JP2839639B2 - リボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 - Google Patents
リボ核酸（ｒｎａ）の合成方法Info
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- JP2839639B2 JP2839639B2 JP2121066A JP12106690A JP2839639B2 JP 2839639 B2 JP2839639 B2 JP 2839639B2 JP 2121066 A JP2121066 A JP 2121066A JP 12106690 A JP12106690 A JP 12106690A JP 2839639 B2 JP2839639 B2 JP 2839639B2
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- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、特定の核酸配列（ターゲット配列）を含む
デオキシリボ核酸（DNA）からRNAを合成する方法に係わ
る。
デオキシリボ核酸（DNA）からRNAを合成する方法に係わ
る。
分子生物学では核酸配列の特定フラグメントの単離及
び／又は検出に関する研究が盛んに行われている。基本
的問題の１つは、核酸を単離した後で核酸配列の特定フ
ラグメントの量及び／又は存在を調べることにある。こ
の問題は簡単には解決できない。なぜなら、生物学的材
料、例えば細胞培養物及び／又は組織培養物並びに尿及
び血液のような体液はしばしば核酸複合体を含み、検出
すべき配列を含むのはこの複合体の極めて小さいフラク
ションにすぎないからである。米国特許第4,683,202号
でCetusはこの問題を解決すべく、いわゆるPCR（Polyme
rase chain reaction）法でターゲット配列を複製する
方法を開示している。この方法はターゲット配列のフラ
グメントを認識するプライマーを少なくとも２つ使用す
るものであり、ターゲット配列を複数のサイクルで加速
度的に複製せしめる。この方法を使用するとターゲット
配列が３時間の間に20サイクルで約105倍に複製され、
その結果ターゲット配列の検出が可能になる。
び／又は検出に関する研究が盛んに行われている。基本
的問題の１つは、核酸を単離した後で核酸配列の特定フ
ラグメントの量及び／又は存在を調べることにある。こ
の問題は簡単には解決できない。なぜなら、生物学的材
料、例えば細胞培養物及び／又は組織培養物並びに尿及
び血液のような体液はしばしば核酸複合体を含み、検出
すべき配列を含むのはこの複合体の極めて小さいフラク
ションにすぎないからである。米国特許第4,683,202号
でCetusはこの問題を解決すべく、いわゆるPCR（Polyme
rase chain reaction）法でターゲット配列を複製する
方法を開示している。この方法はターゲット配列のフラ
グメントを認識するプライマーを少なくとも２つ使用す
るものであり、ターゲット配列を複数のサイクルで加速
度的に複製せしめる。この方法を使用するとターゲット
配列が３時間の間に20サイクルで約105倍に複製され、
その結果ターゲット配列の検出が可能になる。
ごく最近になって、SISKA DiagnosticsはWO 88/10315
で二重鎖DNAフラグメントから出発するRNA製造方法を開
示した。
で二重鎖DNAフラグメントから出発するRNA製造方法を開
示した。
このSISKA特許出願の方法でも前出のCetusの方法と同
様に、DNAが存在する被検液から前記二重鎖DNAフラグメ
ントを得るために２つのプライマーを使用する。SISKA
の発明では、一方のプライマーに例えばバクテリオファ
ージT7プロモーターのプロモーター配列を与える。その
結果、T7−RNAポリメラーゼを用いてRNAを転写できるよ
うになる。この方法はCetusの方法と同様の欠点、即ち
ターゲット配列を複製するのに必ず２つのプロモーター
を使用しなければならないという欠点を有する。
