JPH03501926A - 自己免疫病に関連する配列の特性決定及び検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫病に関連する配列の特性決定および検出本発明は、自己免疫に関連する ＨＬＡクラスＩＩベータ遺伝子およびタンパク質、およびそれらを診断する方法 に関する。

詳しくは、本発明における自己免疫病はインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤｌ ’ｌ）および尋常性天庖癒（農町立１時囚ｎ肛旦）（ＰＶ）である。

種六の自己免疫病は、ヒト白血球抗原（）ＩＬＡ）クラスＩＩＩ抗原の血清学的 に定義された変異型に関連づけられてきた。ＨＬＡ領域は、染色体の短いアーム 上に位置し、２つのカテゴリーに分類された多数の異なる糖タンパク質をコード する。第１カテゴリー、すなわちクラスｌの産生物は、肛Ａ−Ａ、−Ｂ、および 一〇の位置によりコードされ、すべての有機細胞の表面上に位置し、そして細胞 溶解性Ｔ細胞の認識において標的として機能する。第２カテゴリー、すなわちク ラスＩＩの産生物は、ｔｌＬＡ−Ｄ領域によりコードされ、免疫系の細胞間の協 力および相互作用に参加する。これらのクラスＩＩの産生物は少なくとも３つの 別個遺伝子座、すなわちＤＲ，ＤＱおよびＤＰによりコードされるように思われ 、各々はその別個のアルファおよびベータ鎖をもつ。ヒトの主要組織適合性複合 体（ＭＨＣ）のクラスＩＩの遺伝子座は、高度に多形性の細胞表面の糖タンパク 質をコードする（マクロファージおよびベーター細胞のトランスメンブレン糖タ ンパク質）。文献を概観するためには、Ｇｉｌｅｓら、Ａｄｖ、ｉｎ　Ｉ＋ｎｍ ｕｎｏ１．３７．１−７１　（１９８５）を参照のこと。クラスＩＩの抗原にお ける多形性はＮＨ，−末端の外側のドメインに局在し、そして第２エクソンによ りコードされている。クラスＩＮの多形性の残りは、Ｔ細胞の受容体と、または 外来抗原あるいは両者と相互作用することが推定され（Ｓｅｔｔｅら、Ｎａｔｕ ｒｅ、３Ｌ邦：　３９５−３９９（１９８７）　）　、特定のクラスＩＩの産生 物に関連する抗原ペプチド断片の認識はＴ細胞の活性化を導き、結局ベータリン パ球による抗体の産生の刺激を導（（Ｍａｒχら、５ｃｉｅｎｃｅ。

％坦：６１３−６１４（１９８７）　）。

インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＩＩＩＭ）、すなわぢ、Ｉ型糖尿病としても 知られている慢性自己免疫病は、ヒト白血球抗原（ｌ（ＬＡ）の特定の対立遺伝 子変異型に関連するグルコース代謝の感受性のよく知られた疾患である。ＩＤＤ Ｍ患者において起こるグルコース代謝の機能障害的制御は、膵臓のインスリン産 生小島細胞、すなわちベータ細胞の免疫学的に仲介される破壊から生ずる。ＩＤ ＤＭの進行は６つの段階に分割され、遺伝的感受性で始まり、そしてベータ細胞 の完全な破壊で終わる。

Ｇ、Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、　Ｎ、Ｅｎｇ、ＪＪｅｄ、　、　３１４　：　１３ ６０−１３６８（１９８６）。

Ｄｏｎａｉｃｈら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、、　３４　：　１３−２０（１９ ８３）　、すべてのＴＤＤＭの患者の９０％より多くばＤＲ３および／またはＤ Ｒ４抗原を有し、そしてＤＲ３およびＤＲ４ｃｉ：ｙ両者をもつ個体はホモ接合 性のＤＩ？　３／３またはＤＩ？　４／４の遺伝子型を有する個体より大きい危 険状態にある。Ｌ、ＲａｆｆｅｌおよびＪ、Ｒｏｔｔｅｒ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　 Ｄｉａ−ｂｅｔｅｓ、　３　：５Ｏ−５４（１９８５）　；　Ｓｖｅｊｇａａｒ ｄ　ら、Ｌｍｍｕ、ｎｏｌ、Ｒｅｖ、＋　７３　：１８７（１９８１）　。

水剤またはプステル（ｐｕｓｔｕｌｅ）を意味するギリシャ語のペンフィックス （ｐｅｍｐｈｉｘ）に由来する天ＷＡｉは、かゆみのある水剤の連続する群によ り特徴づけられる慢性または急性の皮膚病につけられた名前である。尋常性天庖 瘉（農五強１竪匹ｊと１旦）（ＰＶ）は、皮膚および粘膜の基底上の、表皮内の 水剤により発現される再発することの希な病気である；しかしながら、緩解はコ ルチコステロイドホルモンおよび免疫抑制薬物の使用により得られている。自己 免疫病であるＰｖは、）ＩＬＡ血清型ＤＲ４およびＤＲｗ６と強く関連づかられ きており（Ｂｒａｕｔｂａｒら、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１６　：　 ２３８−２４１（１９８０）　）　、ＰＶ患者の５％未満はマーカーをもたない 。２つのハブロタイブと病気の関連は、次のことを意味すると解釈することがで きる＝　（１）２つのハブロタイブは共通の対立遺伝子またはエピトープを共有 するか、あるいは（２）２つのハブロタイブ上の異なる対立遺伝子は疾患感受性 を与えることができる。

ＨＬＡクラスＩＩベータ遺伝子の分子分析が示すところによれば、ＨＬＡ血清型 が遺伝学的に異種であり、そしてとくに、ＤＲ４ハブロタイブが０ｗ４　、　Ｄ ＷＩＯ，０ｗ１３．０ｗ１４およびＤ−１５型と定義された５つの混合されたリ ンパ球培養物（ＭＬＣ）に相当する５つの異なるＤＲ−ベーター■対立遺伝子配 列（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）影し２６４２　：　２６４６ （１９８６）　）並びにＤＱ−ベーター３．１　、ＤＱ−ベーター３．２および ＤＱ−ブランク型に相当する３つの異なるＤＱ−ベータ対立遺伝子配列［Ｅｒ１ ｉｃｈら、組織適合性の抗原の分子の分析（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｅｏ−ｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ａｎｔｉｇｅ ｎｓ）、ｐｐ、９３−１０９（Ｓｃｈａｃｔｅｒら、編、１９８７）　）から成 る。クラスＩＩの遺伝子座に特徴的な広範な多形性は事実上すべて、第２エクソ ンに位置付けられている。

ＤＲ−ベータ遺伝子座におけるコード配列の多形性の配列分析は、ＤＷＩＯを他 のＤＲ４サイプタイプと区別するＤＲ４ＤＲ−ベータＩＩ中の配列またはエピト ープがＤＩｈ６ハブロタイプのＤＲ−ベーターＩ鎖により共有されることを明ら かにした。Ｇｏｒｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２２　：　６７−７０（１９８ ６）　、最近、ＤＲ４およびＤＲｗ６ハブロタイブを再分類する制限断片長多形 性（ＲＦＬＰｓ）は、）ＩＬＡ−ＤＱ−ベータｃｒｎａプローブを使用して得ら れた。このようなＲＦＬＰｓは血清型のマーカーよりもＰＶとより一層高度に関 連すると報告されている（Ｓｚｆｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ。

８４　：　６５４２−６５４５（１９８７）　）。

すべての免疫学的に定義される多形性のうつで、ＨＬＡ−ＤＲ−ベータ領域は、 ＩＤＤＭに最も強く関連することが見出されている。したがって、ＩＩＬＡクラ スＩＩベータＤＮＡの制限断片は、インスリン依存性真性糖尿病の遺伝子マーカ ーとして使用するため分析された。　Ｄ、Ｏｗｅｒｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ ＮＡＳ（ＵＳＡ）、８２　：　３３３５−３３３９（１９８５）　；Ｄ、５ｔｅ ｌｔｌｅｒら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　、　８２　：　８１００−８１０４　（ １９８５）。

Ａｒｎｈｅｉｍ　ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８２：６９７０　６９７４（Ｏｃｔ 、１９８５）は、ＩＤＤＭに対する感受性に関連する）ＩＬＡクラスＩＩ遺伝子 座内のＤＮＡ多形性を、ＤＱ−ベータおよびＤＩ？−ベータｃＤＮＡプローブを 使用するゲノムプロット−ハイブリダイゼーション分析により検査した。ＤＲ４ ハブロタイブのＤＱ−ベータの再分類が記載され、ここで１つのＤＲ４変異型は １．８ｋｂのＲｓａｌ制限断片長多形（ＲＦＬＰ）を有し、そして他は１．５　 ｋｂのＲｓａｌ　ＲＦＬＰを有する。

ＤＱ−ベータに関係する１、　５　ｋｂのＲｓａｌ断片は、多数の非−ＤＲ４Ｉ ＤＤＭおよびすべてのＩＤＤＭ　ＤＲ４個体の９０％を同定することが報告され た。

他の制限酵素（例えば、ＢａＩＩＩＨＩ、　）Ｉｉｎｄｌｌｌ）を使用する他の 研究者らは、ＤＱ−ベータプローブを使用するＤＲ４ハブロタイブのＲＦＬＰ再 分類を報告した。Ｈｏ１ｂｅｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８ ６）２４　：　２５１−２５８；ｔ（ｅｎｓｅｎら、Ｉ＋ｎｍｕｎｏｇｅｎｅｔ ｉｃｓ、　（１９８７）　２５　：　１５２−１６）　。

）１ｏ１ｂｅｃｋ　ら、前掲は、００ｗ３．１および００ｗ３．２と表示される ＤＲ４のＲＦＬＰザブセットが、特異的モノクローナル抗体ＴＡＩＯと発現した それらの産生物との反応性により区別されることを発見した。Ｋｉｍ　ら、ＰＮ ＡＳ（ＵＳＡ）、８２　：　８１３９　８１４２（１９８５）　ｓ　Ｔａ１ｔら 、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　（１９８６）２８　：　６５　７１゜Ｄ Ｑｔ＋３．１サイプタイプは血清学的特異性ＴＡＩＯ”と相関関連し、これに対 して００ｗ３．２はＴＡＩＯ−と相関関係する。

欧州特許発行第２３７　、３６２号は、ＤＲ４ハブロタイブのＲｓａｌｌ、５ｋ ｂ（ＤＱｉｅ３．２）およびＲｓａｌ　１．８ｋｂ（００ｗ３．１）変異型のク ローニングおよび配列決定を開示しており、そしてそれらの配列の差を説明して いる。（このような差は表ＩＩＩおよびＩＶに示されている。） Ｗ０８６１０７６４６号は、ＩＤＤＭに関連する特異的ゲノムのマーカーとして 、特異的ＤＱ−ベータ、対立遺伝子変異型ＤＱｗ３．２を開示しており、そして 糖尿病の危険が増大した個体を同定する２つの方法を提供する。第１方法は００ ｗ３．２対立遺伝子の検出に標識したプローブの使用するものであり、これに対 して第２方法はＤ（ｈ３．２対立遺伝子の血清学的検出を用いる。

Ｆｒ１ｉｃｈら、免疫遺伝学および組織適合性における概観（Ｐｅｒｓｐｅｃｔ ｉｖｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａ ｔｉｂｉｌｉｔｙ）。

Ｖｏｌ、７：９３−１０６（Ｓｃｈａｃｔｅｒ　ら、編、１９８７）は、ＤＱｉ ｅ３．１および３．２変異型についてのタンパク質翻訳配列を報告した。

Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７９　：　１１４１　 １１５２（Ａｐｒｉｌ　１９８７）は、００ｗ３．１変異型についてのヌクレオ チド配列を報告した。

Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａら、ＰＮＡｇ　（ＵＳＡ）　、　８４　（８）　：　２４ ３５−２４３５　（１９８７）は、対照マウスおよび糖尿病感受性ＮＯＤ　（非 肥満の糖尿病）マウスの）１−２　、Ｉ−Ａ領域における差の不存在を報告した 。正常マウスは前記領域の位置５７におけるアスラギン酸残基を有するが、これ に対してＮＯＤマウスはその位置に中性のセリン残基を有する。ヒ）ＨＬＡ−Ｄ Ｑ−ベータ領域はマウスのＨ−２１−Ａ領域に類似する。

Ｙｏｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ、　８　（ｓｕｌ　１．１）：３９− ４４（Ｓｅｐｔ、−０ｃｔ。

１９８５）は、動物およびヒトにおけるＩＤＤＭのだめのトリガーとしてウィル スの証拠を概観している。また、Ｂｏｄａｎｓｋｙら、Ｌａｎｃｅｔ、（１９８ ６）　、、　ｉｉ　：　１３５１　１３５３　：　Ｋａｇｎｏｆｆ　ら、Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、＋４０１を参照のこと。

Ｒｏｕｄ　ｉｅｒ　ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　Ａｓ５ｏｃ ｉａｔｉｏｎからのＡｂｓｔｒａｃｔｓ（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ）　、 カリフォルニア州すンデイエゴにおける会合、１９８７年１１月５−７日は、Ｈ ＬＡ　Ｄ賀４　ＤＲ−ベーター■鎖およびエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ ）の糖タンパク質はへキサペプチド共有することを報告した。

Ｔｏｄｄら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９　：　５９９−６０４（Ｏｃｔ、１５．１ ９８７）は、ＩＤＤＭに対する感受性および抵抗性へのＨＬＡ　ＤＱ−ベータ遺 伝子の寄与を論じている。著者らはｒＤＱ分子の構造、とくにベータ鎖の残基５ ７は、インスリン産生小島細胞に対する自己免疫応答を特定する」と結論してい る。

多数のＨＬＡ　ＤＲ−ベータ配列が従来発表されてきている。配列Ａｓｐ　Ｉｌ ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇが、Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、ＰＮ ′ＡＳ（ＵＳＡ）、益：　２６４２−２６４６（１９８６）により、ＨＬＡ　Ｄ Ｒ４ノ＼プロタイプからの種々のＤＲ−ベータ遺伝子の鎖の一部分として報告さ れた。糖尿病とのその関連については何も述べられていない。

さらに、Ｊ、ＧｏｒｓｋｉおよびＢ、Ｍａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３２２　：　６ ７　７０（１９８６）は、ハブロタイブＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲｗ６を包含す る群内のＨＬＡ　−ＤＲの多形性について報告している。ベーター１位置におけ る多形性領域中に見いだされるヌクレオチド配列は、糖尿病との関連性に関して 論じられていない。糖尿病からの）ＩＬＡ配列ついての最初の発表は、Ｄ、Ｏｗ ｅｒｂａｃｈら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ、　２４　：　４ｌ−４６（ １９８６）によりものである。この論文はＩＤＤＭ患者からのＨＬＡ　−ＤＲ− ベータ遺伝子のライブラリーについての研究に基づく、クラスＩＩの多形性およ び病気の感受性の分析は、患者およびＨＬＡ合致対照に由来する多数の配列の比 較を必要とする。

クラスＩＩの抗原における対立遺伝子の多様性は、タンパク質の第２エクソンに よりコードされる外側ドメインに限定される。）ＩＬＡクラスＩＩ遺伝子の多形 性を検出する血清学的方法は、ＤＮＡ法により検出可能な多様性の多くを検出す ることができない。

対立遺伝子の差異は、配列特異的合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するこ とによって、制限部位多形性とは独立に検出することができる。Ｃｏｎｎｅｒら 、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　、８０　：　２７８−（１９８３）。この技術はサザン ブロッテイングを使用するＨＬＡ　ＤＲ−ベータの多形性を研究するために適用 されてきている。

Ａｎｇｅｌｉｎｉら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８３　：　４４８９−４４９３（１ ９８６）。

配列特異的オリゴヌクレオチドのプローグを使用する技術の更なる改良は、上の 欧州特許（ＥＰ）　２３７．３６２号に記載されているように、プライマー、４ 種類のヌクレオチドトリホスフェート、および適当な酵素、例えばＤＮＡポリメ ラーゼを使用して、分析すべき核酸試料を増幅し、次いでドツトプロットのフォ ーマットにおいてプローブを使用して配列中のヌクレオチドの差異を検出するこ とを包含する。。熱安定性酵素を増幅方法において１回だけ添加する温度サイク リング方法は、欧州特許発行第２５８．０１７号に記載されていおり、これは、 また、この増幅方法において使用することができる、熱安定性酵素、精製したま たは組み換え体を開示している。

自己免疫病ＩＤＤＭおよびＰｖに対する感受性についてのより情報に富みかつよ り精密に定義されたマーカーをえるために、血清学的マーカーのＨＬＡ　ＤＲ３ 、ＤＲ４およびＤＲｗ６の再分類が、この分野において要求される。さらに、Ｄ Ｒ３、ＤＲ４またはＤＲｗ６のいずれでもないハブロタイブを与える感受性を同 定することが、この分野において、要求される。

従来、ＤＲ４ハブロタイブのＩＤＤＭ関連ＤＱ−ベータ変異型、００ｗ３．１お よび００ｗ３．２の間の区別は、ＲＦＬＰによるか、あるいは抗体の使用により なされてきた。本発明は、１つの面において、このようなりＱ−ベータ変異型を 同定する方法に関する。

