブランクは配列が決定されなかったことを
示す。PCR増幅のプライマーの位置を下部に示す。PCRの
増幅手順は、オリゴヌクレオチドプライマー間の配列を
決定するだけである〔Schrfら、Science,233:1076−107
8(1986)〕。各配列の由来は各線の左に表示し、そし
てそのDR血清学的型は右に示す。DR型の後の星印は、ID
DMをもつ患者からの対立遺伝子が決定されたことを示
す。PV患者からのHu129配列が決定された。一番右に対
立遺伝子の表示が存在し、可能であればハプロタイプの
DQW型決定に相当する。DCB4配列はLarhammarら、PNAS
(USA),80:7313−7317(1983)からののものであり;C
MCCおよびMMCCはHornら、1988、PNAS(USA)85:6012−6
016からのものであり;DQB37はMichelsenら、J.Clin.In
v.79:1144−1152(1987)からのものであり;KT3はGrege
rsenら、PNAS(USA),83:2642−2646(1986)からのも
のであり:WT49はBossら、PNAS(USA),81:5199−5203
(1984)からのものであり;BURKはKarrら、J.Immunol.8
2:3405−3409(1985)からのものであり;DQBS4およびDQ
BS5はTsukamotoら、Immunogenetics,25:343−346(198
7)からのものであり;AZH、BGE、およびPGFはLeeら、Im
munogenetics,26:85−91(1987)からのものであり;そ
して関係するDX−ベータ配列はOkadaら、PNAS(USA),
82:3410−3414(1985)からのものであった。PGFについ
て示したPCR配列は、発表されているcDNAと一致した。
2人のIDDM患者について報告されているDQBの対立遺伝
子、DCおよびJRは、34人のDR4患者において観測された
唯一のDQB3.1対立遺伝子であった。
第5図は、HLA−DR−ベータタンパク質の配列の整列
を示す。DR−ベータの対立遺伝子のDNA配列を標準的1
文字アミノ酸コード(後記の表VIII)に翻訳し、そして
相同性のパターンを示すために整列させてある。使用し
たコンベンションは上の第4図についての記載において
説明したのと同一である。さらに、下記の実施例Iを参
照のこと。
ここに報告される対立遺伝子の多様な配列を普通のHL
Aの分類と比較し、そして現在のDQw血清学的特異性と配
列パターンとの間の対応に基づく新しい命名方を使用す
る。詳しくは、DNAで定義されたDQB1、DQB2およびDQB3
は、それぞれ、血清学的に定義したDQw1、DQw2およびDQ
w3に由来する配列を表示するが、DQB4はDQ(ブランク)
ハプロタイプに由来するものを表示し、これは明らかに
均質である。このような命名において、遺伝子座および
タンパク質産生物(例えば、DQ−ベータ鎖をコードする
DQ−ベータ遺伝子座)についてギリシャ文字のコンベン
ションを使用し、そして特異的対立遺伝子配列変異型を
表示するためにローマ字の大文字および引き続く数字
(例えば、DQB2対立遺伝子)を使用する。このような型
を再分類する配列の変異型は、サイブタイプの数字によ
り表示する(例えば、DQB1.2およびDQB1.3)。
しかしながら、DQアルファ対立遺伝子変異型の表示
は、DQwの特異性に常に相当するおはかぎらない;例え
ば、DQA4型はDQw2およびDQw3ハプロタイプの両者に関連
する。なぜなら、DQw2およびDQw3の特異性は、アルファ
−鎖上の対立遺伝子の相違に対して独立に、ベータ鎖上
の多形性エピトープにより決定されるように思われるか
らである。
自己免疫病に「積極的に関連する」とは、ここで使用
するとき、マーカーの頻度が対照(病気をもたない個
体)に比べて病気をもつ患者において増加することを意
味する用語である。逆の意味は、自己免疫病に「消極的
に関連する」に適用され、これはマーカーの頻度が対照
に比べて患者において減少することを意味する。
用語「オリゴヌクレオチド」は、ここで使用すると
き、2またはそれ以上の、好ましくは3より多いデオキ
シヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成された
分子として定義される。その正確な大きさは多数の因子
に依存し、そしてこれらの因子は究極の機能またはオリ
ゴヌクレオチドの用途に依存する。オリゴヌクレオチド
は合成的にあるいはクローニングに由来することができ
る。
用語「配列特異的オリゴヌクレオチド」(SSO)は、
対立遺伝子の多様性が起こることができる遺伝子座の領
域である、同定される特異的DNA配列の1つにハイブリ
ダイゼーションするであろうオリゴヌクレオチドを意味
する。このようなオリゴヌクレオチドは、検出されるDN
A領域の1または2以上にまたがる配列を有し、そして
検出される領域の1または2以上に対して特異的であ
る。後述するように、1つの配列特異的オリゴヌクレオ
チドが検出すべき各配列について使用される。
用語「モノクローナル抗体」は、ここで使用すると
き、単一の抗体産生細胞からの有系分裂を経て誘導され
るクローン集団(またはクローン)により産生される免
疫グロブリン組成物を呼ぶ。特記しない限り、この用語
は特定の哺乳動物の種またはアイソタイプの抗体に、あ
るいは所定の方法で調製される抗体に限定されることを
意図しない。この用語は全抗体分子ならびに抗原結合断
片(Fab,F(ab′)2,Fc,Fc′)を包含する。
「抗体産生細胞系」は、多数の世代にわたって生体外
で安定に増殖することができる、単一の抗体産生細胞か
らの有系分裂を経て誘導されるクローン集団またはクロ
ーンである。用語「細胞系」は、ここに呼ぶ細胞系の細
胞から誘導される限り、個々の細胞、収得された細胞、
および細胞を含有する培養物をも意味する。好ましく
は、細胞系は少なくとも約6月間生存能力を維持し、そ
して少なくとも約50の継代培養を通して特定のモノクロ
ーナル抗体を産生する能力を維持する。
ここで使用するとき、用語「インキュベーション」
は、免疫複合体とも称される抗原/抗体複合体の形成を
可能とする条件(例えば、適切なpH、温度、時間、培地
など)下に、抗体および抗原を接触することを意味す
る。また、ここで使用するとき、「分離」は、組成物を
試験支持体または固定化した抗体から分離し、こうして
組成物中の非結合の抗原または抗体を除去しそして支持
体上の免疫複合体を無傷に維持する方法であって、通常
洗浄を呼ぶ。適当なインキュベーションおよび分離技術
の選択は、この分野においてよく知られている。
HLAクラスIIベータ遺伝子はHLA型のIDDM患者およびHL
A合致対照から分離され、そして配列決定されたもので
あり、そして種々の組み合わせで存在しかつIDDMに関連
する特異的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の領域をも
たらした。これらの特異的配列をDNAまたはタンパク質
の診断法において使用して、IDDMに対する遺伝学的感受
性を決定することができる。
IDDMに関連することが発見された4つのDR−ベータ配
列A−Dを下に示す。各場合において、糖尿病のゲノム
中に見られるDNA配列は、DR−ベータタンパク質の1〜
3アミノ酸残基(下線)の変更を生成する。これらのタ
ンパク質中に通常見いだされるアミノ酸は括弧で示す。
配列A−CはDR−ベータ−IIIからのものであり、これ
に対して配列DはDR−ベータ−I領域からのものであ
る。配列Dは下に説明する「I−D」E(位置68,71お
よび72におけるイソロイシン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸)を包含する。
下表Iは、DR3およびDR4ハプロタイプ内のIDDMの感受
性およびDR−ベータの多様性を示す。表IIは、上に同定
したハプロタイプおよび配列A−Dの間の相関関係を示
す。配列A,BおよびCは、B8、DR3対非B8、DR3ハプロタ
イプと相関関係する。
前述の欧州特許発行第237,362号は、ドットブロット
のフォーマットにおいてPCR増幅したDNAにハイブリダイ
ゼーションする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
(ASO)を使用することによって、対立遺伝子配列の変
動を分析する一般的方法を開示している。この刊行物
は、種々のHLA型の個体、IDDM患者または対照、からの
いくつかのHLAクラスII(例えば、DR−ベータ、DQ−ア
ルファ、およびDQ−ベータ)遺伝子のPCRクローニング
から誘導された、ある特異的DNAおよびタンパク質翻訳
の配列を列挙する。PCRにより同定されかつPCR/ドット
ブロット/ASO分析により検出可能な、このようなDNA配
列は、病気の感受性または弁別診断のために有用なマー
カーとして機能することができる。DNAおよび翻訳配列
の1つのこのような情報を与える組は、下表IIIおよびI
Vに示すDQ−ベータ配列であり、これらの表は、それぞ
れ、HLA−DQ−ベータ領域における多数の対立遺伝子変
異型についてのDNAおよびアミノ酸翻訳配列を列挙す
る。その中の表示DR4、DR4′またはDR4″は、それぞれ
用語DQB3.2、DQB3.1およびDQB4(ブランク)と同等であ
る。
詳しくは、表IIIおよびIVにおいてDR4(DQB3.2)およ
びDR4′(DQB3.1)として列挙されている、血清学的に
定義されたDR4ハプロタイプの2つの変異型についての
配列はとくに情報に富む。DR4ハプロタイプのこのDQ−
ベータ再分類はDQ−ベータのRsa I RFLPと相関関係をも
ち、ここで1つのDR4変異型は1.8kbのRsa I断片を有
し、そして他のものは1.5kbのRsa I断片を有した(Arnh
eimら、前掲)。下表Aに示すように、DR4の個体のうち
で、1.5kb(DR4)はIDDMに積極的に関連し、これに対し
て1.8kbの断片(DR4′)はIDDMに消極的に関連すること
が発見された。
DR4(DQB3.2)およびDR4′(DQB3.1)配列は、3つの
異なるアミノ酸の変化生ずる5つのヌクレオチドの置換
により異なる。変化の2つ(コドン45におけるGly対Glu
およびコドン57におけるAla対Asp)は、非保存性であ
り、そして主要な電荷の差を有する。アスパラギン酸に
対してコドン57においてバリンまたはアラニンの存在
は、IDDMに対する感受性に積極的に関連すると考えられ
る。
DQB3.1およびDQB3.2と表示する、DR4ハプロタイプに
おいて見られるDQ−ベータの対立遺伝子間の最も異なる
差の1つは、位置57において見いだされる。(ここで使
用する番号はプロセシグされたタンパク質中のアミノ酸
に相当する。)IDDMの感受性に関連しないDQB3.1のハプ
ロタイプにおける対立遺伝子は位置57においてアスパラ
ギン酸残基を有し、これに対してIDDMの感受性に強くに
関連するDQB3.2のハプロタイプにおける対立遺伝子は位
置57においてアラニン残基を有する。さらに、IDDMに積
極的に関連するDR3ハプロタイプは位置57にアラニンを
有する。IDDMに消極的に関連するDR2ハプロタイプは、
また、位置57にアスパラギン酸残基を有する。
また、DRw6における2つのDQ−ベータの対立遺伝子の
2つのうちで、IDDMに積極的に関連する対立遺伝子は位
置57にバリンを有し、これに対してIDDMに消極的に関連
する対立遺伝子は位置57にやはりアスパラギン酸を有す
ることが発見された。なおさらに、IDDMに中程度に関連
