JPH0732717B2 - タンパク質の回収方法 - Google Patents
タンパク質の回収方法Info
- Publication number
- JPH0732717B2 JPH0732717B2 JP27650987A JP27650987A JPH0732717B2 JP H0732717 B2 JPH0732717 B2 JP H0732717B2 JP 27650987 A JP27650987 A JP 27650987A JP 27650987 A JP27650987 A JP 27650987A JP H0732717 B2 JPH0732717 B2 JP H0732717B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cells
- cell
- liquid ammonia
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞により生産されたタンパク質を回収する方
法に関する。
法に関する。
［従来の技術］ 大量の所望のタンパク質を得るために、近年遺伝子工学
を用いて作り出された組換え体細胞が使用されつつあ
る。ところが組換え体細胞中に生産されたタンパク質が
通常の方法では抽出することが困難な不溶性形態で蓄積
する例がいくつか報告されている（D.C.Williams,et a
l,Science,215,687（1982）;D.C.Paul,et al,Eur.J.Cel
l Biol.,31,71（1983）;G.Simons,et al,Gene 28,55（1
984））。
を用いて作り出された組換え体細胞が使用されつつあ
る。ところが組換え体細胞中に生産されたタンパク質が
通常の方法では抽出することが困難な不溶性形態で蓄積
する例がいくつか報告されている（D.C.Williams,et a
l,Science,215,687（1982）;D.C.Paul,et al,Eur.J.Cel
l Biol.,31,71（1983）;G.Simons,et al,Gene 28,55（1
984））。
従って、この不溶性タンパク質を抽出することが出来る
商業的に実用可能な方法の開発が要求されている。従来
このような不溶性タンパク質を可溶化する方法としてド
デシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと略す）、塩酸グア
ニジン、尿素などの溶剤が一般に使用されている。とこ
ろがこれらの可溶可剤は、タンパク質変性作用が強く、
しかも可溶化後にタンパク質と可溶化剤との分離が困難
であるという問題がある。従って、このような不溶性タ
ンパク質を商業的に実用可能な回収量で、しかもすみや
かにタンパク質との分離が可能な回収方法の確立が必要
とされている。
商業的に実用可能な方法の開発が要求されている。従来
このような不溶性タンパク質を可溶化する方法としてド
デシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと略す）、塩酸グア
ニジン、尿素などの溶剤が一般に使用されている。とこ
ろがこれらの可溶可剤は、タンパク質変性作用が強く、
しかも可溶化後にタンパク質と可溶化剤との分離が困難
であるという問題がある。従って、このような不溶性タ
ンパク質を商業的に実用可能な回収量で、しかもすみや
かにタンパク質との分離が可能な回収方法の確立が必要
とされている。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、原核細胞又は真核細胞により生産されたタン
パク質を効率的な回収量で、しかも可溶化後にすみやか
にタンパク質と可溶化剤が分離可能な回収方法の開発を
目的とする。
パク質を効率的な回収量で、しかも可溶化後にすみやか
にタンパク質と可溶化剤が分離可能な回収方法の開発を
目的とする。
［問題点を解決するための手段］ 上記目的は、以下の本発明により達成される。すなわち
本発明は、細胞により生産されたタンパク質を回収する
際に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させることを
特徴とするタンパク質の回収方法である。
本発明は、細胞により生産されたタンパク質を回収する
際に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させることを
特徴とするタンパク質の回収方法である。
本発明の細胞は、有用タンパク質を生産する細胞であれ
ば特に限定はなく原核細胞でも真核細胞でも良い。
ば特に限定はなく原核細胞でも真核細胞でも良い。
本発明方法は、遺伝子組換え技術により形質転換された
組換え体細胞から生産されたタンパク質を回収する際に
特に有用な方法である。組換え体細胞とは、有用タンパ
ク質をコードするDNA断片が翻訳開始信号とともに、プ
ロモーター制御下に組み込まれた発現ベクターにより、
宿主を形質転換したものであり、公知の方法、たとえば
Goeddel,D.V.et al,Nucleic Acids Res.,8,4057（198
0）;Valenzuela,P.et al,Nature.298,347−350（198
2）;Joel H.et al,Nucleic Acids Res.,11,687−706（1
983）等に記載の方法により作製することができる。
組換え体細胞から生産されたタンパク質を回収する際に
特に有用な方法である。組換え体細胞とは、有用タンパ
ク質をコードするDNA断片が翻訳開始信号とともに、プ
ロモーター制御下に組み込まれた発現ベクターにより、
宿主を形質転換したものであり、公知の方法、たとえば
Goeddel,D.V.et al,Nucleic Acids Res.,8,4057（198
0）;Valenzuela,P.et al,Nature.298,347−350（198
2）;Joel H.et al,Nucleic Acids Res.,11,687−706（1
983）等に記載の方法により作製することができる。
組換え体細胞の宿主としては、特に限定されないが、具
体的には、E.coli,Corynebacterium,Staphylococcus au
reus等の胞子形成能のない細菌、Saccharomyces,Candid
a等の酵母、マウスＬ細胞、CHO細胞、HeLa細胞、ヒト羊
膜由来FL細胞等の動物細胞が挙げられる。この中では特
にE.coliが好ましい。
体的には、E.coli,Corynebacterium,Staphylococcus au
reus等の胞子形成能のない細菌、Saccharomyces,Candid
a等の酵母、マウスＬ細胞、CHO細胞、HeLa細胞、ヒト羊
膜由来FL細胞等の動物細胞が挙げられる。この中では特
にE.coliが好ましい。
本発明のタンパク質は、細胞が生産できる生理活性物質
であれば特に限定されないが、たとえば各種ホルモン、
あるいは各種インターフェロン（α，β，γ）、インタ
ーロイキン２等のリンフォカイン、さらに細胞膜中に存
在するリポタンパクなどが挙げられる。また、細胞膜中
に存在するリポ多糖を細胞から回収する際にも、本発明
方法は適用できる。
であれば特に限定されないが、たとえば各種ホルモン、
あるいは各種インターフェロン（α，β，γ）、インタ
ーロイキン２等のリンフォカイン、さらに細胞膜中に存
在するリポタンパクなどが挙げられる。また、細胞膜中
に存在するリポ多糖を細胞から回収する際にも、本発明
方法は適用できる。
本発明は、上記細胞を培養してタンパク質を生産させた
後に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させ、不溶性
のタンパク質を抽出し可溶化させて回収することを特徴
とする。具体的には、原核細胞又は真核細胞を無水液体
アンモニアと好ましくは−50℃から０℃、１気圧から５
気圧、最も好ましくは−40℃から０℃、１気圧から２気
圧の条件下で接触させる。無水液体アンモニアは、無傷
の細胞又は破砕した細胞と直接接触させることができ
る。破砕は、リゾチーム消化、超音波処理、高圧法、凍
結融解法、ホロジナイズなどによる方法が適宜用いられ
る。
後に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させ、不溶性
のタンパク質を抽出し可溶化させて回収することを特徴
とする。具体的には、原核細胞又は真核細胞を無水液体
アンモニアと好ましくは−50℃から０℃、１気圧から５
気圧、最も好ましくは−40℃から０℃、１気圧から２気
圧の条件下で接触させる。無水液体アンモニアは、無傷
の細胞又は破砕した細胞と直接接触させることができ
る。破砕は、リゾチーム消化、超音波処理、高圧法、凍
結融解法、ホロジナイズなどによる方法が適宜用いられ
る。
無水アンモニア溶液は、1.0mlの無水液体アンモニアに
対し、好ましくは0.1〜100mg、最も好ましくは１〜10mg
の細胞又は細胞破砕液を接触させる。無水液体アンモニ
アは単独でも良いが、ジチオスレイトール等の還元剤等
を添加して使用しても良い。接触時間は好ましくは５分
〜８時間、最も好ましくは30分〜３時間である。
対し、好ましくは0.1〜100mg、最も好ましくは１〜10mg
の細胞又は細胞破砕液を接触させる。無水液体アンモニ
アは単独でも良いが、ジチオスレイトール等の還元剤等
を添加して使用しても良い。接触時間は好ましくは５分
〜８時間、最も好ましくは30分〜３時間である。
本発明の方法はバッチ式、連続式又はその組み合わせに
より実施することが出来る。
より実施することが出来る。
細胞と無水液体アンモニアを接触させた後、この混合物
を減圧または常圧下でアンモニアを蒸発させ、適宜濃縮
する。
を減圧または常圧下でアンモニアを蒸発させ、適宜濃縮
する。
無水液体アンモニアを接触させた後、可溶化したタンパ
ク質を溶剤を用いて再構成することにより回収率をさら
に上げることができる。再構成とは、可溶化したタンパ
ク質を活性のある形に巻き戻すことである。再構成に適
した溶剤としては、エチレグリコール、ポリエチレング
リコール等のタンパク質の安定化に関する有機溶媒、非
イオン系界面活性剤、もしくはウシ血清アルブミン、ヒ
ト血清アルブミン等のタンパク質などの一種又は二種以
上が挙げられる。非イオン系界面活性剤は、たとえば
“Brij 35"、“Brij 58"（アトラス社）等のポリオキシ
エチレンアルキルエーテル系の界面活性剤、もしくは
“Tween 20"、“Tween 80"（アトラス社）等のポリオキ
シエチレンソルビタン樹脂酸エステル系の界面活性剤で
ある。これらの溶剤は、無水液体アンモニアに対し好ま
しくは５〜1000倍量、最も好ましくは10〜100倍量を接
触させて使用する。次いで塩酸、酢酸、ギ酸などの酸で
pHを好ましくは6.0〜9.0、最も好ましくは7.0〜8.0に調
整する。
ク質を溶剤を用いて再構成することにより回収率をさら
に上げることができる。再構成とは、可溶化したタンパ
ク質を活性のある形に巻き戻すことである。再構成に適
した溶剤としては、エチレグリコール、ポリエチレング
リコール等のタンパク質の安定化に関する有機溶媒、非
イオン系界面活性剤、もしくはウシ血清アルブミン、ヒ
ト血清アルブミン等のタンパク質などの一種又は二種以
上が挙げられる。非イオン系界面活性剤は、たとえば
“Brij 35"、“Brij 58"（アトラス社）等のポリオキシ
エチレンアルキルエーテル系の界面活性剤、もしくは
“Tween 20"、“Tween 80"（アトラス社）等のポリオキ
シエチレンソルビタン樹脂酸エステル系の界面活性剤で
ある。これらの溶剤は、無水液体アンモニアに対し好ま
しくは５〜1000倍量、最も好ましくは10〜100倍量を接
触させて使用する。次いで塩酸、酢酸、ギ酸などの酸で
pHを好ましくは6.0〜9.0、最も好ましくは7.0〜8.0に調
整する。
上記の再構成の方法は、有機酸を用いた不溶性タンパク
質の可溶化物の再構成にも適用できる。
質の可溶化物の再構成にも適用できる。
無水液体アンモニアで可溶化されたタンパク質は、必要
により再構成を行ない、次いで沈澱、電気泳動、分子ふ
るい、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィーの如き公知の
方法により回収する。
により再構成を行ない、次いで沈澱、電気泳動、分子ふ
るい、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィーの如き公知の
方法により回収する。
［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。インター
ロイキン−２活性の測定はCTLL−２細胞（Gillis,J.Imm
unol.,120,2027（1978））を用い、T.Moswannの方法
（J.Immunological Methods,65,55（1983））に従っ
た。
ロイキン−２活性の測定はCTLL−２細胞（Gillis,J.Imm
unol.,120,2027（1978））を用い、T.Moswannの方法
（J.Immunological Methods,65,55（1983））に従っ
た。
実施例１ 特開昭61−247387号公報に記載の方法により生産された
ヒト遺伝子組換えインターロイキン−２の培養細胞（E.
coil HB101）をフレンチ・プレスにより破砕し、不溶画
分を遠心分離により分画した。この不溶画分の凍結乾燥
品6.1mgに対し無水液体アンモニア20mlを加え、−33
℃、１気圧で３時間放置後、この混合液を減圧によりア
ンモニアを蒸発させながら1.0mlにまで濃縮後、10％グ
リセロールと0.03％“Brij−35"を含む溶液25mlに加
え、酢酸によりpH7.6に調整した。得られたインターロ
イキン−２再構成溶液についてインターロイキン−２活
性の検定を行なった。結果を表１に示す。
ヒト遺伝子組換えインターロイキン−２の培養細胞（E.
coil HB101）をフレンチ・プレスにより破砕し、不溶画
分を遠心分離により分画した。この不溶画分の凍結乾燥
品6.1mgに対し無水液体アンモニア20mlを加え、−33
℃、１気圧で３時間放置後、この混合液を減圧によりア
ンモニアを蒸発させながら1.0mlにまで濃縮後、10％グ
リセロールと0.03％“Brij−35"を含む溶液25mlに加
え、酢酸によりpH7.6に調整した。得られたインターロ
イキン−２再構成溶液についてインターロイキン−２活
性の検定を行なった。結果を表１に示す。
実施例２ 実施例１と同様にして得られた細胞破砕の不溶性画分の
凍結乾燥品6.0mgに対し無水液体アンモニア20mlとジチ
オスレイトール5.5mgを加え−33℃１気圧で３時間放置
した。この混合液を1.0mlにまで濃縮後、10％グリセロ
ール、0.03％“Brij−35"を含む溶液25mlに加え、酢酸
によりpH7.6に調整した。得られた溶液についてインタ
ーロイキン−２活性の検定を行なった。結果を表１に示
す。
凍結乾燥品6.0mgに対し無水液体アンモニア20mlとジチ
オスレイトール5.5mgを加え−33℃１気圧で３時間放置
した。この混合液を1.0mlにまで濃縮後、10％グリセロ
ール、0.03％“Brij−35"を含む溶液25mlに加え、酢酸
によりpH7.6に調整した。得られた溶液についてインタ
ーロイキン−２活性の検定を行なった。結果を表１に示
す。
［発明の効果］ 本発明の方法においては、タンパク質はSDS、塩酸グア
ニジン、尿素等の強いタンパク質変性剤にさらすことな
く温和な条件で抽出されるため、可溶化による活性の回
収率が塩酸グアニジン、尿素等を用いた場合よりも良く
なる。また、可溶化後のタンパク質からの抽出剤の除去
はSDS、塩酸グアニジン、尿素等では数段階におよぶ、
クロマト操作、透析操作等が必要であるが、本発明の抽
出方法はこの除去工程が必要ない。このため抽出以後の
精製操作が簡略化される。
ニジン、尿素等の強いタンパク質変性剤にさらすことな
く温和な条件で抽出されるため、可溶化による活性の回
収率が塩酸グアニジン、尿素等を用いた場合よりも良く
なる。また、可溶化後のタンパク質からの抽出剤の除去
はSDS、塩酸グアニジン、尿素等では数段階におよぶ、
クロマト操作、透析操作等が必要であるが、本発明の抽
出方法はこの除去工程が必要ない。このため抽出以後の
精製操作が簡略化される。
また本発明方法は、可溶化後に再構成を行なうことによ
り、活性の回収率をさらに上げることができる。
り、活性の回収率をさらに上げることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】細胞により生産されたタンパク質を回収す
る際に、該細胞を無水液体アンモニアに接触させること
を特徴とするタンパク質の回収方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27650987A JPH0732717B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | タンパク質の回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27650987A JPH0732717B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | タンパク質の回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01117796A JPH01117796A (ja) | 1989-05-10 |
| JPH0732717B2 true JPH0732717B2 (ja) | 1995-04-12 |
Family
ID=17570459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27650987A Expired - Lifetime JPH0732717B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | タンパク質の回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0732717B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8181215B2 (en) | 2002-02-12 | 2012-05-15 | Comcast Cable Holdings, Llc | System and method for providing video program information or video program content to a user |
| JPWO2007043615A1 (ja) * | 2005-10-14 | 2009-04-16 | 国立大学法人大阪大学 | ペプチドエステル試薬、およびそのライゲーションまたはチオエステル化合物の製造のための使用 |
-
1987
- 1987-10-30 JP JP27650987A patent/JPH0732717B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01117796A (ja) | 1989-05-10 |
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