JP2784264B2 - 腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするｄｎａ断片 - Google Patents
腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするｄｎａ断片Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規な腫瘍細胞増殖阻害因子をコードする
DNA断片に関する。更に詳細には、3T3細胞由来株化細胞
の培養上清から得ることができ腫瘍細胞の増殖を阻害す
る作用を有する新規な腫瘍細胞増殖阻害因子をコードす
るDNA断片に関する。
DNA断片に関する。更に詳細には、3T3細胞由来株化細胞
の培養上清から得ることができ腫瘍細胞の増殖を阻害す
る作用を有する新規な腫瘍細胞増殖阻害因子をコードす
るDNA断片に関する。
背景技術 従来、抗腫瘍剤として化学療法剤、免疫療法剤などの
合成医薬品が広く用いられているが、一般に特異性が低
く副作用が強いなどの問題がある。これに対して、組織
培養細胞から多くの腫瘍細胞増殖阻害因子が見出されて
おりこれらの因子は特異性が高く、副作用が低い抗腫瘍
剤になり得ると考えられている。このような物質として
は、例えばインターフェロン、リンフォトキシン、ガン
壊死因子（TNF）などが広く知られている。最近では、
ヒト由来の線維芽細胞から得られる腫瘍細胞障害因子
（特開平１−148197号公報）、ヒト由来肺癌細胞から得
られる腫瘍細胞増殖抑制因子（特開平１−187094号公
報）などが報告されている。
合成医薬品が広く用いられているが、一般に特異性が低
く副作用が強いなどの問題がある。これに対して、組織
培養細胞から多くの腫瘍細胞増殖阻害因子が見出されて
おりこれらの因子は特異性が高く、副作用が低い抗腫瘍
剤になり得ると考えられている。このような物質として
は、例えばインターフェロン、リンフォトキシン、ガン
壊死因子（TNF）などが広く知られている。最近では、
ヒト由来の線維芽細胞から得られる腫瘍細胞障害因子
（特開平１−148197号公報）、ヒト由来肺癌細胞から得
られる腫瘍細胞増殖抑制因子（特開平１−187094号公
報）などが報告されている。
一方、Swissマウス胎児から得た細胞から樹立された
線維芽細胞様細胞株3T3細胞からもいくつかの細胞増殖
阻害因子が単離されている。即ち、例えば、Natrajらは
静止期の3T3細胞の細胞表層から増殖阻害因子が得られ
ることを報告しており〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75、6
115−6119（1978）〕、Harelらは、3T3細胞の培養上清
から分子量40kDaの増殖阻害因子が得られることを報告
している〔J.Cell.Physiol.,119、101−106（1984）;ib
id.,123、139−143（1985）〕。しかしながらこれらの
増殖阻害因子はいずれも腫瘍細胞にたいしては有意な阻
害活性を示さないことが知られている。
線維芽細胞様細胞株3T3細胞からもいくつかの細胞増殖
阻害因子が単離されている。即ち、例えば、Natrajらは
静止期の3T3細胞の細胞表層から増殖阻害因子が得られ
ることを報告しており〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75、6
115−6119（1978）〕、Harelらは、3T3細胞の培養上清
から分子量40kDaの増殖阻害因子が得られることを報告
している〔J.Cell.Physiol.,119、101−106（1984）;ib
id.,123、139−143（1985）〕。しかしながらこれらの
増殖阻害因子はいずれも腫瘍細胞にたいしては有意な阻
害活性を示さないことが知られている。
本発明者らは、3T3細胞由来株化細胞の培養上清か
ら、腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有する新規な腫瘍
細胞増殖阻害因子を単離することに成功し、先に特許出
願（特開平３−11950）した。
ら、腫瘍細胞の増殖を阻害する作用を有する新規な腫瘍
細胞増殖阻害因子を単離することに成功し、先に特許出
願（特開平３−11950）した。
この腫瘍細胞増殖阻害因子は、ヒト前骨髄性白血病細
胞、ヒト子宮頸癌由来細胞などの腫瘍細胞に対して強力
な増殖阻害活性を有しており新たに腫瘍治療剤として期
待されものである。
胞、ヒト子宮頸癌由来細胞などの腫瘍細胞に対して強力
な増殖阻害活性を有しており新たに腫瘍治療剤として期
待されものである。
新たな腫瘍治療剤として用いるためには、十分な量の
腫瘍細胞増殖阻害因子を供給することが必要であり、従
って工業的に有利な製造法の開発が望まれる。
腫瘍細胞増殖阻害因子を供給することが必要であり、従
って工業的に有利な製造法の開発が望まれる。
発明の開示 本発明者らは、腫瘍細胞増殖阻害因子の工業的に有利
な製造法として組換えDNA技術による製造法に着目し、
腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするcDNAのクローニング
について研究を行い、該阻害因子の組換えDNA法を用い
て製造法に利用することのできる該阻害因子をコードす
るDNA断片を得ることに成功し本発明を完成した。
な製造法として組換えDNA技術による製造法に着目し、
腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするcDNAのクローニング
について研究を行い、該阻害因子の組換えDNA法を用い
て製造法に利用することのできる該阻害因子をコードす
るDNA断片を得ることに成功し本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記式（１）に示す塩基配列を有す
る腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするDNA断片に関す
る。
る腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするDNA断片に関す
る。
（式中、ＸはTTC TTT CTA又はTTCを表わす）。
図面の簡単な説明 図１は、本発明で対象とする腫瘍細胞増殖阻害因子Ｐ
−１のフェニル5PW−RP逆相HPLCの溶出プロファイルを
示すグラフである。
−１のフェニル5PW−RP逆相HPLCの溶出プロファイルを
示すグラフである。
図２は、本発明で対象とする腫瘍細胞増殖阻害因子Ｐ
−２のフェニル5PW−RP逆相HPLCの溶出プロファイルを
示すグラフである。
−２のフェニル5PW−RP逆相HPLCの溶出プロファイルを
示すグラフである。
図３は、PCR法でプライマーとして用いたオリゴヌク
レオチド〜を示す。
レオチド〜を示す。
図４はPCR法で増幅させたDNA断片の増幅部位の概略図
である。
である。
図５は、PCR法によって得られたDNA断片の概略図であ
る。
る。
図６は、Ｐ−１の一部をコードするDNA断片の塩基配
列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
図７は、Ｐ−１のＣ末端領域をコードするDNA断片の
塩基配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
塩基配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
図８は、Ｐ−１のＮ末端領域をコードするDNA断片の
塩基配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
塩基配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
図９は、Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片を分離
するために行った電気泳動の結果を示す写真である。
するために行った電気泳動の結果を示す写真である。
図10は、Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の塩基
配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
配列と翻訳したアミノ酸配列を示す。
発明を実施するための最良の形態 本発明で対象とする腫瘍細胞増殖阻害因子は、式
（１）においてＸがTTC TTT CTAである塩基配列を有
するDNA断片によってコードされる該阻害因子（以下Ｐ
−１と略記することがある）及びＸがTTCである塩基配
列を有するDNA断片によってコードされる該阻害因子
（以下Ｐ−２と略記することがある）の２種類である。
（１）においてＸがTTC TTT CTAである塩基配列を有
