JPS63270628A - 組み換え体pres−1/s−2/s b型肝炎抗原の酵母からの精製方法 - Google Patents
組み換え体pres−1/s−2/s b型肝炎抗原の酵母からの精製方法Info
- Publication number
- JPS63270628A JPS63270628A JP63042449A JP4244988A JPS63270628A JP S63270628 A JPS63270628 A JP S63270628A JP 63042449 A JP63042449 A JP 63042449A JP 4244988 A JP4244988 A JP 4244988A JP S63270628 A JPS63270628 A JP S63270628A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- yeast
- diafiltration
- membrane
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 68
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 68
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 68
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 30
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical group [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 10
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 9
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 9
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 3
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 claims description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 claims description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 24
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 11
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 11
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 10
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 2
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 2
- 101100028789 Arabidopsis thaliana PBS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- PSDYQSWHANEKRV-UHFFFAOYSA-N [S]N Chemical group [S]N PSDYQSWHANEKRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Chemical group 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 1
- MRXDGVXSWIXTQL-HYHFHBMOSA-N (2s)-2-[[(1s)-1-(2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl)-2-[[(2s)-4-methyl-1-oxo-1-[[(2s)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]pentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]carbamoylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C=O)C1NC(N)=NCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MRXDGVXSWIXTQL-HYHFHBMOSA-N 0.000 description 1
- RRONHWAVOYADJL-HNNXBMFYSA-N (2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RRONHWAVOYADJL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCWXSQNGFGSDMO-UHFFFAOYSA-N 2-iodoacetamide;2-iodoacetic acid Chemical compound NC(=O)CI.OC(=O)CI FCWXSQNGFGSDMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101100139907 Arabidopsis thaliana RAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OLVPQBGMUGIKIW-UHFFFAOYSA-N Chymostatin Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(C1NC(N)=NCC1)NC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OLVPQBGMUGIKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000896148 Enterobacteria phage T4 Baseplate central spike complex protein gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000597227 Escherichia phage Mu Probable terminase, small subunit gp27 Proteins 0.000 description 1
- 101000912555 Escherichia phage lambda Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101710170470 Glycoprotein 42 Proteins 0.000 description 1
- 101000764556 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tape measure protein Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100028790 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PBS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001648319 Toronia toru Species 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- OYHLRJGDELITAF-INIZCTEOSA-N benzyl n-[(2s)-4-chloro-3-oxo-1-phenylbutan-2-yl]carbamate Chemical compound C([C@@H](C(=O)CCl)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OYHLRJGDELITAF-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010086192 chymostatin Proteins 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N n-[(3s)-7-amino-1-chloro-2-oxoheptan-3-yl]-4-methylbenzenesulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- MJRIZSDRKPPHTK-UHFFFAOYSA-N phenothiazine-10-carbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)Cl)C3=CC=CC=C3SC2=C1 MJRIZSDRKPPHTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- -1 transenula Chemical class 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
B型肝炎表面抗原はB型肝炎ウィルスの感染による病理
学的影響に対する免疫性を与える糖タンパク質−タンパ
ク質複合体などを時として生ずる。ワクチンを目的とし
た抗原の製造に際して、安全、迅速かつ安価な供給源と
して、従来は22nmの粒子である必要な抗原をたくさ
ん保持している患者からの直情あるいは、血漿に限定さ
れていた。組み換えDNA技術の出現により、その表面
抗原をコードしているDNAを酵11+)あるいは大腸
菌又は他の細胞系に挿入し、発現する様になった。そし
て、その結果より得られるポリペプチド産物は挿入DN
Aの発現に使用される宿主あるいは細胞系同様に使用さ
れるDNAの構造で実質上、多様に変化するものである
。
学的影響に対する免疫性を与える糖タンパク質−タンパ
ク質複合体などを時として生ずる。ワクチンを目的とし
た抗原の製造に際して、安全、迅速かつ安価な供給源と
して、従来は22nmの粒子である必要な抗原をたくさ
ん保持している患者からの直情あるいは、血漿に限定さ
れていた。組み換えDNA技術の出現により、その表面
抗原をコードしているDNAを酵11+)あるいは大腸
菌又は他の細胞系に挿入し、発現する様になった。そし
て、その結果より得られるポリペプチド産物は挿入DN
Aの発現に使用される宿主あるいは細胞系同様に使用さ
れるDNAの構造で実質上、多様に変化するものである
。
HBウィルス粒子は、コアタンパク質及びエンベロープ
または表面(“S”)タンパク質と呼ばれる2つの構造
タンパク質グループよりなる。更にウィルス粒子、すな
わちゾーン粒子の大部分を占める表面タンパク質である
“S”タンパク質は、オーストラリア抗原と呼ばれる唯
一の成分であり、それは、また22nm粒子においても
同しである。
または表面(“S”)タンパク質と呼ばれる2つの構造
タンパク質グループよりなる。更にウィルス粒子、すな
わちゾーン粒子の大部分を占める表面タンパク質である
“S”タンパク質は、オーストラリア抗原と呼ばれる唯
一の成分であり、それは、また22nm粒子においても
同しである。
“S”タンパク質は、血清型にもよるが389−400
個のアミノ酸をコートしているラージオーブンリーディ
ングフレーム(ORF)による翻訳産物である。このO
RFは3つのドメインにはっきりと区別されており、そ
れぞれが、in vivoにおける翻訳開始点なる機能
を果たすATGコドンを持っている。これらのドメイン
は遺伝子のそれぞれ5’−3’配列において、pres
−1(108−109個のアミノ酸) 、 preS−
2(55個のアミノ酸)、及び5(226個のアミノ酸
)として呼ばれている。このORFからの6個の産生タ
ンパク質は以下の組成よりなる:1) H)42 (
42,000ダルトンの糖タンパク質)=pres−]
/S−2/S (preS−1はpreS−2と隣接し
、preS−2はSと隣接している事を意味する)、2
) p39 (p=タンパク質) = preS−
17S−2/S、3) gp3B= preS−2/
S (2つのグリコシレージョンサイトを持つ)、 4) gp33= preS−2/S (1つのグリ
コシレージョンサイトを持つ)、 5) gp27= S (1つのグリコシレージョン
サイトを持つ)、 6) p24=S。
個のアミノ酸をコートしているラージオーブンリーディ
ングフレーム(ORF)による翻訳産物である。このO
RFは3つのドメインにはっきりと区別されており、そ
れぞれが、in vivoにおける翻訳開始点なる機能
を果たすATGコドンを持っている。これらのドメイン
は遺伝子のそれぞれ5’−3’配列において、pres
−1(108−109個のアミノ酸) 、 preS−
2(55個のアミノ酸)、及び5(226個のアミノ酸
)として呼ばれている。このORFからの6個の産生タ
ンパク質は以下の組成よりなる:1) H)42 (
42,000ダルトンの糖タンパク質)=pres−]
/S−2/S (preS−1はpreS−2と隣接し
、preS−2はSと隣接している事を意味する)、2
) p39 (p=タンパク質) = preS−
17S−2/S、3) gp3B= preS−2/
S (2つのグリコシレージョンサイトを持つ)、 4) gp33= preS−2/S (1つのグリ
コシレージョンサイトを持つ)、 5) gp27= S (1つのグリコシレージョン
サイトを持つ)、 6) p24=S。
HBVゾーン粒子中において、これら6個のタンパク質
ずべてがだいたい等モル量存在している。22nm粒子
中においては、4つの小さなタンパク質がおよそ等モル
置台まれているものの、gp42及びp39は、せいぜ
いあっても、1つの粒子に対して1モルあるいは2.3
モル程度にしかすぎない。preS−1とpres−2
の領域はS領域の分泌を促進する機能をもっているので
あろう。これらタンパク質の基本的特性についてのレビ
ューとして、チオライス、ビー。
ずべてがだいたい等モル量存在している。22nm粒子
中においては、4つの小さなタンパク質がおよそ等モル
置台まれているものの、gp42及びp39は、せいぜ
いあっても、1つの粒子に対して1モルあるいは2.3
モル程度にしかすぎない。preS−1とpres−2
の領域はS領域の分泌を促進する機能をもっているので
あろう。これらタンパク質の基本的特性についてのレビ
ューとして、チオライス、ビー。
(Tiollais、P、)等、サイエンス第21ゴ巻
、第406頁(1981)及びミリッチ、ディー。
、第406頁(1981)及びミリッチ、ディー。
アール、 (Milich、 D、 R,)等、プロ
コ、 す’r−ル・アカド、サイ、 (Prr+c、
Natl、 Acad、 Sci、)第82巻、第81
68頁(1985)を参照。
コ、 す’r−ル・アカド、サイ、 (Prr+c、
Natl、 Acad、 Sci、)第82巻、第81
68頁(1985)を参照。
B型肝炎抗原のpreS−2領域は約55 AA残基よ
り成る。そして、ノイラス、ニー、アール。
り成る。そして、ノイラス、ニー、アール。
(Neurath、八、R8)等、サイエンス第224
巻、第392頁(1984)、ノイラス、ニー、アール
、等、ネイチャー第315巻、第154頁(1985)
、及びミリッチ、ディー、アール、等、と述などにより
、in viv。
巻、第392頁(1984)、ノイラス、ニー、アール
、等、ネイチャー第315巻、第154頁(1985)
、及びミリッチ、ディー、アール、等、と述などにより
、in viv。
において、そのpreS−2の存在は、Sタンパク質の
エピトープよりも、より免疫原性である最も有力なエピ
トープを提供するものである。
エピトープよりも、より免疫原性である最も有力なエピ
トープを提供するものである。
ρres−2ポリペプチドは、ポリヒト血清アルブミン
(pH5A)に対するレセプタ一様特性をもち、こねは
、pH5Aが肝臓細胞に結合していると知られていると
ころからくる特性の一つである。
(pH5A)に対するレセプタ一様特性をもち、こねは
、pH5Aが肝臓細胞に結合していると知られていると
ころからくる特性の一つである。
マチダ、ニー、 (Machida、A、 )等、ガス
トロエンテロロジ−(Gastroenterolog
y)第86巻、第910頁H984)に、報告されてい
る。
トロエンテロロジ−(Gastroenterolog
y)第86巻、第910頁H984)に、報告されてい
る。
表面抗原中におけるpreS−2配列の存在は免疫用の
目的に対しては、ひとつの望ましい特性であるので、発
現系のシステムはpreS−1/S−2/Sタンパク質
あるいはその他のバリアントに対して開発発展されてい
る。例えば、米国出願第824.405号、1月31日
、1986年、参照。
目的に対しては、ひとつの望ましい特性であるので、発
現系のシステムはpreS−1/S−2/Sタンパク質
あるいはその他のバリアントに対して開発発展されてい
る。例えば、米国出願第824.405号、1月31日
、1986年、参照。
本発明は酵母による発現系システムにおける、pres
−1/S−2/Sタンパク質、あるいは膜結合をおこし
ている種々のバリアントのタンパク質などを迅速に精製
する方法を示したものである。これらの新しい方法は、
酵母膜からの不必要なタンパク質の除去を第一に行ない
、次に膜からpreS−1/S−2/Sタンパク質を十
分に純粋な物質として分離するという、本質的には2段
階による過程で行なわれる。外来性タンパク質に対して
人工的な関連性をもたせた、膜システムへの挿入や結合
による外来性タンパク質の精製方法に関する本明細は、
十分に評価されうるものである。
−1/S−2/Sタンパク質、あるいは膜結合をおこし
ている種々のバリアントのタンパク質などを迅速に精製
する方法を示したものである。これらの新しい方法は、
酵母膜からの不必要なタンパク質の除去を第一に行ない
、次に膜からpreS−1/S−2/Sタンパク質を十
分に純粋な物質として分離するという、本質的には2段
階による過程で行なわれる。外来性タンパク質に対して
人工的な関連性をもたせた、膜システムへの挿入や結合
による外来性タンパク質の精製方法に関する本明細は、
十分に評価されうるものである。
例えば酵母などの組み換え体を供給源とした組成物は血
清などの従来用いられていた供給源の物とは異なるので
従来の方法に対する新しい技術や、それら新規の方法と
の併用はほとんど必要ではない。一般的な、あるいは普
通に使用されている供給源からのタンパク質に対する有
効な分離方法の知識やノウハウを基礎として、組み換え
体の細胞培養からのタンパク質の分離に際しては、どん
な方法が有効なのかは、誰も予測できるものではない。
清などの従来用いられていた供給源の物とは異なるので
従来の方法に対する新しい技術や、それら新規の方法と
の併用はほとんど必要ではない。一般的な、あるいは普
通に使用されている供給源からのタンパク質に対する有
効な分離方法の知識やノウハウを基礎として、組み換え
体の細胞培養からのタンパク質の分離に際しては、どん
な方法が有効なのかは、誰も予測できるものではない。
ワクチン調製用として考案されつる精製過程には、産生
物の変わった精製や、公知の技術としては予測できなか
った別の指摘が必要である。この新しい方法と同様の操
作法として、米国特許第4,624.918号を参照。
物の変わった精製や、公知の技術としては予測できなか
った別の指摘が必要である。この新しい方法と同様の操
作法として、米国特許第4,624.918号を参照。
酵母細胞膜由来の組み換え体pres−1/S−27S
B型肝炎抗原あるいはそれに関するタンパク質の実質
的精製方法は、以下のステップより成る。
B型肝炎抗原あるいはそれに関するタンパク質の実質
的精製方法は、以下のステップより成る。
a)抗原付着酵母細胞膜部分の抽出;
b)゛ステップ(a)における抽出物中よりその細胞片
を遠心により除去; C)上清を不必要な酵母細胞膜由来タンパク質を遊離さ
せるのに効果的な溶液の存在下でダイアフィルトレーシ
ョンにかけ、不必要な膜結合タンパク質とされている物
質を除去する: d)ステップ(c)における産物を表面抗原を遊離しう
るのに効果的な第2の溶液と混合する: e)ステップ(d)において遊離してきた表面抗原をダ
イアフィルトレーションにかける:f)ステップ(e)
における濾液を低分子量の不純物を除去するために、ダ
イアフィルトレーションにかけ、十分に精製された組み
換え体preS−]/S−2/S B型肝炎抗原、ある
いはそれに関するタンパク質を結果として得る。
を遠心により除去; C)上清を不必要な酵母細胞膜由来タンパク質を遊離さ
せるのに効果的な溶液の存在下でダイアフィルトレーシ
ョンにかけ、不必要な膜結合タンパク質とされている物
質を除去する: d)ステップ(c)における産物を表面抗原を遊離しう
るのに効果的な第2の溶液と混合する: e)ステップ(d)において遊離してきた表面抗原をダ
イアフィルトレーションにかける:f)ステップ(e)
における濾液を低分子量の不純物を除去するために、ダ
イアフィルトレーションにかけ、十分に精製された組み
換え体preS−]/S−2/S B型肝炎抗原、ある
いはそれに関するタンパク質を結果として得る。
定義と略語
比活性: 免疫化学的に反応するsAgの総タンパク質
に対する重量対重量の比 率。
に対する重量対重量の比 率。
AA アミノ酸
DNA デオキシリボ核酸
DTT ジチオスレイトール
ED5o50%効果量
EDTA エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
塩 L リッター MB 膜結合 Mr 移動度 MW 分子量 NMW 名目上の分画分子量 pH5八 重合したヒト血清アルブミンPBS
リン酸緩衝生理食塩液、0 、15M−Naclを
含む7mM−リン酸ナトリウム緩衝液、pHは約7.2 PMA 防御モノクローナル抗体PMSF
フェニルメチルスルホニル フルオライド PPT 沈渣 psi 1平方インチにおけるボンドS
表面 5os−pへ6E 硫酸ドデシルナトリウム ポリア
クリルアミドゲル電気泳動 Sup 上清 本発明の過程とは酵母抽出物由来の膜結合B型肝炎表面
抗原の新しい積装方法を含むものである。不必要なMB
タンパク買をカオトロピック因子を含む因子による処理
で遊難し、その後MB表面抗原を別の中性界面活性剤あ
るいはカオトロピック因子を含む、あるいはそれらの併
用溶液で遊離させる。
塩 L リッター MB 膜結合 Mr 移動度 MW 分子量 NMW 名目上の分画分子量 pH5八 重合したヒト血清アルブミンPBS
リン酸緩衝生理食塩液、0 、15M−Naclを
含む7mM−リン酸ナトリウム緩衝液、pHは約7.2 PMA 防御モノクローナル抗体PMSF
フェニルメチルスルホニル フルオライド PPT 沈渣 psi 1平方インチにおけるボンドS
表面 5os−pへ6E 硫酸ドデシルナトリウム ポリア
クリルアミドゲル電気泳動 Sup 上清 本発明の過程とは酵母抽出物由来の膜結合B型肝炎表面
抗原の新しい積装方法を含むものである。不必要なMB
タンパク買をカオトロピック因子を含む因子による処理
で遊難し、その後MB表面抗原を別の中性界面活性剤あ
るいはカオトロピック因子を含む、あるいはそれらの併
用溶液で遊離させる。
この本発明における新規な精製道程は発現されたMBタ
ンパク買に対しても適用可能である。基本的な実施例の
一つとして酵母のYADH2/PSSC−1ベクター使
用による酵母のトランスホーメーションがあげられる。
ンパク買に対しても適用可能である。基本的な実施例の
一つとして酵母のYADH2/PSSC−1ベクター使
用による酵母のトランスホーメーションがあげられる。
この系は酵母細胞膜への結合を促進するprcs−1/
S−2/Sのアミノ酸配列を発現しつるものである。
S−2/Sのアミノ酸配列を発現しつるものである。
更にprcs−1あるいはpreS−2領域における変
異を含む、Sタンパク質中のアミノ酸末端配列に種々の
変化があったとしても、酵母細胞膜との隣接S領域アミ
ノ酸配列との結合にも同様の効果が認められる。本発明
の原理に基づいて、本発明の過程というものは、これら
preS−1/S−2/Sによる種々のタンパク質を迅
速かつ効率的に精製することを提供するものである。例
えば、prcS−1/S−2/Sのアミノ酸配列中にお
ける保存性のある置換基は一般的に本発明の原理及び実
施に対する実質的あるいは新規なる改良によって見られ
るものではない。保存性のある置換基はエルファシ、イ
ー、 (Elfassi、E、)等、ジエイ。
異を含む、Sタンパク質中のアミノ酸末端配列に種々の
変化があったとしても、酵母細胞膜との隣接S領域アミ
ノ酸配列との結合にも同様の効果が認められる。本発明
の原理に基づいて、本発明の過程というものは、これら
preS−1/S−2/Sによる種々のタンパク質を迅
速かつ効率的に精製することを提供するものである。例
えば、prcS−1/S−2/Sのアミノ酸配列中にお
ける保存性のある置換基は一般的に本発明の原理及び実
施に対する実質的あるいは新規なる改良によって見られ
るものではない。保存性のある置換基はエルファシ、イ
ー、 (Elfassi、E、)等、ジエイ。
セイル。パイオル、 (J、Theor、Biol、)
第121巻、第371頁(1986)から知られている
。S領域あるいはS領域のカルボキシル基末端側におけ
る選択的な消失があったとしても本明細書中に述べられ
ている精製過程に対しては、一般的になんら改良の必要
性はない。膜結合表面抗原や、アミノ酸配列中に種々の
変化を持つ、それらの部分的なタンパク質は、保存性の
あるアミノ酸置換基、または、消失部分を持っていよう
と、更に表面抗原あるいはそれの部分的タンパク質を提
供する他の特製過程によるものであろうと、膜結合状態
からの精製を経た後には、preS−1/S−2/Sタ
ンパク質、22nm粒子、オーストラリア抗原あるいは
その他の肝炎表面抗原本来のもつ構造に対する特異的抗
体と、免疫化学的に反応するとされている。
第121巻、第371頁(1986)から知られている
。S領域あるいはS領域のカルボキシル基末端側におけ
る選択的な消失があったとしても本明細書中に述べられ
ている精製過程に対しては、一般的になんら改良の必要
性はない。膜結合表面抗原や、アミノ酸配列中に種々の
変化を持つ、それらの部分的なタンパク質は、保存性の
あるアミノ酸置換基、または、消失部分を持っていよう
と、更に表面抗原あるいはそれの部分的タンパク質を提
供する他の特製過程によるものであろうと、膜結合状態
からの精製を経た後には、preS−1/S−2/Sタ
ンパク質、22nm粒子、オーストラリア抗原あるいは
その他の肝炎表面抗原本来のもつ構造に対する特異的抗
体と、免疫化学的に反応するとされている。
種々の酵母による発現のシステムはMB表面抗原の供給
源としては明らかに十分に作用するものである。実施例
1においてYADH2/Pssc−iによりトランスホ
ームされた酵母2150−3−2株は単に供給源として
臨時に使用したものである。シャトルベクター、コスミ
ドブラスミド、キメラプラスミド及び2−ミクロンの環
状プラスミド由来の配列を持つプラスミドなどに、他の
酵母ベクターは限定されるものではない。プロモーター
及びその他の酵母における転写を制御する配列の多様性
というものはGALIO及びα接合型因子を含む表面抗
原をコードしている挿入DNA配列の発現に使用される
。サツカロミセス属には多数の種が含まれている。組み
換え体DNAによる種々の外来性ポリペプチドの発現用
宿主としては、最も−・般的なものとしてサツカロミセ
スセレビシェ(saccharomyces cere
visiae)あるいはパン酵母か使用されている。
源としては明らかに十分に作用するものである。実施例
1においてYADH2/Pssc−iによりトランスホ
ームされた酵母2150−3−2株は単に供給源として
臨時に使用したものである。シャトルベクター、コスミ
ドブラスミド、キメラプラスミド及び2−ミクロンの環
状プラスミド由来の配列を持つプラスミドなどに、他の
酵母ベクターは限定されるものではない。プロモーター
及びその他の酵母における転写を制御する配列の多様性
というものはGALIO及びα接合型因子を含む表面抗
原をコードしている挿入DNA配列の発現に使用される
。サツカロミセス属には多数の種が含まれている。組み
換え体DNAによる種々の外来性ポリペプチドの発現用
宿主としては、最も−・般的なものとしてサツカロミセ
スセレビシェ(saccharomyces cere
visiae)あるいはパン酵母か使用されている。
しかしながら、サツカロミセス属における他の種につい
ての違いというものは、よくわかっていない。これらの
種の中には、サツカロミセスセレビシェと異種交配しつ
るものや、GALlo、ADH2、あるいはα接合型因
子プロモーターと限定されるものではないサツカロミセ
スセレビシェに見られるプロモーターに類似した、また
は同一の制御的プロモーターを持つであろう物も多数あ
る。そわ故、preS−を含むポリペプチドの発現に対
しての宿主株の選択の範囲は、サツカロミセス属のその
他の種にも広げることができ、カールスベルゲンシス(
carlsbergensis)、ラバラム(uvar
um)、ルキシー(rouxii)、モンタナス(mo
ntanus)、クルィベリー(kluyveri)、
エロンギスボラス(elongisporus)、ノル
ベンシス(norbensis)、オビホルミス(ov
iformis) 、及びシアスタテイカス(dias
taticus)などに限定されるものではないことは
当業者にとっては明白である。
ての違いというものは、よくわかっていない。これらの
種の中には、サツカロミセスセレビシェと異種交配しつ
るものや、GALlo、ADH2、あるいはα接合型因
子プロモーターと限定されるものではないサツカロミセ
スセレビシェに見られるプロモーターに類似した、また
は同一の制御的プロモーターを持つであろう物も多数あ
る。そわ故、preS−を含むポリペプチドの発現に対
しての宿主株の選択の範囲は、サツカロミセス属のその
他の種にも広げることができ、カールスベルゲンシス(
carlsbergensis)、ラバラム(uvar
um)、ルキシー(rouxii)、モンタナス(mo
ntanus)、クルィベリー(kluyveri)、
エロンギスボラス(elongisporus)、ノル
ベンシス(norbensis)、オビホルミス(ov
iformis) 、及びシアスタテイカス(dias
taticus)などに限定されるものではないことは
当業者にとっては明白である。
幾つかの酵母酸、例えば、ハンセヌラ
(tlansenula) 、カンジダ(candid
a) 、 )−ルロブシス(Toru 1ops i
s)及びピヒア(Pichia)は、生育のための唯一
の炭素源としてのメタノールを有効使用すべき類似の代
謝経路を持つとされている。この代謝経路に関与してい
る酵素である、アルコールオキシダーゼの遺伝子をピヒ
ア パスドロリス(pastoris)より分離した。
a) 、 )−ルロブシス(Toru 1ops i
s)及びピヒア(Pichia)は、生育のための唯一
の炭素源としてのメタノールを有効使用すべき類似の代
謝経路を持つとされている。この代謝経路に関与してい
る酵素である、アルコールオキシダーゼの遺伝子をピヒ
ア パスドロリス(pastoris)より分離した。
このピヒア バスドロリスのアルコール オキシダーゼ
プロモーターは分離され、発現に際してメタノール誘
発を受けやすい事が示された。この様に誘発されやすい
プロモーターは、酵母においてその選択がネガティブで
ある様なポリペプチドの発現に対して有効使用される。
プロモーターは分離され、発現に際してメタノール誘
発を受けやすい事が示された。この様に誘発されやすい
プロモーターは、酵母においてその選択がネガティブで
ある様なポリペプチドの発現に対して有効使用される。
特にこのプロモーターは、粒子形成しているピヒア バ
ストロリスにおける、Sドメインの誘発発現に対するプ
ラスミド使用に際して活性を示す事が知られている。こ
れは免疫学的活性構造を持つSポリペプチドの組み換え
DNA−介在発現に対する宿主として作用するその他の
酵母属の能力を強く述べたものである。それ故、pre
Sを含むポリペプチド例えばpreS−1/S−2/S
タンパク質などの発現に対しては、サツ力ロミセタシ工
科及びクリプトコツカシ工科の別の酵母属における種に
至るまで、その宿主株とすべき選択範囲が広げられ、こ
れらはビヒア、カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、
クルイベロミセス、及びサツカロミコプシスに限定され
るものではなく当業者にとっては明白なことである。
ストロリスにおける、Sドメインの誘発発現に対するプ
ラスミド使用に際して活性を示す事が知られている。こ
れは免疫学的活性構造を持つSポリペプチドの組み換え
DNA−介在発現に対する宿主として作用するその他の
酵母属の能力を強く述べたものである。それ故、pre
Sを含むポリペプチド例えばpreS−1/S−2/S
タンパク質などの発現に対しては、サツ力ロミセタシ工
科及びクリプトコツカシ工科の別の酵母属における種に
至るまで、その宿主株とすべき選択範囲が広げられ、こ
れらはビヒア、カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、
クルイベロミセス、及びサツカロミコプシスに限定され
るものではなく当業者にとっては明白なことである。
MB表面抗原の積装過程において、表面抗原の過度の不
安定性や分解がみられた。これに対処するために、溶媒
は代表的な緩衝液とし、なおかつPMS FあるいはE
DTAの様なプロテアーゼ インヒビターを含んだ物と
した。更にタンパク質の分解を減少させるためには、す
べての精製ステップは4℃前後において行なうのが好ま
しい。本発明の手順やプロトコールに対して適応しつる
代表的なプロテアーゼインヒビターとは、金属キレート
剤、重金属イオン、SH保護試薬、プロテアーゼに対す
る基質様化合物、あるいはプロテアーゼを阻害するポリ
ペプチドなどに限定されるものではない。有効なプロテ
アーゼインヒビターを以下に記載した。
安定性や分解がみられた。これに対処するために、溶媒
は代表的な緩衝液とし、なおかつPMS FあるいはE
DTAの様なプロテアーゼ インヒビターを含んだ物と
した。更にタンパク質の分解を減少させるためには、す
べての精製ステップは4℃前後において行なうのが好ま
しい。本発明の手順やプロトコールに対して適応しつる
代表的なプロテアーゼインヒビターとは、金属キレート
剤、重金属イオン、SH保護試薬、プロテアーゼに対す
る基質様化合物、あるいはプロテアーゼを阻害するポリ
ペプチドなどに限定されるものではない。有効なプロテ
アーゼインヒビターを以下に記載した。
Ag”、l g +−1Cu〜及び他の重金属イオン類
アンチスロンビンm アンチスロンビン■−ヘパリン α1−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Na−フルロライド4−ブロモ
−フェナシル ブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸塩 システィン 4−ジニトロフェノールジェチルボスフ1−ト DFP(ジイソプロピルホスフォフルオリデート) TT E−64(ベーリンガーマンハイム社製)EDTA及び
その他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン 4−ハイドロキシメルクリベンゾエートヨードアセトア
ミド ヨード酢酸 ロイペプチン α2−マクログロブリン メルカプトエタノール p−メルクリベンゾエート 塩化第二水銀 α−ミクログロブリン α−N−(p〜ニトロベンジル−オキシカルボニル)−
L−アルギニルクロロメチルケトン オキサレート ストレプトマイセスなどより得られるベブスクチン l、10−フエナンスロライン 2−フェナンススロライン フェノチアジン−N−カルボニルクロライド ホスフォルアミトン MS F ブリロホスフェート SH−保護試薬 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター p −1−ルエンスルホニルフルオライドTLCK (
L−1−クロロ−3−(4−トシルアミド)−7−アミ
ノ−2−ヘプタノンハイドロクロライト TPCK (L−1−クロロ−3−(4−1シルアミド
)−4−フェニル−2−ブタノン鶏卵由来トリプシンイ
ンヒビター ZPCK (ベンジルオキシカルボニル−し−フェニル
アラニン) 上記記載のインヒビターを一つあるいは数種含む緩衝液
はMB表面抗原の精製各ステップにおいて、−回もしく
は数回にわたって使用されつるものである。
アンチスロンビンm アンチスロンビン■−ヘパリン α1−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Na−フルロライド4−ブロモ
−フェナシル ブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸塩 システィン 4−ジニトロフェノールジェチルボスフ1−ト DFP(ジイソプロピルホスフォフルオリデート) TT E−64(ベーリンガーマンハイム社製)EDTA及び
その他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン 4−ハイドロキシメルクリベンゾエートヨードアセトア
ミド ヨード酢酸 ロイペプチン α2−マクログロブリン メルカプトエタノール p−メルクリベンゾエート 塩化第二水銀 α−ミクログロブリン α−N−(p〜ニトロベンジル−オキシカルボニル)−
L−アルギニルクロロメチルケトン オキサレート ストレプトマイセスなどより得られるベブスクチン l、10−フエナンスロライン 2−フェナンススロライン フェノチアジン−N−カルボニルクロライド ホスフォルアミトン MS F ブリロホスフェート SH−保護試薬 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター p −1−ルエンスルホニルフルオライドTLCK (
L−1−クロロ−3−(4−トシルアミド)−7−アミ
ノ−2−ヘプタノンハイドロクロライト TPCK (L−1−クロロ−3−(4−1シルアミド
)−4−フェニル−2−ブタノン鶏卵由来トリプシンイ
ンヒビター ZPCK (ベンジルオキシカルボニル−し−フェニル
アラニン) 上記記載のインヒビターを一つあるいは数種含む緩衝液
はMB表面抗原の精製各ステップにおいて、−回もしく
は数回にわたって使用されつるものである。
preS−1/S−2/Sタンパク質、あるいはそこに
変異のみらねるタンパク質などをコードしている発現ベ
クターを使用してトランスホームされた酵母細胞を増殖
し、その後ハーベストした。もしその細胞を保存する時
には、PBSの様な緩衝液で洗浄後、細胞をペースト状
にする。そして、液体窒素中において凍結保存する。代
表的な精製方法は以下により行なわれる。
変異のみらねるタンパク質などをコードしている発現ベ
クターを使用してトランスホームされた酵母細胞を増殖
し、その後ハーベストした。もしその細胞を保存する時
には、PBSの様な緩衝液で洗浄後、細胞をペースト状
にする。そして、液体窒素中において凍結保存する。代
表的な精製方法は以下により行なわれる。
凍結細胞ペーストの1バツチを融解し、タンパク分解阻
害剤を含む緩衝液で懸濁する、例えば1 mM P
M S Fを含むPBS0細胞をできれば機械的手段に
よりばらばらに分解する、例えばスタンステッド セル
ディスラブター(Stansted Ce1l Di
srupter) (スタンステッド フルイツト
パワー社(5tanstedFluid Power
LTD、)) 、ダイノーミル(Dyno−Mill)
(’フィツー ニー、バッコフェンマニュファクチ
ュアリング エンシニアーズ(wiryA、 Bach
ofen Manufacturing Engine
ers) 、あるいはラボラトリ−ホモジナイザー(L
abora−tory Homogenizer (ガ
ラリン コーポレーション(Gaulin Corpo
rat、1on) )などである。この細胞分解に際し
てのゆるやかに泡たつ程度の粉砕方法というものは、大
量の細胞に対しては不適当である。
害剤を含む緩衝液で懸濁する、例えば1 mM P
M S Fを含むPBS0細胞をできれば機械的手段に
よりばらばらに分解する、例えばスタンステッド セル
ディスラブター(Stansted Ce1l Di
srupter) (スタンステッド フルイツト
パワー社(5tanstedFluid Power
LTD、)) 、ダイノーミル(Dyno−Mill)
(’フィツー ニー、バッコフェンマニュファクチ
ュアリング エンシニアーズ(wiryA、 Bach
ofen Manufacturing Engine
ers) 、あるいはラボラトリ−ホモジナイザー(L
abora−tory Homogenizer (ガ
ラリン コーポレーション(Gaulin Corpo
rat、1on) )などである。この細胞分解に際し
てのゆるやかに泡たつ程度の粉砕方法というものは、大
量の細胞に対しては不適当である。
スタンステッド セル デfスラブタ
(Stansted Ce1l DisrupLer)
による分解が、その迅速な操作という面でもっとも好ま
しい機械である。
による分解が、その迅速な操作という面でもっとも好ま
しい機械である。
酵母の細胞分解により、粗抽出物を得る・2こで重要な
事はその後の精製ステップにおける機械的めづまりをな
くすために、抽出物中の細胞片を取り除く事である。遠
心はおよそ4,400×gで5分間かもっとも適当と思
われるが、異なる遠心速度、異なる遠心時間でも同様に
有効でありかつ簡乍に操作しつるものであると考えられ
る。上清を約130,000xgで1時間の超遠心にか
け、MB表面抗原を酵母膜との付随物としてベレットダ
ウンさせ、細胞からの粗抽出物を遠心にかけた後に、存
在しているMB表面抗原をテストする有効な方法として
使用する。pre−Sポリベブチドエピトーブの存在は
、HBV表面抗原に特異的な標識抗体を用いた、RIA
サンドイッチ法によるアッセイで、それらのエピトープ
がポリヒト血清アルブミン(pH3A)と結合するかに
よって確認される。
事はその後の精製ステップにおける機械的めづまりをな
くすために、抽出物中の細胞片を取り除く事である。遠
心はおよそ4,400×gで5分間かもっとも適当と思
われるが、異なる遠心速度、異なる遠心時間でも同様に
有効でありかつ簡乍に操作しつるものであると考えられ
る。上清を約130,000xgで1時間の超遠心にか
け、MB表面抗原を酵母膜との付随物としてベレットダ
ウンさせ、細胞からの粗抽出物を遠心にかけた後に、存
在しているMB表面抗原をテストする有効な方法として
使用する。pre−Sポリベブチドエピトーブの存在は
、HBV表面抗原に特異的な標識抗体を用いた、RIA
サンドイッチ法によるアッセイで、それらのエピトープ
がポリヒト血清アルブミン(pH3A)と結合するかに
よって確認される。
上述にある様に、4,400xgで5分間の遠心による
細胞片の除去操作後に得られる4、400xg上清に対
して更に精製操作を行なう。
細胞片の除去操作後に得られる4、400xg上清に対
して更に精製操作を行なう。
次のステップとしては、上清中にある可溶性物質の除去
である。4,400xg上清中の可溶性分画物質は、超
遠心、口過、ダイアフィルトレーション、圧力を加えて
も、加えなくてもよい、これらを場合に応じて使用する
ことによって除去する。この可溶性物質の除去法として
は、1mMPMSFを含むPBSで洗浄した0、2μm
ポアサイズのミニクロス(Minikros)ダイアフ
ィルトレーションユニット(ミクロボン、インク(Mi
crogon、Inc、) )に約10−15psjの
加圧下で、それら4,400xg上清を通過させる方法
が好ましい。
である。4,400xg上清中の可溶性分画物質は、超
遠心、口過、ダイアフィルトレーション、圧力を加えて
も、加えなくてもよい、これらを場合に応じて使用する
ことによって除去する。この可溶性物質の除去法として
は、1mMPMSFを含むPBSで洗浄した0、2μm
ポアサイズのミニクロス(Minikros)ダイアフ
ィルトレーションユニット(ミクロボン、インク(Mi
crogon、Inc、) )に約10−15psjの
加圧下で、それら4,400xg上清を通過させる方法
が好ましい。
圧力をかける事によりダイアフィルトレーションユニッ
トのメンプランバリアーを可溶性物質が通過しやすくな
る。ダイアフィルトレーションは、透析及びフィルトレ
ージョンと一緒に使用された時に、実質上の有効性がも
たらされる。別のタイプのダイアフィルトレーションユ
ニットも使用可能である、例えばミクロボン、インク(
Microgon、 Inc、)のクロス70−(Kr
osFlo) 、あるいはアミコン(Amicon)ま
たはA/Gテクノロジー(Technology)の種
々のホロファイバーカートリッジなどである。可溶性物
質の溶出は吸光度によりチェックされるO洗浄酵母膜の
調製とは、MB表面抗原の遊離は引きおこさずほとんど
のMBタンパク質が遊離されうる濃度において温和な変
性剤を膜結合物質に対して処理するものである。適当な
溶剤としては、界面活性剤、タンパク変性剤、あるいは
それらの混合物などがあげられる。種々の中性あるいは
非イオン性界面活性剤が使用されつるが、界面活性剤と
してトリトンN系、トリトンX系、ブリッジ系、ツイー
ン系、エマゾール系、デオキシコレート、オクチルグル
コピラノシトあるいはノニデットNP−40などに限定
されるものではない。CHAPSあるいはCHAPSO
などの様な両イオン性界面活性剤も有効であり、かつ適
当な溶剤である。不必要なあるいは好ましくないMBタ
ンパク質を遊離するのに通しているタンパク変性剤は以
下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。
トのメンプランバリアーを可溶性物質が通過しやすくな
る。ダイアフィルトレーションは、透析及びフィルトレ
ージョンと一緒に使用された時に、実質上の有効性がも
たらされる。別のタイプのダイアフィルトレーションユ
ニットも使用可能である、例えばミクロボン、インク(
Microgon、 Inc、)のクロス70−(Kr
osFlo) 、あるいはアミコン(Amicon)ま
たはA/Gテクノロジー(Technology)の種
々のホロファイバーカートリッジなどである。可溶性物
質の溶出は吸光度によりチェックされるO洗浄酵母膜の
調製とは、MB表面抗原の遊離は引きおこさずほとんど
のMBタンパク質が遊離されうる濃度において温和な変
性剤を膜結合物質に対して処理するものである。適当な
溶剤としては、界面活性剤、タンパク変性剤、あるいは
それらの混合物などがあげられる。種々の中性あるいは
非イオン性界面活性剤が使用されつるが、界面活性剤と
してトリトンN系、トリトンX系、ブリッジ系、ツイー
ン系、エマゾール系、デオキシコレート、オクチルグル
コピラノシトあるいはノニデットNP−40などに限定
されるものではない。CHAPSあるいはCHAPSO
などの様な両イオン性界面活性剤も有効であり、かつ適
当な溶剤である。不必要なあるいは好ましくないMBタ
ンパク質を遊離するのに通しているタンパク変性剤は以
下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。
R−C””N−Y
式中
Rは アミノ、低級アルキルチオ、低級アルキルオキシ
、あるいはイオウ: Xは アミノ、イオウあるいは酸素;そしてYは 水素
あるいはアミン。
、あるいはイオウ: Xは アミノ、イオウあるいは酸素;そしてYは 水素
あるいはアミン。
この構造式は約7Mから約IMまでの濃度勾配による使
用か最も好ましかったタンパク変性剤であるグアニジン
・塩酸を含むものである。
用か最も好ましかったタンパク変性剤であるグアニジン
・塩酸を含むものである。
更にClO4−の様なアニオンやカオトロピック因子な
どを含むものも、適当なタンパク変性剤である。
どを含むものも、適当なタンパク変性剤である。
洗浄酵母膜調製のために好ましいプロトコールとは約0
.2mM PMSFと約1 mM E D T A
を含むPBSで膜結合物質のダイアフィルトレーション
を行ない、次に約7Mグアニジン、塩酸での洗浄を1回
、さらに、数回、約7Mグアニジン、塩酸で洗浄するも
のである。洗浄酵母膜は、その後、MB表面抗原の遊離
という目的の為に界面活性剤、タンパク変性剤、あるい
は両者の混合物による抽出操作が行なわれる。非イオン
性あるいは中性界面活性剤のたぐいならばどれでも、抽
出には適当と思われるが、界面活性剤はトリトンN系、
トリトンX系、ブリッジ系、ツイーン系、エマゾール系
、デオキシコレート、オクチルグルコピラノシド、ある
いはノニデットNP−40などに限定されるものではな
い。CHAPSあるいはCHAPSOを含む両イオン性
界面活性剤も適応できる。
.2mM PMSFと約1 mM E D T A
を含むPBSで膜結合物質のダイアフィルトレーション
を行ない、次に約7Mグアニジン、塩酸での洗浄を1回
、さらに、数回、約7Mグアニジン、塩酸で洗浄するも
のである。洗浄酵母膜は、その後、MB表面抗原の遊離
という目的の為に界面活性剤、タンパク変性剤、あるい
は両者の混合物による抽出操作が行なわれる。非イオン
性あるいは中性界面活性剤のたぐいならばどれでも、抽
出には適当と思われるが、界面活性剤はトリトンN系、
トリトンX系、ブリッジ系、ツイーン系、エマゾール系
、デオキシコレート、オクチルグルコピラノシド、ある
いはノニデットNP−40などに限定されるものではな
い。CHAPSあるいはCHAPSOを含む両イオン性
界面活性剤も適応できる。
好ましい界面活性剤は約2%(w/V)から約0.05
%(w/V)の間の濃度で使用されるトリトンx−to
oがあげられるが、最も好ましいのは、それを、約1%
(w/V)から0.1%(w/V)の間の濃度で使用す
る時である。
%(w/V)の間の濃度で使用されるトリトンx−to
oがあげられるが、最も好ましいのは、それを、約1%
(w/V)から0.1%(w/V)の間の濃度で使用す
る時である。
MB表面抗原を遊離するのに通しているタンパク変性剤
は以下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。
は以下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。
H
式中
Rは アミノ、低級アルキルチす、低級アルキルオキシ
、あるいはイオウ; Xは アミノ、イオウあるいは酸素;そしてYは 水素
あるいはアミノ。
、あるいはイオウ; Xは アミノ、イオウあるいは酸素;そしてYは 水素
あるいはアミノ。
この構造式は約IM濃度が好ましいタンパク変性剤であ
るグアニジン・塩酸を含むものである。更にCIO,−
の様なアニオンやカオトロピック剤(chaotrop
ic agents)などを含むものもタンパク変性剤
として適当である。ダイアフィルトレーション後のステ
ップが、超遠心によって行なわれるのでなければ、3M
KSCNを含む溶液でも実施可能である。
るグアニジン・塩酸を含むものである。更にCIO,−
の様なアニオンやカオトロピック剤(chaotrop
ic agents)などを含むものもタンパク変性剤
として適当である。ダイアフィルトレーション後のステ
ップが、超遠心によって行なわれるのでなければ、3M
KSCNを含む溶液でも実施可能である。
洗浄酵母膜からMB表面抗原を抽出あるいは遊離させる
には、洗浄あるいは抽出のステップを数回くりかえす事
が必要である。
には、洗浄あるいは抽出のステップを数回くりかえす事
が必要である。
出願人は以下のステップを提供する。
(a) MB表面抗原を遊離させる為の、0.5%(
w/■)トリトンX−100を含む1Mグアニジン塩酸
による4℃における洗浄酵母膜のインキュベージ1ン; (b) 遊離表面抗原がダイアフィルトレーションユ
ニットの膜を通過しやすくなる様に、0.1%(w/V
) ト!J ト:/X −100を含む1Mグアニジン
・塩酸によるダイアフィルトレーション; (c) ウルトラフィルトレージョンあるいは超遠
心による濾液の濃縮;そして (d) 11:4縮減液を5分間、5rnM DTT
でインキュベーション、次に2mMDTTを含む1Mグ
アニジン・塩酸によるダイアフィルトレーション、更に
PBSでダイアフィルトレーションをして残留不純物を
除去する。
w/■)トリトンX−100を含む1Mグアニジン塩酸
による4℃における洗浄酵母膜のインキュベージ1ン; (b) 遊離表面抗原がダイアフィルトレーションユ
ニットの膜を通過しやすくなる様に、0.1%(w/V
) ト!J ト:/X −100を含む1Mグアニジン
・塩酸によるダイアフィルトレーション; (c) ウルトラフィルトレージョンあるいは超遠
心による濾液の濃縮;そして (d) 11:4縮減液を5分間、5rnM DTT
でインキュベーション、次に2mMDTTを含む1Mグ
アニジン・塩酸によるダイアフィルトレーション、更に
PBSでダイアフィルトレーションをして残留不純物を
除去する。
選択的にステップ(a)におけるグアニジン・塩酸は、
内在性のタンパク分解活性を阻害するのに有効なプロテ
アーゼインヒビターにとりかえてもよい。例えば 0.