するDR1ハプロタイプはDQ−ベータ遺伝子座において位
置57にバリンを有することが発見された。
このような観察に基づいて、位置57におけるアミノ酸
の変動のパターンはIDDMに対する感受性のパターンと平
行することが決定された。位置57にアラニン(疎水性残
基)を含有する対立遺伝子はIDDMと最も高度に関連し、
位置57にバリン(疎水性残基)を含有する対立遺伝子は
IDDMと中程度に関連し、そして位置57にアスパラギン酸
(帯電した残基)を含有するアレルはIDDMに消極的に関
連する。
このパターンに対する主要な例外はDR7ハプロタイプ
のDQB2対立遺伝子であり、これはDR3ハプロタイプと同
様に位置57にアラニンを有し、IDDMの感受性に関連しな
い。
このようなパターンは他の遺伝子にまた拡張する。例
えば、DR3ハプロタイプ内のDR−ベータ−III遺伝子の対
立遺伝子は、増加したIDDMの感受性と相関関係をもち、
位置57にバリンを有するが、これに対して他のDR−ベー
タ対立遺伝子の大部分は位置57にアスパラギン酸を有す
る。こうして、DR−ベータ−III対立遺伝子の位置57に
おける疎水性バリンならびにDQ−ベータ対立遺伝子中の
疎水性アラニンは、IDDMの感受性に関連する。
下表Vは多数の遺伝子中の位置57付近に見いだされる
配列を要約する。表Vの星印は最大のIDDM感受性に関連
するハプロタイプを示す。
表Vが示すように、DQ−ベータ対立遺伝子によりコー
ドされるアミノ酸配列はIDDMの感受性に関連する。これ
らの配列およびそれらをコードするヌクレオチド配列は
下表VIに列挙する。また、その中に、ヌクレオチドおよ
び位置57付近のアミノ酸の翻訳配列が列挙されており、
IDDMの感受性に消極的に関連する対立遺伝子を示す。コ
ドン57はその中に下線を施されている。
表VI中の配列は、アラニン、バリンまたはアスパラギ
ン酸をコードする位置57におけるコドンの同一性を直接
検出するために使用することができる、HLA DQ−ベータ
対立遺伝子からのマーカーDNA配列であると考えられ
る。
DQ−ベータタンパク質中の位置57付近の配列はIDDMの
感受性に最も積極的に関連するが、それに対して直接ハ
イブリダイゼーションするマーカー配列がオリゴヌクレ
オチドのプローブ中の包含されることは最適でないこと
がある。DQ−ベータ対立遺伝子は他の領域で異なり、そ
して他の遺伝子座例えば、DQアルファアレル、に密接に
関連するので、DQ−ベータアレル対立遺伝子の位置57の
アミノ酸の同一性は、DQ−ベータ、DQアルファまたは他
のHLA D領域の他の領域にハイブリダイゼーションする
1または2以上のオリゴヌクレオチドのプローブを使用
する間接のASO分析により決定することができる。さら
に、このような同定は1または2以上のプローブを使用
することによって達成することができ、ここで1つのプ
ローブは位置57付近の領域にハイブリダイゼーション
し、これに対して1または2以上の他のプローブはそれ
と不平衡の結合で他のHLA領域にハイブリダイゼーショ
ンする。
例えば、DR3ハプロタイプはIDDMの感受性に強く関連
し、そしてDQ−ベータにおける位置57のアラニンを含有
する。この領域はASOプローブ、例えばGH74で直接検出
することがきるが、DQ−ベータのそのセグメントのG/C
に富んだ性質は、それに関連する塩基の不一致の可能性
のために、最適ではないプローブに導く。しかしなが
ら、GH70 ASOプローブは、G/Cに富んでない領域におけ
るコドン57から約90bp上流の領域に対して特異的であ
り、こうして位置57のセグメントについての直接のプロ
ーブの塩基の不一致の問題を回避する。こうして、GH70
ASOプローブの結合は、コドン57がアラニンをコードす
るDQ−ベータ対立遺伝子を間接的に同定する。
DQ−ベータのコドン57の位置からなおさらに離れたプ
ローブも、使用することができる。例えば、GH66 ASOプ
ローブは、DQ−ベータから約12kbp離れて位置する、DQ
アルファ位置のDR3対立遺伝子に対して特異的である。
しかしながら、DQアルファ位置のDR3対立遺伝子はDQ−
ベータ位置のDR3対立遺伝子と絶えず結合することが示
されるので、GH66プローブの結合はDQアルファDR3対立
遺伝子ばかりでなく、かつまたDQ−ベータDR3対立遺伝
子をも同定する。DQアルファ位置の使用は、また、IDDM
感受性DR3ハプロタイプと感受性が低いDR7ハプロタイプ
との間の識別を提供する。
他の自己免疫病に対する感受性もまた、コドン57の多
形性に関係づけることができる。尋常性天疱瘡に対する
DRw6の感受性は希なDQ−ベータ対立遺伝子(DQB1.3)に
関連し、後者は位置57の電荷の差異によってのみ非感受
性対立遺伝子DQB1.2およびDQB1.1と異なり、そしてDw9
およびDRw6のサイブタイプと相関関係を持つ。同様に、
腹腔の病気の患者においてのみこれまでこうして見いだ
されたDP−ベータ対立遺伝子は、ホモ接合性型決定細胞
(HTC)において見いだされる対立遺伝子と、位置57に
おいてAla−Aspの置換により異なる。腹腔の病気は、グ
ルテンを含有する食物の消化が関与する、子供および大
人の両者に影響を与える吸収不良症候群により特徴付け
られる消化疾患であり、その病因は知られていないが、
遺伝因子が関係づけられている。
実施例IIIにおいて、3人のPV患者からのDR−ベータ
I、DQ−ベータIIおよびDQ−ベータ遺伝子座の多形性第
2エクソンを配列決定して、特異的多形性クラスIIのエ
ピトープとの可能な病気の関連性を認識することを記載
する。DQ−ベータ遺伝子座において、4つのDR4ハプロ
タイプの3つは対照DR4ハプロタイプの60〜80%に存在
するDQB3を含有し、そしてfoハプロタイプの1つは対照
DR4ハプロタイプの約20〜40%に存在するDQB3.1対立遺
伝子を含有ていた。Erlichら、組織適合性の抗原の分子
の分析(The Molecular Analysis of Histocompability
Analysis),pp.93−109(Schacter et al.編、1987);
Arnheimら、PNAS(USA)、(1985)82:6970−6974;Kim
ら、PNAS(USA)、(1985)82:8139−8143。2つのDR5
ハプロタイプは、また、すべての対照DR5ハプロタイプ
上に存在するDQB3.1アレルの配列変異型を含有した。こ
うして、DQ−ベータ対立遺伝子の分布は患者およびDR一
致対照において本質的に同一であった。この小さい試料
において、すべての3人の患者はDQB3.1/DQB3.2ヘテロ
接合体であった。
しかしながら、DR−ベータ−I遺伝子座において、潜
在的に興味あるパターンを認識することができた。3人
のすべてのPV患者はMLC定義されたサイブタイプ、DW1
0、に関連するDR−ベータ−I対立遺伝子配列の変異型
をもつDR4ハプロタイプを含有した。米国の人口におい
て、DR4ハプロタイプの中のDW10サイブタイプの頻度は
ほぼ10%であると推定される。Hansenら、Brit.Med.Bul
l.(1987)43:203−216。この観察は配列の分析よりむ
しろオリゴヌクレオチドのプローブを使用して確証さ
れ、DR4 PV患者の事実上100%はDW10エピトープを含有
した。このエピトープはMLCで定義される型、DW10、に
関連するので、それはT細胞受容体により認識するよう
に思われる。これらの結果が示唆するように、DR4関連
感受性について、DR4 DR−ベータ−I鎖の位置68、71、
および72におけるアミノ酸残基のイソロシン、アスパラ
ギン酸およびグルタミン酸はPV自己免疫においてある役
割を演ずる。このような残基はここにおいて「I−DE」
エピトープとして同定されるエピトープを定義する。実
施例IIIを参照のこと。
実施例IVに示すように、コドン70付近の同一「I−D
E」エピトープはまた、DRw6ハプロタイプのサブセット
上にも存在するが、このエピトープはこのようなDRw6ハ
プロタイプにおけるPVに積極的に関連することが示され
なかった。エピトープを共有する「I−DE」はDRw6の感
受性を説明することができなかったので、それ以上の研
究を実施して、実施例IIIに例示する方法による2つのD
R5/DRw6 PV患者のDQ−ベータ対立遺伝子の配列を決定す
ることによってDRw6ハプロタイプ内のPV感受性を与える
配列を発見した。両者の患者のDRw6ハプロタイプは従来
未知のDQ−ベータ対立遺伝子を含有することが発見さ
れ、後者の対立遺伝子はDQB1.3と称した(第9図のHU12
9配列を参照のこと)。DQB1.3対立遺伝子は、DR1 DQ−
ベータ対立遺伝子DQB1.1から、位置57におけるバリン対
アスパラギン酸の置換のみにより異なる。同様にそれ
は、DR2 DQ−ベータ対立遺伝子DQB1.2から、位置57にお
けるセリン対アスパラギン酸の置換のみにより異なる。
ヌクレオチドのレベルにおいて、DQB1.3対立遺伝子は位
置57付近の領域においてDR2 Dw12(DQB1.5)対立遺伝子
と同一であり、そして最も普通のDRw6 DQ−ベータ対立
遺伝子DQB1.6と同一である。
PV患者及び対照のDRw6ハプロタイプの間のDQB1.3対立
遺伝子の頻度を決定するために、配列特異的オリゴヌク
レオチド(SSO)プローブの対を使用して、DR1様DQ−ベ
ータフレームワーク配列及びコドン57付近の配列との両
者を同定した。例示されるSSOのプローブは次の通りで
ある: (1)GH69:DR1様DQ−ベータ骨組をフレームワーク同定
するものであり、そしてヌクレオチド配列GATGTGTCTGGT
CACACCCCGを有する21マー; (2)GH60:DRw6様フレームワークを同定するものであ
り、そしてヌクレオチド配列TCTTGTAACCAGACACATCを有
する19マー; (3)CRX03:コドン57がアミノ酸をコードしている、コ
ドン57付近の配列を同定するものであり、そしてヌクレ
オチド配列TCGGCGTCAGGCCGCCCTを有する19マー;および (4)CRX02:コドン57がバリンをコードしている、コド
ン57付近配列を同定するものであり、そしてヌクレオチ
ド配列TCGGCAACAGGCCGCCCCTを有する19マー。
上に表示したプローブを使用して、ハイブリダイゼー
ションパターンを用いて特異的対立遺伝子を同定しかつ
区別することができる。次のチャートはこのような方法
の使用を例示し、ここでプラスのサイン(+)は標的DN
A試料へのSSOプローブのハイブリダイゼーションを示
す。
このアプローチにおいて、13人のDRw6患者の内の11人
のハプロタイプ(85%)はDQB1.3対立遺伝子を含有した
が、これに対して13人の対照DRw6ハプロタイプの1つ
(8%)のみがDQB1.3対立遺伝子を含有していた。他の
2人のDRw6の患者は、DR1様フレームワーク(GH69によ
り同定された)を有したが、CRX03またはCRX02の両者の
プローブとハイブリダイゼーションできないDQ−ベータ
対立遺伝子を有することが明らかにされた。
これらの知見が示すように、DRw6関連PV感受性は、普
通のDQ−ベータ対立遺伝子DQB1.1と1つのみの残基によ
り異なる。希なDQ−ベータ対立遺伝子DQB1.3により付与
され得るようである。DRw6関連PV感受性に関連するDQ−
ベータ鎖の位置57における多形性のこのような単一の電
荷の差は、IDDMについてのDR4およびDR3関連感受性につ
いて発見されたものと相関関係をもつ。しかしながら、
PVの場合においては、感受性を与えるのは位置57付近の
エピトープよりむしろ対立遺伝子であることが明らかで
