JP2727098B2

JP2727098B2 - カルジオジラチン／ａｎｆペプチドのリン酸化誘導体

Info

Publication number: JP2727098B2
Application number: JP63509039A
Authority: JP
Inventors: ホルゼマン、ヴォルフ‐ゲオルグ; ガーゲルマン、ミヒャエル; ホック、ディーター
Original assignee: BORUFUUGEORUGU HORUZEMAN; FUAAMA BITSUSENDORUFU PEPUTAIDO GmbH
Current assignee: BORUFUUGEORUGU HORUZEMAN; FUAAMA BITSUSENDORUFU PEPUTAIDO GmbH
Priority date: 1987-11-07
Filing date: 1988-11-04
Publication date: 1998-03-11
Anticipated expiration: 2013-03-11
Also published as: DE3878254D1; JPH03500776A; EP0386076A1; ATE85346T1; EP0386076B1; WO1989004324A1; DE3737917A1; AU2789089A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、カルジオジラチン／心房のナトリウム排泄
性因子ANFペプチド・プレ−プロ−ガンマ−hANaP（CDD
−ANF）または少なくともアルファ−hANaPのアミノ酸配
列を有するその断片の誘導体に関する。さらに本発明
は、上記誘導体の製造方法およびその用途にも関する。

カルジオジラチン、アルファ−hANaPおよび他のナト
リウム排泄性／利尿性活性ペプチドは、共通のプレカー
サーペプチド、すなわち151個のアミノ酸を含むプレ−
プロ−ガンマ−hANaPから誘導される。

このアミノ酸配列の１〜25の位置は、シグナルペプチ
ドであるとみなされる。これに対して、25〜151の位置
は、ガンマ−hANaPを表わし、とりわけ、そのＣ末端の
領域（124〜151の位置）は、アルファ−hANaPと一致す
る（Oikawa,S.他、“Nature"309（1984）,724−726;お
よびNakayama,K.他、“Nature"310（198）,699−701参
照）。ただし、以下において採用するアミノ酸の番号
は、シグナルペプチドを除外して考える。よって、ガン
マ−hANaPのアミノ酸配列としては１〜126の位置が妥当
であり、アルファ−hANaPのアミノ酸配列としては99〜1
26の位置（CDD−28）が妥当である。

さらに、ガンマ−hANaPのペプチド断片は、39〜126の
位置のアミノ酸を含む断片（CDD−88）および95〜126の
位置のアミノ酸を含む断片（CDD−32）として説明され
ている。後者は、そのＮ末端においてCDD−28に加えて
４個のアミノ酸を有し、ウロジラチンとも呼ばれてい
る。血圧の調整活動は、これらの心房のペプチドによっ
て、ナトリウム排泄、利尿および平滑筋系の弛緩が刺激
されることによる。西独国特許公開公報3443257号（DE
−OS 34 43 257）には、心不全、尿乏性腎不全、血圧調
整異常および腹水等の様々の疾患のための医薬としてア
ルファ−hANaPが説明されている。

ペプチド、そして特に内因性のペプチドは、インビボ
において酵素反応により分解する。よって、治療上有効
な個々の投与量で長期間投与することは可能ではあるが
困難を伴なう。そして、特にペプチドの分解を補償する
ために高い投与量を採用することは、内因性の伝達物質
の高い生理活性のため、多くの場合適用できない。それ
ゆえ、可能な限り低い生物的活性を有するが、内因性の
許容できる変性反応により生理的に活性を有する形態に
変換される生物的に活性を有するペプチドの形態が提供
されることが望まれている。

カルジオジラチンまたは心房のナトリウム排泄性因子
の重要性のため、その活性を有するペプチドおよび／ま
たはペプチド断片を定性的に検出し、定量的に決定する
目的で、対応する生理的な活性を有する化合物の実際の
瞬間的な濃度を安全に分析決定するための方法を利用す
ることが重要である。

