JP2729882B2

JP2729882B2 - 微生物を用いるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法

Info

Publication number: JP2729882B2
Application number: JP4268959A
Authority: JP
Inventors: 太郎鈴木; 泰男浅田; 豊常盤
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1992-10-07
Filing date: 1992-10-07
Publication date: 1998-03-18
Anticipated expiration: 2013-03-18
Also published as: JPH07170989A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、藍藻の培養液から有機
酸および（または）アルコールを取得し、この有機酸お
よび（または）アルコールを炭素源としてポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸を蓄積しうる微生物を培養するポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術および発明の課題】ポリ−β−ヒドロキシ酪
酸（以下ＰＨＢと記す）は、微生物が菌体内に炭素源あ
るいはエネルギー源として生産・蓄積するバイオポリマ
ーであり、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂とし
て、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面で
の応用が期待される物質である。

【０００３】ＰＨＢを微生物菌体内で蓄積させる方法
は、これまでに種々提案されてきた（例えば、特開昭５
９−２２０１９２、特開昭６４−２７４８３および特開
平１−２２２７８８の各公報参照）。しかしながら、こ
れらの何れの場合も資化性炭素源として有機炭素源を必
要としている。

【０００４】また、特殊な微生物を利用して有機炭素源
を必要としないでＰＨＢを製造する方法も提案されてい
る。例えば、Journal of Fermentation and Bioenginee
ringVol.69,No.3,170-174(1990)には、微生物としてア
ルカリゲネス・ユウトロファス (Alcaligenes eutrophu
s)を用い、炭素源として二酸化炭素を用いてＰＨＢを製
造する方法が記載している。しかし、この方法では、Ｐ
ＨＢ生産に二酸化炭素と同時に還元物質であるＨ₂が必
須となっている。

【０００５】また、Journal of Bacteriology,Vol.172,
No.5,2791-2792(1990)には、藍藻類のスピルリナ（Spir
ulina)は光合成を行うことにより、有機炭素源もＨ₂等
の還元物質も必要としないでＰＨＢを蓄積することが可
能であることが記載されている。しかし、この方法では
ＰＨＢ含有率は極めて低く、実用化は期待できない。

【０００６】本発明の課題は、上記のような実情から、
有機炭素源やＨ₂等の還元物質を用いる必要がなく、微
生物の培養によりＰＨＢを効率的に生産する方法を提供
する点にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、藍藻を光照射下で、炭酸
ガス、重炭酸金属塩などの無機炭素源を用いて培養し、
その培養物を暗嫌気条件下で培養することにより培養液
から有機酸および（または）アルコールを取得し、この
有機酸および（または）アルコールを炭素源として用い
てＰＨＢを蓄積しうる微生物を培養することにより、該
菌体内にＰＨＢを効率的に蓄積させることができること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明によれば、藍藻を光照射
下で、炭素源として無機炭素源を用いて培養し、ついで
その培養物を暗嫌気条件下で培養することにより、培養
物から有機酸および（または）アルコールを取得し、得
られた有機酸および（または）アルコールを炭素源とし
て用いてポリ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積しうる微生物
を培養することにより、該菌体内にポリ−β−ヒドロキ
シ酪酸を蓄積させ、菌体からポリ−β−ヒドロキシ酪酸
を採取する、微生物を用いるポリ−β−ヒドロキシ酪酸
の製造方法が提供せられる。

【０００９】まず、藍藻の培養による有機酸および（ま
たは）アルコールの生成工程について説明する。

【００１０】Ｉａ）藍藻を光照射下で無機炭素源を用
いて培養するに当たり、使用する藍藻は、暗嫌気条件下
で培養液中に有機酸および（または）アルコールを放出
する藍藻であればいかなるものでもよい。好適に用いら
れる藍藻としては、例えばスピルリナ・プラテンシス
（Spirulina platensis ）財団法人地球・人間環境フ
ォーラム（以下ＧＥＦと記す）寄託NIES-39 、スピルリ
ナ・プラテンシス（Spirulina platensis ）ＧＥＦ寄託
NIES-46 、オシラトリア・リムネチカ（Oscillatoria l
imnetica）ＧＥＦ寄託NIES-36 、ミクロシスティス・ア
エルギノーサ（Microcystis aeruginosa) ＧＥＦ寄託NI
ES-44 、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Microcys
tis aeruginosa) ＧＥＦ寄託NIES-87 、ノストック・コ
ミューン（Nostoc commune）ＧＥＦ寄託NIES-24 および
シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elonga
tus ）微工研寄託ＦＥＲMP-12393などが例示される。

【００１１】上述した藍藻は独立栄養微生物であるた
め、光照射下で培養する段階で、ＮａＨＣＯ₃、Ｋ₂Ｈ
ＰＯ₄、ＮａＮＯ₃、Ｋ₂ＳＯ₄、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ
₄、ＣａＣｌ₂等の無機塩類のみを含む水溶液培地でよ
く生育し、従属栄養微生物を培養する時のように、グル
コース、ペプトン、酵母エキス等の有機添加物を培地に
加える必要はない。

【００１２】炭素源としては、無機炭素源のみを用い
る。無機炭素源の代表例は、二酸化炭素、重炭酸塩等で
ある。

【００１３】培養液としては、使用する菌株に応じて、
例えば、ＳＯＴ培地（表１）、ＭＡ培地（表２）、ＭＤ
Ｍ培地（表３）、ＢＧ−１１培地（表４）等を適宜選ん
で使用することができる。

【００１４】藍藻の培養は、光照射下で行ういわゆる明
所培養である。この明所培養の照度は、たとえば、１０
０〜１００００ルックス、好ましくは５００〜３０００
ルックスである。

【００１５】また、光照射下での培養段階では、通気攪
拌培養を行うことも好ましい。培養時間、培養温度、ｐ
Ｈ等の培養条件は、使用する菌株に応じて有機酸および
（または）アルコールの生産量が最大になるように適宜
設定される。一般に、培養時間は３時間以上、培養温度
は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５５℃、培養液のｐ
Ｈは６〜１１、好ましくは７〜９が望ましい。

【００１６】Ｉｂ）つぎに、暗嫌気条件下での藍藻の
培養は、例えば下記のような操作で行われる。すなわ
ち、上述のように光照射下で培養した藍藻菌体を培養液
から分離し、得られた藍藻菌体を別の培養液に接種し、
これを嫌気状態下で暗所培養する。

【００１７】藍藻菌体を培養液から分離する手段は、濾
過、遠心分離等である。分離した藍藻菌体を接種する別
の培養液は、トリス−塩酸塩緩衝液、塩酸塩緩衝液、リ
ン酸塩緩衝液等である。これらの緩衝液のｐＨは６〜１
１、好ましくは７〜１０である。嫌気状態は、培養容器
内の空気を窒素ガス、ヘリウムガス等の不活性ガスで置
換することにより確保される。振盪培養器等を用いて攪
拌しながら培養を行うことも好ましい。培養時間、培養
温度等の培養条件は、使用する菌株に応じて有機酸およ
びアルコールの生産量が最大になるように適宜設定され
る。一般に、培養時間は５〜２０時間、培養温度は２０
〜６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、光を遮断し
て暗所培養を行う。

【００１８】こうして、藍藻の培養によって培養液中
に、蟻酸、酢酸、乳酸等の低級有機酸、またはエタノー
ル等のアルコール、または有機酸とアルコールの両者が
生成される。有機酸および（または）アルコールは培養
液から採取してもよいが、そのまま培養液中の溶液の形
態でつぎの工程に使用してもよい。

【００１９】有機酸およびアルコールの同定、培養液中
の濃度の測定は、例えば高速液体クロマトグラフィ、ガ
スクロマトグラフィ等を用いた手法によって行われる。
有機酸および（または）アルコールを培養液から採取
し、精製するには、一般に有機化合物の採取、精製に用
いられる手法を採用することができる。

【００２０】つぎに、有機酸および（または）アルコー
ルを炭素源として用い、ＰＨＢを蓄積しうる微生物を培
養する工程について説明する。

【００２１】IIａ）この培養工程では、有機酸および
（または）アルコールを含有した培養液に、ＰＨＢを蓄
積しうる微生物を増殖可能にする種々の無機成分を添加
し、該微生物がＰＨＢを蓄積する培養条件で培養を行
う。

【００２２】培養液中の有機酸および（または）アルコ
ールの濃度の下限は、使用する微生物がＰＨＢを蓄積し
うる濃度であればよく、上限は微生物の培養が阻害され
ない濃度であればよい。

【００２３】添加する無機成分としては、例えば、カル
シウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、
コバルト塩、ニッケル塩、クロム塩、ほう素化合物等が
適宜選択される。ＰＨＢを蓄積しうる微生物は、ＰＨＢ
の菌体内蓄積能を有する微生物であれば特に制限はない
が、実用上は、アルカリゲネス・ユウトロファス（Alca
ligenes eutrophus ）ATCC17699 、アルカリゲネス・フ
ェカリス（Alcaligenes faecalis）ATCC8750、ロドスピ
リルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum ）ATCC2590
3 、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter spha
eroides ）ATCC17023 等が用いられる。培養時間、培養
温度、ｐＨ等の培養条件は、使用する微生物に応じて微
生物がＰＨＢを蓄積する量が最大になるように適宜設定
される。一般に、培養時間は３〜９６時間、好ましくは
８〜４８時間、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２
５〜３５℃であり、ｐＨは６〜１１、好ましくは７〜１
０である。このような条件下でそれぞれの菌株に応じ
て、好気的にあるいは嫌気的に培養を行う。また、光合
成微生物を用いて効率を高めるには、明所培養を行うこ
とも好ましい。この明所培養における照度は、たとえ
ば、１００〜１００００ルックス、好ましくは５００〜
３０００ルックスである。振盪培養器等を用いて攪拌し
ながら培養を行うこともある。

【００２４】IIb ）こうして菌体内に蓄積されたＰＨ
Ｂを菌体から採取するには、例えば下記のような公知の
処理操作が採取される。すなわち、培養液を濾過、遠心
分離等の個液分離手段で菌体を分離し、得られた菌体か
ら、もしくは必要に応じて超音波処理などで破壊された
菌体からＰＨＢを抽出する。抽出物は必要に応じて公知
の処理方法で精製される。抽出溶媒としては、例えば、
クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化
炭化水素が好ましい。

【００２５】ＰＨＢの同定、培養液中の濃度の測定は、
必要に応じてＰＨＢをモノマーに加水分解した後、例え
ば高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ等
を用いた手法によって行われる。

【００２６】

【実施例】つぎに、本発明の実施例を幾つか挙げ、本発
明を具体的に説明する。

【００２７】実施例１Ｉ）スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensi
s ）ＧＥＦ寄託NIES-39の湿菌体１００ｍｇをＳＯＴ培
地（表１）の培養液に接種し、温度３０℃で１２００ル
ックスの光照射下１０日間培養を行った。その際、培養
液に空気を供給し、通気攪拌培養を行った。

【００２８】次に、培養液を濾紙を用いて濾過すること
により湿菌体約３ｇを得た。得られた湿菌体を５０ｍＬ
の三角フラスコ中のｐＨ８の２０ｍＭリン酸緩衝液３０
ｍＬに接種した。口にゴム栓を施して三角フラスコを密
閉した後、注射針を用いて窒素ガスを供給しフラスコ内
部を窒素ガスで置換することにより、嫌気状態を確保し
た。その後、振盪培養器を用いて攪拌しながら光を遮断
して１０時間、３０℃で培養を行った。その結果、蟻酸
２．４ｍＭ、酢酸９．７ｍＭ、エタノール６．２ｍＭ、
乳酸０．５ｍＭを含む培養液が得られた。濃度の測定は
ガスクロマトグラフフィ法により行った。

【００２９】II) この培養液３０ｍＬに表５に示す無
機成分を添加してなるｐＨ７の培養液に、ロドスピリル
ム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum)ATCC25903 の湿
菌体１ｍｇを植菌し、温度３０℃で１３００Ｌｕｘの光
照射下、２４時間培養した。培養後の菌体によるＰＨＢ
生産量は４．２ｍｇであった。

【００３０】ＰＨＢの採取および定量は、下記のように
行った。すなわち、凍結乾燥した菌体をスクリューキャ
ップ付き１０ｍＬ試験管に入れ、クロロホルム２ｍＬ
と、３wt% 硫酸−メタノール溶液２ｍＬを加え、口に栓
をして１００℃で３．５時間反応を行った。この反応に
より、ＰＨＢをモノマーに加水分解した後、水１ｍＬを
加えて激しく１０分間振盪し、２層に分離した下層のク
ロロホルム層を取り出し、このクロロホルム層をガスク
ロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪酸メチルのピ
ークの面積からＰＨＢ量を計算して求めた。

【００３１】実施例２ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum ）
ATCC25903 の代わりにロドバクター・スフェロイデス
（Rhodobacter sphaeroides ）ATCC17023 を用いたこと
以外は、実施例１と全く同様に操作を行った。その結
果、培養後の菌体によるＰＨＢ生産量は１．２ｍｇであ
った。

【００３２】実施例３スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis ）Ｇ
ＥＦ寄託NIES-39 の代わりにノストック・コミューン
（Nostoc commune) ＧＥＦ寄託NIES-24 を用い、ＳＯＴ
培地の代わりにＭＤＭ培地（表３）を用いたこと以外
は、実施例１と全く同様に操作を行った。その結果、蟻
酸０．２ｍＭ、酢酸２．５ｍＭ、乳酸１．５ｍＭを含む
培養液が得られた。また、ロドスピリルム・ルブラム
（Rhodospirillum rubrum ）ATCC25903 からのＰＨＢ生
産量は０．９ｍｇであった。

【００３３】実施例４スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis ）Ｇ
ＥＦ寄託NIES-39 の代わりにシネココッカス・エロンガ
タス（Synechococcus elongatus ）微工研寄託FERM P-1
2393を用い、ＳＯＴ培地の代わりにＢＧ−１１培地（表
４）を用いたこと以外は、実施例１と全く同様に操作を
行った。その結果、蟻酸３．４ｍＭ、酢酸５．６ｍＭ、
エタノール２．８ｍＭ、乳酸４．６ｍＭを含む培養液が
得られた。また、ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospi
rillum rubrum ）ATCC25903 からのＰＨＢ生産量は１．
９ｍｇであった。

【００３４】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【００３５】

【発明の効果】本発明により、光合成を行うため無機物
のみを炭素源として、有機炭素源もしくはＨ₂等の還元
物質を必要とすることなく、微生物から効率的にＰＨＢ
を生産することができる。

フロントページの続き (72)発明者浅田泰男茨城県つくば市春日１丁目102番506号 (72)発明者常盤豊茨城県土浦市桜ケ丘46−12 審査官村上騎見高 (56)参考文献ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＢＩＯＥＮＧ．，ＶＯＬ．28，ＮＯ．７（1986）, Ｐ．1014−1023

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】藍藻を光照射下で、炭素源として無機炭
素源を用いて培養し、その培養物をさらに暗嫌気条件下
で培養することにより、有機酸および（または）アルコ
ールを取得し、得られた有機酸および（または）アルコールを炭素源と
して用いてポリ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積しうる微生
物を培養することにより、該菌体内にポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸を蓄積させ、菌体からポリ−β−ヒドロキシ酪
酸を採取する、微生物を用いるポリ−β−ヒドロキシ酪
酸の製造方法。