ある。なぜなら、PVに関連しない最も普通のd6DQ−ベー
タ対立遺伝子であるDQB1.6は位置57付近に同一の配列を
有するからである。DQB1.6対立遺伝子はその配列の他の
領域において異なる(第4図を参照のこと)ので、直ぐ
上に示したように、SOSプローブ、例えば、GH69,GH80,C
RX03、およびCRX02プローブ、の対の使用により希なDQB
1.3対立遺伝子からDQB1.6の普通の対立遺伝子を区別す
ることができる。
新規なDQ−ベータ対立遺伝子がPVに対するDRw6関連感
受性を説明するという結論は、Sfazerら、前掲(1987)
のDQ−ベータRFLP分析と一致する。
DQ−ベータの対立遺伝子の多様性のパターンは自己免
疫素因における位置57と明らかに関係するが、これの領
域は自己免疫病に寄与するハプロタイプを与える感受性
内の唯一のクラスIIエピトープであると思われない、ク
ラスII配列はIDDMにユニークに関連することは見出され
なかった。その観察が示唆するところによれば、「通常
の」クラスII対立遺伝子が感受性を与えるか、あるいは
感受性遺伝子がMHC中のどこかに存在する。IDDMについ
ての浸透度(penetrance)および一致(concordance)
の推定(モノ接合性の双子について50%、およびHLAの
同一の子孫について25%)が与えられているので、〔He
nsenら、Mol.Biol.Med.(1986)、:129−136〕、ある
影響を受けない個体が推定上のクラスIIの感受性遺伝子
を含有することは驚くべきことではない。
ある環境的「トリガー」剤例えばウイルスの感染は、
感受性の個体において病気が発生するために要求される
と思われる。DQ−ベータ対立遺伝子とIDDMの病原性にお
いて関係するウイルスである風疹との間の相同性は、ウ
イルスのトリガー機構を示唆する。
ウイルスはそれらの宿主の免疫防御を侵略する機構を
発させ(McChesneyら、前掲;Srinivasappaら、前掲)、
そしてこれらの機構のあるものは致死的なMHCエピトー
プの模倣(mimicry)を含むように思われる。相同性がH
LA−DQタンパク質およびヒトウイルス病原体の間に存在
する。実施例VIIを参照のこと。表VIは、そのゲノムに
ついて完全に配列決定されているエピスタイン−バール
ウイルス(EBV)に対しての観測された主要な相同性を
要約する。Baerら、Nature、310:207−211。
完全EBVゲノム及びDQB1.4(DR2)対立遺伝子中の位置
57に集中する潜在的エピトープペプチドの間に、1つの
みの相同性が見られた。しかしながら、6つの合致がDR
B2(DR3)対立遺伝子からのペプチドに見られ、そして2
1つがDQB3.2(DR4)対立遺伝子からのGPPAAペプチドに
見られた。後の相同性の多くは、直接6回反復する5ア
ミノ酸の1つのセグメントを包含するEBVゲノムの反復
セグメントにおいて見いだされた。さらに、風疹のE1エ
ンベロープタンパク質〔Nakhasiら、J.Biol.Chem.,(19
86)、261:16616−16621)、IDDM病原性に関係するウイ
ルス(Rubensteinら、Dibetes,(1982)、31:1088−109
1〕は、位置261にGPPAAペプチドを含有する。風疹ウイ
ルスに胎児を暴露すると、先天的感染、および糖尿病に
対する高い危険を導く。ウイルスの病原体(例えば、EB
Vおよび風疹)とDQ−ベータペプチドGly Pro Pro Ala G
luとの間の相同性に基づいて、このような領域はまた、
分子の類似性のための標的として働き(Oldstoneら、前
掲)、感染ウイルスへの免疫応答は自己の細胞への攻撃
を導く可能性がある。
さらに、EBVおよび風疹以外のウイルス、例えば、コ
クサッキーウイルスおよびサイトメガロウイルス(CM
V)(Yoonら、supra)がIDDMと関係づけられた。
これらのウイルスはHLAクラスII遺伝子を模倣してい
るように思われ、そしてとくにコドン57付近のHLA DQ−
ベータ−遺伝子は、有効な免疫応答の開始を遅延または
変更する。免疫系が実際に、模倣されたHLAエピトープ
に対して応答する場合、免疫系の正常の調節は混乱さ
れ、自己免疫病を導くことがある。
自己免疫病は1系列の因子から生じうる:1)ウイルス
により模倣されるHLA対立遺伝子の遺伝、2)宿主HLAク
ラスII対立遺伝子を模倣するウイルスによる感染、3)
模倣されたエピトープに対する宿主による免疫応答、
4)自己免疫応答の免疫調節の混乱、5)自己免疫の応
答の発達、および6)自己免疫病に導く進行性の組織破
壊。
この機構の1例はIDDMへの増加した危険との相関関係
をもつDQB3.2対立遺伝子を遺伝的に受けつぎ次いで風疹
ウイルスにより感染される人をまきこむものであり、前
記風疹ウイルスはIDDMとも相関関係をもち、そしてDQB
3.2タンパク質の一部分を特異的に模倣するそのE1エン
ベロープタンパク質中にエピトープを含有する。ウイル
スによる感染の後、この人はE1タンパク質に対して向け
られたそしてDQB3.2タンパク質と交差反応性である抗体
またはT細胞を包含する免疫応答を誘発する。この抗体
またはT細胞の応答はHLA DQタンパク質の正常の機能を
妨害し、自己免疫応答およびIDDMを導く。最後の自己免
疫の標的は、ウイルスの感染の位置、この場合において
ランゲルハンス小島のベータ細胞、により決定されるで
あろう。危険の程度の増加は確証することができるであ
ろう。なぜなら、個体はDQB3.2対立遺伝子を有すること
が示され、次いで風疹ウイルスによる感染され、次いで
HLA DQ−ベータタンパク質と交差反応性の抗風疹抗体が
出現するからである。
自己免疫感受性に関連する対立遺伝子をもつ個体が自
己免疫病に対する感受性に相応して関連するウイルスに
より感染されたかどうかを決定する診断試験(HLAクラ
スII対立遺伝子のセグメントに対する相同性を有するウ
イルスに基づく)は、このような個体のための有効な予
防または治療の処置のプランの決定に使用することがで
きるであろう。次いで、例えば、ワクチン、免疫毒素、
免疫抗原、模倣された領域のエピトープに対応するペプ
チド、または抗イディオタイプ抗体を使用して、病原性
生物により提供されるエピトープに対する免疫応答を防
止または逆転することができるであろう。
このような診断試験の1例は、Schwinnbeckら、J.Ex
p.Med.,166:173−181(1987)において報告されている
ように、免疫応答(例えば、抗体または反応性免疫細胞
の産生)を検出することであり、この方法においてはク
ラスI HLA分子B27の一部分に対する抗体が合成ペプチド
を固体の支持体に取り付け、それを試験血清の希釈物で
処理し、そして抗体が保持されているかどうかを試験す
ることによって検出される。このような診断試験の他の
例は、Kwokら、J.Virol.,61:1690−1694(1987)におい
てHIV(AIDS)ウイルスを使用して実施されたように、
ウイルスのDNAゲノムについて直接プロービングする
か、あるいはCMV抗体についての凝集試験におけるよう
に、感染から生ずる抗体について間接アッセイすること
によることができる。
DR4、DRW10 DR−ベータ−I対立遺伝子はPVおよびIDD
Mの両者に対する感受性に関連する。その対立遺伝子
は、DR−ベータ−I鎖の位置68−72付近の第3超可変領
域(第5図においてHV3;セグメントD)におけるI−DE
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有す
る。また、同一の超可変領域(第5図においてHV3;セグ
メントD)において多形性である、他のDR4 DR−ベータ
−I対立遺伝子は、位置68−72付近に配列GGAGCAGAAGCG
GGCCGCGを有しそして、また、IDDMに関連する。こうし
て、ほとんどのDR4+IDDMの患者はDR4、Dw4またはDR4、
DW10であり、両者のDQ−ベータ対立遺伝子の変異型(上
を参照)およびDR−ベータ−I対立遺伝子の変異型は自
己免疫性に寄与する。Dw4変異型は、他のDR4、DR−ベー
タ−I対立遺伝子から、配列特異的オリゴヌクレオチド
(SSO)分析により区別することができる。
DR4ハプロタイプ、Dw4サイブタイプもまた、DR4、Dw1
4のように、慢性関節リウマチ(RA)に関連する。Roudi
erら、カリフォルニア州サンディゴにおける1987年11月
5−7日のアメリカリウマチ学会(Western Region)の
会合からのアブストラクツ(Abstract)、p.15。Dw4を
他のDR4、DR−ベータ−I対立遺伝子から区別する、ア
ミノ酸69−74におけるDR−ベータ−I鎖のHV3領域から
のヘキサペプチドは、エプスタイン−バールウイルス
(EBV)のオープンリーディングフレームBALF4により共
有され、そして分子の模倣性についての標的として働く
ことができる。
前述のDNA配列はDNAハイブリダイゼーションプローブ
技術により検出することができる。排他的でない1つの
例において、遺伝子のマーカーを含有することが疑われ
る試料を1系列の膜上に直接スポッティングし、そして
各膜を特定の配列の相違に対して特異的である、異なる
標識したオリゴヌクレオチドのプローブとハイブリダイ
ゼーションさせる。試料を膜上にスポッティングする1
つの手順は、Kafotsら、Nucleic Acids Research,:15
41−1552(1979)に記載されている。
簡潔に記載すれば、膜に固定されたDNAの試料は、ド
デシル硫酸ナトリウム、フィコル(Ficoll)、血清アル
ブミンおよび種々の塩類を含有する予備ハイブリダイゼ
ーション溶液で、プローブの添加前に、予備処理するこ
とができる。次いで、検出すべき各配列に対して特異的
である標識したオリゴヌクレオチドのプローブを、予備
ハイブリダイゼーション溶液に類似するハイブリダイゼ
ーション溶液に添加する。ハイブリダイゼーション溶液
を膜に適用し、そして膜をハイブリダイゼーション条件
に暴露し、前記ハイブリダイゼーション条件はプローブ
の型および長さ、成分の濃度などに依存する。一般に、
ハイブリダイゼージョンは約25〜75℃、好ましくは35〜
65℃において0.25〜50時間、好ましくは3時間より短い
時間の間実施する。ストリンジエンシーが大きくなるほ
ど、プローブと試料との間のハイブリダイゼーションに
要求される相補性はより大きくなる。バックグラウンド
のレベルが高い場合、ストリンジエンシーはそれに応じ
て増加することがある。ストリンジエンシーは、また、
洗浄液中に組み入れることができる。
ハイブリダイゼーション後、試料を適当な手段によ
り、例えば、変化する濃度の標準的生理的塩類溶液のリ
ン酸塩EDTA(SSPE)(180mM NaCl、10mM Na2HPO4および
1M EDTA,pH7.4)溶液で25〜75℃において、温度に依存
して約10分〜1時間1または2回以上洗浄することによ
って、ハイブリダイゼーションしないプローブを洗浄除
去する。次いで、標識を適当な検出技術により検出す
る。
ここで使用することができる配列特異的オリゴヌクレ
オチドのプローブは、適当な手段、例えば、ヌクレオシ
ド誘導体からの核酸の有機合成により調製することがで
きるオリゴヌクレオチドである。この合成は溶液中でま
たは固体の支持体上で実施することができる。有機合成
の1つの型は、遺伝子断片または短い遺伝子の調製に利
用される、ホスホトリエステル法である。ホスホトリエ
ステル法においては、オリゴヌクレオチドを調製し、次
いでこれらを一緒に連結してより長い核酸を形成するこ
とができる。この方法の説明については、Narang,S.A.