2 mM P M S F、10mM EI7TA
、0.1%(w/V)ペプスタチンA、0.013%(
w/V)7ブロチニン及び10mMベンズアミジン・塩
酸であり、すべて、同種の抽出用緩衝液にそれぞれ最終
濃度において含まれている。
内在性のタンパク分解活性を阻害するのに有効なプロテ
アーゼインヒビターにとりかえてもよい。例えば 0.
2 mM P M S F、10mM EI7TA
、0.1%(w/V)ペプスタチンA、0.013%(
w/V)7ブロチニン及び10mMベンズアミジン・塩
酸であり、すべて、同種の抽出用緩衝液にそれぞれ最終
濃度において含まれている。
洗浄酵母膜からのMB表面抗原の抽出や遊離にはダイア
フィルトレーションは必要ではない。もし適当な界面活
性剤あるいは変性剤を使用するのならば遠心及び透析も
選択されつる有効な手段である。ステップ(a) −(
d)は実際上はいろいろと改良されるものと思われる。
フィルトレーションは必要ではない。もし適当な界面活
性剤あるいは変性剤を使用するのならば遠心及び透析も
選択されつる有効な手段である。ステップ(a) −(
d)は実際上はいろいろと改良されるものと思われる。
場合によっては、−回あるいは数回に及ぶ濃縮ステップ
が必要であろう。
が必要であろう。
本発明の操作手順やプロトコールは以下に示す操作を、
更に1回あるいは数回行なう事により、改良あるいは変
更されるであろう事はたやすく理解しつるものである。
更に1回あるいは数回行なう事により、改良あるいは変
更されるであろう事はたやすく理解しつるものである。
つまり、疎水性クロマトグラフィー、例えばシリカゲル
などにょる固相クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
塩などによる沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、
免疫アフィニティークロマトグラフィー、あるいは、組
み換え体によるタンパク質の精製を目的としたその他の
有効な手段などである。
などにょる固相クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
塩などによる沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、
免疫アフィニティークロマトグラフィー、あるいは、組
み換え体によるタンパク質の精製を目的としたその他の
有効な手段などである。
電子顕微鏡による精製抗原の解析は、KSCNによる抽
出法以外のすべての方法におけるロットに対して、直径
約22nmの粒子が検出されなかった事を示している。
出法以外のすべての方法におけるロットに対して、直径
約22nmの粒子が検出されなかった事を示している。
ロットのほとんどは不均質な粒子の集団であり、小胞様
構造、大きな粒子のかたまり、及び直径約114−25
nの球状粒子などであった。
構造、大きな粒子のかたまり、及び直径約114−25
nの球状粒子などであった。
以下に記載の物質は市販されているものである:
グアニジン・塩酸、シュハルツ/マン
(Schwartz/Mann)バイオチック(Bio
tech) ;トリトンX−100、フィッシャー
サイエンティフ(’/り カンパニー(Fisher
5cientificC□mpany) ;ジチオスレ
イトール、バイオ−ラッド(Bio−Rad) ;ミニ
クロス0.2μmモデュール(l ft、2)、ミクロ
ボン インク(MicrogonInc、) ;アミ
コン ホロファイバーカートリッジ(HIP 100
−20)、アミコン。
tech) ;トリトンX−100、フィッシャー
サイエンティフ(’/り カンパニー(Fisher
5cientificC□mpany) ;ジチオスレ
イトール、バイオ−ラッド(Bio−Rad) ;ミニ
クロス0.2μmモデュール(l ft、2)、ミクロ
ボン インク(MicrogonInc、) ;アミ
コン ホロファイバーカートリッジ(HIP 100
−20)、アミコン。
この出願の全体を通して、糖タンパク質の検出は、ネビ
ーレ、ディー、エム、 (Neville、D。
ーレ、ディー、エム、 (Neville、D。
M、)等[メソッド イン エンザイモロジ−(Met
hods in Enzymology)第32@、第
92頁(1979)]の]過ヨウ素酸−シッフ塩基方に
よる。タンパク質の濃度測定には、ローリ−、オー、エ
ッチ(Lowry、O,t(、)等[シエイ、パイオル
、ケム、 (J、Biol、Chem、)第193巻、
第265頁(1951)コによるS D S −Low
ry法、またはブラッドフォルト、エム、エム。
hods in Enzymology)第32@、第
92頁(1979)]の]過ヨウ素酸−シッフ塩基方に
よる。タンパク質の濃度測定には、ローリ−、オー、エ
ッチ(Lowry、O,t(、)等[シエイ、パイオル
、ケム、 (J、Biol、Chem、)第193巻、
第265頁(1951)コによるS D S −Low
ry法、またはブラッドフォルト、エム、エム。
(Bradford、M、M、) [アナル、バイオ
ケム。
ケム。
(Anal、Biochcm、)第72巻、第248頁
(1976)]による、クーマジーブルー結合法が使用
された。
(1976)]による、クーマジーブルー結合法が使用
された。
プルネット、ダブル、エヌ、 (Burnette、
W。
W。
N、)[アナル、バイオケム、(^na1.Bioch
em、)第112巻、第195頁(1981)コによる
ウェスタン プロット法も使用されている。
em、)第112巻、第195頁(1981)コによる
ウェスタン プロット法も使用されている。
以下記載の方法により精製されたロットに対しての免疫
化学的なテストが行なわれた。
化学的なテストが行なわれた。
ポリヒト血清アルブミンに対する結合はバレンズエラ(
Valezuela)等[バイオテクノロジー(Bio
technology)第3巻、第317頁(1985
)]に従って行なわれ、その結果を第■表に示した。免
疫化学的な抗原決定基はAUSRIAII−125(ア
ボットラプス(Abbott Labs)の改良法によ
りアッセイされた。そこにおいて、J251−標識され
た表面抗原特異的抗体はすてに固相に結合している特異
的抗原−抗体複合体と結合する。生物学的活性はマウス
ポテンシーテストによりチェックした。
Valezuela)等[バイオテクノロジー(Bio
technology)第3巻、第317頁(1985
)]に従って行なわれ、その結果を第■表に示した。免
疫化学的な抗原決定基はAUSRIAII−125(ア
ボットラプス(Abbott Labs)の改良法によ
りアッセイされた。そこにおいて、J251−標識され
た表面抗原特異的抗体はすてに固相に結合している特異
的抗原−抗体複合体と結合する。生物学的活性はマウス
ポテンシーテストによりチェックした。
B、 PreS−1/S−2S D、のYADH2/
PSSC−1なる酵母ベクターには、アルコールデヒド
ロゲナーゼ■(ADH2)プロモータ及びHB V
preS−1/S−2/S D NA配列が含まれてい
る。酵母サツカロミセスセレビシェ株2150−3−2
は、YADH2/PSSC−1によりトランスホームさ
れ、細胞は、増殖後ハーベストされた。ベクターの構築
及びトランスホーメーションの詳細はこれらの目的に対
する参考文献を含む。米国出願第824.405号、1
月31日、1986年において知られるところである。
PSSC−1なる酵母ベクターには、アルコールデヒド
ロゲナーゼ■(ADH2)プロモータ及びHB V
preS−1/S−2/S D NA配列が含まれてい
る。酵母サツカロミセスセレビシェ株2150−3−2
は、YADH2/PSSC−1によりトランスホームさ
れ、細胞は、増殖後ハーベストされた。ベクターの構築
及びトランスホーメーションの詳細はこれらの目的に対
する参考文献を含む。米国出願第824.405号、1
月31日、1986年において知られるところである。
細胞はリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄しかつ、
細胞ペーストは液体窒素中で凍結されるものである。
細胞ペーストは液体窒素中で凍結されるものである。
C,PC−160ツトの1原寧 り
このセクションCにおけるすべての積装ステップは4℃
で実施する。酵母細胞産生抗原を含む凍結細胞ペースト
(100g)を1mMフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド(PMSF)を含む200m1のPBSで溶かす
。次にシュタンステッドセルディスラプタに2回通して
細胞をばらばらにする。細胞片を除くために、この得ら
れた粗抽出物を4,400xg 、 5分の遠心にかけ
る。4,400xgのF清物質は更に100.000x
g、1時間の遠心にかけ、その沈殿物(酵母膜分画物)
を可溶性分画物質から分離する。組み換え体preS−
1/S−2/SB型肝炎抗原の局在性はポリヒト血清ア
ルブミン結合によるラジオイムノアッセイによって行な
われる。アッセイ法の原理はpreS−2領域物質のビ
ーズにコーティングされたポリヒト血清アルブミンに対
する結合を測定するサンドイッチ型のRIAアッセイ法
である。コーティングされたビーズを未知量のpreS
−2ポリペプチドを含むサンプルと伴にインキュベーシ
ョンし、洗浄後更にHBV表面□ 抗原に特異的な125I−標識抗体と一緒にインキュベ
ーションする。ビーズを再洗浄後、その放射活性をカウ
ントする。1バッチ36gについての結果を第1表に示
す。
で実施する。酵母細胞産生抗原を含む凍結細胞ペースト
(100g)を1mMフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド(PMSF)を含む200m1のPBSで溶かす
。次にシュタンステッドセルディスラプタに2回通して
細胞をばらばらにする。細胞片を除くために、この得ら
れた粗抽出物を4,400xg 、 5分の遠心にかけ
る。4,400xgのF清物質は更に100.000x
g、1時間の遠心にかけ、その沈殿物(酵母膜分画物)
を可溶性分画物質から分離する。組み換え体preS−
1/S−2/SB型肝炎抗原の局在性はポリヒト血清ア
ルブミン結合によるラジオイムノアッセイによって行な
われる。アッセイ法の原理はpreS−2領域物質のビ
ーズにコーティングされたポリヒト血清アルブミンに対
する結合を測定するサンドイッチ型のRIAアッセイ法
である。コーティングされたビーズを未知量のpreS
−2ポリペプチドを含むサンプルと伴にインキュベーシ
ョンし、洗浄後更にHBV表面□ 抗原に特異的な125I−標識抗体と一緒にインキュベ
ーションする。ビーズを再洗浄後、その放射活性をカウ
ントする。1バッチ36gについての結果を第1表に示
す。
第工表
酵母における組み換え体preS−1/S−2/SB型
抗原の含有量に対する遠心の効果 pH5八結へRIA タンパク質 比活性μg
RIAl、400xg上清 3.2 3
,600 0.9惇母膜分画 3.