するDNA断片によってコードされる該阻害因子（以下Ｐ
−１と略記することがある）及びＸがTTCである塩基配
列を有するDNA断片によってコードされる該阻害因子
（以下Ｐ−２と略記することがある）の２種類である。
これらの阻害因子は、Swissマウス胎児から樹立され
た線維芽細胞様細胞株3T3細胞の１種であるNIH3T3細胞
〔J.Virol.,４、549（1969）〕からの継代培養により得
られる株化細胞、NIH3T3−sf細胞の培養上清から単離精
製することができる（特開平３−11950）。
た線維芽細胞様細胞株3T3細胞の１種であるNIH3T3細胞
〔J.Virol.,４、549（1969）〕からの継代培養により得
られる株化細胞、NIH3T3−sf細胞の培養上清から単離精
製することができる（特開平３−11950）。
阻害因子Ｐ−１及びＰ−２は、下記式（２）で示され
るアミノ酸配列を有するペプチドである。
るアミノ酸配列を有するペプチドである。
（式中、ＹはPhe−Phe−Leu又はPheを表わす） 阻害因子Ｐ−１は、式（２）においてＹがPhe−Phe−
Leuであるアミノ酸配列を有するペプチドであり、阻害
因子Ｐ−２は、ＹがPheであるアミノ酸配列を有するペ
プチドである。
Leuであるアミノ酸配列を有するペプチドであり、阻害
因子Ｐ−２は、ＹがPheであるアミノ酸配列を有するペ
プチドである。
阻害因子Ｐ−１あるいはＰ−２をコードするcDNAのク
ローニングは以下のようにして行うことができる。
ローニングは以下のようにして行うことができる。
3T3細胞由来株化細胞であるNIH3T3−sf細胞からmRNA
を抽出し、次いでオリゴdTセルロースカラムに吸着させ
た後に溶出させてmRNAを精製する。これらの操作は市販
のmRNA抽出キットを用いて行うことができる。
を抽出し、次いでオリゴdTセルロースカラムに吸着させ
た後に溶出させてmRNAを精製する。これらの操作は市販
のmRNA抽出キットを用いて行うことができる。
精製したmRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとし
て用いて、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼによりcDNA
を合成する。このcDNAの末端を通常の方法により平滑化
しこれに例えばEcoR Iアダプターを結合させ、これと例
えば市販品のラムダファージgt10−EcoR Iアームとを混
合してT4DNAリガーゼにより両者を結合させてcDNAを含
むベクターを構築する。次いでベクターと結合したcDNA
を鋳型としてin vitroパッケージング法〔Hohn et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,3259（1977）〕により
ファージ粒子を形成させ、cDNAライブラリーを得る。
て用いて、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼによりcDNA
を合成する。このcDNAの末端を通常の方法により平滑化
しこれに例えばEcoR Iアダプターを結合させ、これと例
えば市販品のラムダファージgt10−EcoR Iアームとを混
合してT4DNAリガーゼにより両者を結合させてcDNAを含
むベクターを構築する。次いでベクターと結合したcDNA
を鋳型としてin vitroパッケージング法〔Hohn et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,3259（1977）〕により
ファージ粒子を形成させ、cDNAライブラリーを得る。
次いでこのcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法（Sai
ki et al.,Science,230、1350、（1985）〕により阻害
因子Ｐ−１あるいはＰ−２をコードすると考えられる各
種のDNA断片の増幅を行い、得られるDNA断片より目的と
する阻害因子Ｐ−１あるいはＰ−２をコードするDNA断
片の塩基配列を決定することができる。
ki et al.,Science,230、1350、（1985）〕により阻害
因子Ｐ−１あるいはＰ−２をコードすると考えられる各
種のDNA断片の増幅を行い、得られるDNA断片より目的と
する阻害因子Ｐ−１あるいはＰ−２をコードするDNA断
片の塩基配列を決定することができる。
具体的には、例えば以後に記載する実施例に示した方
法を採用することができる。
法を採用することができる。
即ち、最初に、式（２）に示した阻害因子Ｐ−１のア
ミノ酸配列のうち、１残基目から６残基目までのアミノ
酸配列部分に対応する塩基配列を有する図３に示すオリ
ゴヌクレオチドを５′側プライマーとし、41残基目か
ら46残基目までのアミノ酸配列部分に対応する塩基配列
と相補的な配列を有する図３に示すオリゴヌクレオチド
を３′側プライマーとして、前記したcDNAライブラリ
ーを鋳型にして阻害因子Ｐ−１をコードすると考えられ
るDNA断片をPCR法により増幅させる。次いでこの増幅さ
れたDNA断片（反応生成物−１）を鋳型にして、オリゴ
ヌクレオチドを５′側プライマーとし、32残基目から
37残基目までのアミノ酸配列部分に対応する塩基配列と
相補的な配列を有する図３に示すオリゴヌクレオチド
を３′側プライマーとして、阻害因子Ｐ−１の一部分を
コードすると考えられるDNA断片をPCR法により更に増幅
させる。
ミノ酸配列のうち、１残基目から６残基目までのアミノ
酸配列部分に対応する塩基配列を有する図３に示すオリ
ゴヌクレオチドを５′側プライマーとし、41残基目か
ら46残基目までのアミノ酸配列部分に対応する塩基配列
と相補的な配列を有する図３に示すオリゴヌクレオチド
を３′側プライマーとして、前記したcDNAライブラリ
ーを鋳型にして阻害因子Ｐ−１をコードすると考えられ
るDNA断片をPCR法により増幅させる。次いでこの増幅さ
れたDNA断片（反応生成物−１）を鋳型にして、オリゴ
ヌクレオチドを５′側プライマーとし、32残基目から
37残基目までのアミノ酸配列部分に対応する塩基配列と
相補的な配列を有する図３に示すオリゴヌクレオチド
を３′側プライマーとして、阻害因子Ｐ−１の一部分を
コードすると考えられるDNA断片をPCR法により更に増幅
させる。
増幅されたDNA断片（反応生成物−２）を電気泳動に
付して分離し、更に得られるDNA断片を例えば一本鎖フ
ァージM13mp18RF〔Messing et al.,Gene,33、103（198
5）〕にクローニングし、ジデオキシ・チェイン・ター
ミネーター法〔Sanger,E.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,74、5463、（1977）〕によりDNA断片の塩基配列
を決定する。図６に、このDNA断片、即ち障害因子Ｐ−
１の１残基目から36残基目までのアミノ酸配列部分をコ
ードするDNA断片の上記の如くにして決定された塩基配
列が示されている。
付して分離し、更に得られるDNA断片を例えば一本鎖フ
ァージM13mp18RF〔Messing et al.,Gene,33、103（198
5）〕にクローニングし、ジデオキシ・チェイン・ター
ミネーター法〔Sanger,E.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,74、5463、（1977）〕によりDNA断片の塩基配列
を決定する。図６に、このDNA断片、即ち障害因子Ｐ−
１の１残基目から36残基目までのアミノ酸配列部分をコ
ードするDNA断片の上記の如くにして決定された塩基配
列が示されている。
次いで、かくして決定された塩基配列に基づき、更
に、阻害因子Ｐ−１のＣ末端領域をコードすると考えら
れるDNA断片の増幅をPCR法により行う。即ち、例えば図
６に示した塩基配列のうち18塩基目から37塩基目までに
対応するオリゴヌクレオチド（図３参照）、及び68塩
基目から87塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド
（図３参照）を５′側プライマーとし、cDNAライブラリ
ーを作製する際に用いたλgt10のEcoR I切断部位近傍の
塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド（図３参照）を３′側プライマーとし、前記したcD
NAライブラリーを鋳型にして、上記したと同様にしてDN
A断片の増幅を行い、得られるDNA断片（反応生成物−
４）に基づいて上記したと同様の手法によりその塩基配
列を決定する。図７に阻害因子Ｐ−１のＣ末端領域を含
むDNA断片の塩基配列が示されている。
に、阻害因子Ｐ−１のＣ末端領域をコードすると考えら
れるDNA断片の増幅をPCR法により行う。即ち、例えば図
６に示した塩基配列のうち18塩基目から37塩基目までに
対応するオリゴヌクレオチド（図３参照）、及び68塩
基目から87塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド
（図３参照）を５′側プライマーとし、cDNAライブラリ
ーを作製する際に用いたλgt10のEcoR I切断部位近傍の
塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド（図３参照）を３′側プライマーとし、前記したcD
NAライブラリーを鋳型にして、上記したと同様にしてDN
A断片の増幅を行い、得られるDNA断片（反応生成物−
４）に基づいて上記したと同様の手法によりその塩基配
列を決定する。図７に阻害因子Ｐ−１のＣ末端領域を含
むDNA断片の塩基配列が示されている。
次いで、同様にして、阻害因子Ｐ−１のＮ末端領域を
コードするDNA断片の塩基配列を決定する。即ち、図３
に示したオリゴヌクレオチド、及びをプライマー
として用いてPCR法によりDNA断片の増幅を行い、得られ
るDNA断片（反応生成物−５）を用いて同様にして塩基
配列を決定する。図８に阻害因子Ｐ−１のＮ末端領域を
含むDNA断片の塩基配列が示されている。
コードするDNA断片の塩基配列を決定する。即ち、図３
に示したオリゴヌクレオチド、及びをプライマー
として用いてPCR法によりDNA断片の増幅を行い、得られ
るDNA断片（反応生成物−５）を用いて同様にして塩基
配列を決定する。図８に阻害因子Ｐ−１のＮ末端領域を
含むDNA断片の塩基配列が示されている。
以上のようにして得られた各種DNA断片の塩基配列な
らびに阻害因子Ｐ−１のアミノ酸配列に基づいて、阻害
因子Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の塩基配列
（図10参照）を決定することができる。
らびに阻害因子Ｐ−１のアミノ酸配列に基づいて、阻害
因子Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の塩基配列
（図10参照）を決定することができる。
このようにして決定された塩基配列に基づいて、阻害
因子Ｐ−１をコードするDNA断片をクローニングし多量
に得ることができる。
因子Ｐ−１をコードするDNA断片をクローニングし多量
に得ることができる。
即ち、図10あるいは式（１）で示される塩基配列の
５′末端領域に対応する図３に示したオリゴヌクレオチ
ドを５′側プライマーとし、３′末端領域に対応する
塩基配列と相補的な配列を有する図３に示したオリゴヌ
クレオチドを３′側プライマーとし、前記したように
調整したcDAライブラリーを鋳型としてPCR法によりDNA
断片を増幅する。増幅されたDNA断片（反応生成物−
６）を電気泳動に付して分離し、次いで前記したように
して、例えば一本鎖ファージM13mp18RFのSma I部位にク
ローニングする。このようにして阻害因子Ｐ−１をコー
ドする式（１）で示される塩基配列を有するDNA断片を
得ることができる。
５′末端領域に対応する図３に示したオリゴヌクレオチ
ドを５′側プライマーとし、３′末端領域に対応する
塩基配列と相補的な配列を有する図３に示したオリゴヌ
クレオチドを３′側プライマーとし、前記したように
調整したcDAライブラリーを鋳型としてPCR法によりDNA
断片を増幅する。増幅されたDNA断片（反応生成物−
６）を電気泳動に付して分離し、次いで前記したように
して、例えば一本鎖ファージM13mp18RFのSma I部位にク
ローニングする。このようにして阻害因子Ｐ−１をコー
ドする式（１）で示される塩基配列を有するDNA断片を
得ることができる。
以上に記載した、オリゴヌクレオチド〜をプライ
マーとしPCR法により各種DNA断片を増幅する増幅部位は
図４に模式的に示されている。図５には、増幅された各
種DNA断片、即ち前記した反応生成物−2,4,5及び６のDN
A断片が模式的に示されている。
マーとしPCR法により各種DNA断片を増幅する増幅部位は
図４に模式的に示されている。図５には、増幅された各
種DNA断片、即ち前記した反応生成物−2,4,5及び６のDN
A断片が模式的に示されている。
阻害因子Ｐ−２をコードするDNA断片も同様にして得
ることができる。例えば、図10の塩基配列の５′末端領
域に対応するオリゴヌクレオチドを５′側プライマー
とし、図10の３′末端側の113塩基目から132塩基目まで
の塩基配列に相補的な塩基配列（５′−GAAGTGCTCACATC
GCAGAC−３′）を有するオリゴヌクレオチドを３′側プ
ライマーとし、前記したcDNAライブラリーを鋳型として
PCR法によりDNA断片を増幅し、この増幅されたDNA断片
を、前記と同様にして分離し次いでクローニングして、
阻害因子Ｐ−２をコードするDNA断片を得ることができ
る。
ることができる。例えば、図10の塩基配列の５′末端領
域に対応するオリゴヌクレオチドを５′側プライマー
とし、図10の３′末端側の113塩基目から132塩基目まで
の塩基配列に相補的な塩基配列（５′−GAAGTGCTCACATC
GCAGAC−３′）を有するオリゴヌクレオチドを３′側プ
ライマーとし、前記したcDNAライブラリーを鋳型として
PCR法によりDNA断片を増幅し、この増幅されたDNA断片
を、前記と同様にして分離し次いでクローニングして、
阻害因子Ｐ−２をコードするDNA断片を得ることができ
る。
阻害因子Ｐ−１及びＰ−２をコードするcDNAのクロー
ニングは次のようにして行うこともできる。
ニングは次のようにして行うこともできる。
式（２）に示したアミノ酸配列から推測されるオリゴ
ヌクレオチドを化学的に合成して放射性同位体で標識
し、これをプローブとして用いて、例えば前記したcDNA
ライブラリーよりプラークハイブリダイゼーション法に
よって目的とするcDNAを単離し通常の方法によりクロー
ニングすることもできる。
ヌクレオチドを化学的に合成して放射性同位体で標識
し、これをプローブとして用いて、例えば前記したcDNA
ライブラリーよりプラークハイブリダイゼーション法に
よって目的とするcDNAを単離し通常の方法によりクロー
ニングすることもできる。
あるいは、障害因子Ｐ−１又はＰ−２をコードする式
（１）の塩基配列を有するDNA断片は、例えばリン酸ト
リエステル法〔Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.,91、
3350（1969）〕などの公知の方法により化学的に合成す
ることもできる。
（１）の塩基配列を有するDNA断片は、例えばリン酸ト
リエステル法〔Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.,91、
3350（1969）〕などの公知の方法により化学的に合成す
ることもできる。
以下に本発明を実施例及び参考例により更に詳細に説
明する。
明する。
参考例 阻害因子Ｐ−１及びＰ−２の単離精製及び構造決定 1.3T3細胞由来株化細胞の調製 NIH3T3細胞を10％牛胎児血清を含むDF培養液（ダルベ
ッコウ改変MEM:HamF−12＝1:1）継代培養した後、イン
スリン５μg/ml、トランスフェリン５μg/ml、セレン酸
塩、２×10-8Mを含むDF培養液で培養し、増殖するクロ
ーンを得た。
ッコウ改変MEM:HamF−12＝1:1）継代培養した後、イン
スリン５μg/ml、トランスフェリン５μg/ml、セレン酸
塩、２×10-8Mを含むDF培養液で培養し、増殖するクロ
ーンを得た。
さらに、このクローンにより、DF培養液のみで増殖す
るクローンを得、継代培養して株化した。得られた株化
細胞をNIH3T3−sfと命名した。培養は、37℃、５％CO2
の気相下で行った。培養液は３日毎に70％の新鮮培養液
を交換する方法で行った。継代は、培養細胞が、サブコ
ンフルエンスに達した時点で２倍に希釈する方法で行っ
た。培養液は、コンディションメディウム50％、新鮮培
養液50％の比率の培養液を調製して用いた。
るクローンを得、継代培養して株化した。得られた株化
細胞をNIH3T3−sfと命名した。培養は、37℃、５％CO2
の気相下で行った。培養液は３日毎に70％の新鮮培養液
を交換する方法で行った。継代は、培養細胞が、サブコ
ンフルエンスに達した時点で２倍に希釈する方法で行っ
た。培養液は、コンディションメディウム50％、新鮮培
養液50％の比率の培養液を調製して用いた。
2.NIH3T3−sf細胞の無血清培養上清の調製 NIH3T3−sf細胞を、10％牛胎児血清含有DF培養液を用
い培養した細胞がコンフルエンスに達した時点で、この
培養液を、除去し、PBS（−）（KCl:0.2g、KH2PO4:0.2
g、NaCl:8g、Na2HPO4:1.150g/L）で１回洗浄した後、DF
培養液で48時間培養した。この培養液を除去し、新たに
DF培養液で96時間から120時間培養した。96時間から120
時間毎に培養液を交換し100L収集した。収集した培養液
は、遠心分離（2000回転×10分間）を行ない上清を回収
した。
い培養した細胞がコンフルエンスに達した時点で、この
培養液を、除去し、PBS（−）（KCl:0.2g、KH2PO4:0.2
g、NaCl:8g、Na2HPO4:1.150g/L）で１回洗浄した後、DF
培養液で48時間培養した。この培養液を除去し、新たに
DF培養液で96時間から120時間培養した。96時間から120
時間毎に培養液を交換し100L収集した。収集した培養液
は、遠心分離（2000回転×10分間）を行ない上清を回収
した。
3.精製 １） Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー 回収した培養上清100Lをペリコンカセットシステム
（限外濾過膜システム、分画分子量1000）を用いて、約
50倍に濃縮した。さらに90％硫安飽和により塩析し、80
00×ｇで60分間遠心した沈澱を20mMトリス・HClバッフ
ァー（pH7.4）に溶解し、同バッファに対し透析した。
次に、予め同バッファで平衡化したＱ−セファロースカ
ラム（ファルマシア）（φ5cm×5cm）に添加し非吸着画
分及び洗浄画分を集めた。
（限外濾過膜システム、分画分子量1000）を用いて、約
50倍に濃縮した。さらに90％硫安飽和により塩析し、80
00×ｇで60分間遠心した沈澱を20mMトリス・HClバッフ
ァー（pH7.4）に溶解し、同バッファに対し透析した。
次に、予め同バッファで平衡化したＱ−セファロースカ
ラム（ファルマシア）（φ5cm×5cm）に添加し非吸着画
分及び洗浄画分を集めた。
溶出条件は以下の通りである。
流速 8ml/min 分画 2ml/tube 溶離液 20mMトリス、HClバッファー（pH7.4） ２） Ｓ−セファロースカラムクロマトグラフィー 非吸着画分のpHを酢酸で5.0に調製し、20mM酢酸バッ
ファー（pH5.0）で平衡化したＳ−セファロースカラム
（ファルマシア）（φ2.5cm×6cm）に添加した。活性成
分は吸着し、次いで、20mMトリス、HClバッファー（pH
7.4）を用いて溶出することで活性画分を得た。溶出条
件は以下の通りである。
ファー（pH5.0）で平衡化したＳ−セファロースカラム
（ファルマシア）（φ2.5cm×6cm）に添加した。活性成
分は吸着し、次いで、20mMトリス、HClバッファー（pH
7.4）を用いて溶出することで活性画分を得た。溶出条
件は以下の通りである。
流速 0.85ml/min 分画 4ml/tube 溶離液 20mMトリス、HClバッファー（pH7.4） ３） ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
FPLC Ｓ−セファロースカラムより溶出された活性画分を酢
酸でpH6.0に調整し、予め20mM酢酸バッファー（pH6.0）
で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（ペンタック
スφ7.5mm×10cm旭光学）に注入し、非吸着画分を集め
た。
FPLC Ｓ−セファロースカラムより溶出された活性画分を酢
酸でpH6.0に調整し、予め20mM酢酸バッファー（pH6.0）
で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（ペンタック
スφ7.5mm×10cm旭光学）に注入し、非吸着画分を集め
た。
溶出条件は以下の通りである。
流速 1ml/min 分画 1ml/tube 溶離液 20mM酢酸バッファー（pH6.0） ４） TSKgel CM−3SWカラムクロマトグラフィーHPLC 活性画分を酢酸でpH5.0に調整し、予め５％アセトニ
トリル（CH3CN）含有20mM酢酸バッファー（pH5.0）で平
衡化したTSKgel CM−3SWカラム（φ7.5mm×7.5cm東ソ
ー）に注入した。
トリル（CH3CN）含有20mM酢酸バッファー（pH5.0）で平
衡化したTSKgel CM−3SWカラム（φ7.5mm×7.5cm東ソ
ー）に注入した。
溶出条件は以下の通りである。
流速 1ml/min 分画 1ml/tube 活性は、２分画にわかれ、各々NaCl濃度86mM（Ｐ−
１）、100mM（Ｐ−２）で溶出した。
１）、100mM（Ｐ−２）で溶出した。
５） Penyl 5PW−RP逆相カラムクロマトグラフィーHPL
C CM−3SW HPLCステップより得られた活性画分を、各
々５％CH3CN含有燐酸バッファー（pH7.4）で平衡化した
Penyl−5PWRPカラム（φ4.6mm×7.5cm東ソー）に注入し
た。溶出は20％CH3CN含有5mM燐酸バッファー（pH7.4）
で20分間溶出した後、20％から40％CH3CN含有同バッフ
ァーを用いて80分間の直線型濃度勾配で溶出をおこなっ
た。流速は、1ml/min、分取は、2ml/tubeで行った。Ｐ
−１はリテンションタイム59分から60分の位置に、Ｐ−
２は60分から61分の位置に溶出した（図１及び図２参
照）。
C CM−3SW HPLCステップより得られた活性画分を、各
々５％CH3CN含有燐酸バッファー（pH7.4）で平衡化した
Penyl−5PWRPカラム（φ4.6mm×7.5cm東ソー）に注入し
た。溶出は20％CH3CN含有5mM燐酸バッファー（pH7.4）
で20分間溶出した後、20％から40％CH3CN含有同バッフ
ァーを用いて80分間の直線型濃度勾配で溶出をおこなっ
た。流速は、1ml/min、分取は、2ml/tubeで行った。Ｐ
−１はリテンションタイム59分から60分の位置に、Ｐ−
２は60分から61分の位置に溶出した（図１及び図２参
照）。
5.アミノ酸配列の決定 ２種類の精製品について、気相プロテインシークエン
サー（モデル470Aアプライドバイオシステムズ社）を使
用した自動エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定し
た。前記した通り、Ｐ−１は式（２）においてＹがPhe
−Phe−Leuであるアミノ酸配列、Ｐ−２はＹがPheであ
るアミノ酸配列を有することが判った。
サー（モデル470Aアプライドバイオシステムズ社）を使
用した自動エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定し
た。前記した通り、Ｐ−１は式（２）においてＹがPhe
−Phe−Leuであるアミノ酸配列、Ｐ−２はＹがPheであ
るアミノ酸配列を有することが判った。
実施例 Ｐ−１およびＰ−２をコードするDNA断片の単離及び
塩基配列の決定 １） NIH3T3−sf細胞のcDNAライブラリーの作製 （１） NIH3T3−sf細胞の調整 NIH3T3−sf細胞を、参考例の2.に示した方法で培養し
た。即ち、該細胞を10％牛胎児血清含有DF培養液で37
℃、５％CO2の条件で培養し、細胞がコンフルエンスに
達した時点で、培養液を除去し、PBS（−）で１回洗浄
した後、DF培養液で120時間培養した。
塩基配列の決定 １） NIH3T3−sf細胞のcDNAライブラリーの作製 （１） NIH3T3−sf細胞の調整 NIH3T3−sf細胞を、参考例の2.に示した方法で培養し
た。即ち、該細胞を10％牛胎児血清含有DF培養液で37
℃、５％CO2の条件で培養し、細胞がコンフルエンスに
達した時点で、培養液を除去し、PBS（−）で１回洗浄
した後、DF培養液で120時間培養した。
（２） NIH3T3−sf細胞からのmRNAの抽出（１）に示し
た方法で培養した細胞の培養液を除去し、PBS（−）で
１回洗浄した後、PBS（−）を添加してセルスクレイパ
ーで細胞をかきとり、コニカルチューブに集めた。遠心
（1500×ｇ、５分、室温）後、PBS（−）を添加して細
胞を懸濁し、再度遠心して沈澱を得た。この沈澱からmR
NA抽出キット（インビトロジェン社製）を用いてmRNAを
抽出した。この方法を用い２×108の細胞から19.2μｇ
のmRNAを精製することができた。
た方法で培養した細胞の培養液を除去し、PBS（−）で
１回洗浄した後、PBS（−）を添加してセルスクレイパ
ーで細胞をかきとり、コニカルチューブに集めた。遠心
（1500×ｇ、５分、室温）後、PBS（−）を添加して細
胞を懸濁し、再度遠心して沈澱を得た。この沈澱からmR
NA抽出キット（インビトロジェン社製）を用いてmRNAを
抽出した。この方法を用い２×108の細胞から19.2μｇ
のmRNAを精製することができた。
（３） cDNAの合成 （２）に示した方法で調整したmRNAを鋳型とし、cDNA
合成キット（ファルマシア社製）を用い、オリゴdTをプ
ライマーとしてcDNAを合成した。この方法を用いて1.9
μｇのmRNAから1.0μｇのcDNAを合成することができ
た。
合成キット（ファルマシア社製）を用い、オリゴdTをプ
ライマーとしてcDNAを合成した。この方法を用いて1.9
μｇのmRNAから1.0μｇのcDNAを合成することができ
た。
（４） cDNAとベクターの結合 cDNAクローニングキット（ファルマシア社製）を利用
した。即ち、（３）に示した方法で合成したcDNAの末端
を大腸菌のDNAポリメラーゼラージフラグメント及び４
種のデオキシヌクレオチド三燐酸を用いて平滑化したの
ち、EcoR Iアダプターを結合した。
した。即ち、（３）に示した方法で合成したcDNAの末端
を大腸菌のDNAポリメラーゼラージフラグメント及び４
種のデオキシヌクレオチド三燐酸を用いて平滑化したの
ち、EcoR Iアダプターを結合した。
該cDNAをラムダファージgt10−EcoR Iアーム（ストラ
テジーン社製）と混合し、T4DNAリガーゼを用いて両者
を結合した。
テジーン社製）と混合し、T4DNAリガーゼを用いて両者
を結合した。
（５） in vitroパッケージング （４）に示した方法でベクターと結合したcDNAを鋳型
とし、in vitroパッケージングキット（アマシャム社
製）を用いてファージ粒子を形成させ、cDNAライブラリ
ーを作成した。
とし、in vitroパッケージングキット（アマシャム社
製）を用いてファージ粒子を形成させ、cDNAライブラリ
ーを作成した。
２）PCR法によるＰ−１の一部をコードするDNA断片の増
幅及び塩基配列の解析 （１） Ｐ−１の一部をコードするDNA断片の増幅参考
例の５で決定したＰ−１のアミノ酸配列を元にして、Ｎ
末端領域及にＣ末端領域のアミノ酸配列に対応するオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これらをプライマーとして、
１）に示した方法で調整したcDNAライブラリーを鋳型と
して、PCR法〔Saiki et al.,Science,230、1350、（198
5）〕によりＰ−１の一部をコードするDNA断片の増幅を
行なった。PCR反応はGeneAmp PCR reagent Kit with Am
pliTaq DNA Polymerase（Perkin−Elmer Cetus Instrum
ent社製）を用い、DNA Thermal Cycler（Perkin−Elmer
Cetus Instrument社製）を使用した。
幅及び塩基配列の解析 （１） Ｐ−１の一部をコードするDNA断片の増幅参考
例の５で決定したＰ−１のアミノ酸配列を元にして、Ｎ
末端領域及にＣ末端領域のアミノ酸配列に対応するオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これらをプライマーとして、
１）に示した方法で調整したcDNAライブラリーを鋳型と
して、PCR法〔Saiki et al.,Science,230、1350、（198
5）〕によりＰ−１の一部をコードするDNA断片の増幅を
行なった。PCR反応はGeneAmp PCR reagent Kit with Am
pliTaq DNA Polymerase（Perkin−Elmer Cetus Instrum
ent社製）を用い、DNA Thermal Cycler（Perkin−Elmer
Cetus Instrument社製）を使用した。
即ち、式（２）に示したＰ−１のアミノ酸配列のう
ち、１残基目から６残基目までのアミノ酸配列（Val−G
ln−Ile−Thr−Lys−Cys）に対応する塩基配列を有する
オリゴヌクレオチド（５′−GTNCARATHACNAARTG−
３′;N＝A,T,G,C,;R＝A,G,;H＝A,C,T:N,R,Hがこれらの
それぞれの塩基を表わす各オリゴヌクレオチドの混合物
を用いた）、41残基目から46残基目までのアミノ酸配列
（Cys−Glu−His−Phe−Phe−Leu）に対応する塩基配列
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（５′−
ARRAARAARTGYTCRCA−３′;Y＝C,T:YがＣ又はＴである２
種のオリゴヌクレオチドの混合物を用いた）、32残基目
から37残基目までのアミノ酸配列（Cys−Glu−Val−Gly
−Thy−Thr）に対応する塩基配列と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチド（５′−GTRTANCCNACYTCRCA−
３′）を合成した（図３及び４参照）。
ち、１残基目から６残基目までのアミノ酸配列（Val−G
ln−Ile−Thr−Lys−Cys）に対応する塩基配列を有する
オリゴヌクレオチド（５′−GTNCARATHACNAARTG−
３′;N＝A,T,G,C,;R＝A,G,;H＝A,C,T:N,R,Hがこれらの
それぞれの塩基を表わす各オリゴヌクレオチドの混合物
を用いた）、41残基目から46残基目までのアミノ酸配列
（Cys−Glu−His−Phe−Phe−Leu）に対応する塩基配列
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（５′−
ARRAARAARTGYTCRCA−３′;Y＝C,T:YがＣ又はＴである２
種のオリゴヌクレオチドの混合物を用いた）、32残基目
から37残基目までのアミノ酸配列（Cys−Glu−Val−Gly
−Thy−Thr）に対応する塩基配列と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチド（５′−GTRTANCCNACYTCRCA−
３′）を合成した（図３及び４参照）。
次に以下に示す方法を用いてＰ−１の一部をコードす
るDNA断片の増幅を行った。
るDNA断片の増幅を行った。
１）−（５）に示した方法で調整したcDNAライブラリー 10μｌ 100℃で10分間加熱 氷冷 ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（PerKin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ 10μｌ 〔100mM Tris−HCl,pH8.3/500mM KCl/15mM MgCl2/0.01
％（w/v）gelatin〕 ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→40℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−１ 反応生成物−１ 10μｌ ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（PerKin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ 10μｌ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→40℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−２（図５参照） （２） Ｐ−１の一部をコードするDNA断片のクローニ
ング 反応生成物−２を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、110塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、以下に示す方法を用いた１本鎖ファージM13mp18RF
のSma I部位にクローニングした。
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ 10μｌ 〔100mM Tris−HCl,pH8.3/500mM KCl/15mM MgCl2/0.01
％（w/v）gelatin〕 ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→40℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−１ 反応生成物−１ 10μｌ ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度10μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（PerKin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ 10μｌ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→40℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−２（図５参照） （２） Ｐ−１の一部をコードするDNA断片のクローニ
ング 反応生成物−２を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、110塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、以下に示す方法を用いた１本鎖ファージM13mp18RF
のSma I部位にクローニングした。
バンドの切り出し、DNAの抽出（T.Maniatis et al.,;
Molecular Cloning,p178,1982）： DNAを７μｌのH2Oに溶解 ＋10×緩衝液Ｂ １μｌ （0.5M Tris−HCl,pH7.8/0.1M MgCl2/10mM DTT） ＋Klenow fragment １μｌ （5units） ＋10mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） １μｌ 22℃ １時間 68℃ 10分 エタノール沈澱 ７μｌの蒸留水に溶解 ＋10×緩衝液Ｃ １μｌ （0.5M Tris−HCl,pH7.6/0.1M MgCl2/0.1MDTT） ＋10mM ATP １μｌ （5units） ＋T4ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 37℃ １時間 68℃ 10分 フェノール抽出 エタノール沈澱 DNAを７μｌの蒸留水に溶解 ＋10×緩衝液Ｄ １μｌ （0.66M Tris−HCl,pH7.6/50mM MgCl2/50m MDTT/10m
M ATP） ＋T4 DNAリガーゼ １μｌ （350units） ＋Sma Iで切断したM13mp18RF 0.5μｇ １μｌ 15℃ 15時間 このDNAを塩化カルシウム処理〔Maniatis et al.,Mol
ecular Cloning,p250,（1982）〕した大腸菌JM109株
〔C.Yanisch−Perrson,et al.,Genc.33,p103,（198
5）〕に導入し、Ｌ寒天培地（トリプトン:10g、酵母エ
キス:5g、塩化ナトリウム:10g、寒天末:15g/L）に播種
した。45℃に保温した軟寒天培地（トリプトン:10g,酵
母エキス:5g、塩化ナトリウム:10g、アガロース:7.5g/
L）3mlに別途培養した大腸菌JM109株0.1mlを混合し、前
記Ｌ寒天培地プレート上に重層し、37℃で培養すること
によりプラークを得た。
Molecular Cloning,p178,1982）： DNAを７μｌのH2Oに溶解 ＋10×緩衝液Ｂ １μｌ （0.5M Tris−HCl,pH7.8/0.1M MgCl2/10mM DTT） ＋Klenow fragment １μｌ （5units） ＋10mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） １μｌ 22℃ １時間 68℃ 10分 エタノール沈澱 ７μｌの蒸留水に溶解 ＋10×緩衝液Ｃ １μｌ （0.5M Tris−HCl,pH7.6/0.1M MgCl2/0.1MDTT） ＋10mM ATP １μｌ （5units） ＋T4ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 37℃ １時間 68℃ 10分 フェノール抽出 エタノール沈澱 DNAを７μｌの蒸留水に溶解 ＋10×緩衝液Ｄ １μｌ （0.66M Tris−HCl,pH7.6/50mM MgCl2/50m MDTT/10m
M ATP） ＋T4 DNAリガーゼ １μｌ （350units） ＋Sma Iで切断したM13mp18RF 0.5μｇ １μｌ 15℃ 15時間 このDNAを塩化カルシウム処理〔Maniatis et al.,Mol
ecular Cloning,p250,（1982）〕した大腸菌JM109株
〔C.Yanisch−Perrson,et al.,Genc.33,p103,（198
5）〕に導入し、Ｌ寒天培地（トリプトン:10g、酵母エ
キス:5g、塩化ナトリウム:10g、寒天末:15g/L）に播種
した。45℃に保温した軟寒天培地（トリプトン:10g,酵
母エキス:5g、塩化ナトリウム:10g、アガロース:7.5g/
L）3mlに別途培養した大腸菌JM109株0.1mlを混合し、前
記Ｌ寒天培地プレート上に重層し、37℃で培養すること
によりプラークを得た。
（３） 塩基配列の解析 ２）−（２）で調製したプラークをJM109株に吸着さ
せて培養し、その培養上清から一本鎖DNAを抽出し〔Mes
sing et al.,Gene,33,103（1985）〕、ジデオキシ・チ
ェイン・ターミネータ法〔Sanger,F.et.al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,74,5463,（1977）〕により７−Deaza
−Sequening Kit（東洋紡社）を使用して、塩基配列を
決定した（図６参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳し
た結果、該DNA断片はＰ−１の一部（１番目から36番目
のアミノ酸残基）をコードしていることが明かになっ
た。
せて培養し、その培養上清から一本鎖DNAを抽出し〔Mes
sing et al.,Gene,33,103（1985）〕、ジデオキシ・チ
ェイン・ターミネータ法〔Sanger,F.et.al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,74,5463,（1977）〕により７−Deaza
−Sequening Kit（東洋紡社）を使用して、塩基配列を
決定した（図６参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳し
た結果、該DNA断片はＰ−１の一部（１番目から36番目
のアミノ酸残基）をコードしていることが明かになっ
た。
３） PCR法によるＰ−１のＣ末端領域をコードするDNA
断片の増幅と塩基配列の解析 （１） Ｐ−１のＣ末端領域をコードするDNA断片の増
幅 ２）−（３）で決定した塩基配列を元にして、オリゴ
ヌクレオチドを合成し、これらとλgt10の一部をプライ
マーとして、１）−（５）に示した方法で調製したcDNA
ライブラリーを鋳型として、PCR法によりＰ−１のＣ末
端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。
断片の増幅と塩基配列の解析 （１） Ｐ−１のＣ末端領域をコードするDNA断片の増
幅 ２）−（３）で決定した塩基配列を元にして、オリゴ
ヌクレオチドを合成し、これらとλgt10の一部をプライ
マーとして、１）−（５）に示した方法で調製したcDNA
ライブラリーを鋳型として、PCR法によりＰ−１のＣ末
端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。
即ち、図４に示した塩基配列のうち、18塩基目から37
塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド、68塩基目
から87塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド、λ
gt10のEcoR I切断部位近傍の塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した（図３及び４参照）。
塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド、68塩基目
から87塩基目までに対応するオリゴヌクレオチド、λ
gt10のEcoR I切断部位近傍の塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した（図３及び４参照）。
次に以下に示す方法を用いてＰ−１のＣ末端領域をコ
ードするDNA断片の増幅を行った。
ードするDNA断片の増幅を行った。
１）−（５）に示した方法で調製したcDNAライブラリ
ー 10μｌ 100℃で10分間加熱 氷冷 ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→52℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−３ 反応生成物−３ 10μｌ ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→55℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−４（図５参照） （２） Ｐ−１のＣ末端領域をコードするDNA断片のク
ローニング 反応生成物−４を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、400塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、２）−（２）に示した方法を用いて１本鎖ファージ