酵素や受容体のような生体分子の作用の調節に関して
知られている生化学的な原理は、リン酸化および脱リン
酸化反応に基づくものである。

リッテンハウス・ジェイ（Rittenhouse,J.）他は、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）261号（1986）7607〜7610頁におい
て、ｃ−AMP依存性のプロテインキナーゼを使用するア
ルファ−hANaPのarg¹⁰¹−Tyr−¹²⁶のアミノ酸配列を有
する合成ペプチドのリン酸化について説明している。上
記プロテインキナーゼは、認識配列としてArg−Arg−Ｘ
−Ser−を要求する。そこには、合成ペプチドがK_m＝0.5
μＭのミカエリス定数を有することも記述されている。
インビトロにおいてSer¹⁰⁴の位置でリン酸化された合成
ペプチドは、生理的な活性を有する。この活性は、平滑
筋系の培養血管細胞におけるNa/K/Clの共輸送を賦活す
ることで証明される。一方、ブロッシュ・ケイ・ディー
（Bloch,K.D.）他は、ジャーナル・オブ・バイオロジー
・アンド・ケミストリー（J.Biol.Chem.）262号（198
7）9956〜9961頁において、ラットの新生児の心臓細胞
の一次培養中で、プロ−ANF（ガンマ−hANaP）のトリプ
シン分解により得られた断片（ガンマ−hANaPの26〜67
の部分）のセリンの部分が、インビボでリン酸化されて
いるとの実験を報告している。これらの発見は、ガンマ
−hANaPが、アルファ−hANaPとして除かれる領域内では
リン酸化されないことを支持する。従って、合成リン酸
化ペプチド、Arg¹⁰¹−Tyr¹²⁶およびGly⁹⁶−Tyr¹²⁶（Rit
tenhouse他参照）は、天然の生理的な重要性を有しては
いない。

本発明の目的は、ガンマーhANaPの活性の基本配列、
すなわちアルファ−hANaP（98〜126の位置）を含むペプ
チドを、容易に定性的かつ定量的に決定できる化学物質
を提供することである。本発明の目的は、出発物質が全
くあるいはほとんど静物的活性を有していないのに対し
て、内因性の変性により活性物質が形成される化学物質
を提供することでもある。さらに、本発明の目的は、ナ
トリウム排泄性の心房のペプチドを定性的かつ定量的に
決定できる方法を提供することでもある。

上記の目的は、下記Ｉで表される化合物により達成さ
れた。

上記式Ｉにおいて、Ｘはリン酸エステル基またはチオ
リン酸エステル基であり、Ｒは−Ｈ残基またはガンマ−
hANaPの１〜98、39〜98または95〜98の位置のアミノ酸
配列からのペプチド断片のいずれかである。

本発明に従う式Ｉの化合物は、式IIの対応する出発物
質を各ヌクレオチドと酵素的にリン酸化反応させること
により、特に穏やかな方法で得ることができる。

好ましい態様に従うと、酵素として、ｃ−AMP依存性
のプロテインキナーゼまたはその触媒サブユニット、そ
してヌクレオチドとして、アデノシン５′−三リン酸
（ATP）またはアデノシン５′（ガンマ−チオ）三リン
酸を、それ自身は公知の方法で式IIの化合物と反応させ
る。放射性標識されたヌクレオチドも同様に使用するこ
とができる。そして、³²P、あるいは（ガンマ−チオ）
ヌクレオチドを使用する場合、³⁵Sを含むヌクレオチド
が用いられる。このように、少なくともアルファ−hANa
P（CDD−28）のアミノ酸配列を含む、相当する放射性標
識されたペプチドが得られる。

本発明に従い、当業者にとり公知のメリフィールド
（Merrifield）の合成法によって、適当なリン酸化成
分、例えば、リン酸化セリンを放射性標識された形態あ
るいは標識されない形態で用いて、合成することはもち
ろん可能である。

上記ペプチド断片Ｒは、１〜98（ガンマ−hANaPのペ
プチドに相当する）、39〜98（CDD−88に相当する）お
よび95〜98（ウロジラチンとも呼CDD−32に相当する）
のアミノ酸を含む。

プレ−プロ−ガンマ−hANaPから誘導されるナトリウ
ム排泄性ペプチドを定性的および／または定量的に決定
するための分析方法は、対応するように放射性標識され
たペプチドを用いて実施することができる。本発明に従
い、これらのペプチドは、少なくともアルファ−hANaP
（CDD−28）配列を有するものが、直接検出される。プ
レ−プロ−ガンマ−hANaPの生理的活性ペプチドの分析
的な検出は、体液中、例えば血清中および尿中の平均的
な水準から逸脱した濃度を用いて、ある手段の臨床用写
真を識別するため、診断において重要である。この目的
のため、体液中に存在する式IIを有するペプチドを、例
えば、ｃ−AMP依存性のプロテインキナーゼまたはその
触媒サブユニットと、放射性標識したヌクレオチド、例
えば［ガンマ−³²P］ATPあるいは³⁵Sまたは³²Pで標識さ
れたアデノシン５′（ガンマ−チオ）三リン酸の存在下
で反応させることができる。この態様において、少なく
ともプレ−プロ−ガンマ−hANaPのCDD−28配列を含む全
ての生理的活性断片が、標識される。分析方法を実施す
るために、体液または組織のホモジネートからなるサン
プルが、適切な方法、例えば前者の場合、非極性マトリ
ックス中を通過させることにより調製される。

次いで、サンプルは、ｃ−AMP依存性プロテインキナ
ーゼのような酵素の存在下で、適当なヌクレオチドを用
いてリン酸化する。標識された断片またはプレ−プロ−
ガンマ−hANaPそのものは、PAGE電気泳動法、引き続い
てオートラジオグラフィーを実施する尿素ゲル電気泳動
法、シンチレーション測定、薄層クロマトグラフィー、
高圧電気泳動法、等電点電気泳動あるいはHPLC（高性能
液体クロマトグラフィー）のような公知の方法を用いて
検出される。しかしながら、標識されたリン酸化ペプチ
ドを利用することで分離された断片の特徴を、他の生化
学的または免疫学的な方法（モノクローン性抗体）を使
用して、さらに詳細に検出することも基本的に可能であ
る。

ｃ−AMP依存性のプロテインキナーゼまたはその触媒
サブユニットのような酵素を比較的多量に添加するこ
と、および／またはインキュベーションの期間をそれぞ
れ延長すること、あるいは高度に特異的な放射性活性を
有するヌクレオチドを使用することのいずれかにより、
検出の限界を下げ、検出の感度を増加させることが、そ
れぞれ可能である。物質としてのペプチドには、かなり
の量の経時的な損失がある。例えば、アルファ−hANaP/
CDD−28は、ガラス表面の物質に吸着することによる損
失がある。この損失は、ポリエチレンから反応容器を使
用することで、大幅に減少されるであろう。ｃ−AMP依
存性のリン酸化は、ペプチド物質の生物的活性を大幅に
変化させる可能性がある。よって、バイオアッセイを用
いる物質の決定を追加する場合は、共基質として「ガン
マ−³²P］ATPのみを、相当する標識されてないATPが存
在しない状態で使用することが勧められる。

本発明の好ましい態様において、式Ｉの化合物を使用
する結果として、プレ−プロ−ガンマ−hANaPと同様
に、アルファ−hANaP（CDD−28）、CDD−32、CDD−88お
よびガンマ−hANaPが定性的および／または定量的に決
定される。

本発明に従う式Ｉの化合物の誘導体は、それらの生理
的活性により医薬として使用することができる。式Ｉに
従う化合物が相当する実際の活性物質よりも劣る生理的
効果を有する場合は、本発明に従う化合物は、貯蔵形態
の一種として、式IIに従う実際の活性物質を保存するた
めに用いることができる。式Ｉの化合物は、加水分解酵
素、特にリン酸エステル分解酵素（フォスファターゼ）
の作用により、インビボにて連続的にそれらの活性状態
に転換される。

生物学的に、式Ｉに従うリン酸化ペプチドは、臨床、
診断および治療において非常に重要であるという効果が
示されている。とりわけ、式Ｉに従う化合物は、以下の
適用領域において適切に使用することができる。すなわ
ち、ある種の血管床の分化した血管拡張、高血圧の診断
および治療、人工心臓を移植した患者の代わりに血液量
および血液の電解質の同時調節、皮膚の疾患、特に発汗
障害、心臓血管系のショック、腎臓および副腎皮質の障
害を伴なう皮膚の疾患、胃腸管の疾患、特に運動性障害
および腸閉塞、脳水腫および緑内障の治療、狭心症のよ
うな痙攣性の冠動脈炎の治療、急性腎不全の治療、ネフ
ローゼおよび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不
全、腹水、全身水腫、肺水腫、脳水腫、一次および二次
のリンパ水腫、水胸症、緑内障、大静脈狭窄症、低たん
ばく血症、視覚障害、本能性かつ腎性高血圧、悪性高血
圧、妊娠中の高血圧のようなEPH妊娠中毒症、妊娠中の
ネフローゼ、大脳のナトリウム貯蔵症候群、レーノー病
のような血管痙攣、腹部アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈
性心臓疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ビン
グ−ホートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域におけ
る血液循環障害、レニン−アンギオテンシン系の障害、
一次および二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫
瘍、褐色細胞腫、バーター症候群、シュヴァルツ−バー
ター症候群、膵不全、無発汗症のような一次汗腺不全、
排尿および排便障害、下垂体腺前葉の不順、カテコール
増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心
臓血管系の副作用、心臓移植、PEEP呼吸（積極末端呼気
圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術における支援
治療、人工心臓の移植後の合併症の治療等である。

式Ｉに従う化合物は、複数の疾患、例えば、高血圧／
心不全を伴なう痛風、あるいは高血圧／心不全を伴なう
糖尿病の治療のための利尿剤として、さらにはセファレ
スポリン、アミノグリコシドまたは抗凝血剤と組み合わ
せて利尿剤として用いることもできる。さらに、腎臓移
植後の急性腎不全の予防、シクロスポリン（cyclospori
n）シスプラチン（cisplatin）およびイフォスファミド
（ifosfamid）のような腎毒素物質の治療、手術後、高
血圧の発症後あるいは腎臓の機能障害の患者への対照中
膜の実施後の急性腎不全の予防にも、上記の化合物は適
している。本発明に従う薬剤を、内皮の変化の鑑別診断
における診断薬として使用することもできる。

従って、本発明の主題は、以上述べたような診断およ
び治療方法に使用するため、式Ｉに従うリン酸化化合物
を含む医薬でもある。この医薬は従来の静脈、経口また
は非経口の投与形態とすることができる。例えば、錠
剤、座剤、糖剤、液剤、スプレー、吸入用の処方、さら
にマイクロカプセル化等である。さらに、必要に応じて
賦形剤および／または希釈剤と共に用いてもよい。本発
明に従う医薬は、遅延投与形態として処方することもで
きる。活性物質の使用量は、１投与量単位当たり5ng乃
至50μｇであることが好ましい。

さらに、本発明によれば、免疫学的検定法の原則に従
い式Ｉに従う化合物に対する抗体を用いて、この化合物
に特異的な検出方法が提供される。式Ｉに従う化合物に
対する抗体を用いると、体液中においてカルジオジラチ
ンが高度に特異的かつ非常に鋭敏に検出されることが明
らかとなった。上記の特異的なカルジオジラチンの検出
方法は、脳脊髄液中のカルジオジラチンまたはその断片
を特異的に検出することにより、神経系統の疾患の診断
に使用することができる。

本発明に従う医薬の使用においては、活性物質として
式Ｉの化合物を含む。この化合物の作用の有益な特異性
およびその低毒性により、本発明に従う医薬は様々な疾
患の治療に処方される。この疾患には、前末期または末
期の腎不全、レニン−アンギオテンシン−アルドステロ
ン系の機能不全、バソプレッシンの分泌不全、液状壊死
（腹水、緑内障、脳水腫、水胸症等の第三体腔の問題）
のような電解質と水の平衡の不全、さらにリンパ水腫、
EPH妊娠中毒症、大静脈狭窄症、あるいは腎臓疾患、腸
症および肝臓疾患等の低たんぱく血症を伴なう疾患のよ
うな溢血の蓄積量の増加を伴なう疾患が含まれる。

本発明に従う医薬は、その血管拡張性により、血管収
縮の増大を伴なう全ての疾患の治療に用いることができ
る。従って、本発明に従う化合物を含む医薬は、レーノ
ー病、心房隔壁筋の痙攣等の血管の痙攣および視覚障害
等の治療に使用することができる。式Ｉの化合物は、さ
らに他の血管の疾患の治療、例えば、冠動脈性心臓疾
患、腹部アンギナ、血管運動性の頭痛、基底椎骨流路領
域における血液循環障害を伴なう脳底動脈性偏頭痛、ビ
ング−ホートン症候群等の治療にも用いることができ
る。

式Ｉで表される化合物を含む本発明に従う医薬は、そ
の血圧低下性により、一次の血圧増加を伴なう全ての疾
患に有効である。すなわち、この医薬は悪性高血圧、妊
娠中の高血圧、高血圧による頭痛、痛風や糖尿病等の他
の疾患を伴なう高血圧に処方される。

本発明に従う医薬は、ナトリウム維持機能、水分維持
機能および血管収縮性ホルモンに対して拮抗性を示す。
これにより本発明の医薬を、一次および二次の高アルド
ステロン症、腎血管性高血圧、レニン分泌性腫瘍、褐色
細胞腫、バーター症候群およびシュヴァルツ−バーター
症候群の治療に用いることが可能である。

式Ｉで表される化合物を含む本発明に従う医薬は、心
臓移植における、または人工心臓に伴なう心不全の治
療、バイパス手術および開心手術におけるPEEP（積極末
端呼気圧）の支援等にも用いることができる。積極末端
呼気圧を伴なう呼吸において、大気圧以上の圧力に対す
る呼気に効果がある。

本発明に従う医薬は、腎臓移植の手術後の急性腎不全
の予防、移植される腎臓の機能を本発明の医薬で前処理
することによる移植腎臓機能の向上にも用いることがで
きる。

式Ｉで表される化合物を含む本発明に従う医薬は、診
断を目的として使用することもできる。その血管拡張性
は内皮と独立しているため、内皮依存性の血管拡張剤と
の比較により、内皮の状態についての所見を作成するこ
とができる。

本発明に従う医薬の用途は、膵臓の分泌の変化および
付随的な利用不全、外分泌膵不全、腸および膀胱の調節
（排尿および排便障害）のような胃腸系にも処方され
る。

皮膚科においても、本発明に従う医薬は無発汗症に対
して使用することができる。精神科においても、本発明
に従う薬剤は、カテコールアミン放出を伴なう精神性の
疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治
療に用いることができる。

これらの効果は、ナノ分子量の範囲の濃度でも認めら
れる。ただし、この薬剤は低毒性および優れた適合性が
あるため、より高濃度で注射または注入しても良い。

式Ｉで表される化合物は、注射または注入用の液剤、
鼻用スプレー、眼用の滴下剤、あるいは以上述べたよう
な投与の場合における遅延投与形態等で医薬の調剤に使
用することができる。

動物の急性毒性試験が示すところによれば、体重当た
り400μg/kgまでの範囲では、従来の（生化学的）対照
パラメーターを用いて検出できる毒性反応は認められな
かった。LD₅₀値は、この物質の毒性が低いため、決定で
きなかった。心臓−循環系、気管支系、肝臓または腎臓
機能、性腺および中枢神経系において、重大な副作用は
全く認められなかった。

以上述べたような疾患の治療における薬理学的な有効
性は、静脈投与における急激な利尿性およびナトリウム
外分泌性の上昇という結果を示すナトリウム排泄効果が
認められたことによる。さらに、式Ｉで表される化合物
は、ノルアドレナリンの血管収縮効果を代償できること
も認められる。

さらにまた、この物質はアンギオテンシンの収縮効果
を阻害することも認められた。これが特に有益な場合と
して、従来の治療方法では対応できない全身水腫を伴な
う深刻な心不全を挙げることができる。血圧調節系およ
びバソプレシン調節系に対する作用も重要であると考え
られる。このため、下垂体後葉の障害およびそれにより
起こる精神性の作用にも適用できる。この物質につい
て、さらに詳細な臨床的研究により、より有益な適用分
野が発見されることも否定できない。

チオリン酸エステル基を含むペプチドの誘導体は、非
常にゆっくりした速度でのみ対応する生理的な活性を有
する等価物に転換するため、本発明の好ましい態様にお
いて特に有利な方法として、チオリン酸エステル基を含
むペプチドを貯蔵形態として使用することができる。

第１図は、リン酸化アルファ−hANaP（CDD−28）およ
びCDD88の溶離パターンを示す。

第２図は、リン酸化されたウシの心房の粗製抽出物の
溶離パターンを示す。第２図において、ｃ−AMP依存性
のプロテインキナーゼの触媒サブユニットを用いてリン
酸化されたCDD−28とCDD−88の部分標本は、TSK−ODS−
120Tカラム（300mm×7.8mmID）上の逆相HPLCを用いて分
離した。使用した溶離剤は、ａ）0.01M塩酸、および
ｂ）80％水性アセトニトリル中における0.01M塩酸であ
った。流速は、1.5ml/分であった。溶媒の勾配は、グラ
フ上に斜めに延びている実線で示されている。光学濃度は、210nm（吸収範囲0.1）で測定された。放射性活性の測定のため、集めた各分画毎に0.5mlを取りカウント
した。

第３図は、非リン酸化アルファ−hANaP（CDD−28）、
CDD−32（ウロジラチン）およびリン酸化アルファ−hAN
aPについて、それぞれ２μｇの分離を示す。サンプルは
混合し、RP−HPLC（逆相HPLC）で分離した。溶離剤は、
緩衝液Ｂとしてアセトニトリル/0.01％塩酸および緩衝
液Ａとして0.01％塩酸の直線勾配からなるものであっ
た。緩衝液Ｂの初期濃度は20％であった。カラムは、緩
衝液Ｂの連続的な添加（0.5％／分）において、0.7ml/
分の流速で展開した。測定したシグナルは230nmにおけ
る吸収であった。これらの条件下で実施した分離におい
て、最初に非リン酸化アルファ−hANaPの溶離が認めら
れ、次いでリン酸化アルフア−hANaP、最後にCDD−32
（ウロジラチン）の溶離が認められた。

第４図は、血管の平滑筋系におけるｃ−AMP依存性リ
ン酸化および非リン酸化 CDD−28の効果を示す。ウナギの大動脈の筋肉切片を、
まずノルエピネフリン（10^-7M）の溶液の作用で収縮さ
せた。一定条件に調整後、ペプチドを加えた（矢印の位
置）。最終濃度は0.3乃至0.6×10^-9Mであった。実線
は、非リン酸化CDD−28の存在下における典型的な弛緩
挙動を示す。破線は、それと対象的なリン酸化CDD−28
を適用後の挙動を示している。このような条件下では、
わずかな弛緩のみが検出できる。

第５図は、リン酸化CDD−28とCDD−88および非リン酸
化CDD−28とCDD−88についての多くの実験のまとめを表
している。双方の場合において、濃度は０。３乃至0.6
×10^-9Mであった。グラフ上では、弛緩の相対速度、お
よび非リン酸化（無地の長方形）とリン酸化（陰を付け
た長方形）CDD−28およびCDD−88ペプチドの標準誤差が
示されている（長方形の上の数字は、実施した実験の回
数を意味する）。

第６図は、非リン酸化、リン酸化、そして再度非リン
酸化アルファ−hANaP（CDD−28）の段階的な添加に対す
るウサギの大動脈の筋肉切片の応答を示す。それぞれの
化合物は、試験浴中の最終濃度が0.3×10^-9Mとなるよう
に添加した。前収縮した筋肉切片は、非リン酸化アルフ
ァ−hANaPの添加により、ある程度弛緩した。しかしな
がら、リン酸化アルファ−hANaP｛CDD〜｝の添加は、
ほとんど効果を示さない。非リン酸化アルファhANaPを
さらに添加した直後から、筋肉弛緩は継続する。

第７図は、リン酸化および非リン酸化CDD−32（ANF/C
DD−95−126;ウロジラチン）の相対的な弛緩能力を示
す。リン酸化CDD−32が有している弛緩能力は、対応す
る濃度において、非リン酸化体の能力よりも顕著に低い
ことが明らかである。比較の目的で第７図では、アルフ
ァ−hANaPの組み合わせが対応する割合も示されてい
る。そこから明らかなように、リン酸化化合物は、互い
に対応して、それぞれ非リン酸化状態の元の化合物より
も低い活性を有している。

本発明は、以下の各例によりさらに詳細に説明する。

第１例尿および血清サンプル（それぞれ2ml）をSEP−PAKカ
プセル（Ｃ−18カートリッジ、ウォターズ社（Waters A
ssoc.）、ミリポア）を通して前精製する。次いで、カ
プセルの活性化（2mlのトリエチルアミン−メタノー
ル、20:80）を、2ml容量のサンプルに活性化溶液2mlを
加えた溶離剤を適用して実施する。

リン酸化の反応バッチ： 100μの反応バッチには、50mMのMOPS緩衝液（Ｎ−
モルホリノ−３−プロパンスルホン酸）、pH6.8、10mM
の酢酸マグネシウム、ウシの心臓（10μ）から得られ
た約12.7μｇのｃ−AMP依存性のプロテインキナーゼ（E
C2.7.1.37）の触媒サブユニット、血清または尿サンプ
ルが含まれる。リン酸化反応は、10μ中の2mMのATPと
［ガンマ−³²P］ATP（10μCi/ATPの20ナノモル）を加
え、混合することにより開始される。インキュベーショ
ンは30℃で５分間である。触媒サブユニットの濃度は、
リン酸化が５乃至40分の範囲で実質的に終了するように
選択することができる。

リン酸化反応は液体窒素中の急激な冷凍で終了させ
る。

リン酸化した反応バッチの分離は、東洋ソーダ社のTS
K−ODS−120Tカラム（300mm×7.8mmID）を経由するHPLC
を用いて実施する。0.01Nの塩酸中のアセトニトリルの
直線勾配（０％から80％まで）を溶離剤として使用す
る。吸収は210nmで測定する。分画の収集量は1.5mlであ
る。³²Pの取り込みは、センチレーションカウンター
（１分）の内部で2mlの水と共に0.5mlの部分標本中で測
定する。

対照ペプチドとして、合成により調製されたカルジオ
ジラチン−28（CDD−28、ビッセンドルフ・ペプタイド
社）および−32（バケム（Bachem）社、さらにリン酸化
のため｛ホック・ディー（Hock,D.）他、ジャーナル・
オブ・クロマトグラフィー（J.Chromatograpy）397号
（1987）347〜353頁参照｝ウシの心臓の心房から得られ
たCDD−88を使用した。

第２例逆相HPLCを用いてリン酸化ペプチドを、以下のように
さらに精製することができる。

リン酸化後得られた反応混合物を、RPカラム（ミクロ
ポア、C₁₈、4.6mm×30mm;応用バイオシステム社（Compa
ny Applied Biosystem））に充填する。装置としては、
応用バイオシステム社から供給されたような分析用HPLC
が適切な装置として用いることができる。この装置に
は、２つのポンプ、1400A溶媒補充システム、491ダイナ
ミックミキサー／インジェクター（0.2mlサンプルルー
プ）および1783吸着検出集電器が付属している。カラム
は、最初に01％TFA（トリフルオロ酢酸）を含む緩衝液
Ａで平衡状態とし、次いで、アセトニトリル濃度（緩衝
液B:70％アセトニトリル/0.09％TFA）を増加させて展開
する。流速は、1ml/分であり、吸収は220nmで測定す
る。クロマトグラフィーは室温で実施する。リン酸化お
よび非リン酸化ペプチドは、等圧の条件下でアセトニト
リル濃度が24％の均一なピークとして溶離する。リン酸
化ペプチドを含む分画を集め、冷凍乾燥し、そして−70
℃で保存する。

第３例カチオン交換HPLCによるリン酸化ペプチドの精製リン酸化ペプチド、例えばアルファ−hANaPの分離
は、カチオン交換カラム（4mm×50mm）を用いてLKB社の
HPLC装置により実施する。この装置には、２つのポン
プ、2152コントローラー、2151可変波長モニターおよび
レオジン（Reodyne）インジェクター（1mlサンプルルー
プ）が付属している。カラムは、リン酸水素二ナトリウ
ム（pH5）10mM中の塩化ナトリウムを用いて直線勾配で
0.7ml/分の流速で展開する。吸収は230nmで測定する。
クロマトグラフィーは室温で実施する。塩化ナトリウム
の初期濃度は100mMである。リン酸化アルファ−hANaPを
含む分画は、含まれる放射性活性を測定することで決定
する。相当する分画を集め、冷凍乾燥し、そして−70℃
で保存する。サンプルは、さらに逆相HPLCを用いること
で脱塩することができる。

第４例生物活性試験ニュージーランドのウサギの大動脈を調製した。筋肉
の緊張を、生理的食塩水を含む有機浴中で筋肉切片を用
いて測定した。切片は、ノルピネフリンの10^-6M溶液で
前処理し、充分に弛緩させた。分析のため、ノルエピネ
フリンの10^-7Mで、さらに緊縮を誘導した。一定の緊縮
条件に達した後、ペプチドを適用した。

第５例筋肉弛緩におけるリン酸化アルファ−hANaPの効果第１例に従うATPと触媒サブユニットの存在下で、第
１例に従いアルファ−hANaPをリン酸化した。対照のた
め、非リン酸化アルファhANaPを、ATPが存在しない以外
は同様の条件でインキュベートした。リン酸化および非
リン酸化アルファ−hANaPを、それらの存在量として最
終濃度が0.3×10^-9Mとなるように、前緊縮したウサギの
大動脈の筋肉切片に加えた。非リン酸化ペプチドの影響
下で、大動脈筋肉切片が部分的に弛緩するのに対して、
リン酸化アルファ−hANaPは無視できる程度の効果しか
生じない。非リン酸化、リン酸化、そして再度非リン酸
化ペプチドを段階的に添加すると、リン酸化アルファ−
hANaPと比較して非リン酸化アルファ−hANaPのみが、顕
著な弛緩効果を示すことが明らかに認められる。添加順
序を逆にして、リン酸化、非リン酸化、そして再度リン
酸化アルファ−hANaPとすると、対応する逆の順序の弛
緩効果が観察される、第６例第１例に従いCDD−32（ウロジラチン）をリン酸化
し、その生物的活性を第５例と同様に研究した。非リン
酸化状態におけるウロジラチンは、より高濃度において
さらに強い弛緩機能を伴うという投与量依存性の弛緩活
性を示す。対応する濃度におけるリン酸化ウロジラチン
の投与による弛緩は、明らかに弱いものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホルゼマン、ヴォルフ‐ゲオルグドイツ連邦共和国、ハイデルベルグ、１、デー‐6900、インラングギャバン、93 (72)発明者ガーゲルマン、ミヒャエルドイツ連邦共和国、シュリースハイム、デー‐6905、ヴォルムザーシュトラーセ、９ (72)発明者ホック、ディータードイツ連邦共和国、ネッカルビッショフスハイムデー‐6924、ヴァインベルクシュトラーセ、14

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉで表される化合物。上記式Ｉにおいて、Ｘはリン酸エステル基またはチオリ
ン酸エステル基であり、Ｒは−Ｈ残基またはガンマ−hA
NaPの１〜98、39〜98または95〜98の位置のアミノ酸配
列からのペプチド断片のいずれかである。
【請求項２】リン酸エステル基が同位元素³²Pを含むこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に従う化合物。
【請求項３】チオリン酸エステル基が同位元素³²P、³⁵S
または双方の放射性活性同位元素を含むことを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に従う化合物。
【請求項４】式IIの化合物をヌクレオチドまたは（ガン
マ−チオ）ヌクレオチドの存在下で酵素的に反応させる
ことによる第１項に従う化合物を調製する方法。上記式IIにおいて、Ｒは特許請求の範囲第１項に記載し
たものと同様の定義を有する。
【請求項５】酵素がｃ−AMP依存性のプロテインキナー
ゼまたはその触媒サブユニットであり、そしてヌクレオ
チドがATPまたは（ガンマ−チオ）ATPであることを特徴
とする特許請求の範囲第４項に従う方法。
【請求項６】ATPが³²Pが標識されているか、（ガンマ−
チオ）ATPが³²Pおよび／または³⁵Sで標識されているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第４項または第５項のい
ずれかの項に従う方法。
【請求項７】メリフィールドの方法に従い化学的な全合
成を実施する特許請求の範囲第１項に従う化合物の調製
方法。
【請求項８】特許請求の範囲第１項に従う化合物を生理
的に有効な投与量、および任意に生理的に許容できる担
体を含む、高血圧、血管および心臓の疾患、発汗障害を
含む皮膚の疾患、心臓血管系のショック、腎臓および副
腎皮質の障害、胃腸管の疾患、特に運動性障害、脳水
腫、緑内障、痙攣性の冠動脈炎および神経性疾患の診断
および治療；急性腎不全、ネフローゼおよび腎炎の症候
群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹水、全身水腫、肺
水腫、脳水腫、一次および二次のリンパ水腫、水胸症、
緑内障、大静脈狭窄症、低たんばく血症、聴覚障害、本
能性かつ腎性高血圧、悪性高血圧、妊娠中の高血圧のよ
うなEPH妊娠中毒症、妊娠中のネフローゼ、大脳のナト
リウム貯蔵症候群、レーノー病のような血管痙攣、腹部
アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈性心臓疾患、血管運動性
の頭痛、高血圧性の頭痛、ビング−ホートン片偏頭痛症
候群、基底椎骨流路領域における血液循環障害、レニン
−アンギオテンシン系の障害、一次および二次の高アル
ドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バータ
ー症候群、シュヴァルツ−バーター症候群、膵不全、無
発汗症のような一次汗腺不全、排尿および排便障害、下
垂体腺前葉の不順、カテコール増加を伴なう精神性の疾
患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治
療；心臓移植、PEEP呼吸（積極末端呼気圧を伴なう人工
呼吸）およびバイパス手術における支援治療；人工心臓
移植後の合併症の治療；複数の疾患、例えば、高血圧／
心不全を伴なう痛風および高血圧／心不全を伴なう糖尿
病の治療のための利尿；セファレスポリン、アミノグリ
コシドまたは抗凝血剤と組み合わせた利尿腎臓移植後の
急性腎不全の予防、およびシクロスポリン、シスプラチ
ンおよび／またはイフォスファミドのような腎毒素物質
の治療；あるいは手術後、高血圧の発症後あるいは腎臓
の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急性腎不全の
予防のための医薬。
【請求項９】特許請求の範囲第１項の化合物を含む、内
皮の変化の鑑別診断のための診断薬。
【請求項１０】Ｘが（ガンマ−チオ）ATP基であり、少
なくともCDD−28のアミノ酸配列を含む生物的活性断片
を遅延放出する特許請求の範囲第８項に従う医薬または
第９項に従う診断薬。
【請求項１１】１投与量単位当たり、特許請求の範囲第
１項に従う化合物を10ng乃至50μｇ含むことを特徴とす
る特許請求の範囲第８項に従う医薬または第９項に従う
診断薬。
【請求項１２】特許請求の範囲第１項に従う化合物を活
性成分として含むことを特徴とする血管拡張効果を有す
る特許請求の範囲第８項に従う医薬または第９項に従う
診断薬。
【請求項１３】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、急性腎不全、ネフローゼお
よび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹
水、全身水腫、肺水腫、脳水腫、一次および二次のリン
パ水腫、水胸症、緑内障、大静脈狭窄症、低たんぱく血
症、聴覚障害、本能性かつ腎性高血圧、悪性高血圧、妊
娠中の高血圧のようなEPH妊娠中毒症、妊娠中のネフロ
ーゼ、大脳のナトリウム貯蔵症候群、レーノー病のよう
な血管痙攣、腹部アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈性心臓
疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ビング−ホ
ートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域における血液
循環障害、レニン−アンギオテンシン系の障害、一次お
よび二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐
色細胞腫、バーター症候群、シュヴァルツ−バーター症
候群、膵不全、無発汗症のような一次汗腺不全、排尿お
よび排便障害、下垂体腺前葉の不順、カテコール増加を
伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管
系の副作用の治療のための注入用または注射用溶液。
【請求項１４】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、心臓移植、PEEP呼吸（積極
末端呼気圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術にお
ける支援治療のための注入用または注射用溶液。
【請求項１５】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、人工心臓移植後の合併症の
治療のための注入用または注射用溶液。
【請求項１６】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、複数の疾患、例えば、高血
圧／心不全を伴なう痛風および高血圧／心不全を伴なう
糖尿病の治療のための利尿剤。
【請求項１７】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物と、セファレスポリン、アミノグリ
コシドまたは抗凝血剤とを組み合わせた利尿剤。
【請求項１８】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、腎臓移植後の急性腎不全の
予防、およびシクロスポリン、シスプラチンおよび／ま
たはイフォスファミドのような腎毒素物質の治療のため
の注入用または注射用溶液。
【請求項１９】生理的に有効な投与量の特許請求の範囲
第１項に従う化合物を含む、手術後、高血圧の発症後あ
るいは腎臓の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急
性腎不全の予防のための注入用または注射用溶液。
【請求項２０】特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
れかの項に従う化合物を使用することを特徴とする、血
清、尿、組織ホモジネートのような体液中における、プ
レ−プロ−ガンマ−hANaPおよび／またはプレ−プロ−
ガンマ−hANaPのCDD−28、CDD−32および／またはCDD−
88断片の少なくとも一つを含む断片の含有を定性的およ
び／または定量的に測定する方法。
【請求項２１】特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
れかの項に従う化合物を含む、内皮の変化の鑑別診断の
ための診断薬。