2 320 IQ町溶性分
画 0.51 2.800
0.2町Wt−ロー” −±01・0 −*
pt(SA結合旧Aμg/タンパクmgとして定義され
る第1表はpreS−2ポリペプチドのほとんどが酵母
膜タンパク質中に存在している事を立証するものである
。100,000xgの遠心ステップをはふくために4
,400xg上清に対して更なる操作が実施された。
抗原の含有量に対する遠心の効果 pH5八結へRIA タンパク質 比活性μg
RIAl、400xg上清 3.2 3
,600 0.9惇母膜分画 3.
2 320 IQ町溶性分
画 0.51 2.800
0.2町Wt−ロー” −±01・0 −*
pt(SA結合旧Aμg/タンパクmgとして定義され
る第1表はpreS−2ポリペプチドのほとんどが酵母
膜タンパク質中に存在している事を立証するものである
。100,000xgの遠心ステップをはふくために4
,400xg上清に対して更なる操作が実施された。
(a)洗浄酵母膜の調製
4.400xg上清をペリスタポンプによる1〇−15
psiの加圧下において、ミニクロス(Minikro
s)ホロファイバーメンブラン(0,2μm、1 ft
、’)を持つダイアフィルトレーションユニット(45
0mffi用)に通す。0.2 mMPMSF及び1
mM E D T Aを含む2.5LのPBS、25
0ml2の7Mグアニジン・塩酸、及び3Lの1Mグア
ニジン・塩酸を順次使用するダイアフィルトレーション
は膜からの抗原除去なしに、膜結合酵母不純物だけを除
去する。モして得・られた保留産物が膜結合抗原であっ
た(洗浄酵母膜)。
psiの加圧下において、ミニクロス(Minikro
s)ホロファイバーメンブラン(0,2μm、1 ft
、’)を持つダイアフィルトレーションユニット(45
0mffi用)に通す。0.2 mMPMSF及び1
mM E D T Aを含む2.5LのPBS、25
0ml2の7Mグアニジン・塩酸、及び3Lの1Mグア
ニジン・塩酸を順次使用するダイアフィルトレーション
は膜からの抗原除去なしに、膜結合酵母不純物だけを除
去する。モして得・られた保留産物が膜結合抗原であっ
た(洗浄酵母膜)。
(b)酵母膜からの抗原の抽出
上述の実施例ICのパラグラフ(a)における洗浄酵母
膜は4℃、20分間、05%(w/V)l−リドンX−
100を含む1Mグアニジン・塩酸lil中でインキユ
ベーシヨンされる。可溶化抗原をミニクロスホロファイ
バーユニット(0,2μm)により200ml1まて濃
縮し、史に0.1%(w/■)トリトンX−100を含
む1Mグアニジン・塩酸1.5L使用のダイアフィルト
レーションにより酵母膜より分離する。抗原を含む濾過
液はアミコンホロファイバーメンブー7 ン(IOo、
00ONMW、o、6ft、、2) 1.: ヨリ20
0mflまで濃縮され5mM DTTで5分間インキ
ュベーションした後、2mM DTTを含む1Mグア
ニジン・塩酸12でダイアフィルトレーションをし、更
に2LのPBSを使用する。得られた精製抗原(PS−
16と表示)は第1I表の結果に示されている様に高い
比活性を保持している。
膜は4℃、20分間、05%(w/V)l−リドンX−
100を含む1Mグアニジン・塩酸lil中でインキユ
ベーシヨンされる。可溶化抗原をミニクロスホロファイ
バーユニット(0,2μm)により200ml1まて濃
縮し、史に0.1%(w/■)トリトンX−100を含
む1Mグアニジン・塩酸1.5L使用のダイアフィルト
レーションにより酵母膜より分離する。抗原を含む濾過
液はアミコンホロファイバーメンブー7 ン(IOo、
00ONMW、o、6ft、、2) 1.: ヨリ20
0mflまで濃縮され5mM DTTで5分間インキ
ュベーションした後、2mM DTTを含む1Mグア
ニジン・塩酸12でダイアフィルトレーションをし、更
に2LのPBSを使用する。得られた精製抗原(PS−
16と表示)は第1I表の結果に示されている様に高い
比活性を保持している。
第■表
0.5%トリトンX−100存在下で膜より遊離された
酵母からの膜結合組み換え体preS−]/S−27S
B型肝炎抗原の精製1pH5A結合RIA タン
パク質 比活性μgRIA粗抽出物 7
]2 9,700 71.24.
400xg−ト清 16
5.800 2.8洗浄酵
NIQ 8.3 240
34精製抗原(PS−16) −茎生−−
−−−−堀一一−−−−皿−−−m−=1 抗原ロット
番号PS−16 精製抗原の一部を更に3M KSCNを含むPBSで
16時間処理する。これを5倍量の3M にSCNを含
むPBS及び10倍量のPBSによりアミノコンホロフ
ァイバーメンプラン(+00,000 NMW、0.6
ft、” )使用のダイアフィルトレーションにかける
。そして獲得物をロット番号PS−16/にSCNとす
る。
酵母からの膜結合組み換え体preS−]/S−27S
B型肝炎抗原の精製1pH5A結合RIA タン
パク質 比活性μgRIA粗抽出物 7
]2 9,700 71.24.
400xg−ト清 16
5.800 2.8洗浄酵
NIQ 8.3 240
34精製抗原(PS−16) −茎生−−
−−−−堀一一−−−−皿−−−m−=1 抗原ロット
番号PS−16 精製抗原の一部を更に3M KSCNを含むPBSで
16時間処理する。これを5倍量の3M にSCNを含
むPBS及び10倍量のPBSによりアミノコンホロフ
ァイバーメンプラン(+00,000 NMW、0.6
ft、” )使用のダイアフィルトレーションにかける
。そして獲得物をロット番号PS−16/にSCNとす
る。
支胤■ユ、ロットPS−17
実施例1のCのステップ(b)における、酵母膜からの
表面抗原遊離の為に使用されていた0、5%(w/V)
トリトンX−100を含む1Mグアニジン・塩酸を1%
(w/v)トリトンX−100を含む1Mグアニジン・
塩酸におきかえる以外は、実施例1の操作に順するもの
である。組み換え体preS−1/S−2/S表面抗原
は十分に精製されたタンパク質として得られ、ロフト番
号PS−17とする。
表面抗原遊離の為に使用されていた0、5%(w/V)
トリトンX−100を含む1Mグアニジン・塩酸を1%
(w/v)トリトンX−100を含む1Mグアニジン・
塩酸におきかえる以外は、実施例1の操作に順するもの
である。組み換え体preS−1/S−2/S表面抗原
は十分に精製されたタンパク質として得られ、ロフト番
号PS−17とする。
笈に■ユ、ロットPS−12
酵母細胞産生の抗原を含む100g凍結細胞ペーストの
他のバッチにおいては、1mMPMSFを含むPBS2
00mflで溶解した後、シュタンスチットセルディス
ラブターに2回通しての細胞破砕を行なった。粗抽出物
は、細胞片を除去するために、4,400xg、5分の
遠心にかけられた。4,400xg上清をペリスタポン
プによる10−15ρsiの加圧下においてミニクロス
(Minikros)ホロファイバーメンプラン(0,
2μm、1 ft、”)を持つダイアフィルトレーショ
ンユニット(450mJl用)に通す。0.2 mMP
MSF及び1 mM E D T Aを含むP B
S 2.5L、更に7Mグアニジン・塩酸250mJ2
及び1Mグアニジン・塩酸3Lによる、このダイアフィ
ルトレーションは膜からの抗原除去なしに膜結合酵母不
純物を取り除く。保留産物である膜結合タンパク質は次
に130,000xg、60分の超遠心にかけられ、沈
殿物はPBSに再浮遊して洗浄膜分画物とする。実施例
3プロトコール中の各ステップにおける比活性を測定し
、結果を第■表に示した。
他のバッチにおいては、1mMPMSFを含むPBS2
00mflで溶解した後、シュタンスチットセルディス
ラブターに2回通しての細胞破砕を行なった。粗抽出物
は、細胞片を除去するために、4,400xg、5分の
遠心にかけられた。4,400xg上清をペリスタポン
プによる10−15ρsiの加圧下においてミニクロス
(Minikros)ホロファイバーメンプラン(0,
2μm、1 ft、”)を持つダイアフィルトレーショ
ンユニット(450mJl用)に通す。0.2 mMP
MSF及び1 mM E D T Aを含むP B
S 2.5L、更に7Mグアニジン・塩酸250mJ2
及び1Mグアニジン・塩酸3Lによる、このダイアフィ
ルトレーションは膜からの抗原除去なしに膜結合酵母不
純物を取り除く。保留産物である膜結合タンパク質は次
に130,000xg、60分の超遠心にかけられ、沈
殿物はPBSに再浮遊して洗浄膜分画物とする。実施例
3プロトコール中の各ステップにおける比活性を測定し
、結果を第■表に示した。
第■表
酵母からの組み換え体pres−1/S−2/S Bを
肝炎抗原の分!!1:洗浄酵母膜における超遠心の効果 pH5A結合R1A タンパク質 比活性μgR
IA粗抽出物 6,200 10,4
00 0.64.400xg上清 6.
480 B、700 0.7−
−1画 5,400 230 24
、洗浄膜分画の一部分はその後、3M KSC
Nを含むPBS 600mJA40分間の抽出操作、
+30.OOOxg以外の回転数による超遠心60分に
よる上清はアミコンホローファイバーメンプラン(10
0,00ONMW、0.6ft、”)で200mfiに
まで濃縮し、3M KSCNを含むPBS IL、
及びPBS 2Lによるダイアフィルトレーションに
かけ、ロット番号PS−12なる産生物を得る。結果は
第7表に示しである。
肝炎抗原の分!!1:洗浄酵母膜における超遠心の効果 pH5A結合R1A タンパク質 比活性μgR
IA粗抽出物 6,200 10,4
00 0.64.400xg上清 6.
480 B、700 0.7−
−1画 5,400 230 24
、洗浄膜分画の一部分はその後、3M KSC
Nを含むPBS 600mJA40分間の抽出操作、
+30.OOOxg以外の回転数による超遠心60分に
よる上清はアミコンホローファイバーメンプラン(10
0,00ONMW、0.6ft、”)で200mfiに
まで濃縮し、3M KSCNを含むPBS IL、
及びPBS 2Lによるダイアフィルトレーションに
かけ、ロット番号PS−12なる産生物を得る。結果は
第7表に示しである。
第7表
洗浄膜分画に対する3M KSCN抽出の効果pH5
A結合R昆 タンパク質 比活性μgllTA保留
物質 200 11
18(PS−12) ’f’ 220 18
121 すなわち最終130,000xgの超遠心に
よる沈殿物。
A結合R昆 タンパク質 比活性μgllTA保留
物質 200 11
18(PS−12) ’f’ 220 18
121 すなわち最終130,000xgの超遠心に
よる沈殿物。
この沈殿物は、アッセイ前にPBSで再浮遊する。
夫五■A、ロットPS−15
2mMDDTを含む2M尿素IL、及びPBS 2L
を使用する最終ダイアフィルトレーションステップ以外
は実施例3に順する。産生精製抗原をロット番号PS−
15とする。
を使用する最終ダイアフィルトレーションステップ以外
は実施例3に順する。産生精製抗原をロット番号PS−
15とする。
結果は第■表に示しである。
第■表
調製物質 pHsA結合RIA タンパク質
比活性μgRI^粗抽出物 23
9,200 2.54.400%g上
清 22 7,000 3
.2洗浄酵母膜 21 270
77鯖製抗原 0.44
19 23PS−15)
−え五l、ロットP
S−48 酵母細胞産生の抗原を含む凍結細胞ペーストを1.0m
M PMSF、10mMEDTA及び0・1μトリス
塩酸pH7,5を含むPBS (“バッファー”)90
mJZに溶解する。細胞ペーストを1.4 Lのバッフ
ァーで希釈しダイノーミル(Dyno−Mill)にお
いて30秒、5回でこなごなにした後にダイノーミルよ
り取り出す。得られた粗抽出物を4,400%g、10
分の遠心にかけ、細胞片を除去する。4,400%g上
清をペリスタポンプによる10−15psiの加圧下に
おいてミニクロスホロファイバーメンプラン(0,2μ
m、1 ft、”)を持つダイアフィルトレーションユ
ニット(450mIL用)に通す。ダイアフィルトレー
ションは0.2mM PMSF及び10mMEDTA
を含むPBS3.5L、6Mグアニジン・塩酸300m
u、1Mグアニジン・塩酸2L、0.2mM PMS
F及び10mM EDTAを含むPBSl、5Lの順
に行なう。得られた保留物質(洗浄酵母膜)を0.4%
トリトンX−100及びプロテアーゼインヒビターを含
むPBSl、6Lと4℃、20分間、インキュベーショ
ンする[PBSにおける最終濃度はそれぞれ0.2 m
M PMSF、 10mM EDTA、 0.1
%(w/V)ペプスタチンA、0.013%(w/V)
アプロチニン及び10mMベンズアミジン・塩酸である
]。
比活性μgRI^粗抽出物 23
9,200 2.54.400%g上
清 22 7,000 3
.2洗浄酵母膜 21 270
77鯖製抗原 0.44
19 23PS−15)
−え五l、ロットP
S−48 酵母細胞産生の抗原を含む凍結細胞ペーストを1.0m
M PMSF、10mMEDTA及び0・1μトリス
塩酸pH7,5を含むPBS (“バッファー”)90
mJZに溶解する。細胞ペーストを1.4 Lのバッフ
ァーで希釈しダイノーミル(Dyno−Mill)にお
いて30秒、5回でこなごなにした後にダイノーミルよ
り取り出す。得られた粗抽出物を4,400%g、10
分の遠心にかけ、細胞片を除去する。4,400%g上
清をペリスタポンプによる10−15psiの加圧下に
おいてミニクロスホロファイバーメンプラン(0,2μ
m、1 ft、”)を持つダイアフィルトレーションユ
ニット(450mIL用)に通す。ダイアフィルトレー
ションは0.2mM PMSF及び10mMEDTA
を含むPBS3.5L、6Mグアニジン・塩酸300m
u、1Mグアニジン・塩酸2L、0.2mM PMS
F及び10mM EDTAを含むPBSl、5Lの順
に行なう。得られた保留物質(洗浄酵母膜)を0.4%
トリトンX−100及びプロテアーゼインヒビターを含
むPBSl、6Lと4℃、20分間、インキュベーショ
ンする[PBSにおける最終濃度はそれぞれ0.2 m
M PMSF、 10mM EDTA、 0.1
%(w/V)ペプスタチンA、0.013%(w/V)
アプロチニン及び10mMベンズアミジン・塩酸である
]。
ミニクロスホロファイバーユニット(0,2μm)で酵
母膜を200+mQまで濃縮し、更にその酵母膜を0,
1%(w/V)I−リドンX−100及び上記記載プロ
テアーゼインヒビターを含む、pH7,5の10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液1.5 Lでダイアフィルトレー
ションする事によって、可溶化抗原を酵母膜より分離す
る。抗原を含む濾過液は、アミコンホロファイバーメン
プラン(100,0OON M W、0.6ft、2)
により200mj2まで濃縮され、その後、7倍容量の
PBSでダイアフィルト・レーションされる。抗原を含
む、保留物質を5mMDTTを含む4M尿素で15分間
インキュベーションし、アミコンホロファイハーメンプ
ラン(100,00ONMW、0.6fl”)により2
00mJ2まで濃縮後、最終ステップとして5倍容量の
2mMDTTを含む2M尿素、10倍容量のPBSの順
にダイアフィルトレーションし、精製抗原(PS−48
)を得る。結果を第■表に示した。
母膜を200+mQまで濃縮し、更にその酵母膜を0,
1%(w/V)I−リドンX−100及び上記記載プロ
テアーゼインヒビターを含む、pH7,5の10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液1.5 Lでダイアフィルトレー
ションする事によって、可溶化抗原を酵母膜より分離す
る。抗原を含む濾過液は、アミコンホロファイバーメン
プラン(100,0OON M W、0.6ft、2)
により200mj2まで濃縮され、その後、7倍容量の
PBSでダイアフィルト・レーションされる。抗原を含
む、保留物質を5mMDTTを含む4M尿素で15分間
インキュベーションし、アミコンホロファイハーメンプ
ラン(100,00ONMW、0.6fl”)により2
00mJ2まで濃縮後、最終ステップとして5倍容量の
2mMDTTを含む2M尿素、10倍容量のPBSの順
にダイアフィルトレーションし、精製抗原(PS−48
)を得る。結果を第■表に示した。
第■表
調製物質 pt+s^結合RIA タンパク
質 比活性μgRrA粗抽出物 +7.9
14,400 1.24.400x
g −ヒ清 18.6 14
.800 1.3洗浄酵素膜
3.1 508 6.0鯖製抗原
★ 2.5 67 38
−便と伊り一一一一一 ★ このサンプルはAUSRIAに対しても同様に測定
され比活性として2.9 μg AUSRIA/mgタ
ンパク質を示した。
質 比活性μgRrA粗抽出物 +7.9
14,400 1.24.400x
g −ヒ清 18.6 14
.800 1.3洗浄酵素膜
3.1 508 6.0鯖製抗原
★ 2.5 67 38
−便と伊り一一一一一 ★ このサンプルはAUSRIAに対しても同様に測定
され比活性として2.9 μg AUSRIA/mgタ
ンパク質を示した。
それぞれのロットに対する免疫学的特性を第■表にまと
めて示した。更に、低い、AUSRIA値はpreS−
1の領域におけるポリペプチドにより抗原決定基がマス
クされている結果によることも示唆している。
めて示した。更に、低い、AUSRIA値はpreS−
1の領域におけるポリペプチドにより抗原決定基がマス
クされている結果によることも示唆している。
第■表
種々のロットにおける免疫化学的、生物学的特性RTA
比活性RIA活性μg/mgタンパク質Oyト o
H5A結Δ7 ッセイA[l5RIA
R,P、bPS−12(実施例3)
15 <0.4 0.183aP
S−15(実施例4 ) 23
<o、oe O,0189’PS−16
(実施例1) 46 4.
1 0.0067(PS−16)’
ND 、1.9’ 0.
0193’PS−16/KSCN (実施例1)
26 2.1 0.0126(P
S−167KSCN)’ ND
1.6IIO,0256aPS−17(実施
例2) 50 5.1
0.0125PS−48′ 包111538
2.9 NDND=未決定 a アッセイ前に可溶化抗原に最終濃度約0.4M−
0,6Mの尿素を加える。
比活性RIA活性μg/mgタンパク質Oyト o
H5A結Δ7 ッセイA[l5RIA
R,P、bPS−12(実施例3)
15 <0.4 0.183aP
S−15(実施例4 ) 23
<o、oe O,0189’PS−16
(実施例1) 46 4.
1 0.0067(PS−16)’
ND 、1.9’ 0.
0193’PS−16/KSCN (実施例1)
26 2.1 0.0126(P
S−167KSCN)’ ND
1.6IIO,0256aPS−17(実施
例2) 50 5.1
0.0125PS−48′ 包111538
2.9 NDND=未決定 a アッセイ前に可溶化抗原に最終濃度約0.4M−
0,6Mの尿素を加える。
bR,P、=相対的ボテンシー、抗体濃度、比活性及び
親和性の測定値をあわせたもので以下の式により定義さ
れる:50−ぢド誓イレト?、イブ告り=リブ′含灯式
中、サンプルのエンドポイントはある特定の抗原により
得られた抗体の標準的、一定濃度の抗体に結合する抗原
の濃度であり、抗原決定基を必要とする抗体により計算
される、最大結合をもつロジット(Logit)転換パ
ーセント解析である。
親和性の測定値をあわせたもので以下の式により定義さ
れる:50−ぢド誓イレト?、イブ告り=リブ′含灯式
中、サンプルのエンドポイントはある特定の抗原により
得られた抗体の標準的、一定濃度の抗体に結合する抗原
の濃度であり、抗原決定基を必要とする抗体により計算
される、最大結合をもつロジット(Logit)転換パ
ーセント解析である。
pH3A結合及びAUSRIAアッセイ法による結果は
、ワクチン使用目的にはPS−16及びPS−17が好
ましいロットであることを示している。
、ワクチン使用目的にはPS−16及びPS−17が好
ましいロットであることを示している。
4羽のウサギにアルヒドロゲル吸着されたPS−16を
20μg1.M、の量で接種する。
20μg1.M、の量で接種する。
以下のスケ−ジュールによる。
比」 ム
−8前採血
0 アルヒドロゲルを持つPS−16,20μg1
.M、の接種 比」 笈詰 (つづき) 27 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 27 採血 41 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 41 採血 76 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 産生抗体は以下の結果として測定された:PS−16、
ウサギ# 227.228.229及び230逆数によ
る力価 R227R228R229R230 抗−5(^USAb) 日付−8、前免疫 <8 <8 36 3
Fi76 720 2350 160
+60抗−52(ELISA) 日付−8、前免疫 <to <10 <10
<10抗−5l (ELISA) 日付−8、前免疫 <10 <10 <10
<10支五里1 実施例ICにおいて調製されたロット番号PS−16サ
ンプルはMW>106の抗原複合体を含んでいる。ロッ
トサンプルをラエミリイ、ニー、ケイ−、(1,aem
mli、Ll、に、) Cネイチャー(Nature)
、第227巻、第680頁(1970)]の方法にょる
5DS−ポリアクリルドアミドゲル電気泳動にかける。
.M、の接種 比」 笈詰 (つづき) 27 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 27 採血 41 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 41 採血 76 アルヒドロゲルPS−16,20μg1.
M、接種 産生抗体は以下の結果として測定された:PS−16、
ウサギ# 227.228.229及び230逆数によ
る力価 R227R228R229R230 抗−5(^USAb) 日付−8、前免疫 <8 <8 36 3
Fi76 720 2350 160
+60抗−52(ELISA) 日付−8、前免疫 <to <10 <10
<10抗−5l (ELISA) 日付−8、前免疫 <10 <10 <10
<10支五里1 実施例ICにおいて調製されたロット番号PS−16サ
ンプルはMW>106の抗原複合体を含んでいる。ロッ
トサンプルをラエミリイ、ニー、ケイ−、(1,aem
mli、Ll、に、) Cネイチャー(Nature)
、第227巻、第680頁(1970)]の方法にょる
5DS−ポリアクリルドアミドゲル電気泳動にかける。
ロット番号Ps−16は、約39,000ダルトン、4
5,000ダルトンに相当する移動度をもつ十分に精製
されたポリペプチドサブユニットを含んでいると判明し
た。
5,000ダルトンに相当する移動度をもつ十分に精製
されたポリペプチドサブユニットを含んでいると判明し
た。
過ヨウ素酸−シッフ試薬による染色法は、45.000
ダルトン部位に移動するサブユニットは糖タンパク質で
あることを示している。ウェスタンブロッティング法は
、両サブユニットがpreS−1、preS−2、Sタ
ンパク質の免疫学的抗原決定基を保持していることを示
している。以上の結果より45.000ダルトン部位へ
の移動をもつ大きなサブユニットは39.000ダルト
ンサブユニツトか糖化されたものである。
ダルトン部位に移動するサブユニットは糖タンパク質で
あることを示している。ウェスタンブロッティング法は
、両サブユニットがpreS−1、preS−2、Sタ
ンパク質の免疫学的抗原決定基を保持していることを示
している。以上の結果より45.000ダルトン部位へ
の移動をもつ大きなサブユニットは39.000ダルト
ンサブユニツトか糖化されたものである。
これまでに記載されている明細内容は、例証を目的とし
た実施例よりなる本発明の主旨を示すものであるが、本
発明の実行には、特許請求の範囲の中において見られる
様に、この明細書記載の手順やプロトコールに対して変
更点、適応性、改良、削除、付加的な操作すべてが含ま
れることはよく知られるところである。
た実施例よりなる本発明の主旨を示すものであるが、本
発明の実行には、特許請求の範囲の中において見られる
様に、この明細書記載の手順やプロトコールに対して変
更点、適応性、改良、削除、付加的な操作すべてが含ま
れることはよく知られるところである。
第1図は膜−結合タンパク質の精製方法を示す図である
。 第2図はpreS−1/S−2/Sタンパク質の酵母膜
からの最適と思われるN製方法を示す図である。 図面の浄書(内容に変更なし) 第1図 粗抽出物 精製抗原 酵母膜 粗抽出物 第 2 図 Sup PPT Ita液 酵@桑 精製 抗原 手続補正書 昭和63年5月16日
。 第2図はpreS−1/S−2/Sタンパク質の酵母膜
からの最適と思われるN製方法を示す図である。 図面の浄書(内容に変更なし) 第1図 粗抽出物 精製抗原 酵母膜 粗抽出物 第 2 図 Sup PPT Ita液 酵@桑 精製 抗原 手続補正書 昭和63年5月16日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、酵母膜からの組み換え体preS−1/S−2/S
B型肝炎抗原あるいはその一部分を十分に精製する方法
であって、 a)抗原が結合している酵母の膜部分の抽出、 b)ステップ(a)の抽出物における細胞片の遠心によ
る除去、 c)望ましくない酵母膜−結合タンパク質を遊離させる
効果のある溶液の存在下で上清をダイアフィルトレーシ
ョンにかける、そして、上述の望ましくない酵母膜−結
合タンパク質の除去後保留産物として洗浄酵母膜を得る
、 d)ステップ(c)の保留産物を膜−結合表面抗原を遊
離させる効果のある第2番目の溶液の作用をうける、 e)ステップ(d)により遊離してきた表面抗原を、そ
の表面抗原のダイアフィルトレーションメンブランに対
する通過を促進させるために、ダイアフィルトレーショ
ンにかける、そして f)ステップ(e)の濾液をダイアフィルトレーション
にかけ、低分子量の不純物を除去し、十分に精製された
組み換え体preS−1/S−2/SB型肝炎抗原、あ
るいはその抗原の一部を得ることによりなる方法。 2、ステップ(c)のダイヤフィルトレーションは約1
0−15psiの加圧下において行なう特許請求の範囲
第1項記載の方法。 3、ステップ(c)のダイアフィルトレーションはポア
直径約0.2μmであるミニクロス装置を使用する特許
請求の範囲第2項記載の方法。 4、ステップ(c)の望ましくない酵母膜タンパク質の
遊離に効果的な溶液は、タンパク質変性剤あるいは界面
活性剤あるいは両者の混合物を含む特許請求の範囲第2
項記載の方法。 5、上述溶液はタンパク質変性剤を含む特許請求の範囲
第4項記載の方法。 6、ステップ(c)のダイアフィルトレーション操作に
おいて、上述タンパク質変性剤とは、約7Mと1Mの間
で変化する濃度をもつグアニジン−塩酸である特許請求
の範囲第5項記載の方法。 7、ステップ(d)のダイアフィルトレーションはポア
直径約0.2μmであるミニクロス装置を使用する特許
請求の範囲第2項記載の方法。 8、ステップ(d)の膜−結合表面抗原遊離に効果的な
第2番目の溶液はタンパク質変性剤あるいは界面活性剤
あるいは両者の混合物を含む特許請求の範囲第2項記載
の方法。 9、上述第2番目の溶液は0.5%(w/v)トリトン
X−100を含む1Mグアニジン塩酸から成る特許請求
の範囲第8項記載の方法。 10、上述第2番目の溶液は1.0%(w/v)トリト
ンX−100を含む1Mグアニジン塩酸から成る特許請
求の範囲第8項記載の方法。 11、上述第2番目の溶液は約1Mのグアニジン・塩酸
及び約0.5%(w/v)と約1.0%(w/v)の間
の濃度をもつトリトンX−100を含む特許請求の範囲
第8項記載の方法。 12、ステップ(e)のダイアフィルトレーションはポ
ア直径約0.2μmであるミニクロス装置を使用する特
許請求の範囲第2項記載の方法。 13、第2番目の溶液は緩衝液、濃度範囲が約1%(w
/v)から約0.1%(w/v)であるトリトンX−1
00及びプロテアーゼインヒビターを含む特許請求の範
囲第2項記載の方法。 14、第2番目の溶液は本質的には約0.4%(w/v
)トリトンX−100、約0.2mM PMSF、約1
0mM EDTA、約0.1%(w/v)ペプスタチン
A、約0.013%(w/V)アプロチニン、及び約1
0mMベンズアミジン塩酸を含むPBSから成っている
特許請求の範囲第13項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US1982087A | 1987-02-27 | 1987-02-27 | |
US019,820 | 1987-02-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63270628A true JPS63270628A (ja) | 1988-11-08 |
Family
ID=21795203
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63042449A Pending JPS63270628A (ja) | 1987-02-27 | 1988-02-26 | 組み換え体pres−1/s−2/s b型肝炎抗原の酵母からの精製方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0280470B1 (ja) |
JP (1) | JPS63270628A (ja) |
AT (1) | ATE91304T1 (ja) |
DE (1) | DE3882154T2 (ja) |
DK (1) | DK100888A (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE93891T1 (de) * | 1987-03-09 | 1993-09-15 | Merck & Co Inc | Reinigung von rekombiniertem hepatitis-boberfl|chen-antigen. |
EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
JPH0216975A (ja) * | 1988-02-09 | 1990-01-19 | Eugene Tech Internatl Inc | 異成分混交性のプレーsに富んだb型肝炎表面抗原 |
IL99025A0 (en) * | 1990-08-15 | 1992-07-15 | Astra Ab | Novel process for the detection of pathogens using dna probes |
CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
EP0135435A3 (en) * | 1983-08-22 | 1987-03-25 | Merck & Co. Inc. | Immunogenic hbsag derived from transformed yeast |
US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
EP0232410A4 (en) * | 1985-08-15 | 1988-01-25 | Amgen | CLEAVAGE PROCESS AND BUFFER FOR THE EXTRACTION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGENS FROM YEAR CELLS. |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
-
1988
- 1988-02-18 AT AT88301382T patent/ATE91304T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-18 DE DE88301382T patent/DE3882154T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-02-18 EP EP88301382A patent/EP0280470B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-26 DK DK100888A patent/DK100888A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-02-26 JP JP63042449A patent/JPS63270628A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0280470B1 (en) | 1993-07-07 |
DE3882154D1 (de) | 1993-08-12 |
DK100888A (da) | 1988-10-28 |
DK100888D0 (da) | 1988-02-26 |
EP0280470A1 (en) | 1988-08-31 |
DE3882154T2 (de) | 1993-12-02 |
ATE91304T1 (de) | 1993-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0233044B1 (en) | Process for purifying recombinant proteins, and use of products thereof | |
EP0278940A2 (en) | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigens containing them | |
EP0401941A2 (en) | Hepatitis B virus surface antigen and production thereof | |
US4707542A (en) | Immunogenic HbsAg derived from transformed yeast | |
US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
JP2950970B2 (ja) | 百日咳菌からの69000ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法 | |
US4738926A (en) | Method for purification of HBs antigen | |
US5011915A (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
JPS63270628A (ja) | 組み換え体pres−1/s−2/s b型肝炎抗原の酵母からの精製方法 | |
KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
JP3136327B2 (ja) | B型およびc型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 | |
EP0135435A2 (en) | Immunogenic HBsAg derived from transformed yeast | |
US6362320B1 (en) | Process for purifying hepatitis B viral surface antigen comprising pres2 peptide | |
Koistinen | Hepatitis B surface antigen polypeptides: artifactual bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis caused by aggregation | |
EP0294071A2 (en) | Hepatitis B vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof | |
EP0314240A2 (en) | Process for purifying recombinant hepatitis antigens | |
US5026828A (en) | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast | |
Pillot et al. | Immunochemical structure of the hepatitis B surface antigen vaccine—I. Treatment of immobilized HBsAg by dissociation agents with or without enzymatic digestion and identification of polypeptides by protein blotting | |
Vnek et al. | Association of normal serum protein antigens with chimpanzee hepatitis B surface antigen particles | |
EP1256804B1 (en) | HBcAg expression and diagnostic and therapeutic uses | |
Montie et al. | Isolation of toxic subunits from two murine-toxic proteins from Pasteurella pestis | |
EP0340837A1 (en) | Recombinant GAG precursor of HIV, product, process, and use as aids vaccine | |
EP0205625A1 (en) | Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation | |
JP2001503750A (ja) | B型肝炎インヒビター | |
KR930012107B1 (ko) | 한국형 c형 간염 바이러스의 특이 항원인 khcv 403 단백질의 정제방법 |