JP2687942B2 - 固定化酵素膜の形成方法 - Google Patents
固定化酵素膜の形成方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオセンサに係る技
術分野に関し、特にバイオセンサ基板上に固定化酵素膜
を形成する方法に関する。
術分野に関し、特にバイオセンサ基板上に固定化酵素膜
を形成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の“固定化酵素膜を形成して構成さ
れるバイオセンサ”としては、例えば半導体あるいは絶
縁性基板上に電界効果トランジスタや貴金属電極を設置
し、この上の感応部に酵素を固定化した構造からなるも
のが知られている。
れるバイオセンサ”としては、例えば半導体あるいは絶
縁性基板上に電界効果トランジスタや貴金属電極を設置
し、この上の感応部に酵素を固定化した構造からなるも
のが知られている。
【０００３】この種のバイオセンサは、全血あるいは生
体表面から浸出させた浸出液のような溶液中の特定の有
機物が、固定化酵素中で酵素の触媒作用により化学反応
をした時に生じる水素イオン濃度あるいは電子濃度の変
化を検出することにより、特定の有機物の濃度を測定す
るものである。このような選択性をもつ酵素の固定化膜
の例としては、尿素検出用としてウレア−ゼ固定化膜、
グルコ−ス検出用としてグルコ−スオキシダ−ゼ膜、乳
酸検出用として乳酸オキシダ−ゼ膜などが知られてい
る。
体表面から浸出させた浸出液のような溶液中の特定の有
機物が、固定化酵素中で酵素の触媒作用により化学反応
をした時に生じる水素イオン濃度あるいは電子濃度の変
化を検出することにより、特定の有機物の濃度を測定す
るものである。このような選択性をもつ酵素の固定化膜
の例としては、尿素検出用としてウレア−ゼ固定化膜、
グルコ−ス検出用としてグルコ−スオキシダ−ゼ膜、乳
酸検出用として乳酸オキシダ−ゼ膜などが知られてい
る。
【０００４】一方、酵素の固定化膜を形成する方法とし
ては、グルコ−スオキシダ−ゼ(以下“ＧＯＤ”と略記
する)のような酵素、牛血清アルブミン(以下“ＢＳＡ”
と略記する)及びグルタルアルデヒド架橋剤(以下“Ｇ
Ａ”と略記する)を混合した蛋白質溶液を10℃以下に冷
却し、そして、基板温度も10℃以下に冷却した状態で直
ちにスピン塗布する方法が知られている(特開平2−1681
53号公報参照)。
ては、グルコ−スオキシダ−ゼ(以下“ＧＯＤ”と略記
する)のような酵素、牛血清アルブミン(以下“ＢＳＡ”
と略記する)及びグルタルアルデヒド架橋剤(以下“Ｇ
Ａ”と略記する)を混合した蛋白質溶液を10℃以下に冷
却し、そして、基板温度も10℃以下に冷却した状態で直
ちにスピン塗布する方法が知られている(特開平2−1681
53号公報参照)。
【０００５】また、予じめパタ−ン化したい部分に開口
部をもったフォトレジスト膜を設置した後、酵素，ＢＳ
Ａ及びＧＡを混合した蛋白質溶液をスピン塗布する。そ
して、所望の固定化酵素膜厚を得るために、上記蛋白質
溶液を繰り返しスピン塗布する。なお、繰り返すスピン
塗布間には、それぞれＧＡの架橋反応に必要な時間を置
き、架橋反応を完了させる。その後、上記フォトレジス
トをリフトオフで除去して、局部的な場所に固定化酵素
膜を形成する方法も知られている(特公平3−49388号公
報参照)。
部をもったフォトレジスト膜を設置した後、酵素，ＢＳ
Ａ及びＧＡを混合した蛋白質溶液をスピン塗布する。そ
して、所望の固定化酵素膜厚を得るために、上記蛋白質
溶液を繰り返しスピン塗布する。なお、繰り返すスピン
塗布間には、それぞれＧＡの架橋反応に必要な時間を置
き、架橋反応を完了させる。その後、上記フォトレジス
トをリフトオフで除去して、局部的な場所に固定化酵素
膜を形成する方法も知られている(特公平3−49388号公
報参照)。
【０００６】ここで、従来の固定化酵素膜の形成方法に
ついて、図５を参照して説明する。なお、図５は、従来
の固定化酵素膜の形成方法を説明するための図であっ
て、工程Ａ〜Ｃからなる工程順概略図であり、工程Ａは
フロ−図で示し、工程Ｂ及び工程Ｃは断面図で示す。
ついて、図５を参照して説明する。なお、図５は、従来
の固定化酵素膜の形成方法を説明するための図であっ
て、工程Ａ〜Ｃからなる工程順概略図であり、工程Ａは
フロ−図で示し、工程Ｂ及び工程Ｃは断面図で示す。
【０００７】従来の固定化酵素膜の形成方法は、まず図
５工程Ａに示すように、ＢＳＡ35ａ，ＧＯＤ35ｂ及びＧ
Ａ35ｃを準備し、これらを混合して酵素含有溶液35を調
製する。一方、ガラス基板31上にイオン感応性電界効果
トランジスタ(ＩＳＦＥＴ32)を形成し、このガラス基板
31上にフォトレジスト33を塗布した後、ＩＳＦＥＴ32上
に開口部34を設ける(図５工程Ｂ参照)。
５工程Ａに示すように、ＢＳＡ35ａ，ＧＯＤ35ｂ及びＧ
Ａ35ｃを準備し、これらを混合して酵素含有溶液35を調
製する。一方、ガラス基板31上にイオン感応性電界効果
トランジスタ(ＩＳＦＥＴ32)を形成し、このガラス基板
31上にフォトレジスト33を塗布した後、ＩＳＦＥＴ32上
に開口部34を設ける(図５工程Ｂ参照)。
【０００８】そして、図５工程Ｂに示すように、前記工
程Ａで得られた酵素含有溶液35をスピン塗布し、次に、
フォトレジスト33及びこの上の酵素含有溶液35をリフト
オフで除去して、図５工程Ｃに示すように、ＩＳＦＥＴ
32上に固定化酵素膜36を形成させる。なお、図５工程Ｃ
中の37は、固定化酵素膜36のエッジ部分を示すが、これ
については後述する。
程Ａで得られた酵素含有溶液35をスピン塗布し、次に、
フォトレジスト33及びこの上の酵素含有溶液35をリフト
オフで除去して、図５工程Ｃに示すように、ＩＳＦＥＴ
32上に固定化酵素膜36を形成させる。なお、図５工程Ｃ
中の37は、固定化酵素膜36のエッジ部分を示すが、これ
については後述する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上記した従来の固定化
酵素膜の形成方法では、図５工程Ａに示すように、ＢＳ
Ａ35ａ，ＧＯＤ35ｂ及びＧＡ35ｃを混合した酵素含有溶
液35を使用する方法である。
酵素膜の形成方法では、図５工程Ａに示すように、ＢＳ
Ａ35ａ，ＧＯＤ35ｂ及びＧＡ35ｃを混合した酵素含有溶
液35を使用する方法である。
【００１０】ところで、この酵素含有溶液35は、ＢＳＡ
35ａ，ＧＯＤ35ｂ，ＧＡ35ｃを混合した時点で架橋反応
が始まり、約５ｃｐｓの粘度が僅か２〜３分間程度で、
常温下で、約100ｃｐｓに達してしまう。従って、ガラ
ス基板31上に均一な蛋白質溶液膜(固定化酵素膜36)を形
成するためには、前掲の特開平2−168153号公報に記載
されているように、ガラス基板31を0〜4℃程度に冷却し
なければならず、また、ＢＳＡ35ａ，ＧＯＤ35ｂ，ＧＡ
35ｃの混合時において、氷水で冷却した容器内で混合し
なければならない。
35ａ，ＧＯＤ35ｂ，ＧＡ35ｃを混合した時点で架橋反応
が始まり、約５ｃｐｓの粘度が僅か２〜３分間程度で、
常温下で、約100ｃｐｓに達してしまう。従って、ガラ
ス基板31上に均一な蛋白質溶液膜(固定化酵素膜36)を形
成するためには、前掲の特開平2−168153号公報に記載
されているように、ガラス基板31を0〜4℃程度に冷却し
なければならず、また、ＢＳＡ35ａ，ＧＯＤ35ｂ，ＧＡ
35ｃの混合時において、氷水で冷却した容器内で混合し
なければならない。
【００１１】このように、従来の固定化酵素膜の形成方
法では、前掲の特開平2−168153号公報に記載の方法で
も同様であるが、低温環境下でのスピン塗布であるの
で、ガラス基板31上面が結露し易く、このため、蛋白質
膜(即ち固定化酵素膜36)の密着性が劣化し、再現性、安
定性に問題があり、また、繰り返し使用時の信頼性に欠
けるという問題があった。
法では、前掲の特開平2−168153号公報に記載の方法で
も同様であるが、低温環境下でのスピン塗布であるの
で、ガラス基板31上面が結露し易く、このため、蛋白質
膜(即ち固定化酵素膜36)の密着性が劣化し、再現性、安
定性に問題があり、また、繰り返し使用時の信頼性に欠
けるという問題があった。
【００１２】さらに、スピン塗布時には、混合してから
塗布するまでの時間を短縮しなければならず、このため
作業性が悪く、一方、多数枚の基板を処理する場合に
は、初めの基板と後半の基板において、固定化酵素膜の
膜厚にバラツキが発生し(約±300％にもなり)、その結
果 、バイオセンサとして構成した時に、必然的にその
性能にもバラツキが生じるという欠点があった。
塗布するまでの時間を短縮しなければならず、このため
作業性が悪く、一方、多数枚の基板を処理する場合に
は、初めの基板と後半の基板において、固定化酵素膜の
膜厚にバラツキが発生し(約±300％にもなり)、その結
果 、バイオセンサとして構成した時に、必然的にその
性能にもバラツキが生じるという欠点があった。
【００１３】また、従来の固定化酵素膜の形成方法にお
いて、塗布したい部分に予めフォトレジスト33の開口部
34を設け、スピン塗布する場合も(前掲の図５工程Ｂ参
照)同様に問題となる。特にフォトレジスト33の膜を冷
却すると、この膜は、開口パタ−ン角部から亀裂が入
り、その結果として、剥離するようになってしまう。従
って、この膜の上に酵素含有溶液35をスピン塗布する
と、パタ−ン精度に影響を与えることになり、問題が生
じる。
いて、塗布したい部分に予めフォトレジスト33の開口部
34を設け、スピン塗布する場合も(前掲の図５工程Ｂ参
照)同様に問題となる。特にフォトレジスト33の膜を冷
却すると、この膜は、開口パタ−ン角部から亀裂が入
り、その結果として、剥離するようになってしまう。従
って、この膜の上に酵素含有溶液35をスピン塗布する
と、パタ−ン精度に影響を与えることになり、問題が生
じる。
【００１４】また、所望の膜厚を得るために、前掲の特
公平3−49388号公報に記載の方法のように酵素含有溶液
35を繰り返し塗布する場合には、架橋反応が進行して粘
性が高まることにより、リフトオフで余分な蛋白質膜
(フォトレジスト33の膜上に存在する酵素含有溶液35)を
除去した後では、前掲の図５工程Ｃに示すように、固定
化酵素膜36のエッジ部分37は、極端に盛り上がる結果に
なってしまう。例えば、固定化酵素膜36の中心部が２μ
ｍ厚とすると、エッジ部分37は急峻な５μｍ以上の突起
となり(図５工程Ｃ参照)、このためゴミの発生源ともな
り、感度のバラツキの原因にもなる。
公平3−49388号公報に記載の方法のように酵素含有溶液
35を繰り返し塗布する場合には、架橋反応が進行して粘
性が高まることにより、リフトオフで余分な蛋白質膜
(フォトレジスト33の膜上に存在する酵素含有溶液35)を
除去した後では、前掲の図５工程Ｃに示すように、固定
化酵素膜36のエッジ部分37は、極端に盛り上がる結果に
なってしまう。例えば、固定化酵素膜36の中心部が２μ
ｍ厚とすると、エッジ部分37は急峻な５μｍ以上の突起
となり(図５工程Ｃ参照)、このためゴミの発生源ともな
り、感度のバラツキの原因にもなる。
【００１５】本発明は、従来の固定化酵素膜の形成方法
で発生する上記諸問題に鑑み成されたものであって、そ
の目的とするところは、上記諸問題を解消し、そして、
酵素やＢＳＡなどの蛋白質膜を基板上に均一に、しかも
安定して再現性良く塗布することができる固定化酵素膜
の形成方法を提供することにある。
で発生する上記諸問題に鑑み成されたものであって、そ
の目的とするところは、上記諸問題を解消し、そして、
酵素やＢＳＡなどの蛋白質膜を基板上に均一に、しかも
安定して再現性良く塗布することができる固定化酵素膜
の形成方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明に係る固定化酵素
膜の形成方法は、従来の固定化酵素膜の形成方法いある
“ＢＡＳ，ＧＯＤ，ＧＡなどを混合した酵素含有溶液を
使用する方法”と異なり、 ・架橋剤を含む第１の有機質溶液を基板面上のみに塗布
する工程と、 ・牛血清アルブミン、酵素類の第２の有機質溶液を重ね
て塗布する工程と、 ・必要により、前記基板に超音波振動を印加し、前記第
１および第２の有機質溶 液の有機質間界面の拡散を促進
させる工程と、 ・前記各工程を２回以上繰り返して行う工程と、から少
なくとも構成されることを特徴とし、これにより上記目
的とする固定化酵素膜の形成方法を提供するものであ
る。
膜の形成方法は、従来の固定化酵素膜の形成方法いある
“ＢＡＳ，ＧＯＤ，ＧＡなどを混合した酵素含有溶液を
使用する方法”と異なり、 ・架橋剤を含む第１の有機質溶液を基板面上のみに塗布
する工程と、 ・牛血清アルブミン、酵素類の第２の有機質溶液を重ね
て塗布する工程と、 ・必要により、前記基板に超音波振動を印加し、前記第
１および第２の有機質溶 液の有機質間界面の拡散を促進
させる工程と、 ・前記各工程を２回以上繰り返して行う工程と、から少
なくとも構成されることを特徴とし、これにより上記目
的とする固定化酵素膜の形成方法を提供するものであ
る。
【００１７】即ち、本発明は、「微小電極あるいはイオ
ン感応性電界効果トランジスタが形成された基板上に、
酵素，架橋剤，アルブミンなどを含む蛋白質溶液を塗布
することにより固定化酵素膜を形成する方法において、 (1) 架橋剤を含む第１の有機質溶液を前記基板面上のみ
に塗布する工程、 (2) 牛血清アルブミン，酵素類の第２の有機質溶液を重
ねて塗布する工程、 (3) 前記(1)の工程と前記(2)の工程を２回以上繰り返し
て塗布する工程、とから少なくとも構成されることを特
徴とする固定化酵素膜の形成方法。」(請求項１)を要旨
とする。
ン感応性電界効果トランジスタが形成された基板上に、
酵素，架橋剤，アルブミンなどを含む蛋白質溶液を塗布
することにより固定化酵素膜を形成する方法において、 (1) 架橋剤を含む第１の有機質溶液を前記基板面上のみ
に塗布する工程、 (2) 牛血清アルブミン，酵素類の第２の有機質溶液を重
ねて塗布する工程、 (3) 前記(1)の工程と前記(2)の工程を２回以上繰り返し
て塗布する工程、とから少なくとも構成されることを特
徴とする固定化酵素膜の形成方法。」(請求項１)を要旨
とする。
【００１８】また、本発明は、「上記(2)の工程と(3)の