したがって、本発明は、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤ！１）に関連しか つ尋常性天庖庶（ハ」虫匡岨旦江肛旦）　（ＰＶ）に対するＤＲ４関連感受性に 関連するＨＬＡクラスＩＩベータ遺伝子からのマーカーＤＲ−ベーターＩ　ＤＮ Ａ配列を提供する。

詳しくは、１つの面において、本発明は、ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡ ＧＣＧＧ　、またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖である、ＩＤＤＭに関連しか つ尋常性天庖癒に対するＤＲ４Ｒ４関連性受性連するＨＬＡクラスＩＩベータ遺 伝子からのマーカーＯＲ−ベーターｌＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は 、前記、　ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇを提供する。

本発明は、また、ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧ　、またはそれに対 して相補性のＤＮＡ鎖である、ＩＤＤＭに対するＤＲ４、０ｗ４関連感受性に関 連するマーカーＤＲ−ベーターＩ　ＤＮＡ配列を提供する。

さらに、本発明は、ＩＤＤＭおよび前記アミノ酸配列に対する抗体に対するＤＲ ４、０ｗ４関連感受性に関連するマーカーＤＲ−ベータＩ　ＤＮＡ配列によりコ ードされるアミノ酸配列に関する。

本発明は、尋常性天庖庶に対するＤＲｗ６関連惑受性に関連するＨＬＡクラスＩ Ｉベータ遺伝子からのマーカーＤＱ−ベータＤＮＡ配列を提供する。詳しくは、 このようなりＱ−ベータのＤＮＡ配列は、およそコドン２０〜約コドン８０のユ ニークＤＱＢ１．３対立遺伝子の第２エクソンからの１または２以上の配列を含 んでなる。さらに、本発明は、このようなりＱＢｌ、３　ＤＮＡ配列によりコー ドされるアミノ酸配列および該アミノ酸配列に対する抗体に関する。

他の面において、本発明は、ＤＯ−ベータタンパク質の配列の位置５７における コドンの同一性を直接または間接に検出するために使用することができる、イン スリン依存性真性糖尿病に対する感受性に関連するＨＬＡ　ＤＱ−ベータ対立遺 伝子からのマーカーＤＮＡ配列、および前記位置５７におけるコドンがアラニン 、バリン、およびアスパラギン酸のためのコドンから成る群より選択されるマー カーＤＮＡ配列に関する。前記ＤＮＡ配列は、好ましくは、 （ａ　）　Ｇ（、ＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣ。

（ｂ　）　ＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣ。

（ｃ　）　ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣ。

（ｄ　）　ＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣ、、および（ｅ　）　ＧＧＧＣＧＧ ＣＣＴＧＡＴＧＣＣ。

またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖から成る群より選択される。

本発明は、さらに、ＤＲ４ハブロタイブの１．５ｋｂ（Ｄローベーター３．２） 変異型および１．８　ｋｂ　（ＤＱ−ベーター３．１）変異型のＤＱ−ベータの 再分類に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブに関する。詳しくは、１． ５　ｋｂ　（ＤＱ−ベーター３．２）変異型に対して特異的なこのようなオリゴ ヌクレオチドのプローブは、ＧＨ７４と表示し、１９マーであり、そして配列： 　ＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣｆ；ＣＣＴＧＣ（：Ｇを有する。

ＧＨ９２と表示し、１．８　ｋｂ　（ＤＱ−ベーター３．１）ＲＦＬＰに対して 特異的なオリゴヌクレオチドのプローブもまた、１９７−であり、そしてＣＧＴ ＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧを有する。適当なハイブリダイゼーションお よび洗浄条件下に、これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、キナーゼ処理によ り３ｔｐで標識するか、あるいは非放射性同位元素のリポータ−１例えば、ビオ チンまたは酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識して、ＤＱ−ベーター３ ．２およびＤＱ−ベーター３．１変異型を特異的に同定する。本発明は、さらに 、このようなプローブの診断的使用に関する。

さらに、本発明は、第２　ＤＮＡを間接的に検出するためのものであり、前記第 ２　ＤＮＡ配列が位置５７におけるコドンを含んでなり、前記コドン３．はアラ ニン、バリン、およびアスパラギン酸のためのコドンから成る群より選択される 、マーカーＤＮＡ配列を提供する。第２　ＤＮＡを間接に検出するために使用す る前記マーカーＤＮＡ配列は、好ましくは、（ａ　）　ＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡ ＴＣＧＧＧＣＧ。

（ｂ　）　ＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ。

（Ｃ）　ＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ、および（ｄ　）　ＧＴＧＧＧ ＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡ。

またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖から成る群より選択される。

さらに、本発明は、Ｄローベータ遺伝子座におけるコドン５７の同一性を間接的 に同定するために使用することができる、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド プローブ（ＡＳＯ）を提供し、ここでこのようなプローブは、好ましくは、（１ ）ヌクレオチド配列：　ＣＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣｌｌ、ＧＣＡＧを有する 、ＤＲ３ハブロタイブのＤＱ−ベーターＢＧｉ域からのＧｌ（６１と表示する１ ９マー、 （２）ヌクレオチド配列：　ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣを有する 、ＤＲ３ハブロタイブのＤＱ−ベーター８８Ｍ域からのＧ）１６６と表示される １９マー、および （３）ヌクレオチド配列：　ＧＡＴＧＣτＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧを有 する、ＤＲ３ハブロタイブのＤＱ−ベーターＢＳｉ域からのＧＨ７０と表示され る２１マー、 から成る群より選択される。

本発明は、また、工程： （ａ）試料を処理してその中のＤＮＡをハイブリダイゼーションに暴露し、 （ｂ）前記処理した試料を膜に固定し、（ｃ）前記膜を、ハイブリダイゼーショ ン条件下で、標識された配列特異的オリゴヌクレオチドのプローブで処理し、前 記プローブは、 （１）　ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ　。

（２）ＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣ。

（３）　ＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣ、および（４）　ＧＧＧＣＧＧＣＣＴ ＧＴＴＧＣＣ。

から成る群より選択されるＤＮＡ配列の１または２以上と、あるいはそれに対し て相補性のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションすることができるものであり、そ して（ｄ）前記プローブが試料中のいずれかの卦＾とハイブリダイゼーションし たかどうかを検出する、ことを含んでなる、ＤＮＡ試料中のインスリン依存性真 性糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在または不存在を検出する方法に関 する。

本発明は、また、ＤＱ−ベータタンパク質の位置５７に相当するアミノ酸残基を 含んでなるエピトープを含有するペプチドに結合する抗体であつて、前記抗体は ヒト永続性ウィルス病原体によりコードされる相同性ペプチド配列との交差反応 性を有し、そして前記アミノ酸残基はアラニンおよびバリンから成る群より選択 される、抗体に関する。前記抗体は、好ましくは （ａ　）　Ｇａｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　％（ｂ　）　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　、および（ｃ　）　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　。

から成る群より選択されるペプチドに結合する。さらに、ウィルスの病原体は、 好ましくは、エプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス、風疹ウ ィルス、コクサラキーウィルス、サイトメガロウィルス、およびレオウィルスか ら成る群より選択される。

なおさらに、本発明は、工程： （ａ）試料を抗体の１または２以上の存在下にインキュベーションし、前記抗体 は、 （ａ　）　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　。

（ｂ　）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　、および（ｃ　）　Ｇｌ ｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　。

から成る群より選択されるペプチドに結合し、前記抗体は検出可能な部分で標識 されており、そして（ｂ）前記部分を検出する、 ことを含んでなる、タンパク質試料中のインスリン依存性真性糖尿病に対する感 受性に関連する配列の存在または不存在を検出する方法に関する。ＩＤＤＭ関連 配列を検出する前記方法は、標識した抗体とのインキュベーションの前、間、ま たは後に、前記試料をモノクローナル抗体の存在下にインキュベーションし、こ こで前記モノクローナル抗体は固体の支持体に固定化されておりそして （ａ　）　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　。

（ｂ　）　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　、および（ｃ　）　Ｇｌ ｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　。

から成る群より選択される１又は複数のアミノ酸配列に結合する、方法を包含す る。

本発明は、さらに、工程： （ａ）血清試料をＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ、　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ 　Ａｌａ　Ａｌａ。

およびＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａから成る群より選択されるペプ チドの１または２以上の存在下にインキュベーションし、（ｂ）前記ペプチドと 前記血清試料中に存在する抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出し、 そして（Ｃ）工程（ｂ）の結果から、感受性のハブロタイブが存在するかどうか を決定する、 ことからなる、血清試料中のインスリン依存性真性糖尿病に対する感受性に関連 するハブロタイブを同定する方法に関する。前記方法において使用するペプチド は、検出可能な成分で標識し、そして検出は酵素反応、蛍光性または発光の放射 により行うことができる。

本発明は、さらに、前述の抗体およびペプチドの予防的または治療的使用に関す る。

他の面において、本発明は、ＤＮＡ試料中のインスリン依存性真性糖尿病または 尋常性天庖渣に対する感受性に関連する配列の存在または不存在を検出するキッ トを提供し、前記キットは、包装された形態で、上に特定したＤＮＡ配列の１ま たは２以上と、またはそれに対する相補性のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーション することができる、各標識した配列特異的ＤＮＡプローブにつき１つの容器を有 する複数の容器からなる。

最後の面において、本発明は、タンパク質試料中のインスリン依存性真性糖尿病 または尋常性天庖癒に対する感受性に関連するアミノ酸配列の存在または不存在 を検出するキットを提供し、前記キットは、包装された形態で、上に同定したア ミノ酸配列の１または２以上と結合する検出可能な成分で標識した各抗体につき １つの容器を有する複数の容器からなる。

前述のように、Ｉ　ＤＤＭに対する遺伝学的感受性は、族および集団の研究にお いて、血清学的マーカーのＨＬＡ　ＤＲ３およびＤＲ４の存在と相関関係づけら れている。ＩＤＤＭの最高の危険は、ＨＬＡ　ＤＲ３，４へテロ接合体に関連し 、これらの２つのＤＲ型に関連する感受性対立遺伝子は異なることができ、そし てＩＤＤＭに対する高い危険のために２つの投与が要求されうろことが示唆され る。従来の制限断片長多形性の分析は、ＤＲ３およびＤＲ４を各２つのサブセッ トに再分類した。

同様に、前述のように、ｐｖに対する遺伝学的感受性は、血清学的マーカーであ るＨＬＡ　ＤＲ３およびＤＲ４の存在と相関関係づけらだ。従来の制限断片長多 形性の分析は、ＤＲ３およびＤＲ４ハブロタイブに再分類した。

ここにおけるＨＬＡ遺伝子の分子分析はミＨＬＡ　ＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲｗ ６血清学的型をさらに再分類し、そして新規な、より情報に冨む、かつより正確 に定義されたＩＤＤＭおよびＰｖに対する感受性のマーカーの生成をもたらした 。ここにおける分子技術が示すところによれば、クラスＩＩの遺伝子座の数が予 想外に多いばかりでなく、これらの遺伝子座における対立遺伝子変化が血清学的 型分けにより定義される多形性系列より大でありそしてより正確に位置付けする ことができる。

第１図は、実施例ＩＩＩに従い増幅されたＤＲ−ベータ断片ＰＣＲ（ポリメラー ゼ鎖反応）の配列を示す。ＰＣＲプライマーの配列は長い矢印により示されてお り、この矢印は、また、ポリメラーゼによる伸長の方向をも示す。破線は、クロ ーニングのための制限部位の発生のために使用されたＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌ の認識配列を示す。第２エクソン配列の開始は短い矢印により示されており、そ してＤ−１０配列特異的オリゴヌクレオチドＧＨ７８に相当する断片の領域は括 弧セグメントにより示されている。ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによる消化は、ク ローニングのための２４８ｂＰの断片を生成した。ここに示す配列は、ＤＲ４１ ０ハブロタイブからのプロトタイプのＤＲＢＩ対立遺伝子を表す。

第２図は、標準的１文字アミノ酸コード（参照、下表ＶＩＩＩ）を使用する３つ の尋常性天庖ｊｆ（Ｐｖ）（参照、実施例ＩＩＩ）からおよびＤＲ−ベータプロ トタイプ（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ　ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　。

益：　２６４２−２６４６（１９８６）　）からの）ＩＬＡ　ＤＲ−ベータ第２ エクソンについてのアミノ酸配列を示す。ＤＲ４０ｗ４ハブロタイブからのＤＲ −ベーター■対立遺伝子の全体のアミノ酸配列が示されており、これに対して他 の配列はそれと整列されており、ダッシュで相同性を示し、そして文字で多形性 アミノ酸を示す。ＤＲ型（および適当ならばＤ−型）およびＤＲ−ベータの割り 当てを各配列の右端に示す。「Ｉ」はＤＲ−ベーター■遺伝子を意味し、ｒｌｌ Ｉ　ＪはＤＲｗ５２特異性をコードするＤＲ−ベーター１１１遺伝子座を意味し 、そしてｒｌＶＪはＤＲｗ５３の特異性をコードするＤＲ−ベーター■ｖを意味 する。ＰＣＲクローニングにより得られる断片は、ｃＤＮＡクローンから誘導さ れるプロトタイプの配列より小さい。

第３図は、第２図のコンベンション（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）に従い３人のＰｖ 愚者のＨＬＡ　ＤＲ−ベータ第２エクソンからのアミノ酸配列を示し、ここで配 列は、ｃＤＮＡクローンからのＤＲ４ＤＱ−ベーター３．１およびＤローベータ ー３．２のプロトタイプ配列と整列されている。旧ｃｈｅｌｓｅｎ　ら、Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｉｎｖ、　７９　：　１１４４　１１５２（１９８７）　；　Ｇｒｅｇ ｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａ　、各配列の右において、ＤＲ型およびＤ Ｑ−ベータ型が存在する。ＰＣＲクローニングにより得られるＤＱ−ベータ配列 は、プロトタイプ配列より短い。

第４図は、ＨＬＡ　−ＤＱ−ベータタンパク質の整列を示す。ＤＱ−ベータの対 立遺伝子を標準的１文字アミノ酸コード（下表ＶｉｌＮ）に翻訳し、そして相同 性のパターンを示すために整列しである。ダッシュはプロトタイプのＤローベー タ（ＤＲ４）対立遺伝子中の同等のアミノ酸との相同性を示す、ブランクは配列 が決定されなかっ゛たことを示す。ＰＣＲ増幅のプライマーの位置を下部に示す 。ＰＣＲの増幅手順は、オリゴヌクレオチドプライマー間の配列を決定するだけ である（Ｓｃｈｒｆ　ら、５ｃｉｅ−ｎｅｅ、２３３　：　１０’７６−１０７ ８（１９８６）　”ｌ　、各配列の由来は各線の左に表示し、そしてそのＤＲ血 血清学現型右に示す、　ＤＲ型の後の星印は、ＩＤＤＭをもつ患者からの対立遺 伝子が決定されたことを示す。ｐｖ患者からのＨｕ１２９配列が決定された。一 番右に対立遺伝子の表示が存在し、可能であればハブロタイブのＤＱＷ型決定に 相当する。１）ＣＢ４配列はＬａｒｈａｍｍａｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８０ ニア３１３−７３１７　（１９８３）からののものであり、　ＣＦ’ｉＣＣおよ びＭＭＣＣはｋｌｏｒｎら、１９８８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　８５　：　６０１ ２−６０１６からのものであり；ＤＱ、Ｂ３７　はＭｉｃｈｅｌｓｅｎ　ら、Ｊ 、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖ、　７３：　１１４４　１１５２（１９８７）（ＵＳＡ）、 ８１　：　５１９９−５２０３（１９８４）からのものであり；ＢｔＪＲＫはＫ ａｒｒら、３．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｑ　：　３４．０５　３４０９（１９８５） からのものであり；ＤＱＢＳ４およびＤＱＢＳ５はＴｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｉｍ ｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　２５　：３４３−３４．６　（１９８７）からの ものであり、　ＡＺＨ，、ＢＧＥ、およびＰＧＦはＬｅｅら、　Ｉ＋＊ｍｕｎ’ ｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　２６　：　８５　９１　（１９８７）からのものであり ；そしＴ関係するＤＸ−Ｃ−夕配列は０ｋａｄａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　。

８２　：　３４１０−３４１４（１９８５）カラ（７）モ（７］？アツタ。ＰＧ Ｆニツいテ示したＰＣＲ配列は、発表されているｃＤＮＡと一致した。２人のＩ ＤＤＭ患者について報告されているＤＱＢの対立遺伝子、ＤＣおよびＪＲは、３ ４人のＤＲ４患者において観測された唯一のＤＱＢ３．１対立遺伝子であった。

第５図は、ＨＬＡ　−ＤＲ−ベータタンパク質の配列の整列を示す。ＤＲ−ベー タの対立遺伝子のＤＮＡ配列を標準的１文字アミノ酸コード（後記の表Ｖｌｌｌ ）に翻訳し、そして相同性のパターンを示すために整列させである。使用したコ ンベンションは上の第４図についての記載において説明したのと同一である。さ らに、下記の実施例Ｉを参照のこと。