ら、Meth.Enzymol.,68、90(1979)および米国特許第4,
356,270号を参照のこと。この特許はソマトスタチン遺
伝子の合成およびクローニングを記載している。
有機合成の第2型は、tRNA遺伝子の調製に利用されて
いる、ホスホジエステル方法である。。この方法の説明
についてBrown,E.L.ら、Meth.Enzymol.,68、106(197
9)を参照のこと。ホスホトリエステル法におけるよう
に、ホスホジエステル法はオリゴヌクレオチドの合成を
包含し、引き続いてオリゴヌクレオチドを一緒に連結し
て所望の核酸を形成する。
これらの自動化された実施態様を使用することもでき
る。1つのこのような自動化された実施態様において、
ジエチルホスホルアミダイトを出発物質として使用し、
そしてBeaucageら、Tetrahedron Letters,22:1895−186
2(1981)に記載されているように合成することができ
る。修飾された固体の支持体上でオリゴヌクレオチドを
合成する1つの方法は、米国特許第4,458,066号に記載
されている。また、生物源から分離されたプライマーを
使用することができる(例えば、制限エンドヌクレアー
ゼの消化)。
配列特異的オリゴヌクレオチドは、検出されるヌクレ
オチドの変動部にまたがる領域を包含しなければなら
ず、且つヌクレオチドの変動に対して特異的でなくては
ならない。例えば、4種類のDNAのそれぞれに特徴的な
ヌクレオチド配列部位を含有する4種類のオリゴヌクレ
オチドを合成することができる。各オリゴヌクレオチド
を同一試料の複製物に対してハイブリダイゼーションし
て、IDDMまたはPVに特徴的である対立遺伝子の変化が起
こる位置の1または2以上の領域を試料が含有するかど
うかを決定する。
配列特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ
ドの由来およびヌクレオチド組成を包含する、多数の因
子に依存する。ここにおける目的のために、オリゴヌク
レオチドは典型的には15〜25ヌクレオチドを含有する
が、より多いか、あるいはよりすくないヌクレオチドを
含有することができる。長さが少なくとも19マーである
オリゴヌクレオチドは特異性および/または感受性を増
大することができ、19マーより小さい、例えば、16マー
のプローブは、多分、単一の不一致がより不安定化する
ため、一層の配列特異的の識別を示す。プローブを使用
する検出前に試料の増幅を後述するように実施する場
合、増幅は特異性を増加するので、より長いプローブの
長さは臨界的ではなく、そしてハイブリダイゼーション
および洗浄温度は同一塩濃度について低下することがで
きる。したがって、このような場合において、19マーよ
り小さいプローブを使用することが好ましい。
試料をまず膜上に配置し、次いでオリゴヌクレオチド
で検出する場合、オリゴヌクレオチドは適当な標識成分
で標識しなくてはならず、この成分は分光光度測定、光
化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的手段によ
り検出することができるものである。免疫化学的手段
は、適当な条件下にオリゴヌクレオチドと複合体を形成
することができる抗体を用い、そして生物化学的手段は
適当な条件下にオリゴヌクレオチド複合体を形成するこ
とができるポリペプチドまたはレクチンを用いる。例え
ば次のものが挙げられる:蛍光性染料、電子高密度試
薬、不溶性反応生成物を析出するか、あるいは発色的に
検出することができる酵素、例えば、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、放射性標識、例えば、32Pまたはビオチン。
ビオチンを使用する場合、スペーサーアームを利用して
それをオリゴヌクレオチドに取り付けることができる。
好ましくは、使用する標識は非放射性である。
「逆」ドットプロットのフォーマットにおいて、DNA
配列の1つとハイブリダイゼーションすることができる
標識した配列特異的オリゴヌクレオチドのプローブを前
述の予備ハイブリダイゼーション条件下に膜上にスポッ
トする。次いで、試料を予備処理した膜に前述のハイブ
リダイゼーション条件下に添加する。次いで、検出手段
を使用して試料中の配列が標識したオリゴヌクレオチド
にハイブリダイゼーションしたかどうかを決定すること
ができるような方法で、標識したオリゴヌクレオチドま
たはその断片を膜から解放する。この解放は、例えば、
プローブ中の制限部位を認識する制限酵素を膜に添加す
ることによって、行うことができる。この手順は、オリ
ゴマー制限法として知られており、欧州特許発行164,05
4号(1985年12月11日発行)により完全に記載されてい
る。
あるいは、膜に固定化された配列特異的オリゴヌクレ
オチドは標的DNA鎖(PCR増幅した)を結合または「捕
捉」することができるであろう。この「捕捉された」鎖
は第2標識プローブにより検出することができるであろ
う。第2オリゴヌクレオチドのプローブは遺伝子座特異
的または対立遺伝子特異的であることができる。
ここにおけるDNA配列を検出する別の方法において
は、分析すべき試料をまずDNAポリメラーゼ、4種類の
ヌクレオチドトリホスフェートおよび2種類のプライマ
ーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応と呼ばれる方法に
より増幅する。簡潔には、この増幅方法は次の工程を包
含する: (a)4つのIDDM遺伝子マーカー配列の1または2以上
を含有することが疑われるDNA試料を、一緒にまたは順
次に、4種類の異なるヌクレオチドトリホスフェート、
ヌクレオチドトリホスフェートの重合のための試薬、お
よびIDDMまたはPV遺伝子マーカーを含有することが疑わ
れる各DNAの各鎖につき1種類のデオキシリボヌクレオ
チドプライマーでハイブリダイゼーション条件下に処理
し、こうして検出すべき各異なる遺伝子マーカーを含有
する各DNA鎖について、各DNA鎖に対して相補的である各
プライマーの伸長産生物を合成し、ここで前記プライマ
ーは各異なる遺伝子マーカーを含有する各DNA鎖に対し
て実質的に相補的であるように選択し、こうして1つの
プライマーから合成された伸長産生物は、その相補体か
ら分離するとき、他方のプライマーの伸長産生物の合成
のための鋳型として働くことができるようにする; (b)試料を変性条件下に処理して、検出すべき配列が
存在する場合、プライマー伸長産生物をそれらの鋳型か
ら分離する;そして (c)試料を、一緒にまたは順次に、前記4種類のヌク
レオチドトリホスフェート、ヌクレオチドトリホスフェ
ートの重合のための試薬、およびオリゴヌクレオチドプ
ライマーで処理し、こうしてプライマー伸長産生物を鋳
型として工程(b)において産生された一本鎖の各を使
用して合成し、ここで工程(b)および(c)を十分な
回数で反復して、存在する場合、配列を含有する核酸の
検出可能な増幅生じさせる。
次いで、試料を膜に添付し、そして前述したように配
列特異的プローブで検出する。好ましくは、試料がヒト
ゲノムDNAを含有する場合、工程(b)および(c)を
少なくとも5回、より好ましくは15〜30回反復する。試
料が細胞を含む場合、好ましくはそれらを工程(a)前
に加熱してその中のDNAを試薬に対して暴露する。この
工程は試薬添加の前のDNAの抽出を回避する。
「逆」ドットブロットのフォーマットにおいて、増幅
連鎖反応において使用するプライマーの少なくとも1種
および/または4種類のヌクレオチドトリホスフェート
の少なくとも1種を検出可能な標識で標識し、こうし
て、生ずる増幅した配列を標識する。これらの標識した
部分は最初に反応混合物中に存在するか、あるいは後の
サイクルの間に添加することができる。次いで、配列が
存在する場合に増幅した配列とハイブリダイゼーション
することができる非標識配列特異的オリゴヌクレオチド
を、前述したように予備ハイブリダイゼーション条件下
に膜にスポットする。次いで、増幅した試料を前述した
ようにハイブリダイゼーション条件下に予備処理した膜
に添加する。最後に、検出手段を使用して、DNA試料中
の増幅した配列が膜に固定したオリゴヌクレオチドにハ
イブリダイゼーションしているかどうかを決定する。変
化を含有する膜結合した配列が増幅産生物中に存在する
場合にのみ、ハイブリダイゼーションは起こるであろ
う。
上に示したように、この方法の変法は、サンドイッチ
アッセイにおいて、非標識PCR標的、非標識固定化対立
遺伝子特異的プローブおよび標識したオリゴヌクレオチ
ドのプローブを使用することを包含する。
増幅方法は、プローブの改良された特異性および感受
性を提供する;解釈可能なシグナルを4時間で0.04μg
の試料を使用して得ることができる。また、膜上にスポ
ットした試料の量を0.1〜0.5μgに増加する場合、放射
性同位元素を用いずに標識したオリゴヌクレオチドを、
前の方法において使用した放射性同位元素のプローブの
代わりに、利用することができる。最後に、前述のよう
に、増幅方法は大きさが19マーより小さい配列特異的オ
リゴヌクレオチドの使用に適用することができ、こうし
てより認識可能な配列特異的オリゴヌクレオチドの使用
を可能とすることができる。
増幅法の変法においては、熱安定性酵素、例えば、テ
ルムス・アクアチクス(Thermus aquaticus)から精製
したものを温度サイクル連鎖反応においてDNAポリメラ
ーゼとして利用することができる。熱安定性酵素は熱に
対して安定性であり、耐熱性であり、そして適切な方法
でヌクレオチドの結合を触媒(促進)して各DNA鎖に対
して相補的であるプライマー伸長産生物を形成する酵素
を意味する。
この技術のこの後者の変法においては、プライマーお
よびヌクレオチドトリホスフェートを試料に添加し、こ
の混合物を加熱し、次いで冷却し、次いで酵素を添加
し、次いでこの混合物を約90〜100℃に加熱してDNAを変
性し、次いで約35〜40℃に冷却し、そして所望の量の増
幅が起こるまで、サイクルを反復する。この方法はまた
自動化することができる。熱安定性酵素を使用する増幅
方法は、欧州特許発行258,017号(1988年3月2日発
行)により完全に記載されている。
本発明は、また、各標識した配列特異的DNAプローブ
のための容器を有する、包装した多容器ユニットからな
るキットのフォーマットを包含する。このキットは、必
要に応じて、標識(例えば、標識がビオチンである場
合、アビジン−酵素接合体および酵素の基質並びに色素
原)を検出する手段を含有することができる。さらに、
キットは検出すべき配列をもつ1または2以上のDNA鎖
を含有するプローブのための陽性の対照、および検出す
べき配列のいずれかを有するDNA鎖を含有しないプロー
ブのための陰性の対照を有する容器を含むことができ
る。
IDDMまたはPVに関連するタンパク質の試料中のアミノ
酸配列を検出する1つの方法は、4つのアミノ酸配列の
1または2以上に結合する1または2以上の抗体を使用
するイムノアッセイの使用を包含する。抗体はポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体であることができ
るが、モノクローナル抗体は抗原に対するそれらの特異
性および親和性にかんがみて好ましい。
ポリクローナル抗体はよく知られた方法により調製す
ることができる。この方法はIDDMまたはPVに関連する1
または2以上のアミノ酸配列を含有するペプチドを合成
し、ペプチドを精製し、標準技術によりペプチドに担体
タンパク質を取り付け、そして宿主、例えば、ウサギ、
ラット、ヤギ、マウスなどにペプチドを注射することを
包含する。血清を宿主から既知の方法により抽出し、そ
してスクリーニングして、ペプチドの免疫原に対して特
異的であるポリクローナル抗体を得る。ペプチドはMerr
ifield,R.B.,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,32:2
21−296(1969)および「ポリペプチドの化学(The Che
mistry of Polypeptides)」(P.G.Katsoyannis,編)、
pp.336−361、Plenum、ニューヨーク(1973)(それら
の開示をここに引用によって加える)に記載されている
固相合成方法により合成することができる。次いで、ペ
プチドを精製し、そしてキーホールリンペットヘモシア
ニン(KLH)またはウシ血清アルブミン(BSA)に接合さ
せることができる。これは、ペプチドがスステインを含
有する場合、スルフヒドリル基を経て、ヘテロ二官能性
架橋剤、例えば、1−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼン
−4−スルホン酸ナトリウム塩のN−マレイミド−6−
アミノカプロイルエステルを使用して達成することがで
きる。
モノクローナル抗体は通常齧歯類またはヒト由来のも
のであろう。なぜなら、モノクローナル抗体を分泌する
永久増殖性のハイブリッド細胞系の産生に使用すること
ができるネズミ、ラット、およびヒトの腫瘍細胞系は入
手可能であるからである。抗体はアイソタイプであるこ
とができるが、好ましくはIgG,IgMまたはIgA、最も好ま
しくはIgG2aである。
ネズミのモノクローナル抗体は、宿主を前述のペプチ
ドで免疫化することによって産生することができる。宿