M13mp18RFのSma I部位にクローニングした。
ー 10μｌ 100℃で10分間加熱 氷冷 ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→52℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−３ 反応生成物−３ 10μｌ ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→55℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−４（図５参照） （２） Ｐ−１のＣ末端領域をコードするDNA断片のク
ローニング 反応生成物−４を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、400塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、２）−（２）に示した方法を用いて１本鎖ファージ
M13mp18RFのSma I部位にクローニングした。
（３） 塩基配列の解析 ２）−（３）で示した方法により、塩基配列を決定し
た（図７参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、該DNA断片はＰ−１のＣ末端領域をコードしている
ことが明かになった。即ち、図７の下線を引いた部分の
24番目から46番目のアミノ酸残基に相当するＣ末端領域
をコードしている。
た（図７参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、該DNA断片はＰ−１のＣ末端領域をコードしている
ことが明かになった。即ち、図７の下線を引いた部分の
24番目から46番目のアミノ酸残基に相当するＣ末端領域
をコードしている。
４） PCR法によるＰ−１のＮ末端領域をコードするDNA
断片の増幅と塩基配列の解析 （１） Ｐ−１のＮ末端領域をコードするDNA断片の増
幅 ２）−（３）で決定したＰ−１の塩基配列を元にして、
オリゴヌクレオチドを合成し、これらとλgt10の一部を
プライマーとして、１）−（５）に示した方法で調製し
たcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によりＰ−１
のＮ末端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。
断片の増幅と塩基配列の解析 （１） Ｐ−１のＮ末端領域をコードするDNA断片の増
幅 ２）−（３）で決定したＰ−１の塩基配列を元にして、
オリゴヌクレオチドを合成し、これらとλgt10の一部を
プライマーとして、１）−（５）に示した方法で調製し
たcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によりＰ−１
のＮ末端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。
即ち、図４に示したＰ−１の一部の塩基配列のうち、
18塩基目から37塩基目までに対応する配列と相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド、68塩基目から87塩基
目までに対応する配列と相補的な配列を有するオリゴヌ
クレオチド、λgt10のEcoR I切断部位近傍の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを合成した（図３及び４
参照）。
18塩基目から37塩基目までに対応する配列と相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド、68塩基目から87塩基
目までに対応する配列と相補的な配列を有するオリゴヌ
クレオチド、λgt10のEcoR I切断部位近傍の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを合成した（図３及び４
参照）。
次に実施例２）−（１）に示した方法を用いてＰ−１
のＮ末端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。但
し、オリゴヌクレオチド、のかわりにオリゴヌクレ
オチド、を用い、オリゴヌクレオチドのかわりに
オリゴヌクレオチドを用い、最終的に反応生成物−５
（図５参照）を得た。
のＮ末端領域をコードするDNA断片の増幅を行った。但
し、オリゴヌクレオチド、のかわりにオリゴヌクレ
オチド、を用い、オリゴヌクレオチドのかわりに
オリゴヌクレオチドを用い、最終的に反応生成物−５
（図５参照）を得た。
（２） Ｐ−１のＮ末端領域をコードするDNA断片のク
ローニング 反応生成物−５を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、310塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、２）−（２）で示した方法を用いて１本鎖ファージ
M13mp18RFのSma I部位にクローニングした。
ローニング 反応生成物−５を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、310塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した。バンドを切り出
し、２）−（２）で示した方法を用いて１本鎖ファージ
M13mp18RFのSma I部位にクローニングした。
（３） 塩基配列の解析 ２）−（３）で示した方法により、塩基配列を決定し
た（図８参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、該DNA断片はＰ−１のＮ末端領域をコードしている
ことが明かになった。即ち、図８の下線を引いた部分の
１番目から12番目のアミノ酸残基に相当するＮ末端領域
をコードしている。
た（図８参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、該DNA断片はＰ−１のＮ末端領域をコードしている
ことが明かになった。即ち、図８の下線を引いた部分の
１番目から12番目のアミノ酸残基に相当するＮ末端領域
をコードしている。
５）PCR法によるＰ−１の全領域をコードするDNA断片の
塩基配列の確認 ２）〜４）によって決定された塩基配列の中でＰ−１
の全領域をコードするDNA断片の塩基配列を確認するた
めに５′末端領域に対応するオリゴヌクレオチドと
３′末端領域に対応する塩基配列と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを合成し（図３及び４参照）、
これらをプライマーとして、２）〜４）に示した方法と
同様な方法で、Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の
増幅及びクローニングを行い、塩基配列を解析した。
塩基配列の確認 ２）〜４）によって決定された塩基配列の中でＰ−１
の全領域をコードするDNA断片の塩基配列を確認するた
めに５′末端領域に対応するオリゴヌクレオチドと
３′末端領域に対応する塩基配列と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを合成し（図３及び４参照）、
これらをプライマーとして、２）〜４）に示した方法と
同様な方法で、Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の
増幅及びクローニングを行い、塩基配列を解析した。
（１） Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片の増幅 １）−（５）に示した方法で調製したcDNAライブラリ
ー 10μｌ 100℃で10分間加熱 氷冷 ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→55℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−６（図５参照） （２） Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片のクロー
ニング 反応生成物−６を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、138塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した（図９参照）。バ
ンドを切り出し、２）−（２）に示した方法を用いて１
本鎖ファージM13mp18RFのSma I部位にクローニングし
た。