ここに報告される対立遺伝子の多様な配列を普通の）ＩＬＡの分類と比較し、そ して現在の００ｗ血清学的特異性と配列パターンとの間の対応に基づく新しい命 名方を使用する。詳しくは、ＤＮＡで定義されたＤＱＢＩ、ＤＱＢ２およびＤＱ Ｂ３は、それぞれ、血清学的に定義したＤＱｗｌ、ＤＱｗ２および００ｗ３に由 来する配列を表示するが、ＤＱＢ４はＤＱ　（ブランク）ハブロタイブに由来す るものを表示し、これは明らかに均質である。このような命名において、遺伝子 座およびタンパク質産生物（例えば、ＤＱ−ベータ鎖をコードするＤＱ−ベー・ 夕遺伝子座）についてギリシャ文字のコンベンションを使用し、そして特異的対 立遺伝子配列変異型を表示するためにローマ字の大文字および引き続く数字（例 えば、ＤＱＢ２対立遺伝子）を使用する。このような型を再分類する配列の変異 型は、サイプタイプの数字により表示する（例えば、ＤＱＢｌ、２およびＤＱＢ ｌ、３）　。

しかしながら、ＤＱアルファ対立遺伝子変異型の表示は、ＤＱｗの特異性に常に 相当するおはかぎらない；例えば、ＤＱＡＪ型はｐＯ−２およびＤロー３ハブロ タイブの両者に関連する。なぜなら、Ｄ（ｈ２および００ｗ３の特異性は、アル ファー領土の対立遺伝子の相違に対して独立に、ベータ領土の多形性エピトープ により決定されるように思われるからである。

自己免疫病に「積極的に関連する」とは、ここで使用するとき、マーカーの頻度 が対照（病気をもたない個体）に比べて病気をもつ患者において増加することを 意味する用語である。逆の意味は、自己免疫病に「消極的に関連する」に通用さ れ、これはマーカーの頻度が対照に比べて患者において減少することを意味する 。

用語「オリゴヌクレオチド」は、ここで使用するとき、２またはそれ以上の、好 ましくは３より多いデオキシヌクレオチドまたはりボヌクレオチドから構成され た分子として定義される。その正確な大きさは多数の因子に依存し、そしてこれ らの因子は究極の機能またはオリゴヌクレオチドの用途に依存する。オリゴヌク レオチドは合成的にあるいはクローニングに由来することができる。

用語「配列特異的オリゴヌクレオチドＪ　（ＳＳＯ）は、対立遺伝子の多様性が 起こることができる遺伝子座の領域である、同定される特異的ＤＮＡ配列の１つ にハイブリダイゼーションするであろうオリゴヌクレオチドを意味する。このよ うなオリゴヌクレオチドは、検出されるＤＮＡ領域の１または２以上にまたがる 配列を有し、そして検出される領域の１または２以上に対して特異的である。後 述するように、１つの配列特異的オリゴヌクレオチドが検出すべき各配列につい て使用される。

用語［モノクローナル抗体」は、ここで使用するとき、単一の抗体産生細胞から の有糸分裂を経て誘導されるクローン集団（またはクローン）により産生される 免疫グロブリン組成物を呼ぶ。特記し、ない限り、この用語は特定の哺乳動物の 種またはアイソタイプの抗体に、あるいは所定の方法で調製される抗体に限定さ れることを意図しない。この用語は全抗体分子ならびに抗原結合断片（例えば、 Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’　）ｚ＋Ｆｃ５Ｆｃ’　）を包含する。

「抗体産生細胞系」は、多数の世代にわたって生体外で安定に増殖することがで きる、単一の抗体産生細胞からの有糸分裂を経て誘導されるクローン集団または クローンである。

用語「細胞系」は、ここに呼ぶ細胞系の細胞から誘導される限り、個々の細胞、 収得された細胞、および細胞を含有する培養物をも意味する。好ましくは、細胞 系は少なくとも約６月間生存能力を維持し、そして少な（とも約５０の継代培養 を通して特定のモノクローナル抗体を産生ずる能力を維持する。

ここで使用するとき、用語「インキュベーション」は、免疫複合体とも称される 抗原／抗体複合体の形成を可能とする条件（例えば、適切なｐｎ、温度、時間、 培地など）下に、抗体および抗原を接触することを意味する。また、ここで使用 するとき、「分離」は、組成物を試験支持体または固定化した抗体から分離し、 こうして組成物中の非結合の抗原または抗体を除去しそして支持体上の免疫複合 体を無傷に維持する方法であって、通常洗浄を呼ぶ。適当なインキュベーション および分離技術の選択は、この分野においてよく知られている。

ＨＬＡクラス■１ベータ遺伝子はＨＬＡ型のＩＤＤＭ患者およびＨＬＡ合致対照 から分離され、そして配列決定されたものであり、そして種々の組み合わせで存 在しかつＩＤＤＭに関連する特異的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の領域をも たらした。これらの特異的配列をＤＮＡまたはタンパク質の診断法において使用 して、ＩＤＤＭに対する遺伝学的怒受性を決定することができる。

ＩＤＤＭに関連することが発見された４つのＤＲ−ベータ配列Ａ−Ｄを下に示す 。各場合において、糖尿病のゲノム中に見られるＤＮＡ配列は、ＯＲ−ベータタ ンパク質の１〜３アミノ酸残基（下線）の変更を生成する。これらのタンパク質 中に通常見いだされるアミノ酸は括弧で示す。配列Ａ−ＣはＤＲ−ベーターＩＩ Ｉからのものであり、これに対して配列りはＤＲ−ベーターエ領域からのもので ある。配列りは下に説明するｒｌ−ＤＪ　Ｅ　Ｃ位１６８　、７１および７２に おけるイソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を包含する。

下表■は、ＤＲ３およびＤＲ４ハブロタイブ内のＩＤＤＭの感受性およびＤＲ− ベータの多様性を示す。表ＩＩは、上に同定したハブロタイブおよび配列Ａ−Ｄ の間の相関関係を示す。配列Ａ。

ＢおよびＣは、Ｂ８、ＤＲ３対非Ｂ８、ＤＲ３ハブロタイブと相関関係する。

ＤＲ−ベーターＩ　非変動　変動（５）ＤＲ−ベーターＩＩＩ　変動（２）　非 変動１二」１ 前述の欧州特許発行筒２３７，３６２号は、ドツトプロットのフォーマットにお いてＰＣＲ増幅したＤＮＡにハイブリダイゼーションする対立遺伝子特異的オリ ゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用することによって、対立遺伝子配列の変動を分 析する一般的方法を開示している。この刊行物は、種々のＦＩＬＡ型の個体、Ｉ 　ＤＤＭ患者または対照、からのいくつかのＨＬＡクラス１１（例えば、ＤＲ− ベータ、ＤＱ−アルファ、およびＤＱ−ベータ）遺伝子のＰＣＲクローニングか ら誘導された、ある特異的ＤＮＡおよびタンパク質翻訳の配列を列挙する。ＰＣ Ｈにより同定されかつＰＣＲ／ドツトプロット／ＡＳＯ分析により検出可能な、 このようなりＮＡ配列は、病気の感受性または弁別診断のために有用なマーカー として機能することができる。ＤＮＡおよび翻訳配列の１つのこのような情報を 与える組は、下表ＩＩＩおよびＩＶに示すＤＱ−ベータ配列であり、これらの表 は、それぞれ、ＨＬＡ−ＤＱ−ベータ領域における多数の対立遺伝子変異型につ いてのＤＮＡおよびアミノ酸翻訳配列を列挙する。その中の表示ＤＲ４、ＤＲ４ ’またはＤＲ４”は、それぞれ用語ＤＱＢ３．２、ＤＱＢ３．１およびＤＱＢ４ 　（ブランク）と同等である。

、表−ユＵ− ＨＬＡ−ＤＱ−ベータ（セグメントＡ）：ＨＬＡ−ＤＱ−ベータ（セグメントＢ およびＤ）：＋−セグメントＤ７−＋　＋−−−−セグメントＢ−−−−−−＋ ＨＬＡ−ＤＱ−ベータ（セグメントｃ）：詳しくは、表ＩＩＩおよびＩＶにおい てＤＲ４（ＤＱＢ３．２）およびＤＲ４’　（ＤＱ８３．１）として列挙されて いる、血清学的に定義されたＤＲ４ハブロタイブの２つの変異型についての配列 はとくに情報に冨む、ＤＲ４ハブロタイブのこのＤＱ−ベータ再分類はＤＱ−ベ ータのＲｓａｌ　ＲＦＬＰと相関関係をもち、ここで１つのＤＲ４変異型は１． ８　ｋｂのＲｓａｌ断片を有し、そして他のものは１．５ｋｂのＲｓａｌ断片を 有した（Ａｒｎｈｅｉｍら、前掲）、下表Ａに示すように、ＤＲ４の個体のうち で、１．５　ｋｂ　（ＤＲ４）はＩＤＤＦｌに積極的に関連し、これに対して１ ．８ｋｂの断片（０１１１４’　）はＩＤＤＭに消極的に関連することが発見さ れた。

ＤＲ４３４／４６　１５１５７　７．９ＤＲ４３２／４６　１０１５７　１０． ８（１，５ｋｂ、ＤＱ８３．２） ＤＲ４（ＤＱＢ３．２）およびＤＲ４’　（ＤＱＢ３．１）配列は、３つの異な るアミノ酸の変化生ずる５つのヌクレオチドの置換により異なる。変化の２つ（ コドン４５におけるＧ１ｙ対Ｇｌｕおよびコドン５７におけるＡｌａ対Ａｓｐ） は、非保存性であり、そして主要な電荷の差を有する。アスパラギン酸に対して コドン５７においてバリンまたはアラニンの存在は、ＩＤＤＭに対する感受性に 積極的に関連すると考えられる。

１１１ＱＢ３．１およびＤＱＢ３．２と表示する、ＤＲ４ハブロタイブにおいて 見られるＤＱ−ベータの対立遺伝子間の最も異なる差の１つは、位置５７におい て見いだされる。（ここで使用する番号はブロセシグされたタンパク質中のアミ ノ酸に相当する。）ＩＤＤＭの感受性に関連しないＩＩＱ８３．１のハブロタイ ブにおける対立遺伝子は位置５７においてアスパラギン酸残基を有し、これに対 してＩ　ＤＩ）Ｍの感受性に強くに関連するＩ］ＱＢ３．２のハブロタイブにお ける対立遺伝子は位置５７においてアラニン残基を有する。さらに、ＩＤＤＭに 積極的に関連するＤＲ３ハブロタイブは位置５７にアラニンを有する。ＩＤＤＭ に消極的に関連するＤＲ２ハブロタイブは、また、位置５７にアスパラギン酸残 基を有する。

また、ＤＲｗ６における２つのＤＱ−ベータの対立遺伝子の２つのうちで、ＩＤ ＤＭに積極的に関連する対立遺伝子は位置５７にバリンを有し、これに対してＩ ＤＤＦｌに消極的に関連する対立遺伝子は位置５７にやはりアスパラギン酸を有 することが発見された。なおさらに、ＩＤＤＭに中程度に関連するＤＰＩハブロ タイブはＤローベータ遺伝子座において位置５７にバリンを有することが発見さ れた。

このような観察に基づいて、位置５７におけるアミノ酸の変動のパターンはＩＤ Ｄｔｌに対する感受性のパターンと平行することが決定された。位置５７にアラ ニン（疎水性残基）を含有する対立遺伝子はＩＤＤＭと最も高度に関連し、位１ ．５７にバリン（疎水性残基）を含有する対立遺伝子はＩＤＤＭと中程度に関連 し、そして位置５７にアスパラギン酸（帯電した残基）を含有するアレルはＩ　 ＤＤＭに消極的に関連する。

このパターンに対する主要な例外はＤＲ７Ｒ７ハブロタイブＱＢ２対立遺伝子で あり、これはＤＲ３ハブロタイブと同様に位置５７にアラニンを有し、ＩＤＤＭ の感受性に関連しない。

このようなパターンは他の遺伝子にまた拡張する。例えば、ＤＲ３ハブロタイブ 内のＤＲ−ベーターＩＩＩ遺伝子の対立遺伝子は、増加したＴＤＤＭの感受性と 相関関係をもち、位置５７にバリンを有するが、これに対して他のＤＲ−ベータ 対立遺伝子の大部分は位置５７にアスパラギン酸を有する。こうして、ＤＲ−ベ ーターＩＩＩ対立遺伝子の位２５７における疎水性バリンならびにＤＱ−ベータ 対立遺伝子中の疎水性アラニンは、ＩＤＤＭの感受性に関連する。

下表■は多数の遺伝子中の位置５７付近に見いだされる配列を要約する。表■の 星印は最大のＩ　００Ｍ感受性に関連するハブロタイブを示す。

議ニー■ 位置５７におけるＭＨＣクラスＩＩベーベーンパク質の多様性ＤＱ−ベータ：　 位置５７ およびそれらをコードするヌクレオチド配列は下表Ｖｌに列挙する。また、その 中に、ヌクレオチドおよび位置５７付近のアミノ酸の翻訳配列が列挙されており 、ＩＤＤＭの感受性に消極的に関連する対立遺伝子を示す、コドン５７はその中 に下線を施されている。

表Ｖｌ中の配列は、アラニン、バリンまたはアスパラギン酸をコードする位置５ ７におけるコドンの同一性を直接検出するために使用することができる、ＨＬＡ 　ＤＱ−ベータ対立遺伝子からのマーカーＤＮＡ配列であると考えられる。

ＤＱ−ベータタンパク質中の位置５７付近の配列はＩＤＤＨの感受性に最も積極 的に関連するが、それに対して直接ハイブリダイゼーションするマーカー配列が オリゴヌクレオチドのプローブ中の包含されることは最適でないことがある。Ｄ Ｑ−ベータ対立遺伝子は他の領域で異なり、そして他の遺伝子座例えば、ＤＱア ルファアレル、に害接に関連するので、ＤＱ−ベータアレル対立遺伝子の位置５ ７のアミノ酸の同一性は、ＤＱ−ベータ、ＤＱアルファまたは他のＨＬＡ　Ｄ　 領域の他の領域にハイブリダイゼーションする１または２以上のオリゴヌクレオ チドのプローブを使用する間接のＡＳＯ分析により決定することができる。さら に、このような同定は１または２以上のプローブを使用することによって達成す ることができ、ここで１つのプローブは位置５７付近の領域にハイブリダイゼー ションし、これに対して１または２以上の他のプローブはそれと不平衡の結合で 他のＨＬＡｉｌ域にハイブリダイゼーションする。

例えば、ＤＲ３ハブロタイブはＩＤＤＭの感受性に強く関連し、そしてＯＱ−ベ ータにおける位置５７のアラニンを含有する。こきるが、ＤＱ−ベータのそのセ グメントのＧ／Ｃに冨んだ性質は、それに関連する塩基の不一致の可能性のため に、最適ではないプローブに導く。しかしながら、ＧＨ７０ＡＳＯプローブは、 Ｇ／Ｃに富んでない領域におけるコドン５７から約９０ｂｐ上流の領域に対して 特異的であり、こうして位置５７のセグメントについての直接のプローブの塩基 の不一致の問題を回避する。

こうして、Ｇｌ（７０ＡＳＯプローブの結合は、コドン５７がアラニンをコード するＤＱ−ベータ対立遺伝子を間接的に同定する。

ＤＱ−ベータのコドン５７の位置からなおさらに離れたプローブも、使用するこ とができる０例えば、ＧＨ６６ＡＳＯプローブは、ＤＱ−ベータから約１２ｋｂ ｐ離れて位置する、ＤＱアルファ位置のＤＲ３対立遺伝子に対して特異的である 。しかしながら、ＤＱアルファ位置のＤＲ３対立遺伝子はＤＱ−ベータ位置のＤ Ｒ３対立遺伝子と絶えず結合することが示されるので、ＧＨ６６プローブの結合 はＤＱアルファＤＲ３対立遺伝子ばかりでなく、かつまたＤＱ−ベータＤＲ３対 立遺伝子をも同定する。ＤＱアルファ位置の使用は、また、ＩＤＤＭ感受性ＤＲ ３ハブロタイブと感受性が低いＤＲ７Ｒ７ハブロタイブ間の識別を提供する。

他の自己免疫病に対する感受性もまた、コドン５７の多形性に関係づけることが できる。尋常性天庖癒に対するＤＲｗ６の感受性は希なりＱ−ベータ対立遺伝子 （ＤＱＢｌ、３）に関連し、後者は位置５７の電荷の差異によってのみ非感受性 対立遺伝子ＤＱＢ１．２およびＤＱＢｌ、１と異なり、そしてＤｗ９およびＤＲ ｗ６のサイプタイプと相関関係を持つ。同様に、腹腔の病気の患者においてのみ これまでこうして見いだされたＤＰ−ベータ対立遺伝子は、ホモ接合性型決定細 胞（ＨＴＣ）において見いだされる対立遺伝因子と、位２５７においてＡｌａ− Ａｓｐの置換により異なる。腹腔の病気は、グルテンを含有する食物の消化が関 与する、子供および大人の両者に影響を与える吸収不良症候群により特徴付けら れる消化疾患であり、その病因は知られていないが、遺伝因子が関係づけられて いる。