主は免疫原量のペプチドを腹腔内に接種し、次いで同様
な量の免疫原ペプチドで追加免疫することができる。免
疫化したマウスから、脾臓またはリンパの組織を最後の
追加免疫後数日で集め、そして細胞懸濁液をそれからの
融合において使用するために調製する。
ハイブリドーマは、脾臓細胞またはリンパの組織と腫
瘍(骨髄腫)パートナーとから、Koehler,B.およびMils
tein,C.,Nature,256:495−497(1975)およびKoehler,
B.ら、Eur.J.Immunol.,:511−519(1976)の一般的体
細胞のハイブリダイゼーション技術を使用して調製する
ことができる。この目的に好ましい好ましい骨髄腫細胞
は、効率よく融合し、選択した抗体産生細胞による抗体
の安定な、高レベルの発現を支持し、そして培地、例え
ば、HAT培地に対して感受性であるものである。これら
のうちで、好ましい骨髄腫細胞系はネズミ骨髄腫系統、
例えば、ソーク研究所(Salk Institute,Cell Distribu
tion Center、米国カリフォルニア州サンジエゴ)から
入手可能なMOPC−21およびMOPC−11マウス腫瘍、および
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the
American Type Culture Collection、米国マリイランド
州ロックビレ)から、それぞれ、ATCC CRL No.1580およ
び1581で入手可能なP3X63−Ag8.653(653)およびSp2/0
−Ag14(Sp2/0)骨髄腫系統から誘導されるものであ
る。
基本的には、この技術は適当な腫瘍細胞および脾臓細
胞またはリンパ組織を融合源、例えば、ポリエチレング
リコールを使用して融合することを包含する。融合後、
細胞を融合培地、例えば、HAT培地から分離して、ハイ
ブリダイゼーションしない親細胞を排除し、そして培地
に対して抵抗性でありかつ永久増殖性であるハイブリド
ーマのみを選択する。ハイブリドーマを、必要に応じ
て、増殖させ、そして上澄み液を普通のイムノアッセイ
手順(例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッ
セイ、または蛍光イムノアッセイ)により抗原として免
疫化剤を使用してアッセイすることができる。陽性のク
ローンはさらに特性決定して、それが本発明の抗体の基
準を満足するかどうかを決定することができる。例え
ば、抗体の抗原結合能力をイムノブロッティング、ELIS
Aおよび抗原中和試験により生体外で評価することがで
きる。
アミノ酸遺伝子マーカーに対するヒト抗体を分泌する
ハイブリッドの細胞系をつくる好ましい手順は、十分に
高いレベルのこのような抗体を産生するマウス×ヒト親
ハイブリッド細胞系およびヒト細胞系を使用する、体細
胞ハイブリダイゼーションである。ヒト細胞系は前述の
ペプチドで免疫化したボランティアーから得ることがで
きる。ヒト細胞系は、例えば、Foung et al.,J.Immuno
l.Methods,70:83−90(1984)に記載されているよう
に、エプステイン−バーウイルス(EBV)で形質転換す
ることができる。
EBVの形質転換を使用するとき、最も首尾よいアプロ
ーチは、Kozbarら、Scan.J.Immunol.,10:187−194(197
9)およびSteinitzら、J.Clin.Lab.Immun.,:1−7(1
979)に記載されているように、パニング(panning)ま
たはロセッティング技術により、形質転換すべきB細胞
の集団を前選択するか、あるいは抗原特異的な形質転換
した集団を後選択することであった。最近、EBVの形質
転換を細胞融合と組み合わせてヒトモノクローナル抗体
が調製された(参照、例えば、Foungら、J.Immun.Met
h.,70:83−90(1984)。これは、EBVリンパ芽球細胞系
と比較したときハイブドーマにより免疫グロブリンの分
泌の不安定性、および抗原特異的集団のレスキュー(re
scue)のより高い頻度のためである。EBVはIgMを有する
B細胞を最も頻繁に感染しかつ形質転換するが、Igの他
のクラスを分泌するB細胞は、また、BrownおよびMille
r,J.Immuol.,128:24−29(1982)に記載されているよう
に、EBV融合技術を使用して長期間の系統にすることが
できる。
モノクローナル抗体を産生する細胞系は、適当な培
地、例えば、イスコウブ(Iscove)の培地、ダルベッコ
変性イーグル培地、またはRPMI培地(Gibco、ニューヨ
ーク州グランドアイランド)中で生体外で、あるいはシ
ンジェネイックまたは免疫欠損の実験室動物において生
体内で増殖することができる。必要に応じて、抗体は培
地または体液から、場合に応じて、普通の技術、例え
ば、硫酸アンモニウムの沈澱、ヒドロキシアパタイトの
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
親和クロマトグラフィー、電気泳動、ミクロ濾過、およ
び超遠心により分離することができる。
ここにおける抗体を使用して、HLAクラスII抗原を発
現する全血細胞中のIDDMに関連するアミノ酸配列の存在
または不存在を検出することができる。細胞は抗体の存
在下にインキュベーションし、そして反応(抗体−ペプ
チドの結合)の存在または不存在および/または程度
は、抗体/抗原の相互作用を決定または定量するために
使用する種々の方法(例えば、蛍光、酵素結合イムノア
ッセイ(ELISA)、および標準の方法による抗体および
補体を使用する殺細胞)のいずれによっても決定するこ
とができる。使用する抗体は好ましくはモノクローナル
抗体である。
固相イムノアッセイにおいて使用するため、本発明に
おいて使用する適当な固体の支持体上に適当な技術によ
り固定化することができる。固体の試験支持体は、イム
ノアッセイにおいて抗体を結合するために適当な不溶性
の担体材料のいずれであることもできる。多数のこのよ
うな材料はこの分野において知られており、次のものを
包含するが、これらに限定されない:ニトロセルロース
のシートまたはフィルター;アガロース、樹脂、プラス
チック(例えば、PVCまたはポリスチレン)ラテック
ス、または金属ビーズ;プラスチック容器など。抗体を
固定化する多数の方法もまた、この分野において知られ
ている。参照、例えば、Silmanら、Ann.Rev.Biochem.,3
5:873(1966);Melrose,Rev.Pure & App.Chem.,21:83
(1971);Cuatrecafasら、Meth.Enzym.,Vol.22(197
1)。このような方法は、共有結合カップリング、直接
吸着、物理学的捕捉、およびタンパク質被覆した表面へ
の取り付けを包含する。後者の方法において、表面をま
ず不溶性タンパク質、例えば、ゼイン、コラーゲン、フ
ィブリノゲン、ケラチン、グルテリンなどで被覆する。
抗体は単にタンパク質被覆表面を抗体の水溶液と接触さ
せ、そしてそれを乾燥することによって取り付ける。
洗浄の間にすべての結合した抗体を保持することがで
きるように、抗体を免疫反応性のままにしなお抗体を十
分に固定する結合技術及び支持体の任意の組合わせで本
発明において使用することができる。好ましい固体の試
験支持体はプラスチックビーズである。
サンドイッチイムノアッセイにおいて、標識した抗体
を使用して、固定化されたモノクローナル抗体により結
合された抗原の量を測定する。標識は、支持体に結合し
たとき、抗体の検出を可能とする任意の型であることが
できる。一般に、標識は直接または間接にシグナルを生
成し、このシグナルは測定可能であり、そして試料中に
存在する標識の量に関係づけられる。例えば、直接測定
可能な標識は放射性同位元素(例えば125I、35S、14Cな
ど)を包含することができる。好ましい直接測定な標識
は、適当な基質(例えば、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ/o−フェニレンジアミン)の存在下に色の反応を生
成する。抗体へ接合した酵素である。間接に測定可能な
標識の例は、ビオチン化した抗体であろう。この標識の
存在は、それを標識したアビジンを含有する溶液と接触
させることによって測定され、それによりアビジンはビ
オチン化抗体に結合するようになる。次いで、アビジン
に関連する標識を測定する。間接標識の好ましい例は、
アビジンに接合した酵素を使用するアビジン/ビオチン
系であり、この酵素は前述したように色の反応を生成す
る。しかしながら、用語「酵素」はその最も広い意味に
おいて使用し、そして、例えば、「標識した」抗体を使
用することを包含することができ、ここで標識はキセノ
タイプまたはアイソタイプ的に固定化された抗体と異な
るので、「標識した」抗体の存在は直接に検出可能な標
識を有する抗キセノタイプまたは抗アイソタイプの抗体
とのインキュベーションにより検出可能である。
どの標識を選択しても、それは測定することができか
つ試料中の標識の量に関係付けられるシグナルを生ず
る。普通のシグナルは放射能レベル(放射性同位元素を
使用するとき)、光学密度(例えば、酵素の色反応を使
用するとき)、および蛍光(蛍光性化合物を使用すると
き)である。非放射性シグナル、例えば、酵素反応によ
り生成される光学密度(または色強度)を使用すること
は好ましい。適当なシグナルを生成することができる多
数の酵素/基質の組み合わせては、イムノアッセイの分
野において知られている。参照、例えば、米国特許第4,
323,647号および米国特許第4,190,496号。
診断的使用のため、抗体は典型的には多容器キットの
形態で分配されるであろう。これらのキットは典型的に
は適当な容器中に標識または非標識の形態の抗体、使用
する場合、非標識抗体と反応性の検出可能なリガンド、
必要に応じてインキュベーションおよび洗浄のための試
薬、検出すべき標識部分を検出するための試薬、例え
ば、標識に依存して基質または誘導化試薬、産生物のイ
ンサートおよび使用説明、IDDMまたはPVに関連する陽性
の対照、例えば、IDDMまたはPVに関連するHLAクラスII
抗原を含有するであろう。キット中の抗体は、それらが
ポリクローナルである場合、親和精製することができ
る。
次の実施例は本発明の種々の実施態様を例示し、そし
ていかなる面においても限定を意図しない。実施例にお
いて、特記しない限り、すべての部および百分率は固体
である場合重量により、そして液体である場合体積によ
り、そしてすべての温度はセ氏度(℃)である。
実施例I この実施例は、IDDMに関連するDR−ベータ配列を同定
した方法を例示する。
I.HLA−DR−ベータ配列の分析 いくつかのHLAクラスIIベータ遺伝子を、種々のHLA型
IDDMの固体(ピッツバーグクリニック大学からおよびHu
man Genetic Mutant Cell Repositer、ニュージャージ
イ州カメデンから入手可能なIDDM患者からの細胞系か
ら)の臨床的血液試料および非糖尿病の対照(ホモ接合
体型別細胞)からのクローニング方法を使用して分離し
た。標準方法である1つのこのような方法において、ヒ
トゲノムのDNAを患者の試料から、本質的にManiatis
ら、分子クローニング:実験室のマニュアル(Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual)(1982)、280−281
の方法を使用して分離するか、あるいはSaikiら、Bio/T
echnology,:1008−1012(1985)に記載されているよ
うに、末梢血液リンパ球から主として構成された、バフ
ィーコート(buffy coat)の分画から調製した。次い
で、このDNAを、Maniatisら、supra,pp.269−294に記載
されているように、完全なゲノムのライブラリーとして
バクテリオファージのベクター中にクローニングした。
HLA−DR−ベータ遺伝子のための個々のクローンを、放
射性cDNAプローブへのハイブリダイゼーションにより選
択し(Maniatisら、pp.309−328)そして制限地図によ
り特性決定した。参照、米国特許第4,582,788号(1986
年4月15日発行)。IDDM患者からの個々のクローンを、
クローンの制限地図を患者の族内のRFLP分離パターンと
比較することによってDR型別ハプロタイプに割り当て
た。最後に、変動する第2エクソンを表すこれらのクロ
ーンの小さい断片をM13p10クローニングベクター(これ
はベーリンガー・マンヘイム(Boehringer Mannheim)
から広く入手可能である)中にサブクローニング(Mani
atis,pp.390−402)した。
遺伝子をクローニングする別の手順において、遺伝子
の関連する部分(第2エクソン)の増幅を後述するよう
に実施した。
各分離したヒトゲノムDNAの合計1μgを、100mMトリ
ス−HCl緩衝液(pH7.5)、500mM NaCl、および100mM Mg
Cl2、10μの10μMプライマーGH46、10μの10マイ
クロミリリットルのプライマーGH50、15μの40ミリモ
ルのdNTP(10ミリモルの各dATP,dCTP,dGTPおよびTTPを
含有する)、および45μの水を含有する溶液の10μ
を含有する最初の100μの反応体積中で増幅した。プ
ライマーGH46およびGH50は次の配列を有する: これらのプライマーは、リンカー/プライマーとして作
用する非相同性の配列を有し、次のようにして調製し
た: A.自動化合成手順:BeaucageおよびCaruthers(Tetrahed
ron Letters(1981)22:1859−1862)に従い合成した、
ジエチルホスホルアミダイトを、バイオサーチ(Biosea
rch)SAM−1を使用してヌクレオチド誘導化制御された
孔のガラス支持体へ順次に縮合させた。この手順はジク
ロロメタン中のトリクロロ酢酸を使用する脱トリチル
化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾールを
使用する縮合、およびテトラヒドロフランおよびピリジ
ン中の酢酸無水物およびヂメチルアミノピリジンのキャ
ッピングを包含した。サイクル時間はほぼ30分であっ
た。各工程において収量は本質的に定量的であり、そし
て脱トリチル化の間に解放されるジメトキシトリチルア
ルコールの収集および分光光度測定の検査により決定し
た。
B.オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護および精製
の手順:固体の支持体をカラムから取り出し、そして1m
lの濃水酸化アンモニウムに室温において4時間閉じた
管中で暴露した。次いで、支持体を濾過により除去し、
そして部分的に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを含有する溶液を55℃において5時間保持した。ア
ンモニウムを除去し、そして残留物を調製用ポリアクリ
ルアミドゲルに適用した。eplを30ボルト/cmにおいて90
分間実施し、次いで産生物を含有するバンドを蛍光板の
紫外線のシャドウイングにより同定した。このバンドを
切除し、そして4℃において1mlの蒸留水で一夜溶離し
た。この溶液をアルテク(Altech)RP18カラムに適用
し、そして1%の酢酸アンモニウム中のアセトニトリル
の7〜13%の勾配でpH6.0において溶離した。溶離液を
紫外線吸収により、260nmにおいて監視し、そして適当
な分画を集め、固定した体積で紫外線吸収により定量
し、そして真空遠心で室温において蒸発乾固した。
C.オリゴデオキシリボヌクレオチドの特性決定:精製し
たオリゴヌクレオチドの試験のアリコートをポリヌクレ
オチドキナーゼおよびq−32P−ATPで32P標識した。標
識した化合物を14〜20%のポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーにより50ボルト/cmにおいて45分
間の電気泳動後検査した。この手順は分子量を評価す
る。塩基の組成は、オリゴデオキシリボヌクレオチドを
ヌクレオチドにベノム(venom)ジエステラーゼおよび
バクテリアのアルカリ性ホスファターゼの使用により消
化し、次いで誘導されたヌクレオチドを逆相HPLCカラム
および10%のアセトニトリル、1%の酢酸アンモニウム
の移動相を使用する分離および定量により決定した。
上の反応混合物を95℃にセットした加熱ブロック内に
10分間保持してDNAを変性した。次いで、各DNA試料を28
サイクルの増幅にかけ、ここで各サイクルは4つの工程
から構成されていた: (1)マイクロセントリフーグ中で試料を短時間(10〜
20秒)回転して沈澱濃縮し、そして変性された物質を直
ちに30℃にセットして加熱ブロックに2分間移して、プ
ライマーおよびゲノムのDNAをアニーリングし、 (2)39μのE. coliのDNAポリメラーゼIのクレノ
ー断片(ニュー・イングランド・バイオラブス(New En
gland Biolabs)、5単位/μ)、39μの100ミリモ
ルのトリス緩衝液(pH7.5)、500ミリモルのNaClおよび
100ミリモルのMgCl2の塩混合物、および312μの水を
混合することによって調製した溶液の2μを添加し、 (3)反応を30℃において2分間進行させ、そして (4)この試料を95℃の加熱ブロックに2分間移して新
しく合成したDNAを変性するが、ただしこの反応は最後
のサイクルにおいて実施しなかった。
次いで,この混合物を−20℃において貯蔵した。次の
クローニング手順を増幅した産生物について使用した。
反応混合物は、まず50μの50mM NaCl、10mMトリス
−HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、20単位のPst I、および2
0単位のHind IIIを含有する緩衝液中で37℃において90
分間消化することによって、M13mp10中にサブクローニ
ングした。反応を凍結により停止した。体積をトリス−
HClおよびEDTAを含有する緩衝液で110μに調節し、そ
してBioGel P−4回転透析カラムに装入した。1つの分
画を集め、そしてエタノール沈澱させた。
エタノールの沈澱物を15μの水中に再懸濁し、そし
て50mMトリス−MCl(pH7.8)、10mM MgCl2、0.5mM AT
P、0.5μgのPst IおよびHind IIIで消化したM13mp10ベ
クターおよび400単位のリガーゼを含有する20μの体
積に調節した。この混合物を16℃において3時間インキ
ュベーションした。
10μのモルト(Molt)4DNAを含有する結合反応混合
物をE. coli菌株JM103コンピテント細胞(これはBRL、
マリイランド州ベセスダ)から入手可能である)中に形
質転換した。形質転換した菌株の調製に使用した手順
は、Messing,J.(1981)高分子物質についての第3回ク
レブッランドシンポジウム:組み換えDNA(Third Clebe
land Symposium on macromolecules:Recombinat DN
A)、A.Walton片、アムステルダム、エルセビーア、143
−153に記載されている。
これらの2つのクローニング手順からの約40の異なる
対立遺伝子を配列決定した。決定した配列の幾つかにお
いて、特異的DNAおよびタンパク質の配列の4つの領域
は種々の組み合わせで存在し、そしてIDDMに関連するこ
とが見いだされた。IDDM患者のゲノム中のこれらのセグ
メントの各々において見られるDNA配列は、DR−ベータ
タンパク質の1〜3アミノ酸残基の変更を生成した。多
数の糖尿病源から得られる配列中に見いだされ、そして
A〜Dと表示する、DR−ベータ第2エクソンのこれらの
可変のセグメントが上において同定される。このような
配列の検出のために使用するプローブを案出するために
使用できる領域は第5図に特定されており、ここでアミ
ノ酸の略号を表VIIIに示す。
II.検出のためのプライマーの調製 DR−ベータ第2エクソンの保存された5′および3′
末端の対抗する鎖に対して相補的であるGH46およびGH50
と表示するオリゴヌクレオチドを、プライマーとして使
用した。プライマーは上の節において同定した。
III.期待した増幅反応 試験すべき各DNA試料からのDNAの1μg(10μの10
0μg/mlのDNA)を、100mMトリス緩衝液(pH7.5)、500m
M NaCl、および100mM MgCl2、10μの10μMプライマ
ーGH46、10μの10μMプライマーGH50、15μの40mM
dNTP(10mMの各dATP,dCTP,dGTPおよびTTPを含有す
る)、10μのDMSO、および45μの水を含有する溶液
の10μを含有する最初の100μの反応体積中で増幅
することができる。
各反応混合物を95℃にセットした加熱ブロック内に10
分間保持してDNAを変性した。次いで、各DNA試料を30サ
イクルの増幅にかけ、ここで各サイクルは4つの工程か
ら構成されていた: (1)マクロセントリフーグ中で試料を短時間(10〜20
秒)回転して沈澱濃縮し、そして変性された物質を直ち
に37℃にセットした加熱ブロックに2分間移して、プラ
イマーおよびゲノムのDNAをアニーリングし、 (2)39μのE. coliのDNAポリメラーゼIのクレノ
ー断片(ニュー・イングランド・バイオラブス(New En
gland Biolabs)、5単位/μ)、39μの100mMトリ
ス緩衝液(pH7.5)、500mM NaClおよび100mM MgCl2の塩
混合物、および312μの水を混合することによって調
製した溶液を2μを添加し、 (3)反応を37℃において2分間進行させ、そして (4)この試料を95℃の加熱ブロックに2分間移して新
しく合成したDNAを変性するが、ただしこの反応は最後
のサイクルにおいて実施しなかった。
最後の反応体積は150μであり、そして反応混合物
を−20℃において貯蔵した。
IV.オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの期待す
る合成およびリン酸化 それぞれ、領域CおよびDからの、GH54(V−−S)
およびGH78(I−−DE)と表示する、4種の標識したプ
ローブの内の2種を使用する。
これらの2種のプローブを、クローニングするための
プライマーの調製について前述の手順に従い合成する。
プローブは、10pMのそれを、70mMトリス緩衝液(pH7.
6)、10mM MgCl2、1.5mMスペルミン、100mMジチオスレ
イトールおよび水を含有する40μの反応体積中で、4
単位のT4ヌクレオチドキナーゼ(ニュー・イングランド
・バイオラブス(New England Biolabs))および薬40p
Mのガンマ-32P−ATP(ニュー・イングランド・ニューク
リアー(New England Nuclear)、抗体7000Ci/ミリモ
ル)と37℃において60分間接触させることによって標識
する。次いで、合計の体積を25mMのEDTAで100μに調
節し、そしてManiatisら、Molecular Cloning(198
2)、466−467の手順に従い、トリス−EDTA(TE)緩衝
液(10mMトリス緩衝液、0.1mMのEDTA、pH8.0)と平衡化
した1mlのBioGel P−4(BioRad)回転透析カラムで精
製する。
V.期待するドットブロットハイブリダイゼーション 節IIIからの150μの増幅した試料の各5μを195
μの0.4N NaOH、25mM EDTAで希釈し、そして3つの反
復実験のゼナトラン(Genatoran)45(PLASCO)ナイロ
ンフィルター上にスポットし、ここでReedおよびMann,N
ucleic Acids Research,13。7202−7221(1985)に記載
されているように、まずフィルターを水で湿潤させ、そ
れをフィルターを所定位置に保持するドットブロットを
調製するバイオドット(BioDot)(BioRad)装置に配置
し、そして各ウェルを0.4mlの20×SSPE(3.6MのNaCl、2
00mM NaH2PO4、20mM EDTA)ですすぐ。次いで、フィル
ターを取り出し、20×SSPE中ですすぎ、そして真空炉内
で80℃において30分間ベーキングする。
ベーキング後、各フィルター5×SSPE、5×デンハル
ト溶液(1×=0.02%のポリビニルピロリドン、0.02%
のフィコール、0.02%のウシ血清アルブミン、0.2mMト
リス−HCl、0.2mM EDTA、pH8.0)および0.5%のSDSから
成るハイブリダイゼーション溶液の6mlと接触させ、そ
して55℃において60分間インキュベーションした。次い
で、プローブの各々の5μをハイブリダイゼーション
溶液に添加し、そしてフィルターを55℃において60分間
インキュベーションした。
最後に、各ハイブリダイゼーションしたフィルターを
厳格な条件下に洗浄する。遺伝子型は90分のオートラジ
オグラフィー後容易に現れることが期待される。プロー
ブは、ゲノムのDNA試料中で検出されるアレルの部分に
対する合理的な特異性を有することが期待される。
実施例II 開示するアミノ酸配列に対するペプチドは、前述のよ
うに調製し、そして免疫原として使用して、タンパク質
タンパク質中のアミノ酸配列を検出するイムノアッセイ
において有用な、それに対する抗体を発生するために使
用できる。
実施例III 尋常性天疱瘡(Pemphigus vulgaris)(PV)に関連
するDR4およびDRw6の両者のハプロタイプがDR−ベータ
−I鎖におけるPVの感受性を示す共通のエピトープを含
有する可能性を探査するために、3人のPV患者からのDR
−ベータおよびDQ−ベータの位置の多形性第2エクソン
のヌクレオチド配列を決定した。3人のPV患者のHLA−D
R血清型はDR4/4、DR4/5およびDR4/5であったので、DR4
関連PV感受性の発生のみをこの実施例において探査し
た。配列の分析は、特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)増幅した断片を含有するM13クローンについて実施し
た。PCRの増幅、クローニングおよび配列の分析につい
ては、次の文献を参照:Saiki et al.,Science,230:1350
−1354(1985);およびScharf et al.,Science,233:10
76−1078(1986)。
試料の調製および増幅の手順 3人の尋常性天疱瘡の患
者からの血液試料は、ブルース・ウィントロウブ(Bruc
e Wintroub)博士、UCSF(カリフォルニア州)により提
供された。0.5mlの全血を1.5mlの10mMトリス(pH7.
