JP2722228B2 - 気相過酸化水素による生活細胞またはその近傍の表面の汚染除去方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般的に汚染除去方法、より詳細には気相過
酸化水素を用いて行なわれる汚染除去方法に関する。 微生物による汚染は、組織培養を行なっている人が現
在遭遇する最も厄介な問題の一つである。汚染は時間と
金を浪費し、貴重な組織培養物の損失をもたらす。汚染
の問題に加えて、植物組織培養者は、培養に先立つ植物
細胞の“殺菌”の実施から生ずる問題に直面する。一般
に、植物組織自体を傷つける危険なしで植物組織を殺菌
する便利な方法は存在しない。 培養物が収容されている組織培養恒温器の汚染除去、
すなわち、その位置のままの汚染除去方法は全く知られ
ていない。なぜならば、既知の汚染除去方法、たとえば
水蒸気またはエチレンオキサイドによる処理は培養物を
破壊してしまうからである。 このように、その位置のままでの汚染除去をする方法
が知られていないので、組織培養汚染の機会を少なくす
るための種々の技術が用いられて来た。恒温器は、培養
内容物上に垂直な空気層流を供給するように工夫され
た。この空気層流は、空気に運ばれた汚染物が組織培養
物と接触することを妨げる。ある製造業者は、適当な条
件下で細菌殺菌性および菌類殺菌性を有する、銅壁を備
えた恒温器を開発した。 しかしながら、かかる恒温器は空気中、棚上、または
種々の組織培養容器中の汚染物を破壊することができな
い。かっては、抗生物質が汚染を防止するために組織培
養物に加えられた。しかしながら、細胞の遺伝的または
代謝変化が起ることがあり、現在では可能な限り、増殖
媒体中に抗生物質の添加を避けることが望ましい。従っ
て培養物が収容されている組織培養恒温器の汚染除去が
可能な方法に対する要望が存在する。 植物細胞培養者らは、現在、培養実験に先立って植物
細胞を殺菌するのに幼稚な方法を使用することが要求さ
れている。現在の実務には、試料を希釈クロロックス
（Chlorox）（１％）、グルタルアルデヒド、またはエ
タノール中に30分も浸漬することが含まれる。多くの植
物細胞は、かかる殺菌剤にさらすことができない。しか
しながら、これに代るものが存在しない。試行錯誤が純
粋な培養物を得るのに用いられた一般的ルールである。
従って、培養実験に先立って植物細胞培養者が植物細胞
を殺菌することができる方法に対する要望が存在する。 気相過酸化水素は低濃度であっても汚染除去および殺
菌に効果的であることが知られている。気相過酸化水素
は、過去においてかかる目的に使用されたが、かかる使
用には生活細胞は含まれていない。たとえば、カルター
（Coulter）の“パン製造物の保存”と題する米国特許
第2,193,622号、ムーア（Moore）らの“過酸化水素蒸気
殺菌法”と題する米国特許第4,169,123号、およびホル
ストロム（Forstrom）らの“冷ガス殺菌法”と題する米
国特許第4,169,124号を参照。 これら各特許においては、気相過酸化水素が殺菌に用
いられているが、生きている組織を含む環境においては
用いられていない。 液相過酸化水素は、汚染除去の目的ではなく、酸素付
加反応を増大させる目的で、固定された全細胞について
は用いられた。Applied Microbiology and Biotochnolo
gy,22巻,383〜388頁記載の、ホルスト（Holst）による
“固定された酸化性グルコノバクター（Gluconobacte
r）のための酸素源としての過酸化水素”を参照。この
方法の大きな欠点は、液相における過酸化水素濃度（34
mg/l）が、過酸化水素の酸素および水への酵素による分
解に先立って、大部分の細胞を破壊することである。明
らかに、その場における便利な汚染除去方法および培養
に先立って植物細胞を殺菌する方法に対する要望が存在
する。 本発明の概要 本発明は、予め決定された領域内の汚染微生物を選択
的に死滅させて、その場における汚染除去を可能にする
方法である。 気相過酸化水素が、実質的な圧力変化や予め決定され
た領域における過酸化水素の凝縮を防止しながら、予め
決定された過酸化水素濃度に十分到達するような割合い
で、予め決定された領域内に導入される。 過酸化水素の予め決定された濃度が、望ましくない汚
染微生物を死滅させるのに十分な時間の間、保持され
る。 気相過酸化水素は次いで、その時間の経過の後に、か
つ汚染微生物以外の生存細胞が過酸化水素によって被害
を受ける以前にその領域から除去される。 本発明の方法は、恒温器やオートクレーブのような容
器と共に用いることができる。 本発明の方法は、容器内の空気中の汚染微生物の死滅
と共に、組織培養物を収容する容器の表面を含む封じら
れた領域の全ての外部表面の汚染除去または殺菌を可能
にする。しかしながら、暴露時間および過酸化水素濃度
は組織培養物が気相過酸化水素によって影響を受けない
ように制御される。 本発明の一態様によれば、生存細胞が容器内に収容さ
れ、各容器はその開口に曲折した通路を有するように準
備される。過酸化水素が上記の曲折した通路を通過して
生存細胞に到着するには不十分な時間を有するようにす
る。予め決定された濃度の気相過酸化水素およびその
間、予め決定された濃度が保持される時間がモニターさ
れる。 本発明の他の態様によれば、生存細胞が容器内に保持
され、各容器はその開口に濾過器を有するように準備さ
れる。次いで、過酸化水素がその濾過器を通って生存細
胞に到着するには不十分な時間を持つように、予め決定
された濃度の気相過酸化水素、およびその間、予め決定
された濃度が保持される時間がモニターされる。 本発明の更に他の態様によれば、生存細胞が開放容器
中に保持される。 過酸化水素が生存細胞を害することなしに消毒できる
ように、予め決定された濃度の気相過酸化水素、および
その間、予め決定された濃度が保持される時間がモニタ
ーされる。 予め決定された領域内の汚染微生物を選択的に死滅さ
せるための本発明の方法は、下記の工程から成る。 予め決定された領域を経て空気流を確立する。 流れる空気の温度を測定する。 気相過酸化水素の予め決定された領域への注入の最高
割合いを、測定された温度にもとづいて計算する。 過酸化水素水溶液源の濃度を確かめる。 計算された気相過酸化水素の最高注入割合いよりも大
きくない、望ましい注入割合いを達成するのに必要な液
相過酸化水素の滴数割合いまたは流量を計算する。 過酸化水素水溶液を計算された割合いで蒸発装置中に
供給する。この供給割合いを、予め決定された気相過酸
化水素濃度を確立し、かつ汚染微生物を死滅させるのに
十分であり、生存細胞を損なうのには不十分な時間の
間、予め決定された濃度を保持するのに十分な時間の
間、保持する。 過酸化水素水溶液の気化装置への供給を中止した後
も、予め決定された領域から気相過酸化水素を除去する
のに十分な時間の間、予め決定された領域を通る空気流
を保持する。 本発明は、恒温器やオートクレーブを含む種々のタイ
プの容器と共に使用できることが期待される。 本発明は、容器内側表面、組織培養物を収容した容器
の外側表面、および組織培養物が容器内に収容されてい
る容器内の空間部分の殺菌または消毒が可能である。 このような汚染が除去された、または消毒された環境
の維持によって、実質的に組織培養物の汚染の可能性が
減少する。 また、本発明は、植物組織培養物の調整と組合わせて
使用することも考えられる。 或る種の植物組織培養物は、試料を殺菌するのには十
分であるが、試料に何らかの有害な影響を与えるには不
十分な気相過酸化水素濃度にさらすことができる。 本発明は従って、現在使用されている殺菌技術の代替
物を提供する。本発明のこれらの、および他の用途、な
らびに利点は、後述する好ましい態様の記述から明らか
になるであろう。 図面の簡単な説明 本発明を明確に理解し、容易に実施するために、好ま
しい態様を実施例にのみもとづき、添付図面を参考にし
て記述する。 ここで、第１図は本発明のその場における汚染除去方
法の実施が可能な装置を有する恒温器を示す。 第２図は、本発明の方法の実施に含まれる工程を説明
するフローチャートを示す。 第３図は時間の函数としての気相過酸化水素濃度を示
すグラフであり、第４図は本発明の効果の試験に用いら
れた恒温器を説明する。 好ましい態様の記述 第１図に、本発明の方法を実施できる装置12を備えた
恒温器10を示す。破線でかこまれた装置12は、第１図に
おいて恒温器10とは分離した構成要素として説明されて
いるが、装置12から成る要素は恒温器10内に組み込むこ
とができることが確認されるべきである。 装置12は説明の目的のためにのみ恒温器10と別体で示
されている。装置12は、オートクレーブと共に、または
何れか他の閉じられた、予め決定された領域と共に使用
することができる。 恒温器10は、導入管14および排出管16を有する既存の
慣用的なタイプである。導入管14には、部屋の空気、ま
たは恒温器が用いられる目的のために必要な他のガスが
導入される。 排出管16は、恒温器10からガスを排出するために用い
られる。装置12は、この例では部屋の空気を受け入れる
ための導入管18を有する。装置12は、恒温器10の導入管
14と連結された排出管20を有する。 導入管18はサブミクロン空気濾過器24を経てポンプ22
に連結される。ポンプ22の代りに、排出管16に吸引可能
な装置を位置させることもできる。ポンプ22の出口は気
化室26に連結される。気化室26は、流量計28を経て排出
管20に連結される。気化室26は、また、バルブ32を経て
液相過酸化水素源30に連結される。 気化室26は温度センサ34および熱源38によって加熱さ
れた気化グリッド36を有する。熱源38は、また、空気流
を加熱、または予熱することができる。気化室26は下記
のように機能する。気化グリッド36が熱源38によって予
め決定された温度に保持される。予め決定された温度は
液相過酸化水素が気化グリッド36と接触して気化せしめ
られるように十分に高い。バルブ32は、液相過酸化水素
源30、たとえば過酸化水素タンクからの液相過酸化水素
の流れをコントロールする。バルブ32の開閉を制御する
ことによって、気化グリッド36上に運搬される液相過酸
化水素の量が制御される。気化グリッド36の温度は、温
度センサ34の使用によって制御される。バルブ32を制御
する場合と同様に、気化グリッド36の温度を制御するた
めの温度センサ34の使用は、第２図の記述と関連して後
述する。 恒温器10の排出管16は、排出ガスから気相過酸化水素
を除去するための過酸化水素濾過器39を有する。 装置12は手動で制御されるか、またはマイクロプロセ
ッサ42の制御下に置かれる。マイクロプロセッサ42は、
気化グリッド36の温度を表わす温度センサ34からの入力
信号T_V、矢印46によって表わされる空気流の温度を表わ
す温度センサ40からの入力信号T_S、および矢印46によっ
て表わされる空気流を表わす流量計28からの入力信号Ｆ
を受ける。 これらの入力信号に加えて、マイクロプロセッサ42は
入力装置44から入力データを受ける。入力データは、恒
温器10の容積、容器30内の液相過酸化水素の濃度、望ま
しい殺菌または汚染除去時間、および恒温器10内に保持
される気相過酸化水素の望ましい濃度を含む。 もしも装置12が恒温器10内に作られている場合には、
オペレータが種々の予めセットされた操作条件の間から