実施例ＩＩＩにおいて、３人のＰν患者からのＤＲ−ベータ■、ＤＱ−ベータＩ ＩおよびＤＱ−ベータ遺伝子座の多形性第２エクソンを配列決定して、特異的多 形性クラスＩＩのエピトープとの可能な病気の関連性を認識することを記載する 。　ＤＱ−ベータ遺伝子座において、４つのＤＲ４ハブロタイブの３つは対照Ｄ Ｒ４ハブロタイブの６０〜８０％に存在するＤＱＢ３を含有し、そしてｆｏハブ ロタイブの１つは対照ＤＲ４ハブロタイブの約２０〜４０％に存在するＤＱ８３ ．１対立遺伝子を含有ていた。Ｅｒ１ｉｃｈら、組織適合性の抗原の分子の分析 （Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＨｉｓｔｏｃｏｍｐａ ｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）＋ｐｐ、９３−１０９（Ｓｃｈａｃｔｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、纒、Ｋｉｍ　ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　、（１９８５）斂：　８１ ３９−８１４３．　２つのＤＲ５ハブロタイブは、また、すべての対照ＤＲ５ハ ブロタイブ上に存在するＤＱＢ３．１アレルの配列変異型を含有した。こうして 、ＤＱ−ベータ対立遺伝子の分布は患者およびＤＲ一致対照において本質的に同 一であった。この小さい試料において、すべての３人の患者はＤＱＢ３．１　／ ＤＱＢ３．２へテロ接合体であった。

しかしながら、ＤＲ−ベーター１遺伝子座において、潜在的に興味あるパターン を認識することができた。３人のすべてのＰｖ患者はＭＬＣ定義されたサイプタ イプ、ＤＷｌ、Ｏｌに関連するＤＲ−ベーター■対立遺伝子配列の変異型をもつ ＤＲ４ハブロタイブを含有した。米国の人口において、ＤＲ４ハブロタイブの中 のＤＷＩＯサイプタイプの頻度はほぼ１０％であると推定される。

Ｈａｎｓｅｎら、Ｂｒ１ｔ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、　（１９８７）４３　：　２０ ３−２１６　、この観察は配列の分析よりむしろオリゴヌクレオチドのプローブ を使用して確証され、ＤＲ４ＰＶ患者の事実上１００％はＤＷＩＯエピトープを 含有した。このエピトープは？ＩＬＣで定義される型、ＤＷＩＯｌに関連するの で、それはＴ細胞受容体により認識するように思われる。これらの結果が示唆す るように、ＤＲ４関連感受性について、ＤＲ４ＤＲ−ベーター１鎖の位置６８． ７１、および７２におけるアミノ酸残基のイソロジン、アスパラギン酸およびグ ルタミン酸はＰｖ自己免疫においである役割を演する。このような残基はここに おいてｒ　Ｉ−ＤＥＪエピトープとして同定されるエピトープを定義する。実施 例ＩＩＩを参照のこと。

実施例■ｖに示すように、コドン７０付近の同−ｒ　Ｉ−ＤＥＪエピトープはま た、ＤＲｗ６ハブロタイプのサブセラＩ・上にも存在するが、このエピトープは このようなりＲｗ６ハブロタイプにおけるＰｖに積極的に関連することが示され なかった。エピトープを共有するｒ　Ｉ−ＤＥＪはＤＲｉｅ６の感受性を説明す ることができなかったので、それ以上の研究を実施して、実施例ＩＩＩに例示す る方法による２つのＤＲ５／ＤＲｗ６　ＰＶ患者のＤＱ−ベータ対立遺伝子の配 列を決定することによってＤＲｗ６ハブロタイプ内のｐｖ感受性を与える配列を 発見した０両者の患者のＤＲｗ６ハブロタイブは従来未知のＤＱ−ベータ対立遺 伝子を含有することが発見され、後者の対立遺伝子はＤＱＢｌ、３と称した（第 ９図のＨ１ｌｉ２９配列を参照のこと）。ＤＱＢｌ、３対立遺伝子は、ＤＲＩ　 ＤＱ−ベータ対立遺伝子ＤＱＢ１．１から、位置５７におけるバリン対アスパラ ギン酸の置換のみにより異なる。同様にそれは、ＤＲ２ＤＱ・−ベータ対立遺伝 子ＤＱＢ１．２から、位置５７におけるセリン対アスパラギン酸の置換のみによ り異なる。ヌクレオチドのレベルにおいて、ＤＱＢｌ、３対立遺伝子は位置５７ 付近の領域において！ＩＲ２０ｗ１２（ＤＱＢｌ、５）対立遺伝子と同一であり 、そして最も普通のＤＲｅｙ６　ＤＱ−ベータ対立遺伝子ＤＱＢｉ、６と同一で ある。

ｐｖ患者及び対照の０Ｒ−６ハブロタイプの間のＤＱＢｌ、３対立遺伝子の頻度 を決定するために、配列特異的オリゴヌクレオチド（５５０）プローブの対を使 用して、ＤＲ１様ＤＱ−ベータフレームワーク配列及びコドン５７付近の配列と の両者を同定した。例示されるＳＳＯのプローブは次の通りである：（１）　Ｇ Ｈ６９：ＤＲ１様ＤＱ−ベータ骨組をフレームワーク同定するものであり、そし てヌクレオチド配列ＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＡＣＣＣＣＧを有する２１ マー； （２）　Ｇ）１６０：ＤＲｗ６様フレ一フレームワークするものであり、ソシテ ヌクレオチド配列ＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣを有する１９７（３ ）　ＣＲＸＯ３：コドン５７がアミノ酸をコードしている、コドン５７付近の配 列を同定するものであり、そしてヌクレオチド配列ＴＣＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣ ＧＣＣＣＴを有する１９マー；および（４）　ＣＲＸＯ２：コドン５７がバリン をコードしている、コドン５７付近配列を同定するものであり、そしてヌクレオ チド配列ＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴを有する１９マー。

上に表示したプローブを使用して、ハイブリダイゼーションパターンを用いて特 異的対立遺伝子を同定しかつ区別することができる。次のチャートはこのような 方法の使用を例示し、ここでプラスのサイン（＋）は標的ＤＮＡ試料へのｓｓｏ プローブのハイブリダイゼーションを示す。

プローブ アレル　ＧＨ６９Ｇ）１８０　ＣＲＸＯ３ＣＲＸＯ２Ｄｗ９１．３　＋　÷ １．１　＋　＋ ０ｗ１８１．６　÷　＋ ０ｗ１９１．７　＋　＋ このアプローチにおいて、１３人のＤＲｗ６患者の内の１１人のハブロタイブ（ ８５％）はＤＱＢｌ、３対立遺伝子を含有したが、これに対して１３人の対照Ｄ Ｒｗ６ハブロタイプの１つ（８％）のみがＤＱＢｌ、３対立遺伝子を含有してい た。他の２人のＤＲｗ６の患者は、ＤＩ’ｌ　ｌ様フレームワーク（ＧＨ６９に より同定された）を有したが、ＣＲＸＯ３またはＣＲＸＯ２の両者のプローブと ハイブリダイゼーションできないＤＯ−ベータ対立遺伝子を有することが明らか にされた。

これらの知見が示すように、ＤＲｗ６関連ｐｖ惑受性は、普通のＤＱ−ベータ対 立遺伝子ＤＱＢ１．１と１つのみの残基により異なる。

希なりＱ−ベータ対立遺伝子ＤＱＢ１．３により付与され得るようである。ＤＲ ｗ６関連ｐｖ感受性に関連するＤＱ−ベータ鎖の位置５７における多形性のこの ような単一の電荷の差は、ＩＤＤＭについてのＤＲ４およびＤＲ３関連感受性に ついて発見されたものと相関関係をもつ。しかしながら、Ｐｖの場合においては 、感受性を与えるのは位置５７付近のエピトープよりむしろ対立遺伝子であるこ とが明らかである。なぜなら、Ｐｖに関連しない最も普通のｄ６ＤＱ−ベータ対 立遺伝子であるＤＱＢｌ、６は位置５７付近に同一の配列を有するからである。

ＤＱＢｌ、６対立遺伝子はその配列の他の領域において異なる（第４図を参照の こと）ので、直ぐ上に示したように、ＳＯＳプローブ、例えば、ＧＨ６９，ＧＨ ８０゜ＣＲχ０３、およびＣＲＸＯ２プローブ、の対の使用により希なりＱＢｌ 、３対立遺伝子からＤＱＢｌ、６の普通の対立遺伝子を区別することができる。

新規なりＱ−ベータ対立遺伝子がｐｖに対するＤＲｗ６関連惑受性を説明すると い・）結論は、５ｆａｚｅｒら、前掲（１９８７）のＤＱ−ベータＲＦＬＰ分析 と一致する。

ＤＱ−ベータの対立遺伝子の多様性のパターンは自己免疫素因における位置５７ と明らかに関係するが、これの領域は自己免疫病に寄与するハブロタイブを与え る感受性内の唯一のクラスＩＩエピトープであると思われない。クラスＩＩ配列 はＩＤＤＭにユニークに関連することは見出されなかった。その観察が示唆する ところによれば、「通常の」クラスＩＩ対立遺伝子が感受性を与えるか、あるい は感受性遺伝子がＭＨＣ中のどこかに存在する。　ＩＤＤＭについての浸透度（ ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ）および一致（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ）の推定（モノ接 合性の双子について５０％、およびＨＬＡの同一の子孫について２５％）が与ら れているので、（Ｈｅｎｓｅｎら、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、（１９８６）　 、影１２９−１３６）　、ある影響を受けない個体が推定上のクラスＩＩの感受 性遺伝子を含有することは驚くべきことではない。

ある環境的「トリガー」剤例えばウィルスの感染は、感受性の個体において病気 が発生するために要求されると思われる。ＤＱ−ベータ対立遺伝子とＩＤＤＭの 病原性において関係するウィルスである風疹との間の相同性は、ウィルスのトリ ガー機構を示唆する。

ウィルスはそれらの宿主の免疫防御を侵略する機構を発させ（ＭｃＣｈｅｓｎｅ ｙら、前掲Ｈ５ｒｉｎｉｖａｓａｐｐａら、前掲）、そしてこれらの機構のある ものは致死的なＭＢＣエピトープの模倣（＋＋＋１ｍ１ｃｒｙ）を含むように思 われる。相同性がＨＬＡ　−ＤＱタンパク質およびと０表Ｖｌは、そのゲノムに ついて完全に配列決定されているエビスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）に対 しての観測された主要な相同性を要約する。Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１ ０　：　２０７−２１１゜表−」上Ｌ ＨＬＡ−ＤＱ−ベータ対立遺伝子とＥＢＶとの間の相同性ＰＡＡＥＹ　７３７１ ３　Ｒ３１３７４ＢＯＬＰＩ＊　（３０７２ｂｐの「ＩＲｌ」反復の一部分とし て１２２回反復ている）＊＊（６回直接反復している） 完全ＥＢＶゲノム及びＤＱＢｌ、４（ＤＲ２）一対立遺伝子中の位置５７に集中 する潜在的エビトープペプチドの間に、１つのみの相同性が見られた。しかしな がら１．６つの合致がＤＲＢ２　（ＤＲ３）対多くは、直接６回反復する５アミ ノ酸の１つのセグメントを包含するＥＢＶゲノムの反復セグメントにおいて見い だされた。

さらに、風疹のＥ１エンベロープタンパクｔ　ＣＮａｋｈａｓｉ　ら、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｏ＋、、（１９８６）　、２６１　：　１６６１６−１６６２１） 、Ｉ　００Ｍ病原性に関係するウィルス（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、Ｄｉｂｅｔ ｅｓ、　（１９８２）、３ｉ：１０８８−１０９１　）は、位置２６１にＧＰＰ ＡＡペプチドを含有する。風疹ウィルスに胎児を暴露すると、先天的感染、およ び糖尿病に対する高い危険を導く。ウィルスの病原体（例えば、ＥＢＶおよび風 疹）とＤＱ−ベータペプチドＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕとの間の 相同性に基づいて、このような領域はまた、分子の類似性のための標的として働 き（Ｏｌｄｓｔｏｎｅら、前掲）、感染ウィルスへの免疫応答は自己の細胞への 攻撃を導く可能性がある。

さらに、ＥＢＶおよび風疹以外のウィルス、例えば、コクサラキーウィルスおよ びサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）　（Ｙｏｏｎら、５ｕｐｒａ）がＩＤＤＭと 関係づけられた。

これらのウィルスはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子を模倣しているように思われ、そし てとくにコドン５７付近のＨＬＡ　ＤＱ−ベーター遺伝子は、有効な免疫応答の 開始を遅延または変更する。免疫系が実際に、模倣されたＨＬＡエピトープに対 して応答する場合、免疫系の正常の調節は混乱され、自己免疫病を導くことがあ る。

自己免疫病は１系列の因子から生じうる：１）ウィルスにより模倣されるＨＬＡ 対立遺伝子の遺伝、２）宿主）ＩＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を模倣するウィルス による感染、３）模倣されたエピトープに対する宿主による免疫応答、４）自己 免疫応答の免疫調節の混乱、５）自己免疫の応答の発達、および６）自己免疫病 に導く進行性の組織破壊。

この機構の１例はＩ　ＤＤＭへの増加した危険との相関関係をもつＤＱＢ３−２ 対立遺伝子を遺伝的ムこ受↓すつぎ次いで風疹ウィルスにより感染される人をま きこむものであり、前記１・風疹ウィルスはＩＤＩＩＭとも相関関係をもち、そ して・ＤＱＢ３．２タンパク質の一部分を特異的に模倣するそのＥ１エンベロー プタンパク質中にエピトープを含有する。ウィルスによる感染の後、この人はＥ １タンパク質に対して向けられたそしてＤＱ８３．２タンパク質と交差反応性で ある抗体またはＴ細胞を包含する免疫応答を誘発する。この抗体またはＴ細胞の 応答はＨＬＡ　ＤＱタンパク質の正常の機能を妨害し、自己免疫応答およびＩＤ ＤＭを導く。

最後の自己免疫の標的は、ウィルスの感染の位置、この場合においてランゲルハ ンス小島のベータ細胞、により決定されるであろう。危険の程度の増加は確証す ることができるであろう。なぜなら、個体はＤＱＢ３．２対立遺伝子を存するこ とが示され、次いで風疹ウィルスによる感染され、次いで）ＩＬＡ　ＤＱ−ベー タタンパク質と交差反応性の抗風疹抗体が出現するからである。

自己免疫感受性に関連する対立遺伝子をもつ個体が自己免疫病に対する感受性に 相応して関連するウィルスにより感染されたかどうかを決定する診断試験（ＨＬ ＡクラスＩｌ対立遺伝子のセグメントに対する相同性を有するウィルスに基づく ）は、このような個体のための有効な予防または治療の処置のプランの決定に使 用することができるであろう０次いで、例えば、ワクチン、免疫毒素、免疫抗原 、模倣された領域のエビ）　−プに対応するペプチド、または抗イデイオタイプ 抗体を使用して、病原性生物により提供されるエピトープに対する免疫応答を防 止または逆転することができるであろう。

このような診断試験の１例は、Ｓｃｈｗｉｎｎｂｅｃｋら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、。

１６６　：　１７３−１．８１（１９８７）において報告されているように、免 疫応答（例えば、抗体または反応性免疫細胞の産生）を検出することであり、こ の方法においてはクラスＩ　ＨＬＡ分子Ｂ２７の一部分に対する抗体が合成ペプ チドを固体の支持体に取り付け、それを試験血清の希釈物で処理し、そして抗体 が保持されているかどうかを試験することによって検出される。このような診断 試験の他の例は、Ｋｗｏｋら、Ｊ、ν１ｒｏｌ、、　６１　：　１６９０−１６ ９４　（１９８７）においてＨＩＶ（ＡＩＤＳ）ウィルスを使用して実施された ように、ウィルスのＤＮＡゲノムについて直接ブロービングするか、あるいはＣ ＭＶ抗体についての凝集試験におけるように、感染から生ずる抗体について間接 アッセイすることによることができる。

ＤＲ４、ＤＲＷＩＯＤＲ−ベーターＩ対立遺伝子はＰＶおよびＩＤＤＭ（７）両 者に対する感受性に関連する。その対立遺伝子は、ＤＲ−ベーターｌ鎖の位置６ ８−７２付近の第３超可変領域（第５図においてＨＶ３；セグメントＤ）におけ るＩ−ＤＨアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。また、同一 の超可変領域（第５図においてＨＶ３；セグメントＤ）において多形性である、 他のＤＲ４ＤＲ−ベータＬｘ対立遺伝子は、位置６８−７２付近に配列ＧＧＡＧ ＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧを有しそして、また、ＩＤＤＭに関連する。こ うして、はとんどのＤＲ４＋１００Ｍの患者はＤＲ４，０ｗ４またはＤＲ４、［ １０であり、両者のＤＱ−ベータ対立遺伝子の変異型（上を参照）およびＤＲ− ベーターＩ対立遺伝子の変異型は自己免疫性に寄与する。０ｗ４変異型は、他の ＤＲ４、ＤＲ−ベーターＩ対立遺伝子から、配列特異的オリゴヌクレオチド（５ ５０）分析により区別することができる。

ＤＲ４ハブロタイブ、Ｄｉ＜４サイプタイプもまた、ＤＲ４，０ｗ１４のように 、慢性関節リウマチ（ＲＡ）に関連する。　Ｒｏｕｄｉｅｒら、カリフォルニア 州すンディゴにおける１９８７年１１月５−７日のアメリカリウマチ学会（Ｗｅ ｓｔｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ）の会合からのアブストラクツ（Ａｂｓｔｒａｃｔ） 、ｐ、１５゜０ｗ４を他のＤＲ４、ＤＲ−ベーター■対立遺伝子から区別する、 アミノ酸６９−７４におけるＤＲ−ベーター■鎖のＨＶａＳＮ域からのへキサペ プチドは、エプスタイン−バールウィルス（ＢＢＶ）のオーブンリーディングフ レームＢＡＬＦ４により共有され、そして分子の模倣性についての標的として働 （ことができる。

前述のＤＮＡ配列はＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ技術により検出する ことができる。排他的でない１つの例において、遺伝子のマーカーを含有するこ とが疑われる試料を１系列の膜上に直接スポツティングし、そして各膜を特定の 配列の相違に対して特異的である、異なる標識したオリゴヌクレオチドのプロー ブとハイブリダイゼーションさせる。試料を膜上にスポツティングする１つの手 順は、Ｋａｆｏｔｓら、Ｎｕｃ−１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ユ ニ　１５４１−１５５２（１９７９）に記載されている。

簡潔に記載すれば、膜に固定されたＤＮＡの試料は、ドデシル硫酸ナトリウム、 フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ）、血清アルブミンおよび種々の塩類を含有する予備ハ イブリダイゼーション溶液で、プローブの添加前に、予備処理することができる 。次いで、検出すべき各配列に対して特異的である標識したオリゴヌクレオチド のプローブを、予備ハイブリダイゼーション溶液に類似するハイブリダイゼーシ ョン溶液に添加する。ハイブリダイゼーション溶液を膜に通用し、そして膜をハ イブリダイゼーション条件に暴露し、前記ハイブリダイゼーション条件はプロー ブの型および長さ、成分の濃度などに依存する。一般に、ハイブリダイゼーショ ンは約２５〜７５°Ｃ１好ましくは３５〜６５°Ｃにおいて０．２５〜５０時間 、好ましくは３時間より短い時間の間実施する。ストリンジエンシーが大きくな るほど、プローブと試料との間のハイブリダイゼーションに要求される相補性は より大きくなる。バックグラウンドのレベルが高い場合、ストリンジエンシーは それに応じて増加することがある。ストリンジエンシーは、また、洗浄液中に組 み入れることができる。

ハイブリダイゼーション後、試料を適当な手段により、例えば、変化する濃度の 標準的生理的塩類溶液のリン酸塩ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）　（１８０ｍＭ　ＮａＣ ｆ　、　１０ｏ＋Ｍ　ＮａｚＨＰＯａおよびＩ　Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）溶 液で２５〜７５°Ｃにおいて、温度に依存して約１０分〜１時間１または２回以 上洗浄することによって、ハイブリダイゼーションしないプローブを洗浄除去す る０次いで、標識を適当な検出技術により検出する。

ここで使用することができる配列特異的オリゴヌクレオチドのプローブは、適当 な手段、例えば、ヌクレオシド誘導体からの核酸の有機合成により調製すること ができるオリゴヌクレオチドである。この合成は溶液中でまたは固体の支持体上 で実施することができる。有機合成の１つの型は、遺伝子断片または短い遺伝子 の調製に利用される、ホスホトリエステル法である。ホスホトリエステル法にお いては、オリゴヌクレオチドを調製し、次いでこれらを一緒に連結してより長い 核酸を形成することができる。この方法の説明については、Ｎａｒａｎｇ　＋　 Ｓ、　Ａ、ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．．６８．９０（１９７９）および 米国特許第４．３５６．２７０号を参照のこと。この特許はソマトスフチン遺伝 子の合成およびクローニングを記載している。

有機合成の第２型は、ｔＲＮＡ遺伝子の調製に利用されている、ホスホジエステ ル方法である。。この方法の説明についてＢｒｏｗｎ＋Ｅ、Ｌ、ら、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋６８．１０６（１９７９）を参照のこと。

ホスホトリエステル法におけるように、ホスホジエステル法はオリゴヌクレオチ ドの合成を包含し、引き続いてオリゴヌクレオチドを一緒に連結して所望の核酸 を形成する。

これらの自動化された実施Ｂ様を使用することもできる。

１つのこのような自動化された実施態様において、ジエチルホスホルアミダイト を出発物質として使用し、そしてＢｅａｕｃａｇａら、丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２　：　１８９５−１８６２（１９８１）に記載されてい るように合成することができる。修飾された固体の支持体上でオリゴヌクレオチ ドを合成する１つの方法は、米国特許第４，４５８．０６６号に記載されている 。また、生物源から分離されたプライマーを使用することができる（例えば、制 限エンドヌクレアーゼの消化）。

配列特異的オリゴヌクレオチドは、検出されるヌクレオチドの変動部にまたがる 領域を包含しなければならず、且つヌクレオチドの変動に対して特異的でなくて はならない。例えば、４種類のＤＮＡのそれぞれに特徴的なヌクレオチド配列部 位を含有する４種類のオリゴヌクレオチドを合成することができる。各オリゴヌ クレオチドを同一試料の複製物に対して対立遺伝子の変化が起こる位置の１また は２以上の領域を試料が含有するかどうかを決定する。

配列特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの由来およびヌクレオチ ド組成を包含する、多数の因子に依存する。ここにおける目的のために、オリゴ ヌクレオチドは典型的には１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、より多いか、 あるいはよりすくないヌクレオチドを含有することができる。

長さが少なくとも１９７−であるオリゴヌクレオチドは特異性および／または感 受性を増大することができ、１９７−より小さい、例えば、１６マーのプローブ は、多分、単一の不一致がより不安定化するため、一層の配列特異的の識別を示 す。プローブを使用する検出前に試料の増幅を後述するように実施する場合、増 幅は特異性を増加するので、より長いプローブしたがって、このような場合にお いて、１９マーより小さいプローブを使用することが好ましい。

試料をまず膜上に配置し、次いでオリゴヌクレオチドで検出する場合、オリゴヌ クレオチドは適当な標識成分で標識しなくてはならならず、この成分は分光光度 測定、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的手段により検出すること ができるものである。免疫化学的手段は、適当な条件下にオリゴヌクレオチドと 複合体を形成することができる抗体を用い、そして生物化学的手段は適当な条件 下にオリゴヌクレオチド複合体を形成することができるポリペプチドまたはレク チンを用いる。例えば次のものが挙げられる：蛍光性染料、電子高密度試薬、不 溶性反応生成物を析出するか、あるいは発色的に検出することができる酵素、例 えば、アルカリ性ホスファターゼ、放射性標識、例えば、！！ｐまたはビオチン 。

ビオチンを使用する場合、スペーサーアームを利用してそれをオリゴヌクレオチ ドに取り付けることができる。好ましくは、使用する標識は非放射性である。

「逆」ドツトプロットのフォーマットにおいて、ＤＮＡ配列の１つとハイブリダ イゼーションすることができる標識した配列特異的オリゴヌクレオチドのプロー ブを前述の予備ハイブリダイゼーション条件下に膜上にスポットする。次いで、 試料を予備処理した膜に前述のハイブリダイゼーション条件下に添加する。次い で、検出手段を使用して試料中の配列が標識したオリゴヌクレオチドにハイブリ ダイゼーションしたかどうかを、決定する、こを、ができ４ような方法で、ａ識 し、たオリゴヌクレオチドまた↓よその断片を情か、・ら解、放する１、、二・ の解放ｔよ、例え：ば、ブ・ローブ中・の制ｉ限１部位を認識する制ｉｐ］ｕ留 素を膜ニ添加する、口上によって、行うことができる、２０手（順ｔは、オリゴ マー制：＠法として知・られており、欺洲笛許発行Ｘ１ｆｆｔ４．！Ｉ）’５４ 号（１９８５年１２月１１日発行）により完全に記載されている。

あるいは、膜に固定化された配列特異的オリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡ鎖（Ｐ ＣＲ増幅した）を結合または「捕捉」することができるであろう。この「捕捉さ れたＪ　Ｓｉｔは第２標識プローブにより検出することができるであろう。第２ オリゴヌクレオチドのプローブは遺伝子座特異的または対立遺伝子特異的である ことができる。

ここにおけるＤＮＡ配列を検出する別の方法においては、分析すべき試料をまず ＤＮＡ’ポリメラーゼ、４種類のヌクレオチドトリホスフェートおよび２種類の プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応と呼ばれる方法により増幅する。

簡潔には、この増幅方法は次の工程を包含する：（ａ）４つのＩＤＤＭ遺伝子マ ーカー配列の１または２以上を含有することが疑われるＤＮＡ試料を、−緒にま たは順次に、４種類の異なるヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチドトリ ホスフェートの重合のための試薬、およびＩＤＤＭまたはＰν遺伝子マーカーを 含有することが疑われる各ＤＮＡの各鎖につき１種類のデオキシリボヌクレオチ ドプライマーでハイブリダイゼーション条件下に処理し、こうして検出すべき各 異なる遺伝子マーカーを含有する各ＤＮＡ鎖について、各ＤＮＡ鎖に対して相補 的である各プライマーの伸長産生物を合成し、ここで前記プライマーは各異なる 遺伝子マーカーを含有する各ＤＮＡ鎖に対して実質的に相補的であるように選択 し、こうして１つのプライマーから合成された伸長産生物は、その相補体から分 離するとき、他方のプライマーの伸長産生物の合成のための鋳型として働くこと ができるようにする；（ｂ）試料を変性条件下に処理して、検出すべき配列が存 在する場合、プライマー伸長産生物をそれらの鋳型から分離する；そして （ｃ）試料を、−緒にまたは順次に、前記４種類のヌクレオチドトリホスフェー ト、ヌクレオチドトリホスフェートの重合のための試薬、およびオリゴヌクレオ チドプライマーで処理し、こうしてプライマー伸長産生物を鋳型として工程（ｂ ）において産生された一本鎖の各を使用して合成し、ここで工程（ｂ）および（ ｃ）を十分な回数で反復して、存在する場合、配列を含有する核酸の検出可能な 増幅生じさせる。

次いで、試料を膜に添付し、そして前述したように配列特異的プローブで検出す る。好ましくは、試料がヒトゲノムＤＮＡを含有する場合、工程（ｂ）および（ ｃ）を少なくとも５回、より好ましくは１５〜３０回反復する。試料が細胞を含 む場合、好ましくはそれらを工程（ａ）前に加熱してその中のＤＮＡを試薬に対 して暴露する。この工程は試薬添加の前のＤＮＡの抽出を回避する。

「逆」ドツトプロットのフォーマットにおいて、増幅連鎖反応において使用する プライマーの少なくとも１種および／または４種類のヌクレオチドトリホスフェ ートの少なくとも工種を検出可能な標識で標識し、こうして、生ずる増幅した配 列を標識する。これらの標識した部分は最初に反応混合物中に存在するか、ある いは後のサイクルの間に添加することができる０次いで、配列が存在する場合に 増幅した配列とハイブリダイゼーションすることができる非標識配列特異的オリ ゴヌクレオチドを、前述したように予備ハイブリダイゼーション条件下に膜にス ポットする。次いで、増幅した試料を前述したようにハイブリダイゼーション条 件下に予備処理した膜に添加する。最後に、検出手段を使用して、ＤＮＡ試料中 の増幅した配列が膜に固定したオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションし ているかどうかを決定する。変化を含有する膜結合した配列が増幅産生物中に存 在する場合にのみ、ハイブリダイゼーションは起こるであろう。

上に示したように、この方法の変法は、サンドイッチアッセイにおいて、非標ｉ 　ＰＣＲ標的、非標識固定化対立遺伝子特異的プローブおよび標識したオリゴヌ クレオチドのプローブを使用することを包含する。

増幅方法は、プローブの改良された特異性および感受性を提供する；解釈可能な シグナルを４時間で０．０４■の試料を使用して得ることができる。また、膜上 にスポットした試料の量を０．１〜０．５　ｕｇに増加する場合、放射性同位元 素を用いずに標識したオリゴヌクレオチドを、前の方法において使用した放射性 同位元素のプローブの代わりに、利用することができる。最後に、前述のように 、増幅方法は大きさが１９マーより小さい配列特異的オリゴヌクレオチドの使用 に適用することができ、こうしてより認識可能な配列特異的オリゴヌクレオチド の使用を可能とすることができる。

増幅法の変法においては、熱安定性酵素、例えば、テルムス・７１７４−９　ス （ｆｆｈｅｒｓｔｕｓ　ａ３４主１且すｐから精製したちのを温度サイクル連鎖 反応においてＤＮＡポリメラーゼとして利用することができる。熱安定性酵素は 熱に対して安定性であり、耐熱性であり、そして適切な方法でヌクレオチドの結 合を触媒（促進）して各ＤＮＡ頓に対して相補的であるプライマー伸長産生物を 形成する酵素を意味する。

この技術のこの後者の変法においては、プライマーおよびヌクレオチドトリホス フェートを試料に添加し、この混合物を加熱し、次いで冷却し、次いで酵素を添 加し、次いでこの混合物を約９０〜１００’Ｃに加熱してＤＮＡを変性し、次い で約３５〜４０°Ｃに冷却し、そして所望の量の増幅が起こるまで、サイクルを 反復する。この方法はまた自動化することができる。

熱安定性酵素を使用する増幅方法は、欧州特許発行２５８．０１７号（１９８８ 年３月２日発行）により完全に記載されている。

本発明は、また、各標識した配列特異的ＤＮＡプローブのための容器を有する、 包装した多容器ユニットからなるキットのフォーマットを包含する。このキット は、必要に応じて、標識（例えば、標識がビオチンである場合、アビジン−酵素 接合体および酵素の基質並びに色素原）を検出する手段を含有することができる 。さらに、キットは検出すべき配列をもつ１または２以上のｏＮＡｔＸを含有す るプローブのための陽性の対照、および検出すべき配列のいずれかを存するＤＮ Ａ鎖を含有しないプローブのための陰性の対照を有する容器を含むことができる 。

ＩＤＤＭまたはＰｖに関連するタンパク質の試料中のアミノ酸配列を検出する１ つの方法は、４つのアミノ酸配列の１または２以上、に結合する１または２・以 上の抗体を使用するイムノアッセイの使用を包含する。抗体はポリクローナル抗 体またｔよモノクローナル抗体であることができるが、モノクローナル抗体は抗 原に対するそれらの特異性および親和性にかんがみて好ましい。

ポリクローナル抗体はよく知られた方法により調製することができる。この方法 はＩＤＤＭまたはＰｖに関連する１または２以上のアミノ酸配列を含有するペプ チドを合成し、ペプチドを精製し、標準技術によりペプチドに担体タンパク質を 取り付け、そして宿主、例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、マウスなどにペプチド を注射することを包含する。血清を宿主から既知の方法により抽出し、そしてス クリーニングして、ペプチドの免疫原に対して特異的であるポリクローナル抗体 を得る。ペプチドはＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　、　Ａｄｖ、Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、Ｒｅ１ａｔ、ＡｒｅａｓＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、３２　：　２２１−２ ９６（１９６９）および「ポリペプチドの化学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ｏｆ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ　（Ｐ、Ｇ、Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ、 　り、ｐｐ、３３６−３６１、Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク（１９７３）（それ らの開示をここに引用によって加える）に記載されている固相合成方法により合 成することができる。次いで、ペプチドを精製し、そしてキーホールリンベット ヘモシアニン（ＫＩＪＩ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に接合させるこ とができる。これは、ペプチドがススティンを含有する場合、スルフヒドリル基 を経て、ヘテロ三官能性架橋剤、例えば、１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン −４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ−７レイミドー６−アミノカブｌフイルエス テルを使用して達成することができる。

モノクローナル抗体は通常擢歯類またはヒト由来のものであろう。なぜなら、モ ノクローナル抗体を分泌する永久増殖性のハイブリッド細胞系の産生に使用する ことができるネズミ、ラット、およびヒトの腫瘍細胞系は入手可能であるからで ある。抗体はアイソタイプであることができるが、好ましくはＩｇＧ、　Ｉｇｌ ｌまたはＩｇＡ　、最も好ましくはＩｇＧ２ａである。

ネズミのモノクローナル抗体は、宿主を前述のペプチドで免疫化することによっ て産生ずることができる。宿主は免疫原量のペプチドを腹腔内に接種し、次いで 同様な量の免疫原ペプチドで追加免疫することができる。免疫化したマウスから 、肺臓またはリンパの組織を最後の追加免疫後数日で集め、そして細胞懸濁液を それからの融合において使用するために調製する。

ハイブリドーマは、肺臓細胞またはリンパの組織と腫瘍（骨髄腫）パートナ−と から、Ｋｏｅｈｌｅｒ＋　Ｂ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　：　４９５−４９７（１９７５）およびＫｏｅｂｌｅ ｒ、　Ｂ、ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

ｔ＋ｎ１Ｉｕｎｏ１．、６　：　５１１−５１９（１９７６）の一般的体細胞の ハイブリダイゼーション技術を使用して調製することができる。この目的に好ま しい好ましい骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択した抗体産生細胞による抗体 の安定な、高レベルの発現を支持し、そして培地、例えば、ＨＡＴ培地に対して 感受性であるものである。これらのうちで、好ましい骨髄腫細胞系はネズミ骨髄 腫系統、例えば、ソータ研究所（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅ１ｌＤｉ ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　、、米国カリフォルニア州すンジエゴ） から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＯＰＣ−１１マウス腫瘍、およびアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　、米国マリイランド州０７クビ レ）から、それぞれ、ＡＴＣＣＣＲＬ　Ｎｏ、１５８０および１５８１で入手可 能なＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）およびｓｐ２／　Ｏ−Ａｇ１４（Ｓ ｐ２／　０　）骨髄腫系統から誘導されるものである。

基本的には、この技術は適当な腫瘍細胞および＊Ｗｔ細胞またはリンパ組織を融 合源、例えば、ポリエチレングリコールを使用して融合することを包含する。融 合後、細胞を融合培地、例えば、）ＩＡＴ培地から分離して、ハイブリダイゼー ションしない親細胞を排除し、そして培地に対して抵抗性でありかつ永久増殖性 であるハイプリドーマのみを選択する。ハイブリドーマを、必要に応じて、増殖 させ、そして上澄み液を普通のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッ セイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗原として免疫 化剤を使用してアッセイすることができる。陽性のクローンはさらに特性決定し て、それらが本発明の抗体の基準を満足するかどうかを決定することができる。

例えば、抗体の抗原結合能力をイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび抗原中 和試験により生体外で評価することができる。

アミノ酸遺伝子マーカーに対するヒト抗体を分泌するハイブリッドの細胞系をつ くる好ましい手順は、十分に高いレベルのこのような抗体を産生ずるマウス×ヒ ト親ハイブリッド細胞系およびヒト細胞系を使用する、体細胞ハイブリダイゼー ションである。ヒト細胞系は前述のペプチドで免疫化したボランティア−から得 ることができる。ヒト細胞系は、例えば、Ｆｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　７０　：　８３　９０（１９８４）に記載され ているように、ニブスティン−バーウィルス（ＥＢＶ）で形質転換することがで きる。

ＥＢＶの形質転換を使用するとき、最も首尾よいアプローチは、Ｋｏｚｂａｒら 、５ｃａｎ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１０　：　１８７−１９４　（１９７ ９）および５ｔｅｉｎｉＬｚら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｍ＋ｗｕｎ、　２　 ：　１　７　（１９７９）に記載されているように、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ ）またはロセッティング技術により、形質転換すべきＢ細胞の集団を前選択する か、あるいは抗原特異的な形質転換した集団を後選択することであった。最近、 ＥＢＶの形質転換を細胞融合と組み合わせてヒトモノクローナル抗体が調製され た（参照、例えば、ｐｏｕｎｇら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈ、、７０：８３　 ９０（１９８４）。これは、ＥＢＶ　リンパ芽球細胞系と比較したときバイブド ーマにより免疫グロブリンの分泌の不安定性、および抗原特異的集団のレスキュ ー（ｒｅｓｃｕｅ）のより高い頻度のためである。ＥＢＶはＩｇＭを有するＢ細 胞を最も頻繁に感染しかつ形質転換するが、１．の他のクラスを分泌するＢ細胞 は、また、ＢｒｏｗｎおよびＭｉｌｌｅｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｏｌ、、　１２８　：　２４　２９（１９８２）に記載されているよう に、ＥＢＶ融合技術を使用して長期間の系統にすることができる。

モノクローナル抗体を産生ずる細胞系は、適当な培地、例えば、イスコウブ（Ｉ ｓｃｏｖｅ）の培地、ダルベツコ変性イーグル培地、またはＲＰＭＩ培地（Ｇｉ ｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で生体外で、あるいはシンジェ ネイックまたは免疫欠損の実験室動物において生体内で増殖することができる。

必要に応じて、抗体は培地または体液から、場合に応じて、普通の技術、例えば 、硫酸アンモニウムの沈澱、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー、イオ ン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、電気泳動、ミクロ濾過、 および超遠心により分離することができる。

ここにおける抗体を使用して、）ＩＬＡクラスＩＩ抗原を発現する全血細胞中の ＩＤＤＭに関連するアミノ酸配列の存在または不存在を検出することができる。

細胞は抗体の存在下にインキュベーションし、そして反応（抗体−ペプチドの結 合）の存在または不存在および／または程度は、抗体／抗原の相互作用を決定ま たは定量するために使用する種々の方法（例えば、蛍光、酵素結合イムノアッセ イ（ＥＬＩＳＡ）　、および標準の方法による抗体および補体を使用する殺細胞 ）のいずれによっても決定することができる。使用する抗体は好ましくはモノク ローナル抗体である。

固相イムノアッセイにおいて使用するため、本発明において使用する適当な固体 の支持体上に適当な技術により固定化することができる。固体の試験支持体は、 イムノアッセイにおいて抗体を結合するために適当な不溶性の担体材料のいずれ であることもできる。多数のこのような材料はこの分野において知られており、 次のものを包含するが、これらに限定されない二ニトロセルロースのシートまた はフィルター；アガロース、樹脂、プラスチック（例えば、ＰｖＣまたはポリス チレン）ラテックス、または金属ビーズ；プラスチック容器など。抗体を固定化 する多数の方法もまた、この分野において知られている。参照、例えば、Ｓｉｌ ｍａｎら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

３５　：　８７３（１９６６）；Ｍｅｌｒｏｓｅ、Ｒｅｖ、Ｐｕｒｅ　＆　Ａｐ ｐ、Ｃｈｅｍ、、２１　：　８３（１９７１）；Ｃｕａｔｒｅｃａｆａｓ　ら、 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、Ｖｏｌ、２２（１９７１）。このうような方法は、共 有結合カップリング、直接吸着、物理学的捕捉、およびタンパク質被覆した表面 への取り付けを包含する。後者の方法において、表面をまず不溶性タンパク質、 例えば、ゼイン、コラーゲン、フィブリノゲン、ケラチン、グルテリンなどで被 覆する。抗体は単にタンパク質被覆表面を抗体の水溶液と接触させ、そしてそれ を乾燥することによって取り付ける。

洗浄の間にすべての結合した抗体を保持することができるように、抗体を免疫反 応性のままにしなお抗体を十分に固定する結合技術及び支持体の任意の組合わせ で本発明において使用することができる。好ましい固体の試験支持体はプラスチ ックビーズである。

サンドイッチイムノアッセイにおいて、標識した抗体を使用して、固定化された モノクローナル抗体により結合された抗原の量を測定する。標識は、支持体に結 合したとき、抗体の検出を可能とする任意の型であることができる。一般に、標 識は直接または間接にシグナルを生成し、このシグナルは測定可能であり、そし て試料中に存在する標識の量に関係づけられる。例えば、直接測定可能な標識は 放射性同位元素（例えば、＋２５１．３ＳＳ　、　＋４Ｃなど）を包含すること ができる。

好ましい直接測定可能な標識は、適・当な基質（例えば、セイヨウワサビペルオ キシダーゼ１０−フェニレンジアミン）の存在下に色の反応を生成する、抗体へ 接合した酵素である。

間接に測定可能な標識の例は、ビオチン化した抗体であろう。

この標識の存在は、それを標識したアビジンを含有する溶液と接触させることに よって測定され、これによりアビジンはビオチン化抗体に結合するようになる。

次いで、アビジンに関連する標識を測定する。間接標識の好ましい例は、アビジ ンに接合した酵素を使用するアビジン／ビオチン系であり、この酵素は前述した ように色の反応を生成する。しかしながら、用語「酵素」はその最も広い意味に おいて使用し、そして、例えば、「標識した」抗体を使用することを包含するこ とができ、ここで標識はキセノタイプまたはアイソタイプ的に固定化された抗体 と異なるので、「標識した」抗体の存在は直接に検出可能な標識を有する抗キセ ノタイプまたは抗アイソタイプの抗体とのインキュベーションにより検出可能で ある。

どの標識を選択しても、それは測定することができかつ試料中の標識の量に関係 付けられるシグナルを生ずる。普通のシグナルは放射能レベル（放射性同位元素 を使用するとき）、光学密度（例えば、酵素の色反応を使用するとき）、および 蛍光（蛍光性化合物を使用するとき）である。非放射性ジグ色強度）を使用する ことは好ましい。適当なシグナルを生成することができる多数の酵素／基質の組 み合わせは、イムノアッセイの分野において知られている。参照、例えば、米国 特許第４，３２３．６４７号および米国特許第４．１９０．．４９６号。

診断的使用のため、抗体は典型的には多容器キットの形態で分配されるであろう 。これらのキットは典型的には適当な容器中に標識または非標識の形態の抗体、 使用する場合、非標識抗体と反応性の検出可能なりガント、必要に応じてインキ ュベーションおよび洗浄のための試薬、検出すべき標識部分を検出するための試 薬、例えば、標識に依存して基質または誘導化試薬、産生物のインサートおよび 使用説明、ＩＤＤＭまたはｐｖに関連する陽性の対照、例えば、ＩＤＤＭまたは Ｐνに関連するＨＬＡクラスＩＩ抗原を含有するであろう。キット中の抗体は、 それらがポリクローナルである場合、親和精製することができる。

次の実施例は本発明の種々の実施Ｂ様を例示し、そしていかなる面においても限 定を意図しない。実施例において、特記しない限り、すべての部および百分率は 固体である場合重量により、そして液体である場合体積により、そしてすべての 温度はセ氏度（°Ｃ）である。

１隻■よ この実施例は、ＩＤＤＭに関連するＤＲ−ベータ配列を同定した方法を例示する 。

Ｉ、ＨＬＡ−ＤＲ−ベータ配列の分析 いくつかのＢＬＡクラス！Ｉベータ遺伝子を、種々のＨＬＡ型ＩＤＤＭの固体（ ピッツバーグクリニック大学からおよびＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｅｒ　％ニュージャーシイ州カメデンから入手可 能なＩＤＤＭ患者からの細胞系から）の臨床的血液試料および非糖尿病の対照（ ホモ接合体型別細胞）からのクローニング方法を使用して分離した。標準方法で ある１つのこのような方法において、ヒトゲノムのＤＮＡを患者の試料から、本 質的にＭａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）（１ ９８２）、２８０−２８１の方法を使用して分離するか、あるいは５ａｉｋｉ　 ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３　：　１００８−１０１２（１９８５ ）に記載されているように、末梢血液リンパ球から主として構成された、パフィ ーコー）　（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）の分画から調製した。次いで、このＤＮＡ を、Ｍａｎｉａｔｉｓら、５ｕｐｒａ、　ｐｐ、２６９−２９４に記載されてい るように、完全なゲノムのライブラリーとしてバクテリオファージのベクター中 にクローニングした。ＨＬＡ　−ＤＲ−ベータ遺伝子のだめの個々のクローンを 、放射性ｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションにより選択しくＭａｎｉ ａｔｉｓら、ｐｐ、３０９−３２８）そして制限地図により特性決定した。参照 、米国特許第４．５８２，７８８号（１９８６年４月１５日発行）　、　ＩＤＤ Ｍ患者からの個々のクローンを、クローンの制限地図を患者の族内のＲＦＬＰ分 離パターンと比較することによってＤＲ型別ハブロタイブに割り当てた。

最後に、変動する第２エクソンを表すこれらのクローンの小さい断片をＭ　１３ 　ｐ　１．０クローニングベクター（これはベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から広く入手可能である）中にサブクロー ニング（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｐｐ、３９０−４０２）　した。

遺伝子をクローニングする別の手順において、遺伝子の関連する部分（第２エク ソン）の増幅を後述するように実施した。

各分離したヒトゲノムＤＮＡの合計ＩＩｒｇを、１００ｍＭ　）リス−）ＩＣＩ 緩衝液（ｐＨ７，５）、５００ｍＭ　ＮａＣ１、および１００＊Ｍ　ＭｇＣ１ｚ 、Ｒｏｄの１０団プライマーＧＨ４６，１０Ｊ！１の１０マイクロミリリツトル のプライマーＧＨ５０，１５＃の４０ミリモルのｄＮＴＰ　（１０ミリモルの各 ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびＴＴＰを含有する）、および４５ｉ１ ！の水を含有する溶液の１０ｍを含有する最初の１００４の反応体積中で増幅し た。プライマーＧＨ４６およびＧＨ５０は次の配列を存する：５’−ＣＣＧＧＡ ＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ−３’　（ＧＨ４６）５’−Ｃ ＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡ−３’　（ＧＨ５０） これらのプライマーは、リンカ−／プライマーとして作用する非相同性の配列を 有し、次のようにして調製した：Ａ、自動化合成手順：　Ｂｅａｕｅａｇｅおよ びＣａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄ−ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１ ）２２　：　１８５９−１８６２）に従い合成した、ジエチルホスホルアミダイ トを、バイオザーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）ＳＡＭ−１を使用してヌクレオチド 誘導化制御された孔のガラス支持体へ順次に縮合させた。この手順はジクロロメ タン中のトリクロロ酢酸を使用する脱トリチル化、活性化プロトン供与体として ベンゾトリアゾールを使用する縮合、およびテトラヒドロフランおよびピリジン 中の酢酸無水物およびデメチルアミノピリジンのキャッピングを包含した。サイ クル時間はほぼ３０分であった。各工程において収量は本質的に定量的であり、 そして脱トリチル化の間に解放されるジメトキシトリチルアルコールの収集およ び分光光度測定の検査により決定した。

Ｂ、オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護および精製の手順：固体の支持体 をカラムから取り出し、そしてｌｌ１１の濃水酸化アンモニウムに室温において ４時間開じた管中で暴露した０次いで、支持体を濾過により除去し、そして部分 的に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液を５５°Ｃにお いて５時間保持した。アンモニアを除去し、そして残留物を調製用ポリアクリル アミドゲルに適用した。ａｐｌを３０ポル）／ＣＩにおいて９０分間実施し、次 いで産生物を含有するバンドを蛍光板の紫外線のシャドウィングにより同定した 。このバンドを切除し、そして４°Ｃにおいてｌｄの蒸留水通用し、そして１％ の酢酸アンモニウム中のア七ト二トリルの７〜１３％の勾配でｐＨ６，０におい て溶離した。溶離液を紫外線吸収により２６０ｎｍにおいて監視し、そして適当 な分画を集め、固定した体積で紫外線吸収により定量し、そして真空遠心で室温 において蒸発乾固した。

Ｃ，オリゴデオキシリボヌクレオチドの特性決定：精製したオリゴヌクレオチド の試験のアリコートをポリヌクレオチドキナーゼおよびｑ−”Ｐ−ＡＴＰで３２ ｐ標識した。標識した化合物を１４〜２０％のポリアクリルアミドゲルのオート ラジオグラフィーにより５０ボルト／ｃ１ｎにおいて４５分間の電気泳動後検査 した。この手順は分子量を評価する。塩基の組成は、オリゴデオキシリボヌクレ オチドをヌクレオチドにベノム（νｅｎｏｍ）ジェステラーゼおよびバクテリア のアルカリ性ホスファターゼの使用により消化し、次いで誘導されたヌクレオシ ドを逆相ＨＰＬＣカラムおよび１０％のア七ト二トリル、１％の酢酸アンモニウ ムの移動相を使用する分離および定量により決定した。

上の反応混合物を９５°Ｃにセントした加熱ブロック内に１０分間保持してＤＮ Ａを変性した。次いで、各ＤＮＡ試料を２８サイクルの増幅にかけ、ここで各サ イクルは４つの工程から構成されていた： （１）マイクロセントリフーグ中で試料を短時間（１０〜２０秒）回転して沈澱 濃縮し、そして変性された物質を直ちに３０°Ｃにセットした加熱ブロックに２ 分間移して、プライマーおよびゲノムのＤＮＡをアニーリングし、（２）３９ｍ のＥ、印旦のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（二ニー・イングランド・バ イオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏ−１ａｂｓ）　、５単位／ｍ）　 、３９ｍの１００ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ７，５）、５００ミリモルのＮ ａＣ１および１００ミリモルのＭｇＣ１゜の塩混合物、および３１２Ｉの水を混 合することによって調製した溶液の２１ｔｌを添加し、 （３）反応を３０°Ｃにおいて２分間進行させ、そして（４）この試料を９５° Ｃの加熱ブロックに２分間移して新しく合成したＤＮＡを変性するが、ただしこ の反応は最′後のサイクルにおいて実施しなかった。　− 次いで、この混合物を一２０°Ｃにおいて貯蔵した。次のクローニング手順を増 幅した産生物について使用した。

反応混合物は、まず５０ｐ１の５０ｍＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　）リス−）１ｃ Ｉ（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、２０単位のＰｓｔｌ、および２０単 位のＨｉｎｄｌｌｌを含有する緩衝液中で３７°Ｃにおいて９０分間消化するこ とによって、Ｍ１３ｍｐｌＯ中にサブクローニングした。反応を凍結により停止 した。体積をトリス−ＨＣｌおよびＥＤＴＡを含有する緩衝液で１１０Ｉに調節 し、そしてＢｉｏＧｅ）　Ｐ−４回転透析カラムに装入した。１つの分画を集め 、そしてエタノール沈澱させた。

エタノールの沈澱物を１５ｐ１の水中に再懸濁し、そして５０＋ｎＭトリスーＭ ＣＩ（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．５　ｍＭ　ＡＴＰ、　０． ５　ｉｒｇのＰｓｔｌおよび旧ｎｄｌｌＩで消化したＭ１３ｍｐｌＯベクターお よび４００単位のりガーゼを含有する２０ｍの体積に調節した。この混合物を１ ６°Ｃにおいて３時間インキュベーションした。

１０Ｉのモル）　（Ｍｏｌｔ）　４　ＤＮＡを含有する結合反応混合物をＥ、　 ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０３コンピテント細胞（これはＢＲＬ　、マリイランド州ベ セスダ）から入手可能である）中に形質転換した。

形質転換した菌株の調製に使用した手順は゛、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　（１９ ８１）高分子物質についての第３回タレブッランドシンポジウム：組み換えＤＮ Ａ（Ｔｈｉｒｄ　Ｃ１ｅｂｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｆｕｍ　ｏｎ　ｍａｃｒｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ　ＤＮＡ）　、Ａ、Ｗａｌｔｏｎ片 、アムステルダム、エルセビーア、１４３−１５３に記載されている。

これらの２つのクローニング手順からの約４０の異なる対立遺伝子を配列決定し た。決定した配列の幾つかにおいて、特異的ＤＮＡおよびタンパク質の配列の４ つの領域は種々の組み−合わせで存在し、そしてＩＤＤＭに関連することが見い だされた。

ＩＤＤＭ患者のゲノム中のこれらのセグメントの各々において見られるＤＮＡ配 列は、ＤＲ−ベータタンパク質の１〜３アミノ酸残基の変更を生成した。多数の 糖尿病源から得られる配列中に見いだされ、そしてＡ−Ｄと表示する、ＤＲ−ベ ータ第２エクソンのこれらの可変のセグメントが上において同定される。

このような配列の検出のために使用するプローブを案出するために使用できる領 域は第５図に特定されており、ここでアミノ酸の略号を表ｎｌｌに示す。

表−■旦 アミノ酸の略号のコード アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ システィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　ｃｒｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ イソロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ スレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ バリン　Ｖａｌ　Ｖ Ｉｌ、検出のためのプライマーの調製 ＤＲ−ベータ第２エクソンの保存された５′および３′末端の対抗する鎖に対し て相補的であるＧＨ４６およびＧ）１５０と表示するオリゴヌクレオチドを、プ ライマーとして使用した。プライマーは上の節において同定した。

１１Ｎ、期待した増幅反応 試験すべき各ＤＮＡ試料からのＤＮＡの１４（１０ｔｌ！の１００鱈／絨のＤＮ Ａ　）を、１００ｍＭ　）リス緩衝液（ｐＨ７，５）　、５００ｍＭ　ＮａＣ１ ゜および１００ｍＭ　ＭｇＣ１□、１０ｍの１０団プライマーＧ）１４６．１０ ｍの１０オプライマーＧＨ５０，１５Ｊ１１の４（ｂａＭ　ｄＮＴＰ　（１０ｄ の各ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびＴＴＰを含有する）　、１０ｄのＤＭＳＯｌおよび４５Ｊ１１の 水を含有する溶液の１０ｍを含有する最初の１００Ｉｔｌの反応体積中で増幅す ることができる。

各反応混合物を９５°Ｃにセントした加熱ブロック内に１０分間保持してＤＮＡ を変性した。次いで、各ＤＮＡ試料を３０サイクルの増幅にかけ、ここで各サイ クルは４つの工程から構成されていた： （１）マイクロセントリフーグ中で試料を短時間（１０〜２０秒）回転して沈澱 濃縮し、そして変性された物質を直ちに３７よびゲノムのＤＮＡをアニーリシグ し、（２）３９ｍのＥ、　ｃｏ￥ＬのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（二 ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏ−１ａｂ ｓ）　、　５単位／ｐり　、３９ｍの１００＋ａＭ　）リス緩衝液（ｐ）１７． ５）、５００＋ｗｌｌ　ＮａＣ１および１００ｍＭ　ＭｇＣｈの塩混合物、およ び３１２ｉ１１の水を混合することによって調製した溶液の２１ｔｌを添加し、 （３）反応を３７°Ｃにおいて２分間進行させ、そして（４）この試料を９５° Ｃの加熱ブロックに２分間移して新しく合成したＤＮＡを変性するが、ただしこ の反応は最後のサイクルにおいて実施しなかった。

最後の反応体積は１５０Ｊｌｌであり、そして反応混合物を一２０℃において貯 蔵した。

ＩＶ、オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの期待する合成およびリン酸化 それぞれ、領域ＣおよびＤからの、Ｇｌ（５４（Ｖ−５）およびＧＨ７８（１− ＤＥ）と表示する、４種の標識したプローブの内の２種を使用する。

これらの２種のプローブを、クローニングのためのプライマーの調製について前 述の手順に従い合成する。プローブは、１０ｐＭのそれを、７０１１Ｍ　）リス 緩衝液（ｐ）１７．６　）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、１、５　ｍＭスペルミン、 １００ｍＭジチオスレイトールおよび水を含有する４０メの反応体積中で、４単 位のＴ４ヌクレオチドキナーゼ（二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ 　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））および約４０ｐＭのガンマ−”Ｐ−ＡＴＰ （ニュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ）　、抗体７０００Ｃｉ／ミリモル）と３７°Ｃにおいて６０分間接触さ せることによって標識する。次いで、合計の体積を２５＋＋＋ＨのＥＤＴＡで１ ００ｄに調節し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ（１９８２）　、、　４６６−４６７の手順に従い、トリス−ＥＤＴＡ　（ ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ）リス緩衝液、０．１＋ｎＭのＥＤＴＡ、　ｐ［３，０ ）と平衡化したＩＩｄのＢｉｏＧｅｌＰ−４（ＢｉｏＲａｄ）回転透析カラムで 精製する。

■１Ｍ持するドントブロットハイプリダイゼーシジン節ＩＩＩからの１５０４の 増幅した試料の各の５４を１９５Ｊｄの０．４　Ｎ　ＮａＯＨ、２５ｍ？ｌ　Ｅ ＤＴＡで希釈し、そして３つの反復実験のゼナトラン（Ｇｅｎａ　ｔｏｒａｎ） ４５　（ＰＬＡＳＣＯ）ナイロンフィルター上にスポットし、ここでＲｅｅｄお よびＭａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ−ｒｃｈ、１３．７２ ０２−７２２１（１９８５）に記載されているように、まずフィルターを水で湿 潤させ、それをフィルターを所定位置に保持するドツトプロットを調製するバイ オドツト（ＢｉｏＤｏｔ）　（Ｂｉ。

Ｒａｄ）装置に配置し、そして各ウェルを０．４−の２０　Ｘ　５ＳＰＥ　（３ ，６ＨのＮａＣ１，２００ＩｔｌＭ　ＮａＨ＊ＰＯａ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ）で すすぐ。次いで、フィルターを取り出し、２０　Ｘ　５ＳＰＥ中ですすぎ、そし て真空炉内で８０°Ｃにおいて３０分間ベーキングする。

ヘ−キンク後、各フィルター５　Ｘ５ＳＰＥ、　５　Ｘデンハルト溶液（Ｉ　Ｘ 　＝０．０２％のポリビニルピロリドン、０．０２％のフィコール、０．０２％ のウシ血清アルブミン、０．２　ａｌｌ　）リス−）ＩＣＩ　。

０、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、、ｐＨ８，０）および０．５％のＳＤＳから成るハ イブリダイゼーション溶液の６ｄと接触させ、そして５５°Ｃにおいて６０分間 インキュベーションした。次いで、プローブの各々の５ｉ！１をハイブリダイゼ ーション溶液に添加し、そしてフィルターを５５℃において６０分間インキュベ ーションした。

最後に、各ハイブリダイゼーションしたフィルターを厳格な条件下に洗浄する。

遺伝子型は９０分のオートラジオグラフィー後容易に現れることが期待される。

プローブは、ゲノムのＤＮＡ試料中で検出されるアレルの部分に対する合理的な 特異性を有することが期待される。

災施■旦 開示するアミノ酸配列に対するペプチドは、前述のように調製し、そして免疫原 として使用して、タンパク質タンパク質中のアミノ酸配列を検出するイムノアッ セイにおいて有用な、それに対する抗体を発生するために使用できる。

裏差団−田一 尋常性天庖陰（ガ５立Ｌｇ＝烈り肛ｉｓ）　（ＰＶ）に関連するＤＲ４およびＤ Ｒｉｖ６の両者のハブロタイブがＤＲ−ベーターＩ鎖におけるｐｖの感受性を示 す共通のエピトープを含有する可能性を探査するために、３人のＰν患者からの ＤＲ−ベータおよびＤＯ−ベータの位置の多形性第２エクソンのヌクレオチド配 列を決定した。３人＋７）ＰＶ患者（７）　ＨＬＡ−ＤＲ血清型はＤＲ４／４、 ＤＲ４１５およびＤＲ４１５であったので、ＤＲ４関連Ｐν感受性の発生のみを この実施例において探査した。配列の分析は、特異的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）増幅した断片を含有するＭ１３クローンについて実施した。ＰＣＨの増幅 、クローニングおよび配列の分析については、次の文献を参照＝　５ａｉｋｉ　 ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３０　：　１３５０−１３５４（１９８５）　；および５ｃｈａｒｆ　ｅｔ　 ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３　：１０７６−１０７８　（１９８６）。

−・の−および　の　違　３人の尋常性天庖癒の患者からの血液試料は、ブルー ス・ウィントロラブ（Ｂｒｕｃｅ　Ｗｉｎｔｒｏｕｂ）博士、ＵＣＳＦ　（カリ フォルニア州）により提供された。Ｑ、５ｄの全血を１．５　ｍの１０１１Ｍト リス（ｐＨ７，５）　、１０＋ｓＭＥＤＴＡ　、１００＊Ｍ　ＮａＣＬ　、　４ ０ｗＭジチオスレイトール、および２００＊ｇ／ｄのプロイテイナーゼにの添加 により溶解し、そして５５°Ｃにおいて１６時間インキュベーションした。試料 をフェノール抽出し、フェノール−ＣＨＣｌ３およびＣＨＣｌ３抽出し、そして −２０゛Ｃにおいて一夜エタノール沈澱した。沈澱したＤＮＡを遠心によりペレ ットにし、７０％のエタノールで洗浄し、合成し、そして１００ｐ１の１０＋ｍ Ｍ　）リス、０．１　＋ａＭ　１００■／ｄのｌ１ｉＮアーゼＡを含有するＥＤ ＴＡ中に再懸濁し、そして３７°Ｃにおいて１５分間インキュベーションした。

ＤＮＡの試料を、前述したように、フェノール−ＣＢＣＩ！およびＣＨＣｈで再 抽出してＲＮアーゼＡを不活性化し、エタノール沈澱させ、各し、そして乾燥し た。１ｊｒｇの完全なゲノムのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓｃ ｈａｒｆ　ｅｔ　ａｌ、＋ｉｄ）により増幅し、ここで反応条件を次のように変 化させた：Ａ、）ＨＬＡ　ＤＲ−ベータ領域の遺伝子は１マイクロミリリツトル のＰＣＲプライマーＧＨ４６およびＧＨ５０を使用して増幅した（参照、プライ マーの説明およびＨＬＡ　ＤＲ−ベータの標的の断片について第１図）；１単位 のクローニングしたＥ、　ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ１の大きい断片（クレ ノー断片）を２０サイクルの増幅のために添加した；増幅の追加の５サイクルは ４単位のクレノー断片を使用して試料について実施した。Ｂ、）１ｍのＰＣＲプ ライマーＧＨ４６およびＧＨ５０を使用して増幅された［（ＬＡ　ＤＲ−ベータ 領域遺伝子： Ｇ）１２Ｂ　（Ｃ−ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣ Ｇ）ＧＨ２９（ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣ）１ 単位のクレノー断片を２０サイクルの増幅のために添加した；追加の８サイクル の増幅を２単位／サイクルのクレノー断片を使用して実施した。ＤＱ−ベータの プライマーは２３８塩基対の断片を産生ずる。ＤＲ−ベータの調製は２１２ｂｐ の断片を産生じた（参照、第１図）。ＰＣＲ反応の１／１０を４％のＮｕＳｉｅ ｖｅ、０．５％の５ｅａＫｅｒａ　（ＦＭＣ）アガロースゲルで実施し、そして ゼナトラン４５ナイロン膜に移した（Ｓｃｈａｒｆ　ら、前掲）。フィルターを １０ａ１４の５　Ｘ５ＳＰＥ、　４　Ｘデンハルト溶液および０．５％のドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で３７°Ｃにおいて１５分間ノ１イプリダイゼー ションした。フィルターを０．１　ｐＭ（ガンマ−３２２）ＡＴＰ標識したＤＲ −ベータ特異的オリゴマーｃＨｆｆの添加で３７°Ｃにおいて１６時間ハイブリ ダイゼーションした。フィルターを４　Ｘ５ＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で３０ °Ｃにおいて２．５分間および３７°Ｃにおいて１．５分間洗浄し、そして強化 スクリーン（デュポンＣｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｐｌｕｓ）で−７０° Ｃにおいて１６時間露出した。

フィルターを沸騰するＱ、　ｌ　Ｘ５ＳＰＥ、０．１％ｎｏＳＤＳ中で５分間イ ンキュベーションしてプローブをストリッピングし、乾燥し、そして１０ｄの６ 　Ｘ５ＳＰＥ、　ＩＯＸデンハルトン容液および０．２％のＳＤＳ中で４２°Ｃ において予備ハイブリダイゼーションした。

０．２ｐＭ（ガンマ−”Ｐ）ＡＴＰ標識したＤＲ４ＤｗｌＯ配列特異的オリゴマ ー〇ＧＨ７８を予備ハイブリダイゼーション溶液に添加し、そして４２°Ｃにお いて１６時間インキュベーションした。ノλイブリダイゼーション後、フィルタ ーをＩ　Ｘ５ＳＰＥ、　０．１％のＳＤＳ中で３７°Ｃにおいて１０分間洗浄し 、そしてオートラジオグラフィーにかけた。

１（ＬＡ　ＤＲ−ベー　およびＤＱ−ベー　のＰＣＲのクローニン１盈よグ星死 夾定。各ＰＣＲ反応の１／２をエタノール沈澱させ、再懸濁し、そして４％のＮ ｕＳｉｅｖｅ　％　０．５％のＳｅａＫｅｍゲル上に通用し、そして２０ボルト ／Ｃ！Ｉｌで１時間電気泳動にかけた。

ＤＲ−ベータについて２６５および２８０塩基対の間のスライスおよびＤＱ−ベ ータについて２２０および２５０塩基対の間のスライスをゲルから取り出し、そ してＤＮＡをゲルから２００　ｍの０．５Ｘ　ＴＢＥ緩衝液中で電気溶離した。

電気溶離したＤＮＡ試料を透析し、６Ｏ単位のＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌ　にュ ー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ） ）で３７°Ｃにおいて３時間消化し、フェノール、フェノール−Ｃ）ＩＣｈおよ びＣＨＣｌ３抽出し、そしてエタノール沈澱した。消化したＰＣＲＤＮＡの１／ ４を２００■のＢａｏ＋ＨＩ／Ｐｓｔｌ消化し、脱リン酸化したＭ１３＋１ｌｐ ｌＯに結合し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３中に形質転換し、そして選択培地上 に配置した、５ｃｈａｒｆ、ｉｄ；Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１、ｐｐ、２Ｏ−７８（Ｗｕ　ら編、１９８３）。

陽性のクローンをその場のプラークフィルターのハイブリダイゼーションにより ニック翻訳したＤＲ−ベータｃＤＮＡを使用して同定し、プラーク精製し、そし て精製したファージのクローンをチェインーミネション法により配列決定した。

Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、７４　：　５４６３−５４６８（１９ ７７）。

分■穿ＤＲ−ベータｃＤＮＡのプローブを使用する、ＰＣＲ増幅産生物およびＤ Ｒ−３ホモ接合体の型別細胞ＤＮＡ　（一般のＤＲ−ベータ増幅およびハイブリ ダイゼーションの対照を包含する）サザンプロットの分析において、すべての４ つの試料はほぼ等しい量の増幅したＤＲ−ベータ断片を含有することが示された 。

次いで、フィルターをニック翻訳したＤＲ−ベータのプローブからストリンピン グし、そしてＧ）１７Ｂ、すなわち、ＤＲ４サイプタイプＤｗｌＯに対して特異 的のオリゴヌクレオチドのプローブで再ブロービングした（第１図、参照）。Ｇ Ｈ７８配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）はＤｗｌＯ配列に特異的にハイ ブリダイゼーションするが、他のＤＲ４サイプタイプ（例えば、Ｄ−４゜Ｄｗ１ ４．０ｗ１３および０ｗ１５）のいずれにもハイブリダイゼーションしない。す べての３人のＰｖ患者からの増幅したＤＮＡはＧＨ７８にハイブリダイゼーショ ンしたが、ＤＲ−３ホモ接合体の対照にハイブリダイゼーションしなかった。

ＨＬＡ　ＤＲ−ベータおよびＤＱ−ベータの遺伝子座についての増幅したＤＮＡ 配列をクローニングし、そしてコード配列のレベルでより詳述な多形性において 配列決定して検査した。第２図ハ、ＨＬＡ　ＤＲ−ベータ位置についてのヌクレ オチド配列のデータから誘導したアミノ酸の整列を示す。ＤＲ４ＤｗｌＯサイプ タイプのプロトタイプの配列は、それぞれ、アミノ酸位置６８゜７１および７２ におけるロイシン、グルタミンおよびリジンのイソロイシン、アスパラギン酸、 およびグルタミン酸（「Ｉ−ＤＥＪエピトープ）による置換により、ＤＲ４Ｄｗ ４プロトタイプ配列から区別される。配列の整列が示すように、３人の患者のＤ Ｒ４対立遺伝子からのＤＲ−ベーターｌ配列は、また、このｒ　１−ＤＥＪを含 有する。２人のＤＲ４１５患者（患者ＩＩおよびＩＩＩ）からのＤＲ５対立遺伝 子からのＤＲ−ベーターｌ配列は、ＤＲ５１０トタイプからのＤＲ−ベータ−１ 配列と同一である。

