JPH01117796A - タンパク質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞により生産されたタンパク質を回収する方
法に関する。

［従来の技術］ 大量の所望のタンパク質を得るために、近年遺伝子工学
を用いて作り出された組換え体細胞が使用されつつある
。ところが組換え体細胞中に生産されたタンパク質が通
常の方法では抽出することが困難な不溶性形態で蓄積す
る例がいくつか報告されている（Ｄ、Ｃ，Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ、ｅｔ　ａｔ、５ｃｉｅｎｃｅ、２１５，６８７（
１９８２）；Ｄ、Ｃ，Ｐａｕｌ、ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、３１゜７１（１９８３）；
Ｇ、Ｓｉｍｏｎｓ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　２Ｂ、５５
（１９８４））。

従って、この不溶性タンパク質を抽出することが出来る
商業的に実用可能な方法の開発が要求されている。従来
このような不溶性タンパク質を可溶化する方法としてド
デシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略す）、塩酸グ
アニジン、尿素などの溶剤が一最に使用されている。と
ころがこれらの可溶化剤は、タンパク質変性作用が強く
、しかも可溶化後にタンパク質と可溶化剤との分離が困
難であるという問題がある。従って、このような不溶性
タンパク質を商業的に実用可能な回収量で、しかもすみ
やかにタンパク質との分離が可能な回収方法の確立が必
要とされている。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、原核細胞又は真核細胞により生産されたタン
パク質を効率的な回収量で、しかも可溶化後にすみやか
にタンパク質と可溶化剤が分離可能な回収方法の開発を
目的とする。

［問題点を解決するための手段］ 上記目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち本発明は、細胞により生産されたタンパり質を
回収する際に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させ
ることを特徴とするタンパク質の回収方法である。

本発明の細胞は、有用タンパク質を生産する細胞であれ
ば特に限定はなぐ原核細胞でも真核細胞でも良い。

本発明方法は、遺伝子組換え技術により形質転換された
組換え体細胞から生産されたタンパク質を回収する際に
特に有用な方法である。組換え体細胞とは、有用タンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片が翻訳開始信号とともに、
プロモーター制御下に組み込まれた発現ベクターにより
、宿主を形質転換したものであり、公知の方法、たとえ
ばＧＯｅｄｄｅｌ、［）、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅ
ｉＣＡｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、８．４０５７（１９８０）
；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒ
ｅ、２９８，３４７−３５０（１９８２）；Ｊｏｅｌ　
Ｈ，ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、１°１，６８７−７０６（１９８３）等に記載の方
法により作製することができる。

組換え体細胞の宿主としては、特に限定されないが、具
体的にはＥ、　Ｃｏ　Ｉ　ｉ　、　ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒ　ｉ　ｕｎ、　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｕｒｅｕｓ等の胞子形成能のない細菌、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｃａｎｄ　ｉｄａ等の酵母、マウス
Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊膜由来ＦＬ
細胞等の動物細胞が挙げられる。この中では特にＥ。

ｃｏｌｉが好ましい。

本発明のタンパク質は、細胞が生産できる生理活性物質
であれば特に限定されないが、たとえば各種ホルモン、
あるいは各種インターフェロン（α、β、γ）、インタ
ーロイキン２等のリンフ才力イン、さらに細胞膜中に存
在するりボタンバクなどが挙げられる。また、細胞膜中
に存在するリボ多糖を細胞から回収する際にも、本発明
方法は適用できる。

本発明は、上記細胞を培養してタンパク質を生産させた
後に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させ、不溶性
のタンパク質を抽出し可溶化させて回収することを特徴
とする。具体的には、原核細胞又は真核細胞を無水液体
アンモニアと好ましくは一５０℃から０℃、１気圧から
５気圧、最も好ましくは一４０℃から０℃、１気圧から
２気圧の条件下で接触させる。無水液体アンモニアは、
無傷の細胞又は破砕した細胞と直接接触させることがで
きる。破砕は、リゾチーム消化、超音波処理、高圧法、
凍結融解法、ホモジナイズなどによる方法が適宜用いら
れる。

無水アンモニア溶液は、１．０ｍｌの無水液体アンモニ
アに対し、好ましくは０．１〜１００■、最も好ましく
は１〜１０■の細胞又は細胞破砕液を接触させる。無水
液体アンモニアは単独でも良いが、ジチオスレイトール
等の還元剤等を添加して使用しても良い。接触時間は好
ましくは５分〜８時間、最も好ましくは３０分〜３時間
である。

本発明の方法はバッチ式、連続式又はその組み合わせに
より実施することが出来る。

細胞と無水液体アンモニアを接触させた後、この混合物
を減圧または常圧下でアンモニアを蒸発させ、適宜濃縮
する。

無水液体アンモニアを接触させた後、可溶化したタンパ
ク質を溶剤を用いて再構成することにより回収率をさら
に上げることができる。再構成とは、可溶化したタンパ
ク質を活性のある形に巻き戻すことである。再構成に適
した溶剤としては、エチレングリコール、ポリエチレン
グリコール等のタンパク質の安定化に関する有機溶媒、
非イオン系界面活性剤、もしくはウシ血清アルブミン、
ヒト血清アルブミン等のタンパク質などの一種又は二種
以上が挙げられる。非イオン系界面活性剤は、たとえば
”Ｂｒ１ｊ　３５　”、”Ｂｒ１ｊ　５Ｂ　”　（アト
ラス社）等のポリオキシエチレンアルキルエーテル系の
界面活性剤、もしくは“丁Ｗｅｅｎ　２０”、“丁ｗｅ
ｅｎ　８０”　　（アトラス社）等のポリオキシエチレ
ンソルビタン脂肪酸エステル系の界面活性剤である。

これらの溶剤は、無水液体アンモニアに対し好ましくは
５〜１０００倍量、最も好ましくは１０〜１００倍量を
接触させて使用する。次いで塩酸、酢酸、ギ酸などの酸
でＰＨを好ましくは６．０〜９．０、最も好ましくは７
．０〜８，０に調整する。

上記の再構成の方法は、有機酸を用いた不溶性タンパク
質の可溶化物の再構成にも適用できる。

無水液体アンモニアで可溶化させたタンパク質は、必要
により再構成を行ない、次いで沈澱、電気泳動、分子ふ
るい、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィーの如き公知の
方法により回収する。

［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

インターロイキン−２活性の測定はＣＴＬＬ−２細胞（
Ｇｉ　ｌ　ｌ　ｉｓ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　
１２０．２０２７（１９７Ｂ）　）を用い、Ｔ、　Ｈｏ
ｓｗａｎｎの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５．５５（１９８３）　）に従った
。

実施例１ 特開昭６１−２４７３８７号公報に記載の方法により生
産されたヒト遺伝子組換えインターロイキン−２の培養
細胞（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌ）をフレンチ・プレス
により破砕し、不溶画分を遠心分離により分画した。こ
の不溶画分の凍結乾燥品６．１■に対し無水液体アンモ
ニア２０ｍ１を加え、−３３℃、１気圧で３時間放置後
、この混合液を減圧によりアンモニアを蒸発させながら
１．０ｍｌにまで濃縮後、１０％グリセロールと０．０
３％“Ｂｒ１ｊ−３５”を含む溶液２５ｍ１に加え、酢
酸によりＰＨ７，６に調整した。得られたインターロイ
キン−２再構成溶液についてインターロイキン−２活性
の検定を行なった。結果を表１に示す。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた細胞破砕の不溶性画分の
凍結乾燥品６．０■に対し無水液体アンモニア２０ｍ１
とジチオスレイトール５．５■を加え一３３℃１気圧で
３時間放置した。この混合液を１．０ｍｌにまで濃縮後
、１０％グリセロール、０．０３％”Ｂｒ１ｊ−３５’
”を含む溶液２５ｍ１に加え、酢酸によりｐＨ７，６に
調整した。得られた溶液についてインターロイキン−２
活性の検定を行なった。結果を表１に示す。

表１ ［発明の効果］ 本発明の方法においては、タンパク質はＳＤＳ、塩酸グ
アニジン、尿素等の強いタンパク質変性剤にさらすこと
なく温和な条件で抽出されるため、可溶化による活性の
回収率が塩酸グアニジン、尿素等を用いた場合よりも良
くなる。また、可溶化後のタンパク質からの抽出剤の除
去はＳＤＳ、塩酸グアニジン、尿素等では数段階におよ
ぶ、クロマト操作、透析操作等が必要であるが、本発明
の抽出方法はこの除去工程が必要ない。このため抽出以
後の精製操作が簡略化される。

また本発明方法は、可溶化後に再構成を行なうことによ
り、活性の回収率をさらに上げることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）、細胞により生産されたタンパク質を回収する際
   に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させることを特
   徴とするタンパク質の回収方法。