選ぶことができる予めプログラムされたメモリがマイク
ロプロセッサ42に提供される。 もしも装置12が、種々の異なる恒温器10および他の容
器と共に使用することができるポータブル装置の場合に
は、入力装置44は目的とする情報を入力するためのキイ
パッドの形状をとることができる。目的とする情報をマ
イクロプロセッサ42にインプットする方法は、この分野
における当業者の技術的範囲であり、これについて更に
記述する必要はないと考える。 装置12は、組織培養が恒温器10内で行なわれている間
に、本発明の汚染除去方法を実施できるようにする。 第１図において、恒温器10内に三つの棚48,49および5
0を有することが示されている。棚49には二つの容器52,
54が置かれている。容器52は、その中に組織培養物53を
有する開放容器である。容器54は、固くねじ締めしない
場合にはガスに曲折した通路を与える、ねじ締めキャッ
プ55を有する密封容器である。容器54は組織培養物56を
収容している。棚50には、過酸化水素を吸収するが基質
ガスは容器57を出入りさせるメンブレン58をその口に有
する密封容器57が置かれている。容器57は組織培養物59
を収容する。 開放型容器52は植物細胞または過酸化水素におかされ
ない他の細胞の汚染除去に関して使用できると考えられ
る。曲折したガス通路を有する密封容器54およびメンブ
レン58を有する密封容器57は、動物細胞または過酸化水
素から保護されることを必要とする他の細胞の培養に関
して使用できる。明らかなように、他のタイプの容器も
本発明と共に使用することができる。 第２図にもどって、本発明を実施するための工程を説
明する。 第２図に説明された工程は、マイクロプロセッサ42に
よって行なわれるか、または手動によって行なわれる。
第２図において、工程60では気化グリッド36の温度を表
わす温度信号T_Vが読まれる。決定工程62では、気化グリ
ッド36の温度が十分か否かについての決定がなされる。
もしも温度が十分でなければ、工程64において加熱器38
にスイッチが入れられ、液相過酸化水素の即時気化に十
分になるまで温度T_Vが連続的にモニタされる。 気化グリッド36の温度が目的とする水準に達したなら
ば、工程66で熱源38が切られる。工程68でポンプが始動
され、気化室26を経て恒温器10内に矢印46で示される空
気流が確立される。 ポンプ22の始動後に、気化室26を通る空気流を表わす
空気流量計28によって生じた信号Ｆが工程70で読まれ
る。 空気流を表わす信号を提供する流量計を設置する代り
に、ポンプ22の製造者によって与えられるデータから良
く知られた式に従って空気流量を計算することもでき
る。 空気流を読んだ後に、または計算した後に、工程72に
おいて温度センサ40から空気流の温度T_Sが読まれる。空
気流の流量Ｆおよび温度T_Sにもとづいて、恒温器10内に
導入されうる過酸化水素の理論的最高割合いが工程74で
計算される。この計算は、気相過酸化水素の凝縮をもた
らす量で、または恒温器10内の圧力を上昇させる量で過
酸化水素を恒温器10内に導入すべきではないとの制限下
で行なわれる。気相過酸化水素が凝縮するようになる
と、さらされた組織培養物が被害を受け、汚染除去を一
様に達成することができない。もしも恒温器内の圧力が
上昇せしめられると、過酸化水素の浸透防止を意図した
障害を過酸化水素蒸気が通過するようになる。従って、
過酸化水素の導入量は、気相過酸化水素が凝縮せず、恒
温器内の圧力が上昇しないような量であることが望まし
い。 下記の式は、過酸化水素導入の理論的最高割合いの計
算に用いられる。 m/t＝0.2427PYF/Ts ……（１） ここで、ｍ＝注入されたH₂O₂量（グラム） ｔ＝時間（分） Ｐ＝H₂O₂‐H₂O溶液の分圧（torr） Ｙ＝H₂O₂‐H₂O蒸気中のH₂O₂のモル分率 Ｆ＝空気流量（ft³／時間） T_S＝空気流の温度（゜K） 式１において、項目ＰおよびＹの値はマイクロプロセ
ッサ42内に蓄えられた適切な表から調べることができ
る。例えば、シャンブ（Shumb）らの「Hydrogen Peroxi
de」、第226および第227頁、1955年に見出される項目Ｐ
およびＹの値の表を参照。この代りに、システムの既知
の条件に従ってインプット装置44を経て項目ＰおよびＹ
の値をインプットすることができる。項目ＦおよびT_Sの
値いは、流量計28および温度センサ40から夫々読まれ
る。しかる後に、過酸化水素の、単位時間当り注入され
る理論最高量が式１を使って計算される。 もしも供給源30に蓄えられた過酸化水素が100％純粋
であるならば、供給源30からの過酸化水素水溶液の流量
は工程74で計算された最高理論量に等しい。しかしなが
ら、通常過酸化水素は著しく低い濃度で貯えられるの
で、過酸化水素水溶液の流量は、工程74で計算された注
入割合いを達成するのに典型的にはより高くなければな
らない。たとえば、もしも過酸化水素水溶液が30％の濃
度を有するならば、工程74において計算された割合いを
達成するのに、過酸化水素水溶液の流量は工程74におい
て計算された最高割合いの約３倍でなければならない。 工程76では、供給源30に貯えられた液相過酸化水素の
濃度が貯えられたメモリから調べられるか、または入力
装置44から読まれる。 工程74において計算された単位時間当りの過酸化水素
の理論的最高量は、過酸化水素供給源30内に収容された
過酸化水素の濃度にもとづいて、目的とする注入割合い
を達成するのに必要な液相過酸化水素の流量または滴下
量に工程78において変換される。 式１が、空気流温度T_Sが37℃として解かれ、結果が30
％過酸化水素水溶液にもとづいて目的とする注入量を達
成するのに必要な要求される液相過酸化水素流量に変換