同様に、これらの２人のＤＲ４１５ｆｉ者からのＤＲ５対立遺伝子からのＤＲ− ベーターＩＩＩ配列は、ＤＲ５ＤＲ−ベーターＩＩＩ　プロトタ・イブの配列と 同一である。ＤＲ４／４である患者Ｉは１つのＤｗｌＯおよび１つの０ｗ１３ハ ブロタイブを有し、そして患者からのＩＩＲ−ベータ■ν配列はＤＲ４−ベータ ーＩＶプロトタイプ配列と同一である。ＨＬＡ　ＤＱ−べ・−夕位置についての ヌクレオチド配列のデータから誘導したアミノ酸の整列を第３図りこ示す。

愚者Ｉは１つのＤＲ４対立遺伝子に・ついてＤＱ８３．２および他のＤＲ４幻立 遺伝子についてＤＱＢ３．１としてサイプタイプに分類される。患者のＩＮおよ びＩＩＩ（両者はＤＲ４１５）は、また、それらのＤＱ−ベータ遺伝子座につい てホモ接合性である；　ＤＲ４対立遺伝子はＤＱＢ３．２であり、そしてＤＱ８ ３．１遺伝子座はＤＲ５ハブロタイブからのものである。ＤＲ血清型が与えられ ると、ＤＱ−ベータ遺伝子座におけるこのヘテロ接合性驚くべきことではない。

なぜなら、両者のＤＱＢ３．１およびＤＱＢ３．２はＤＲ４ハブロタイブ関連し 、そしてＤＱＢ３．１はＤＲ５ハブロタイブに関連するからである。すべての３ 人の患者からのＤＱ８３．１およびＤＱ８３．２配列は、それらのそれぞれのプ ロトタイプ配列と同一である。

尖詣尉一旦 ＤＲ４−ＤｗｌＯを他のＤＲ４−０ｗサイプタイプと区別する実施例ＩＩＩに前 述したコドン７０付近の同一の配列は、また、ＤＲｗ６ハブロタイプのサブセッ ト上に存在する。配列の多形性のパターンが示唆するように、この共有する「エ ピトープＪはＰｖに関連するＤＲ４およびＤＲｗ６の病気の原因となり得るであ ろう。

イスラエルの患者、ＤＲ合致する対照、およびオーストラリアの患者からのＤＮ Ａ試料を、前述のドツトプロットのフォーマットにおいてＰＣＲ増幅したＤＮＡ を使用して、ＤＲ−ベータおよびＤＱ−ベータの配列特異的オリゴヌクレオチド のプローブのパネルで分析した。ＤＲ−ベータｌのオリゴヌクレオチドのプロー ブを使用する分析において、本質的にすべての患者のＤＲ４ハブロタイブ（２４ ／２４イスラエルの患者；　１０／１４非イスラエルの患者）はＤｗｌＯ関連エ ピトープを有し、これに対して対照１）Ｒ４のハブロタイブはより小さい比率で あった（１５／２５イスラエルの対照；　１／１９非イスラエルの対照）。しか しながら、そのエピトープを含有するＤＲｗ６のＤＲ−ベーターＩ対立遺伝子の 比率は、対照（８／１３）に関しテＤＲｗ６（７）ＰＶ患者（４／１４）ニおい てより低かった。したがって、Ｐｖに対するＤＲ４感受性が特異的ＤＲ−ベータ ー１対立遺伝子に寄与することができる場合、ＤＲｗ６感受性は異なる配列によ り説明されなくてはならない。

スｌｌＩ竺 ＤＱ−ベータのゲノムの西　痕阻１Ｌ贋Ｍ。第４図に示す結果を得るために、第 ４図の左側に示す種々の細胞系の各々からのゲノムのＤＮＡのｌｕｇをＰＣＲ（ Ｓａｉｋｉ−ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２４　：　１６３−１６６　（１９８６） ）により２８サイクルの間Ｅ、匹旦のＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で増幅 した。増幅プライマーＧ）１２８および２９（参照、実施例ｍを使用してＤＱ− ベータ遺伝子の２３８ｂｐのセグメントを増幅した。増幅の程度および特異性を アガロースゲルの電気泳動、プロッティング、および２ｔｐ標１ＤＱ−ベータの ｃＤＮＡプローブ（Ｓｃｈａｒｆ　ら、５ｕｐｒａ）とのハイブリダイゼーショ ンにより監視した。Ｉ　ＤＤＭ患者の源はＡｒｎｈｅｉ＋ｍら、前掲、に記載さ れている。

１１３ｍ１０　のＰＣＲクローニング。増幅したＤＮＡを１回等しい体積のＴＥ 飽和したフェノールで抽出し、次いでフェノール／クロロホルム混合物で２回抽 出した。次いで、ＤＮＡを無菌の水で２ｄに希釈し、透析し、そしてセントリコ ン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ）で５０００ｋｌにおいて 室温で６０分間遠心により濃縮した。ＤＱ−ベータの増幅の場合において、ＰＣ Ｒプライマーはある数の非１１ＬＡ増幅産生物を産生じ、標的のバンドをまずア ガロースゲルから切断し、そして１００ボルトで１時間０．５ＸＴＢＥ中で電気 泳動した。ＤＮＡを１００Ｉに希釈し、そして３７°Ｃにおいて２時間４０単位 のＢａｍ）ＩＩおよびＰｓｔＩの各々で消化し７た。消化後、ＤＮＡを再びフェ ノール／クロロホルムで抽出し、透析し、そして濃縮した。次いで。それをＭ１ ３ｍｐｌＯベクター中にＰＣＲクローニング手順（Ｓｅｈａｒｆ　ら、前掲）の 変法により結合した。Ｆ′１１３プラークを最初にインサートについてＩ）Ｑ− アルファまたはＤローベータのｃＤＮＡプローブと、および場合におうじて対立 遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ（Ｓａｉｋｉら、前掲）と のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。これらのクローンは、ま た、ＡＳＯプローブの使用によりＤＸアルファまたはＤＸ−ベータの増幅産生物 についてスクリーニングした。−重鎖のファージＤＮＡを標準技術により分離し 、そしてジデオキシヌクレオチドブライマー伸長方法、Ｓｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、６５　：　５６０−５８０（１９８０）により配列決定した 。

実１小１ ウィルスの西　ｌの　６ エプスタイン−バールウィルスの菌株Ｂ９５−８の１７２２８２−ｂｐのゲノム の配列（Ｂａｅｒ　ら、前掲）をコンピュータによりタンパク質の配列に、すべ ての６つの前進および逆の相について翻訳した。次いで、これらの翻訳を５また はそれ以上のアミノ酸とＤＱ−ベータ対立遺伝子の位置５７を中心とするポリペ プチド配列との正確な合致についてサーチした（参照、表Ｖｌｌ）。

次いで、各合致についてのオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置およ び大きさを決定し、そして主要なＯＲＦおよびＥＢνゲノムの転写のセグメント と相関関係づけた（Ｂａｅｒら、前掲）。これらの相同性の有意性を判定する１ つの方法は、不規則に起こるそれらの機会を推定することによる。ＥＢＶの６つ の翻訳の相において、ＤＯ−ベータ対立遺伝子の位置５７付近のアミノ酸残基は 端数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）で起こる：、　Ａ　＝　０．０８０４、Ｄ　＝０．０ ２５８、Ｅ　＝０．０３３７、Ｇ＝０．１０８９、Ｌ　＝０．０８９０、Ｐ〒０ 、１０８９、Ｒ＝０．０９６２、およびＹ　＝０．０ｉ４１．これらの頻度を一 緒に掛けることによって、ポリペプチドのエピトープについての不規則に起こる 機会は、次の通りである：　ｒＲＰＤＡＥ　Ｊ　＝１　／１，３７０，０００、 ’ＧＬＰＡＡ　Ｊ　＝　１　／１４７，０００　、ｒＰＡＡＥＹ　Ｊ　−１／２ ，９９０．０ＯＯ２ｒＧＰＰＡＡ　Ｊ　＝　１　／１２０，０００およびｒＰＰ ＡＡＥＹＪ＝　１　／２７，４００，０００゜こうして、すべての６つの翻訳に おいて３４４．５６０の残基が存在するので、ｒＧＰＰＡＡ　ＪおよびｒＧＬＰ ＡＡ　Ｊエピトープについていくつかの不規則の発生が期待されるが、他につい て期待されない。主要なＯＲＦとおよびゲノムの反復したセグメントとの合致お よびそれらの相関関係の過剰な数は、それらの有意性に寄与する。統計的確率の みにより、６つの残基の合致ｒＰＰＡＡＥＹＪは不規則に起こった可能性が特に ある。

分子および臨床生物学および診断および関係する修練の分野における当業者にと って明らかなように、本発明の前述の実施態様の他の変更は、次の請求の範囲内 入ることが意図される。

浄會（内容に変更なし） ＰＣＲ増幅ＤＲ−ベータセグメントの配列６１　ＣＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧ ＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＣ ＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡ１２１　ＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧ ＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴ Ｇ` ＰＣＲプライマーの配列　− Ｇ）＋４６；　ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ　２ ７−ｍａｒＧＨ５０：　ＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧ ＣＡ　２７−ｍａｒＤｗ配列特異的オリゴマーの配列 ＧＨ７８：　ＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣ１９−ｒｎｅｘＦＩＧ、 ｊ ＤＲベベーーＩ配列 ＦＩＧ、　２ −Ｆ’−−−−−−−−−−Ｅ−−−−−−−−ｒ−−ＤＲ−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−（ＤＲ５）−１ＦＩＧ、２（続き） −Ｅ−−−−−−−−−−−Ｄ−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−ＤＲ ４ＤＯ讐３．１ＨＬＡＤＱ−ベータタンパクｗＬ配列の整列ＦＩＧ、４ｂ ＦＩＧ、４ｂ（続き） ）（ＬＡＤＲ−ベータタンパク質配列の整列ＦＩＧ、５ａ ＦＩＧ、５ａ（続き） ＨＬＡＤＲ−ベータタンパク質配列の整列ＦＩＧ、　５ｂ ＦＩＧ、５ｂ（続ぎ） ＨＬＡＤＨ−ベータタンパク質配列の整列會ｒＤＤＭ患者がう ＦＩＧ、　５ｃ 手続補正！（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０４０６７ ２、発明の名称 自己免疫病に関連する配列の特性決定及び検出３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ６、補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）図面の翻訳文　１通 国際調査報告 ｌｍｆｉａ＋１ｅｅａｌ　Ａｓ２−ｂｅ７．、ＰＣＴ／ＩＪｓ　８Ｅ１１０４０ ６７　２特表千３−５０１９２６　（２６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インスリン依存性真性糖尿病に関連しかつ尋常性天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕ ｓｖｕｌｇａｒｉｓ）に対するＤＲ４関連感受性に関連するＨＬＡクラスＩＩベ ータ遺伝子からのマーカ−ＤＲ−ベータ−ＩＤＮＡ配列。 ２．【配列があります】、またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖である、請求項 １に記載のマーカ−ＤＲ−べータ−ＩＤＮＡ配列。 ３．インスリン依存性真性糖尿病に対するＤＲ４、Ｄｗ６関連感受性に関連する 、請求項１に記載のマーカ−ＤＲーベータ−ＩＤＮＡ配列。 ４．【配列があります】、またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖である、請求項 ３に記載のマーカ−ＤＲ−ベータ−ＩＤＮＡ配列。 ５．尋常性天疱瘡に対するＤＲｗ６関連感受性に関連するＨＬＡクラスＩＩベー タ遺伝子からのマーカ−ＤＱ−ベータＤＮＡ配列。 ６．およそコドン２０〜約コドン８０のＤＱＢ１．３対立遺伝子の第２エクソン からの１または２以上の配列を含んでなる、請求項５に記載のマーカ−ＤＱ−ベ ータＤＮＡ配列。 ７．ＤＱ−ベータタンパク質の配列の位置５７におけるコドンの同一性を直接ま たは間接に検出するために使用することができる、インスリン依存性真性糖尿病 に対する感受性に関連するＨＬＡＤＱ−ベータ対立遺伝子からのマーカ−ＤＮＡ 配列。 ８．前記位置５７におけるコドンがアラニン、バリン、およびアスパラギン酸の ためのコドンから成る群より選択される、請求項７に記載のマーカ−ＤＮＡ配列 。 ９．　前記ＤＮＡ配列が、 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】および （ｃ）【配列があります】 またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖から成る群より選択される、請求項８に記 載のマーカ−ＤＮＡ配列。 １０．アラニン、バリンおよびアスパラギン酸のコドンから成る群から選択され る位置５７のコドンを含んで成る第２ＤＮＡ配列を直接検出するために使用され る、請求項７に記載のマーカ−ＤＮＡ配列。 １１．前記ＤＮＡ配列が、 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】および （ｄ）【配列があります】 またはそれに対して相補性のＤＮＡ鎖から成る群から選択される、請求項１０に 記載のマーカーＤＮＡ配列。 １２．次の工程： （ａ）ＤＮＡの試料を処理してその中のＤＮＡをハイブリダイゼーションに対し て暴露し、 （ｂ）前記処理した試料を膜に固定し、（ｃ）前記膜を、ハイブリダイゼーショ ン条件下で、標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブで処理し、該プ ローブは、 （１）【配列があります】 （２）【配列があります】 （３）【配列があります】および （４）【配列があります】 から成る群より選択されるＤＮＡ配列の１または２以上と、あるいはそれに対し て相補性のＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションすることができるものであり、そ して（ｄ）前記プローブが試料中のいずれかのＤＮＡとハイブリダイゼーション したかどうかを検出する、ことを含んでなるＤＮＡの試料中のインスリン依存性 真性糖尿病に対する感受性に関連する配列の存在または存在を検出する方法。 １３．ＤＱ−ベータタンパク質の位置５７に相当するアミノ酸残基を含んでなる エピトープを含有するペプチドに結合する抗体であって、該抗体はヒト永続性ウ イルス病原体によりコードされる相同性ペプチド配列との交差反応性を有し、そ して前記アミノ酸残基はアラニンおよびバリンから成る群より選択される、抗体 。 １４．前記ペプチドが、 （ａ）【配列があります】、 （ｂ）【配列があります】、および （ｃ）【配列があります】、 から成る群より選択される、上記第１３項記載の抗体。 １５．前記ウイルスの病原体が、エプスタインバール（Ｅｐｓｔｅ−ｉｎ−Ｂａ ｒｒ）ウイルス、風疹ウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス 、およびレオウイルスから成る群より選択される、請求項１３に記載の抗体。 １６．次の工程： （ａ）タンパク質の試料を、検出可能な成分で標識した請求項１３に記載の抗体 の１または２以上の存在下にインキュベーションし、そして （ｂ）前記成分を検出する、 ことを含んでなる、タンパク質の試料中のインスリン依存性真性糖尿病に対する 感受性に関連する配列の存在または不存在を検出する方法。 １７．標識した抗体とのインキュベーションの前、間、または後に、前記試料を モノクローナル抗体の存在下にインキュベーションし、該モノクローナル抗体は 固体の支持体に固定化されており、そして、 （ａ）【配列があります】、 （ｂ）【配列があります】、および （ｃ）【配列があります】、 から成る群より選択されるアミノ酸配列の１又は２以上と結合するものである請 求項１６に記載の方法。 １８．次の工程： （ａ）血清試料を、【配列があります】、【配列があります】、および【配列が あります】から成る群より選択されるペプチドの１または２以上の存在下にイン キュベーションし、 （ｂ）前記ペプチドと前記血清試料中に存在する抗体との間で形成された免疫複 合体の存在を検出し、そして（ｃ）工程（ｂ）の結果から、感受性のハプロタイ プが存在するかどうかを決定する、 ことを含んでなる、血清試料中のインスリン依存性真性糖尿病に対する感受性に 関連するハプロタイプを同定する方法。 １９．アミノ酸配列が、インスリン依存性真性糖尿病に関連しかつ尋常性天疱瘡 （Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）に対するＤＲ４関連感受性に関連す るＨＬＡクラスＩＩベータ遺伝子からのマーカ−ＤＲ−ベータ−ＩＤＮＡ配列； 尋常性天疱瘡に対ずるＤＲｗ６関連感受性に関連するマーカ−ＤＱ−ベータＤＮ Ａ配列；インスリン依存性真性糖尿病に関連するマーカ−ＤＲ３ベータＩＩＩ配 列；および配列決定したＤＱ−ベータタンパク質配列の位置５７のためのコドン を含有する、インスリン依存性真性糖尿病に対する感受性に関連するＤＱ−ベー タ対立遺伝子からのマーカーＤＮＡ配列；から成る群より選択されるＨＬＡクラ スＩＩベータ遺伝子からのＤＮＡ配列によりコードされているアミノ酸配列およ び／またはそれに対する抗体の予防的および／または治療的使用。