JPS63270628A - 組み換え体ｐｒｅｓ−１／ｓ−２／ｓ ｂ型肝炎抗原の酵母からの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎表面抗原はＢ型肝炎ウィルスの感染による病理
学的影響に対する免疫性を与える糖タンパク質−タンパ
ク質複合体などを時として生ずる。ワクチンを目的とし
た抗原の製造に際して、安全、迅速かつ安価な供給源と
して、従来は２２ｎｍの粒子である必要な抗原をたくさ
ん保持している患者からの直情あるいは、血漿に限定さ
れていた。組み換えＤＮＡ技術の出現により、その表面
抗原をコードしているＤＮＡを酵１１＋）あるいは大腸
菌又は他の細胞系に挿入し、発現する様になった。そし
て、その結果より得られるポリペプチド産物は挿入ＤＮ
Ａの発現に使用される宿主あるいは細胞系同様に使用さ
れるＤＮＡの構造で実質上、多様に変化するものである
。

ＨＢウィルス粒子は、コアタンパク質及びエンベロープ
または表面（“Ｓ”）タンパク質と呼ばれる２つの構造
タンパク質グループよりなる。更にウィルス粒子、すな
わちゾーン粒子の大部分を占める表面タンパク質である
“Ｓ”タンパク質は、オーストラリア抗原と呼ばれる唯
一の成分であり、それは、また２２ｎｍ粒子においても
同しである。

“Ｓ”タンパク質は、血清型にもよるが３８９−４００
個のアミノ酸をコートしているラージオーブンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）による翻訳産物である。このＯ
ＲＦは３つのドメインにはっきりと区別されており、そ
れぞれが、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける翻訳開始点なる機能
を果たすＡＴＧコドンを持っている。これらのドメイン
は遺伝子のそれぞれ５’−３’配列において、ｐｒｅｓ
−１（１０８−１０９個のアミノ酸）　、　ｐｒｅＳ−
２（５５個のアミノ酸）、及び５（２２６個のアミノ酸
）として呼ばれている。このＯＲＦからの６個の産生タ
ンパク質は以下の組成よりなる：１）　　Ｈ）４２　（
４２，０００ダルトンの糖タンパク質）＝ｐｒｅｓ−］
／Ｓ−２／Ｓ　（ｐｒｅＳ−１はｐｒｅＳ−２と隣接し
、ｐｒｅＳ−２はＳと隣接している事を意味する）、２
）　　ｐ３９　　（ｐ＝タンパク質）　＝　ｐｒｅＳ−
１７Ｓ−２／Ｓ、３）　　ｇｐ３Ｂ＝　ｐｒｅＳ−２／
Ｓ　（２つのグリコシレージョンサイトを持つ）、 ４）　　ｇｐ３３＝　ｐｒｅＳ−２／Ｓ　（１つのグリ
コシレージョンサイトを持つ）、 ５）　　ｇｐ２７＝　Ｓ　（１つのグリコシレージョン
サイトを持つ）、 ６）　　ｐ２４＝Ｓ。

ＨＢＶゾーン粒子中において、これら６個のタンパク質
ずべてがだいたい等モル量存在している。２２ｎｍ粒子
中においては、４つの小さなタンパク質がおよそ等モル
置台まれているものの、ｇｐ４２及びｐ３９は、せいぜ
いあっても、１つの粒子に対して１モルあるいは２．３
モル程度にしかすぎない。ｐｒｅＳ−１とｐｒｅｓ−２
の領域はＳ領域の分泌を促進する機能をもっているので
あろう。これらタンパク質の基本的特性についてのレビ
ューとして、チオライス、ビー。

（Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ、）等、サイエンス第２１ゴ巻
、第４０６頁（１９８１）及びミリッチ、ディー。

アール、　　（Ｍｉｌｉｃｈ、　Ｄ、　Ｒ，）等、プロ
コ、　す’ｒ−ル・アカド、サイ、　（Ｐｒｒ＋ｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）第８２巻、第８１
６８頁（１９８５）を参照。

Ｂ型肝炎抗原のｐｒｅＳ−２領域は約５５　ＡＡ残基よ
り成る。そして、ノイラス、ニー、アール。

（Ｎｅｕｒａｔｈ、八、Ｒ８）等、サイエンス第２２４
巻、第３９２頁（１９８４）、ノイラス、ニー、アール
、等、ネイチャー第３１５巻、第１５４頁（１９８５）
、及びミリッチ、ディー、アール、等、と述などにより
、ｉｎ　ｖｉｖ。

において、そのｐｒｅＳ−２の存在は、Ｓタンパク質の
エピトープよりも、より免疫原性である最も有力なエピ
トープを提供するものである。

ρｒｅｓ−２ポリペプチドは、ポリヒト血清アルブミン
（ｐＨ５Ａ）に対するレセプタ一様特性をもち、こねは
、ｐＨ５Ａが肝臓細胞に結合していると知られていると
ころからくる特性の一つである。

マチダ、ニー、　（Ｍａｃｈｉｄａ、Ａ、　）等、ガス
トロエンテロロジ−（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ）第８６巻、第９１０頁Ｈ９８４）に、報告されてい
る。

表面抗原中におけるｐｒｅＳ−２配列の存在は免疫用の
目的に対しては、ひとつの望ましい特性であるので、発
現系のシステムはｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓタンパク質
あるいはその他のバリアントに対して開発発展されてい
る。例えば、米国出願第８２４．４０５号、１月３１日
、１９８６年、参照。

本発明は酵母による発現系システムにおける、ｐｒｅｓ
−１／Ｓ−２／Ｓタンパク質、あるいは膜結合をおこし
ている種々のバリアントのタンパク質などを迅速に精製
する方法を示したものである。これらの新しい方法は、
酵母膜からの不必要なタンパク質の除去を第一に行ない
、次に膜からｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓタンパク質を十
分に純粋な物質として分離するという、本質的には２段
階による過程で行なわれる。外来性タンパク質に対して
人工的な関連性をもたせた、膜システムへの挿入や結合
による外来性タンパク質の精製方法に関する本明細は、
十分に評価されうるものである。

例えば酵母などの組み換え体を供給源とした組成物は血
清などの従来用いられていた供給源の物とは異なるので
従来の方法に対する新しい技術や、それら新規の方法と
の併用はほとんど必要ではない。一般的な、あるいは普
通に使用されている供給源からのタンパク質に対する有
効な分離方法の知識やノウハウを基礎として、組み換え
体の細胞培養からのタンパク質の分離に際しては、どん
な方法が有効なのかは、誰も予測できるものではない。

ワクチン調製用として考案されつる精製過程には、産生
物の変わった精製や、公知の技術としては予測できなか
った別の指摘が必要である。この新しい方法と同様の操
作法として、米国特許第４，６２４．９１８号を参照。

酵母細胞膜由来の組み換え体ｐｒｅｓ−１／Ｓ−２７Ｓ
　Ｂ型肝炎抗原あるいはそれに関するタンパク質の実質
的精製方法は、以下のステップより成る。

ａ）抗原付着酵母細胞膜部分の抽出； ｂ）゛ステップ（ａ）における抽出物中よりその細胞片
を遠心により除去； Ｃ）上清を不必要な酵母細胞膜由来タンパク質を遊離さ
せるのに効果的な溶液の存在下でダイアフィルトレーシ
ョンにかけ、不必要な膜結合タンパク質とされている物
質を除去する： ｄ）ステップ（ｃ）における産物を表面抗原を遊離しう
るのに効果的な第２の溶液と混合する： ｅ）ステップ（ｄ）において遊離してきた表面抗原をダ
イアフィルトレーションにかける：ｆ）ステップ（ｅ）
における濾液を低分子量の不純物を除去するために、ダ
イアフィルトレーションにかけ、十分に精製された組み
換え体ｐｒｅＳ−］／Ｓ−２／Ｓ　Ｂ型肝炎抗原、ある
いはそれに関するタンパク質を結果として得る。

定義と略語 比活性：　免疫化学的に反応するｓＡｇの総タンパク質
に対する重量対重量の比 率。

ＡＡ　　　　　アミノ酸 ＤＮＡ　　　　デオキシリボ核酸 ＤＴＴ　　　　ジチオスレイトール ＥＤ５ｏ５０％効果量 ＥＤＴＡ　　　　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
塩 Ｌ　　　　　リッター ＭＢ　　　　　膜結合 Ｍｒ　　　　　移動度 ＭＷ　　　　　分子量 ＮＭＷ　　　　名目上の分画分子量 ｐＨ５八　　　重合したヒト血清アルブミンＰＢＳ　　
　　リン酸緩衝生理食塩液、０　、１５Ｍ−Ｎａｃｌを
含む７ｍＭ−リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約７．２ ＰＭＡ　　　　防御モノクローナル抗体ＰＭＳＦ　　　
　フェニルメチルスルホニル　フルオライド ＰＰＴ　　　　沈渣 ｐｓｉ　　　　　１平方インチにおけるボンドＳ　　　
　表面 ５ｏｓ−ｐへ６Ｅ　　硫酸ドデシルナトリウム　ポリア
クリルアミドゲル電気泳動 Ｓｕｐ　　　　上清 本発明の過程とは酵母抽出物由来の膜結合Ｂ型肝炎表面
抗原の新しい積装方法を含むものである。不必要なＭＢ
タンパク買をカオトロピック因子を含む因子による処理
で遊難し、その後ＭＢ表面抗原を別の中性界面活性剤あ
るいはカオトロピック因子を含む、あるいはそれらの併
用溶液で遊離させる。

この本発明における新規な精製道程は発現されたＭＢタ
ンパク買に対しても適用可能である。基本的な実施例の
一つとして酵母のＹＡＤＨ２／ＰＳＳＣ−１ベクター使
用による酵母のトランスホーメーションがあげられる。

この系は酵母細胞膜への結合を促進するｐｒｃｓ−１／
Ｓ−２／Ｓのアミノ酸配列を発現しつるものである。

更にｐｒｃｓ−１あるいはｐｒｅＳ−２領域における変
異を含む、Ｓタンパク質中のアミノ酸末端配列に種々の
変化があったとしても、酵母細胞膜との隣接Ｓ領域アミ
ノ酸配列との結合にも同様の効果が認められる。本発明
の原理に基づいて、本発明の過程というものは、これら
ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓによる種々のタンパク質を迅
速かつ効率的に精製することを提供するものである。例
えば、ｐｒｃＳ−１／Ｓ−２／Ｓのアミノ酸配列中にお
ける保存性のある置換基は一般的に本発明の原理及び実
施に対する実質的あるいは新規なる改良によって見られ
るものではない。保存性のある置換基はエルファシ、イ
ー、　　（Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、）等、ジエイ。

セイル。パイオル、　（Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、）
第１２１巻、第３７１頁（１９８６）から知られている
。Ｓ領域あるいはＳ領域のカルボキシル基末端側におけ
る選択的な消失があったとしても本明細書中に述べられ
ている精製過程に対しては、一般的になんら改良の必要
性はない。膜結合表面抗原や、アミノ酸配列中に種々の
変化を持つ、それらの部分的なタンパク質は、保存性の
あるアミノ酸置換基、または、消失部分を持っていよう
と、更に表面抗原あるいはそれの部分的タンパク質を提
供する他の特製過程によるものであろうと、膜結合状態
からの精製を経た後には、ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓタ
ンパク質、２２ｎｍ粒子、オーストラリア抗原あるいは
その他の肝炎表面抗原本来のもつ構造に対する特異的抗
体と、免疫化学的に反応するとされている。

種々の酵母による発現のシステムはＭＢ表面抗原の供給
源としては明らかに十分に作用するものである。実施例
１においてＹＡＤＨ２／Ｐｓｓｃ−ｉによりトランスホ
ームされた酵母２１５０−３−２株は単に供給源として
臨時に使用したものである。シャトルベクター、コスミ
ドブラスミド、キメラプラスミド及び２−ミクロンの環
状プラスミド由来の配列を持つプラスミドなどに、他の
酵母ベクターは限定されるものではない。プロモーター
及びその他の酵母における転写を制御する配列の多様性
というものはＧＡＬＩＯ及びα接合型因子を含む表面抗
原をコードしている挿入ＤＮＡ配列の発現に使用される
。サツカロミセス属には多数の種が含まれている。組み
換え体ＤＮＡによる種々の外来性ポリペプチドの発現用
宿主としては、最も−・般的なものとしてサツカロミセ
スセレビシェ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）あるいはパン酵母か使用されている。

しかしながら、サツカロミセス属における他の種につい
ての違いというものは、よくわかっていない。これらの
種の中には、サツカロミセスセレビシェと異種交配しつ
るものや、ＧＡＬｌｏ、ＡＤＨ２、あるいはα接合型因
子プロモーターと限定されるものではないサツカロミセ
スセレビシェに見られるプロモーターに類似した、また
は同一の制御的プロモーターを持つであろう物も多数あ
る。そわ故、ｐｒｅＳ−を含むポリペプチドの発現に対
しての宿主株の選択の範囲は、サツカロミセス属のその
他の種にも広げることができ、カールスベルゲンシス（
ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ラバラム（ｕｖａｒ
ｕｍ）、ルキシー（ｒｏｕｘｉｉ）、モンタナス（ｍｏ
ｎｔａｎｕｓ）、クルィベリー（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、
エロンギスボラス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、ノル
ベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、オビホルミス（ｏｖ
ｉｆｏｒｍｉｓ）　、及びシアスタテイカス（ｄｉａｓ
ｔａｔｉｃｕｓ）などに限定されるものではないことは
当業者にとっては明白である。

幾つかの酵母酸、例えば、ハンセヌラ （ｔｌａｎｓｅｎｕｌａ）　、カンジダ（ｃａｎｄｉｄ
ａ）　、　　）−ルロブシス（Ｔｏｒｕ　１ｏｐｓ　ｉ
ｓ）及びピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）は、生育のための唯一
の炭素源としてのメタノールを有効使用すべき類似の代
謝経路を持つとされている。この代謝経路に関与してい
る酵素である、アルコールオキシダーゼの遺伝子をピヒ
ア　パスドロリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）より分離した。

このピヒア　バスドロリスのアルコール　オキシダーゼ
　プロモーターは分離され、発現に際してメタノール誘
発を受けやすい事が示された。この様に誘発されやすい
プロモーターは、酵母においてその選択がネガティブで
ある様なポリペプチドの発現に対して有効使用される。

特にこのプロモーターは、粒子形成しているピヒア　バ
ストロリスにおける、Ｓドメインの誘発発現に対するプ
ラスミド使用に際して活性を示す事が知られている。こ
れは免疫学的活性構造を持つＳポリペプチドの組み換え
ＤＮＡ−介在発現に対する宿主として作用するその他の
酵母属の能力を強く述べたものである。それ故、ｐｒｅ
Ｓを含むポリペプチド例えばｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓ
タンパク質などの発現に対しては、サツ力ロミセタシ工
科及びクリプトコツカシ工科の別の酵母属における種に
至るまで、その宿主株とすべき選択範囲が広げられ、こ
れらはビヒア、カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、
クルイベロミセス、及びサツカロミコプシスに限定され
るものではなく当業者にとっては明白なことである。

ＭＢ表面抗原の積装過程において、表面抗原の過度の不
安定性や分解がみられた。これに対処するために、溶媒
は代表的な緩衝液とし、なおかつＰＭＳ　ＦあるいはＥ
ＤＴＡの様なプロテアーゼ　インヒビターを含んだ物と
した。更にタンパク質の分解を減少させるためには、す
べての精製ステップは４℃前後において行なうのが好ま
しい。本発明の手順やプロトコールに対して適応しつる
代表的なプロテアーゼインヒビターとは、金属キレート
剤、重金属イオン、ＳＨ保護試薬、プロテアーゼに対す
る基質様化合物、あるいはプロテアーゼを阻害するポリ
ペプチドなどに限定されるものではない。有効なプロテ
アーゼインヒビターを以下に記載した。

Ａｇ”、ｌ　ｇ　＋−１Ｃｕ〜及び他の重金属イオン類
アンチスロンビンｍ アンチスロンビン■−ヘパリン α１−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Ｎａ−フルロライド４−ブロモ
−フェナシル　ブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸塩 システィン ４−ジニトロフェノールジェチルボスフ１−ト ＤＦＰ（ジイソプロピルホスフォフルオリデート） ＴＴ Ｅ−６４（ベーリンガーマンハイム社製）ＥＤＴＡ及び
その他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン ４−ハイドロキシメルクリベンゾエートヨードアセトア
ミド ヨード酢酸 ロイペプチン α２−マクログロブリン メルカプトエタノール ｐ−メルクリベンゾエート 塩化第二水銀 α−ミクログロブリン α−Ｎ−（ｐ〜ニトロベンジル−オキシカルボニル）−
Ｌ−アルギニルクロロメチルケトン オキサレート ストレプトマイセスなどより得られるベブスクチン ｌ、１０−フエナンスロライン ２−フェナンススロライン フェノチアジン−Ｎ−カルボニルクロライド ホスフォルアミトン ＭＳ　Ｆ ブリロホスフェート ＳＨ−保護試薬 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター ｐ　−１−ルエンスルホニルフルオライドＴＬＣＫ　（
Ｌ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）−７−アミ
ノ−２−ヘプタノンハイドロクロライト ＴＰＣＫ　（Ｌ−１−クロロ−３−（４−１シルアミド
）−４−フェニル−２−ブタノン鶏卵由来トリプシンイ
ンヒビター ＺＰＣＫ　（ベンジルオキシカルボニル−し−フェニル
アラニン） 上記記載のインヒビターを一つあるいは数種含む緩衝液
はＭＢ表面抗原の精製各ステップにおいて、−回もしく
は数回にわたって使用されつるものである。

ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓタンパク質、あるいはそこに
変異のみらねるタンパク質などをコードしている発現ベ
クターを使用してトランスホームされた酵母細胞を増殖
し、その後ハーベストした。もしその細胞を保存する時
には、ＰＢＳの様な緩衝液で洗浄後、細胞をペースト状
にする。そして、液体窒素中において凍結保存する。代
表的な精製方法は以下により行なわれる。

凍結細胞ペーストの１バツチを融解し、タンパク分解阻
害剤を含む緩衝液で懸濁する、例えば１　ｍＭ　　Ｐ　
Ｍ　Ｓ　Ｆを含むＰＢＳ０細胞をできれば機械的手段に
よりばらばらに分解する、例えばスタンステッド　セル
　ディスラブター（Ｓｔａｎｓｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉ
ｓｒｕｐｔｅｒ）　　（スタンステッド　フルイツト　
パワー社（５ｔａｎｓｔｅｄＦｌｕｉｄ　Ｐｏｗｅｒ　
ＬＴＤ、））　、ダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）
　　（’フィツー　ニー、バッコフェンマニュファクチ
ュアリング　エンシニアーズ（ｗｉｒｙＡ、　Ｂａｃｈ
ｏｆｅｎ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｓ）　、あるいはラボラトリ−ホモジナイザー（Ｌ
ａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　（ガ
ラリン　コーポレーション（Ｇａｕｌｉｎ　Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔ、１ｏｎ）　）などである。この細胞分解に際し
てのゆるやかに泡たつ程度の粉砕方法というものは、大
量の細胞に対しては不適当である。

スタンステッド　セル　デｆスラブタ （Ｓｔａｎｓｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　ＤｉｓｒｕｐＬｅｒ）
による分解が、その迅速な操作という面でもっとも好ま
しい機械である。

酵母の細胞分解により、粗抽出物を得る・２こで重要な
事はその後の精製ステップにおける機械的めづまりをな
くすために、抽出物中の細胞片を取り除く事である。遠
心はおよそ４，４００×ｇで５分間かもっとも適当と思
われるが、異なる遠心速度、異なる遠心時間でも同様に
有効でありかつ簡乍に操作しつるものであると考えられ
る。上清を約１３０，０００ｘｇで１時間の超遠心にか
け、ＭＢ表面抗原を酵母膜との付随物としてベレットダ
ウンさせ、細胞からの粗抽出物を遠心にかけた後に、存
在しているＭＢ表面抗原をテストする有効な方法として
使用する。ｐｒｅ−Ｓポリベブチドエピトーブの存在は
、ＨＢＶ表面抗原に特異的な標識抗体を用いた、ＲＩＡ
サンドイッチ法によるアッセイで、それらのエピトープ
がポリヒト血清アルブミン（ｐＨ３Ａ）と結合するかに
よって確認される。

上述にある様に、４，４００ｘｇで５分間の遠心による
細胞片の除去操作後に得られる４、４００ｘｇ上清に対
して更に精製操作を行なう。

次のステップとしては、上清中にある可溶性物質の除去
である。４，４００ｘｇ上清中の可溶性分画物質は、超
遠心、口過、ダイアフィルトレーション、圧力を加えて
も、加えなくてもよい、これらを場合に応じて使用する
ことによって除去する。この可溶性物質の除去法として
は、１ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳで洗浄した０、２μｍ
ポアサイズのミニクロス（Ｍｉｎｉｋｒｏｓ）ダイアフ
ィルトレーションユニット（ミクロボン、インク（Ｍｉ
ｃｒｏｇｏｎ、Ｉｎｃ、）　）に約１０−１５ｐｓｊの
加圧下で、それら４，４００ｘｇ上清を通過させる方法
が好ましい。

圧力をかける事によりダイアフィルトレーションユニッ
トのメンプランバリアーを可溶性物質が通過しやすくな
る。ダイアフィルトレーションは、透析及びフィルトレ
ージョンと一緒に使用された時に、実質上の有効性がも
たらされる。別のタイプのダイアフィルトレーションユ
ニットも使用可能である、例えばミクロボン、インク（
Ｍｉｃｒｏｇｏｎ、　Ｉｎｃ、）のクロス７０−（Ｋｒ
ｏｓＦｌｏ）　、あるいはアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ま
たはＡ／Ｇテクノロジー（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の種
々のホロファイバーカートリッジなどである。可溶性物
質の溶出は吸光度によりチェックされるＯ洗浄酵母膜の
調製とは、ＭＢ表面抗原の遊離は引きおこさずほとんど
のＭＢタンパク質が遊離されうる濃度において温和な変
性剤を膜結合物質に対して処理するものである。適当な
溶剤としては、界面活性剤、タンパク変性剤、あるいは
それらの混合物などがあげられる。種々の中性あるいは
非イオン性界面活性剤が使用されつるが、界面活性剤と
してトリトンＮ系、トリトンＸ系、ブリッジ系、ツイー
ン系、エマゾール系、デオキシコレート、オクチルグル
コピラノシトあるいはノニデットＮＰ−４０などに限定
されるものではない。ＣＨＡＰＳあるいはＣＨＡＰＳＯ
などの様な両イオン性界面活性剤も有効であり、かつ適
当な溶剤である。不必要なあるいは好ましくないＭＢタ
ンパク質を遊離するのに通しているタンパク変性剤は以
下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。

Ｒ−Ｃ””Ｎ−Ｙ 式中 Ｒは　アミノ、低級アルキルチオ、低級アルキルオキシ
、あるいはイオウ： Ｘは　アミノ、イオウあるいは酸素；そしてＹは　水素
あるいはアミン。

この構造式は約７Ｍから約ＩＭまでの濃度勾配による使
用か最も好ましかったタンパク変性剤であるグアニジン
・塩酸を含むものである。

更にＣｌＯ４−の様なアニオンやカオトロピック因子な
どを含むものも、適当なタンパク変性剤である。

洗浄酵母膜調製のために好ましいプロトコールとは約０
．２ｍＭ　　ＰＭＳＦと約１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
を含むＰＢＳで膜結合物質のダイアフィルトレーション
を行ない、次に約７Ｍグアニジン、塩酸での洗浄を１回
、さらに、数回、約７Ｍグアニジン、塩酸で洗浄するも
のである。洗浄酵母膜は、その後、ＭＢ表面抗原の遊離
という目的の為に界面活性剤、タンパク変性剤、あるい
は両者の混合物による抽出操作が行なわれる。非イオン
性あるいは中性界面活性剤のたぐいならばどれでも、抽
出には適当と思われるが、界面活性剤はトリトンＮ系、
トリトンＸ系、ブリッジ系、ツイーン系、エマゾール系
、デオキシコレート、オクチルグルコピラノシド、ある
いはノニデットＮＰ−４０などに限定されるものではな
い。ＣＨＡＰＳあるいはＣＨＡＰＳＯを含む両イオン性
界面活性剤も適応できる。

好ましい界面活性剤は約２％（ｗ／Ｖ）から約０．０５
％（ｗ／Ｖ）の間の濃度で使用されるトリトンｘ−ｔｏ
ｏがあげられるが、最も好ましいのは、それを、約１％
（ｗ／Ｖ）から０．１％（ｗ／Ｖ）の間の濃度で使用す
る時である。

ＭＢ表面抗原を遊離するのに通しているタンパク変性剤
は以下の構造式なる総称的化合物類を含んでいる。

Ｈ 式中 Ｒは　アミノ、低級アルキルチす、低級アルキルオキシ
、あるいはイオウ； Ｘは　アミノ、イオウあるいは酸素；そしてＹは　水素
あるいはアミノ。

この構造式は約ＩＭ濃度が好ましいタンパク変性剤であ
るグアニジン・塩酸を含むものである。更にＣＩＯ，−
の様なアニオンやカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐ
ｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）などを含むものもタンパク変性剤
として適当である。ダイアフィルトレーション後のステ
ップが、超遠心によって行なわれるのでなければ、３Ｍ
　　ＫＳＣＮを含む溶液でも実施可能である。

洗浄酵母膜からＭＢ表面抗原を抽出あるいは遊離させる
には、洗浄あるいは抽出のステップを数回くりかえす事
が必要である。

出願人は以下のステップを提供する。

（ａ）　　ＭＢ表面抗原を遊離させる為の、０．５％（
ｗ／■）トリトンＸ−１００を含む１Ｍグアニジン塩酸
による４℃における洗浄酵母膜のインキュベージ１ン； （ｂ）　　遊離表面抗原がダイアフィルトレーションユ
ニットの膜を通過しやすくなる様に、０．１％（ｗ／Ｖ
）　ト！Ｊ　ト：／Ｘ　−１００を含む１Ｍグアニジン
・塩酸によるダイアフィルトレーション； （ｃ）　　　ウルトラフィルトレージョンあるいは超遠
心による濾液の濃縮；そして （ｄ）　　１１：４縮減液を５分間、５ｒｎＭ　ＤＴＴ
でインキュベーション、次に２ｍＭＤＴＴを含む１Ｍグ
アニジン・塩酸によるダイアフィルトレーション、更に
ＰＢＳでダイアフィルトレーションをして残留不純物を
除去する。

選択的にステップ（ａ）におけるグアニジン・塩酸は、
内在性のタンパク分解活性を阻害するのに有効なプロテ
アーゼインヒビターにとりかえてもよい。例えば　０．
２　ｍＭ　　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ、１０ｍＭ　　ＥＩ７ＴＡ
、０．１％（ｗ／Ｖ）ペプスタチンＡ、０．０１３％（
ｗ／Ｖ）７ブロチニン及び１０ｍＭベンズアミジン・塩
酸であり、すべて、同種の抽出用緩衝液にそれぞれ最終
濃度において含まれている。

洗浄酵母膜からのＭＢ表面抗原の抽出や遊離にはダイア
フィルトレーションは必要ではない。もし適当な界面活
性剤あるいは変性剤を使用するのならば遠心及び透析も
選択されつる有効な手段である。ステップ（ａ）　−（
ｄ）は実際上はいろいろと改良されるものと思われる。

場合によっては、−回あるいは数回に及ぶ濃縮ステップ
が必要であろう。

本発明の操作手順やプロトコールは以下に示す操作を、
更に１回あるいは数回行なう事により、改良あるいは変
更されるであろう事はたやすく理解しつるものである。

つまり、疎水性クロマトグラフィー、例えばシリカゲル
などにょる固相クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
塩などによる沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、
免疫アフィニティークロマトグラフィー、あるいは、組
み換え体によるタンパク質の精製を目的としたその他の
有効な手段などである。

電子顕微鏡による精製抗原の解析は、ＫＳＣＮによる抽
出法以外のすべての方法におけるロットに対して、直径
約２２ｎｍの粒子が検出されなかった事を示している。

ロットのほとんどは不均質な粒子の集団であり、小胞様
構造、大きな粒子のかたまり、及び直径約１１４−２５
ｎの球状粒子などであった。

以下に記載の物質は市販されているものである： グアニジン・塩酸、シュハルツ／マン （Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ）バイオチック（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ）　　；トリトンＸ−１００、フィッシャー　
サイエンティフ（’／り　カンパニー（Ｆｉｓｈｅｒ　
５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣ□ｍｐａｎｙ）　；ジチオスレ
イトール、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　；ミニ
クロス０．２μｍモデュール（ｌ　ｆｔ、２）、ミクロ
ボン　インク（ＭｉｃｒｏｇｏｎＩｎｃ、）　　；アミ
コン　ホロファイバーカートリッジ（ＨＩＰ　　１００
−２０）、アミコン。

この出願の全体を通して、糖タンパク質の検出は、ネビ
ーレ、ディー、エム、　　（Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｄ。

Ｍ、）等［メソッド　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第３２＠、第
９２頁（１９７９）］の］過ヨウ素酸−シッフ塩基方に
よる。タンパク質の濃度測定には、ローリ−、オー、エ
ッチ（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ，ｔ（、）等［シエイ、パイオル
、ケム、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）第１９３巻、
第２６５頁（１９５１）コによるＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｌｏｗ
ｒｙ法、またはブラッドフォルト、エム、エム。

（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、）　　［アナル、バイオ
ケム。

（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｃｍ、）第７２巻、第２４８頁
（１９７６）］による、クーマジーブルー結合法が使用
された。

プルネット、ダブル、エヌ、　　（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、
　Ｗ。

Ｎ、）［アナル、バイオケム、（＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）第１１２巻、第１９５頁（１９８１）コによる
ウェスタン　プロット法も使用されている。

以下記載の方法により精製されたロットに対しての免疫
化学的なテストが行なわれた。

ポリヒト血清アルブミンに対する結合はバレンズエラ（
Ｖａｌｅｚｕｅｌａ）等［バイオテクノロジー（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第３巻、第３１７頁（１９８５
）］に従って行なわれ、その結果を第■表に示した。免
疫化学的な抗原決定基はＡＵＳＲＩＡＩＩ−１２５（ア
ボットラプス（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ）の改良法によ
りアッセイされた。そこにおいて、Ｊ２５１−標識され
た表面抗原特異的抗体はすてに固相に結合している特異
的抗原−抗体複合体と結合する。生物学的活性はマウス
ポテンシーテストによりチェックした。

Ｂ、　ＰｒｅＳ−１／Ｓ−２Ｓ　　Ｄ、のＹＡＤＨ２／
ＰＳＳＣ−１なる酵母ベクターには、アルコールデヒド
ロゲナーゼ■（ＡＤＨ２）プロモータ及びＨＢ　Ｖ　　
ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓ　Ｄ　ＮＡ配列が含まれてい
る。酵母サツカロミセスセレビシェ株２１５０−３−２
は、ＹＡＤＨ２／ＰＳＳＣ−１によりトランスホームさ
れ、細胞は、増殖後ハーベストされた。ベクターの構築
及びトランスホーメーションの詳細はこれらの目的に対
する参考文献を含む。米国出願第８２４．４０５号、１
月３１日、１９８６年において知られるところである。

細胞はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄しかつ、
細胞ペーストは液体窒素中で凍結されるものである。

Ｃ，ＰＣ−１６０ツトの１原寧　り このセクションＣにおけるすべての積装ステップは４℃
で実施する。酵母細胞産生抗原を含む凍結細胞ペースト
（１００ｇ）を１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）を含む２００ｍ１のＰＢＳで溶かす
。次にシュタンステッドセルディスラプタに２回通して
細胞をばらばらにする。細胞片を除くために、この得ら
れた粗抽出物を４，４００ｘｇ　、　５分の遠心にかけ
る。４，４００ｘｇのＦ清物質は更に１００．０００ｘ
ｇ、１時間の遠心にかけ、その沈殿物（酵母膜分画物）
を可溶性分画物質から分離する。組み換え体ｐｒｅＳ−
１／Ｓ−２／ＳＢ型肝炎抗原の局在性はポリヒト血清ア
ルブミン結合によるラジオイムノアッセイによって行な
われる。アッセイ法の原理はｐｒｅＳ−２領域物質のビ
ーズにコーティングされたポリヒト血清アルブミンに対
する結合を測定するサンドイッチ型のＲＩＡアッセイ法
である。コーティングされたビーズを未知量のｐｒｅＳ
−２ポリペプチドを含むサンプルと伴にインキュベーシ
ョンし、洗浄後更にＨＢＶ表面□ 抗原に特異的な１２５Ｉ−標識抗体と一緒にインキュベ
ーションする。ビーズを再洗浄後、その放射活性をカウ
ントする。１バッチ３６ｇについての結果を第１表に示
す。

第工表 酵母における組み換え体ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／ＳＢ型
抗原の含有量に対する遠心の効果 ｐＨ５八結へＲＩＡ　　　タンパク質　　比活性μｇ　
ＲＩＡｌ、４００ｘｇ上清　　　３．２　　　　　　３
，６００　　　　　　　０．９惇母膜分画　　　　３．
２　　　　　　　３２０　　　　　　　　ＩＱ町溶性分
画　　　　０．５１　　　　　２．８００　　　　　　
　０．２町Ｗｔ−ロー”　　　　　−±０１・０　−＊
ｐｔ（ＳＡ結合旧Ａμｇ／タンパクｍｇとして定義され
る第１表はｐｒｅＳ−２ポリペプチドのほとんどが酵母
膜タンパク質中に存在している事を立証するものである
。１００，０００ｘｇの遠心ステップをはふくために４
，４００ｘｇ上清に対して更なる操作が実施された。

（ａ）洗浄酵母膜の調製 ４．４００ｘｇ上清をペリスタポンプによる１〇−１５
ｐｓｉの加圧下において、ミニクロス（Ｍｉｎｉｋｒｏ
ｓ）ホロファイバーメンブラン（０，２μｍ、１　ｆｔ
、’）を持つダイアフィルトレーションユニット（４５
０ｍｆｆｉ用）に通す。０．２　ｍＭＰＭＳＦ及び１　
ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む２．５ＬのＰＢＳ、２５
０ｍｌ２の７Ｍグアニジン・塩酸、及び３Ｌの１Ｍグア
ニジン・塩酸を順次使用するダイアフィルトレーション
は膜からの抗原除去なしに、膜結合酵母不純物だけを除
去する。モして得・られた保留産物が膜結合抗原であっ
た（洗浄酵母膜）。

（ｂ）酵母膜からの抗原の抽出 上述の実施例ＩＣのパラグラフ（ａ）における洗浄酵母
膜は４℃、２０分間、０５％（ｗ／Ｖ）ｌ−リドンＸ−
１００を含む１Ｍグアニジン・塩酸ｌｉｌ中でインキユ
ベーシヨンされる。可溶化抗原をミニクロスホロファイ
バーユニット（０，２μｍ）により２００ｍｌ１まて濃
縮し、史に０．１％（ｗ／■）トリトンＸ−１００を含
む１Ｍグアニジン・塩酸１．５Ｌ使用のダイアフィルト
レーションにより酵母膜より分離する。抗原を含む濾過
液はアミコンホロファイバーメンブー７　ン（ＩＯｏ、
００ＯＮＭＷ、ｏ、６ｆｔ、、２）　１．：　ヨリ２０
０ｍｆｌまで濃縮され５ｍＭ　　ＤＴＴで５分間インキ
ュベーションした後、２ｍＭ　　ＤＴＴを含む１Ｍグア
ニジン・塩酸１２でダイアフィルトレーションをし、更
に２ＬのＰＢＳを使用する。得られた精製抗原（ＰＳ−
１６と表示）は第１Ｉ表の結果に示されている様に高い
比活性を保持している。

第■表 ０．５％トリトンＸ−１００存在下で膜より遊離された
酵母からの膜結合組み換え体ｐｒｅＳ−］／Ｓ−２７Ｓ
　Ｂ型肝炎抗原の精製１ｐＨ５Ａ結合ＲＩＡ　　　タン
パク質　比活性μｇＲＩＡ粗抽出物　　　　　　　　７
］２　　　　　　９，７００　　　　　　７１．２４．
４００ｘｇ−ト清　　　　　　　　　　１６　　　　　
　　　　５．８００　　　　　　　　　　２．８洗浄酵
ＮＩＱ　　　　　　　　８．３　　　　　２４０　　　
　　３４精製抗原（ＰＳ−１６）　　　　　−茎生−−
−−−−堀一一−−−−皿−−−ｍ−＝１　抗原ロット
番号ＰＳ−１６ 精製抗原の一部を更に３Ｍ　　ＫＳＣＮを含むＰＢＳで
１６時間処理する。これを５倍量の３Ｍ　にＳＣＮを含
むＰＢＳ及び１０倍量のＰＢＳによりアミノコンホロフ
ァイバーメンプラン（＋００，０００　ＮＭＷ、０．６
ｆｔ、”　）使用のダイアフィルトレーションにかける
。そして獲得物をロット番号ＰＳ−１６／にＳＣＮとす
る。

支胤■ユ、ロットＰＳ−１７ 実施例１のＣのステップ（ｂ）における、酵母膜からの
表面抗原遊離の為に使用されていた０、５％（ｗ／Ｖ）
トリトンＸ−１００を含む１Ｍグアニジン・塩酸を１％
（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む１Ｍグアニジン・
塩酸におきかえる以外は、実施例１の操作に順するもの
である。組み換え体ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓ表面抗原
は十分に精製されたタンパク質として得られ、ロフト番
号ＰＳ−１７とする。

笈に■ユ、ロットＰＳ−１２ 酵母細胞産生の抗原を含む１００ｇ凍結細胞ペーストの
他のバッチにおいては、１ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳ２
００ｍｆｌで溶解した後、シュタンスチットセルディス
ラブターに２回通しての細胞破砕を行なった。粗抽出物
は、細胞片を除去するために、４，４００ｘｇ、５分の
遠心にかけられた。４，４００ｘｇ上清をペリスタポン
プによる１０−１５ρｓｉの加圧下においてミニクロス
（Ｍｉｎｉｋｒｏｓ）ホロファイバーメンプラン（０，
２μｍ、１　ｆｔ、”）を持つダイアフィルトレーショ
ンユニット（４５０ｍＪｌ用）に通す。０．２　ｍＭＰ
ＭＳＦ及び１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含むＰ　Ｂ　
Ｓ　２．５Ｌ、更に７Ｍグアニジン・塩酸２５０ｍＪ２
及び１Ｍグアニジン・塩酸３Ｌによる、このダイアフィ
ルトレーションは膜からの抗原除去なしに膜結合酵母不
純物を取り除く。保留産物である膜結合タンパク質は次
に１３０，０００ｘｇ、６０分の超遠心にかけられ、沈
殿物はＰＢＳに再浮遊して洗浄膜分画物とする。実施例
３プロトコール中の各ステップにおける比活性を測定し
、結果を第■表に示した。

第■表 酵母からの組み換え体ｐｒｅｓ−１／Ｓ−２／Ｓ　Ｂを
肝炎抗原の分！！１：洗浄酵母膜における超遠心の効果 ｐＨ５Ａ結合Ｒ１Ａ　　　タンパク質　　比活性μｇＲ
ＩＡ粗抽出物　　　　　６，２００　　　　　１０，４
００　　　　　　０．６４．４００ｘｇ上清　　　６．
４８０　　　　　　　Ｂ、７００　　　　　　０．７−
−１画　　　５，４００　　　　２３０　　　２４　　
　　　、洗浄膜分画の一部分はその後、３Ｍ　　ＫＳＣ
Ｎを含むＰＢＳ　　６００ｍＪＡ４０分間の抽出操作、
＋３０．ＯＯＯｘｇ以外の回転数による超遠心６０分に
よる上清はアミコンホローファイバーメンプラン（１０
０，００ＯＮＭＷ、０．６ｆｔ、”）で２００ｍｆｉに
まで濃縮し、３Ｍ　　ＫＳＣＮを含むＰＢＳ　　ＩＬ、
及びＰＢＳ　　２Ｌによるダイアフィルトレーションに
かけ、ロット番号ＰＳ−１２なる産生物を得る。結果は
第７表に示しである。

第７表 洗浄膜分画に対する３Ｍ　　ＫＳＣＮ抽出の効果ｐＨ５
Ａ結合Ｒ昆　　タンパク質　　比活性μｇｌｌＴＡ保留
物質　　　　　２００　　　　　　　１１　　　　　　
　　１８（ＰＳ−１２） ’ｆ’　　　　　２２０　　　　　　１８　　　　　　
　１２１　すなわち最終１３０，０００ｘｇの超遠心に
よる沈殿物。

この沈殿物は、アッセイ前にＰＢＳで再浮遊する。

夫五■Ａ、ロットＰＳ−１５ ２ｍＭＤＤＴを含む２Ｍ尿素ＩＬ、及びＰＢＳ　　２Ｌ
を使用する最終ダイアフィルトレーションステップ以外
は実施例３に順する。産生精製抗原をロット番号ＰＳ−
１５とする。

結果は第■表に示しである。

第■表 調製物質　　　　ｐＨｓＡ結合ＲＩＡ　　　タンパク質
　　比活性μｇＲＩ＾粗抽出物　　　　　　２３　　　
　　　９，２００　　　　　　２．５４．４００％ｇ上
清　　　　２２　　　　　　７，０００　　　　　　３
．２洗浄酵母膜　　　　　２１　　　　　　　２７０　
　　　　　７７鯖製抗原　　　　　　０．４４　　　　
　　１９　　　　　　２３ＰＳ−１５）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　−え五ｌ、ロットＰ
Ｓ−４８ 酵母細胞産生の抗原を含む凍結細胞ペーストを１．０ｍ
Ｍ　　ＰＭＳＦ、１０ｍＭＥＤＴＡ及び０・１μトリス
塩酸ｐＨ７，５を含むＰＢＳ　（“バッファー”）９０
ｍＪＺに溶解する。細胞ペーストを１．４　Ｌのバッフ
ァーで希釈しダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）にお
いて３０秒、５回でこなごなにした後にダイノーミルよ
り取り出す。得られた粗抽出物を４，４００％ｇ、１０
分の遠心にかけ、細胞片を除去する。４，４００％ｇ上
清をペリスタポンプによる１０−１５ｐｓｉの加圧下に
おいてミニクロスホロファイバーメンプラン（０，２μ
ｍ、１　ｆｔ、”）を持つダイアフィルトレーションユ
ニット（４５０ｍＩＬ用）に通す。ダイアフィルトレー
ションは０．２ｍＭ　　ＰＭＳＦ及び１０ｍＭＥＤＴＡ
を含むＰＢＳ３．５Ｌ、６Ｍグアニジン・塩酸３００ｍ
ｕ、１Ｍグアニジン・塩酸２Ｌ、０．２ｍＭ　　ＰＭＳ
Ｆ及び１０ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むＰＢＳｌ、５Ｌの順
に行なう。得られた保留物質（洗浄酵母膜）を０．４％
トリトンＸ−１００及びプロテアーゼインヒビターを含
むＰＢＳｌ、６Ｌと４℃、２０分間、インキュベーショ
ンする［ＰＢＳにおける最終濃度はそれぞれ０．２　ｍ
Ｍ　　ＰＭＳＦ、　　１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　０．１
％（ｗ／Ｖ）ペプスタチンＡ、０．０１３％（ｗ／Ｖ）
アプロチニン及び１０ｍＭベンズアミジン・塩酸である
］。

ミニクロスホロファイバーユニット（０，２μｍ）で酵
母膜を２００＋ｍＱまで濃縮し、更にその酵母膜を０，
１％（ｗ／Ｖ）Ｉ−リドンＸ−１００及び上記記載プロ
テアーゼインヒビターを含む、ｐＨ７，５の１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液１．５　Ｌでダイアフィルトレー
ションする事によって、可溶化抗原を酵母膜より分離す
る。抗原を含む濾過液は、アミコンホロファイバーメン
プラン（１００，０ＯＯＮ　Ｍ　Ｗ、０．６ｆｔ、２）
により２００ｍｊ２まで濃縮され、その後、７倍容量の
ＰＢＳでダイアフィルト・レーションされる。抗原を含
む、保留物質を５ｍＭＤＴＴを含む４Ｍ尿素で１５分間
インキュベーションし、アミコンホロファイハーメンプ
ラン（１００，００ＯＮＭＷ、０．６ｆｌ”）により２
００ｍＪ２まで濃縮後、最終ステップとして５倍容量の
２ｍＭＤＴＴを含む２Ｍ尿素、１０倍容量のＰＢＳの順
にダイアフィルトレーションし、精製抗原（ＰＳ−４８
）を得る。結果を第■表に示した。

第■表 調製物質　　　　ｐｔ＋ｓ＾結合ＲＩＡ　　　タンパク
質　　比活性μｇＲｒＡ粗抽出物　　　　　　＋７．９
　　　　　１４，４００　　　　　１．２４．４００ｘ
ｇ　−ヒ清　　　　　　１８．６　　　　　　　　１４
．８００　　　　　　　　　１．３洗浄酵素膜　　　　
　３．１　　　　　　５０８　　　　　６．０鯖製抗原
★　　　　　２．５　　　　　　　６７　　　　　３８
−便と伊り一一一一一 ★　このサンプルはＡＵＳＲＩＡに対しても同様に測定
され比活性として２．９　μｇ　ＡＵＳＲＩＡ／ｍｇタ
ンパク質を示した。

それぞれのロットに対する免疫学的特性を第■表にまと
めて示した。更に、低い、ＡＵＳＲＩＡ値はｐｒｅＳ−
１の領域におけるポリペプチドにより抗原決定基がマス
クされている結果によることも示唆している。

第■表 種々のロットにおける免疫化学的、生物学的特性ＲＴＡ
比活性ＲＩＡ活性μｇ／ｍｇタンパク質Ｏｙト　ｏ　　
　　　　　　Ｈ５Ａ結Δ７　ッセイＡ［ｌ５ＲＩＡ　　
　　Ｒ，Ｐ、ｂＰＳ−１２（実施例３）　　　　　　　
　　１５　　　　　　　＜０．４　　　０．１８３ａＰ
Ｓ−１５（実施例４　）　　　　　　　　　２３　　　
　　　　＜ｏ、ｏｅ　　　　Ｏ，０１８９’ＰＳ−１６
（実施例１）　　　　　　　　　４６　　　　　　４．
１　　　０．００６７（ＰＳ−１６）’　　　　　　　
　　　　　ＮＤ　　　　　　　、１．９’　　　　０．
０１９３’ＰＳ−１６／ＫＳＣＮ　（実施例１）　　　
　　　２６　　　　　　２．１　　　０．０１２６（Ｐ
Ｓ−１６７ＫＳＣＮ）’　　　　　　　　　　ＮＤ　　
　　　　　１．６ＩＩＯ，０２５６ａＰＳ−１７（実施
例２）　　　　　　　　　５０　　　　　　５．１　　
　０．０１２５ＰＳ−４８′　　包１１１５３８　　　
　　　２．９　　　　ＮＤＮＤ＝未決定 ａ　　アッセイ前に可溶化抗原に最終濃度約０．４Ｍ−
０，６Ｍの尿素を加える。

ｂＲ，Ｐ、＝相対的ボテンシー、抗体濃度、比活性及び
親和性の測定値をあわせたもので以下の式により定義さ
れる：５０−ぢド誓イレト？、イブ告り＝リブ′含灯式
中、サンプルのエンドポイントはある特定の抗原により
得られた抗体の標準的、一定濃度の抗体に結合する抗原
の濃度であり、抗原決定基を必要とする抗体により計算
される、最大結合をもつロジット（Ｌｏｇｉｔ）転換パ
ーセント解析である。

ｐＨ３Ａ結合及びＡＵＳＲＩＡアッセイ法による結果は
、ワクチン使用目的にはＰＳ−１６及びＰＳ−１７が好
ましいロットであることを示している。

４羽のウサギにアルヒドロゲル吸着されたＰＳ−１６を
２０μｇ１．Ｍ、の量で接種する。

以下のスケ−ジュールによる。

比」　　　　　ム −８前採血 ０　　　アルヒドロゲルを持つＰＳ−１６，２０μｇ１
．Ｍ、の接種 比」　　　　　笈詰　（つづき） ２７　　　　アルヒドロゲルＰＳ−１６，２０μｇ１．
Ｍ、接種 ２７　　　　採血 ４１　　　　アルヒドロゲルＰＳ−１６，２０μｇ１．
Ｍ、接種 ４１　　　　採血 ７６　　　　アルヒドロゲルＰＳ−１６，２０μｇ１．
Ｍ、接種 産生抗体は以下の結果として測定された：ＰＳ−１６、
ウサギ＃　２２７．２２８．２２９及び２３０逆数によ
る力価 Ｒ２２７Ｒ２２８Ｒ２２９Ｒ２３０ 抗−５（＾ＵＳＡｂ） 日付−８、前免疫　　　＜８　　　＜８　　３６　　３
　Ｆｉ７６　　　　　　７２０　２３５０　１６０　　
＋６０抗−５２（ＥＬＩＳＡ） 日付−８、前免疫　　　＜ｔｏ　　＜１０　　＜１０　
　＜１０抗−５ｌ　（ＥＬＩＳＡ） 日付−８、前免疫　　　＜１０　　＜１０　　＜１０　
　＜１０支五里１ 実施例ＩＣにおいて調製されたロット番号ＰＳ−１６サ
ンプルはＭＷ＞１０６の抗原複合体を含んでいる。ロッ
トサンプルをラエミリイ、ニー、ケイ−、（１，ａｅｍ
ｍｌｉ、Ｌｌ、に、）　Ｃネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、第２２７巻、第６８０頁（１９７０）］の方法にょる
５ＤＳ−ポリアクリルドアミドゲル電気泳動にかける。

ロット番号Ｐｓ−１６は、約３９，０００ダルトン、４
５，０００ダルトンに相当する移動度をもつ十分に精製
されたポリペプチドサブユニットを含んでいると判明し
た。

過ヨウ素酸−シッフ試薬による染色法は、４５．０００
ダルトン部位に移動するサブユニットは糖タンパク質で
あることを示している。ウェスタンブロッティング法は
、両サブユニットがｐｒｅＳ−１、ｐｒｅＳ−２、Ｓタ
ンパク質の免疫学的抗原決定基を保持していることを示
している。以上の結果より４５．０００ダルトン部位へ
の移動をもつ大きなサブユニットは３９．０００ダルト
ンサブユニツトか糖化されたものである。

これまでに記載されている明細内容は、例証を目的とし
た実施例よりなる本発明の主旨を示すものであるが、本
発明の実行には、特許請求の範囲の中において見られる
様に、この明細書記載の手順やプロトコールに対して変
更点、適応性、改良、削除、付加的な操作すべてが含ま
れることはよく知られるところである。

【図面の簡単な説明】

第１図は膜−結合タンパク質の精製方法を示す図である
。 第２図はｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓタンパク質の酵母膜
からの最適と思われるＮ製方法を示す図である。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 粗抽出物 精製抗原　　　　酵母膜 粗抽出物　　　　　　第　　２　　図 Ｓｕｐ　　　　ＰＰＴ Ｉｔａ液　　　酵＠桑 精製　抗原 手続補正書 昭和６３年５月１６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵母膜からの組み換え体ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／Ｓ
   Ｂ型肝炎抗原あるいはその一部分を十分に精製する方法
   であって、 ａ）抗原が結合している酵母の膜部分の抽出、 ｂ）ステップ（ａ）の抽出物における細胞片の遠心によ
   る除去、 ｃ）望ましくない酵母膜−結合タンパク質を遊離させる
   効果のある溶液の存在下で上清をダイアフィルトレーシ
   ョンにかける、そして、上述の望ましくない酵母膜−結
   合タンパク質の除去後保留産物として洗浄酵母膜を得る
   、 ｄ）ステップ（ｃ）の保留産物を膜−結合表面抗原を遊
   離させる効果のある第２番目の溶液の作用をうける、 ｅ）ステップ（ｄ）により遊離してきた表面抗原を、そ
   の表面抗原のダイアフィルトレーションメンブランに対
   する通過を促進させるために、ダイアフィルトレーショ
   ンにかける、そして ｆ）ステップ（ｅ）の濾液をダイアフィルトレーション
   にかけ、低分子量の不純物を除去し、十分に精製された
   組み換え体ｐｒｅＳ−１／Ｓ−２／ＳＢ型肝炎抗原、あ
   るいはその抗原の一部を得ることによりなる方法。 ２、ステップ（ｃ）のダイヤフィルトレーションは約１
   ０−１５ｐｓｉの加圧下において行なう特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、ステップ（ｃ）のダイアフィルトレーションはポア
   直径約０．２μｍであるミニクロス装置を使用する特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４、ステップ（ｃ）の望ましくない酵母膜タンパク質の
   遊離に効果的な溶液は、タンパク質変性剤あるいは界面
   活性剤あるいは両者の混合物を含む特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ５、上述溶液はタンパク質変性剤を含む特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、ステップ（ｃ）のダイアフィルトレーション操作に
   おいて、上述タンパク質変性剤とは、約７Ｍと１Ｍの間
   で変化する濃度をもつグアニジン−塩酸である特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 ７、ステップ（ｄ）のダイアフィルトレーションはポア
   直径約０．２μｍであるミニクロス装置を使用する特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ８、ステップ（ｄ）の膜−結合表面抗原遊離に効果的な
   第２番目の溶液はタンパク質変性剤あるいは界面活性剤
   あるいは両者の混合物を含む特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ９、上述第２番目の溶液は０．５％（ｗ／ｖ）トリトン
   Ｘ−１００を含む１Ｍグアニジン塩酸から成る特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０、上述第２番目の溶液は１．０％（ｗ／ｖ）トリト
   ンＸ−１００を含む１Ｍグアニジン塩酸から成る特許請
   求の範囲第８項記載の方法。 １１、上述第２番目の溶液は約１Ｍのグアニジン・塩酸
   及び約０．５％（ｗ／ｖ）と約１．０％（ｗ／ｖ）の間
   の濃度をもつトリトンＸ−１００を含む特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 １２、ステップ（ｅ）のダイアフィルトレーションはポ
   ア直径約０．２μｍであるミニクロス装置を使用する特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 １３、第２番目の溶液は緩衝液、濃度範囲が約１％（ｗ
   ／ｖ）から約０．１％（ｗ／ｖ）であるトリトンＸ−１
   ００及びプロテアーゼインヒビターを含む特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 １４、第２番目の溶液は本質的には約０．４％（ｗ／ｖ
   ）トリトンＸ−１００、約０．２ｍＭ　ＰＭＳＦ、約１
   ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、約０．１％（ｗ／ｖ）ペプスタチン
   Ａ、約０．０１３％（ｗ／Ｖ）アプロチニン、及び約１
   ０ｍＭベンズアミジン塩酸を含むＰＢＳから成っている
   特許請求の範囲第１３項記載の方法。