工程との間に、第１および第２の有機質溶液の有機質間
界面の拡散を促進させるため、“(3)基板に超音波振動
を印加する工程”を組み込み、そして、(1)の工程と(2)
の工程と(3)の工程とからなる工程を、２回以上繰り返
して行う工程とから少なくとも構成されることを特徴と
する固定化酵素膜の形成方法。(請求項２)」を要旨とす
る。
工程との間に、第１および第２の有機質溶液の有機質間
界面の拡散を促進させるため、“(3)基板に超音波振動
を印加する工程”を組み込み、そして、(1)の工程と(2)
の工程と(3)の工程とからなる工程を、２回以上繰り返
して行う工程とから少なくとも構成されることを特徴と
する固定化酵素膜の形成方法。(請求項２)」を要旨とす
る。
【００１９】以下、本発明について詳細に説明するが、
それに先立って“有機物溶液の架橋剤添加による硬化”
について説明すると、スピン塗布法などで塗布した有機
物溶液を硬化させるには、予め架橋剤を混合しておけば
一般的には架橋する。通常、100℃程度で加熱して架橋
反応を促進させることができる。
それに先立って“有機物溶液の架橋剤添加による硬化”
について説明すると、スピン塗布法などで塗布した有機
物溶液を硬化させるには、予め架橋剤を混合しておけば
一般的には架橋する。通常、100℃程度で加熱して架橋
反応を促進させることができる。
【００２０】しかしながら、本発明で対象とする蛋白質
の場合は、40℃以上に加熱すると分解し、特に本発明で
対象とする酵素などは失活してしまい、本来の機能を発
揮することが不可能になってしまう。そこで、酵素など
を固定化する場合、常温で架橋させなければならない。
の場合は、40℃以上に加熱すると分解し、特に本発明で
対象とする酵素などは失活してしまい、本来の機能を発
揮することが不可能になってしまう。そこで、酵素など
を固定化する場合、常温で架橋させなければならない。
【００２１】本発明では、具体的には、２〜３ｃｐｓ程
度のＧＡ溶液(第１の有機質溶液)と、ＢＳＡ及びＧＯＤ
の混合溶液(第２の有機質溶液)とを交互に塗布する工程
を基本とし、この工程を２回以上繰り返して所望の膜厚
とすることを特徴とする。この第１の有機質溶液である
“ＧＡ溶液”と、第２の有機質溶液である“ＢＳＡ及び
ＧＯＤの混合溶液”とは、単体では硬化せず、双方が接
触した時に各層間の界面から硬化が始まるものである。
なお、各層の１回で塗布する膜厚としては、出来るだけ
薄い方が短時間で架橋反応が完了するが、これでは塗布
回数を増やす必要があるところから、トレ−ドオフで最
適値を求めることが必要となる。
度のＧＡ溶液(第１の有機質溶液)と、ＢＳＡ及びＧＯＤ
の混合溶液(第２の有機質溶液)とを交互に塗布する工程
を基本とし、この工程を２回以上繰り返して所望の膜厚
とすることを特徴とする。この第１の有機質溶液である
“ＧＡ溶液”と、第２の有機質溶液である“ＢＳＡ及び
ＧＯＤの混合溶液”とは、単体では硬化せず、双方が接
触した時に各層間の界面から硬化が始まるものである。
なお、各層の１回で塗布する膜厚としては、出来るだけ
薄い方が短時間で架橋反応が完了するが、これでは塗布
回数を増やす必要があるところから、トレ−ドオフで最
適値を求めることが必要となる。
【００２２】
【実施例】次に、本発明の実施例について図１〜図４を
参照して説明するが、本発明は、以下の実施例により限
定されるものではなく、種々の変更が可能であり、これ
らの変更も本発明に包含されるものである。
参照して説明するが、本発明は、以下の実施例により限
定されるものではなく、種々の変更が可能であり、これ
らの変更も本発明に包含されるものである。
【００２３】（実施例１）図１は、本発明の一実施例
(実施例１)を示す工程Ａ〜Ｄからなる工程順断面概略図
であり、図２は、図１に続く工程Ｅ〜Ｇからなる工程順
断面概略図である。
(実施例１)を示す工程Ａ〜Ｄからなる工程順断面概略図
であり、図２は、図１に続く工程Ｅ〜Ｇからなる工程順
断面概略図である。
【００２４】本実施例１では、まず図１工程Ａに示すよ
うに、ガラス基板11上に島状シリコン膜を用いてイオン
感応性電界効果トランジスタ(ＩＳＦＥＴ12)を形成す
る。次に、図１工程Ｂに示すように、フォトレジスト13
をスピン塗布し、続いてＩＳＦＥＴ12上に開口部14を設
ける。
うに、ガラス基板11上に島状シリコン膜を用いてイオン
感応性電界効果トランジスタ(ＩＳＦＥＴ12)を形成す
る。次に、図１工程Ｂに示すように、フォトレジスト13
をスピン塗布し、続いてＩＳＦＥＴ12上に開口部14を設
ける。
【００２５】次に、必要に応じて電界処理及び親水性プ
ライマ処理を施して密着性を高める処理をした後、図１
工程Ｃに示すように、５％グルタールアルデヒド溶液
（ＧＡ溶液15ａ）だけを、ＩＳＦＥＴ12が設置してある
ガラス基板11の面側のみに、スピン塗布する。この塗布
条件としては、例えばスピン塗布の回転数を2000ｒｐｍ
とすれば、約0.2μｍ厚の塗膜が塗布される。また、温
度条件は、ＧＡ溶液15ａ及びガラス基板11とも冷却せ
ず、常温で塗布するが、25℃±2℃程度に制御された環
境下が好ましい。
ライマ処理を施して密着性を高める処理をした後、図１
工程Ｃに示すように、５％グルタールアルデヒド溶液
（ＧＡ溶液15ａ）だけを、ＩＳＦＥＴ12が設置してある
ガラス基板11の面側のみに、スピン塗布する。この塗布
条件としては、例えばスピン塗布の回転数を2000ｒｐｍ
とすれば、約0.2μｍ厚の塗膜が塗布される。また、温
度条件は、ＧＡ溶液15ａ及びガラス基板11とも冷却せ
ず、常温で塗布するが、25℃±2℃程度に制御された環
境下が好ましい。
【００２６】次に、図１工程Ｄに示すように、酵素溶液
16ａをスピン塗布する。この酵素溶液16ａとしては、例
えば約300ｍｇ／ｄｌの牛血清アルブミン(ＢＳＡ)と約5
0ｍｇ／ｄｌのグルコ−スオキシダ−ゼ(ＧＯＤ)とを約
２：１に混合した溶液を用い、これをスピン塗布する。
この塗布条件としては、回転数が約2000ｒｐｍで、前記
のＧＡ溶液15ａ塗布と同一で良い。この時、ＢＳＡとＧ
ＯＤとを混合した酵素溶液16ａは、ＧＡ溶液15ａと接触
し、架橋反応が開始する。なお、スピン回転により均一
性も改善され、攪拌も促進される。
16ａをスピン塗布する。この酵素溶液16ａとしては、例
えば約300ｍｇ／ｄｌの牛血清アルブミン(ＢＳＡ)と約5
0ｍｇ／ｄｌのグルコ−スオキシダ−ゼ(ＧＯＤ)とを約
２：１に混合した溶液を用い、これをスピン塗布する。
この塗布条件としては、回転数が約2000ｒｐｍで、前記
のＧＡ溶液15ａ塗布と同一で良い。この時、ＢＳＡとＧ
ＯＤとを混合した酵素溶液16ａは、ＧＡ溶液15ａと接触
し、架橋反応が開始する。なお、スピン回転により均一
性も改善され、攪拌も促進される。
【００２７】次に、図２工程Ｅに示すように、第２回目
のＧＡ溶液15ｂを塗布する。この場合、先に塗布したＢ
ＳＡとＧＯＤとの混合された酵素溶液16ａの上面のまだ
充分架橋反応が進んでいない部分を硬化させる作用効果
も生じる。続いて、図２工程Ｆに示すように、第２回目
のＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵素溶液16ｂをさらに塗
布する。
のＧＡ溶液15ｂを塗布する。この場合、先に塗布したＢ
ＳＡとＧＯＤとの混合された酵素溶液16ａの上面のまだ
充分架橋反応が進んでいない部分を硬化させる作用効果
も生じる。続いて、図２工程Ｆに示すように、第２回目
のＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵素溶液16ｂをさらに塗
布する。
【００２８】第２回目に塗布したＧＡ溶液16ｂと、スピ
ン回転による攪拌促進作用とで、架橋反応が起こり硬化
する。そして、必要な膜厚例えば約１μｍの総厚を得る
には、上記工程Ｅ［第２回目のＧＡ溶液を塗布する工
程］及び工程Ｆ［第２回目の酵素溶液を積層塗布する工
程］を５〜６回繰り返した後、約30分間常温にて放置す
る。
ン回転による攪拌促進作用とで、架橋反応が起こり硬化
する。そして、必要な膜厚例えば約１μｍの総厚を得る
には、上記工程Ｅ［第２回目のＧＡ溶液を塗布する工
程］及び工程Ｆ［第２回目の酵素溶液を積層塗布する工
程］を５〜６回繰り返した後、約30分間常温にて放置す
る。
【００２９】このようにして多層の蛋白質膜を積層して
硬化した後、アセトンに浸漬し、必要に応じて超音波振
動を印加する。この際、フォトレジスト13は、アセトン
に溶解するので、フォトレジスト13の開口部14以外に塗
布された酵素を含む蛋白質膜は、剥離し、除去され、固
定化酵素膜17がＩＳＦＥＴ12上に形成される(図２工程
Ｇ参照)。以上の工程Ａ〜Ｇによって、ＩＳＦＥＴ12上
にのみ固定化酵素膜17が設置され、生化学成分のグルコ
−ス濃度を計測するバイオセンサが完成する。
硬化した後、アセトンに浸漬し、必要に応じて超音波振
動を印加する。この際、フォトレジスト13は、アセトン
に溶解するので、フォトレジスト13の開口部14以外に塗
布された酵素を含む蛋白質膜は、剥離し、除去され、固
定化酵素膜17がＩＳＦＥＴ12上に形成される(図２工程
Ｇ参照)。以上の工程Ａ〜Ｇによって、ＩＳＦＥＴ12上
にのみ固定化酵素膜17が設置され、生化学成分のグルコ
−ス濃度を計測するバイオセンサが完成する。
【００３０】本実施例１の上記工程Ａ〜Ｇによれば、ガ
ラス基板11及び塗布する蛋白質溶液(ＧＡ溶液15ａ，15
ｂ、酵素溶液16ａ，16ｂ)を冷却する必要がなく、常温
で作業ができるようになる。また、固定化した酵素膜に
予じめ架橋剤を混合する手間が省け、しかもガラス基板
11が多数枚であっても、任意に膜厚の制御をすることが
でき、常に安定な固定化酵素膜が形成できる作用効果が
生じる。
ラス基板11及び塗布する蛋白質溶液(ＧＡ溶液15ａ，15
ｂ、酵素溶液16ａ，16ｂ)を冷却する必要がなく、常温
で作業ができるようになる。また、固定化した酵素膜に
予じめ架橋剤を混合する手間が省け、しかもガラス基板
11が多数枚であっても、任意に膜厚の制御をすることが
でき、常に安定な固定化酵素膜が形成できる作用効果が
生じる。
【００３１】さらに、本実施例１によれば、作業温度が
常温であるので、特に結露することがなく、その結果、
水分の混入がないため再現性良く、高信頼性のバイオセ
ンサを作製することができる。その他、塗布する蛋白質
溶液は、それぞれ単体では粘性が２〜３ｃｐｓであるた
め、従来の固定化酵素膜の形成方法において生じる前記
した“固定化酵素膜36のエッジ部分37の盛り上がり(前
掲の図５工程Ｃ参照)”が小さく、急峻な突起が形成し
ないという利点を有する。
常温であるので、特に結露することがなく、その結果、
水分の混入がないため再現性良く、高信頼性のバイオセ
ンサを作製することができる。その他、塗布する蛋白質
溶液は、それぞれ単体では粘性が２〜３ｃｐｓであるた
め、従来の固定化酵素膜の形成方法において生じる前記
した“固定化酵素膜36のエッジ部分37の盛り上がり(前
掲の図５工程Ｃ参照)”が小さく、急峻な突起が形成し
ないという利点を有する。
【００３２】また、従来の固定化酵素膜の形成方法で
は、１〜５μｍ程度の膜厚バラツキがあったが、本実施
例１によれば、2±0.5μｍ程度に改善できる。さらに、
本実施例１では、常温での作業が可能になることから、
フォトレジスト開口部パタ−ン精度が高く、１枚のガラ
ス基板に多数個を高密度に作った場合でも、素子間の干
渉がなく、安定したバイオセンサを作製できる利点を有
する。
は、１〜５μｍ程度の膜厚バラツキがあったが、本実施
例１によれば、2±0.5μｍ程度に改善できる。さらに、
本実施例１では、常温での作業が可能になることから、
フォトレジスト開口部パタ−ン精度が高く、１枚のガラ
ス基板に多数個を高密度に作った場合でも、素子間の干
渉がなく、安定したバイオセンサを作製できる利点を有
する。
【００３３】なお、この実施例１では、ガラス基板11上
にＩＳＦＥＴ12を形成した構成としたが、本発明は、こ
れに限定されるものではなく、単に微小電極を対向させ
た構成の場合でも有効であり、この場合も前記と同様な
工程Ａ〜Ｇで作製することができ、これも本発明に包含
されるものである。
にＩＳＦＥＴ12を形成した構成としたが、本発明は、こ
れに限定されるものではなく、単に微小電極を対向させ
た構成の場合でも有効であり、この場合も前記と同様な
工程Ａ〜Ｇで作製することができ、これも本発明に包含
されるものである。
【００３４】（実施例２）図３は、本発明の他の実施例
(実施例２)を示す工程Ａ〜Ｄからなる工程順断面概略図
であり、図４は、図３に続く工程Ｅ〜Ｈからなる工程順
断面概略図である。
(実施例２)を示す工程Ａ〜Ｄからなる工程順断面概略図
であり、図４は、図３に続く工程Ｅ〜Ｈからなる工程順
断面概略図である。
【００３５】本実施例２では、まず、ガラス基板11上に
ＩＳＦＥＴ12を形成し(図３工程Ａ)、フォトレジスト13
に開口部14を設け(図３工程Ｂ)、続いて、ＧＡ溶液15ａ
を塗布し(図３工程Ｃ)、ＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵
素溶液16ａを塗布する(図３工程Ｄ)。なお、この工程Ａ
〜Ｄまでは、前記実施例１と同一である。
ＩＳＦＥＴ12を形成し(図３工程Ａ)、フォトレジスト13
に開口部14を設け(図３工程Ｂ)、続いて、ＧＡ溶液15ａ
を塗布し(図３工程Ｃ)、ＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵
素溶液16ａを塗布する(図３工程Ｄ)。なお、この工程Ａ
〜Ｄまでは、前記実施例１と同一である。
【００３６】次に、図３工程Ｄに示す状態で、ガラス基
板11を超音波振動板18に載置し、振動を加える(図４工
程Ｅ)。その後、前記実施例１と同様、第２回目のＧＡ
溶液15ｂの塗布(図４工程Ｆ)、第２回目のＢＳＡとＧＯ
Ｄとを混合した酵素溶液16ｂの塗布(図４工程Ｇ)、フォ
トレジスト13の除去(図４工程Ｈ)を行い、ＩＳＦＥＴ12
上に固定化酵素膜17を形成させる。
板11を超音波振動板18に載置し、振動を加える(図４工
程Ｅ)。その後、前記実施例１と同様、第２回目のＧＡ
溶液15ｂの塗布(図４工程Ｆ)、第２回目のＢＳＡとＧＯ
Ｄとを混合した酵素溶液16ｂの塗布(図４工程Ｇ)、フォ
トレジスト13の除去(図４工程Ｈ)を行い、ＩＳＦＥＴ12
上に固定化酵素膜17を形成させる。
【００３７】本実施例２によれば、特に図４工程Ｅに示
すように、ＧＡ溶液15ａと、ＢＳＡ及びＧＯＤ混合溶液
(酵素溶液16ａ)との混合が、10ＫＨｚ〜１ＭＨｚ程度の
超音波振動を印加することにより、さらに促進され、架
橋反応による硬化が短時間に終了する。従って、本実施
例２では、連続した塗布作業が可能であり、工業的に有
利なプロセスが実現できるという利点を有する。
すように、ＧＡ溶液15ａと、ＢＳＡ及びＧＯＤ混合溶液
(酵素溶液16ａ)との混合が、10ＫＨｚ〜１ＭＨｚ程度の
超音波振動を印加することにより、さらに促進され、架
橋反応による硬化が短時間に終了する。従って、本実施
例２では、連続した塗布作業が可能であり、工業的に有
利なプロセスが実現できるという利点を有する。
【００３８】なお、実施例１，２では、グルコ−ス濃度
を計測するための酵素を用いて説明したが、本発明は、
これに限定されるものではなく、これ以外に例えば尿素
検出用としてウレア−ゼ、乳酸検出用として乳酸オキシ
ダ−ゼ、アルコ−ル検出用としてアルコ−ルオキシダ−
ゼ、クレアチニン検出用としてクレアチナ−ゼなど、各
種の酵素を含んだ蛋白質膜を使っても同様な効果が得ら
れ、これらも本発明に包含されるものである。また、酵
素を含まない“牛血清アルブミンだけの蛋白質膜”で構
成し、ｐＨ濃度を計測するセンサなどにも適用でき、蛋
白質の種類を選べば、電解質の計測にも使えるようにな
るが、これらも本発明に包含されるものである。
を計測するための酵素を用いて説明したが、本発明は、
これに限定されるものではなく、これ以外に例えば尿素
検出用としてウレア−ゼ、乳酸検出用として乳酸オキシ
ダ−ゼ、アルコ−ル検出用としてアルコ−ルオキシダ−
ゼ、クレアチニン検出用としてクレアチナ−ゼなど、各
種の酵素を含んだ蛋白質膜を使っても同様な効果が得ら
れ、これらも本発明に包含されるものである。また、酵
素を含まない“牛血清アルブミンだけの蛋白質膜”で構
成し、ｐＨ濃度を計測するセンサなどにも適用でき、蛋
白質の種類を選べば、電解質の計測にも使えるようにな
るが、これらも本発明に包含されるものである。
【００３９】さらに、前記実施例１，２では、ガラス基
板11上にまずＧＡ溶液15ａを塗布し、次に、ＢＳＡとＧ
ＯＤとを混合した酵素溶液16ａを積層する例を示したが
(図１工程Ｃ〜Ｄ，図３工程Ｃ〜Ｄ参照)、ガラス基板11
上にまずＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵素溶液16ａを塗
布し、次に、ＧＡ溶液15ａを積層することもでき、これ
も本発明に包含されるものである。
板11上にまずＧＡ溶液15ａを塗布し、次に、ＢＳＡとＧ
ＯＤとを混合した酵素溶液16ａを積層する例を示したが
(図１工程Ｃ〜Ｄ，図３工程Ｃ〜Ｄ参照)、ガラス基板11
上にまずＢＳＡとＧＯＤとを混合した酵素溶液16ａを塗
布し、次に、ＧＡ溶液15ａを積層することもでき、これ
も本発明に包含されるものである。
【００４０】
【発明の効果】本発明は、以上詳記したとおり、酵素を
固定化する際に、常温でしかも酵素を含んだ蛋白質溶液
と架橋剤溶液とを別々に塗布し、また、必要に応じ架橋
反応を促進させるために超音波振動を印加することによ
り、安定な品質の高い酵素膜固定化を形成させることが
できる効果が生じる。
固定化する際に、常温でしかも酵素を含んだ蛋白質溶液
と架橋剤溶液とを別々に塗布し、また、必要に応じ架橋
反応を促進させるために超音波振動を印加することによ
り、安定な品質の高い酵素膜固定化を形成させることが
できる効果が生じる。
【００４１】また、本発明では、常温で作業することが
でき、そのため、特に冷却機能のある特殊な塗布装置を
使用する必要がなく、かつ水分混入のない高感度のバイ
オセンサを作製することができる効果が生じる。さら
に、本発明は、薄い塗布膜の積み重ねによる方法である
ので、膜厚制御が容易であり、膜厚を任意に設定できる
効果がある。
でき、そのため、特に冷却機能のある特殊な塗布装置を
使用する必要がなく、かつ水分混入のない高感度のバイ
オセンサを作製することができる効果が生じる。さら
に、本発明は、薄い塗布膜の積み重ねによる方法である
ので、膜厚制御が容易であり、膜厚を任意に設定できる
効果がある。
【図１】本発明の一実施例(実施例１)を示す工程Ａ〜Ｄ
からなる工程順断面概略図
からなる工程順断面概略図
【図２】図１に続く工程Ｅ〜Ｇからなる工程順断面概略
図
図
【図３】本発明の他の実施例(実施例２)を示す工程Ａ〜
Ｄからなる工程順断面概略図
Ｄからなる工程順断面概略図
【図４】図３に続く工程Ｅ〜Ｈからなる工程順断面概略
図
図
【図５】従来の固定化酵素膜の形成方法を示す工程Ａ〜
Ｃからなる工程順概略図
Ｃからなる工程順概略図
１１ ガラス基板 １２ ＩＳＦＥＴ １３ フォトレジスト １４ 開口部 １５ａ，１５ｂ ＧＡ溶液 １６ａ，１６ｂ 酵素溶液 １７ 固定化酵素膜 １８ 超音波振動板 ３１ ガラス基板 ３２ ＩＳＦＥＴ ３３ フォトレジスト ３４ 開口部 ３５ 酵素含有溶液 ３５ａ ＢＳＡ ３５ｂ ＧＯＤ ３５ｃ ＧＡ ３６ 固定化酵素膜 ３７ エッジ部分
Claims (4)
- 【請求項１】 微小電極あるいはイオン感応性電界効果
トランジスタが形成された基板上に、酵素，架橋剤，ア
ルブミンなどを含む蛋白質溶液を塗布することにより固
定化酵素膜を形成する方法において、 (1) 架橋剤を含む第１の有機質溶液を前記基板面上のみ
に塗布する工程、 (2) 牛血清アルブミン，酵素類の第２の有機質溶液を重
ねて塗布する工程、 (3) 前記(1)の工程と前記(2)の工程を２回以上繰り返し
て塗布する工程、とから少なくとも構成されることを特
徴とする固定化酵素膜の形成方法。 - 【請求項２】 微小電極あるいはイオン感応性電界効果
トランジスタが形成された基板上に、酵素，架橋剤，ア
ルブミンなどを含む蛋白質溶液を塗布することにより固
定化酵素膜を形成する方法において、 (1) 架橋剤を含む第１の有機質溶液を前記基板面上のみ
に塗布する工程、 (2) 牛血清アルブミン，酵素類の第２の有機質溶液を重
ねて塗布する工程、 (3) 前記第１及び第２の有機質溶液を塗布した後、該有
機質間界面の拡散を促進させるため、前記基板に超音波
振動を印加する工程、 (4) 前記(1)の工程と前記(2)の工程と前記(3)の工程と
からなる工程を、２回以上繰り返して行う工程、とから
少なくとも構成されることを特徴とする固定化酵素膜の
形成方法。 - 【請求項３】 前記第２の有機質溶液は、牛血清アルブ
ミン又は酵素の単体あるいはその混合溶液であることを
特徴とする請求項１又は２記載の固定化酵素膜の形成方
法。 - 【請求項４】 前記第１の有機質溶液を塗布する前に、
先に、前記第２の有機質溶液を前記基板上に塗布するこ
とを特徴とする請求項１又は２記載の固定化酵素膜の形
成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7186403A JP2687942B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | 固定化酵素膜の形成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7186403A JP2687942B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | 固定化酵素膜の形成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0915191A JPH0915191A (ja) | 1997-01-17 |
| JP2687942B2 true JP2687942B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=16187804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7186403A Expired - Fee Related JP2687942B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | 固定化酵素膜の形成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2687942B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019039734A (ja) * | 2017-08-24 | 2019-03-14 | 学校法人東北学院 | イオン・バイオセンサチップとイオン・バイオセンサモジュールおよびこれらを用いたイオン・バイオセンサ |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6254155A (ja) * | 1985-09-02 | 1987-03-09 | Nec Corp | 半導体バイオセンサ酵素固定化膜の形成方法 |
-
1995
- 1995-06-29 JP JP7186403A patent/JP2687942B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0915191A (ja) | 1997-01-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |