JP2798531B2 - ソマトトロピンモノマーの精製方法 - Google Patents
ソマトトロピンモノマーの精製方法Info
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Description
【０００１】発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術によって製造されたソマト
トロピン蛋白質の精製に関し、さらに詳しくは、ソマト
トロピンオリゴマー、残留宿主細胞蛋白質および他の不
純物を、選択的沈殿過程によって分離および除去するこ
とによるソマトトロピンモノマーの精製および回収に関
する。
トロピン蛋白質の精製に関し、さらに詳しくは、ソマト
トロピンオリゴマー、残留宿主細胞蛋白質および他の不
純物を、選択的沈殿過程によって分離および除去するこ
とによるソマトトロピンモノマーの精製および回収に関
する。
【０００２】発明の背景 組換えＤＮＡ技術は、宿主細胞たとえば大腸菌細菌中で
の異種蛋白質の発現を可能にした。成長ホルモンである
ソマトトロピンの場合、この蛋白質は宿主細胞の細胞質
内の屈折体中に隔離される。屈折体は、細胞を破壊して
屈折体を放出させ、ついで分別遠心分離によって屈折体
を固体ペレットとして捕集することにより、宿主細胞培
養液から回収できる。屈折体は、適当なカオトロピック
剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩の水溶液中、ア
ルカリ性のｐＨ、一般的には１０〜１２の範囲で可溶化
される。可溶化された蛋白質を次に、温和な酸化剤と接
触させて再生し、分子内ジスルフィド結合を形成させ、
その蛋白質をその生物学的に活性な生のコンホーメーシ
ョンにリフォールディングまたは復元させる。組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、大腸菌細菌によって産生させたソマ
トトロピン蛋白質の可溶化および再生の方法は、米国特
許第４，５１１，５０２号およひ第４，６５２，６３０
号に記載されている。これらの記載は参考として本明細
書に導入する。
の異種蛋白質の発現を可能にした。成長ホルモンである
ソマトトロピンの場合、この蛋白質は宿主細胞の細胞質
内の屈折体中に隔離される。屈折体は、細胞を破壊して
屈折体を放出させ、ついで分別遠心分離によって屈折体
を固体ペレットとして捕集することにより、宿主細胞培
養液から回収できる。屈折体は、適当なカオトロピック
剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩の水溶液中、ア
ルカリ性のｐＨ、一般的には１０〜１２の範囲で可溶化
される。可溶化された蛋白質を次に、温和な酸化剤と接
触させて再生し、分子内ジスルフィド結合を形成させ、
その蛋白質をその生物学的に活性な生のコンホーメーシ
ョンにリフォールディングまたは復元させる。組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、大腸菌細菌によって産生させたソマ
トトロピン蛋白質の可溶化および再生の方法は、米国特
許第４，５１１，５０２号およひ第４，６５２，６３０
号に記載されている。これらの記載は参考として本明細
書に導入する。
【０００３】再生工程から得られるリフォールディング
溶液は、ソマトトロピンモノマー、ダイマーおよびもっ
と高次のオリゴマーからなり、これらに宿主細胞からの
残渣および他の残屑を含んでいる。これらの中で、ソマ
トトロピンモノマーが所望の生物学的に活性な成分であ
り、標的動物へ注射によって投与するのに適当な高度に
精製された形で回収されなければならない。
溶液は、ソマトトロピンモノマー、ダイマーおよびもっ
と高次のオリゴマーからなり、これらに宿主細胞からの
残渣および他の残屑を含んでいる。これらの中で、ソマ
トトロピンモノマーが所望の生物学的に活性な成分であ
り、標的動物へ注射によって投与するのに適当な高度に
精製された形で回収されなければならない。
【０００４】蛋白質の精製はバイオテクノロジーにおけ
る共通の問題であって、このような精製を達成するため
のいくつかの方法が開発されている。Ｊ．Ｂｏｎｎｅｒ
ｊｅａらによってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４
巻、９５５〜９５８頁（１９８６年１１月）に報告され
ている“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：
Ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ Ｓｔｅｐ ａｔ ｔｈｅ Ｒｉｇ
ｈｔ Ｔｉｍｅ”と題する文献概説には、蛋白質の精製
に共通な１０種の方法が挙げられていて、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
およびゲル濾過が３つの最も一般的な方法とされてい
る。この文献の報告するところでは、蛋白質を均質に精
製するためには、平均４工程の精製が必要で、総収率は
２８％、精製係数は６，３８０であったという。精製案
の半分以上が、一般にホモジネーション後の第一または
第二工程として、沈殿を包含することが報告されてい
る。精製の最も普遍的な策略は、ホモジネーション、続
いて沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィー分離、そして最終的にゲル濾過であった。沈殿では
平均３倍の精製係数が得られる旨記載されている。
る共通の問題であって、このような精製を達成するため
のいくつかの方法が開発されている。Ｊ．Ｂｏｎｎｅｒ
ｊｅａらによってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４
巻、９５５〜９５８頁（１９８６年１１月）に報告され
ている“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：
Ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ Ｓｔｅｐ ａｔ ｔｈｅ Ｒｉｇ
ｈｔ Ｔｉｍｅ”と題する文献概説には、蛋白質の精製
に共通な１０種の方法が挙げられていて、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
およびゲル濾過が３つの最も一般的な方法とされてい
る。この文献の報告するところでは、蛋白質を均質に精
製するためには、平均４工程の精製が必要で、総収率は
２８％、精製係数は６，３８０であったという。精製案
の半分以上が、一般にホモジネーション後の第一または
第二工程として、沈殿を包含することが報告されてい
る。精製の最も普遍的な策略は、ホモジネーション、続
いて沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィー分離、そして最終的にゲル濾過であった。沈殿では
平均３倍の精製係数が得られる旨記載されている。
【０００５】微生物源に由来し、動物への非経口投与が
意図される生物学的に活性な生成物は、投与時にアレル
ギー反応、発熱および他の副作用のような有害反応を誘
発しないように、パイロジェン、生の微生物蛋白質およ
び核酸のような夾雑物質が実質的に除去されていなけれ
ばならない。Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｃｕｒｌｉｎｇら：Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，３３〜３７頁（１９８３）、“Ｄｏｗｎｓ
ｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆＦｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ”に記載されているように、１９５０
年代以来血漿分画に用いられてきた沈殿法のような因襲
的な精製技術では、組換えＤＮＡで産生された生成物に
要求される高レベルの純度は達成できない。遺伝子工学
に利用できる高分離精製技術としては、研究、生産いず
れのレベルにおいても、クロマトグラフィーが最初に選
択される方法と考えられている。「クロマトグラフィ
ー」の語は、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーク
ロマトグラフィー、疏水性クロマトグラフィーおよび等
電点クロマトグラフィーの特異的な方法を包含する。等
電点クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーゲルを
特別に調製された緩衝液で滴定することによって作られ
たｐＨ勾配を有する樹脂床中で蛋白質をそれらの等電点
に応じて分離する技術である。
意図される生物学的に活性な生成物は、投与時にアレル
ギー反応、発熱および他の副作用のような有害反応を誘
発しないように、パイロジェン、生の微生物蛋白質およ
び核酸のような夾雑物質が実質的に除去されていなけれ
ばならない。Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｃｕｒｌｉｎｇら：Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，３３〜３７頁（１９８３）、“Ｄｏｗｎｓ
ｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆＦｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ”に記載されているように、１９５０
年代以来血漿分画に用いられてきた沈殿法のような因襲
的な精製技術では、組換えＤＮＡで産生された生成物に
要求される高レベルの純度は達成できない。遺伝子工学
に利用できる高分離精製技術としては、研究、生産いず
れのレベルにおいても、クロマトグラフィーが最初に選
択される方法と考えられている。「クロマトグラフィ
ー」の語は、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーク
ロマトグラフィー、疏水性クロマトグラフィーおよび等
電点クロマトグラフィーの特異的な方法を包含する。等
電点クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーゲルを
特別に調製された緩衝液で滴定することによって作られ
たｐＨ勾配を有する樹脂床中で蛋白質をそれらの等電点
に応じて分離する技術である。
【０００６】クロマトグラフィーは、細菌ホモジネート
から超純粋なヒト蛋白質およびホルモンを治療的応用の
ために工業的に回収する場合の第一選択方法であると報
告されている。クロマトグラフィー精製は、それに先立
って、初期分別工程たとえば蛋白質沈殿または液−液分
配を行って、クロマトグラフィーへの供給流における濃
度を高め、効率を改良することが好ましい旨、たとえば
Ｐ．Ｄｕｎｎｉｌｌ：Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，９〜１３頁（１９８３年１０月）、“Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ”に記載されている。
から超純粋なヒト蛋白質およびホルモンを治療的応用の
ために工業的に回収する場合の第一選択方法であると報
告されている。クロマトグラフィー精製は、それに先立
って、初期分別工程たとえば蛋白質沈殿または液−液分
配を行って、クロマトグラフィーへの供給流における濃
度を高め、効率を改良することが好ましい旨、たとえば
Ｐ．Ｄｕｎｎｉｌｌ：Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，９〜１３頁（１９８３年１０月）、“Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ”に記載されている。
【０００７】ＤＮＡ組換え技術によって大腸菌から発現
されたプロキモシンの精製に際してのクロマトグラフィ
ーの使用例は、Ｊ．Ｍ．Ｅｍｔａｇｅら：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，第８０巻、３６７１〜３６７５頁（１９
８３年６月）、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｌｆ
Ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ（ｐｒｏｒｅｎｎｉｎ）ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”に記載されてい
る。この文献にはまた、大部分の大腸菌蛋白質（約９０
％）が酸性条件（ｐＨ６．３）で沈殿し、遠心分離によ
って除去できることも述べられている。
されたプロキモシンの精製に際してのクロマトグラフィ
ーの使用例は、Ｊ．Ｍ．Ｅｍｔａｇｅら：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，第８０巻、３６７１〜３６７５頁（１９
８３年６月）、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｌｆ
Ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ（ｐｒｏｒｅｎｎｉｎ）ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”に記載されてい
る。この文献にはまた、大部分の大腸菌蛋白質（約９０
％）が酸性条件（ｐＨ６．３）で沈殿し、遠心分離によ
って除去できることも述べられている。
【０００８】沈殿法による蛋白質の分離は、Ａｌｂｅｒ
ｔ，Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ：Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，第２版、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｓｃ
ｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９７５），“Ｔ
ｈｅ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”に
論じられている。この教科書には、溶液中の蛋白質の溶
解度は、ｐＨ、イオン強度、温度および溶媒の誘電率の
関数として著しく変化すること、また蛋白質は、その等
電点ｐＨ、すなわちその分子が正味の電荷をもたないＰ
ｈで最も溶解し難いことが説明されている。このような
条件下には、蛋白質は合体して沈殿しやすい。ある種の
蛋白質はそれらの等電点ｐＨでは事実上不溶で、この文
献に述べられているように、溶解している異種の蛋白質
が異なる等電点ｐＨ値を有するときは、多くの場合、そ
れらは等電点沈殿法で互いに分離させることができる。
ｔ，Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ：Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，第２版、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｓｃ
ｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９７５），“Ｔ
ｈｅ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”に
論じられている。この教科書には、溶液中の蛋白質の溶
解度は、ｐＨ、イオン強度、温度および溶媒の誘電率の
関数として著しく変化すること、また蛋白質は、その等
電点ｐＨ、すなわちその分子が正味の電荷をもたないＰ
ｈで最も溶解し難いことが説明されている。このような
条件下には、蛋白質は合体して沈殿しやすい。ある種の
蛋白質はそれらの等電点ｐＨでは事実上不溶で、この文
献に述べられているように、溶解している異種の蛋白質
が異なる等電点ｐＨ値を有するときは、多くの場合、そ
れらは等電点沈殿法で互いに分離させることができる。
【０００９】ｐＨ調整に基づく分別沈殿による精製は、
さらにＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｂａｉｌｅｙ ＆ Ｏ
ｌｌｉｓ，第２版、７４５〜７４９頁（１９８６）に論
じられている。他の性質たとえば分子量が同じでも、等
電点（ｐＩ）が異なる蛋白質は、与えられたｐＨでそれ
に最も近いｐＩをもつ蛋白質が沈殿しやすいことによ
り、蛋白質を分離する方法が示唆されている。ｐＨを変
動させることにより、異なる蛋白質を含む分画を分離で
きる。
さらにＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｂａｉｌｅｙ ＆ Ｏ
ｌｌｉｓ，第２版、７４５〜７４９頁（１９８６）に論
じられている。他の性質たとえば分子量が同じでも、等
電点（ｐＩ）が異なる蛋白質は、与えられたｐＨでそれ
に最も近いｐＩをもつ蛋白質が沈殿しやすいことによ
り、蛋白質を分離する方法が示唆されている。ｐＨを変
動させることにより、異なる蛋白質を含む分画を分離で
きる。
【００１０】蛋白質の溶解度は、塩濃度および溶媒温度
によって影響され、沈殿分画の分割は、塩析法および／
または低温により蛋白質の溶解度をさらに低下もしくは
上昇させることで改善できる場合がある。低溶解性蛋白
質の等電点沈殿は、水性媒体中への溶質たとえばエタノ
ールもしくはアセトンまたは有機ポリマーたとえばポリ
エチレングリコールの添加によっても改良できる。これ
らの方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ，Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，第２版、４１〜４７頁（１
９８７）に述べられている。この論文に記載されている
沈殿分画化処理における塩析法の使用の典型例は、ｐＨ
７．５以上、３．２Ｍ硫酸アンモニウム含有水溶液中で
の沈殿によるウサギ筋肉からのリン酸グリセロアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼの１工程精製である。
によって影響され、沈殿分画の分割は、塩析法および／
または低温により蛋白質の溶解度をさらに低下もしくは
上昇させることで改善できる場合がある。低溶解性蛋白
質の等電点沈殿は、水性媒体中への溶質たとえばエタノ
ールもしくはアセトンまたは有機ポリマーたとえばポリ
エチレングリコールの添加によっても改良できる。これ
らの方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ，Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，第２版、４１〜４７頁（１
９８７）に述べられている。この論文に記載されている
沈殿分画化処理における塩析法の使用の典型例は、ｐＨ
７．５以上、３．２Ｍ硫酸アンモニウム含有水溶液中で
の沈殿によるウサギ筋肉からのリン酸グリセロアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼの１工程精製である。
【００１１】以上の記述から明らかなように、沈殿分画
化は、溶液中の蛋白質のある程度の分離および精製を達
成するための古い、よく知られた方法であり、またその
後の処理および高分割技術たとえばクロマトグラフィー
による最終的精製への供給原料中の濃度を高めるための
大まかな分離方法として受け入れられている。沈殿分画
化を行う特定の条件によって、得られる蛋白質の収率お
よび純度は影響されるが、標的動物への注射による非経
口投与を意図した蛋白質の最終的な精製に、沈殿法が利
用されたことはこれまでなかった。食肉用および酪農用
の牛に使用するための、組換えＤＮＡ技術によって製造
されたウシソマトトロピン、ならびに豚を育てるための
相当するブタソマトトロピンは、一般に慣用のクロマト
グラフィー法で精製されてきた。不純な蛋白質原料溶液
に適用されるこの種の方法の一例としては、米国特許第
４，６１２，３２６号に記載されているような、大孔性
アクリレートエステル共重合体樹脂支持体上での逆相精
製、ついで約７〜９のｐＨでの水溶液中有機希釈剤によ
る溶出がある。
化は、溶液中の蛋白質のある程度の分離および精製を達
成するための古い、よく知られた方法であり、またその
後の処理および高分割技術たとえばクロマトグラフィー
による最終的精製への供給原料中の濃度を高めるための
大まかな分離方法として受け入れられている。沈殿分画
化を行う特定の条件によって、得られる蛋白質の収率お
よび純度は影響されるが、標的動物への注射による非経
口投与を意図した蛋白質の最終的な精製に、沈殿法が利
用されたことはこれまでなかった。食肉用および酪農用
の牛に使用するための、組換えＤＮＡ技術によって製造
されたウシソマトトロピン、ならびに豚を育てるための
相当するブタソマトトロピンは、一般に慣用のクロマト
グラフィー法で精製されてきた。不純な蛋白質原料溶液
に適用されるこの種の方法の一例としては、米国特許第
４，６１２，３２６号に記載されているような、大孔性
アクリレートエステル共重合体樹脂支持体上での逆相精
製、ついで約７〜９のｐＨでの水溶液中有機希釈剤によ
る溶出がある。
【００１２】以下にさらに挙げる米国特許は、様々な蛋
白精製法が開示されている点で興味のもたれるものであ
る。
白精製法が開示されている点で興味のもたれるものであ
る。
【００１３】米国特許第３，２３９，４１８号には、下
垂体成長ホルモンプロモーターを精製するための、２段
階沈殿過程、それに続くイオン交換法が記載されてい
る。
垂体成長ホルモンプロモーターを精製するための、２段
階沈殿過程、それに続くイオン交換法が記載されてい
る。
【００１４】米国特許第４，０５４，５５７号には、成
長促進ポリペプチドのゲル濾過による精製が記載されて
いる。
長促進ポリペプチドのゲル濾過による精製が記載されて
いる。
【００１５】米国特許第４，４６２，３２３号には、最
初に不純物を沈殿によって除去し、それに続いて所望の
蛋白質を沈殿させ回収する２段階脱塩およびｐＨ沈殿過
程が記載されている。
初に不純物を沈殿によって除去し、それに続いて所望の
蛋白質を沈殿させ回収する２段階脱塩およびｐＨ沈殿過
程が記載されている。
【００１６】米国特許第４，４５１，４８７号には、所
望の蛋白質の沈殿を促進し、一方、不純物は溶液中に残
存させる選択的沈殿剤の添加による生物学的に活性な蛋
白質の精製方法が記載されている。
望の蛋白質の沈殿を促進し、一方、不純物は溶液中に残
存させる選択的沈殿剤の添加による生物学的に活性な蛋
白質の精製方法が記載されている。
【００１７】米国特許第４，５６９，７９４号には、ク
ロマトグラフィー技術による生物活性ポリペプチドおよ
び蛋白質の精製が記載されている。
ロマトグラフィー技術による生物活性ポリペプチドおよ
び蛋白質の精製が記載されている。
【００１８】米国特許第４，６１７，３７６号には、グ
ルカゴン塩ケーキから疏水性クロマトグラフィーによる
グルカゴンの精製方法が記載されている。
ルカゴン塩ケーキから疏水性クロマトグラフィーによる
グルカゴンの精製方法が記載されている。
【００１９】ソマトトロピン蛋白質を包含する蛋白質の
クロマトグラフィー法による精製の従来技術は、複雑で
経費がかかる。沈殿法は、操作が比較的簡単で安価につ
くが、非経口的使用を意図した生成物に要求される収率
および分割を達成できなかった。
クロマトグラフィー法による精製の従来技術は、複雑で
経費がかかる。沈殿法は、操作が比較的簡単で安価につ
くが、非経口的使用を意図した生成物に要求される収率
および分割を達成できなかった。
【００２０】したがって、本発明の目的は、組換えＤＮ
Ａ技術によって製造されたソマトトロピン蛋白質の精製
方法を提供することにある。
Ａ技術によって製造されたソマトトロピン蛋白質の精製
方法を提供することにある。
【００２１】本発明のさらに他の目的は、溶液中に含ま
れるソマトトロピンダイマーおよびさらに高次のオリゴ
マーからソマトトロピンモノマーを分離する方法を提供
することにある。
れるソマトトロピンダイマーおよびさらに高次のオリゴ
マーからソマトトロピンモノマーを分離する方法を提供
することにある。
【００２２】本発明のなおさらに他の目的は、ソマトト
ロピンモノマーおよびオリゴマーを、残留宿主細胞蛋白
質および他の夾雑物とともに含有する溶液からソマトト
ロピンモノマーを単離および回収する方法を提供するこ
とにある。
ロピンモノマーおよびオリゴマーを、残留宿主細胞蛋白
質および他の夾雑物とともに含有する溶液からソマトト
ロピンモノマーを単離および回収する方法を提供するこ
とにある。
【００２３】本発明のまたさらに他の目的は、ソマトト
ロピンの製造のための組換えＤＮＡ方法における再生工
程のリフォールディング溶液から高純度のソマトトロピ
ンを回収する経済的な沈殿分画化法を提供することにあ
る。
ロピンの製造のための組換えＤＮＡ方法における再生工
程のリフォールディング溶液から高純度のソマトトロピ
ンを回収する経済的な沈殿分画化法を提供することにあ
る。
【００２４】本発明のこれらのおよび他の目的ならびに
利点は、以下の記述および実施例から、本技術分野の熟
練者には明白になるものと考える。
利点は、以下の記述および実施例から、本技術分野の熟
練者には明白になるものと考える。
【００２５】要約 略述すれば、本発明は、生物活性ソマトトロピンモノマ
ーをリフォールディング溶液から、ソマトトロピンダイ
マーおよびより高次のオリゴマーを残留宿主細胞蛋白質
および他の夾雑物質とともに選択的に沈殿させ、一方、
所望のモノマーは溶液中に残すことによって、単離およ
び回収する方法を提供する。沈殿は、可溶化および再生
工程に用いられた初期の高レベルのｐＨから、リフォー
ルディング溶液のｐＨを終点ｐＨ、一般的には約４．５
〜６の範囲に低下させることによって達成される。この
ｐＨにおいて、実質的にすべての宿主細胞蛋白質および
夾雑残留物が沈殿し、ソマトトロピンオリゴマーの大部
分が沈殿し、ソマトトロピンモノマーの大部分が溶液中
に残る。等電点クロマトグラフィーにより、ソマトトロ
ピンモノマーは、わずかに表面電荷が異なる様々な「ア
イソフォーム」として存在し、これらのアイソフォーム
は、等電点が有意に異なる主要な３つの群に分類できる
ことが明らかにされている。驚くべきことに、ソマトト
ロピンモノマーとオリゴマーの等電点は重複した範囲内
にあるにもかかわらず、ソマトトロピンモノマーはオリ
ゴマーから沈殿によって効率的に分離できることが見出
された。さらに、ソマトトロピンモノマーのアイソフォ
ームの主要な３群は有意に異なる等電点を有するにもか
かわらず、これらの群の有意な分離は起こらないことが
見出されたのである。
ーをリフォールディング溶液から、ソマトトロピンダイ
マーおよびより高次のオリゴマーを残留宿主細胞蛋白質
および他の夾雑物質とともに選択的に沈殿させ、一方、
所望のモノマーは溶液中に残すことによって、単離およ
び回収する方法を提供する。沈殿は、可溶化および再生
工程に用いられた初期の高レベルのｐＨから、リフォー
ルディング溶液のｐＨを終点ｐＨ、一般的には約４．５
〜６の範囲に低下させることによって達成される。この
ｐＨにおいて、実質的にすべての宿主細胞蛋白質および
夾雑残留物が沈殿し、ソマトトロピンオリゴマーの大部
分が沈殿し、ソマトトロピンモノマーの大部分が溶液中
に残る。等電点クロマトグラフィーにより、ソマトトロ
ピンモノマーは、わずかに表面電荷が異なる様々な「ア
イソフォーム」として存在し、これらのアイソフォーム
は、等電点が有意に異なる主要な３つの群に分類できる
ことが明らかにされている。驚くべきことに、ソマトト
ロピンモノマーとオリゴマーの等電点は重複した範囲内
にあるにもかかわらず、ソマトトロピンモノマーはオリ
ゴマーから沈殿によって効率的に分離できることが見出
された。さらに、ソマトトロピンモノマーのアイソフォ
ームの主要な３群は有意に異なる等電点を有するにもか
かわらず、これらの群の有意な分離は起こらないことが
見出されたのである。
【００２６】沈殿した固体を、濾過、遠心分離または他
の適当な手段で溶液から除去したのち、可溶されたソマ
トトロピンモノマーを含有する上澄液を透析濾過（ｄｉ
ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または他の適当な手段を用い
て処理して、溶液を濃縮し、緩衝を除去し、ついで溶液
を乾燥して精製ソマトトロピン生成物を回収する。精製
された生成物は、残留細菌蛋白質や他の夾雑物、有害組
織反応を生じるパイロジェン等を実質的に含まず、本発
明以前には一般に用いられていたクロマトグラフィーま
たは他の手段によりさらに精製することなく、標的動物
に注射または移植によつてそのまま投与するのに適して
いる。精製された生成物は１％未満から約５％またはそ
れ以上のソマトトロピンオリゴマーを含有することがあ
る。ソマトトロピンオリゴマーは生物学的に不活性であ
るが、標的動物に投与した場合に有害反応を生じること
はない。
の適当な手段で溶液から除去したのち、可溶されたソマ
トトロピンモノマーを含有する上澄液を透析濾過（ｄｉ
ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または他の適当な手段を用い
て処理して、溶液を濃縮し、緩衝を除去し、ついで溶液
を乾燥して精製ソマトトロピン生成物を回収する。精製
された生成物は、残留細菌蛋白質や他の夾雑物、有害組
織反応を生じるパイロジェン等を実質的に含まず、本発
明以前には一般に用いられていたクロマトグラフィーま
たは他の手段によりさらに精製することなく、標的動物
に注射または移植によつてそのまま投与するのに適して
いる。精製された生成物は１％未満から約５％またはそ
れ以上のソマトトロピンオリゴマーを含有することがあ
る。ソマトトロピンオリゴマーは生物学的に不活性であ
るが、標的動物に投与した場合に有害反応を生じること
はない。
【００２７】この方法は、とくにＮ−メチオニルウシソ
マトトロピン（ＭＢＳＴ）、Ｎ−アラニルウシソマトト
ロピン（ＡＢＳＴ）およびＮ−アラニルブタソマトトロ
ピン（ＰＳＴ）について説明する。
マトトロピン（ＭＢＳＴ）、Ｎ−アラニルウシソマトト
ロピン（ＡＢＳＴ）およびＮ−アラニルブタソマトトロ
ピン（ＰＳＴ）について説明する。
【００２８】図面の説明 図１は、部分単離ＭＢＳＴソマトトロピン蛋白質を示す
等電点クロマトグラフィーゲルの写真であり、レーン３
および４には、Ａ，Ｂ，Ｃと表示した３つの主要なソマ
トトロピンモノマー群が例示され、レーン５にはソマト
トロピンダイマーが示されている。
等電点クロマトグラフィーゲルの写真であり、レーン３
および４には、Ａ，Ｂ，Ｃと表示した３つの主要なソマ
トトロピンモノマー群が例示され、レーン５にはソマト
トロピンダイマーが示されている。
【００２９】図２は、ＭＢＳＴモノマー、ＭＢＳＴオリ
ゴマー、および大腸菌由来蛋白質残渣の溶解度曲線であ
る。
ゴマー、および大腸菌由来蛋白質残渣の溶解度曲線であ
る。
【００３０】図３は、ＡＢＳＴの沈殿精製過程の収率に
対するリフォールディング尿素濃度の影響を示す。
対するリフォールディング尿素濃度の影響を示す。
【００３１】図４は、ＡＢＳＴのリフォールディング過
程の収率に対するリフォールディング尿素濃度の影響を
例示する。
程の収率に対するリフォールディング尿素濃度の影響を
例示する。
【００３２】発明の説明 本発明の目的においては、以下の用語は以下に掲げる定
義を有するものと考えるべきである。
義を有するものと考えるべきである。
【００３３】「ソマトトロピン」の語は、哺乳動物ソマ
トトロピン、たとえばヒト、ヒツジ、ブタおよびウシソ
マトトロピン、ならびに他のたとえばトリソマトトロピ
ンを包含する意味であるが、またこれらに限定されるも
のではない。天然に存在する配列をもつ上記ソマトトロ
ピン蛋白質が適当であることに加えて、本発明は、ソマ
トトロピン様生物活性を有する、天然に生じる蛋白質の
同族体および類縁体を包含する系にも同様に適用可能で
ある。したがって、このような蛋白質も精製目的に対し
て均等である限り、本発明に包含される。
トトロピン、たとえばヒト、ヒツジ、ブタおよびウシソ
マトトロピン、ならびに他のたとえばトリソマトトロピ
ンを包含する意味であるが、またこれらに限定されるも
のではない。天然に存在する配列をもつ上記ソマトトロ
ピン蛋白質が適当であることに加えて、本発明は、ソマ
トトロピン様生物活性を有する、天然に生じる蛋白質の
同族体および類縁体を包含する系にも同様に適用可能で
ある。したがって、このような蛋白質も精製目的に対し
て均等である限り、本発明に包含される。
【００３４】「異種」蛋白質とは、その宿主細胞によっ
て正常には産生されない蛋白質である。組換えＤＮＡ技
術は比較的大量の異種蛋白質たとえばソマトトロピン
の、形質転換宿主細胞たとえば大腸菌からの発現を可能
にした。しかしながら、完全にはわかっていないが、こ
れらの異種蛋白質は、宿主細胞の細胞質中の不溶性屈折
体内に隔離されていることが多い。
て正常には産生されない蛋白質である。組換えＤＮＡ技
術は比較的大量の異種蛋白質たとえばソマトトロピン
の、形質転換宿主細胞たとえば大腸菌からの発現を可能
にした。しかしながら、完全にはわかっていないが、こ
れらの異種蛋白質は、宿主細胞の細胞質中の不溶性屈折
体内に隔離されていることが多い。
【００３５】「屈折体」は、回収される異種蛋白質の少
なくとも一部を含有する封入体または細胞質顆粒を意味
する。これらの顆粒は位相差顕微鏡では、明かるい点と
して認められる。
なくとも一部を含有する封入体または細胞質顆粒を意味
する。これらの顆粒は位相差顕微鏡では、明かるい点と
して認められる。
【００３６】「宿主細胞」は、微生物細胞たとえば細菌
細胞および酵母細胞、または異種蛋白質を発現するよう
に形質転換された動物および植物細胞を含めた適当な細
胞を意味する。本発明において意図される宿主細胞は、
細胞によって発現された異種ソマトトロピンが屈折体内
に隔離される細胞である。宿主細胞の例には、ウシまた
はブタソマトトロピンを発現できるように形質転換され
た大腸菌Ｋ１２，Ｗ３１１０Ｇ株〔ｐＢＧＨ１〕があ
る。
細胞および酵母細胞、または異種蛋白質を発現するよう
に形質転換された動物および植物細胞を含めた適当な細
胞を意味する。本発明において意図される宿主細胞は、
細胞によって発現された異種ソマトトロピンが屈折体内
に隔離される細胞である。宿主細胞の例には、ウシまた
はブタソマトトロピンを発現できるように形質転換され
た大腸菌Ｋ１２，Ｗ３１１０Ｇ株〔ｐＢＧＨ１〕があ
る。
【００３７】「再生」は、異種ソマトトロピン蛋白質の
生物活性を保証するように、その生のコンホーメーショ
ンへのフォールディングおよび酸化を意味する。
生物活性を保証するように、その生のコンホーメーショ
ンへのフォールディングおよび酸化を意味する。
【００３８】「フォールディング」とは、蛋白質の全体
的なコンホーメーション形状の、適当な酸化が可能なよ
うな復元を意味する。フォールディングは、蛋白質のア
ミノ酸配列が自由に相互作用して、その生の二次および
三次構造が採用されるときに達成される。
的なコンホーメーション形状の、適当な酸化が可能なよ
うな復元を意味する。フォールディングは、蛋白質のア
ミノ酸配列が自由に相互作用して、その生の二次および
三次構造が採用されるときに達成される。
【００３９】「酸化」は、フォールディングされた蛋白
質における、生のコンホーメーションを安定化し、生物
活性を保証するための、分子内ジスルフィド結合の形成
を意味する。
質における、生のコンホーメーションを安定化し、生物
活性を保証するための、分子内ジスルフィド結合の形成
を意味する。
【００４０】「リフォールディング溶液」の語は、再生
工程におけるフォールディングおよび酸化の結果として
得られた原料溶液を意味する。
工程におけるフォールディングおよび酸化の結果として
得られた原料溶液を意味する。
【００４１】ソマトトロピンオリゴマーからのソマトト
ロピンモノマーの分離に際してのｐＨ沈殿の有効性は、
等電点（ｐＩ）に基づく蛋白質の分離に関する通常の理
論に一致しない。組換えＤＮＡ法によって生成されたソ
マトトロピンは、実質的に等電点が異なる３種の、優越
的なモノマーアイソフォーム群を包含する。分析的等電
点クロマトグラフィー（ＩＥＦ）により、これらのモノ
マー群は、図１にＭＢＳＴについて例示したように、明
瞭な蛋白質バンドに分離される。例示した分析的ＩＥＦ
は、平板床電気泳動装置上で実施した。ゲルは、１％ア
ガロース、１０％ソルビトール、６Ｍ尿素、および２．
５％ｐＨ５〜９Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓを含有し、これを
ＦＭＣ ＧｅｌＢｏｎｄ上に１ｍｍ厚に鋳造した。フォ
ーカシングは１５℃、１０ワットの定電力で、１３５分
間行った。ゲルを固定し、集束された蛋白質を染色して
検出した。レーン１は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ標準ＩＥＦ
蛋白質、レーン２は、クロマトグラフィー単離によって
製造された高純度のモノマー標品、レーン３および４
は、本発明の方法によって精製されたＭＢＳＴモノマ
ー、レーン５は高度に精製、単離されたＭＢＳＴダイマ
ーを含有する。レーン３および４のＭＢＳＴモノマー
は、Ａ，ＢおよびＣと表示した３種の主要なアイソフォ
ーム群からなっている。
ロピンモノマーの分離に際してのｐＨ沈殿の有効性は、
等電点（ｐＩ）に基づく蛋白質の分離に関する通常の理
論に一致しない。組換えＤＮＡ法によって生成されたソ
マトトロピンは、実質的に等電点が異なる３種の、優越
的なモノマーアイソフォーム群を包含する。分析的等電
点クロマトグラフィー（ＩＥＦ）により、これらのモノ
マー群は、図１にＭＢＳＴについて例示したように、明
瞭な蛋白質バンドに分離される。例示した分析的ＩＥＦ
は、平板床電気泳動装置上で実施した。ゲルは、１％ア
ガロース、１０％ソルビトール、６Ｍ尿素、および２．
５％ｐＨ５〜９Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓを含有し、これを
ＦＭＣ ＧｅｌＢｏｎｄ上に１ｍｍ厚に鋳造した。フォ
ーカシングは１５℃、１０ワットの定電力で、１３５分
間行った。ゲルを固定し、集束された蛋白質を染色して
検出した。レーン１は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ標準ＩＥＦ
蛋白質、レーン２は、クロマトグラフィー単離によって
製造された高純度のモノマー標品、レーン３および４
は、本発明の方法によって精製されたＭＢＳＴモノマ
ー、レーン５は高度に精製、単離されたＭＢＳＴダイマ
ーを含有する。レーン３および４のＭＢＳＴモノマー
は、Ａ，ＢおよびＣと表示した３種の主要なアイソフォ
ーム群からなっている。
【００４２】さらに分離および分析を行ったところ、３
種のソマトトロピンモノマーアイソフォーム群は、Ｎ−
メチオニルウシソマトトロピン（ＭＢＳＴ）、Ｎ−アラ
ニルウシソマトトロピン（ＡＢＳＴ）およびＮ−アラニ
ルブタソマトトロピン（ＰＳＴ）に共通することが明ら
かにされた。３種のアイソフォーム群の相対的な割合お
よびそれらの等電点のおおよその平均を、各ソマトトロ
ピン生成物の代表的なサンプルについて、以下の表１に
示す。
種のソマトトロピンモノマーアイソフォーム群は、Ｎ−
メチオニルウシソマトトロピン（ＭＢＳＴ）、Ｎ−アラ
ニルウシソマトトロピン（ＡＢＳＴ）およびＮ−アラニ
ルブタソマトトロピン（ＰＳＴ）に共通することが明ら
かにされた。３種のアイソフォーム群の相対的な割合お
よびそれらの等電点のおおよその平均を、各ソマトトロ
ピン生成物の代表的なサンプルについて、以下の表１に
示す。
【表１】
【００４３】ソマトトロピンダイマーおよびより高次な
オリゴマーは、一定の等電点値を示さず、図１のレーン
５のダイマーによって例示されるように、上にモノマー
（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）について記録されたｐＩの
全範囲にわたって均一に分散することがわかっている。
オリゴマーは、一定の等電点値を示さず、図１のレーン
５のダイマーによって例示されるように、上にモノマー
（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）について記録されたｐＩの
全範囲にわたって均一に分散することがわかっている。
【００４４】以下の記述および実施例においては、本発
明の精製方法は、米国特許第４，６５２，６３０号に記
載されている尿素水溶液中での屈折体の可溶化および再
生によって得られたリフォールディング溶液の精製に関
して例示するが、本発明がリフォールディング溶液の生
成に用いられた方法の特定の細部によって限定されるも
のではないことを理解すべきである。たとえば、屈折体
の可溶化に使用される尿素は、他のカオトロピック剤た
とえばグアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウムおよ
び各種の界面活性剤、またはきわめて高濃度の水酸化ナ
トリウムによって置き換えることができるものである。
再生工程は、可溶化工程に使用したよりも低いｐＨ値で
および／または低いカオトロピック剤濃度で実施するこ
ともできる。
明の精製方法は、米国特許第４，６５２，６３０号に記
載されている尿素水溶液中での屈折体の可溶化および再
生によって得られたリフォールディング溶液の精製に関
して例示するが、本発明がリフォールディング溶液の生
成に用いられた方法の特定の細部によって限定されるも
のではないことを理解すべきである。たとえば、屈折体
の可溶化に使用される尿素は、他のカオトロピック剤た
とえばグアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウムおよ
び各種の界面活性剤、またはきわめて高濃度の水酸化ナ
トリウムによって置き換えることができるものである。
再生工程は、可溶化工程に使用したよりも低いｐＨ値で
および／または低いカオトロピック剤濃度で実施するこ
ともできる。
【００４５】米国特許第４，６５２，６３０号に記載の
可溶化および再生方法の場合、典型的なリフォールディ
ング溶液の成分は一般に、約３０〜６０％のソマトトロ
ピンモノマー、約１０〜３０％のソマトトロピンダイマ
ーおよびより高次なオリゴマー、ならびに大腸菌細菌に
由来する約２０〜５０％の残留物たとえばそれらに限定
されるものではないが、蛋白質、膜フラグメント、色素
体、エンドトキシン、パイロジェンおよび核酸等であ
る。さらに、リフォールディング溶液には、酸化される
ソマトトロピンの型に依存して約１．５〜６Ｍ濃度の尿
素を含有してもよい。米国特許第４，６５２，６３０号
に開示されているように、ウシソマトトロピンの再生に
は約４〜５Ｍの尿素濃度が好ましいが、ブタソマトトロ
ピンについては約２．５〜３．５Ｍの濃度が好ましい。
可溶化および再生方法の場合、典型的なリフォールディ
ング溶液の成分は一般に、約３０〜６０％のソマトトロ
ピンモノマー、約１０〜３０％のソマトトロピンダイマ
ーおよびより高次なオリゴマー、ならびに大腸菌細菌に
由来する約２０〜５０％の残留物たとえばそれらに限定
されるものではないが、蛋白質、膜フラグメント、色素
体、エンドトキシン、パイロジェンおよび核酸等であ
る。さらに、リフォールディング溶液には、酸化される
ソマトトロピンの型に依存して約１．５〜６Ｍ濃度の尿
素を含有してもよい。米国特許第４，６５２，６３０号
に開示されているように、ウシソマトトロピンの再生に
は約４〜５Ｍの尿素濃度が好ましいが、ブタソマトトロ
ピンについては約２．５〜３．５Ｍの濃度が好ましい。
【００４６】本発明の好ましい態様においては、再生工
程から得られたリフォールディング溶液は、本発明の沈
殿分画法を進める前に、必要があれば再調整する。とく
に、溶液が沈殿工程に干渉する十分な量のカオトロピッ
ク剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩を含有する場
合には、この剤の濃度を許容できるレベルまで低下させ
なければならない。尿素の場合は、３Ｍを越える濃度は
ソマトトロピンの溶解度を上昇させて沈殿過程を妨害す
ることが明らかにされている。したがって、リフォール
ディング溶液が３Ｍを越える尿素を含有する場合は、透
析濾過または希釈によって３Ｍ未満、好ましくは１Ｍも
しくはそれ以下に低下させる。リフォールディング溶液
が尿素以外のカオトロピック剤、たとえばグアニジン塩
酸塩を含有する場合には、効果的な沈殿分画化のために
許容される最低限の濃度を測定し、必要に応じて濃度を
調整しなければならない。
程から得られたリフォールディング溶液は、本発明の沈
殿分画法を進める前に、必要があれば再調整する。とく
に、溶液が沈殿工程に干渉する十分な量のカオトロピッ
ク剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩を含有する場
合には、この剤の濃度を許容できるレベルまで低下させ
なければならない。尿素の場合は、３Ｍを越える濃度は
ソマトトロピンの溶解度を上昇させて沈殿過程を妨害す
ることが明らかにされている。したがって、リフォール
ディング溶液が３Ｍを越える尿素を含有する場合は、透
析濾過または希釈によって３Ｍ未満、好ましくは１Ｍも
しくはそれ以下に低下させる。リフォールディング溶液
が尿素以外のカオトロピック剤、たとえばグアニジン塩
酸塩を含有する場合には、効果的な沈殿分画化のために
許容される最低限の濃度を測定し、必要に応じて濃度を
調整しなければならない。
【００４７】米国特許第４，６５２，６３０号に記載さ
れているように、可溶化ソマトトロピンの再生は、尿素
の分解を遅延させるために、４℃のような低温で実施し
てもよいが、本発明の沈殿分画化法においては温度にと
くに制限はなく、リフォールディング溶液は所望によ
り、放置して室温まで温めてもよい。２０〜２５℃の範
囲のやや高い温度の方が、オリゴマーの分離はわずかな
がらよくなることも事実である。
れているように、可溶化ソマトトロピンの再生は、尿素
の分解を遅延させるために、４℃のような低温で実施し
てもよいが、本発明の沈殿分画化法においては温度にと
くに制限はなく、リフォールディング溶液は所望によ
り、放置して室温まで温めてもよい。２０〜２５℃の範
囲のやや高い温度の方が、オリゴマーの分離はわずかな
がらよくなることも事実である。
【００４８】本発明の沈殿法の一実施態様においては、
リフォールディング溶液のｐＨは、再生工程で用いられ
た高いレベル、通常はｐＨ１０以上から、酸たとえば希
酢酸または他の適当な有機酸もしくは無機酸を徐々に加
えて、ゆっくり低下させる。この場合、よく混合して、
高い酸濃度のポケットを生じないようにする。これはｐ
Ｈ平衡を変化させ、蛋白質の溶解度に局所的な効果をも
たらすことになる。酸は、予め決定した至適ｐＨ終点値
に到達するまで加える。至適ｐＨ終点値は各蛋白質系の
それぞれについて決定しなければならない。この値は、
ソマトトロピンモノマーとオリゴマーの相対的な割合、
存在する細菌蛋白質および夾雑物の量、ならびに蛋白質
の溶解度に影響する各種カオトロピック剤、溶媒、塩ま
たは溶質の存否のような変数に依存する。至適ｐＨ終点
値は一般的に４．５〜６の範囲であり、実質的にすべて
の細菌性残留物および随伴する夾雑物が沈殿し、大部分
のソマトトロピンオリゴマーが沈殿して溶液中に残る量
は最終生成物の純度について許容される最高レベルを越
えず、ソマトトロピンモノマーの大部分は溶液中に残っ
て沈殿した量は許容される収率の点での最大レベルを越
えないｐＨとして確認される。
リフォールディング溶液のｐＨは、再生工程で用いられ
た高いレベル、通常はｐＨ１０以上から、酸たとえば希
酢酸または他の適当な有機酸もしくは無機酸を徐々に加
えて、ゆっくり低下させる。この場合、よく混合して、
高い酸濃度のポケットを生じないようにする。これはｐ
Ｈ平衡を変化させ、蛋白質の溶解度に局所的な効果をも
たらすことになる。酸は、予め決定した至適ｐＨ終点値
に到達するまで加える。至適ｐＨ終点値は各蛋白質系の
それぞれについて決定しなければならない。この値は、
ソマトトロピンモノマーとオリゴマーの相対的な割合、
存在する細菌蛋白質および夾雑物の量、ならびに蛋白質
の溶解度に影響する各種カオトロピック剤、溶媒、塩ま
たは溶質の存否のような変数に依存する。至適ｐＨ終点
値は一般的に４．５〜６の範囲であり、実質的にすべて
の細菌性残留物および随伴する夾雑物が沈殿し、大部分
のソマトトロピンオリゴマーが沈殿して溶液中に残る量
は最終生成物の純度について許容される最高レベルを越
えず、ソマトトロピンモノマーの大部分は溶液中に残っ
て沈殿した量は許容される収率の点での最大レベルを越
えないｐＨとして確認される。
【００４９】一般的に、過程の収率と最終生成物の純度
とは逆相関する。オリゴマーの低レベルを反映する最終
ソマトトロピンモノマー生成物の高純度は収率を犠牲に
して得られることからオリゴマーの最大許容レベルが経
済的な見地から設定される。ソマトトロピンオリゴマー
は最終生成物中では不活性希釈剤として働き、活性モノ
マー成分の有効濃度を低下させ、それを然るべく上昇さ
せるためには、標的動物に投与する用量レベルの増加が
必要になる。オリゴマーが負の活性をもったり、望まし
くない副作用を生じたりすることはないと考えられてい
る。
とは逆相関する。オリゴマーの低レベルを反映する最終
ソマトトロピンモノマー生成物の高純度は収率を犠牲に
して得られることからオリゴマーの最大許容レベルが経
済的な見地から設定される。ソマトトロピンオリゴマー
は最終生成物中では不活性希釈剤として働き、活性モノ
マー成分の有効濃度を低下させ、それを然るべく上昇さ
せるためには、標的動物に投与する用量レベルの増加が
必要になる。オリゴマーが負の活性をもったり、望まし
くない副作用を生じたりすることはないと考えられてい
る。
【００５０】収率と純度の間の実際の関係はある程度、
再生工程時に用いられる上流条件、および沈殿分画化工
程で処理される供給原料の品質に依存する。上述のよう
に尿素中での屈折体の可溶化および再生から得られたリ
フォールディング溶液では、好ましい精製ソマトトロピ
ン生成物中のソマトトロピンオリゴマーの最大許容レベ
ルは５重量％、最も望ましくは約２．５％またはそれ以
下と確立されている。ソマトトロピンモノマーの最小許
容収率は５０％、望ましくは少なくとも６５％と確立さ
れている。これらの結果を得るための至適ｐＨ終点は、
各沈殿精製系ごとに個々の決定されなければならない
が、ＭＢＳＴリフォールディング溶液では、以下のよう
に処理する場合、一般的に４．５〜６の範囲であり、最
も通常には約５．０である。
再生工程時に用いられる上流条件、および沈殿分画化工
程で処理される供給原料の品質に依存する。上述のよう
に尿素中での屈折体の可溶化および再生から得られたリ
フォールディング溶液では、好ましい精製ソマトトロピ
ン生成物中のソマトトロピンオリゴマーの最大許容レベ
ルは５重量％、最も望ましくは約２．５％またはそれ以
下と確立されている。ソマトトロピンモノマーの最小許
容収率は５０％、望ましくは少なくとも６５％と確立さ
れている。これらの結果を得るための至適ｐＨ終点は、
各沈殿精製系ごとに個々の決定されなければならない
が、ＭＢＳＴリフォールディング溶液では、以下のよう
に処理する場合、一般的に４．５〜６の範囲であり、最
も通常には約５．０である。
【００５１】与えられたシステムの至適ｐＨ終点値の範
囲は、たとえば図２に例示したような、上述の尿素シス
テムから得られた代表的なＭＢＳＴリフォールディング
溶液の蛋白質成分についての溶解性データを提供する、
蛋白質溶解度曲線に基づいて予測することができる。こ
の図に例示するように、大腸菌に由来する残留蛋白質お
よび不純物は、約４．５〜７．２のｐＨ範囲では、実質
的に完全に沈殿する。総ＭＢＳＴに対する溶液中のソマ
トトロピンオリゴマーの量は、約５．５〜７．２の範囲
のｐＨ範囲では１％未満であるが、ｐＨが４．５未満に
低下するに従い急速に増加する。ソマトトロピンモノマ
ーはｐＨ約６．５で最小の溶解性を有し、この溶解性は
ｐＨが６以下のレベルに低すると急速に増大する。この
特定のシステムにおける至適ｐＨ終点値は約５．０±
０．２であり、このｐＨでは、細菌残留物は実質的に不
溶で、ソマトトロピンオリゴマーの溶解度は約２．５％
であり、その結果、最終ＭＢＳＴ生成物の純度は約９
７．５％となる。また最初にこの系内に存在したソマト
トロピンモノマーの８０％以上が溶液中に残留し、許容
される収率を与える。
囲は、たとえば図２に例示したような、上述の尿素シス
テムから得られた代表的なＭＢＳＴリフォールディング
溶液の蛋白質成分についての溶解性データを提供する、
蛋白質溶解度曲線に基づいて予測することができる。こ
の図に例示するように、大腸菌に由来する残留蛋白質お
よび不純物は、約４．５〜７．２のｐＨ範囲では、実質
的に完全に沈殿する。総ＭＢＳＴに対する溶液中のソマ
トトロピンオリゴマーの量は、約５．５〜７．２の範囲
のｐＨ範囲では１％未満であるが、ｐＨが４．５未満に
低下するに従い急速に増加する。ソマトトロピンモノマ
ーはｐＨ約６．５で最小の溶解性を有し、この溶解性は
ｐＨが６以下のレベルに低すると急速に増大する。この
特定のシステムにおける至適ｐＨ終点値は約５．０±
０．２であり、このｐＨでは、細菌残留物は実質的に不
溶で、ソマトトロピンオリゴマーの溶解度は約２．５％
であり、その結果、最終ＭＢＳＴ生成物の純度は約９
７．５％となる。また最初にこの系内に存在したソマト
トロピンモノマーの８０％以上が溶液中に残留し、許容
される収率を与える。
【００５２】至適終点ｐＨならびにこの沈殿過程から得
られる生成物の収率および純度は、再生工程に用いられ
た条件、とくにリフォールディングｐＨ、蛋白質濃度お
よび尿素濃度によって影響される。表２に示すデータ
は、リフォールディングｐＨの、至適終点ｐＨおよび２
％オリゴマー含有ＡＢＳＴを製造する場合の沈殿収率に
対する影響を例示するものである。
られる生成物の収率および純度は、再生工程に用いられ
た条件、とくにリフォールディングｐＨ、蛋白質濃度お
よび尿素濃度によって影響される。表２に示すデータ
は、リフォールディングｐＨの、至適終点ｐＨおよび２
％オリゴマー含有ＡＢＳＴを製造する場合の沈殿収率に
対する影響を例示するものである。
【表２】
【００５３】再生工程時のソマトトロピン蛋白質濃度が
２％オリゴマー含有ＡＢＳＴの沈殿収率、および２％オ
リゴマー含有ＰＳＴの沈殿収率に及ぼす影響は、表３の
データによつて例示される。
２％オリゴマー含有ＡＢＳＴの沈殿収率、および２％オ
リゴマー含有ＰＳＴの沈殿収率に及ぼす影響は、表３の
データによつて例示される。
【表３】
【００５４】リフォールデイングｐＨおよび蛋白質濃度
の、以後のソマトトロピンモノマーの精製に及ぼすこの
影響は、リフォールディング条件下に生成される高レベ
ルのオリゴマーおよび／または他の不純物により沈殿収
率の低下を招くものと考えられる。したがって、本発明
の方法において考慮すべき重要な供給原料の品質であ
り、可溶化および再生工程は、モノマーの収率を最大に
し、本発明の方法で除去されるオリゴマーおよび他の望
ましくない成分の濃度を最小にするような、過程につい
て考慮すべき他の点と調和した様式で操作すべきであ
る。
の、以後のソマトトロピンモノマーの精製に及ぼすこの
影響は、リフォールディング条件下に生成される高レベ
ルのオリゴマーおよび／または他の不純物により沈殿収
率の低下を招くものと考えられる。したがって、本発明
の方法において考慮すべき重要な供給原料の品質であ
り、可溶化および再生工程は、モノマーの収率を最大に
し、本発明の方法で除去されるオリゴマーおよび他の望
ましくない成分の濃度を最小にするような、過程につい
て考慮すべき他の点と調和した様式で操作すべきであ
る。
【００５５】ＭＢＳＴの場合、沈殿収率に対するリフォ
ールディング尿素濃度の影響は図３に例示する。この場
合、最終精製工程の収率は、再生工程に用いられる尿素
の濃度が２．５Ｍから５．５Ｍに増大するに従って上昇
するようにみえる。しかしながら、さらに図４に例示す
るように、再生工程における生成物収率は４．５Ｍの尿
素において最大で、尿素の濃度が５．５Ｍに増大するに
従って急速に低下する。すなわち、過程全体の効率は、
この過程の各工程における個々の収率の関数であって、
再生時の尿素濃度は、全過程収率を最大にするように選
択されなければならない。図３および図４に例示された
システムの場合には、再生工程における至適尿素濃度は
約４．５Ｍで、これによって全体的な生成物の収率が最
大になるように思われる。
ールディング尿素濃度の影響は図３に例示する。この場
合、最終精製工程の収率は、再生工程に用いられる尿素
の濃度が２．５Ｍから５．５Ｍに増大するに従って上昇
するようにみえる。しかしながら、さらに図４に例示す
るように、再生工程における生成物収率は４．５Ｍの尿
素において最大で、尿素の濃度が５．５Ｍに増大するに
従って急速に低下する。すなわち、過程全体の効率は、
この過程の各工程における個々の収率の関数であって、
再生時の尿素濃度は、全過程収率を最大にするように選
択されなければならない。図３および図４に例示された
システムの場合には、再生工程における至適尿素濃度は
約４．５Ｍで、これによって全体的な生成物の収率が最
大になるように思われる。
【００５６】本発明の沈殿精製方法を、次に、Ｎ−アラ
ニルウシソマトトロピンおよびＮ−アラニルブタソマト
トロピンの精製を目的とした以下の実施例によって例示
する。実施例中、百分率はすべて重量百分率である。
ニルウシソマトトロピンおよびＮ−アラニルブタソマト
トロピンの精製を目的とした以下の実施例によって例示
する。実施例中、百分率はすべて重量百分率である。
【００５７】例１ 大腸菌内で発現され、Ｎ−アラニルウシソマトトロピン
（ＡＢＳＴ）を含有する屈折体を、既知の技術を用いて
製造し、単離した。十分な量の屈折体をｐＨ１１．２
５、温度４℃で、４．５Ｍの尿素水溶液に可溶化する
と、濃度約３．４ｇ／ｌのＡＢＳＴ溶液が得られた。屈
折体は速やかに溶解し、得られた溶液の再生は、４℃で
数日間または少なくとも約９５％のＡＢＳＴが酸化され
その生の型にリフォールディングされるまで攪拌して行
った。酸化されリフォールディングされた溶液のＨＰＬ
Ｃ分析では、ＡＢＳＴの収率約７３％が示された。
（ＡＢＳＴ）を含有する屈折体を、既知の技術を用いて
製造し、単離した。十分な量の屈折体をｐＨ１１．２
５、温度４℃で、４．５Ｍの尿素水溶液に可溶化する
と、濃度約３．４ｇ／ｌのＡＢＳＴ溶液が得られた。屈
折体は速やかに溶解し、得られた溶液の再生は、４℃で
数日間または少なくとも約９５％のＡＢＳＴが酸化され
その生の型にリフォールディングされるまで攪拌して行
った。酸化されリフォールディングされた溶液のＨＰＬ
Ｃ分析では、ＡＢＳＴの収率約７３％が示された。
【００５８】リフォールディングされた溶液は、Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｏｐｅｒａｔｉ
ｏｎ，８０Ａｓｈｂｙ Ｒｄ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
０１７３０）ＰＬＧＣ，公称分子量限界１０，０００
の膜を用いた透析濾過によって６００ｍｌに濃縮し、つ
いで５容の冷脱イオン水で交換した。得られた溶液は約
２５ｇ／ｌのＡＢＳＴモノマー、８ｇ／ｌのＡＢＳＴオ
リゴマー、２７ｇ／ｌの大腸菌残渣、および０．２Ｍ未
満の尿素を含有する、ｐＨ約１０の水溶液であった。
ｌｉｐｏｒｅ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｏｐｅｒａｔｉ
ｏｎ，８０Ａｓｈｂｙ Ｒｄ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
０１７３０）ＰＬＧＣ，公称分子量限界１０，０００
の膜を用いた透析濾過によって６００ｍｌに濃縮し、つ
いで５容の冷脱イオン水で交換した。得られた溶液は約
２５ｇ／ｌのＡＢＳＴモノマー、８ｇ／ｌのＡＢＳＴオ
リゴマー、２７ｇ／ｌの大腸菌残渣、および０．２Ｍ未
満の尿素を含有する、ｐＨ約１０の水溶液であった。
【００５９】慣用の既知操作に従ってこのように調製さ
れた溶液を次に、以下のように本発明の方法により精製
してＡＢＳＴモノマーを回収した。調製溶液２００ｍｌ
を室温まで加温し、５％酢酸を徐々に加え、３時間を要
して溶液のｐＨを４．８に低下させ、沈殿を生成させ
た。溶液のｐＨを４．８に維持して１時間攪拌し、つい
で遠心分離して沈殿を除去した。分析によれば、澄明な
上清に溶解した蛋白質には、ＥＬＩＳＡで測定して２．
３％のＡＢＳＴオリゴマーおよび０．１％未満の大腸菌
残渣を含有し、ＡＢＳＴモノマーの純度は９７％であっ
た。精製過程におけるＡＢＳＴモノマーの収率は８３％
と計算された。ＡＢＳＴモノマーの純度はＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で確認された。
れた溶液を次に、以下のように本発明の方法により精製
してＡＢＳＴモノマーを回収した。調製溶液２００ｍｌ
を室温まで加温し、５％酢酸を徐々に加え、３時間を要
して溶液のｐＨを４．８に低下させ、沈殿を生成させ
た。溶液のｐＨを４．８に維持して１時間攪拌し、つい
で遠心分離して沈殿を除去した。分析によれば、澄明な
上清に溶解した蛋白質には、ＥＬＩＳＡで測定して２．
３％のＡＢＳＴオリゴマーおよび０．１％未満の大腸菌
残渣を含有し、ＡＢＳＴモノマーの純度は９７％であっ
た。精製過程におけるＡＢＳＴモノマーの収率は８３％
と計算された。ＡＢＳＴモノマーの純度はＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で確認された。
【００６０】例２ 大腸菌内で発現され、Ｎ−アラニルブタソマトトロピン
を含有する屈折体を既知技術によって調製し、単離し
た。十分な量の屈折体を、ｐＨ１１．２５、温度４℃で
３Ｍ尿素水溶液２ｌに可溶化して、濃度約３ｇ／ｌのＰ
ＳＴ溶液を得た。屈折体は速やかに溶解し、得られた溶
液の再生は４℃で数日間にわたって攪拌して、ＰＳＴを
酸化させその生の型にリフォールディングさせることに
よって行った。酸化、リフォールディング溶液のＨＰＬ
Ｃ分析では、ＰＳＴモノマーの収率は約７０％であっ
た。
を含有する屈折体を既知技術によって調製し、単離し
た。十分な量の屈折体を、ｐＨ１１．２５、温度４℃で
３Ｍ尿素水溶液２ｌに可溶化して、濃度約３ｇ／ｌのＰ
ＳＴ溶液を得た。屈折体は速やかに溶解し、得られた溶
液の再生は４℃で数日間にわたって攪拌して、ＰＳＴを
酸化させその生の型にリフォールディングさせることに
よって行った。酸化、リフォールディング溶液のＨＰＬ
Ｃ分析では、ＰＳＴモノマーの収率は約７０％であっ
た。
【００６１】リフォールディング溶液は、Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ ＰＬＧＬ、公称分子量限界１０，０００の膜を
用いた透析濾過によって２００ｍｌに濃縮し、ついで５
容の冷脱イオン水で交換した。得られた溶液は、ｐＨ約
１０の水溶液中に、約２０ｇ／ｌのＰＳＴモノマー、７
ｇ／ｌのＰＳＴオリゴマー、１５ｇ／ｌの大腸菌残渣お
よび０．２Ｍ未満の尿素を含有した。
ｏｒｅ ＰＬＧＬ、公称分子量限界１０，０００の膜を
用いた透析濾過によって２００ｍｌに濃縮し、ついで５
容の冷脱イオン水で交換した。得られた溶液は、ｐＨ約
１０の水溶液中に、約２０ｇ／ｌのＰＳＴモノマー、７
ｇ／ｌのＰＳＴオリゴマー、１５ｇ／ｌの大腸菌残渣お
よび０．２Ｍ未満の尿素を含有した。
【００６２】慣用の既知操作に従いこのようにして調製
された溶液を次に、以下のように本発明の方法によって
精製し、ＰＳＴモノマーを回収した。調製された溶液１
７５ｍｌに予め８．７５ｇのセライト５７７濾過補剤を
加え、室温に加温して、５％酢酸を１．７５時間にわた
って徐々に加えて溶液のｐＨを４．７に低下させて、沈
殿を形成させた。溶液を攪拌しながら１時間ｐＨ４．７
に維持したのち、遠心分離して沈殿を除去した。分析に
より、澄明な上清中に溶解した蛋白質は、ＥＬＩＳＡで
測定して、２．６％ＰＳＴオリゴマーおよび０．０１％
未満の大腸菌残渣を含有し、ＰＳＴモノマーの純度は９
７＋％であることがわかった。精製過程におけるＰＳＴ
モノマーの収率は８４．５％と計算された。ＰＳＴモノ
マーの純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって確認された。
された溶液を次に、以下のように本発明の方法によって
精製し、ＰＳＴモノマーを回収した。調製された溶液１
７５ｍｌに予め８．７５ｇのセライト５７７濾過補剤を
加え、室温に加温して、５％酢酸を１．７５時間にわた
って徐々に加えて溶液のｐＨを４．７に低下させて、沈
殿を形成させた。溶液を攪拌しながら１時間ｐＨ４．７
に維持したのち、遠心分離して沈殿を除去した。分析に
より、澄明な上清中に溶解した蛋白質は、ＥＬＩＳＡで
測定して、２．６％ＰＳＴオリゴマーおよび０．０１％
未満の大腸菌残渣を含有し、ＰＳＴモノマーの純度は９
７＋％であることがわかった。精製過程におけるＰＳＴ
モノマーの収率は８４．５％と計算された。ＰＳＴモノ
マーの純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって確認された。
【００６３】上述の直接沈殿法の変法においては、リフ
ォールディング溶液のｐＨを実質的にすべての可溶化ソ
マトトロピンモノマーが溶液中に残存するレベルまでま
ず低下させ、ついでｐＨを至適終点に増大させることに
より、至適終点ｐＨに酸側から接近することもできる。
図２のＭＢＳＴ溶解度曲線をみれば、酢酸をｐＨ１０の
冷リフォールディング溶液に添加して、ｐＨを約４．５
未満に低下させることもできる。このｐＨレベルでは、
すべての可溶化蛋白質が尿素水溶液中に実質的に溶解し
たままで残り、酢酸の添加中に沈殿した蛋白質は、ｐＨ
が４．５以下にさらに低下していくと再溶解することが
わかる。存在する尿素または他のカオトロピック剤の溶
液中濃度は、必要に応じて、透析濾過または他の適当な
手段によって、ついで低下させることができる。次に、
ｐＨを、ＮａＯＨまたは他の適当な塩基の添加によっ
て、実質的にすべてのオリゴマーおよび大腸菌蛋白質の
沈殿、一方、ＭＢＳＴモノマーの溶液中への好収率での
残存によって指示される至適ｐＨ終点が達成されるま
で、上方に調整する。沈殿を除去して、精製されたＭＢ
ＳＴモノマーを上述のように溶液から回収する。
ォールディング溶液のｐＨを実質的にすべての可溶化ソ
マトトロピンモノマーが溶液中に残存するレベルまでま
ず低下させ、ついでｐＨを至適終点に増大させることに
より、至適終点ｐＨに酸側から接近することもできる。
図２のＭＢＳＴ溶解度曲線をみれば、酢酸をｐＨ１０の
冷リフォールディング溶液に添加して、ｐＨを約４．５
未満に低下させることもできる。このｐＨレベルでは、
すべての可溶化蛋白質が尿素水溶液中に実質的に溶解し
たままで残り、酢酸の添加中に沈殿した蛋白質は、ｐＨ
が４．５以下にさらに低下していくと再溶解することが
わかる。存在する尿素または他のカオトロピック剤の溶
液中濃度は、必要に応じて、透析濾過または他の適当な
手段によって、ついで低下させることができる。次に、
ｐＨを、ＮａＯＨまたは他の適当な塩基の添加によっ
て、実質的にすべてのオリゴマーおよび大腸菌蛋白質の
沈殿、一方、ＭＢＳＴモノマーの溶液中への好収率での
残存によって指示される至適ｐＨ終点が達成されるま
で、上方に調整する。沈殿を除去して、精製されたＭＢ
ＳＴモノマーを上述のように溶液から回収する。
【００６４】本発明の沈殿精製方法の供給原料の品質お
よび効率は、場合によっては、ソマトトロピン蛋白質の
可溶化および再生工程の前に、屈折体の付加的な洗浄を
行って夾雑する細胞残屑を除去することによって改良で
きる。ある種の場合には、水または、界面活性剤、溶媒
もしくはＮａＯＨを含有する水溶液による洗浄が、多く
の可溶性不純物の除去に助けとなり、過程収率および最
終的ソマトトロピンモノマー生成物の純度に全体的な改
善を生じる。
よび効率は、場合によっては、ソマトトロピン蛋白質の
可溶化および再生工程の前に、屈折体の付加的な洗浄を
行って夾雑する細胞残屑を除去することによって改良で
きる。ある種の場合には、水または、界面活性剤、溶媒
もしくはＮａＯＨを含有する水溶液による洗浄が、多く
の可溶性不純物の除去に助けとなり、過程収率および最
終的ソマトトロピンモノマー生成物の純度に全体的な改
善を生じる。
【００６５】別の態様−２段階沈殿 本発明の別の実施態様においては、初期のリフォールデ
ィング溶液のｐＨを、至適ｐＨ終点値を越えて、少なく
とも約８０％のソマトトロピンモノマーが溶液中に残存
し、約３０％までのソマトトロピンオリゴマーが溶液中
に残存し、約１０％までの小部分の残留宿主細胞蛋白質
が溶液中に残存する点まで低下させる。生成した沈殿
は、主として細菌残査からなり、かなりの量のソマトト
ロピンオリゴマーを含有する。これを濾過または遠心分
離によって系から除去すると、ソマトトロピンモノマー
に富んだ溶液が残り、これは溶解した総蛋白質に対し
て、約２０％未満のソマトトロピンオリゴマーおよび約
５％未満の細菌残渣を含有することが好ましい。この濃
縮した溶液のｐＨをＮａＯＨまたは他の適当な塩基の添
加によって、残った大部分のソマトトロピンオリゴマー
が存在する実質的にすべての宿主細胞残渣とともに沈殿
し、ソマトトロピンモノマーの高度に精製された溶液が
残る至適終点値まで低下させる。この２工程沈殿方法の
利点は、第二の沈殿に使用される濃縮された供給原料に
より、高純度のソマトトロピンモノマーがえられるとい
う事実にある。
ィング溶液のｐＨを、至適ｐＨ終点値を越えて、少なく
とも約８０％のソマトトロピンモノマーが溶液中に残存
し、約３０％までのソマトトロピンオリゴマーが溶液中
に残存し、約１０％までの小部分の残留宿主細胞蛋白質
が溶液中に残存する点まで低下させる。生成した沈殿
は、主として細菌残査からなり、かなりの量のソマトト
ロピンオリゴマーを含有する。これを濾過または遠心分
離によって系から除去すると、ソマトトロピンモノマー
に富んだ溶液が残り、これは溶解した総蛋白質に対し
て、約２０％未満のソマトトロピンオリゴマーおよび約
５％未満の細菌残渣を含有することが好ましい。この濃
縮した溶液のｐＨをＮａＯＨまたは他の適当な塩基の添
加によって、残った大部分のソマトトロピンオリゴマー
が存在する実質的にすべての宿主細胞残渣とともに沈殿
し、ソマトトロピンモノマーの高度に精製された溶液が
残る至適終点値まで低下させる。この２工程沈殿方法の
利点は、第二の沈殿に使用される濃縮された供給原料に
より、高純度のソマトトロピンモノマーがえられるとい
う事実にある。
【００６６】２工程沈殿法は図２を参照すれば、さらに
容易に理解できる。単一工程沈殿法に関連して上述した
ように、この系におけるＭＢＳＴモノマーの分離および
回収に際しての至適ｐＨ終点値は約５．０±０．２であ
って、このｐＨで実質的にすべての細菌残渣は沈殿し、
溶液中に残るソマトトロピンオリゴマーの濃度は約２．
５％である。さらにｐＨを約４．３まで低下させること
により、沈殿したソマトトロピンモノマーは実質的にす
べてが再溶解し、一方、約３０％のソマトトロピンオリ
ゴマーが再溶解して、その溶液中の濃度はＭＢＳＴの約
１０重量％に上昇する。しかしながら、細菌残渣は、こ
のｐＨでは実質的に不溶のままである。この点で沈殿を
分離すれば、実質的にすべての細菌残渣と、この系に最
初存在したソマトトロピンオリゴマーの約７０％が除去
される。ついで、残った溶液のｐＨを第二の沈殿の至適
終点値に増大させると、残存するソマトトロピンオリゴ
マーの大部分と溶液中にまだ残っている残留細菌蛋白質
があればそれも沈殿して、実質的にさらに分画化が起こ
る。第二の沈殿における至適終点値は、単一沈殿の場合
と同じでなくてもよい。一般的には、第二の沈殿の至適
終点ｐＨは、ウシソマトトロピンの場合５．５〜８．５
の範囲、ブタソマトトロピンの場合５．５〜７．５であ
ろう。
容易に理解できる。単一工程沈殿法に関連して上述した
ように、この系におけるＭＢＳＴモノマーの分離および
回収に際しての至適ｐＨ終点値は約５．０±０．２であ
って、このｐＨで実質的にすべての細菌残渣は沈殿し、
溶液中に残るソマトトロピンオリゴマーの濃度は約２．
５％である。さらにｐＨを約４．３まで低下させること
により、沈殿したソマトトロピンモノマーは実質的にす
べてが再溶解し、一方、約３０％のソマトトロピンオリ
ゴマーが再溶解して、その溶液中の濃度はＭＢＳＴの約
１０重量％に上昇する。しかしながら、細菌残渣は、こ
のｐＨでは実質的に不溶のままである。この点で沈殿を
分離すれば、実質的にすべての細菌残渣と、この系に最
初存在したソマトトロピンオリゴマーの約７０％が除去
される。ついで、残った溶液のｐＨを第二の沈殿の至適
終点値に増大させると、残存するソマトトロピンオリゴ
マーの大部分と溶液中にまだ残っている残留細菌蛋白質
があればそれも沈殿して、実質的にさらに分画化が起こ
る。第二の沈殿における至適終点値は、単一沈殿の場合
と同じでなくてもよい。一般的には、第二の沈殿の至適
終点ｐＨは、ウシソマトトロピンの場合５．５〜８．５
の範囲、ブタソマトトロピンの場合５．５〜７．５であ
ろう。
【００６７】２工程沈殿法を以下の実施例によつて例示
する。
する。
【００６８】例３ ４．５Ｍ尿素水溶液中、ｐＨ１１のＭＢＳＴリフォール
ディング溶液２００ｍｌを約５０ｌの１ｍＭ ＮａＯＨ
に対し、４℃で１６時間にわたって透析して、尿素の濃
度を０．２Ｍ未満に低下させた。この溶液をＹＭ１０膜
を付したＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆Ｃｏ．，Ｄａｎｖ
ｅｒｓ，ＭＡ０１９２３）で１３０ｍｌに濃縮した。こ
の時点で、溶液は約７．０ｇ／ｌのＭＢＳＴモノマー、
３．４ｇ／ｌのＭＢＳＴオリゴマー、および２．１ｇ／
ｌの大腸菌残留蛋白質を含有していた。溶液を室温まで
加温し、希酢酸を滴加してｐＨを５．０に低下させた。
この時点で有意な沈殿を生じた。溶液を遠心分離して沈
殿を除去した。澄明な上清を集め、ＮａＯＨを加えてｐ
Ｈを６．０に調整した。１時間後にサンプルを遠心分離
して第二の沈殿を除去し、澄明な上清中のＭＢＳＴモノ
マーを回収した。この過程の各工程における純度および
収率を表４に示す。
ディング溶液２００ｍｌを約５０ｌの１ｍＭ ＮａＯＨ
に対し、４℃で１６時間にわたって透析して、尿素の濃
度を０．２Ｍ未満に低下させた。この溶液をＹＭ１０膜
を付したＡｍｉｃｏｎ攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆Ｃｏ．，Ｄａｎｖ
ｅｒｓ，ＭＡ０１９２３）で１３０ｍｌに濃縮した。こ
の時点で、溶液は約７．０ｇ／ｌのＭＢＳＴモノマー、
３．４ｇ／ｌのＭＢＳＴオリゴマー、および２．１ｇ／
ｌの大腸菌残留蛋白質を含有していた。溶液を室温まで
加温し、希酢酸を滴加してｐＨを５．０に低下させた。
この時点で有意な沈殿を生じた。溶液を遠心分離して沈
殿を除去した。澄明な上清を集め、ＮａＯＨを加えてｐ
Ｈを６．０に調整した。１時間後にサンプルを遠心分離
して第二の沈殿を除去し、澄明な上清中のＭＢＳＴモノ
マーを回収した。この過程の各工程における純度および
収率を表４に示す。
【表４】 全過程の収率は約７６％である。
【００６９】ＭＢＳＴの精製においては、第一の沈殿の
ためのｐＨ終点は通常４．０〜５．５の範囲であるが、
一方、第二の沈殿のためのｐＨ終点は通常５．５〜６．
５の範囲である。ＡＢＳＴの場合、第一のｐＨ終点は通
常４．０〜５．５の範囲であり、一方、第二のｐＨ終点
は通常６．５〜８．５の範囲である。ＰＳＴの場合、第
一のｐＨ終点は通常４．０〜５．０の範囲であり、一
方、第二のｐＨ終点は通常５．５〜７．５の範囲であ
る。すべての場合、第一のｐＨ終点は、大部分のソマト
トロピンオリゴマーと大腸菌残渣が沈殿し、一方、最初
に存在したソマトトロピンモノマーの少なくとも約８０
％、好ましくは９０〜９５％またはそれ以上が溶液中に
残るように選択される。
ためのｐＨ終点は通常４．０〜５．５の範囲であるが、
一方、第二の沈殿のためのｐＨ終点は通常５．５〜６．
５の範囲である。ＡＢＳＴの場合、第一のｐＨ終点は通
常４．０〜５．５の範囲であり、一方、第二のｐＨ終点
は通常６．５〜８．５の範囲である。ＰＳＴの場合、第
一のｐＨ終点は通常４．０〜５．０の範囲であり、一
方、第二のｐＨ終点は通常５．５〜７．５の範囲であ
る。すべての場合、第一のｐＨ終点は、大部分のソマト
トロピンオリゴマーと大腸菌残渣が沈殿し、一方、最初
に存在したソマトトロピンモノマーの少なくとも約８０
％、好ましくは９０〜９５％またはそれ以上が溶液中に
残るように選択される。
【００７０】２工程沈殿方法では、最終生成物中のオリ
ゴマーのレベルは容易に２％未満に、多くの場合１％未
満に低下させることができて、回収されたソマトトロピ
ンモノマーの最終純度は９９％を越える。
ゴマーのレベルは容易に２％未満に、多くの場合１％未
満に低下させることができて、回収されたソマトトロピ
ンモノマーの最終純度は９９％を越える。
【００７１】以上の説明および実施例は特定のソマトト
ロピン蛋白質系についてのものであったが、本発明の方
法は一般的に、ＭＢＳＴ，ＡＢＳＴ，ＰＳＴおよび他の
ソマトトロピン変異体の精製にも適用できるものである
ことを理解すべきである。至適ｐＨ終点値および他の工
程変数は、特定の系の特定の条件に依存して変動する
が、それらは蛋白質溶解度曲線およびわずかな実験から
容易に決定できる。溶液中における蛋白質の相対的溶解
度は、温度、または様々な塩、溶媒、溶質等の存在によ
って影響され、沈殿工程時の分画化を高めるために上述
の変動因子を利用して溶解度差を増大させることは、本
発明の範囲内に包含される。分画化を高めるために使用
できる溶媒修飾剤には、アルコールたとえばエタノール
およびイソプロパノール、非イオン界面活性剤たとえば
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ８０、ポリ
エチレングリコール、糖、ならびに様々な塩が包含され
る。方法の他の要素、たとえばｐＨ調整に用いられる酸
または塩基は、個人の好みにより、実行者が選択でき
る。ｐＨはたとえば、酢酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸
またはクエン酸を用いて低下させることができるが、至
適ｐＨ終点は、酸が異なるとわずかなが上方または下方
にシフトすることがある。ｐＨはＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｎ
Ｈ４ＯＨ，トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンま
たはエタノールアミンを用いて上昇させることができる
が、この場合も至適ｐＨ終点は選択された特定の塩基に
よつてシフトすることがある。このような方法の変動因
子はすべて本発明の範囲内に包含されるものである。
ロピン蛋白質系についてのものであったが、本発明の方
法は一般的に、ＭＢＳＴ，ＡＢＳＴ，ＰＳＴおよび他の
ソマトトロピン変異体の精製にも適用できるものである
ことを理解すべきである。至適ｐＨ終点値および他の工
程変数は、特定の系の特定の条件に依存して変動する
が、それらは蛋白質溶解度曲線およびわずかな実験から
容易に決定できる。溶液中における蛋白質の相対的溶解
度は、温度、または様々な塩、溶媒、溶質等の存在によ
って影響され、沈殿工程時の分画化を高めるために上述
の変動因子を利用して溶解度差を増大させることは、本
発明の範囲内に包含される。分画化を高めるために使用
できる溶媒修飾剤には、アルコールたとえばエタノール
およびイソプロパノール、非イオン界面活性剤たとえば
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ８０、ポリ
エチレングリコール、糖、ならびに様々な塩が包含され
る。方法の他の要素、たとえばｐＨ調整に用いられる酸
または塩基は、個人の好みにより、実行者が選択でき
る。ｐＨはたとえば、酢酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸
またはクエン酸を用いて低下させることができるが、至
適ｐＨ終点は、酸が異なるとわずかなが上方または下方
にシフトすることがある。ｐＨはＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｎ
Ｈ４ＯＨ，トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンま
たはエタノールアミンを用いて上昇させることができる
が、この場合も至適ｐＨ終点は選択された特定の塩基に
よつてシフトすることがある。このような方法の変動因
子はすべて本発明の範囲内に包含されるものである。
【図１】部分精製ＭＢＳＴソマトトロピンの等電点クロ
マトグラフィーゲルの写真 レーン１：Ｐｈａｒｍａｃｉａ標準ＩＥＦ蛋白質 レーン２：高純度モノマー標品 レーン３および４：本発明の方法によって精製されたモ
ノマー レーン５：精製ダイマー。
マトグラフィーゲルの写真 レーン１：Ｐｈａｒｍａｃｉａ標準ＩＥＦ蛋白質 レーン２：高純度モノマー標品 レーン３および４：本発明の方法によって精製されたモ
ノマー レーン５：精製ダイマー。
【図２】ＭＢＳＴモノマー、ＭＢＳＴオリゴマー、およ
び大腸菌由来蛋白質残渣の溶解度曲線。
び大腸菌由来蛋白質残渣の溶解度曲線。
【図３】ＡＢＳＴの沈殿精製過程の収率に対する尿素濃
度の影響を示すグラフ。
度の影響を示すグラフ。
【図４】ＡＢＳＴのリフォールディング過程の収率に対
する尿素濃度の影響を示すグラフ。
する尿素濃度の影響を示すグラフ。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−195698（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ Ａ ＮＤ ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ （1973），ＶＯＬ．37，ＮＯ．６，Ｐ. 860−866 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00,21/02 C12N 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (35)
- 【請求項１】 ａ） pH７以上の水溶液中ソマトトロピ
ンモノマーおよびソマトトロピンオリゴマーからなる酸
化されたリフォールディング溶液を得、ｂ）その溶液の
pHを４．５〜６．０に低下させてこの溶液からソマトト
ロピンオリゴマーを選択的に沈殿させ、一方大部分のソ
マトトロピンモノマーは溶液中に維持させ、ｃ） 沈殿
を除去して溶液中に残るソマトトロピン蛋白質を回収す
る、ソマトトロピン蛋白質の分離方法。 - 【請求項２】 得られたリフォールディング溶液は大部
分のソマトトロピンモノマーおよび小部分のソマトトロ
ピンオリゴマーからなる「請求項１」記載の方法。 - 【請求項３】 ソマトトロピンオリゴマーは総蛋白質の
１０〜３０重量％の量存在する「請求項２」記載の方
法。 - 【請求項４】 沈殿後溶液中に残存するソマトトロピン
オリゴマーの量は、溶液中に残存する総ソマトトロピン
蛋白質の５重量％未満である「請求項３」記載の方法。 - 【請求項５】 得られたリフォールディング溶液はpH１
０以上の水溶液中に存在する「請求項１」記載の方法。 - 【請求項６】 さらに回収された溶液から揮発性物質を
除去する工程を包含し、乾燥ソマトトロピン蛋白質生成
物を得る「請求項１」記載の方法。 - 【請求項７】 ソマトトロピン蛋白質はウシまたはブタ
ソマトトロピンである「請求項１」記載の方法。 - 【請求項８】 ソマトトロピンはＮ−メチオニルまたは
Ｎ−アラニルウシソマトトロピンである「請求項７」記
載の方法。 - 【請求項９】 ソマトトロピンはＮ−アラニルブタソマ
トトロピンである「請求項７」記載の方法。 - 【請求項１０】 ａ） pH７以上の水溶液中、ソマトト
ロピンモノマー、ソマトトロピンオリゴマーおよび細菌
残渣からなる蛋白質の混合物を得、ｂ） その溶液のpH
を４．５〜６．０に低下させてこの溶液からソマトトロ
ピンオリゴマーと細菌残渣を選択的に沈殿させ、一方大
部分のソマトトロピンモノマーは溶液中に維持させ、
ｃ） 沈殿を除去して溶液中に残る精製ソマトトロピン
蛋白質を回収する、ソマトトロピン蛋白質の分離および
精製方法。 - 【請求項１１】 蛋白質の溶液中混合物は、組換えＤＮ
Ａ技術による宿主細胞培養から産生されるソマトトロピ
ン蛋白質の再生で得られる「請求項１０」記載の方法。 - 【請求項１２】 細菌残渣は大腸菌宿主細胞に由来する
「請求項１１」記載の方法る - 【請求項１３】 細菌残渣の大部分はソマトトロピンオ
リゴマーとともに選択的に沈殿される「請求項１０」記
載の方法。 - 【請求項１４】 得られた溶液は、少くとも３０％のソ
マトトロピンモノマー、１０〜３０％のソマトトロピン
オリゴマー、および２０〜５０％の細菌残渣からなる
「請求項１０」記載の方法。 - 【請求項１５】 沈殿後溶液中に残存する蛋白質は、少
くとも９５％のソマトトロピンモノマー、５％未満のソ
マトトロピンオリゴマーおよび１％未満の細菌残渣から
なる「請求項１４」記載の方法。 - 【請求項１６】 さらに沈殿後に残った溶液から揮発性
物質を除去する工程を包含し、乾燥ソマトトロピン蛋白
質生成物を得る「請求項１０」記載の方法。 - 【請求項１７】 水溶液はカオトロピック剤を包含する
「請求項１０」記載の方法。 - 【請求項１８】 カオトロピック剤は、尿素、グアニジ
ン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウムおよび界面活性剤か
らなる群より選ばれる「請求項１７」記載の方法。 - 【請求項１９】 カオトロピック剤は尿素であり、その
尿素の沈殿工程時における濃度は３Ｍ未満である「請求
項１７」記載の方法。 - 【請求項２０】 得られる蛋白質の混合物はpH１０以上
の水溶液中に存在する「請求項１９」記載の方法。 - 【請求項２１】 ソマトトロピン蛋白質はウシまたはブ
タソマトトロピンである「請求項１０」記載の方法。 - 【請求項２２】 ソマトトロピンはＮ−メチオニルまた
はＮ−アラニルウシソマトトロピンである「請求項２
１」記載の方法。 - 【請求項２３】 ソマトトロピンはＮ−アラニルブタソ
マトトロピンである「請求項２１」記載の方法。 - 【請求項２４】 ａ） pH７以上で水溶液中ソマトトロ
ピンモノマーとソマトトロピンオリゴマーの混合物を細
菌残渣とともに得、ｂ） その溶液のpHを、実質的部分
のソマトトロピンオリゴマーと細菌残渣を沈殿させ、一
方大部分のソマトトロピンモノマーを溶液中に残存させ
るのに有効な第一の値に低下させ、ｃ） 沈殿を溶液か
ら除去し、ｄ） この溶液のpHを、さらにソマトトロピ
ンオリゴマーと細菌残渣を溶液から選択的に沈殿させ、
一方大部分のソマトトロピンモノマーを溶液中に残存さ
せるのに有効な第二の終点値に上昇させ、ｅ） 沈殿を
除去して溶液中に精製ソマトトロピン蛋白質を回収す
る、ソマトトロピンモノマーの分離および精製方法。 - 【請求項２５】 ソマトトロピンはウシソマトトロピン
であり、第一のpH値は４．０〜５．５であり、第二のpH
値は５．５〜８．５である「請求項２４」記載の方法。 - 【請求項２６】 ソマトトロピンはＮ−メチオニルウシ
ソマトトロピンであり、第二のpH値は５．５〜６．５で
ある「請求項２５」記載の方法。 - 【請求項２７】 ソマトトロピンはＮ−アラニルウシソ
マトトロピンであり、第二のpH値は６．５〜８．５であ
る「請求項２５」記載の方法。 - 【請求項２８】 ソマトトロピンはＮ−アラニルブタソ
マトトロピンであり、第一のpH値は４．０〜５．０、第
二のpH値は５．５〜７．５である「請求項２４」記載の
方法。 - 【請求項２９】 少くとも８０％のソマトトロピンモノ
マーが第一のpH値で溶液中に残る「請求項２４」記載の
方法。 - 【請求項３０】 第二の終点pHにおいて溶液中にソマト
トロピンオリゴマーのレベルは、溶液中の総ソマトトロ
ピン蛋白質の２重量％未満である請求項２４」記載の方
法。 - 【請求項３１】 ａ） pH７以上の水溶液中ソマトトロ
ピンモノマーおよびソマトトロピンオリゴマーからなる
ソマトトロピン蛋白質の混合物を得、ｂ）このモノマー
とオリゴマーを溶液中に実質的に維持しながら、この溶
液のpHを４．５未満に低下させ、ｃ） この溶液のpHを
５．５以上に上昇させることによってソマトトロピンモ
ノマーの大部分は溶液中に維持しながら、ソマトトロピ
ンオリゴマーを選択的にこの溶液から沈殿させ、ついで
ｄ） 沈殿を除去して溶液中に残るソマトトロピン蛋白
質を回収する、ソマトトロピン蛋白質の分離方法。 - 【請求項３２】 水溶液にはソマトトロピン蛋白質の溶
解度を実質的に上昇させるのに十分な量のカオトロピッ
ク剤を包含させる「請求項３１」記載の方法。 - 【請求項３３】 カオトロピック剤は、尿素、グアニジ
ン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウムおよび界面活性剤か
らなる群より選ばれる「請求項３２」記載の方法。 - 【請求項３４】 カオトロピック剤は、ソマトトロピン
オリゴマーの選択的沈殿に先立って水溶液から実質的に
除去する「請求項３２」記載の方法。 - 【請求項３５】 ソマトトロピン蛋白質はウシまたはブ
タソマトトロピンである「請求項３１」記載の方法。
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| US486476 | 1990-02-28 | ||
| US07/486,476 US5182369A (en) | 1990-02-28 | 1990-02-28 | Method for purifying somatotropin monomers |
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1995
- 1995-12-21 US US08/576,517 patent/US5986073A/en not_active Expired - Fee Related
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