5)、10mM EDTA、100mM NaCl、40mMジチオスレイトー
ル、および200μg/mlのプロイテイナーゼKの添加によ
り溶解し、そして55℃において16時間インキュベーショ
ンした。試料をフェノール抽出し、フェノール−CHCl3
およびCHCl3抽出し、そして−20℃において一夜エタノ
ール沈澱した。沈澱したDNAを遠心によりペレットに
し、70%のエタノールで洗浄し、合成し、そして100μ
の10mMトリス、0.1mM 100μg/mlのRNアーゼAを含有
するEDTA中に再懸濁し、そして37℃において15分間イン
キュベーションした。DNAの試料を、前述したように、
フェノール−CHCl3およびCHCl3で再抽出してRNアーゼA
を不活性化し、エタノール沈澱させ、各し、そして乾燥
した。1μgの完全なゲノムのDNAをポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)(Scharf et al.,id)により増幅し、ここ
で反応条件を次のように変化させた:A.)HLA DR−ベー
タ領域の遺伝子は1マイクロミリリットルのPCRプライ
マーGH46およびGH50を使用して増幅した(参照、プライ
マーの説明およびHLA DR−ベータの標的の断片について
第1図);1単位のクローニングしたE. coliのDNAポリ
メラーゼ1の大きい断片(クレノー断片)を20サイクル
の増幅のために添加した;増幅の追加の5サイクルは4
単位のクレノー断片を使用して試料について実施した。
B.)1μMのPCRプライマーGH46およびGH50を使用して
増幅されたHLA DR−ベータ領域遺伝子: 1単位のクレノー断片を20サイクルの増幅のために添加
した;追加の8サイクルの増幅を2単位/サイクルのク
レノー断片を使用して実施した。DQ−ベータのプライマ
ーは238塩基対の断片を産生する。DR−ベータの調製は2
72bpの断片を産生した(参照、第1図)。PCR反応の1/1
0を4%のNuSieve、0.5%のSeaKem(FMC)アガロースゲ
ルで実施し、そしてゼナトラン45ナイロン膜に移した
(Scharfら、前掲)。フィルターを10mlの5×SSPE、4
×デンハルト溶液および0.5%のドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)中で37℃において15分間ハイブリダイゼーシ
ョンした。フィルターを0.1pM(ガンマ-32P)ATP標識し
たDR−ベータ特異的オリゴマーGH22の添加で37℃におい
て16時間ハイブリダイゼーションした。フィルターを4
×SSPE、0.1%のSDS中で30℃において2.5分間および37
℃において1.5分間洗浄し、そして強化スクリーン(デ
ュポンCronex Lighting Plus)で−70℃において16時間
露出した。フィルターを沸騰する0.1×SSPE、0.1%noSD
S中で5分間インキュベーションしてプローブをストリ
ッピングし、乾燥し、そして10mlの6×SSPE、10×デン
ハルト溶液および0.2%のSDS中で42℃において予備ハイ
ブリダイゼーションした。0.2pM(ガンマ-32P)ATP標識
したDR4 Dw10配列特異的オリゴマーのGH78を予備ハイブ
リダイゼーション溶液に添加し、そして42℃において16
時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーション
後、フィルターを1×SSPE、0.1%のSDS中で37℃におい
て10分間洗浄し、そしてオートラジオグラフィーにかけ
た。
HLA DR−ベータおよびDQ−ベータのPCR産生物のクロー
ニングおよび配列決定。各PCR反応の1/2をエタノール沈
澱させ、再懸濁し、そして4%のNuSieve、0.5%のSeaK
emゲル上に適用し、そして20ボルト/cmで1時間電気泳
動にかけた。DR−ベータについて265および280塩基対の
間のスライスおよびDQ−ベータについて220および250塩
基対の間のスライスをゲルから取り出し、そしてDNAを
ゲルから200μ0.5×TBE緩衝液中で電気溶離した。電
気溶離したDNA試料を透析し、60単位のBamH IおよびPst
I(ニュー・イングランド・バイオラブス(New Englan
d Biolabs))で37℃において3時間消化し、フェノー
ル、フェノール−CHCl3およびCHCl3抽出し、そしてエタ
ノール沈澱した。消化したPCR DNAの1/4を200μgのBam
H I/Pst I消化し、脱リン酸化したM13mp10に結合し、E.
coli JM103中に形質転換し、そして選択培地上に配置し
た、Scharf,id;Messing,Methods in Enzymology、101
pp.20−78(Wuら編、1983)。陽性のクローンをその場
のプラークフィルターのハイブリダイゼーションにより
ニック翻訳したDR−ベータcDNAを使用して同定し、プラ
ーク精製し、そして精製したファージのクローンをチェ
イン−ミネション法により配列決定した。Sangerら、PN
AS(USA)、74:5463−5468(1977)。
分析:DR−ベータcDNAのプローブを使用する、PCR増幅産
生物およびDR−3ホモ接合体の型別細胞DNA(一般のDR
−ベータ増幅およびハイブリダイゼーションの対照を包
含する)サザンプロットの分析において、すべての4つ
の試料はほぼ等しい量の増幅したDR−ベータ断片を含有
することが示された。
次いで、フィルターをニック翻訳したDR−ベータのプ
ローブからストリッピングし、そしてGH78、すなわち、
DR4サイブタイプDw10に対して特異的のオリゴヌクレオ
チドのプローブで再プロービングした(第1図、参
照)。GH78配列特異的オリゴヌクレオチド(SSO)はDw1
0配列に特異的にハイブリダイゼーションするが、他のD
R4サイブタイプ(例えば、Dw4,Dw14,Dw13およびDw15)
のいずれにもハイブリダイゼーションしない。すべての
3人のPV患者からの増幅したDNAはGH78にハイブリダイ
ゼーションしたが、DR−3ホモ接合体の対照にハイブリ
ダイゼーションしなかった。
HLA DR−ベータおよびDQ−ベータの遺伝子座について
の増幅したDNA配列をクローニングし、そしてコード配
列のレベルでより詳述な多形性において配列決定して検
査した。第2図は、HLA DR−ベータ位置についてのヌク
レオチド配列のデータから誘導したアミノ酸の整列を示
す。DR4 Dw10サイブタイプのプロトタイプの配列は、そ
れぞれ、アミノ酸位置68,71および72におけるロイシ
ン、グルタミンおよびリジンのイソロイシン、アスパラ
ギン酸、およびグルタミン酸(「I−DE」エピトープ)
による置換により、DR4 Dw4プロトタイプ配列から区別
される。配列の整列が示すように、3人の患者のDR4対
立遺伝子からのDR−ベータ−I配列は、また、この「I
−DE」を含有する。2人のDR4/5患者(患者IIおよびII
I)からのDR5対立遺伝子からのDR−ベータ−I配列は、
DR5プロトチアプからのDR−ベータ−I配列と同一であ
る。同様に、これらの2人のDR4/5患者からのDR5対立遺
伝子からのDR−ベータ−IIIは、DR5 DR−ベータ−IIIプ
ロトタイプの配列と同一である。DR4/4である患者Iは
1つのDw10および1つのDw13ハプロタイプを有し、そし
て患者からのDR−ベータIV配列はDR4−ベータ−IVプロ
トタイプ配列と同一である。HLA DQ−ベータ位置につい
てのヌクレオチド配列のデータから誘導したアミノ酸の
整列を第3図に示す。患者Iは1つのDR4対立遺伝子に
ついてDQB3.2および他のDR4対立遺伝子についてDQB3.1
としてサブタイプに分類される。患者のIIおよびIII
(両者はDR4/5)は、また、それらのDQ−ベータ遺伝子
座についてホモ接合性である;DR4対立遺伝子はDQB3.2で
あり、そしてDQB3.1遺伝子座はDR5ハプロタイプからの
ものである。DR血清型が与えられると、DQ−ベータ遺伝
子座におけるこのヘテロ接合性驚くべきことではない。
なぜなら、両者のDQB3.1およびDQB3.2はDR4ハプロタイ
プ関連し、そしてDQB3.1はDR5ハプロタイプに関連する
からである。すべての3人の患者からのDQB3.1およびDQ
B3.2配列は、それらのそれぞれのプロトタイプ配列と同
一である。
実施例 IV DR4−Dw10を他のDR4−Dwサイブタイプと区別する実施
例IIIに前述したコドン70付近の同一の配列は、また、D
Rw6ハプロタイプのサブセット上に存在する。配列の多
形性のパターンが示唆するように、この共有する「エピ
トープ」はPVに関連するDR4およびDRw6の病気の原因と
なり得るであろう。
イスラエルの患者、DR合致する対照、およびオースト
ラリアの患者からのDNA試料を、前述のドットブロット
のフォーマットにおいてPCR増幅したDNAを使用して、DR
−ベータおよびDQ−ベータの配列特異的オリゴヌクレオ
チドのプローブのパネルで分析した。DR−ベータIのオ
リゴヌクレオチドのプローブを使用する分析において、
本質的にすべての患者のDR4ハプロタイプ(24/24イスラ
エルの患者;10/14非イスラエルの患者)はDw10関連エピ
トープを有し、これに対して対照DR4のハプロタイプは
より小さい比率であった(15/25イスラエルの対照;1/19
非イスラエルの対照)。しかしながら、そのエピトープ
を含有するDRw6のDR−ベータ−I対立遺伝子の比率は、
対照(8/13)に関してDRw6のPV患者(4/14)においてよ
り低かった。したがって、PVに対するDR4感受性が特異
的DR−ベータ−I対立遺伝子に寄与することができる場
合、DRw6感受性は異なる配列により説明されなくてはな
らない。
実施例V DQ−ベータのゲノムの配列のPCR増幅。第4図に示す
結果を得るために、第4図の左側に示す種々の細胞系の
各々からのゲノムのDNAの1μgをPCR(Saikiら、Natur
e,324:163−166(1986))により28サイクルの間E. co
liのDNAポリメラーゼのクレノー断片で増幅した。増幅
プライマーGH28および29(参照、実施例IV)を使用して
DQ−ベータ遺伝子の238bpのセグメントを増幅した。増
幅の程度および特異性をアガロースゲルの電気泳動、ブ
ロッティング、および32P標識DQ−ベータのcDNAプロー
ブ(Scharfら、supra)とのハイブリダイゼーションに
より監視した。IDDM患者の源はArnheimら、前掲、に記
載されている。
M13mp10中のPCRクローニング。増幅したDNAを1回等
しい体積のTE飽和したフェノールで抽出し、次いでフェ
ノール/クロロホルム混合物で2回抽出した。次いで、
DNAを無菌の水で2mlに希釈し、透析し、そしてセントリ
コン(Centricon)10カラム(Amicon)で5000klにおい
て室温で60分間遠心により濃縮した。DQ−ベータの増幅
の場合において、PCRプライマーはある数の非HLA増幅産
生物を産生し、標的のバンドをまずアガロースゲルから
切断し、そして100ボルトで1時間0.5×TBE中で電気泳
動した。DNAを100μに希釈し、そして37℃において2
時間40単位のBamH IおよびPst Iの各々で消化した。消
化後、DNAを再びフェノール/クロロホルムで抽出し、
透析し、そして濃縮した。次いで。それをM13mp10ベク
ター中にPCRクローニング手順(Scharfら、前掲)の変
法により結合した。M13プラークを最初にインサートに
ついてDQ−アルファまたはDQ−ベータのcDNAプローブ
と、および場合におうじて対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチド(ASO)プローブ(Saikiら、前掲)とのハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングした。これらの
クローンは、また、ASOプローブの使用によりDXアルフ
ァまたはDX−ベータの増幅産生物についてスクリーニン
グした。一本鎖のファージDNAを標準技術により分離
し、そしてジデオキシヌクレオチドプライマー伸長方
法、Smith,Meth.Enzymol.,65:560−580(1980)により
配列決定した。
実施例VI ウイルスの配列の相同性 エプスタイン−バールウイルスの菌株B95−8の17228
2−bpのゲノムの配列(Baerら、前掲)をコンピュータ
によりタンパク質の配列に、すべての6つの前進および
逆の相について翻訳した。次いで、これらの翻訳を5ま
たはそれ以上のアミノ酸とDQ−ベータ対立遺伝子の位置
57を中心とするポリペプチド配列との正確な合致につい
てサーチした(参照、表VII)。次いで、各合致につい
てのオープンリーディングフレーム(ORF)の位置およ
び大きさを決定し、そして主要なORFおよびEBVゲノムの
転写のセグメントと相関関係づけた(Baerら、前掲)。
これらの相同性の有意性を判定する1つの方法は、不規
則に起こるそれらの機会を推定することによる。EBVの
6つの翻訳の相において、DQ−ベータ対立遺伝子の位置
57付近のアミノ酸残基は端数(fraction)で起こる:A=
0.0804、D=0.0258、E=0.0337、G=0.1089、L=0.
0890、P=0.1089、R=0.0962、およびY=0.0141。こ
れらの頻度を一緒に掛けることによって、ポリペプチド
のエピトープについての不規則に起こる機会は、次の通
りである:「RPDAE」=1/1,370,000、「GLPAA」=1/14
7,000、「PAAEY」=1/2,990,000、「GPPAA」=1/120,00
0および「PPAAEY」=1/27,400,000。こうして、すべて
の6つの翻訳において344,560の残基が存在するので、
「GPPAA」および「GLPAA」エピトープについていくつか
の不規則の発生が期待されるが、他について期待されな
い。主要なORFとおよびゲノムの反復したセグメントの
合致およびそれらの相関関係の過剰な数は、それらの有
意性に寄与する。統計的確率のみにより、6つの残基の
合致「PPAAEY」は不規則に起こった可能性が特にある。
分子および臨床生物学および診断および関係する修練
の分野における当業者にとって明らかなように、本発明
の前述の実施態様の他の変更は、次の請求の範囲内入る
ことが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平1−501566(JP,A) 国際公開86/7464(WO,A1) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/11 C12Q 1/68 C12N 15/06 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG) GenBank/EMBL(GENET YX) CA(STN) REGISTRY(STN)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】自己免疫病に対する感受性の診断のため
    の、インスリン依存性真性糖尿病に関連しかつ尋常性天
    疱瘡(Pemphigus vulgaris)に対するDR4関連感受性に
    関連するHLAクラスIIベータ遺伝子からのマーカーDR−
    ベータ−I DNA配列。
  2. 【請求項2】GACATCCTGGAAGACGAGCGG、またはそれに対
    して相補性のDNA鎖である、請求項1に記載のマーカーD
    R−ベータ−I DNA配列。
  3. 【請求項3】インスリン依存性真性糖尿病に対するDR
    4、Dw4関連感受性に関連する、請求項1に記載のマーカ
    ーDR−ベータ−I DNA配列。
  4. 【請求項4】GGAGCAGAAGCGGGCCGCG、またはそれに対し
    て相補性のDNA鎖である、請求項3に記載のマーカーDR
    −ベータ−I DNA配列。
  5. 【請求項5】自己免疫病に対する感受性の診断のため
    の、尋常性天疱瘡に対するDRw6関連感受性に関連するHL
    AクラスIIベータ遺伝子からのマーカーDQ−ベータDNA配
    列。
  6. 【請求項6】DQB1.3対立遺伝子の第2エクソンの約コド
    ン20〜約コドン80からの1または2以上の配列を含んで
    なる、請求項5に記載のマーカーDQ−ベータDNA配列。
  7. 【請求項7】自己免疫病に対する感受性の診断のため
    の、DQ−ベータタンパク質の配列の位置57におけるコド
    ンの同一性を直接または間接に検出するために使用する
    ことができる、インスリン依存性真性糖尿病に対する感
    受性に関連するHLA DQ−ベータ対立遺伝子からのマーカ
    ーDNA配列。
  8. 【請求項8】前記位置57におけるコドンがアラニン、バ
    リン、およびアスパラギン酸のためのコドンから成る群
    より選択される、請求項7に記載のマーカーDNA配列。
  9. 【請求項9】前記DNA配列が、 またはそれに対して相補性のDNA鎖から成る群より選択
    される、請求項8に記載のマーカーDNA配列。
  10. 【請求項10】アラニン、バリンおよびアスパラギン酸
    のコドンから成る群から選択される位置57のコドンを含
    んで成る第2DNA配列を間接検出するために使用される、
    請求項7に記載のマーカーDNA配列。
  11. 【請求項11】前記DNA配列が、 またはそれに対して相補性のDNA鎖から成る群より選択
    される、請求項10に記載のマーカーDNA配列。
  12. 【請求項12】次の工程: (a)DNAの試料を処理してその中のDNAをハイブリダイ
    ゼーションに対して暴露するためにDNA試料を処理し、 (b)前記処理した試料を膜に固定し、 (c)前記膜を、ハイブリダイゼーション条件下で、標
    識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブで処理
    し、該プローブは、 から成る群より選択されるDNA配列の1または2以上
    と、あるいはそれに対して相補性のDNA鎖とハイブリダ
    イゼーションすることができるものであり、そして (d)前記プローブが試料中のいずれかのDNAとハイブ
    リダイゼーションしたかどうかを検出する、 ことを含んでなるDNAの試料中のインスリン依存性真性
    糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在または不存
    在を検出する方法。
  13. 【請求項13】DQ−ベータタンパク質の位置57に相当す
    るアミノ酸残基を含んでなるエピトープを含有するペプ
    チドに結合する抗体であって、該抗体はヒト永続性ウイ
    ルス病原体によりコードされる相同性ペプチド配列との
    交差反応性を有し、そして前記アミノ酸残基はアラニン
    およびバリンから成る群より選択される、自己免疫病に
    対する感受性の診断のための抗体。
  14. 【請求項14】前記ペプチドが、 から成る群より選択される、上記第13項記載の抗体。
  15. 【請求項15】前記ウイルスの病原体が、エプスタイン
    バール(Epste−in−Barr)ウイルス、風疹ウイルス、
    コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、および
    レオウイルスから成る群より選択される、請求項13に記
    載の抗体。
  16. 【請求項16】次の工程: (a)タンパク質の試料を、検出可能な成分で標識した
    請求項13に記載の抗体の1または2以上の存在下にイン
    キュベーションし、そして (b)前記成分を検出する、 ことを含んでなる、タンパク質の試料中のインスリン依
    存性真性糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在ま
    たは不存在を検出する方法。
  17. 【請求項17】標識した抗体とのインキュベーションの
    前、間、または後に、前記試料をモノクローナル抗体の
    存在下にインキュベーションし、該モノクローナル抗体
    は固体の支持体に固定化されており、そして から成る群より選択されるアミノ酸配列の1又は2以上
    と結合するものである請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項18】次の工程: (a)血清試料を、Gly Pro Pro Ala Ala、Gly Leu Pro
    Ala Ala、およびGly Arg Pro Val Alaから成る群より
    選択されるペプチドの1または2以上の存在下にインキ
    ュベーションし、 (b)前記ペプチドと前記血清試料中に存在する抗体と
    の間で形成された免疫複合体の存在を検出し、そして (c)工程(b)の結果から、感受性のハプロタイプが
    存在するかどうかを決定する、 ことを含んでなる、血清試料中のインスリン依存性真性
    糖尿病に対する感受性に関連するハプロタイプを同定す
    る方法。
  19. 【請求項19】アミノ酸配列が、インスリン依存性真性
    糖尿病に関連しかつ尋常性天疱瘡(Pemphigus vulgari
    s)に対するDR4関連感受性に関連するHLAクラスIIベー
    タ遺伝子からのマーカーDR−ベータ−I DNA配列;尋常
    性天疱瘡に対するDRw6関連感受性に関連するマーカーDQ
    −ベータDNA配列;インスリン依存性真性糖尿病に関連
    するマーカーDR3ベータIII配列;および配列決定したDQ
    −ベータタンパク質配列の位置57のためのコドンを含有
    する、インスリン依存性真性糖尿病に対する感受性に関
    連するDQ−ベータ対立遺伝子からのマーカーDNA配列;
    から成る群より選択されるHLAクラスIIベータ遺伝子か
    らのDNA配列によりコードされているアミノ酸配列およ
    び/またはそれに対する抗体を含んで成る、自己免疫病
    感受性診断剤。
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567809A (en) * 1986-03-13 1996-10-22 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for HLA DRbeta DNA typing
US5310893A (en) * 1986-03-31 1994-05-10 Hoffmann-La Roche Inc. Method for HLA DP typing
US5714380A (en) * 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US5192659A (en) * 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
GB9002625D0 (en) * 1990-02-06 1990-04-04 Univ Singapore Human leukocyte antigen typing
DK0527199T4 (da) * 1990-05-01 2000-12-04 Univ Leland Stanford Junior Præparater til anvendelse ved en fremgangsmåde tilbehandling af et menneske, der lider afdissemineret sclerose
US7294712B2 (en) * 1990-06-04 2007-11-13 Aventis Pharma S.A. Nucleotide sequences coding for variable regions of β chains of human T lymphocyte receptors, corresponding peptide segments and the diagnostic and therapeutic uses
CA2049449C (en) * 1990-08-20 1999-08-10 Fumiya Obata Hla-dr antigen gene and its nucleotide sequence and its use
EP0514534B1 (en) * 1990-12-06 1998-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for hla drbeta dna typing
CA2075052C (en) * 1990-12-21 2006-08-22 Henry A. Erlich Hla dqbeta dna typing
KR100227303B1 (ko) * 1991-02-12 1999-12-01 장-끌로드 비에이으포스 인체 t 임파구 수용체의 베타 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 진단 및 치료 용도
FR2679252B1 (fr) * 1991-07-17 1993-12-10 Bio Merieux Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes.
US5976789A (en) * 1991-07-17 1999-11-02 Bio Merieux System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
FR2684688B1 (fr) * 1991-12-04 1994-03-18 Bertin Et Cie Procede de selection d'au moins un crible de mutations, son application a un procede d'identification rapide d'alleles de systemes polymorphes et dispositif pour sa mise en óoeuvre.
US5763591A (en) * 1996-03-25 1998-06-09 Cedars-Sinai Medical Center Polynucleic acid sequences that are functionally associated with the development of autoimmune disease
FR2749308B1 (fr) * 1996-06-03 1998-07-24 Bio Merieux Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1
JP4248023B2 (ja) * 1997-02-21 2009-04-02 サイジーン コーポレイション インスリン依存性糖尿病に対する素因を決定するための組成物および方法
US5985567A (en) * 1997-08-15 1999-11-16 Beckman Coulter, Inc. Hybridization detection by pretreating bound single-stranded probes
AU4314300A (en) 1999-04-26 2000-11-10 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Tumor suppressor genes
AU785071B2 (en) * 1999-11-01 2006-09-14 Shunichi Shiozawa Method of diagnosing rheumatoid arthritis
WO2004094986A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
EP1536021A1 (en) * 2003-11-27 2005-06-01 Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) Method for HLA typing
US20100086914A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
EP2279411A4 (en) * 2008-04-09 2011-09-21 Pacific Northwest Res Inst SCREENING METHOD FOR THE GENETIC PRESDITION OF DIABETES OF TYPE I
US20100261189A1 (en) * 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582788A (en) 1982-01-22 1986-04-15 Cetus Corporation HLA typing method and cDNA probes used therein
US5110920A (en) 1982-01-22 1992-05-05 Cetus Corporation HLA typing method and DNA probes used therein
EP0084796B1 (en) * 1982-01-22 1990-05-02 Cetus Corporation Hla typing method and cdna probes used therein
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
WO1986007464A1 (en) 1985-06-14 1986-12-18 Genetic Systems Corporation Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4965189A (en) 1986-07-01 1990-10-23 University Of Massachusetts Medical School Probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
US5059519A (en) 1986-07-01 1991-10-22 University Of Massachusetts Medical School Oligonucleotide probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
DK495186D0 (da) * 1986-10-16 1986-10-16 Nordisk Gentofte Fremgangsmaade og middel til paavisning af genstrukturer hos personer med stor tilbaejelighed til udvikling af iddm
US5039606A (en) 1987-10-29 1991-08-13 Virginia Mason Research Center Diagnostic probe for diabetes type I predisposition
US4971902A (en) 1987-10-30 1990-11-20 Virginia Mason Research Center Diagnostic probe for rheumatoid arthritis predisposition

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