された。下記に示された第１表は、この結果を示す。第
１表は、30％過酸化水素水溶液の種々の量が、恒温器内
への理論最高過酸化水素注入量、すなわち、気相過酸化
水素が凝縮せず、かつ恒温器内の圧力が上昇しない注入
量を達成する空気流量によって気化グリッド36に運ばれ
ることを示す。 第１表に示した過酸化水素水溶液の流量は、4.6mg/lの
気相過酸化水素濃度を生ずる。このことは、空気流量を
l/分に変換し、その数値を過酸化水素流量で割ることに
よって証明される。 第２表に示した値は、空気流の五つの異なる流量に対
する30％過酸化水素水溶液の最高流量を示す。すなわ
ち、バルブ32はマイクロプロセッサ42の制御下でほぼ操
作されて工程74における計算結果および工程78における
変換にもとづいて目的とする液相過酸化水素流が与えら
れる。 明らかなように、もしも過酸化水素水溶液がより高濃
度であるならば、同一の過酸化水素注入量を達成するた
めの液相流量はより低下するであろう。反対に、もしも
過酸化水素水溶液が低濃度であるならば、同一過酸化水
素注入量を達成する液相流量はより増加するであろう。 工程79では、目的とする気相過酸化水素濃度、すなわ
ち部屋の飽和度、および恒温器10の容積が読まれる。こ
の情報はマイクロプロセッサのメモリに貯えられるか、
またはインプット装置44を経てイップットされる。気相
過酸化水素が目的とする濃度に達するのに必要な時間
は、下記式を用いて工程80で計算される。 ｔ＝（−V/F）1n（１−Ct/Cin） ……（２） ここで、ｔ＝目的とする濃度に到達するまでの時間 Ｖ＝恒温器の容積 Ｆ＝流量 Ct＝時間ｔにおける室内のH₂O₂濃度 Cin＝空気流中のH₂O₂濃度 ｔ＝０、Ct＝０としたとき、室内に流れる唯一の空気
は、一定流量Ｆおよび一定濃度Cinにおける過酸化水素
を含んでおり、室内における完全な混合が直ちに起る。
（もしも完全な混合を妨げる条件が自然に生ずるなら
ば、恒温器10内の完全な混合を確実にするための、ファ
ンまたはブァッフルのような装置を用いることができ
る。） これらの推定をして、同一の温度T_S（37℃）および上
記と同一の液相過酸化水素濃度（30％）を用いる三つの
異なる大きさの部屋について式（２）を解いた。 種々の空気流量Ｆを用いる三つの異なる部屋容積につ
いて、気相過酸化水素が12.5％、25％、50％および90％
の部屋飽和に到達するのに要した時間を下記第２表、第
３表及び第４表に示す。 過酸化水素蒸気の注入量を計算するために用いた温度
よりも僅かに低い温度である表面上への気相過酸化水素
の望ましくない凝縮を防ぐために、部分飽和の水準、す
なわち12.5％、25％、50％および90％を用いた。第１表
から第４表に表われるデータは、下記のようにして用い
ることができる。第１表から、空気流量が10ft³/hrと推
定すれば、30％過酸化水素水溶液の最高流量は72.4mg/
分となる。６ft³部屋および目的とする部屋飽和50％と
すれば、第３表から我々は空気流量10ft³/hrにおいて、
部屋が50％飽和に到達するのに0.42時間を要することを
知る。これが工程80において計算された時間範囲であ
る。もちろん、空気流の温度T_Sおよび過酸化水素水溶液
の濃度のようなパラメータが一定に保たれれば、第１表
〜第４表に類似した表を作成し、マイクロプロセッサの
メモリに貯えることができる。その場合には、計算工程
は空気流量Ｆを測定し、貯えられた表から適切な値を取
り出すように縮少することができる。 この操作方法は、この分野の当業者にとって良く知ら
れたことと考えられるので更に議論する必要はないと考
える。 工程82においては、部屋が目的とする％の飽和に保持
される時間範囲が読み取られる。この時間範囲は、ユー
ザによってインプットされ、死滅させられる汚染微生物
の性質、もしも過酸化水素にさらされるならば、生存細
胞の過酸化水素に対する許容性、曲折した通路を有する
容器内に保持された生存細胞に過酸化水素蒸気が到着す
るに要する推定時間、または過酸化水素フィルタを有す
る容器内に収容された生存細胞に過酸化水素蒸気が到着
するに要する時間を含む種々の要因に依存する。 過酸化水素および／または遊離ヒドロキシル基（−O
H）誘導体の組織培養物中の存在は、染色分体の被害に
関係することが示されている。British Journal of Can
cer、52、pp583〜590（1985）記載の、ジョーンズ（Jon
es）らの“Influence of Added Catalase on Chromosom
e Stability and Neoplastic Transformation of Mouse
Cells in Culture"を参照。 本発明は、制御された条件下で極めて低い水準の過酸
化水素蒸気を使用し、これによって蒸気が組織培養媒体
中に浸透したり、または蒸気が凝縮し次いで問題の媒体
と混合することを防止することを目的とする。過酸化水
素蒸気は、汚染除去された、または殺菌された表面を確
実にするのに十分な時間長さでのみ容器中に保持され
る。しかる後に、過酸化水素蒸気は部屋の空気または殺
菌され、湿度が与えられた空気で流し出される。もしも
培養フラスコの曲折した通路が過酸化水素蒸気に対する
防壁を保持するのに適切でないならば、過酸化水素フィ
ルタ、または基体ガスのみがフラスコを出入できる吸着
通路が取付けられたフラスコが用いられるべきである。
低酸化剤濃度および低い温度を用いるので、本発明によ
って、耐過酸化水素蒸気植物細胞が殺菌／汚染除去され
る。 多数の異なるタイプの植物細胞が過酸化水素蒸気に対
して耐性があることが最終的に証明されるであろうと予
測される。このことは、ある種の植物は、植物細胞が代
謝過程において接触する過酸化水素を一般には処理する
事実に一部もとづいている。加えて、植物細胞は硬い壁
を有することが知られている。結局、植物の殺菌に現在
用いられているはげしい薬剤に植物細胞が耐えることが
できるならば、殺菌のために必要な低濃度の気相過酸化
水素にごく僅かさらされることに耐えるであろうと予測
される。 しかしながら予防策として、細胞が過酸化水素蒸気に
さらされるであろうときは、もしも露出時間を論ずる文
献が入手できないならば、安全な露出時間を決定するた
めの個々の培養物の実験が望ましい。 安全な露出時間を決定するために用いうる一つの技術
を、本明細書の下記“実験結果”と題する項の試験番号
８および９に示す。 しかしながら、汚染除去または殺菌のためでさえも、
低水準の過酸化水素蒸気のみ（0.5〜10mg/l）が要求さ
れ、かつ本発明の汚染除去方法が低温度方法（室温〜80
℃）なので、本発明の方法は細胞を害せずに表面の、ま
たはほとんど多くの種類の生活細胞の汚染除去または殺
菌に用いられることに注目すべきである。 工程82に読まれた時間は、マイクロプロセッサのメモ
リに貯えられるか、またはユーザによってイップット装
置44を経て入れられる。この時間は、部屋が目的とする
濃度を得るのに要する時間に加えられ、マイクロプロセ
ッサ42のタイマが工程84における全時間に既知の方法に
よってセットされる。 工程86では、マイクロプロセッサ42が工程78において
決定された液相過酸化水素の流量を達成するのに必要な
量のバルブを開く。 バルブ32が開かれた後に、この方法が目的とするよう
に行なわれることを確実にするためにマイクロプロセッ
サ42が種々のプロセス・パラメータを工程88でモニタす
る。 これらのモニタ工程は、気化グリッド36が適切な温度
に保持されることを確実にするために温度T_Vを読むこ
と、空気流の温度を一定に保つことを確実にするために
温度T_Sを読むこと、空気の流量を一定にすることを確実
にするために流量信号Ｆを読むこと、または何れか他の
目的とするモニタ機能の実行を含むことができる。種々
の機能のモニタ中に時として、工程84でセットした時間
範囲が終了したか否かを決定するために、タイマは決定
工程90でチェックされる。もしも時間が経過していない
ならば、マイクロプロセッサは、種々のパラメータのモ
ニタを継続する。もしも時間が経過したならば、工程92
においてバルブ32を閉じる。 工程92においてバルブ32が閉じられると共に、工程94
においてタイマがリセットされる。工程94においてタイ
マに負荷された時間範囲は、その間はポンプ22は作動状
態にあるがバルブ32は閉じられている時間範囲である。
この時間範囲は、過酸化水素蒸気に対する露出水準がほ
ぼ1ppm以下になるまで恒温器10に気相過酸化水素を流出
させるのに十分であるべきである。決定工程96における
マイクロプロセッサは、タイマによって時間範囲が経過
したか否かを決定する。時間範囲が経過したとき、プロ
グラムの終りを表わす工程98においてマイクロプロセッ
サ42はポンプ22を止める。 第３図について云えば、時間の函数としての恒温器10
内の気相過酸化水素濃度を示すプロファイルが説明され
る。空気流量が10ft³/hrとすれば、第１表から気化グリ
ッド上への過酸化水素水溶液の流量は72.4mg/分である
ことを知る。部屋容積を６ft³とすれば、第３表から空
気流量10ft³／時において、目的とする50％の部屋飽和
に達するのに0.42時間（25.2分）かかることを知る。目
的とする部屋飽和に到達した後に、その飽和度は殺菌を
確実にするために20分間保持されると推定される。 しかる後にバルブ32を閉じ、一方、恒温器から気相過
酸化水素を流し出すために10分の間ポンプ22を作動状態
にしておく。 第３図に説明したプロファイルは上述した条件をグラ
フ化した表現である。 第３図において説明したプロファイルは、本発明の方
法が実施される、事実上制限のない方法の一つの例にす
ぎない。部屋が目的とする飽和％に到達するのに要する
時間は、その飽和度において過す時間と同様に、空気流
量、部屋の大きさ、過酸化水素が組織培養物と接触する
のを防ぐのに用いた装置、過酸化水素蒸気に対する組織
培養物の許容性等の要因に依存する。 実験結果 第４図に示したように、本発明の効果を試験するため
に試験室100を設置した。この試験室には、夫々傾斜し
た頸を有する第１と第２の75cm²ポリスチレン製組織培
養フラスコ103および104を取り付けた。これらフラスコ
を蒸留水50mlで満たした。フラスコ103および104のキャ
ップ106および107をきつく締めつけ、次いで気相過酸化
水素のための曲折した通路を提供するために、半分だけ
キャップをゆるめた。水をマイクロ波によって10〜20
秒、ほぼ37℃に予熱した。 フラスコ103は密封したペトリ皿109および開放したペ
トリ皿110を有する。同様に、フラスコ104は密封したペ
トリ皿112および開放したペトリ皿113を有する。ペトリ
皿は夫々直径5cmのガラス皿で10ccの水が入れてある。 試験室は、矢印115によって示される方向に15ft³/hr
の流れで操作した。部屋を約37℃の温度に保持し、一
方、気化器を97℃の温度で操作した。37℃の空気流の温
度T_Sおよび15ft³/hrの空気流Ｆ、および30％過酸化水素
水溶液を用いて、前記第１表から過酸化水素水溶液の流
量が108.6mg/分であることを知った。これは、4.6mg/l
の最高気相過酸化水素濃度をもたらした。 芽胞クーポン（Spore coupons）（Bacillus subtilis
var.niger）を下記の操作によって作成した。アメリカ
ン・ステリライザー・カンパニィ（American Sterilize
r Company）100380GL株〔HS個体数（population）6.7×
10⁹/ml〕から10⁶希釈菌株懸濁液を調整した。この希釈
液を80℃で20分間、熱衝撃した。10⁴希釈液を調整し、
次いで夫々の希釈液から10ミクロリットルを採取し、１
cm²の面積を有する別々のポリスチレン・クーポン上に
置いた。これにより、10²および10⁴の芽胞個体数を有す
るクーポンが得られた。クーポンは使用に先立って一夜
空気乾燥した。 開放ペトリ皿109および113に10²の個体数を有するク
ーポン、10⁴の個体数を有するクーポンを夫々入れ、縫
合ループ（loop）をサイクル中の漂白をモニタするため
に使用した。密封ペトリ皿112および110には、フラスコ
103および104と同様に、前述したように水以外には何も
入れられていない。 試験No.1 最初の試験においては、15分の循環時間を用いた。こ
の15分の循環時間中、ほぼ８〜15分間、過酸化水素蒸気
を生ずるように気化器を用いた。戸を開く前に、部屋に
７分間、空気を通した。 ８分の時間範囲に0.53gの過酸化水素を気化器に供給
した。すなわち、過酸化水素導入量は0.53g/8分、また
は66.25mg/分であった。この実験において空気流中に達
成された最高過酸化水素蒸気濃度は、気相過酸化水素の
縮合を起すことなく、4.6mg/lの量を導入したにもかか
わらず、2.8mg/lであった。 従って、気相過酸化水素の導入割合いは、最高量の61
％であった。試験を行なった後に、四つのペトリ皿中の
二つの皿中の水、および夫々のフラスコ中の水を分析し
て、夫々の容器中の過酸化水素濃度を分析した。この分
析は、525nmの吸収における過酸化水素とキシレノール
・オレンジとの反応を測定することによって分光光度法
により行なった。 結果を下記第５表にまとめた。 ペトリ皿110および113に位置した10²株数を有するク
ーポンおよび10⁴株数を有するクーポンはすべて殺菌さ
れた。 この試験の結果は、フラスコ103および104のような密
封したフラスコは、本発明の方法によればフラスコの外
側の有害なバクテリアを死滅させてその場で殺菌された
外表面を有することができることを明らかに証明する。
恒温器10の全内側表面の有害バクテリアも、またフラス
コ内の組織培養物に有害な影響を与えることなく、恒温
器10内の空気中の汚染物と同様に全て死滅した。 試験No.2 上述した試験を、循環時間30分で再び行なった。30分
の循環時間で、気化器はほぼ22分操作し、８分を空気流
通のために保留した。22分の気化器操作時間中に1.29g
の過酸化水素を導入したので、導入割合いは58.64mg/分
であった。この導入割合いは、飽和における最高割合い
の54％であった。 種々の容器内の水によって吸収された過酸化水素量を
下記第６表に示す。 第６表は、フラスコ103および104内の水に最少量の過
酸化水素が見出されたことを示す。前記実験のように、
四つの試験クーポンは全て完全な殺菌が行なわれたこと
を示した。 試験No.3,4および５ 室内の株接種クーポンを殺菌するのに要した最低接触
時間を決定するために、そして組織培養フラスコ103お
よび104内の水中に溶解する過酸化水素の量を測定する
ことを目的に、追加試験を行なった。 これらの試験は15ft³/hrの流量F₁および37℃の空気流
温度T_Sで行なった。フラスコ103および104は過酸化水素
の流に面した中に置いた。三つの異なる循環時間におけ
る導入割合いを下記第７表に示す。 フラスコ103および104内の水中に溶解した過酸化水素
を下記第８表にまとめた。 全ての循環時間および全てのフラスコ位置において、
芽胞クーポン（10²および10⁴の芽胞数を含む）は殺菌さ
れた。したがって、循環時間が10分と短かくても、過酸
化水素が３分の周期で注入され、93.3mg/分のみが導入
されたときは、フラスコ周辺の範囲の完全な殺菌をもた
らし、一方、フラスコ内の水によって検出可能な過酸化
水素量は吸収されなかった。 試験No.6および７ 芽胞数が10⁶と高いときに芽胞が死滅するか否かを決
定するために二つの追加試験を行なった。前述した試験
を上記の高い芽胞数を有するクーポンを用いて、10分お
よび15分の循環で再び行なった。下記第９表は過酸化水
素供給量を示す。 フラスコ103および104内の水に溶解した過酸化水素量
を下記第10表に示す。 二つの循環時間の夫々では、全ての芽胞クーポンが殺
菌された。従って、循環時間が10分と短かくても、過酸
化水素が３分間注入されれば、フラスコ内の水によって
検出可能な量の過酸化水素が吸収されることなくフラス
コの外側範囲の殺菌がもたらされた。 まとめるならば、行なわれた試験は本発明の方法が組
織培養物を収納する容器の外側、容器の内側表面範囲、
および容器内の空気の殺菌に用いることができるが、一
方、部分的に開放されたフラスコに収容された組織培養
物はそのままの状態である。過酸化水素濃度および循環
時間は、組織培養物に影響を与えず、完全な殺菌を確実
にするよう調整することができる。本発明は、かかるそ
の場での殺菌を行なうことができない従来技術に対して
実質的な進歩を示すものである。 試験No.8および９ 二つの異なる過酸化水素濃度（0.1および10.0mg/l水
溶液）の影響を決定するために、マウス腹水症腫瘍細胞
について試験を行なった。RPMI1640媒体および10⁶/mlの
マウス腹水症腫瘍細胞を含む６本の試験管（各々に4m
l）を調整した。 細胞の0.1ml部分を500rpmで10分間、遠心分離した。
媒体をパスツール・ピペットで傾斜した。トリパン青染
料の一滴を細胞に加え、染料を取り上げる死細胞とのみ
混合した。上述した濃度の過酸化水素水溶液を37℃に保
温された試験管中に加えた。保温中、連続的に振盪して
細胞が懸濁するようにし、試料を１時間毎に採取した。
試料からの染色された細胞の少数を血球計上に置き、各
試験管中の死細胞数を決定するために500の細胞を無作
為に数えた。この数える方法をコントロール試験管につ
いても行なった。試験を２回繰り返し行なった。下記第
11表に、過酸化水素を含む各試験管中の死細胞数、およ
びコントロール試験管中の死細胞数を種々の接触時間に
ついて示す。 第11表は、細胞を0.1mg/lの過酸化水素にさらしたと
きは、コントロール試験管における死細胞よりも死細胞
数が多くないことを明らかに示している。反対に、10.0
mg/lの過酸化水素にさらすと、実質的に多数の死細胞が
明らかに生ずる。従って、この特定のタイプの細胞につ
いては、過酸化水素濃度を0.1mg/lのレベル以下に保つ
ことは組織培養物の破壊をもたらさないことが明らかで
ある。第5,8および10表で述べたように、殺菌にとって
十分であり、かつ過酸化水素濃度レベルを目的とする0.
1mg/l以下に保持する種々の循環時間および過酸化水素
濃度を用いることができる。 下記する第12および13表は、組織培養媒体中の過酸化
水素残量を示す。 まとめ 要約すれば、本発明は予め決定された領域内の汚染微
生物を選択的に死滅させる方法である。たとえば、気相
過酸化水素を予め決定された領域に予め決定された濃度
に到達するに十分な割合いで導入することによって、そ
してこの濃度を予め決定された時間のあいだ保持するこ
とによって、組織培養フラスコの外側上の、恒温器の全
内部表面上の、および恒温器内空間空気中の汚染微生物
を、フラスコ内に収容される組織培養物を害することな
く、死滅させることができる。 このことは、このような、その場での殺菌が行なわれ
なかった従来技術に比して実質的な進歩を示すものであ
る。 装置12は、戸が開いたときに入る汚染微生物を死滅さ
せるために、そして培養物を汚染させずに保持するため
に戸が閉じた都度、汚染除去サイクルを行なうようにプ
ログラムすることができる。 この代りに、汚染除去サイクルを毎日、恒温器への接
近を妨害しないように、朝早い時間のように予め決定さ
れた時間に行なうこともできる。 本発明は、曲折した通路を有する、またはフラスコの
開口を保護する過酸化水素フィルタを有するフラスコ中
に保持された動物細胞について用いることができる。本
発明は、また、卵のような生物の外側表面の汚染除去／
殺菌に用いることができる。本発明は更に過酸化水素に
対して高い耐性の故に直接さらすことができる植物細胞
培養物についても用いることができる。この方法によれ
ば、植物細胞培養物を周辺環境の殺菌からの上述した利
点に加えて殺菌することができる。 本発明の典型的な態様に関して述べたが、多くの修正
および変形はこの分野の当業者にとって容易に明らかで
ある。この記述および下記のクレームは、かかる全ての
修正および変形を含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−293465（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−103859（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−86165（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−293464（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−66678（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記工程からなる、組織培養中の生存細胞および汚
   染微生物を含有する予め決定された囲まれた領域内の汚
   染微生物を選択的に死滅させる方法。 該予め決定された囲まれた領域内の温度および圧力を調
   整して、圧力におけるどんな実質的変化をも防止し、か
   つ予め決定された領域内の過酸化水素の実質的凝縮を防
   止するために温度を過酸化水素の露点を超えて維持しな
   がら、予め決定された過酸化水素濃度に達せしめるに十
   分な割合で前記予め決定された囲まれた領域内に気相過
   酸化水素を導入する工程； 前記予め決定された濃度を、汚染微生物を死滅させるの
   に十分であり、かつ望ましい生存細胞を害するには不十
   分な時間範囲の間、維持する工程；および 前記気相過酸化水素を、前記時間範囲の経過後に、前記
   領域から除去する工程。 ２．前記気相過酸化水素の導入過程が、予め決定された
   領域を経る空気流の導入および該気流中への気相過酸化
   水素の注入工程を含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記気相過酸化水素の注入工程が過酸化水素水溶液
   の気化手段への運搬を含む請求の範囲第２項に記載の方
   法。 ４．空気流の温度を感知する工程を更に含み、前記過酸
   化水素水溶液が前記気化手段に運搬される割合いが、該
   感知した温度に対応する請求の範囲第３項に記載の方
   法。 ５．前記予め決定された領域中に、前記感知した温度に
   もとづいて気相過酸化水素の導入の最高割合いを計算す
   る工程を含む請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．前記過酸化水素水溶液の濃度を確認する工程を含
   み、かつ該確認した濃度および前記計算された気相過酸
   化水素導入の最高割合いにもとづいて前記気化手段に前
   記過酸化水素水溶液が運搬される割合いを調整する工程
   を含む請求項第５項に記載の方法。 ７．前記気相過酸化水素の除去工程が前記予め決定され
   た領域を経る空気流を維持し、この流れの中への気相過
   酸化水素の注入を終らせる工程を含む請求の範囲第２項
   に記載の方法。 ８．前記望ましい生存細胞が、その開口部に曲折した通
   路を夫々有する容器中に収容され、前記予め決定された
   濃度を保持する前記工程が、前記気相過酸化水素が少な
   くとも該容器の外側を汚染除去するのに十分であり、前
   記気相過酸化水素が前記曲折した通路を通過して前記生
   存細胞に到達するには不十分な時間範囲の間、前記予め
   決定された濃度を保持する工程を含む請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ９．前記望ましい生存細胞が、その開口部にフィルタを
   夫々有する容器に収容され、前記予め決定された濃度を
   保持する前記工程が、前記気相過酸化水素が前記容器の
   外側を少なくとも汚染除去するのに十分であり、前記気
   相過酸化水素が前記フィルタを浸透して前記生存細胞に
   到達するには不十分な時間範囲の間、前記予め決定され
   た濃度を保持する工程を含む請求の範囲第１項に記載の
   方法。 １０．前記望ましい生存細胞が開放容器に収容され、前
   記予め決定された濃度を保持する工程が、前記気相過酸
   化水素が前記細胞の外表面を少なくとも殺菌するのに十
   分であり、前記気相過酸化水素が前記望ましい生存細胞
   を害するには不十分である時間範囲の間、前記予め決定
   された濃度を保持する工程を含む請求の範囲第１項に記
   載の方法。 １１．組織培養中の生存細胞および汚染微生物を含有す
   る、内部表面を有しかつ予め決定された容積を囲む容器
   内の汚染微生物を選択的に死滅させる方法であり、該方
   法は下記工程からなる： 前記容器内に該生存細胞を挿入する工程； 該容器内の温度および圧力を調整して、圧力におけるど
   んな実質的変化をも防止し、また、該容器内の過酸化水
   素の実質的凝縮を防止するために温度を過酸化水素の露
   点を超えて維持しながら、予め決定された過酸化水素濃
   度に達せしめるに十分な割合で該容器内に気相過酸化水
   素を導入することにより、該容器の内部表面を少なくと
   も汚染除去すると共に前記空気中の汚染物を死滅させる
   工程； 前記予め決定された濃度を、汚染微生物を死滅させるの
   に十分であり、かつ望ましい生存細胞を害するには不十
   分な時間範囲の間、維持する工程；および 前記気相過酸化水素を、前記汚染除去工程の後に、前記
   領域から除去する工程。 １２．前記望ましい生存細胞を前記容器内に置く工程が
   その開口部に曲折した通路を有する容器内に該望ましい
   生存細胞を置くことからなり、前記汚染除去工程が前記
   容器の外表面の汚染除去を含む請求の範囲第11項に記載
   の方法。 １３．前記望ましい生存細胞を前記容器内に置く工程が
   その開口部にフィルタを有する容器内に該望ましい生存
   細胞を置くことからなり、前記汚染除去工程が前記容器
   の外表面の汚染除去を含む請求の範囲第11項に記載の方
   法。 １４．前記望ましい生存細胞を前記容器内に置く工程が
   開放容器内に該望ましい生存細胞を置くことからなり、
   前記汚染除去工程が前記生存細胞の外表面の少なくとも
   殺菌を含む請求の範囲第11項に記載の方法。 １５．前記汚染除去工程が、前記容器の内表面を殺菌
   し、前記容積内の空気中の汚染物を死滅させる工程を含
   む請求の範囲第11項に記載の方法。 １６．望ましい生存細胞を挿入する工程が、望ましい生
   存細胞をオートクレーブに挿入する工程を含む請求の範
   囲第11項に記載の方法。 １７．望ましい生存細胞を挿入する工程が望ましい生存
   細胞を恒温器中に挿入する工程を含む請求の範囲第11項
   に記載の方法。 １８．組織培養中の生存細胞および汚染微生物を含有す
   る予め決定された囲まれた領域内の汚染微生物を選択的
   に死滅させる方法であり、下記工程から成る： 前記予め決定した領域を経る空気流を確立する工程； 前記空気流の温度を測定する工程； 前記測定した温度にもとづいて、前記予め決定された領
   域内への気相過酸化水素注入の最高割合いを計算する工
   程； 過酸化水素水溶液源の過酸化水素濃度を確認する工程； 前記計算した気相過酸化水素の最高注入割合いよりも大
   きくない望ましい注入割合いを達成するのに必要な液相
   過酸化水素の流れの割合いを計算する工程； 前記過酸化水素水溶液を前記計算した流れの割合いで気
   化手段中に運搬する工程； 前記流れの割合いを、前記予め決定された領域において
   予め決定された気相過酸化水素濃度を達成するのに十分
   な時間範囲の間、かつ汚染微生物を死滅させるのに十分
   であり、望ましい生存細胞を害するには不十分な時間範
   囲の間、前記予め決定された濃度に保持するのに十分な
   時間範囲の間、維持する工程； 該予め決定された囲まれた領域内の温度および圧力を調
   整して、圧力におけるどんな実質的変化をも防止し、か
   つ予め決定された囲まれた領域内の過酸化水素の実質的
   凝縮を防止するために温度を過酸化水素の露点を超えて
   維持する工程； 前記気化手段中への過酸化水素水溶液の運搬を中止する
   工程；および 前記予め決定された領域を経る前記空気流を、前記予め
   決定された領域から前記気相過酸化水素を除去するのに
   十分な時間範囲の間、維持する工程。