JP2868635B2 - キチン・キトサンオリゴマーの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、亜硝酸を大量に含有し
ているキチン又はキトサンオリゴマー混合物より亜硝酸
を除去するためのキチン・キトサンオリゴマーの精製方
法に係り、特にキチンまたはキトサンを亜硝酸と反応さ
せて得られた未反応の亜硝酸を大量に含有する末端に
２，５−アンヒドロマンノース基を有するキチン又はキ
トサンオリゴマーの混合物より亜硝酸を除去するための
キチン・キトサンオリゴマーの精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、食生活が豊かになり、海外より
蟹、海老が輸入されて、その甲殻のキチン質からキチン
やキトサンが大量に生成されるようになった。これらキ
チンやキトサンはそれ自体が農薬、人工皮膚、生活関連
物質などとして開発されつつあるが、更に付加価値の高
いキチンオリゴ糖またはキトサンオリゴ糖が注目される
ようになった。このようなキチンオリゴ糖またはキトサ
ンオリゴ糖は、一般にキチンをキチナーゼにより、ま
た、キトサンをキトサナーゼにより酵素で分解すること
によって製造されることが知られている。また、キチン
またはキトサンを濃塩酸で部分加水分解してＮ−アセチ
ルグルコサミンやグルコサミンからＮ−アセチルキトペ
ンタオースやキトペンタオースを製造することも知られ
ている。更に、アミノ態窒素を定量するバンスライク法
を利用した、キトサンに亜硝酸を加えて２０〜２５℃の
温度で反応させてグルコサミンなどを製造する（米国特
許第３，９２２，２６０号明細書参照）ことも知られて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記酵
素で分解させる方法は、反応濃度が稀薄であるために大
量生産するのに大規模な設備を必要とする。また、その
生成濃度も０．００１％程度と薄いため、濃縮しなけれ
ばならなく、しかも、該オリゴ糖の末端が

【０００４】

【化１】 の構造のものが生成されることから、濃縮の際などに加
熱されるとアミノ基と糖との反応であるメイラード反応
が起きて着色する虞れがある。また、これを水素化ホウ
素ナトリウムなどで還元したとしても開環して糖アルコ
ールとなってしまうなどの問題があった。また、濃塩酸
で部分加水分解する方法は、前記酵素で分解させる方法
と同じ生成物が得られるので、上記の如き着色問題や開
環の問題を解決することができないといった欠点があ
る。更に、前記キトサンに亜硝酸を反応させる方法は高
分子のキトサンを使用しているためか、使用される亜硝
酸の量がキトサンのアミノ基１モルに対して等モルも添
加していることから、単糖であるグルコサミンにまで分
解されたり、２０℃以上の比較的高い温度で長時間反応
が行なわれていることから、単糖にまで分解される前に
転移反応や反応生成物の再結合反応などが起きて、キト
サンオリゴ糖以外の分子量の比較的大きな生成物が生成
する。従って、生成物中には未反応の亜硝酸が大量に残
存している。しかし、このような亜硝酸が残存している
反応生成物は、該亜硝酸が一般に発癌性物質であるとし
て知られていることから、日本国においては「各種食品
中に２５ｐｐｍ以上残存していないこと。」と食品法に
規定されている。それ故、キトサンオリゴ糖の亜硝酸の
含有量が上記範囲以下にしなければ食品添加物や医薬品
製造用として使用できず、その用途開発に制約を与えて
いる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

［発明の概要］本発明者らは、上記問題点に鑑みて鋭意
研究を重ねた結果、キチン又はキトサンを亜硝酸で加水
分解させるなどの方法によって得られた、亜硝酸又は亜
硝酸塩を含む末端に２，５−アンヒドロマンノース基を
有するキチン・キトサンオリゴマー混合物より亜硝酸又
は亜硝酸塩を除去するためのキチン・キトサンオリゴマ
ーの精製方法において、前記亜硝酸又は亜硝酸塩を含む
キチン又はキトサンオリゴマー混合物に、アンモニア、
アルキルアミン類又は陰イオン交換樹脂を加えて中和
し、更に還元剤を加えて該２，５−アンヒドロマンノー
ス基をアルコール型の２，５−アンヒドロマンニトール
基に還元して変化させた後で、貧溶媒、特にアルコール
類を加えれば、前記キチン・キトサンオリゴマー混合物
よりキチン・キトサンオリゴマーを容易に析出させるこ
とができ、しかも、析出されたキチン・キトサンオリゴ
マー中には亜硝酸又は亜硝酸塩を殆ど含んでいない精製
された安定なキチン・キトサンオリゴマーを得ることが
できるとの知見を得て本発明を完成するに至った。すな
わち、本発明のキチン・キトサンオリゴマーの精製方法
は、亜硝酸又は亜硝酸塩を含む末端に２，５−アンヒド
ロマンノース基を有するキチン又はキトサンオリゴマー
の混合物より亜硝酸又は亜硝酸塩を除去するキチン・キ
トサンオリゴマーの精製方法において、前記末端に２，
５−アンヒドロマンノース基を有するキチン・キトサン
オリゴマー混合物に、アンモニア、アルキルアミン類又
は陰イオン交換樹脂を加えて中和し、更に還元剤を加え
て還元させた後、貧溶媒を加えてキチン・キトサンオリ
ゴマーを析出させることを特徴とするものである。

【０００６】［発明の具体的説明］ [I] 原 料 (1) 亜硝酸又は亜硝酸塩を含有する末端に２，５−ア
ンヒドロマンノース基を有するキチン・キトサンオリゴ
マー混合物 本発明のキチン・キトサンオリゴマーの精製方法におい
て原料として使用される亜硝酸又は亜硝酸塩を含有する
末端に２，５−アンヒドロマンノース基を有するキチン
・キトサンオリゴマー混合物としては、末端に２，５−
アンヒドロマンノース基を有するキチン又はキトサンオ
リゴマー中に亜硝酸又は亜硝酸塩を含有している混合物
であり、このような混合物は各種製法によって製造され
たものをも使用可能である。しかし、これらキチン又は
キトサンオリゴマーの中で好適なものとしては、キチン
又はキトサンを亜硝酸又は亜硝酸塩と反応させて得られ
た、末端に２，５−アンヒドロマンノース基を有するキ
チン又はキトサンオリゴマーと、大量の未反応の亜硝酸
や亜硝酸塩とを含有する反応混合物、或いは、該反応混
合物中より不純物を簡略化した手法によって除去したも
のである。このような末端に２，５−アンヒドロマンノ
ース基を有するキチン又はキトサンオリゴマーと、大量
の未反応の亜硝酸又は亜硝酸塩とを含有する反応混合物
としては、具体的には以下に示すキチンまたはキトサン
を亜硝酸又は亜硝酸塩と反応させて製造したものなどで
ある。

【０００７】(a) キチン又はキトサン 末端に２，５−アンヒドロマンノース基を有するキチン
又はキトサンオリゴマーおよび未反応の亜硝酸を含有す
る反応混合物を製造するために用いられるキチン・キト
サンとしては、海老、蟹などの甲殻類、カブト虫、コオ
ロギなどの昆虫類、シイタケ、糸状菌類の細胞壁の構成
成分として含有されているキチン質を希塩酸で処理して
炭酸カルシウムを除き、アルカリ濃溶液で短時間処理し
てタンパク質を除いたキチン、或いは、これを濃アルカ
リの存在下で加熱して脱アセチル化して得られたキトサ
ンを挙げることができる。

【０００８】(b) 亜硝酸 前記キチン又はキトサンと反応させるために用いられる
亜硝酸としては、亜硝酸をそのまま用いることもできる
が、通常、反応を緩慢に進行させるために、その場で亜
硝酸が得られる亜硝酸塩を使用することが好ましい。こ
のような亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸
カリウム、亜硝酸亜鉛、亜硝酸アンモニウム、亜硝酸カ
ルシウム、亜硝酸バリウム、亜硝酸マグネシウムなどが
あるが、これらの中では亜硝酸アルカリ金属塩、特に亜
硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムが好ましい。これら亜
硝酸塩はキチン又はキトサン中のアミノ基を脱アミノ化
してアルコール化するために用いられることから、アミ
ノ基に対して通常０．０１〜１モル当量、好ましくは
０．１〜０．６モル当量の範囲内で用いられ、その量に
よって生成するキチン・キトサンオリゴマーの分子量の
コントロールを行なうことができる。

【０００９】(c) 反 応 上記原材料を用いてキチン又はキトサンと亜硝酸との反
応は、キチン又はキトサンに可溶化剤を添加して反応溶
媒である水と混合されるのが普通である。このような可
溶化剤としては、蟻酸、酢酸、酪酸、修酸、酒石酸、コ
ハク酸、乳酸、アスコルビン酸、プロピオン酸、アジピ
ン酸、安息香酸などの有機酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸
などの鉱酸などを挙げることができる。該反応条件とし
ては、通常−５〜１０℃、好ましくは０〜８℃、特に好
ましくは２〜６℃の温度で、水素イオン濃度が１〜６、
好ましくは２〜５の水溶液中で、通常２〜３時間程度行
なわれる。この様な条件下で混合されることによって反
応は穏やかに進むことから、キチンまたはキトサンはグ
ルコサミノグルカン単位が結合しているグルコシド結合
部分で加水分解させられるのでは無く、キチンまたはキ
トサン中のアミノ基を部分的に亜硝酸により脱アミノ化
してアルコール化し、このアルコール基がグルコサミノ
グルカン単位のグルコシド結合部分の酸素とにより隣接
した疑似グリコールを構成していることから、下記に示
すピナコール転移反応を生起せしめているのではないか
と推定している。

【００１０】

【化２】 上記反応条件における反応温度が−５℃未満では反応が
著しく遅くなり、１０℃を超えると加水分解反応が生起
して、更に、転移反応や再結合が起こって人体への毒性
の発現が憂慮される再結合したグリコシド化合物などが
できたりする虞がある。また、水素イオン濃度が１未満
の場合はグリコシド結合が切れる加水分解反応が起こり
易く、その上転移反応や再結合を起こす虞もあるし、水
素イオン濃度が６を超える場合は亜硝酸イオンが解離分
解してしまうので失効したり、分子量のコントロールを
行ない難い。反応が終了した際、濃アンモニア水やアル
キルアミンなどの溶液を加えて反応混合物を中和させ
る。

【００１１】(d) 反応生成物 上記キチン又はキトサンと亜硝酸又は亜硝酸塩との反応
によって得られた反応生成物は、一端に構造式が、

【００１２】

【化３】 の２，５−アンヒドロマンノース基を有しており、他端
の構造式が、

【００１３】

【化４】

【００１４】または、

【００１５】

【化５】 を示すものであり、これら両端が直接、或いは、

【００１６】

【化６】 で表されるアセチルアミノ基を備えた構造式の単位の
鎖、或いは、

【００１７】

【化７】 で表されるアミノ基を備えた構造式の単位の鎖を０〜
１，０００個、好ましくは０〜３００個、特に好ましく
は０〜１００個結合したもので、前記アセチルアミノ基
を備えた構造式の単位／アミノ基を備えた構造式の単位
の比率が１を超える場合はキチンオリゴマーであり、１
未満の場合はキトサンオリゴマーである。

【００１８】(2) 中和剤 本発明のキチン・キトサンオリゴマーの精製方法におい
て原料として使用される中和剤としては、アンモニア、
アルキルアミン類又は陰イオン交換樹脂が使用される。
これらアンモニア水、アルキルアミン類又は陰イオン交
換樹脂は、通常の中和剤である水酸化ナトリウムや水酸
化カリウムと異なり、亜硝酸を中和した後でも除去が容
易で、中和後の分離精製の際にも困難なことが生じ難い
ばかりか、その後に行なわれるキチン・キトサンオリゴ
マーの析出を助けることができるので好適である。これ
らアンモニア、アルキルアミン類又は陰イオン交換樹脂
のアンモニアとしては、アンモニアガスを水に溶解させ
て得られた２５〜３０重量％の濃度のアンモニア水、或
いは、前記アルキルアミン類としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１５のアルキルアミン、具体的には
メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチル
アミン、ヘキシルアミンなどのモノアルキルアミン、ジ
メチルアミン、ジエチルアミン、ジブチルアミンなどの
ジアルキルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、トリアミ
ルアミンなどのトリアルキルアミン、或いは、前記陰イ
オン交換樹脂としては、合成樹脂の母体にアミノ基（−
ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−ＮＨ_２、）、第四アンモニウム基
（−^＋ＮＲ_３）などの塩基性基持つ樹脂を挙げることが
できる。これら前記陰イオン交換樹脂によって、亜硝酸
又は亜硝酸塩を吸着して、該陰イオン交換樹脂を濾過な
どによって濾過すれば容易に中和することができる。

【００１９】(3) 還元剤 本発明のキチン・キトサンオリゴマーの精製方法におい
て原料として使用される還元剤としては、アルデヒド基
を穏やかに還元することができる還元剤であればどの様
なものでも使用することができる。例えば、ラネーニッ
ケル、Ｎｉ−カーボンなどのニッケル系水素化還元用触
媒、Ｐｄ−カーボンなどのパラジウム系水素化還元用触
媒、水素化ジイソブチルアルミニウム、有機スズ水素化
物、ヒドロシランなどの金属水素化物；水素化アルミニ
ウムリチュウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ
素カリウム、水素化ホウ素リチュウム、水素化ホウ素カ
ルシウム、水素化ホウ素亜鉛などの金属水素錯化合物；
ジボラン、アルキルボランなどを挙げることができる。
これら還元剤の中で特に好適な還元剤としては、水素化
ジイソブチルアルミニウム、有機スズ水素化物、ヒドロ
シランなどの金属水素化物；水素化アルミニウムリチュ
ウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウ
ム、水素化ホウ素リチュウム、水素化ホウ素カルシウ
ム、水素化ホウ素亜鉛などの金属水素錯化合物；ジボラ
ン、アルキルボランなどを挙げることができる。

【００２０】(4) 析出剤 そして、この中和物に、キチン・キトサンオリゴマーの
貧溶媒で、しかも水と良く混合する析出剤を徐々に、或
いは、段階的に添加していって、該混合液中に溶解して
いるキチン・キトサンオリゴマーを徐々に析出させ、こ
れを濾過することによって回収する。該析出剤の使用量
は中和物の水溶液に対して、一般に０．５〜１，０００
容量％、好ましくは１〜５００容量％である。本発明の
キチン・キトサンオリゴマーの精製方法において還元反
応生成物媒体中より析出させるための原料として使用さ
れる析出剤としては、生成したキチン・キトサンオリゴ
マーの貧溶媒で、しかも水と良く混合するものであれば
使用することができ、例えば、アルコール類、ケトン
類、エーテル類、エステル類、炭化水素類などを挙げる
ことができる。具体的にはメタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、エチレングリコールなどの炭
素数１〜５、好ましくは１〜４のアルコール類、アセト
ン、メチルエチルケトンなどの炭素数１〜５、好ましく
は１〜４のケトン類、エチルエーテルなどの炭素数２〜
６、好ましくは２〜４のエーテル類、酢酸エチルなどの
炭素数２〜１０、好ましくは２〜５のエステル類、ｎ−
ヘキサン、石油エーテルなどの炭素数１〜１０、好まし
くは１〜６の炭化水素などがある。

【００２１】[II] 中 和 前記原料である亜硝酸又は亜硝酸塩を含む末端に２，５
−アンヒドロマンノース基を有するキチン・キトサンオ
リゴマー混合物には、未反応の亜硝酸又は亜硝酸塩が多
量に含まれていることから、強い酸性を示し、これら亜
硝酸又は亜硝酸塩をそのままの状態で次の工程の反応を
行なおうとすると種々の問題が生じるので中和を行なう
ことが重要である。このような中和は上記中和剤を添加
することによって行なわれる。中和剤の添加量は反応混
合物のｐＨが７〜８程度になるまで添加して調整され
る。

【００２２】[III] 還元反応 前記中和混合物中に含まれる末端に２，５−アンヒドロ
マンノース基を有するキチン・キトサンオリゴマーは反
応性の高いアルデヒド基を有しており、着色や再結合或
いは亜硝酸との吸着などを生じやすいことから、本発明
方法においてはこのアルデヒド型の２，５−アンヒドロ
マンノース基をアルコール型の２，５−アンヒドロマン
ニトール基に還元して変化させることが重要である。従
って、本発明方法では前記中和混合物をそのまま或いは
該中和混合物を簡単に不純物を濾過などによって除去し
た後、前記還元剤を添加して還元が行なわれる。還元剤
はキチン・キトサンオリゴマー中の２，５−アンヒドロ
マンノース基１モル当たり、一般に１モル以上、好まし
くは１．５〜３モル添加して、キチン・キトサンオリゴ
マー中の２，５−アンヒドロマンノース基を２，５−ア
ンヒドロマンニトール基に還元する。該還元反応は、一
般に１００℃以下、好ましくは室温以下の温度にて行な
われる。該還元は実質的に還元性の２，５−アンヒドロ
マンノース基が存在しなくなるまで行なわれる。

【００２３】[IV] 析 出 そして、この中和物に、キチン・キトサンオリゴマーの
貧溶媒で、しかも水と良く混合する前記析出剤を徐々
に、或いは、段階的に添加していって、該混合液中に溶
解しているキチン・キトサンオリゴマーを徐々に析出さ
せ、これを濾過することによって回収する。該析出剤の
使用量は中和物の水溶液に対して、一般に０．５〜１，
０００容量％、好ましくは１〜５００容量％である。

【００２４】[V] 精製キチン・キトサンオリゴマー このようにして得られた本発明のキチン・キトサンオリ
ゴマーの構造は、一端の構造式が、

【００２５】

【化８】 の２，５−アンヒドロマンニトール基を有しており、他
端の構造式が、

【００２６】

【化９】

【００２７】または、

【００２８】

【化１０】 を示すものであり、これら両端が直接、或いは、

【００２９】

【化１１】 で表わされるアセチルアミノ基を備えた構造式の単位の
鎖、または、

【００３０】

【化１２】 で表されるアミノ基を備えた構造式の単位の鎖を０〜
１，０００個、好ましくは０〜３００個、特に好ましく
は０〜１００個結合したものである。キチンキトサンオ
リゴマーには貧溶媒を、亜硝酸には良溶媒という二面性
を持つ溶媒を用いることが好ましい。したがって、本発
明のキチン・キトサンオリゴマーは、２，５−アンヒド
ロマンノース基が熱的にも安定な２，５−アンヒドロマ
ンニトール基に還元した状態で、亜硝酸を混合液中にて
十分に中和して、該亜硝酸を水中に溶解させた状態のま
までキチン・キトサンオリゴマーの貧溶媒を徐々に添加
して、該混合液中に溶解しているキチン・キトサンオリ
ゴマーのみを徐々に析出させて回収することから、生成
したキチン・キトサンオリゴマー中には亜硝酸又は亜硝
酸塩が、一般に２０ｐｐｍ以下、好ましくは２ｐｐｍ以
下、特に好ましくは０〜０．７ｐｐｍ程度しか含有され
ていないので、食品法に規定される２５ｐｐｍ以下の濃
度となって合格しており、食品添加物や医薬品製造用と
しての用途開発にも制約を受けることがない。

【００３１】

【実施例】実施例１２，５−アンヒドロマンノース基を有するキトサンオリ
ゴマーの製造 内容積５００ミリリットルの攪拌機付ガラス製ビーカー
に、３０メッシュパスのフレーク状キトサン（分子量：
４０，０００）１０ｇを入れて、これに酢酸水溶液１０
０ミリリットル（可溶化剤／水：１０容量％）を攪拌下
に少量づつ加えて溶解し、氷水浴で十分冷却して４℃と
した。次いで、亜硝酸ナトリウム１０％水溶液１４．５
ミリリットル（亜硝酸／キチン・キトサン中のアミノ基
（モル比）：０．５）を加え、水素イオン濃度を３に調
整して水溶液中で攪拌下に２時間反応させて、２，５−
アンヒドロマンノース基を有するキトサンオリゴマーを
製造した。

【００３２】中和反応 反応終了後、この反応生成物に１５ミリリットルの濃ア
ンモニア水を加えて中和した。

【００３３】還元反応 上記反応生成物の中和物に水素化ホウ素ナトリウム１．
６ｇ（亜硝酸ナトリウムに対して２倍モル）を加えて、
室温で一晩攪拌して還元反応を行なって、２，５−アン
ヒドロマンニトール基を有するキトサンオリゴマーを製
造した。

【００３４】析 出 還元反応終了後、反応液から不純物を取り除くために濾
過し、濾液を１００ミリリットルまで濃縮し、これにメ
タノールを第１表に示す割合で混合して沈澱物を析出さ
せた。

【００３５】分 析 この沈澱物を赤外線分析により分析した結果を第１図と
して示す。この赤外線分析により沈澱物は２，５−アン
ヒドロマンニトール基を有するキトサンオリゴマーであ
ることが判明した。また、この沈澱物中の残留亜硝酸の
量をジアゾ化法によって分析し、その結果を表１に示
す。

【００３６】

【表１】

【００３７】

【発明の効果】このような本発明のキチン・キトサンオ
リゴマーの精製方法は、亜硝酸を含有する末端に２，５
−アンヒドロマンノース基を有するキチン又はキトサン
オリゴマーの混合物に、アンモニア、アルキルアミン類
又は陰イオン交換樹脂を加えて中和し、更に還元剤を加
えて２，５−アンヒドロマンノース基を２，５−アンヒ
ドロマンニトール基に還元して変化させた後、貧溶媒を
加えてキチン・キトサンオリゴマーを析出させることに
よって得られる精製された安定なキチン・キトサンオリ
ゴマー中には、亜硝酸が一般に２０ｐｐｍ以下、好まし
くは２ｐｐｍ以下、特に好ましくは０〜０．７ｐｐｍ程
度しか含有されていないので、食品法に規定される２５
ｐｐｍ以下の濃度となって合格しており、食品添加物や
医薬品製造用としての用途開発にも制約を受けることが
ない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明実施例によって製造されたキトサ
ンオリゴマーの赤外線分析によるチャート紙である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】亜硝酸又は亜硝酸塩を含む末端に２，５−
   アンヒドロマンノース基を有するキチン又はキトサンオ
   リゴマーの混合物より亜硝酸又は亜硝酸塩を除去するキ
   チン・キトサンオリゴマーの精製方法において、前記末
   端に２，５−アンヒドロマンノース基を有するキチン・
   キトサンオリゴマー混合物に、アンモニア、アルキルア
   ミン類又は陰イオン交換樹脂を加えて中和し、更に還元
   剤を加えて還元させた後、貧溶媒を加えてキチン・キト
   サンオリゴマーを析出させることを特徴とする、キチン
   ・キトサンオリゴマーの精製方法。
2. 【請求項２】貧溶媒がケトン類又はアルコール類である
   請求項１に記載のキチン・キトサンオリゴマーの精製方
   法。