様に、DNAが存在する被検液から前記二重鎖DNAフラグメ
ントを得るために２つのプライマーを使用する。SISKA
の発明では、一方のプライマーに例えばバクテリオファ
ージT7プロモーターのプロモーター配列を与える。その
結果、T7−RNAポリメラーゼを用いてRNAを転写できるよ
うになる。この方法はCetusの方法と同様の欠点、即ち
ターゲット配列を複製するのに必ず２つのプロモーター
を使用しなければならないという欠点を有する。
本発明は、ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸
（DNA）からRNAを合成する新規の方法を提供する。本発
明の方法では、前記DNAを１つ又は複数の制限酵素で処
理し、得られたDNAフラグメントを分離ステップによっ
て一重鎖にし、その後ターゲット配列の部分に対応する
ヌクレオチド配列に結合したプロモーター配列を含む１
つの核酸プライマーを、適当な条件下で、対応する一重
鎖DNAにハイブリダイスし、次いでハイブリッド形態で
得られた２つの核酸配列をDNAポリメラーゼにより自由
３′末端から伸長させて二重鎖DNAとし、これをRNAポリ
メラーゼのマトリックスとして使用してRNAを合成す
る。
（DNA）からRNAを合成する新規の方法を提供する。本発
明の方法では、前記DNAを１つ又は複数の制限酵素で処
理し、得られたDNAフラグメントを分離ステップによっ
て一重鎖にし、その後ターゲット配列の部分に対応する
ヌクレオチド配列に結合したプロモーター配列を含む１
つの核酸プライマーを、適当な条件下で、対応する一重
鎖DNAにハイブリダイスし、次いでハイブリッド形態で
得られた２つの核酸配列をDNAポリメラーゼにより自由
３′末端から伸長させて二重鎖DNAとし、これをRNAポリ
メラーゼのマトリックスとして使用してRNAを合成す
る。
この新規の合成方法の大きな利点は、１つ以上の制限
酵素の使用によって、プロモーター配列を備えた核酸プ
ライマーを１つ用いるだけで二重鎖DNAを形成できるよ
うになったという点にある。あとは、RNAポリメラーゼ
によって前記二重鎖DNAからRNAを転写すればよい。本発
明の方法では更に、前記二重鎖DNAを得るのに分離ステ
ップを一度しか必要としない。
酵素の使用によって、プロモーター配列を備えた核酸プ
ライマーを１つ用いるだけで二重鎖DNAを形成できるよ
うになったという点にある。あとは、RNAポリメラーゼ
によって前記二重鎖DNAからRNAを転写すればよい。本発
明の方法では更に、前記二重鎖DNAを得るのに分離ステ
ップを一度しか必要としない。
この新規の方法を使用すれば、ターゲット配列に対応
する一重鎖DNAフラグメントが多数得られる。出発時の
ターゲット配列より多いこれらのRNAフラグメントは、
特定の方法で迅速且つ簡単に検出することができる。こ
れらの方法の１つは、合成RNAを変性条件でゲル電気泳
動にかけ次いでブロッティングすることによって検出
し、その後特定の標識したオリゴヌクレオチド配列（プ
ローブ）とハイブリダイズさせることからなる。適当な
標識物質は標識用の放射性物質、例えば3H、32P又は35S
である。酵素反応の影響下で変換し得、その結果検出が
可能になるような物質も標識物質として使用し得る。例
えば、アビジン／ビオチン複合体は標識物質として極め
て適している。
する一重鎖DNAフラグメントが多数得られる。出発時の
ターゲット配列より多いこれらのRNAフラグメントは、
特定の方法で迅速且つ簡単に検出することができる。こ
れらの方法の１つは、合成RNAを変性条件でゲル電気泳
動にかけ次いでブロッティングすることによって検出
し、その後特定の標識したオリゴヌクレオチド配列（プ
ローブ）とハイブリダイズさせることからなる。適当な
標識物質は標識用の放射性物質、例えば3H、32P又は35S
である。酵素反応の影響下で変換し得、その結果検出が
可能になるような物質も標識物質として使用し得る。例
えば、アビジン／ビオチン複合体は標識物質として極め
て適している。
本発明は、一重鎖DNA又は二重鎖DNAからRNAフラグメ
ントを合成するためのテストキットにも係わる。このテ
ストキットは、１つ又は複数の制限酵素並びにプロモー
ター配列を備えた１つの核酸プライマー、DNAポリメラ
ーゼ及びRNAポリメラーゼを含む。
ントを合成するためのテストキットにも係わる。このテ
ストキットは、１つ又は複数の制限酵素並びにプロモー
ター配列を備えた１つの核酸プライマー、DNAポリメラ
ーゼ及びRNAポリメラーゼを含む。
以下に、ターゲット配列を有するDNAからRNAフラグメ
ントを合成する方法を詳細に説明する。
ントを合成する方法を詳細に説明する。
「ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸（DNA）
から（合成する）」という表現は、本発明の方法が二重
鎖DNA又は一重鎖DNAを用いて開始されることを意味す
る。
から（合成する）」という表現は、本発明の方法が二重
鎖DNA又は一重鎖DNAを用いて開始されることを意味す
る。
「ターゲット配列」という用語は、しばしばゲノムと
呼ばれる総DNA中に存在する検出すべき一配列を意味す
る。この種のターゲット配列は、例えばウイルスのコー
ティングタンパク質の一成分をなす特定のタンパク質を
コードすることができる。
呼ばれる総DNA中に存在する検出すべき一配列を意味す
る。この種のターゲット配列は、例えばウイルスのコー
ティングタンパク質の一成分をなす特定のタンパク質を
コードすることができる。
本発明の方法を二重鎖DNAから始める場合には、１種
類以上の制限酵素を用いてゲノムからターゲット配列を
取出すことができる。そのためには、所定の重複末端
（付着端）又は端がそろったブラント末端のいずれかを
発生させる制限酵素を使用し得る。好ましくはDNAの４
又は６ヌクレオチド配列を認識する制限酵素を用いる。
類以上の制限酵素を用いてゲノムからターゲット配列を
取出すことができる。そのためには、所定の重複末端
（付着端）又は端がそろったブラント末端のいずれかを
発生させる制限酵素を使用し得る。好ましくはDNAの４
又は６ヌクレオチド配列を認識する制限酵素を用いる。
本発明の方法を一寿鎖DNAから始める場合には、クラ
スII制限酵素に属するエンドヌクレアーゼ、例えばFok
I酵素を極めて有効に使用し得る。この酵素の作用及び
特性はPodhajska及びSzybalskiの論文（Gene,40（198
5）,175−182）に詳述されている。このタイプの酵素を
使用すれば、一重鎖DNAからターゲット配列を取出すこ
とができる。
スII制限酵素に属するエンドヌクレアーゼ、例えばFok
I酵素を極めて有効に使用し得る。この酵素の作用及び
特性はPodhajska及びSzybalskiの論文（Gene,40（198
5）,175−182）に詳述されている。このタイプの酵素を
使用すれば、一重鎖DNAからターゲット配列を取出すこ
とができる。
二重鎖DNAからなるターゲット配列の２つの鎖はその
後分離しなければならない。この種の分離は、温度の上
昇、酵素反応の使用、例えばヘリカーゼもしくはトポイ
ソメラーゼの使用、又はアルカリ液（lye）での処理の
ような化学反応によって通常の手法で実施できる。
後分離しなければならない。この種の分離は、温度の上
昇、酵素反応の使用、例えばヘリカーゼもしくはトポイ
ソメラーゼの使用、又はアルカリ液（lye）での処理の
ような化学反応によって通常の手法で実施できる。
その後、「ターゲット配列の部分に対応するヌクレオ
チド配列に結合したプロモーター配列を含む核酸プライ
マー」を、制限酵素によって発生した自由３′末端を有
するターゲット配列を含む先に形成した一重鎖DNA分子
に適当な条件下でハイブリダイズさせる。
チド配列に結合したプロモーター配列を含む核酸プライ
マー」を、制限酵素によって発生した自由３′末端を有
するターゲット配列を含む先に形成した一重鎖DNA分子
に適当な条件下でハイブリダイズさせる。
核酸プライマーという用語は、ターゲット配列に対し
て十分な相同性（homology）を有する核酸配列（有機化
学合成又は組換えDNA法によって作られる）を意味し、
従って適当な条件下でこの核酸プライマーをターゲット
配列にハイブリダイズすることができる。プライマーは
しばしば少なくとも10ヌクレオチドの長さを有し、好ま
しくは約35ヌクレオチドの長さを有する。
て十分な相同性（homology）を有する核酸配列（有機化
学合成又は組換えDNA法によって作られる）を意味し、
従って適当な条件下でこの核酸プライマーをターゲット
配列にハイブリダイズすることができる。プライマーは
しばしば少なくとも10ヌクレオチドの長さを有し、好ま
しくは約35ヌクレオチドの長さを有する。
「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼによって
特異的に認識される核酸配列である（有機化学合成又は
組換えDNA法によって作られる）。前記RNAポリメラーゼ
は認識配列に結合して転写プロセスを開始し、その結果
RNAフラグメントが形成される。原則として、入手でき
るRNAポリメラーゼによって認識されるものであればい
ずれのプロモーター配列を使用してもよい。適当なプロ
モーターは、特定のバクテリオフォージポリメラーゼ、
例えばバクテリファージT3、T7又はSP6によって認識さ
れるプロモーターである。T7及びSP6 RNAポリメラーゼ
が好ましい。
特異的に認識される核酸配列である（有機化学合成又は
組換えDNA法によって作られる）。前記RNAポリメラーゼ
は認識配列に結合して転写プロセスを開始し、その結果
RNAフラグメントが形成される。原則として、入手でき
るRNAポリメラーゼによって認識されるものであればい
ずれのプロモーター配列を使用してもよい。適当なプロ
モーターは、特定のバクテリオフォージポリメラーゼ、
例えばバクテリファージT3、T7又はSP6によって認識さ
れるプロモーターである。T7及びSP6 RNAポリメラーゼ
が好ましい。
「プロモーター配列がターゲット配列の部分に対応す
るヌクレオチド配列に結合している」というのは、その
プロモーター配列がターゲット配列の少なくとも一部分
によって認識されるヌクレオチド配列に１つ又は複数の
ヌクレオチドを介して公知の態様で直接的に又は間接的
に結合しているという意味である。前記認識は、適当な
条件下でヌクレオチド配列とターゲット配列との間に十
分な相同性が存在すれば実施される。
るヌクレオチド配列に結合している」というのは、その
プロモーター配列がターゲット配列の少なくとも一部分
によって認識されるヌクレオチド配列に１つ又は複数の
ヌクレオチドを介して公知の態様で直接的に又は間接的
に結合しているという意味である。前記認識は、適当な
条件下でヌクレオチド配列とターゲット配列との間に十
分な相同性が存在すれば実施される。
適当な条件で核酸プライマーのハイブリダイゼーショ
ンを行った後は、ハイブリッド形態で得られた２つの核
酸配列をDNAポリメラーゼによって自由３′末端から伸
長させ、二重鎖DNAフラグメントを得る。
ンを行った後は、ハイブリッド形態で得られた２つの核
酸配列をDNAポリメラーゼによって自由３′末端から伸
長させ、二重鎖DNAフラグメントを得る。
そのために使用し得る適当なDNAポリメラーゼは大腸
菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラー
ゼＩのKlenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、AMV
逆転写酵素、MMLV逆転写酵素等である。
菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラー
ゼＩのKlenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、AMV
逆転写酵素、MMLV逆転写酵素等である。
形成された二重鎖DNAから適当なRNAポリメラーゼによ
って合成されるRNAは、存在するRNAポリメラーゼの量に
多少とも継続的に依存しながら合成される。
って合成されるRNAは、存在するRNAポリメラーゼの量に
多少とも継続的に依存しながら合成される。
合成されたRNAは本発明に従い前記した方法の１つに
よって検出することができる。複数のRNA分子を検出し
たい場合には、既に合成したRNAを公知の増殖法によっ
て増やすことができる。
よって検出することができる。複数のRNA分子を検出し
たい場合には、既に合成したRNAを公知の増殖法によっ
て増やすことができる。
この種の増殖法としては例えばSISKA Diagnos−tics
の特許出願明細書（WO 88/10315）に記載のものが挙げ
られる。
の特許出願明細書（WO 88/10315）に記載のものが挙げ
られる。
本発明がより良く理解されるように、以下に非限定的
実施例を挙げる。
実施例を挙げる。
実施例 標準的方法（Maniatis,CSH）、即ちプロテイナーゼＫ
で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、次いで
アルコール沈殿にかける方法を用いて、CMV（サイトメ
ガロウイルス）感染の疑いのある被験者の白血球108個
からDNAを単離する。
で消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、次いで
アルコール沈殿にかける方法を用いて、CMV（サイトメ
ガロウイルス）感染の疑いのある被験者の白血球108個
からDNAを単離する。
DNAをEcoRV消化バッファ（10mM Tris（pH7.5）、7mM
MgCl2、7mM2−メルカプトエタノール、100mM NaCl、100
μg/mlウシ血清アルブミン）中に１μg/μｌの濃度で溶
解し、DNA1μｇ当たり３単位のEcoRV制限酵素を加え、3
7℃で２時間消化処理する。EcoRV制限酵素はCMV−DNAの
配列、例えばヌクレオチド番号2069〜2074（Virus Rese
rach,2,1985,107−121のAkriggの論文参照）を認識し、
ブラント末端フラグメントを発生させる。
MgCl2、7mM2−メルカプトエタノール、100mM NaCl、100
μg/mlウシ血清アルブミン）中に１μg/μｌの濃度で溶
解し、DNA1μｇ当たり３単位のEcoRV制限酵素を加え、3
7℃で２時間消化処理する。EcoRV制限酵素はCMV−DNAの
配列、例えばヌクレオチド番号2069〜2074（Virus Rese
rach,2,1985,107−121のAkriggの論文参照）を認識し、
ブラント末端フラグメントを発生させる。
次いで、DNA含有試料を（沸騰水浴又はヒートブロッ
クにより）95℃で10分間加熱してDNAを変性させる。こ
の試料をドライアイスで急冷する。55個のヌクレオチド
からなるプライマー（式Ｉ参照）を２μｇ加え、プライ
マーのアニーリングを65℃で１分間行い、更に42℃で１
分間実施する。200μＭのdATP、200μＭのdTTP、200μ
ＭのdGTP、200μＭのdCTB、1mMのATP、1mMのGTP、1mMの
CTP及び1mMのUTPの存在下で20単位のトリ骨髄芽球症ウ
イルス逆転写酵素を加え、得られた混合物を42℃で15分
間インキュベートする。Promega Biotec社のRNasin を
リボヌクレアーゼ阻害剤として１単位/mlの濃度で加え
る（１単位は５μｇのRNase−Ａの活性を阻害するのに
必要な阻害剤量の50％に相当する）。T7 RNAポリメラー
ゼを加え、この混合物を37℃で25分間インキュベートす
る。
クにより）95℃で10分間加熱してDNAを変性させる。こ
の試料をドライアイスで急冷する。55個のヌクレオチド
からなるプライマー（式Ｉ参照）を２μｇ加え、プライ
マーのアニーリングを65℃で１分間行い、更に42℃で１
分間実施する。200μＭのdATP、200μＭのdTTP、200μ
ＭのdGTP、200μＭのdCTB、1mMのATP、1mMのGTP、1mMの
CTP及び1mMのUTPの存在下で20単位のトリ骨髄芽球症ウ
イルス逆転写酵素を加え、得られた混合物を42℃で15分
間インキュベートする。Promega Biotec社のRNasin を
リボヌクレアーゼ阻害剤として１単位/mlの濃度で加え
る（１単位は５μｇのRNase−Ａの活性を阻害するのに
必要な阻害剤量の50％に相当する）。T7 RNAポリメラー
ゼを加え、この混合物を37℃で25分間インキュベートす
る。
転写体を検出するためには、試料を7.4％（vol/vol）
ホルムアルデヒド/10xSSC中で55℃で20分間変性処理す
る。この試料を氷上で冷却した後、スロットブロット装
置（Bio Rad）を用いてニトロセルロース膜上に固定す
る。
ホルムアルデヒド/10xSSC中で55℃で20分間変性処理す
る。この試料を氷上で冷却した後、スロットブロット装
置（Bio Rad）を用いてニトロセルロース膜上に固定す
る。
そのフィルターを0.5％ウシ血清アルブミン/0.5％ポ
リビニルピロリドン/5xSSPE/1％SDS中55℃で10分間にわ
たり予めハイブリダイズし、次いで同一バッファ中で32
P標識オリゴヌクレオチドプローブ５′−GAT GGC CCC G
TA CAT GGT CAT CAT ACAAGC−３′（２−5x106cpm/ml）
とハイブリダイズさせる。前記プローブは正確な極性で
ヌクレオチド番号2155から2126の間に位置する配列であ
る。
リビニルピロリドン/5xSSPE/1％SDS中55℃で10分間にわ
たり予めハイブリダイズし、次いで同一バッファ中で32
P標識オリゴヌクレオチドプローブ５′−GAT GGC CCC G
TA CAT GGT CAT CAT ACAAGC−３′（２−5x106cpm/ml）
とハイブリダイズさせる。前記プローブは正確な極性で
ヌクレオチド番号2155から2126の間に位置する配列であ
る。
フィルターを55℃で１時間ハイブリダイズし、次いで
室温で1xSSPE/1％SDSにより3x5分間洗浄し、更に55℃で
２分間洗浄する。いわるゆ「増感スクリーン」を用いて
−70℃で16時間オートラジオグラフィーを行う。
室温で1xSSPE/1％SDSにより3x5分間洗浄し、更に55℃で
２分間洗浄する。いわるゆ「増感スクリーン」を用いて
−70℃で16時間オートラジオグラフィーを行う。
オートラジオグラムから、本発明の方法を用いるとDN
AマトリックスからCMV−RNA転写体を合成できることが
確認される。
AマトリックスからCMV−RNA転写体を合成できることが
確認される。
式Ｉ T7 RNAポリメラーゼ結合部位と転写開始部位と検出す
べきCMVターゲット配列の部分に対応する配列（30−me
r）とを含む55個のヌクレオチドからなるプライマー。
べきCMVターゲット配列の部分に対応する配列（30−me
r）とを含む55個のヌクレオチドからなるプライマー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペテル・フランクリン・レンス オランダ国、1015・ヘー・エム・アムス テルダム、ブラウエルスフラツト・823 (72)発明者 フリツツ・ウイーラールト オランダ国、5212・ヘー・エル・デン・ ボツシユ、アケルデイクストラート・42 (56)参考文献 国際公開88／315（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】ターゲット配列を有するデオキシリボ核酸
（DNA）からリボ核酸（RNA）を合成する方法であって、
前記DNAを１種類以上の制限酵素で処理し、得られたDNA
フラグメントを分離して一重鎖DNAを形成し、その後タ
ーゲット配列の部分に対応するヌクレオチド配列に結合
したプロモーター配列を含む１つの核酸プライマーを、
適当な条件下で、対応する一重鎖DNAにハイブリダイズ
し、次いでハイブリッド形態で得られた２つの核酸配列
をDNAポリメラーゼにより自由３′末端から伸長させて
二重鎖DNAを形成し、これをRNAポリメラーゼのマトリッ
クスとして使用してRNAを合成することからなる合成方
法。 - 【請求項２】合成したRNAを変性条件下でゲル電気泳動
にかけ、次いでブロッティングすることによって検出
し、その後特定の標識したオリゴヌクレオチド配列とハ
イブリダイズさせることを特徴とする請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】請求項１に記載のRNA合成を行うためのテ
ストキット。
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