ー 10μｌ 100℃で10分間加熱 氷冷 ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋オリゴヌクレオチド（終濃度１μＭ） ＋AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus Instru
ment社製） 0.5μｌ （2.5units） ＋蒸留水 全量100μｌ ＋10×緩衝液Ａ ＋1.25mM dNTP（Ｎ＝A,T,G,C） 16μｌ 94℃（１分）→55℃（２分）→72℃（３分）（30回繰り
返し）→反応生成物−６（図５参照） （２） Ｐ−１の全領域をコードするDNA断片のクロー
ニング 反応生成物−６を５％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動を行ったところ、138塩基対付近にエチジウムブロ
マイドで染色されるバンドを確認した（図９参照）。バ
ンドを切り出し、２）−（２）に示した方法を用いて１
本鎖ファージM13mp18RFのSma I部位にクローニングし
た。
（３） 塩基配列の解析 ２）−（３）で示した方法により、塩基配列を決定し
た（図10参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、Ｐ−１の全アミノ酸配列と完全に一致した。
た（図10参照）。該塩基配列をアミノ酸に翻訳した結
果、Ｐ−１の全アミノ酸配列と完全に一致した。
Ｐ−２はＰ−１のＣ末端２残基のアミン酸が欠失した
ものである。従って、５）−（１）で用いた５′末端領
域に対応するオリゴヌクレオチドと、Ｐ−２をコード
する塩基配列の３′末端領域に対応する塩基配列と相補
的な配列を有するオリゴヌクレオチド（５′−GAAGTGCT
CACATCGCAGAC−３′）をプライマーとして用いて５）の
（１）〜（２）と同様の操作を行うことによりＰ−２の
全領域をコードするDNA断片のクローニングを行うこと
ができる。
ものである。従って、５）−（１）で用いた５′末端領
域に対応するオリゴヌクレオチドと、Ｐ−２をコード
する塩基配列の３′末端領域に対応する塩基配列と相補
的な配列を有するオリゴヌクレオチド（５′−GAAGTGCT
CACATCGCAGAC−３′）をプライマーとして用いて５）の
（１）〜（２）と同様の操作を行うことによりＰ−２の
全領域をコードするDNA断片のクローニングを行うこと
ができる。
産業上の利用分野 以上に詳述したように、本発明により、白血病や子宮
頸癌などの治療剤として期待される新規な腫瘍細胞増殖
阻害因子をコードするDNA断片が提供される。このDNA断
片を、例えば大腸菌での発現用ベクター中に導入して大
腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養すること
によって該腫瘍細胞増殖阻害因子を大量に製造すること
が可能である。従って本発明のDNA断片は、組換えDNA法
による腫瘍細胞増殖阻害因子の工業的に有利な製造法を
可能にするものである。
頸癌などの治療剤として期待される新規な腫瘍細胞増殖
阻害因子をコードするDNA断片が提供される。このDNA断
片を、例えば大腸菌での発現用ベクター中に導入して大
腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を培養すること
によって該腫瘍細胞増殖阻害因子を大量に製造すること
が可能である。従って本発明のDNA断片は、組換えDNA法
による腫瘍細胞増殖阻害因子の工業的に有利な製造法を
可能にするものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正 製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 平４−211698（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/28 C07K 14/525 A61K 38/19 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】下記式（１）に示す塩基配列を有する腫瘍
細胞増殖阻害因子をコードするDNA断片： （式中、ＸはTTC TTT CTA又はTTCを表わす）。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32192991 | 1991-12-05 | ||
| JP3-321929 | 1991-12-05 | ||
| PCT/JP1992/001580 WO1993011233A1 (en) | 1991-12-05 | 1992-12-03 | Dna fragment which codes for tumor cell proliferation inhibiting factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2784264B2 true JP2784264B2 (ja) | 1998-08-06 |
Family
ID=18137997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5510007A Expired - Fee Related JP2784264B2 (ja) | 1991-12-05 | 1992-12-03 | 腫瘍細胞増殖阻害因子をコードするｄｎａ断片 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0617122B1 (ja) |
| JP (1) | JP2784264B2 (ja) |
| KR (1) | KR100239335B1 (ja) |
| AT (1) | ATE177146T1 (ja) |
| AU (1) | AU666689B2 (ja) |
| CA (1) | CA2124941C (ja) |
| DE (1) | DE69228559T2 (ja) |
| ES (1) | ES2130185T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US8294552B2 (en) * | 2001-07-10 | 2012-10-23 | Xatra Fund Mx, Llc | Facial scan biometrics on a payment device |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675285A (en) * | 1984-09-19 | 1987-06-23 | Genetics Institute, Inc. | Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein |
| JP2784272B2 (ja) * | 1990-06-06 | 1998-08-06 | 大正製薬株式会社 | 腫瘍細胞増殖阻害因子 |
| US5281520A (en) * | 1990-09-12 | 1994-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing acyloxyacyl hydrolase |
-
1992
- 1992-12-03 AT AT92924873T patent/ATE177146T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-12-03 WO PCT/JP1992/001580 patent/WO1993011233A1/ja active IP Right Grant
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- 1992-12-03 US US08/244,309 patent/US5523391A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-03 ES ES92924873T patent/ES2130185T3/es not_active Expired - Lifetime
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| WO1993011233A1 (en) | 1993-06-10 |
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| EP0617122A1 (en) | 1994-09-28 |
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| CA2124941C (en) | 2002-07-23 |
| US5523391A (en) | 1996-06-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |